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AULAS PRÁTICAS
3º ano, 1º semestre
2013-14
EXERCÍCIO Nº 1
primer
ENZIMA (E):___________________
A C G T
____
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ntd 460 ____
____
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____
ntd 429 ____
____
____
3.1. Identifique a enzima (E) utilizada.
3.2. Por que razão se utilizaram os nucleótidos dideoxi (ddNTP) para definir a
posição do nucleótido correspondente na sequência de DNA?
A. ATG
E B S H P X B
5’ 3’
B.
KpnI
BstXI
SmaI
ClaI
ApaI
NotI
XbaI
ScaI
XhoI
HindII
EcoRI
BamHI
SpeI
PstI
BssHII
SacI
Imagine que está a tentar clonar o cDNA que codifica para a proteína X, num
vector de expressão eucariótico (pBM).
Começou por ligar um fragmento de 2Kb de DNA com extremidades EcoRI,
que corresponde ao quadro de leitura da proteína, com o vector de expressão
pBM, que anteriormente tinha sido linearizado com EcoRI.
Após transformação de células E. coli foram obtidas 5 colónias (A, B, C, D e E).
O DNA plasmídico for extraído a partir de cada uma destas colónias, e foi
digerido com as enzimas de restrição EcoRI e SalI.
Os produtos de digestão foram analisados em gel de agarose, e os resultados
do gel estão representados no diagrama seguinte:
5.1. Explique os vários padrões de restrição obtidos, e escolha o clone que
usaria (A, B, C, D e/ou E), se quisesse exprimir a proteína X numa linha celular
eucariótica.
EXERCÍCIO Nº6
A. B.
Hind III Hind III Hind III
0,3 Kb
2,7 Kb
1,6 Kb
Eco RI
fragmento Hind III
vector plasmídico
Tempo (h) 0 1 2 3 4 5 6
mRNA
gene X
biomol
mRNA
?β- actina
Tempo (h) 0 1 2 3 4 5 6
mRNA TF1
mRNA TF2
mRNA TF3
mRNA β-actina
Fig. 8 - A
1 2
Clone genómico
sonda 1 sonda 2
Fig. 8 – B
E L A E L A
8.2. Imagine que quer clonar o cDNA que codifica para este factor de
transcrição:
a) Que estadio de desenvolvimento (E, L ou A) utilizaria para gerar a sua
biblioteca de cDNA? Porquê?
Sequência do cDNA:
5’ ACGTATGATACTGGTACGTCTGTAATGCGAAAAAAAAAAAAAA 3’
sonda 3 sonda 4
E L A E L A
Resultados Resultados
esperados para a esperados para a
sonda 3 sonda 4
EXERCÍCIO Nº9
1 Wt + +++ +++
1 2 3 4 5
2 ∆1 + + +++
2 3 4 5
3 ∆2 + +++ +
1 3 4 5
4 ∆3 - - -
1 2 4 5
5 ∆4 - - -
1 2 3 5
Por outro lado foram efectuados ensaios de EMSA em que se utilizou como
sonda o elemento de resposta do factor FT1 no promotor do gene X e extractos
nucleares de células COS-7 que tinham sido transfectadas com cada um dos
mutantes de deleção. Os resultados obtidos estão representados no diagrama
seguinte:
wt ∆1 ∆2 ∆3 ∆4
shift
sonda livre
9.1. Qual o domínio de ligação ao DNA da proteina FT1? Justifique a sua
resposta.
9.3. Será que FT1 heterodimeriza com FT2 e FT3 através do mesmo domínio?
Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº10
-1560 -1175
SV Luc 6
-1175 -790
SV Luc 5
-2274 -790
SV Luc 4
-790 +1 +50
Luc 3
-2274 +1 +50
Luc 2
-2274
+1 +145
Luc 1
0 1 2 3 4 5 6 7
Actividade Luc (x de indução)
Controlo FTY
-1560 -1175
SV Luc 6
-1175 -790
SV Luc 5
-2274 -790
SV Luc 4
-790 +1 +50
3
Luc
-2274 +1 +50
Luc 2
-2274
+1 +145
1
Luc
0 5 10 15 20 25
Actividade Luc (x de indução)
Controlo 10uMDEX
BamH I
Kpn I
Sph I
Xho I
Bgl I
+1
Actividade
Luc
LUC wt +
LUC m1 -
LUC m2 +
LUC m3 -
m4 +
LUC
Sonda + + + + + + + + +
Competidor - - + - + - + - +
Extracto - F F C C I I R R
nuclear
A
CAR/PXRRE GRE EcoRV EcoRI AvrII AvrII
RGB -1874 LUC
-1839 -1697 -250 -114
-1358 -362
SmaI
RGB / SV40 LUC
SV40
DMSO
4OHT
RIF
PB
RGB
β-ACTINA
RGBCYP-152wt
-152wt
EN
Competidor
anticorpoanti-SEF
Anticorpo anti-HNF4
A capacidade de ligação das proteínas PXR e CAR aos sítios NR1 e NR2
foi avaliada por EMSA (fig.15.2).
Fig. 15.2 - Ligação das proteínas reguladoras aos elementos de resposta NR1 e
NR2. (A) EMSA com sondas oligonucleotídicas de dsDNA correspondentes às
sequências de ligação NR1 e NR2 (ver Fig.2-A). Nas reacções de binding foram
usadas proteínas RXRα, CAR e PXR traduzidas in vitro.
15.1. Sabendo que o PXR é um receptor nuclear, diga quais os domínios
estruturais que poderão fazer parte desta proteína, e qual o papel
desempenhado por eles na regulação da expressão genética.
15.2. Com base nos resultados apresentados nas figuras anteriores, responda
às perguntas seguintes: