UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

CARRERA CIENCIAS DE LA VIDA- BIOTECNOLOGÍA DE LOS RR.NN

TESIS

BARBA JOSELIN, PANOLUISA DANNY

NOVENO 1

DMQ, 20 DE OCTUBRE DEL 2019

TEMA: ANTECEDENTE, JUSTIFICACIÓN, OBJETIVOS, METODOLOGÍA

2.1 Antecedentes

El gran descubrimiento de los fitoplasmas llegó en 1967 cuando fitopatólogos y

entomólogos japoneses reportaron la presencia de microorganismos similares a
micoplasmas en plantas enfermas e insectos vectores, y la recuperación temporal de
plantas enfermas tratadas con antibióticos a base de tetraciclina (Gutiérrez-Ibáñez, Pale,
Cerda, Dávila, Melgarejo, & Gómez, 2013). Aunque los micoplasmas fueron
anteriormente asociados con enfermedades animales, en 1967 se hizo evidente que las
enfermedades proliferativas, de tipo amarillamiento, brotes grandes, escoba de bruja y
ciertas enfermedades del enanismo, no eran de origen viral (Schneider, et al., 1997).
Yoji Doi y colegas en la Universidad de Tokio, usaron la electromicroscopiá de
transmisión para descubrir estructuras que se asemejaban a micoplasmas en tejido
vegetal afectado por las presuntas infecciones virales.

Asi,́ en la década de 1980, cientif́ icos comenzaron a aislar piezas de ADN bacteriano de
plantas afectadas (Gutiérrez-Ibáñez, Pale, Cerda, Dávila, Melgarejo, & Gómez, 2013),
donde se desarrollaron técnicas de diagnóstico y se categorizó a dichos
microorganismos basándose en secuencias compartidas y otros patrones de ADN.

Por muchos años, no se dio crédito al papel crucial desempeñado por el veterinario
Kaoru Koshimizu, quien reconoció por primera vez los fitoplasmas en micrografías
electrónicas de secciones finas de plantas enanas enfermas de mora, preparadas por Y.
Doi (Crosslin, Lin, & Munyaneza, 2011). Asi,́ en el Noveno Congreso de la
Organización Internacional de Micoplasmologiá en 1992, el Equipo de Trabajo de
Fitoplasmas del Proyecto de Investigación Internacional para la Micoplasmología
Comparativa (IRPCM), adoptó el nombre trivial ‘fitoplasma’ para identificar a
procariotas que pertenecen a este grupo que afectan a plantas y para representar su
composición actual de acuerdo al Comité Internacional de Bacteriología Sistemática
Subcomité sobre Taxonomía de Mollicutes (IRPCM, 2004).

Los fitoplasmas son bacterias fitopatógenas sin pared celular que habitan los elementos
cribosos del floema en plantas hospederas y son transmitidos de una planta a otra por
insectos que se alimentan del floema pertenecientes al orden Hemiptera (Hernández-
García, Frías-Treviño, & Flores-Olivas, 2008). Son procariotas pequeños que
descendieron de bacterias ancestrales Gram- positivas con bajo contenido G+C,
posiblemente parecidos a Clostridium del linaje de Lactobacillus (Liefting, 2009).

Junto con los micoplasmas, espiroplasmas, acholeplasmas y otras bacterias carentes de

pared celular, los fitoplasmas están clasificados dentro de la clase Mollicutes. Estas
bacterias pleomórficas tienen diámetros menores a 1 μm, y genomas relativamente
pequeños (680-1600 kb) en comparación con los de sus ancestros, bacterias con pared
del grupo Bacillus/Clostridium (Li, et al., 2009).

A pesar del pequeño tamaño de su genoma cuando se lo compara con el de sus

ancestros, estos organismos conservan un metabolismo independiente que les permite
sobrevivir en entornos trans-reino, tales como el floema de las plantas y la hemolinfa de
los insectos. Esta es una propiedad única entre los microbios, sólo compartida con
algunos virus que infectan plantas u animales (Secor & Rivera, 2009).

Durante más de 40 años se consideró que los fitoplasmas no se podían propagar en

medio axénico y que dependiá n totalmente de su huésped vegetal o insecto (Liefting,
Sutherland, Ward, Paice, Weir, & Clover, 2008), excluyéndolos de los métodos de
clasificación que se aplica para los microorganismos cultivables (European and
Mediterranean Plant Protection Organization , 2013). De acuerdo a Li et al. (2019), la
incapacidad de los fitoplasmas para cumplir con los postulados de Koch restringía
severamente el entendimiento de los roles de estos organismos en enfermedades de las
plantas y en las interacciones fitoplasma/insecto/planta.
Dado que los fitoplasmas no se podiá n aislar y ser cultivados en medios artificiales, se
creó en ellos una condición especial en la cual los taxónomos le dan una categoriá de
‘Candidatus’ (Gutiérrez-Ibáñez, Pale, Cerda, Dávila, Melgarejo, & Gómez, 2013). Esta
clasificación cientif́ ica es un término formal que se coloca antes del género y la especie
de una bacteria que no puede mantenerse en una "Colección de Cultivo Bacteriológico";
es decir, el estatus de ‘Candidatus’ se usa cuando una especie o género está bien
caracterizado, pero no es cultivable artificialmente. Por este hecho, a partir del 2004 el
nombre cientif́ ico para referirse a los fitoplasmas es establecido como Candidatus
Phytoplasma (Li, et al., 2009).

El primer cultivo prolongado de un espiroplasma (tipo de fitoplasma) (Liefting J. ,

2009), fue desarrollado en Spiroplasma citri, el cual fue conseguido en un medio
moderadamente simple. Este éxito fue seguido por el cultivo de diversos
microorganismos relacionados, tal como el fitoplasma del enanismo del maíz (CSS),
que requirió un medio más complejo.

Recientemente Li et al. (2009), describieron otra metodologiá que permite cultivar en

medios líquido y sólido siete cepas de fitoplasmas que se habían mantenido por años en
plantas in vitro de Catharanthus roseus. El éxito del cultivo axénico se demostró por la
similitud en el tamaño de las colonias y la morfología con los micoplasmas, y se
confirmó con evidencia molecular de su identidad, incluyendo secuenciación y perfiles
de restricción tiṕ icos (RFLP’s).

La investigación con cultivos axénicos de fitoplasmas ofrece la posibilidad de estudiar

más a fondo la interrelación entre plantas y estos patógenos y entre plantas e insectos
vectores, llevando en última instancia a la reducción de las pérdidas en el rendimiento y
calidad en cultivos de importancia agrícola En décadas pasadas, debido a la incapacidad
para obtener cultivos puros de ningún fitoplasma, su detección e identificación para esa
época no era precisa. La presencia de síntomas característicos en plantas enfermas y la
subsecuente observación de organismos parecidos a micoplasmas en secciones
ultrafinas de plantas enfermas fueron el criterio principal usado para diagnosticar
enfermedades de posible origen fitoplasmático (Liefting, Sutherland, Ward, Paice, Weir,
& Clover, 2008). El uso de sondas moleculares tales como los anticuerpos mono y
policlonales y ADN específico de fitoplasma clonado, permitió el avance en el
diagnóstico de enfermedades fitoplásmicas (Schneider, et al., 1997). Técnicas de
diagnóstico serológico para la detección de fitoplasmas empezaron a emerger en la
década de 1980 con los métodos basados en el ensayo de inmunobsorción ligado a
enzimas (ELISA). Sin embargo, los métodos serológicos no fueron siempre lo
suficientemente sensibles para detectar varios fitoplasmas (Secor & Rivera, 2009).

Finalmente, a inicios de 1990, el análisis mediante PCR acoplada a la técnica de RFLP

facilitó la identificación precisa de diferentes cepas y especies de fitoplasmas
(Schneider et al. 1993). Inicialmente, cebadores para PCR fueron diseñados basados en
las secuencias de fragmentos de ADN fitoplásmico clonado y fueron usados para
detectar fitoplasmas especif́ icos (Crosslin, Lin, & Munyaneza, 2011). La PCR haciendo
uso de dichos cebadores facilitó la detección de pequeñas concentraciones de
fitoplasmas en plantas en las que no se detectaron fácilmente mediante ensayos
serológicos o de hibridación ADN-ADN.

Subsecuentemente, algunos grupos de investigación diseñaron cebadores de

oligonucleótidos especif́ icos para fitoplasmas, que estuvieron basados en secuencias
altamente conservadas del gen del ARNr 16S (Gutiérrez-Ibáñez, Pale, Cerda, Dávila,
Melgarejo, & Gómez, 2013).

Con el conocimiento de la secuencia conservada del gen del ADNr 16S en fitoplasmas
(Hernández-García, Frías-Treviño, & Flores-Olivas, 2008), se logró el diseño de
oligonucleótidos universales para amplificar este gen por medio de la PCR. El uso de
cebadores universales permite amplificar secuencias comunes a todos los fitoplasmas;
ejemplo de éstos se pueden mencionar a los primers R16F2/R16R2 y fu5/rU3 (Li, et al.,
2009).

Igualmente se han diseñado cebadores universales que amplifican el gen del ADNr 16S,
la región intergénica y parte del gen 23S de fitoplasmas como los primers P1/P7 (Li, et
al., 2009); y en este sentido, los primers P1/Tint inciden en todo el grupo filogenético de
los fitoplasmas, al igual que los primers R16F2n y R16R2 para la reamplificación de la
PCR anidada.

2.2 Justificación

La punta morada (PMP) es una enfermedad emergente a nivel mundial que afecta al
cultivo de papa, y que recientemente ha sido reportada en el país. Es causada por un
fitoplasma (bacteria sin pared) y es transmitida por un insecto. La enfermedad es de
muy difícil control y detección que causa pérdidas significativas de rendimiento y
calidad a nivel mundial (INIAP, 2017)

La Estación Experimental Santa Catalina del INIAP, desde los primeros reportes de
PMP en la provincia del Carchi (2013) priorizó este problema y trabajó en la
identificación del agente causal y su vector. Se han identificado a dos fitoplasmas como
agentes causales de la PMP, Candidatus Fitoplasma Aurentifolia 16SrII y Fitoplasma
Asteris 16SrIF, identificados por Caicedo et al. 2015 y Castillo et al. 2018,
respectivamente; además, se ha reportado la presencia de Bactericera cockerelli, insecto
considerado como el posible vector del fitoplasma (INIAP, 2017).

Actualmente se ha conformado un comité técnico multidisciplinario permanente

compuesto por especialistas para realizar actividades estratégicas de manera conjunta,
se están fortaleciendo alianzas interinstitucionales, que permitan realizar una
prospección de la problemática en la Sierra ecuatoriana y unir esfuerzos para evitar que
el problema siga extendiéndose a otras provincias del país y apoyar a los sitios
afectados (INIAP, 2017).

En el corto plazo se plantea la validación y simplificación de métodos de diagnóstico de

fitoplasma e insecto vector, cuantificación de la transmisión de PMP a través de la
semilla, la validación de estrategias de manejo integrado de PMP y un programa de
capacitación masivo a los diferentes actores en el manejo integrado de la enfermedad.

La implementación del programa de capacitación está constituido por un equipo técnico

multidisciplinario conformado por especialistas de los Departamentos de Protección
Vegetal, Producción de Semillas, Programa Nacional de Raíces y Tubérculos rubro
papa y el Núcleo de Transferencia de Tecnología, quienes están preparados para instruir
a Técnicos y Productores en temas de concientización de la importancia de la
enfermedad, aspectos epidemiológicos, formas de transmisión, monitoreo y la
promoción del uso de semilla de calidad, así como recomendaciones emergentes de
manejo que disminuyan las poblaciones del posible vector y se minimicen las pérdidas
(INIAP, 2017).

Este programa está dirigido a técnicos de territorio del MAG, AGROCALIDAD e

INIAP, así como a agricultores y otros actores vinculados con el cultivo de papa en la
identificación y alternativas de manejo de PMP.
La Estación Experimental Santa Catalina (EESC) del INIAP, conjuntamente con otras
entidades gubernamentales como el MAG y AGROCALIDAD trabajan arduamente
para garantiza la calidad de la semilla de papa distribuida.

Finalmente, los especialistas de Agrocalidad, están analizando rigurosamente el material

cosechado en la EESC (ciclo agrícola 2018) para descartar una posible contaminación
de la semilla y de esta manera asegurar la calidad de la misma que la estación
comercializa a los productores (INIAP, 2017).

2.3 Objetivos

2.3.1 Objetivo genreal

 Identificar molecularmente al fitoplasma causante de la punta morada de la papa

Solanum tuberosum L.

2.3.2 Objetivos específicos

 Ubicar taxonómicamente el grupo al cual pertenece el fitoplasma causante de la

punta morada de la papa Solanum tuberosum.
 Identificar los potenciales insectos vectores del fitoplasma causante de la punta
morada de la papa Solanum tuberosum.

2.4 Metodología/Propuesta de desarrollo

1. Colección de muestra de papa (Solanum tuberosum) que presenten los síntomas

de amarillamiento de foliolos, escoba de bruja, tubérculos aéreos y
enrollamiento de hojas.
2. Procesamiento de muestras se tiene que lavar con agua destilada tipo I en
condiciones totalmente asépticas y su posterior pulverización con nitrógeno
líquido.
3. La extracción de ADN total de las plantas infectadas, se llevará a cabo usando
un Kit de extracción.
4. Cuantificación y determinación de la calidad de ácidos nucleicos mediante el
espectrofotómetro Nanodrop.
5. Detección de fitoplasmas a través de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR-TR) usando cebadores universales y específicos.
6. Interpretación de resultados.
Bibliografía

INIAP. (2017). INIAP ejecuta un plan emergente frente a la presencia de Punta

Morada de la Papa en Ecuador. Retrieved from
http://www.iniap.gob.ec/pruebav3/iniap-ejecuta-un-plan-emergente-frente-a-la-
presencia-de-punta-morada-de-la-papa-en-ecuador/

Schneider, B., Marcone, C., Kampmann, M., Ragozzino, A., Lederer, W., Cousin, M.,
et al. (1997). Characterization and classification of phytoplasmas from wild and
cultivated plants by RFLP and sequence analysis of ribosomal DNA . European Journal
of Plant Pathology , 103, 675-686.

Gutiérrez-Ibáñez, A. T., Pale, J. R., Cerda, A. L., Dávila, J. F., Melgarejo, A. B., &
Gómez, O. G. (2013). Detection of Ca Lineribacter solanacearum and phytoplasma in
potato crop (Solanum tuberosum L.) in Toluca Valley. Revista Colombiana Biotecnol ,
XV (1), 145-149.

Crosslin, J., Lin, H., & Munyaneza, J. (2011). Detection of ‘Candidatus Liberibacter
Solanacearum’ in the Potato Psyllid, Bactericera cockerelli (Sulc), by Conventional and
Real-Time PCR . Southwestern Entomologist , 36 (2), 125-135.

Hernández-García, V., Frías-Treviño, G., & Flores-Olivas, A. (2008). Potato Purple

Top-Zebra Chip, Etiology and Disease Management in México. Universidad Autónoma
Agraria Antonio Narro, Departamento de Parasitología Agrícola, México.

Liefting, J. (2009). Candidatus Liberibacter solanacearum . Centro Nacional de

Referencia Fitosanitaria , Departamento de Análisis de Riesgo de Plagas , México.

Li, W., Abad, J. A., French-Monar, Rascoe, J., Wen, A., Gudmestad, N. C., et al.
(2009). Multiplex real-time PCR for detection, identi cation and quanti cation of
‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potato plants with zebra chip. Journal of
Microbiological Methods , 78, 59-65.

Secor, G. A., & Rivera, V. V. (2009). Association of ‘Candidatus Liberibacter

solanacearum’ with Zebra Chip Disease of Potato Established by Graft and Psyllid
Transmission, Electron Microscopy, and PCR. Plant Disease , 93 (6), 574-583.
European and Mediterranean Plant Protection Organization . (2013). Candidatus
Liberibacter solanacearum . Bulletin OEPP/EPPO Bulletin , 43 (2), 197-201.

Liefting, L., Sutherland, P., Ward, L., Paice, K., Weir, B., & Clover, G. (2008). A New
‘Candidatus Liberibacter’ Species Associated with Diseases of Solanaceous Crops .
Plant Disease , 93 (3), 208-214.