Facultad de Medicina Humana Francisco Baca Dejo

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ

GALLO
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

INMUNOLOGÍA

GUÍA DE PRÁCTICAS

2013-II

Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Facultad de Medicina Humana Francisco Baca Dejo

PRÁCTICA N° 07
PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INOCULACIÓN EN CONEJOS
PARA LA OBTENCIÓN DE INMUNOSUEROS.

INTRODUCCIÓN:
Un antígeno puede definirse como cualquier sustancia a la que se puede unir de forma
específica una molécula de anticuerpo.
La exposición del sistema inmunitario a los antígenos externos ponen en marcha una
serie de acontecimientos que conducen a la activación linfocitaría y a la generación de la
inmunidad humoral y de la mediada por células.
Diferentes antígenos y condiciones de inmunización llevan a respuestas que varían ,
cuantitativamente y cualitativamente , por ejemplo, diferentes antigenos estimulan de
manera preferente la producción de anticuerpos de diferentes isotipos de cadena pesada,
activan a células T que producen citocinas, o generan linfocitos T citolíticos u otros factores
de la inmunidad mediada por células. Tres factores principales influyen en la naturaleza y
magnitud de las respuestas inmunitarias: 1. El tipo de antígeno, la dosis y vía de entrada 2.
El número y tipo de células accesorias que interaccionan inicialmente con el antígeno, e
inducen la actividad linfocitaría 3. La naturaleza de los linfocitos respondedores. Los
primeros análisis de las respuestas de anticuerpos específicos frente a antígenos extraños
se iniciaron a principios del siglo XX y se centraron en los tipos de anticuerpos producidos
en personas o en animales de experimentación expuestos a bacterias o toxinas
microbianas. Los anticuerpos producidos pueden utilizarse como herramientas de
diagnóstico clínico o para investigación.

OBJETIVOS:

1 Capacitar al alumno en la preparación de antígenos para la producción de anticuerpos

2 Adiestrar al alumno en la técnica de inoculación en el conejo para producción de anticuerpos
contra diferentes antígenos.
3 Propiciar el interés del alumno en investigaciones en el área de la inmunología.

MATERIAL Y MÉTODOS

1 MATERIALES
1.1 MATERIAL BIOLÓGICO
- Conejos.
- Glóbulos rojos de los grupos sanguíneos "A", "B° y ORh+
- Glóbulos rojos de camero
- Cultivo de Salmonella typhi.
- Suero humano.

1.2 MATERIAL DE LABORATORIO

- Adyuvante completo e incompleto de Freund.
- Agar Nutritivo pH 7
- Agujas hipodérmicas N° 21,24 y 26
- Algodón
- Alcohol yodado
- Centrífuga
- Frascos de penicilina o viales estériles
- Jeringas de 1, 5 y 10 mL.
- Láminas portaobjetos
- Ligadura.
- Solución salina fisiológica estéril
- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm

2 PROCEDIMIENTO
2.1 GLÓBULOS ROJOS DEL GRUPO SANGUÍNEO "A".
Para la producción de anticuerpos anti-GR- grupos sanguíneo "A"

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1. En un frasquito con 3 mL de Citrato de sodio al 3.8% , colocar 5 mL de sangre tipo "A”

2. Lavar los Glóbulos rojos (GR) por 3 veces en solución salina fisiológica, haciendo una
suspensión al 5%, centrifugando a 2000 rpm durante 10 minutos
3. Luego de realizar el último lavado, hacer una suspensión de GR al 5% con SSF.
4. Luego inocular 0,5 mL de la suspensión por vía endovenosa en la vena marginal de la
oreja del conejo.
5. Cada 7 días sangrar al conejo a partir de la vena safena de la pata, para obtener el
suero y evaluar anticuerpos. Volver a inocular con 0.5mL de suspensión de GR del
grupo "A"
6. Repetir el paso anterior hasta completar 35 días.
7. Al término de la experiencia sangrar al conejo del corazón para obtener la mayor
cantidad de suero y evaluar anticuerpos.
8. Conservar el suero agregando azida de sodio al 1% en solución salina en proporción de
una parte por cada 10 de suero

NOTA: a. Comprobar que el conejo no tenga antígeno A. (Confrontar los glóbulos

rojos del conejo con suero anti -A)
b. Comprobar si el conejo no tiene anticuerpos anti-A. (Extraer sangre al conejo y
colocarlo en un tubo sin anticoagulante, luego centrifugar a 2000 r.p.m durante 10
minutos, obtener el suero y enfrentarlo con GR grupo A)

2.2 GLÓBULOS ROJOS DEL GRUPO SANGUÍNEO "B"

Para la producción de anticuerpos anti-GR- del grupo sanguíneo "B"
1. En un frasquito con 3 mL de Citrato de sodio al 3.8 %, colocar 5 mL de sangre tipo "B".
2. Lavar los GR por 3 veces en solución salina fisiológica, haciendo una suspensión al 5%
, centrifugando a 2000 rpm durante 10 minutos
3. Luego de realizar el último lavado, hacer una suspensión al 5% con SSF.
4. Incubar durante 5 minutos con suero anti-RH, para bloquear el antígeno D que
tuvieran los G.R
5. Luego inocular 0,5 mL de la suspensión por vía endovenosa en la vena marginal de la
oreja del conejo.
6. Cada 7 días sangrar al conejo a partir de la vena safena de la pata para obtener el
suero y evaluar anticuerpos. Volver a inocular con 0.5mL de suspensión de GR grupo
"B".
7. Repetir el paso anterior hasta completar 35 días.
8. Al término de la experiencia sangrar al conejo del corazón para obtener la mayor
cantidad de suero y evaluar anticuerpos.
9. Conservar el suero agregando azida de sodio al 1% en solución salina en proporción
de una parte por cada 10 de suero.
NOTA: a. comprobar que el conejo no tenga antígeno B.(Confrontar los glóbulos rojos
del conejo con suero anti-B )
b. comprobar si el conejo no tiene anticuerpos anti-B. (Extraer sangre al conejo, y
colocarlo en un tubo sin anticoagulante, luego centrifugar a 2000 rpm durante 10
minutos, obtener el suero y enfrentarlo con GR grupo B)

2.3 TITULACIÓN DE LOS INMUNOSUEROS ANTI-A, ANTI-B.

Los sueros serán titulados mediante el método de aglutinación (Baker y Breach, 1990).
PROCEDIMIENTO:
1. De los sueros anti-A, anti-B, anti-D obtenidos en los días 0, 7, 14, 21, 28 y 35 realizar
diluciones (1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, etc.).
2. Preparar los antígenos respectivos al 5% (GR tipo A, GR tipo B y GR tipo ORH positivo)
3. Luego enfrentar 0.2 mL de dilución con 0.2 mi de antígeno y observar aglutinación.
4. El título de anticuerpos corresponderá a la última dilución en que se observa
aglutinación.
5. Estos datos se gráficarán en relación al título de anticuerpos Vs tiempo

2.4 SUERO HUMANO

Para la producción de anticuerpos anti- suero humano
1. Obtener suero humano y hacer un pool de sueros

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Los sueros no deben tener lisis de GR, lípidos, color amarillo ictérico o estar
contaminados.
2. Centrifugar a 2000 r.p.m durante 10 minutos, para purificar el suero.
3. Colocar 2 mi de adyuvante completo de Freund en un frasco de penicilina y añadir gota
a gota 2 mi de suero. Homogenizar con una jeringa y aguja hasta hacer una crema
blanca después de añadir cada gota.
4. Continuar homogenizando hasta obtener una emulsión estable del tipo agua en aceite.
Verificar agregando suavemente una gota sobre solución salina. Sí la emulsión es
estable no se disuelve
5. Inocularen cada extremo posterior de la pata (glúteo) 0,5 mi de la emulsión.
6. A los 15 días sangrar a partir de (a vena safena de la pata para obtener suero y evaluar
anticuerpos .Volver a inocular (proceder como en los pasos 3 y 4).
Se utilizará adyuvante incompleto de Freund a partir de la segunda inoculación.
7. luego cada 7 días durante 28 días. Proceder como en el paso 5.
8. Al término de la experiencia sangrar al conejo del corazón para obtener la mayor
cantidad de suero y evaluar anticuerpos.
9. Conservar el suero agregando azida de sodio al 1% en solución salina en proporción
de una parte porcada 10 de suero.

2.4.1 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-SUERO HUMANO

Los sueros anti-suero humano serán titulados mediante la reacción de precipitación
en gel o inmunodifusión (Crowle,1962).
Luego se procederá a granear título de anticuerpos Vs tiempo

RESULTADOS:

DISCUSIÓN.

CONCLUSIONES.

CUESTIONARIO.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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