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caractéristiques essentielles
énombrement des E. coli dans une préparation
N°2 D des différentes méthodes de
à base de viande 71 dénombrement et les paramètres
N°3 Dénombrement des entérocoques dans une eau 73 qui les différencient.
TECHNIQUE
Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceu- 1.1.1. Une membrane filtrante
tiques buvables ou injectables...), les micro-organismes La membrane filtrante (document 1 ) a des pores d’un
sont à une concentration très faible (voire nulle si le pro- diamètre de 0,45� µm���������������������������������
�����������������������������������
dont la disposition selon un ré-
duit est stérile). Leur dénombrement (rendu en UFC seau en trois dimensions permet de retenir à sa surface
par unité de volume) impose donc de « concentrer les les bactéries. En effet le diamètre des pores du filtre est
micro-organismes » pour pouvoir compter des colonies. inférieur à celui des bactéries classiquement rencontrées.
Cette « concentration » se fait grâce à la filtration d’un Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 µm
grand volume de produit sur une membrane retenant les pour retenir les bactéries les plus petites, des bacilles
micro-organismes. très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage de la
membrane de 0,45 µm (cas de Pseudomonas aeruginosa)
1.1. Matériel nécessaire ou encore des spores.
Les différentes étapes d’un dénombrement par une tech-
nique de filtration nécessitent l’utilisation d’un matériel
spécifique.
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1 Membrane filtrante et aspect microscopique du réseau tridimensionnel d’une membrane de cellulose
L’ATPmétrie
L’ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l’ATP (Adénosine triphosphate), molécule de
stockage d’énergie présente dans les organismes vivants.
La technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant une
quantité d’ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise et mesurée par un luminomètre
(valeur obtenue en Unité Relative de Lumière (URL) :
luciférase Mg2+
ATP + luciférine + O2 AMP + PPi + oxyluciférine + lumière
On distingue trois sources d’ATP au niveau des prélèvements à analyser :
-- ATP d’origine microbienne, provenant des bactéries, des levures ou des moisissures ;
-- ATP dit « somatique », provenant de cellules d’êtres vivants (lait, sang, muscle, végétaux,…) ;
-- ATP extracellulaire, provenant de débris de micro-organismes ou de cellules somatiques. Cet ATP
est rapidement dégradé dans le milieu extérieur.
Le problème des opérations de nettoyage et de désinfection dans les bio-industries est celui de l’hy-
giène. Le nettoyage et la désinfection sont donc des étapes primordiales de la fabrication. Appliqué
ainsi au nettoyage-désinfection, le dosage de l’ATP sur les surfaces ou les eaux de rinçage permet la
détection de résidus organiques vivants (résidus alimentaires) et de développement microbien :
-- si de l’ATP est détecté sur une surface ou dans un liquide, c’est qu’il y a présence de cellules
vivantes ;
-- dans le cas d’ATP microbien, la présence de micro-organismes représente un risque direct
puisqu’il peut y avoir contamination des produits ;
-- en revanche, si l’ATP est d’origine somatique, c’est qu’il reste des débris organiques sur la
surface ; ceux-ci peuvent servir de support de croissance pour des micro-organismes, ce qui
constitue un risque indirect pour les produits.
57
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
1.1.2. Un système de filtration taille des colonies observées après 24 à 48 heures d’incu-
L’unité ou rampe de filtration (document 2 ) comporte bation reste inférieure à celle de colonies qui se dévelop-
un socle grillagé stérilisable sur lequel on dépose dans peraient directement sur le milieu gélosé.
un premier temps la membrane filtrante, puis dans un
second temps un godet (entonnoir) stérilisable dans le- 1.2. Exploitation des résultats
quel on verse le volume de produit à analyser. Le tout
est relié à une pompe à vide qui permet de faire passer Le nombre de colonies suspectes sur la membrane (colo-
rapidement le volume de produit à analyser à travers la nies présentant les caractères biochimiques caractéris-
membrane. Le liquide filtré, débarrassé des bactéries, est tiques de la flore recherchée en fonction du milieu uti-
collecté dans un récipient « poubelle » pour être éliminé. lisé) permet de calculer la concentration bactérienne N
en nombre d’Unité Formant Colonies (UFC) par mL
1.1.3. Des milieux de culture selon la formule :
La membrane est ensuite déposée sur une gélose nutri-
tive adaptée au type de flore recherchée et l’ensemble est N UFC/mL = n
v
mis à incuber (document 3 ). Les milieux utilisés sont
le plus souvent sélectifs : ils permettent le développe- n nombre d’UFC sur la membrane
ment de la flore recherchée en inhibant (au mieux) les V volume de produit filtré (en mL)
autres flores (dites flores contaminantes). Ils sont aussi
Dans l’analyse microbiologique des eaux, les normes im-
souvent discriminatifs (différentiels) : ils permettent de
posent de filtrer 100 mL d’eau à analyser et le résultat est
mettre en évidence un (des) caractère(s) biochimique(s)
rendu en UFC pour 100 mL. Il n’y a donc pas de calcul
caractéristique(s) de la flore recherchée.
à faire : le résultat correspond directement au nombre de
Les nutriments diffusent au travers de la membrane et
colonies sur la membrane.
les colonies se développent directement à sa surface. La
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2 Unité et rampe de filtration pour analyse microbiologique
Couvercle de l’entonnoir
Entonnoir de 250 ml
Branchement du tuyau
valve
Flacon récepteur «poubelle»
rampe de filtration
poubelle pompe à vide
3 Exemples de milieux utilisés dans les techniques de filtration sur membrane
59
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
2.3. Exploitation des résultats Exemple : cinq dilutions ont été ensemencées à raison
de trois essais par dilution ; trois combinaisons (de
2.3.1. Dénombrement à un seul essai trois��������������������������������������������������
chiffres)
�������������������������������������������������
sont possibles avec les résultats obte-
Ce dénombrement s’effectue sans recourir aux tables nus (tableau 5 ). Parmi les trois combinaisons de trois
de Mac Grady. On ensemence 1 tube par dilution avec chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le
1 mL d’inoculum. nombre le plus élevé et inférieur à 330 est sélectionné ;
Exemple de résultats : dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont
Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4 insuffisantes, on peut être amené à utiliser des nombres
caractéristiques comme 333, 332 ou 331.
Résultats + + + - -
-- il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum Lecture du NPP (Nombre le Plus Probable)
(1 mL) de la plus grande dilution (10-2) présentant en- dans la table statistique de Mac Grady
core un trouble : la concentration est donc d’au moins On reporte le nombre caractéristique de la série dans une
102 micro-organismes par mL de produit ou de « sus- table statistique de Mac Grady.
pension mère » non dilués ; On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de micro-
-- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum organismes présents dans l’inoculum de la dilution cor-
(1 mL) de la première dilution (10-3) ne présentant respondant au chiffre des centaines du nombre caracté-
plus de trouble : la concentration est donc strictement ristique.
inférieure à 103 micro-organismes par mL de produit Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie
ou de « suspension mère » non dilués. qu’il y a statistiquement quinze������������������������
�����������������������
bactéries dans l’inocu-
On peut exprimer le résultat selon l’intervalle : lum de la dilution 10-(n+1). D’après les limites de confiance
102 ≤ Nmicro-organismes/mL < 103 données par certaines tables, cette valeur numérique de
La concentration du produit analysé est comprise entre 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38
102 et 103 micro-organismes dans 1 mL. avec une probabilité de 95�������������������������������
%, entre
���������������������������
2 et 52 avec une pro-
babilité de 99 %.
2.3.2. Dénombrement à essais multiples
Ce dénombrement s’effectue en utilisant les tables de Expression du résultat
Mac Grady (document 6 ).
Mise en place du nombre caractéristique
Le nombre caractéristique de la série réalisée est une nombre de micro-organismes par mL de produit
combinaison de trois chiffres : N
NPP x k analysé ou de « suspension mère »
-- chaque chiffre correspond au nombre de tubes « posi-
NPP nombre lu dans la table
tifs » pour une dilution donnée ;
-- les trois chiffres correspondent à trois dilutions suc- facteur de la dilution correspondant au chiffre des cen-
k
cessives ; taines du nombre caractéristique (combinaison retenue)
-- le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilu- V volume de l’inoculum (1 mL en général)
tion (donc à la plus forte concentration en micro-orga-
Si le produit analysé est solide, on prépare une ���������
« �������
suspen-
nismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire
sion mère » de produit en introduisant « �������������
���������������
x������������
» ���������
g de pro-
et celui des unités à la plus grande dilution.
duit dans « 9 x » mL de diluant. Cela correspond à une
Parmi les différentes combinaisons, on choisit celle cor-
dilution au 1/10e du produit. Le nombre de micro-orga-
respondant au nombre le plus grand et, si possible, infé-
nismes par g de produit analysé est donc N x 10.
rieur à 330 (correspond à une meilleure répartition des
micro-organismes dans les dilutions).
60
5 Mise en place du nombre caractéristique
Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de tubes + 3 3 2 1 0
Combinaison possible 3 3 2
Combinaison possible 3 2 1
Combinaison possible 2 1 0
61
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
62
Dénombrement en microméthode des entérocoques
Pour l’analyse des eaux, il existe des microplaques de 96 puits permettant de dénombrer les Enterococcus selon le principe du NPP
(d’autres microplaques permettent de dénombrer E. coli). La microplaque MUD/SF permet de réaliser le dénombrement des entéro-
coques dans les eaux, suivant la méthode NF EN ISO 7899-1-
Les entérocoques (E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae), représentant 70 à 100 % des « streptocoques fécaux », sont de bons
indicateurs de contamination fécale ancienne.
Le principe de ce dénombrement repose sur la mise en évidence des entérocoques par la détection d’une de leur enzyme spécifique, la
β-glucosidase, dont le substrat (4-méthylumbelliféryl-β-D-glucopyranoside ou MUD) est déshydraté dans les cupules de la microplaque.
En présence de l’enzyme le substrat libère un composé fluorescent révélé dans l’UV. Le milieu de culture est déshydraté et fixé au fond
des puits de la microplaque.
La réhydratation du milieu se réalise lorsque l’eau à analyser est introduite dans les puits. Les entérocoques (éventuellement présents
dans l’inoculum) hydrolysent le MUD en 4-méthylumbelliférone et en glucose. La production de 4-méthylumbelliférone, composé à fluores-
cence bleue, est observée à l’aide d’une lampe UV proche du visible, à 366 nm.
De plus, la composition du milieu, à teneur élevée en peptone et en galactose, permet une excellente récupération des entérocoques.
Le milieu contient aussi de l’acide nalidixique et de l’acétate de thallium qui assurent l’inhibition de la presque totalité de la microflore
contaminante. L’incubation à 44 °C permet aussi d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes de la microflore secon-
daire. Ainsi, toutes ces conditions sélectives de culture ne permettent que la croissance des entérocoques.
Une analyse statistique fondée sur la loi de Poisson permet, une fois la lecture faite, de dénombrer les entérocoques présents dans
l’échantillon en fonction du nombre de puits fluorescents obtenus par dilution testée.
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Échantillon à
analyser
Dilutions de
raison 1/10 1/10 1/100 1/1000 1/10 000 1/100 000
réalisées dans
des tubes
contenant 9 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
de diluant stérile
Culture
63
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
5 15,21
6 25,00
Dans un quadrant choisi (A ou B) on dénombre les colonies de la périphérie vers le centre et sur un nombre de secteurs suffisants pour
compter au moins 20 colonies. On répète ce comptage sur le même nombre de secteurs dans le quadrant opposé.
On calcule ensuite la concentration en micro-organismes de l’échantillon :
-- en additionnant les deux comptages ;
-- en ramenant ce nombre d’UFC au volume déposé dans les secteurs dénombrés ;
-- en prenant en considération une dilution préalable du produit analysé.
--
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
B A B A
6
5
6
4
5
3
4
2
3
1
2
1
A B A B
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
21 colonies comptées sur les secteurs 1 à 4 du 15 colonies sur le nombre de secteurs équiva-
quadrant B en haut à gauche. lent dans le quadrant B en bas à droite.
Dans notre exemple, le volume correspondant aux secteurs 1 à 4 des deux quadrants B opposés est de 9 µL (mode spiral exponentiel
de 50 µL) et le produit à analyser a été préalablement dilué au 1/10e avant ensemencement.
nombre total de colonies x k = (21+15) x 10
C= = 4,00.104 UFC.mL-1
Vsecteur 900.10-3
64
4. DÉNOMBREMENT PAR
OBSERVATION DIRECTE
8 Un hématimètre de Malassez
La numération cellulaire peut être réalisée par comptage
au microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale
ou cellule de numération ou hématimètre. Cette tech-
nique ayant déjà été décrite dans l’ouvrage de Première2,
voici les principales informations à retenir.
• Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée,
il est nécessaire de réaliser une dilution préalable de
façon à permettre le comptage des cellules au micros-
cope.
• Le comptage se fait grâce à un hématimètre, épaisse
lame en verre dont le plateau central comporte un qua-
drillage spécifique gravé (document 8 ).
• Le volume de comptage est déterminé par :
-- la surface du quadrillage gravé sur la lame ;
-- la profondeur de la chambre : hauteur entre le plan-
cher de la plate-forme centrale et la face inférieure de
la lamelle optiquement plane. 9 Quadrillage d'un hématimètre de Malassez
• Remplissage de l’hématimètre :
-- faire adhérer parfaitement la lamelle optiquement
plane aux plateaux latéraux ;
-- remplir complètement la chambre de comptage avec
la suspension cellulaire préalablement homogénéisée.
Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans
bulles d’air et sans faire déborder le liquide dans les
rigoles. L’hématimètre doit toujours rester « à plat »
pour éviter une mauvaise répartition des cellules sur
le quadrillage ;
-- laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage
quelques minutes.
• Numération au microscope (objectif X 40 en général) :
-- vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à
compter (si la répartition est mauvaise, recommencer) ;
-- compter les cellules contenues sur une surface donnée
donc un volume donné ; le nombre de cellules comp-
tées doit être compris entre 200 et 500 cellules pour
être statistiquement correct.
• Prévoir une décontamination et un rinçage de l’héma-
timètre après comptage.
• Calcul de la concentration cellulaire :
n×k
N=
V
n nombre de cellules comptées
V volume de comptage (L ou mL)
k facteur de dilution
N nombre de cellules par litre (ou
mL)
65
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
Il existe deux types de colorants utilisables lors d’une recherche de viabilité réalisée en hématimètre.
• Les colorants vitaux ou d’inclusion, qui colorent les cellules vivantes. Un colorant vital est une substance qui met en évidence une
structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de la cellule. Pour cela, il faut que le colorant soit utilisé à concentration
relativement faible et qu’un élément cellulaire soit capable de l’accumuler. Le rouge neutre, par exemple, est un colorant cationique
qui diffuse rapidement à travers la membrane plasmique et se concentre dans les vacuoles (cellules végétales) et les lysosomes. Sa
concentration intracellulaire peut être 100 à 1 000 fois plus importante que la concentration extracellulaire. Les cellules vivantes
sont donc rouges et les cellules mortes sont incolores.
• Les colorants supravitaux ou d’exclusion, qui colorent les cellules mortes. Il existe deux explications concernant la coloration diffé-
rentielle des cellules mortes et vivantes à l’aide de ce type de colorant :
–– ces colorants ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable.
Toute perturbation de l’intégrité membranaire provoquera une modification de la pénétration de ces colorants. Les cellules
vivantes n’incorporent pas ces colorants au contraire des cellules mortes (non viables) qui les incorporent et qui apparaissent
alors colorées ;
–– ces colorants ont tendance à entrer dans les cellules qu’ils rencontrent. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un méca-
nisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cel-
lules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche
au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et deviendra colorée.
Exemples de colorants d’exclusion : le bleu trypan (cancérigène), l’érythrosine B, le bleu de Funk, des colorants fluorescents comme
l’iodure de propidium ou le bromure d’éthidium. Avec le bleu trypan ou le bleu de Funk, les cellules vivantes sont incolores et les cellules
mortes sont donc bleues.
66
Le cytomètre de flux Bactiflow ALS ®
But recherché : passage d’une méthode traditionnelle lente à une méthode alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage
du produit fini en industrie agro-alimentaire (mise plus rapide sur le marché de produit à DLC courte, augmentation de la production en
flux tendu).
67
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
ACTIVITÉ 1
DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION URINAIRE
68
3.3. Indiquer, en le justifiant, le nom donné à la
concentration en antibiotique obtenue dans la gélose Lame gélosée
1
à la limite entre croissance et absence de croissance.
3.4. Pourquoi le technicien mesure-t-il les diamètres
d’inhibition de la croissance autour des disques
d’antibiotique ?
3.5. Construire l’abaque de lecture pour la ticarcilline
(TIC), puis :
-- estimer la CMI de la ticarcilline pour la souche
E. coli ;
-- dire si le médecin peut prescrire la ticarcilline
pour soigner cette infection urinaire.
Face CLED
ANNEXE 1
Principales espèces bactériennes retrouvées dans les infections urinaires
• Bacilles Gram - de la famille des entérobactéries (oxydase -) : Escherichia coli (lactose +), Proteus mirabilis (lactose -),
Klebsiella spp. (lactose +).
• Bacilles Gram -, oxydase + : Pseudomonas spp.(lactose -).
• Coques Gram + : entérocoques (catalase -) et Staphylococcus saprophyticus (catalase +).
69
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
ANNEXE 2
Extrait de la notice de la galerie API 20E
1. Principe
La galerie API 20E comporte vingt microtubes microcupule
contenant des substrats déshydratés. Les microtubes
sont inoculés avec une suspension bactérienne qui
reconstitue les tests. Les réactions produites pendant
la période d’incubation se traduisent par des virages
colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs.
La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau
de lecture et l’identification est obtenue à l’aide du microtube contenant le
Catalogue Analytique (vendu par le fournisseur) ou milieu déshydraté
d’un logiciel d’identification.
70
ACTIVITÉ 2
DÉNOMBREMENT DES E. COLI DANS UNE PRÉPARATION À BASE DE VIANDE
1 Recherche et dénombrement d’E. coli dans une préparation à base de viande
71
Chapitre 3 L’eau, un composant
Dénombrement essentiel
d'une des produit
flore d'un organismes vivants
microbien
ANNEXE 1
Recherche et dénombrement des E. coli selon la norme NF EN ISO 16649-2
Introduire 10 g de préparation à base de viande dans 90 mL de tryptone-sel.
Homogénéiser après broyage. On obtient la « suspension mère ».
-1 -2
Réaliser les dilutions 10 et 10 de la « suspension mère » en tryptone-sel.
J0
ANNEXE 2
Le milieu TBX
Les sels biliaires inhibent la croissance de la majorité des micro-
organismes à Gram positif et favorisent la récupération des
Escherichia coli.
Le BCIG (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique)
est un substrat chromogène. La plupart des souches d’Escherichia
coli possédant une β-glucuronidase agissent par clivage du BCIG,
entraînant la coloration des colonies en bleu.
Il est important de noter que toutes les bactéries de l’espèce
Escherichia coli ne possèdent pas de β-glucuronidase. C’est le cas
notamment du sérotype O157:H7 qui présente donc des colonies
blanches.
L’incubation réalisée à 44 °C et impérativement limitée à 24 h
permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes
contaminants.
72
ACTIVITÉ 3
DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES DANS UNE EAU
73
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
La présence d’azide de sodium limite la croissance de toutes Alors que la prolifération des entérocoques tolérant la bile
les bactéries pourvues d’une chaîne respiratoire (flore n’est pas ralentie, la croissance des bactéries secondaires
secondaire inhibée). Les entérocoques, bactéries anaérobies d’origine non intestinale est largement inhibée par les sels
aérotolérantes donc dépourvues de chaîne respiratoire, ne biliaires. Les entérocoques hydrolysent l’esculine (glucoside)
sont pas inhibés. De plus ils réduisent le TTC en formazan qui en glucose et en esculine. L’esculine forme avec les ions
colore leurs colonies en rouge. Fer(III), un complexe noir qui diffuse dans le milieu.
Le milieu de Rothe contient du glucose, indispensable à Le milieu de Litsky est plus sélectif que le milieu de Rothe car
la croissance des entérocoques (micro-organismes pour il contient, en plus de l’azide de sodium, un second inhibiteur,
lesquels la présence de peptones ne suffit pas à la production l’éthyl violet ou cristal violet. Les quelques souches de bacilles
d’énergie), et un inhibiteur, l’azide de sodium ou azoture sporulés et coques à Gram positif autres que les entérocoques
de sodium, qui rend le milieu sélectif pour les bactéries donnant des résultats positifs en milieu de Rothe, sont inhibés
dépourvues de chaîne respiratoire dont les entérocoques. en présence d’éthyl-violet.
Le développement des entérocoques se traduit par un trouble
associé à la formation (ou non) d’une pastille violette au fond
du tube.
74
ANNEXE 1
Recherche et dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 7899-2
ANNEXE 2
Dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 9308-3
Méthode par ensemencement en milieu liquide et détermination du NPP
Réaliser une série de dilutions de l’eau à analyser en eau physiologique
J0 stérile de raison 1/10. Ensemencer trois bouillons présomptifs glucosés à
l’azoture (bouillon de Rothe) avec 1 mL d’eau analysée et de chaque dilution
réalisée. Incuber 24 h à 37 °C.
Lecture des bouillons de Rothe : considérer comme positifs les tubes pour
J1 lesquels on observe un trouble.
À partir de chaque bouillon de Rothe positif, ensemencer à l’aide d’une anse
calibrée, un bouillon confirmatif de Litsky. Incuber 24 h à 37 °C.
75
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
FICHE TECHNIQUE 1
LA FILTRATION D’UN LIQUIDE
Installer la trompe à vide et placer l’ensemble de l’appareil entre deux becs Bunsen de manière à
2
ménager une zone de travail stérile.
Séparer le godet de la base de l’unité de filtration, en déposant le godet, couvercle à l’envers, derrière
3
la zone de travail. Ne jamais passer les mains au-dessus des structures ouvertes.
4 Déposer stérilement sur le support, une membrane filtrante neuve et stérile (quadrillage vers le haut).
Replacer le godet et l’ouvrir. Déposer son couvercle à l’envers sur la paillasse, toujours derrière la
5
zone de travail pour éviter de passer les mains par-dessus.
Après avoir bien agité le liquide à analyser, le verser doucement jusqu’à la graduation adéquate.
6
Refermer le couvercle du godet.
7 . du liquide
Faire le vide sans brutalité pour ne pas briser la membrane filtrante et filtrer la totalité
8 Arrêter la filtration.
Ouvrir l’unité et rincer (trois fois) avec de l’eau stérile les parois internes du godet pour récupérer les
9
micro-organismes qui s’y seraient déposés. Filtrer après chaque rinçage.
9 . petits vides.
Sécher la membrane filtrante en effectuant plusieurs
10 Arrêter la filtration.
11 Ouvrir l’unité en déposant toujours le godet, couvercle à l’envers, derrière la zone de travail.
Prélever stérilement la membrane filtrante et la déposer sans la retourner sur une gélose nutritive.
12
Il ne doit pas y avoir de bulles d’air sous la membrane sous peine d’avoir des zones ne permettant
pas la diffusion des nutriments.
Dépôt de la
Échantillon d’H2O membrane
filtré au travers sur une boite
Membrane filtrante de la membrane contenant Incubation
sur un support (0,45 µm) le milieu. pendant 24 h
76