LYMPHOPREP: Aislamiento de células mononucleares en sangre periférica por centrifugación en

gradiente de densidad.

INTRODUCCIÓN

La sangre periférica es la fuente primaria de obtención de células mononucleares (linfocitos y monocitos). El proceso
de separación de células mononucleares del resto de los elementos formes de la sangre, se basa en la diferencia de
densidad existente entre ambos (Fig. 1).
Aislamos células mononucleares de sangre periférica o PBMCs (Peripherial Blood Mononuclear Cells), utilizando un
reactivo llamado Lymphoprep para crear un gradiente de densidad.

Cuando ponemos la sangre sobre el Lymphoprep, y lo sometemos a centrifugación, se separan las distintas especies
celulares en función de su densidad. Si tenemos en cuenta que los hematíes y los granulocitos (salvo los basófilos)
tienen una densidad mayor a la del Lymphoprep, éstos caerán al fondo. Por el contrario, las células mononucleares al
tener menor densidad, quedarán por encima del Lymphoprep. Las plaquetas tienen una densidad menor que los
monocitos, por lo que flotan con el plasma, en la parte superior del tubo.

Fig. 1
Fig. 2
Plasma
1.077
(g/ml)

Nube de
Mononucleares

Buffy Coat
(Neutrófilos)
Eritrocitos

La densidad del Lymphoprep es de 1.077 g/ml, y como podemos observar en el gráfico (Fig. 1) no solo aislamos los
linfocitos sino también basófilos y los monocitos, aunque la parte mas abundante es la de linfocitos que son los que nos
interesan en esta práctica.

MUESTRA MATERIALES REACTIVOS TIEMPO

Sangre total extraída por punción venosa, - Pipetas Pasteur 3ml. - Lymphoprep.
anticoagulada con heparina o EDTA. - Tubos 10ml. - PBS (ó RPMI) 1 hora
(1 ml aprox. por alumno ) - Guantes de látex

MÉTODO

1. NOS PONEMOS LA BATA Y LOS GUANTES

2. Diluir la sangre en una proporción 1:1 de tal forma que cojamos 3ml de sangre y 3ml de PBS en un tubo de
10ml (o RPMI en condiciones de esterilidad).
3. Añadimos 3ml de Lymphoprep en un tubo de 10ml.
4. Añadimos en el tubo anterior la sangre diluida con la ayuda de una pipeta Pasteur, de modo que caiga por las
paredes del tubo con un flujo continuo. Para ello dejaremos resbalar la primera gota con el tubo inclinado
levemente para que sea más difícil que se mezclen las fases.
5. Centrifugamos durante 30’ a 2000 rpm (ó 900 g). La ecuación que relacione las rpm y las g es la siguiente:
2
g = 11.17 x r (cm) x (rpm / 1000) Æ r= radio del rotor de la centrífuga

6. Después de la centrifugación, observamos varias capas: (Fig. 2).

7. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, recogemos la nube de mononucleares con cuidado de no mezclar las
fases y de no coger Lymphoprep. OJO!!!!!!! Aspiramos con la pipeta previamente apretada antes de
introducirla en el tubo.
8. Llevamos las células a un tubo de 10ml y añadimos PBS hasta completar el tubo con el fin de lavar las células
y centrifugamos durante 10’ a 1400 rpm, para lavar y eliminar las plaquetas.
9. Decantamos el sobrenadante y resuspendemos en 1ml ó 2ml, según el tamaño del “pellet” o botón celular.

A TENER EN CUENTA:

En condiciones de esterilidad, esta técnica se realiza en cabina de flujo laminar, se suele utilizar medio de cultivo RPMI
al hacer la dilución, y los lavados suelen ser dos y también con el medio indicado. Esto es debido a que en el medio de
cultivo crecen muy bien los hongos que lo pueden contaminar (por ello suplementamos el medio con antibiótico –
antifúngico).

Actualizado el 13/01/2004 por Rebeca Moreno (T. Finnova).