1. Defina y haga la diferencia entre un primer universal y un primer degenerado.

Primer degenerado: existen más tripletes o codones que aminoácidos, de forma que un
determinado aminoácido puede estar codificado por más de un triplete.
Primer universal: el mismo triplete en diferentes especies codifica para el mismo
aminoácido. La principal excepción a la universalidad es el código genético mitocondrial.

2. ¿Qué es la temperatura de melting (Tm)?

La temperatura melting o de fusión del cebador (Tm), por definición, es la temperatura a la
cual la mitad del dúplex de ADN se disocia para convertirse en monocatenario e indica la
estabilidad del dúplex. Los cebadores con temperaturas de fusión en el rango de 52-58 oC
generalmente producen los mejores resultados.
a. ¿Para realizar un PCR cuál es la utilidad de conocer esta temperatura?
En la PCR, es importante conocer esta temperatura ya que la reacción puede someterse
repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas
copias de la región blanco.
b. Como se calcula la Tm?
La ecuación más simple para calcular la Tm está dada por la Regla de Wallace:
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

3. Diseñe un par de primers manualmente para la siguiente secuencia. Tome en cuenta

todas las sugerencias vistas hasta el momento, pero trabaje con una longitud de primer
de solo 10Pb. El producto final de su trabajo debe ser los primers señalados sobre las
secuencias (5’-3’&3’-5’) y, a parte escritos de 5’ a 3’
5’-
GATAGATGAGGCCTAGACAGTTAAATCATTTTCTTAAGTGGTAGATGCAACACT
AGAATCCTG
TTCCAGGTTTTAACTTTTATGGCTCATTCTGTAACCTTCAAAAAGCTAATTCTAA
AATACAGTAG
TATGCCACACAATGGCATTTCTGTCAAGGATGGACCACATATATGACAGAGGT
CCCACACTAC
TATAATGGAGCTGAAAAATTCCTGTCACCCAGTGACATCATAGCAGTCATAAT
ATTATACACAA
TGCATTACTCATGTCTTCGTGGTGATGCTGGTGTAAACCTACTGAAATCCCACT
TGTATAAAAG
TCTAGCACATAGCATTATGTACACTACATAATACTTGATAATGATAATAAACAA
CTATGTTACT
GGTTTATGTATTTACTATCTATATTTTATCATTATTTGTGGAGGTGGAAGACAAT
G-3’

5’-
GATAGATGAG GCCTAGACAG TTAAATCATT TTCTTAAGTG GTAGATGCAA
CACTAGAATC CTGTTCCAGG TTTTAACTTT TATGGCTCAT TCTGTAACCT
TCAAAAAGCT AATTCTAAAA TACAGTAGTA TGCCACACAA TGGCATTTCT
GTCAAGGATG GACCACATAT ATGACAGAGG TCCCACACTA CTATAATGGA
GCTGAAAAAT TCCTGTCACC CAGTGACATC ATAGCAGTCA TAATATTATA
CACAATGCAT TACTCATGTC TTCGTGGTGA TGCTGGTGTA AACCTACTGA
AATCCCACTT GTATAAAAGT CTAGCACATA GCATTATGTA CACTACATAA
TACTTGATAA TGATAATAAA CAACTATGTT ACTGGTTTAT GTATTTACTA
TCTATATTTT ATCATTATTT GTGGAGGTGG AAGACAATG-3’

IMPRIMACIÓN IZQUIERDA TTCGTGGTGA

IMPRIMACIÓN DERECHA CCACCTCCAC

IMPRIMACIÓN IZQUIERDA C TTCGTGGTG

IMPRIMACIÓN DERECHA CCACCTCCAC

IMPRIMACIÓN IZQUIERDA GTCAAGGATG

IMPRIMACIÓN DERECHA AGCATCACCA

IMPRIMACIÓN IZQUIERDA TC TTCGTGGT

IMPRIMACIÓN DERECHA CCACCTCCAC
 4. Descargue la secuencia en formato FASTA de la region 16S de la alguna
enterobacteria de la base de datos NCBI

a. Usando el programa primer3 plus, disene una pareja de primers que no sea mas grande
de 1600pb.

Se utilizo la enterobacteria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2

b. Reporte y analice las Tm, longitudes de primer y porcentajes de GC con alguna
referencia que le pueda ayudar a entender si son buenos parametros para una pareja de primer.

Los primers tienen una longitud de 20Pb, una Tm de 60C, y un GC de 55%

De acuerdo a los parametros de la temperatura melting el primer para que sea optimo debe
tener una temepratura de 60C para que sea optimo.
De acuerdo al contenido de GC debe estar entre un 40-60%, asegurando la union estable entre
el primer y el ADN templado.olig

c. Para el analisis de los valores ANY, SELF, Pair End la literatura solo ayudarlo a
definir esos conceptos, pero no a entender la cuantificacion. El programa Oligoanalyzer le
permitira entender la formacion de homodimeros y heterodimeros de la pareja de primers que
escogio, analice la informacion que ofrece ese software.

Programa OligoAnalizer
Las predicciones son precisas para oligos de 8 a 60 bases de longitud, en soluciones
tamponadas neutras (pH 7 - 8) con concentraciones de cationes monovalentes (Na + ) de 1.2
M a 1.5 mM, concentraciones de cationes divalentes (Mg ++ ) de 600 mM hasta 0.01 mM, y
concentraciones de trifosfatos (dNTP) hasta 120% de la concentración de cationes divalentes.
Se supone que la concentración de oligo es significativamente mayor (al menos 6x) que la
concentración del objetivo complementario, lo cual es cierto en la mayoría de los
experimentos de biología molecular.

d. Teniendo en cuenta lo explicado en clase ¿porque es de particular interes la

amplificacion y secuenciacion de la secuencia de interes? Para apoyar su respuesta busque
un articulo cientifico relacionado con el tema.
Es de vital interes la secuenciacion de cadena de interes porque los investigadores ahora
pueden comparar largos tramos de ADN, de un millón de bases o más, de distintos individuos
rápida y económicamente. Tales comparaciones pueden generar una enorme cantidad de
información acerca de la función de la herencia en la propensión a enfermedades y en la
respuesta a las influencias ambientales. Además, la capacidad de secuenciar el genoma más
rápidamente y con mayor eficacia en función del costo crea un gran potencial para el
diagnóstico y tratamiento.
Aunque todavía falten muchos años para la secuenciación rutinaria de ADN en el consultorio
médico, algunos centros médicos grandes han comenzado a usar la secuenciación para
detectar y tratar algunas enfermedades. En el caso del cáncer, por ejemplo, es cada vez más
frecuente que los médicos puedan usar datos de secuenciación para identificar el tipo
específico de cáncer que tenga un paciente. Esto le permite al médico tomar mejores
decisiones para los tratamientos.
Los investigadores en el Programa de Enfermedades sin Diagnosticar, financiado por el
NHGRI, usan la secuenciación de ADN para tratar de identificar las causas genéticas de
enfermedades poco frecuentes. Otros investigadores están estudiando su uso en la evaluación
de recién nacidos para la detección de enfermedades y el riesgo de enfermedades.
Asimismo, en el proyecto del Atlas del Genoma del Cáncer, financiado por el NHGRI y el
Instituto Nacional del Cáncer, se está usando la secuenciación del ADN para descifrar los
detalles genómicos de unos 30 tipos de cáncer. En otro programa de los Institutos Nacionales
de la Salud se examina cómo se controla la actividad génica en diferentes tejidos, y la función
de la regulación génica en las enfermedades. En otros proyectos a gran escala, tanto en curso
como planificados, se usa la secuenciación del ADN para examinar el desarrollo de
enfermedades comunes y complejas, tales como las enfermedades del corazón y la diabetes,
y enfermedades hereditarias que causan deformidades físicas, retraso del desarrollo y
enfermedades metabólicas.
La comparación de las secuencias genómicas de distintos tipos de animales y organismos,
tales como los chimpancés y la levadura, también puede proporcionar conocimientos sobre
la biología del desarrollo y la evolución. Tambien es importante la amplificacion por que
ayuda a complementar la secuenciacion ya que su utilidad es que tras la amplificación resulta
mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una
enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre la cadena
de interes amplificada.

5. Haga un primer blast de las siguientes secuencias de primers

a. F’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
b. R’ GGTTACCTTGTTACGACTT

¿A que gen corresponde esta secuencia, cual es el tamano aproximado del fragmento a
amplificar? Teniendo en cuenta los parametros vistos en clase, ¿analice si es una buena pareja
de primers con los parametros del punto 4b y 4c?
La secuencia corresponde al gen 16S de una bacteria, el tamaño aproximado de la secuencia
a amplificar es de 1600Pb

La cadena primer es una buena secuencia ya que se encuentra dentro de los parámetros de
Tm y el contenido de GC.
La cadena primer no es tan buena secuencia ya que la Tm se encuentra por debajo de los
parámetros y no alcanza la temperatura optima que es entre 50 y 60C, aunque el contenido
de GC si se encuentra dentro de los parámetros que es entre 40 y 60%.
Hernández, C. Análisis del DNA-II: clonar, secuenciar y PCR. 1995. Disponible en:
https://www.revistanefrologia.com/es-analisis-del-dna-ii-clonar-secuenciar-articulo-
X0211699595022870