PROBLEMAS DE SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS y PROTEÍNAS

BIOQUÍMICA

FUNDAMENTO TEÓRICO

La secuencia de un péptido viene determinada por el tipo de aminoácido que lo integra y

por el orden en que están ensamblados, lo que constituye la estructura primaria, que permite el
estudio de la estructura y función de una proteína.
El estudio de la secuencia consiste en etapas sucesivas de hidrólisis parciales, más o
menos dirigidas, con separación de péptidos menores y el reconocimiento individual de cada
uno de los aminoácidos integrantes de esos péptidos.
El método consta de 3 partes, cada una de las cuales se puede descomponer en varias
etapas de laboratorio.

1- Preparación de las proteínas para la secuenciación.

Rotura de todos los puentes disulfuro: Cys-S-S-Cys.
Separación y purificación de las cadenas polipeptídicas individuales, si la proteína
tuviera más de una;

2- Secuenciación de los polipéptidos.

- Análisis de la composición de aminoácidos (por hidrólisis total).
Identificación de los aminoácidos N-Terminal y C-Terminal.
- Fragmentación de la cadena polipeptídica nativa por rotura, específica o no específica,
en puntos internos, y posterior separación y secuenciación de los distintos fragmentos.

3- Organización de la estructura completa.

- Ordenación de los fragmentos peptídicos pequeños y establecimiento de la secuencia del
polipéptido original.
- Localización de los puentes disulfuro tanto en como entre las cadenas polipeptídicas.

Los problemas siguientes hacen referencia al apartado 2 del método:

Secuenciación de los polipéptidos.
Para su resolución, se adjunta al final una tabla-resumen de los principales re activos
mencionados en los enunciados y las reacciones en las que participan.
Problemas secuenciación Péptido y Proteínas

PROBLEMAS DE SECUENCIACIÓN DE PEPTIDOS y PROTEINAS.

1. Deducir la secuencia de aminoácidos en un péptido a partir de la siguiente información:

Composición: Met + Tyr + Ser + Phe + Gly + Lys + Ala.

 El reactivo de Sanger rindió a, e-diDNP-Lys como único DNP-derivado.

 El Bromuro de cianógeno rindió un péptido que hidrolizado dio Lys + homoserina, y un segundo
péptido que contenía el resto de los aminoácidos.
 El tratamiento del péptido original con carboxipeptidasa A dio lugar a la rápida liberación de
glicina
 El tratamiento con quimotripsina dio tres péptidos: • Uno
contenía Tyr + Lys + Met.
,
 El segundo, Ala + Gly.
 El tercero, Ser + Phe.

2. Un péptido que contiene cantidades equimolares de Met + Phe + Asp + Ser + Thr se trató con
BrCN. Se liberaron un péptido y un sólo aminoácido (identificado como homoserina).
El tratamiento del pentapéptido original con quimotripsina dio dos fragmentos, uno de los
cuales era significativamente más ácido que el otro. El fragmento ácido contenía metionina.
El tratamiento del pentapéptido original con carboxipeptidasa A rindió serina rápidamente,
seguida por treonina.
Deducir la secuencia del pentapéptido.

3. La reacción de. un tetrapéptido con el 2,4-dinitrofluorobenceno, seguida de hidrólisis con HCI 6 N,

produce el 2,4-dinitrofenil derivado de la valina y otros tres aminoácidos.

La hidrólisis de otra muestra del tetrapéptido con tripsina proporcionó dos dipéptido; Uno de ellos
fue reducido con LiBH4 e hidrolizado posteriormente. En el hidrolizado se encontró el
aminoalcohol correspondiente a la glicina, junto con un aminoácido que-forma un producto' de
reacción amarillo con la ninhidrina.

¿Cuál es la secuencia aminoácido posible del tetrapéptido?

 Problemas secuenciación Péptidos y Proteínas

4. Un péptido A, de composición Lys, His, Asp, G1U2, Ala, lIe, Val y Tyr, produjo 2,4-
Problemas secuenciación Péptidos y dinitrofenilaspartato, al efectuar el
Proteínas
análisis del resto N-Terminal con
_ .. ¡

2,4-dinitroflourobenceno y valina libre como primer producto de la

Carboxipeptidasa.

La digestión de A con tripsina rindió dos péptidos:

 Uno de ellos contenía Lys, Asp, Glu, Ala, y Tyr.

El otro (His, Glu, lIe Val) rindió 2,4-dinitrofelhistidina al analizar el resto N- Terminal con 2,4-
dinitroflourobenceno. La escisión de este péptido con termolisina rindió entre otros productos,
histidina libre.

A partir de A, se formaron también dos péptidos mediante hidrólisis con quimotripsina:

 Uno contenía Asp, Ala y Tyr.

 El otro contenía Lys, His, Glu2, lIe y Val.

Dedúzcase una estructura para el péptido A

5- Dedúzcase la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica, a partir de la siguiente

información:

 La hidrólisis ácida completa dio la siguiente composición de aminoácidos: .-1

Pr.o , 2 Glu, 1 Asp, 1 Arg 1 !le, 1 Phe, 1Trp.
 Por tratamiento con quimotripsina se produce lIe, un tripéptido y un tetrapéptido.
 El tripéptido tiene carga neutra, a pH 7,5, Y al tratarlo con cloruro de dansilo, seguido de
hidrólisis acida, se aislaron el derivado dansílico de Pro y cantidades equimoleculares de Glu
y Trp. .

 Al tratar el tetrapéptido con tripsina se obtuvo Phé y un tripéptido con carga

1:
. .
Negativa, a pH 7,5, que al ser tratado con fenilisotiocianato, seguido de hidrólisis
Ácida, daba el derivado correspondiente del ácido glutámico.
DETERMINACIÓN DE ENLACES OBSERVACIONES
COMPOSICIÓN DE Aa
Gln y Asn : Desaroinación
HIDROLISIS ACIDA TODOS Gln Glu+CH3
HCI 6N, al vacío, 24h Asn Asp + CH3
Trp: degradación total

IDENTIFICACION DE EXTREMOS

N- Terminal
Reactivo de Sanger Reacciona con TODOS los grupos
(1 fluoro-2,4- H2N-Rl amino-libres, aunque no ocupen la
dinitrobenceno ): DNFB posición a respecto del carbono. : Ej:
a-DNP-Cys, g-DNP-Lys
Reacción con aminas primarias.
Cloruro de Dansilo (CID) H2N-RI (Resto N-terminal del Pp y con el g-
term-Lys). ClD +pp ...•. ClDderivado
b ••••• ~¡<b Aa dailsilado
fluorescente
Libera el resto N-terminal
Reactivo de Edman Fenil- H2N-RI (derivado feniltiolúdantoínico
isotiocianato (PITC) PTH-Aa) dejando intacto el resto
de la cadena Se emplea p~a la
secuenciación automática.
H2N-RI Al calentar un Aa con un exceso
de ninlúdrina, debido al grupo a-
Ninhidrina arnino libre, da un color púrpura
Con la Prolina (irninoácido) da
color amarillo

C- Terminal

Método Enzimático
Cataliza hidrolisis secuencial del aa.
Carboxipeptidasa A Rn C-terminal, se identifica por
cromatografía
Cataliza hidrolisis secuencial del aa.
Carboxipeptidasa B Rn C-terminal, se identifica por
cromatografía
Método Químico
Reduce al Aminoácido terminal al
Borolúdruro de Litio (LiBI-4) Rn correspondiente I
Aminoalcohol.
(R-COOH ~ R-CH,OH)

FRAGMENTACIO DE LA CADENA
QUIMICA
BrCN Rx=Met Ruptura del enlace
Convierte-la Met en Homoserina
(Bromuro de Cianógeno) peptídico en el que el grupo
Aal- Met -Aa2 => Aal- Hom. + Aa2
carboxilo pertenece a la Met
ENZIMATICA
Rx-Lyso Arg Ruptura del enlace
Lys: La ruptura puede bloquearse
Tripsina peptídico en el que el grupo
con ácido maleico
carboxilo pertenece a una Lys o
Aal- Lys -Aa2 => Aal- Lys+ Aa2
Arg
Quimotripsina Rx = Phe,Tyr,Trp,Leu Aal- Phe -Aa2 '-=> Aal- Phe + .'vil
Termolisina Rx = Leu, Ile,Phe"Tyr,Trp;Val Aal-Ue -Aa2 => Aal +. ne-Aa2

Rl: Primer aminoácido de la cadena

Rn: Último aminoácido de la cadena
Rx = Aminoácido en el interior de la cadena