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geralmente são tanques cilíndricos que apresentam ou não sistema de agitação, mas
também podem ser um simples erlenmeyer. Novos modelos de biorreatores aparecem
constantemente, de forma a melhorar a qualidade do processo dependendo do tipo de
célula a ser cultivada (bactérias, fungos, tecidos animais ou vegetais, células ou enzimas
imobilizadas, etc.) (DORAN, 1995). Ao se utilizar um biorreator, procura-se atender, se
não todos, a maioria dos requisitos listados abaixo: O recipiente onde ocorrerá o cultivo
deverá permanecer em condições assépticas durante um grande período de tempo.
Devem ser promovidas condições adequadas de agitação e areação para satisfazer as
condições metabólicas dos microrganismos, mas sem haver danificação mecânica das
células dos mesmos devido ao processo. O consumo de energia deve ser minimizado.
Deve haver um controle de temperatura e pH. Deve haver uma forma de retirar amostras
do fermentado para o controle do processo. Não deve haver perdas excessivas devido à
evaporação. Não deve haver a necessidade de uma grande quantidade de trabalhadores
para a sua operação, limpeza e manutenção do tanque de fermentação, minimizando
assim os custos com relação à mão-de-obra. Materiais mais baratos, mas que ainda
propiciam um rendimento desejado, devem ser utilizados. (STANBURY et al.,1995)
deve ser feito em pequena escala porque não seria vantajoso fazer esses testes em larga
escala, correndo o risco de perder grandes quantidades de material e ter um prejuízo
econômico (NAJAFPOUR, 2007). O processo de mudança de escala está exemplificado
esquematicamente na figura 2. Após a fase de testes em frascos de 250mL a 1L e
análise dos fatores de produção, passa-se para um biorreator de bancada com
capacidade de 1 a 2 litros, o qual é normalmente equipado com sensores de ajuste de
temperatura, pH e aeração. Isso propicia uma análise mais cuidadosa de alguns
parâmetros e um controle maior sobre o processo do que o cultivo em erlenmeyer.
Nessa etapa também deve-se observar se o processo se desenvolve melhor em batelada,
semibatelada ou contínuo. Próximo passo é o cultivo em um biorreator em escala piloto
de 100 a 1000 litros. A cada processo de aumento de escala deve-se observar se há
alguma alteração na resposta celular com relação ao rendimento do processo. Se tudo
estiver correto, a etapa final seria um biorreator de escala industrial (DORAN, 1995).
Mas ao mudar de escala laboratorial para escala industrial não ocorre somente a
mudança do tamanho em proporção. Devem-se preservar alguns parâmetros de forma a
continuar tendo um bom processo. Esses parâmetros seriam: Número de Reynolds ou
fatores de momento semelhantes. Consumo de energia constante por unidade de volume
de líquido. Velocidade da pá de agitação constante. Mistura do líquido e tempos de
recirculação semelhantes. Coeficiente volumétrico de transferência de massa constante.
2- DEFINIÇÃO DE FERMENTAÇÃO
significa qualquer processo de cultivo microbiológico que ocorre com ou sem ar. O
significado bioquímico da fermentação é o processo metabólico onde o substrato
orgânico atua como doador e como receptor final de elétrons, ocorrendo em condições
anaeróbias, mas sem a utilização de uma cadeia respiratória, como acontece na
respiração anaeróbia. (TORTORA et al., 2006) O termo fermentador também pode
gerar alguma discordância devido a esses conceitos. Ele primeiramente foi utilizado
para descrever os tanques onde ocorria o cultivo. Como a maioria dos cultivos
realizados nesses tanques era de forma aeróbica, propôs-se um novo nome para não
contradizer a definição bioquímica de fermentação. O termo biorreator então começou a
ser usado para descrever o local onde eram realizados cultivos de microrganismos em
condições aeróbicas e anaeróbicas (NAJAFPOUR, 2007). A fermentação ocorre como
uma forma de reoxidar as coenzimas reduzidas NADH e NADPH que são formados
durante a glicólise, de forma a manter o balanço de redução-oxidação dentro da célula.
Os elétrons são transferidos das coenzimas para um composto orgânico, fornecendo
NAD + e NADP+ suficientes para a continuação da glicólise. (TORTORA et al., 2006)
Durante uma fermentação, um mesmo composto orgânico pode sofrer uma oxidação ou
outras a redução dependendo do microrganismo. Por exemplo, no caso do ácido
pirúvico, ele pode sofrer uma oxidação formando ácido acético ou pode sofrer uma
redução e formar ácido láctico. (CROCOMO, 1967) O tipo de fermentação realizada vai
depender da espécie de microrganismo utilizada, do substrato que está sendo fornecido
e dos tipos de enzimas que ele possui e estão ativas. A análise do tipo de produto final
formado na fermentação também pode ser utilizada como forma de identificação de
microrganismos, realizando testes bioquímicos. A figura 3 mostra o tipo de fermentação
que segue alguns microrganismos.
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- Glicólise
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Como mostra a , a glicólise pode ser dividida em duas etapas, a fase preparatória e a
fase de pagamento. Na fase preparatória, inicialmente ocorre a fosforilação da glucose
em C-6 através da enzima hexoquinase. Para isso deve haver o gasto de uma molécula
de ATP. Há então uma conversão entre glucose-6fosfato em frutose-6-fosfato através da
fosfoexose isomerase. Após, a molécula sofre outra fosforilação, mas agora em C-1,
formando frutose-1,6-bifosfato. Essa molécula já está pronta para sofrer uma quebra em
duas moléculas de três carbonos, uma diidroxiacetona fosfato e um gliceraldeído-3-
fosfato. É nesse passo que ocorre a lise da molécula, e por isso ela se chama glicólise. A
diidroxiacetona é isomerizada em outro gliceraldeído-3-fosfato. Aqui termina a etapa de
preparação, onde a molécula de glucose é preparada com o gasto de 2 ATP, para que
depois essa energia armazenada possa gerar lucros energéticos. A fase de pagamento
inicia-se com duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato, as quais são oxidadas e
fosforiladas por fósforo inorgânico, formando 1,3bifosfoglicerato. A partir desse ponto
acontecerá a liberação de energia, onde o pagamento é feito na forma de produção de
ATP através da fosforilação à nível de substrato, diferentemente da fosforilação ligada a
respiração que ocorre na cadeia respiratória. Um dos fósforos do 1,3-bifosfoglicerato
será transferido para uma molécula de ADP através da ação da enzima fosfoglicerato
quinase, formando 3fosfoglicerato. A enzima fosfoglicerato mutase irá então fazer uma
transferência reversível do grupo fosfato do C-3 para o C-2, sendo que a transferência
ocorre em duas etapas. Primeiramente um grupo fosfato presente no sítio ativo da
enzima se liga ao C-2 do substrato, e depois o grupo fosfato em C-3 é transferido para a
enzima. Depois desse processo tem-se 2-fosfoglicerato. Essa molécula irá então sofrer
uma desidratação através da enolase, formando fosfoenolpiruvato (PEP). O PEP é uma
molécula de alto potencial de transferência do grupo fosforila, e isso ocorrerá com a
ação da enzima piruvato quinase. Esta enzima requer a presença de íons K+ e Mg2+ ou
Mn2+, e nesse ponto acontece mais uma fosforilação a nível de substrato, com a
formação de mais uma molécula de ATP por PEP. O resultado final é a formação de
piruvato. Considerando inicialmente uma molécula de glucose e desconsiderando
desvios para outras vias, a cada molécula de glucose metabolizada, tem-se no final duas
moléculas de piruvato, dois ATP e dois NADH formados.
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Essa é a via pela qual a maioria dos organismos realiza a quebra da glucose. No entanto,
alguns microrganismos procariotos utilizam a via de Entner-Doudoroff, pois não
apresentam fosfofrutoquinase-1 e não pode converter frutose-6-fosfato em frutose-1,6-
bifosfato. No entanto, a via das pentoses-fosfato (ou ciclo da hexose monofosfato) pode
ser feita ou não por esses organismos (RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001).
Inicialmente, a glucose-6-fosfato é então transformada em ácido 6fosfoglucônico por
uma enzima desidrogenase. Esse ácido é então transformado em piruvato através de
duas reações:
-HOH
H+ + NADPH
ATP
ADP
NADP+
Glucose
Glucose-6-P
Etapas 6 a 10 da glicólise
Ácido Pirúvico
GA-3P
CDGP
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Portanto, em condições anaeróbias evita-se o ciclo do ácido cítrico (exceto nos casos de
produção de metabólitos para biossíntese), e utiliza-se as vias fermentativas, as quais,
apesar de não gerar tantas moléculas de ATP como o ciclo de ácido cítrico, conseguem
reoxidar NADH suficientemente para manter o funcionamento celular. A mostra
algumas das possíveis vias de fermentação.
- Vias Fermentativas
seguir
serão
discutidas
em
maiores
detalhes
algumas
dessas
fermentações.
É possível obter etanol de três formas: por via destilatória, por via sintética (a partir de
hidrocarbonetos não saturados e de gases de petróleo e da hulha) e por via fermentativa.
A forma fermentativa é uma das mais vantajosas aqui no Brasil, pois há uma grande
disponibilidade de matéria-prima (LIMA et al., 2001).
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O processo reacional do etanol já começou a ser descrito em 1815 por Gay Lussac
através da equação: C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 G=-56000 cal/mol
(CROCOMO, 1967) O francês Luis Pasteur provou que a natureza dessa reação é
microbiana, e se realiza através de uma fermentação em condições anaeróbias (LIMA et
al., 2001). Ele observou que a presença de O2 no meio inibia a formação de etanol,
diminuindo o consumo de açúcar pela levedura e aumentando o crescimento celular.
Essa propriedade foi chamada de Efeito Pasteur. (CROCOCOMO, 1967) No entanto, o
efeito Pasteur é somente observado em culturas quimioestáticas quando a concentração
de substrato limita o crescimento ou quando o cultivo é feito na ausência de fontes de
nitrogênio (LAGUNAS et al., 1982). Lagunas e colaboradores fizeram experimentos
aeróbicos e observaram que S. cerevisiae cultivada na presença de fonte de nitrogênio
usava somente 3 a 20% do açúcar metabolizado para respiração, o restante ia para a via
fermentativa do etanol. Já leveduras cultivadas em meios sem nitrogênio utilizavam 25
a 100% dos açúcares metabolizados para respiração. No entanto, isso não significava
que ouve um aumento da respiração, mas sim uma perda da função fermentativa devido
à inativação dos sistemas de transporte de açúcares (LAGUNAS et al., 1982). Com o
avanço dos estudos, foram elucidados os mecanismos reacionais intermediários da
produção de etanol a partir de glucose. Até a formação de piruvato a reação segue
exatamente igual a glicólise. O ácido pirúvico formado é descarboxilado a acetaldeído e
dióxido de carbono. Essa etapa da reação é um processo irreversível que exige a
presença da enzima carboxilase, da coenzima difosfato de tiamina e de íons magnésio.
O acetaldeído é então reduzido a etanol através da ação da enzima desidrogenase
alcoólica, ocorrendo também nessa etapa a reoxidação de um NADH (). O conjunto de
reações que resultam na formação de álcool etílico e CO 2 à partir de um carboidrato
recebe o nome de via de Embden-Meyer-Parnas. Essa via metabólica foi demonstrada in
vitro pela primeira vez em 1950 por Koshland e Westheimer, utilizando glucose com
carbono marcado radiativamente em C1, e após o seu consumo por leveduras, verificou-
se que havia carbono radioativo na molécula de etanol, mais especificamente nodo
grupo metil (CROCOMO, 1967).
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O ácido lático foi isolado pela primeira vez a partir do leite azedo por Scheele. Pasteur
também realizou estudos com relação à fermentação láctica. Ele observou que assim
como é sempre encontrada levedura na produção de cerveja, onde o fermento promove a
conversão de açúcares em álcool e dióxido de carbono, deve haver um fermento que
produza ácido láctico - a levedura láctica - convertendo açúcares em lactato. Ele
também verificou que nessa fermentação o produto principal é o ácido láctico, mas
também é possível encontrar no caldo fermentado outros produtos como ácido butírico,
álcool e manitol, sendo que suas proporções podem variar (PASTEUR, 1857). Evitar
essas outras vias e direcionar os compostos de carbono somente para a produção de
lactato é uma forma de otimizar a sua produção.
O ácido lático pode ser produzido através da fermentação de bactérias como os bactérias
homofermentativos (Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus, L. pentosus, L. casei, L.
leichmannii, Streptococcus lactis), de fungos como leveduras e ficomicetos, e também
de algumas algas. Ele também pode ser produzido de forma sintética, através da
hidrólise da lactonitrila (LIMA et al., 2001). O ácido lático pode apresentar duas formas
esterioquímicas, devido ao carbono quiral presente. Durante a fermentação são
formadas as duas formas, formando uma mistura racêmica (PRESCOTT et al, 1959). A
fermentação ocorre em temperaturas relativamente altas e dependerá do microrganismo
utilizado. Lactobacillus delbrueckii cresce bem à temperatura de 45ºC; L. bulgaricus,
pode ser incubado em 45-50ºC; já L. pentosus, L. casei, e Streptococcus lactis podem
ser cultivados em 30ºC (PRESCOTT et al, 1959).
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A última forma de fermentação seria em meio neutro. Nesse caso não haverá produção
de etanol nem CO2, sendo acumulados glicerol e ácido pirúvico. Essa reação ainda não
está muito bem elucidada, mas é representada como: C6H12O6 CH3-CO-COOH +
CH2OH-CH2OH-CH2OH
(CROCOMO, 1967)
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Pasteur foi o primeiro pesquisador a mostrar que o álcool butílico era um produto direto
da fermentação, através dos seus experimentos da fermentação butírica do ácido lático e
do lactato de cálcio em 1861: M. Pasteur. croit pouvoir affirmer que l alcool butylique
est um produit ordinaire de la fermentation butyrique. (PRESCOTT et al., 1959). No
entanto, foi somente em 1905 que Schardinger notificou a produção de acetona através
da fermentação (JONES & WOODS, 1986). A partir de 1910, o químico Chaim
Weizmann trabalhou junto com outros pesquisadores no processo de fabricação de
borracha sintética. Para isso seriam necessários compostos como butanol e isoamil, que
seriam produzidos através de microrganismos. Em 1910 eles acharam um
microrganismo capaz de produzir butanol quando cultivado em batatas. Entre 1912 e
1914 Weizmann isolou várias culturas, as quais ele chamou de BY (e que atualmente
são classificadas como bactérias da espécie Clostridium acetobutylicum). Durante a
Primeira Guerra Mundial a Inglaterra precisou de grandes quantidades de acetona, e foi
o microrganismo isolado por Weizmann que propiciou um aumento na produção. Como
durante esse período não houve necessidade de butanol, ele foi estocado em grandes
quantidade, sendo ele posteriormente a guerra muito utilizado como solvente na
indústria automobilística (JONES & WOODS, 1986). A produção desses solventes em
escala industrial era feita antigamente na forma de batelada, usando fermentadores sem
agitação mecânica e com capacidade de 50000 a 200000 galões. Os fermentadores eram
enchidos de 90 a 95% de sua capacidade e o restante era preenchido com uma camada
gasosa de dióxido de carbono estéril. O dióxido de carbono também era borbulhado
antes e depois da inoculação para facilitar a mistura (JONES & WOODS, 1986). As
bactérias freqüentemente utilizadas para a fermentação acetona-butanol são do gênero
Clostridium. Esses microrganismos são esporulados, apresentam uma forma de bastão e
são sacarolíticos (fermentam açúcares). Devido a esses fatores o isolamento dessas
bactérias é relativamente fácil. Elas são geralmente encontradas em associação com
plantas como batatas, raízes de legumes e cereais. (JONES & WOODS, 1986). Cada
empresa que produz esses solventes pode possuir uma cepa de bactérias diferente. A
maioria dessas culturas é utilizada em processos já
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- Produção de Acetona-Butanol
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- Fermentação Butanol-isopropanólica
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- Produção de Propionato
- Produção de Propionato
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4.1- BACTÉRIAS
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danosas à célula. Em determinado momento, a população microbiana entra em fase de
morte celular (ou declínio), quando o número de mortes excede a produção de novas
células (TORTORA et al., 2006). A maioria das bactérias cresce em pH perto da
neutralidade (6,5-7,5), sendo que poucas delas (as acidófilas) conseguem crescer em pH
4. Elas podem ser cultivadas tanto em meio sólido quanto em meio líquido (TORTORA
et al., 2006).
4.2- FUNGOS
4.3- LEVEDURAS
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