FUNFAMENTOS La energía total emitida en forma de luz es siempre menor
a la energía total absorbida y la diferencia entre ambas es En la espectroscopia de fluorescencia, las especies son disipada en forma de calor. En la mayoría de los casos la las primeras en ser excitadas mediante la absorción de un longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor fotón, desde su estado electrónico fundamental, a uno de energía- que la absorbida, sin embargo, si la radiación de los diversos estados vibratorios en el estado electrónico excitación es intensa, es posible para excitado. La molécula luego vuelve a declinar a uno de los un electrón absorber dos fotones; en esta absorción varios niveles de vibración del estado electrónico bifotónica, la longitud de onda emitida es más corta que la fundamental emitiendo un fotón en el proceso. Como las absorbida, sin embargo en ambos casos la energía total moléculas pueden decaer en cualquiera de los varios emitida es menor que la energía total absorbida. niveles vibratorios en el estado fundamental, los fotones En general las sustancias fluorescentes absorben energía emitidos tendrán entonces diferentes energías, y de este en forma de radiación electromagnética de onda corta (p modo diferentes frecuencias. ej radiación gamma, rayos x, UV, luz azul, etc), y luego la emiten nuevamente a una longitud de onda más larga, por El paquete de software (programa de computador) ejemplo dentro del espectro visible; los ejemplos más FluSpec es una herramienta educativa que contiene una notables de fluorescencia ocurren cuando la luz absorbida serie de experimentos en espectroscopia de fluorescencia se encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro - que se pueden simular bajo ciertas condiciones. El invisible al ojo humano- y la luz emitida se encuentra en la procedimiento que se debe seguir para cada uno de los región visible. experimentos a simular esta contenido también en el El mecanismo de fluorescencia típico implica tres pasos paquete de datos del programa y de la misma forma se secuenciales, llamados respectivamente absorción (1), encuentra un paquete con los resultados que se pueden disipación no radiativa (2) y emisión (3). obtener con dicho software. El ciclo completo es muy breve, transcurre en tiempos del La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, orden de los nanosegundos, por lo que puede que caracteriza a las sustancias que son capaces de considerarse prácticamente instantáneo. Es este tiempo absorber energía en forma de radiaciones tan corto lo que diferencia a la fluorescencia de otro electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en conocido fenómeno luminoso, la fosforescencia. El forma de radiación electromagnética de longitud de mecanismo de fluorescencia también se encuentra muy onda diferente.1 relacionado con el proceso de quimioluminiscencia. Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser fuentes de excitación, incluyendo el láser, fotodiodos y excitadas por diferentes tipos de radiación se lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de denominan fluoróforos. Es posible obtener una amplia mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiancia en variedad de colores por fluorescencia, dependiendo de la un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por longitud de onda que emita el compuesto fluorescente. lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el El fenómeno de fluorescencia posee numerosas monocromador de excitación o el filtro. La desventaja aplicaciones prácticas, entre las que se encuentran por de este método es que la longitud de onda de un láser ejemplo análisis en mineralogía, gemología, sensores no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de químicos (espectroscopia fluorescente), pigmentos y mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que tintas, detectores biológicos y lámparas fluorescentes. emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el * Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz contrario, un arco de xenón tiene un espectro de incidente y la luz fluorescente. emisión continuo con intensidad casi constante en el * Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz las mediciones hasta justo por encima de 200 nm. fluorescente. En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente monocromadores. Un monocromador transmite luz de esquema. La luz de una fuente de excitación pasa a una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo través de un filtro o monocromador, e incide sobre la más común de monocromador utiliza un retículo de muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por difracción; es decir, la luz colimada entra en una rejilla la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra y sale con un ángulo diferente dependiendo de la producen una fluorescencia. La luz fluorescente es longitud de onda. El monocromador puede entonces emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para fluorescente pasa a través de un segundo filtro o permitir mediciones de anisotropía se añaden dos monocromador y llega a un detector, el cual muy a filtros de polarización: uno después del monocromador menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz de excitación o filtro, y otro antes del monocromador incidente para minimizar el riesgo de que la luz de emisión o filtro. incidente reflejada o transmitida llegue al detector.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como
2. CONCEPTOS ciertas longitudes de onda, en relación con los niveles de energía implicados en una transición cuántica. Fluorescencia: Es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de Existen tres casos de interacción con la materia: radiación electromagnética y al relajarse al estado choque elástico: existe sólo un cambio en el impulso basal liberan el exceso de energía en forma de fotones. de los fotones (por ejemplo, los rayos X, la difracción Espectrofotometría de Fluorescencia: también de electrones y la difracción de neutrones); llamada espectrofotometría es un tipo choque inelástico: por ejemplo, la espectroscopia de espectroscopia electromagnética, la cual analiza la Raman; fluorescencia de una muestra. La cual consiste en absorción o emisión resonante de fotones. medir la cantidad de energía radiante que absorbe una molécula en razón a una longitud de onda incidente. 3. PROCEDIMIENTO
UN EXPERIMENTO SIMULADO CON
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Para la simulación de experimentos en
espectroscopia de fluorescencia se utilizó el programa o software educativo FluSpec que contiene una serie de experimentos que son posibles ser ESPECTROSCOPIA: desarrollados mediante un proceso de simulación. La espectroscopia o espectroscopia es el estudio de la interacción entre la radiación electromagnética y la materia, con absorción o emisión de energía radiante. En primera instancia se reconoce el programa a utilizar, y se hace Tiene aplicaciones un recorrido y explicación acerca de dicho software. Luego se asigna a uno de los experimentos que eran posibles simular. en astronomía, física, química y biología, entre otras disciplinas científicas El análisis espectral se basa en detectar la absorción o Se investigó entonces, el efecto de la excitación de longitud de onda sobre el espectro de emisión de excitación a 280, 300, emisión de radiación electromagnética a 375 y 390 nm.
De este modo se registraron los valores de longitud de onda para
los cuales en el espectro se presentaba un mayor valor de intensidad de luz.