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GUATEMALA
PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS
PRACTICA
PRACTICA TEMA FECHA
1 EQUIPO UTILIZADO EN EL LABORATORIO DE 14/08/2012
FITOPATOLOGIA
2 TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE Y 24/08/2012
ALMACENAMIENTO
3 RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS Y SIGNOS 16/08/2012
4 ELABORACIÓN Y CONSERVACION DE MONTAJES 16/08/2012
5 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 23/08/2012
6 AISLAMIENTO DE HONGOS EN MEDIOS DE 28/08/2012
CULTIVO
7 IDENTIFICACION DE HONGOS VERDADEROS 04/09/2012
(REINO FUNGI)
8 IDENTIFICACION DE HONGOS ANAMÓRFICOS 06/09/2012
9 IDENTIFICACION DE ORGANISMOS SIMILARES A 11/09/2012
HONGOS (REINO CROMISTA)
10 AISLAMIENTO DE BACTERIAS FITOPATOGENAS 20/09/2012
11 IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS 25/09/2012
12 METODOS DE EXTRACCION DE NEMATODOS 04/10/2012
FITOPARÁSITOS
13 IDENTIFICACION DE NEMATODOS FITOPARASITOS 09/10/2012
14 TRANSMISIÓN Y RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS 25/10/2012
DE VIRUS FITOPATOGENOS
15 MONITOREO Y ELABORACION DE ESCALAS DE No se
SEVERIDAD realizará
Practica No. 1
EQUIPO UTILIZADO EN EL LABORATORIO DE FITOPATOLOGIA
Introducción
Objetivo
Materiales y Equipo
• Microscopio
• Estereoscopio
• Autoclave
• Centrifuga
• Incubadora
• Tamices
• Cámara de flujo laminar
• Licuadora
• Pinzas con punta fina
• Agujas de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Bisturí No. 22 y No. 15
• Gillettes
• Alcohol al 95% y al 70%
• Hipoclorito de sodio al 1%
• Mechero (de alcohol o gas)
• Material vegetal (hojas)
• Lactofenol azul o rojo
Introducción.
Por lo anterior, la importancia de esta práctica radica en que el estudiante pueda tener
criterios en la toma de decisión en el método de muestreo a utilizar y proceda
correctamente en el transporte y almacenamiento de las muestras en el laboratorio
para su posterior análisis.
Objetivos
Materiales y Equipo
• Bolsas plásticas
• Papel mayordomo
• Pinzas grandes
• Tijeras para podar
• Navajas o cuchillas
• Hieleras
• Marcadores permanentes
• Cubetas plásticas
• Pala pequeña (de jardinería)
• Barrenos para suelo
• GPS
• Lupa 10x
Desarrollo de la práctica
Punto de goteo
Bibliografía
Introducción
Objetivos
Materiales y Equipo
• Estereoscopio
• Pinzas con punta fina
• Pinzas grandes
• Cartulina blanca
• Material vegetal enfermo
Procedimiento:
Conteste lo siguiente:
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Practica No.4
ELABORACIÓN Y CONSERVACION DE MONTAJES
Introducción
Entre las diferentes técnicas de elaboración de montajes esta el raspado que consiste
en tomar directamente las estructuras (comúnmente hongos) del material vegetal que
se pueden observar en el tejido afectado. Por otro lado están los cortes de tejidos, esto
permite tener un panorama histológico de infección y desarrollo del patógeno, así
como también observar las estructuras importantes de identificación. Las estructuras
del raspado o el corte se colocan directamente en una solución que permite que la
muestra este hidratada y fijada. Para montajes temporales se pude usar agua
destilada, este permite observar el montaje e identificarlo en el momento. Para
montajes permanentes se puede usar lactofenol o gelatina glicerada, estos permitirán
fijar y conservar la muestra.
Objetivos
Materiales y Equipo
• Estereoscopio
• Microscopio
• Agujas de disección
• Pinzas con punta fina
• Cartulina blanca
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul y rojo
• Agua destilada
• Gelatina glicerada
• Pintauñas transparente
• Material vegetal enfermo (preferiblemente hongos)
Desarrollo de la práctica
Figura 3. Diagrama de colocación del cubreobjetos. Se debe colocar a 45° para evitar
la formación de burbujas de aire.
Cortes:
Conservación:
Conteste lo siguiente:
Bibliografía
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Introducción
Cada reactivo que se agrega al medio tiene una finalidad, puede ser nutricional,
inductora al desarrollo de cuerpos fructíferos, inhibidora y en otros casos indicadora
para los patógenos o microorganismos aislados. Es importante conocer al menos los
medios de cultivo más comunes para diagnóstico fitopatológico.
Objetivos
Materiales y Equipo
Desarrollo de la práctica
Para un 1L de medio:
Extracto de carne 3 g
Peptona 5g
Agar 15 g
Para un 1L de medio:
Papa (sólida) 250 g
Dextrosa 20 g
Agar 20 g
Para un 1L de medio:
Jugos de vegetales V8 200 ml
CaCO3 3g
Agar 20 g
Para un 1L de medio:
Peptona Proteosa No. 3 20 g
K2HPO4 1.5 g
MgSO4 . 7H2O 1.5 g
Glicerol 10 ml
Agar 15 g
Para un 1L de medio:
Extracto de levadura 10 g
Dextrosa (Glucosa) 20 g
CaCO3 20 g
Agar 15 g
Para un 1L de medio:
Peptona 2g
NaCl 5g
K2HPO4 0.3 g
Azul Bromotimol (sol. 1%) 3 ml
Dextrosa (Glucosa) 10 g
Agar 3g
Conteste lo siguiente:
1. Si se quisiera hacer los mismos medios pero en forma líquida, que haría?
2. Por qué se debe sellar las cajas petri conteniendo el medio sólido?
3. Investigue la receta para la elaboración y el uso del medio D1M, TZCA, CMA,
Agar Sabouraud.
4. Que agregaría a los medios si quisiera evitar el crecimiento de hongos
contaminantes? y de bacterias contaminantes?
5. Escriba ventajas y desventajas del uso de medio de cultivos para diagnóstico.
Bibliografía
Gonzales, M. (2003). Cultivo in vitro de ojo de gallo. Hoja técnica No. 44. CATIE.
Manejo Integrado de Plagas y Agroecología (Costa Rica) No. 67 p 91-93.
Introducción
Los hongos verdaderos son organismos que afectan diversos cultivos y son muy
variables en cuanto a su bioecología. Un hongo verdadero se puede aislar en medio
de cultivo fácilmente si este no es un parasito obligado como las royas o como las
cenicillas. En algunos casos se utilizan medios de cultivos especiales y específicos,
pero son muy costosos y el procedimiento es complicado, para efectos de diagnóstico
no es práctico.
Un hongo se puede aislar de cualquier órgano y cualquier tejido de la planta que este
afectado por este, el procedimiento es sencillo y se debe tener mucha asepsia al
momento de realizar el aislamiento. Después de aislado se purifica y se procede a
identificar el organismo. Los medios más utilizados son el PDA y el V8A, por ser los
más nutritivos que pueden inducir a una alta esporulación de los hongos en especial el
medio V8A.
Objetivo
Materiales y Equipo
• Medio PDA
• Medio V8A
• Alcohol al 95% y al 70%
• Hipoclorito de sodio al 1%
• Cajas petri pequeñas
• Vidrios de reloj
• Agua estéril
• Papel absorbente estéril
• Tijeras
• Pinzas
• Mechero
• Incubadoras
• Beaker 250ml
• Marcadores permanentes punta fina
• Material vegetal enfermo (preferiblemente hojas afectadas con hongos)
Desarrollo de la práctica:
• Selle la caja de petri e identifíquela con el tipo de medio, I.D muestra, cultivo y
fecha
• Coloque las cajas con los explantes sembrados en una incubadora a 27°C y
observe a las 48 hrs.
Purificación:
Conteste lo siguiente:
1. Por qué los explantes deben tener tejido sano al momento de cultivarlos?
2. Por qué es importante que antes de pasar los explantes, después de
desinfectar, al medio de cultivo deben estar secos? Explique la causa
3. Investigue la metodología para elaborar cultivos monospóricos de hongos
4. Investigue la metodología para conservar los cultivos de hongos purificados
5. Elabore un diagrama de flujo con el procedimiento de aislamiento y purificación
de hongos en medio de cultivo.
Bibliografía
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Introducción
Los hongos verdaderos (reino fungi) son organismos que se pueden encontrar en
cualquier cultivo causando enfermedades, en su mayoría el Phylum Ascomycota. Este
es el phylum más extenso en cuanto a agentes causales de enfermedades fungosas
en plantas. Dentro de este grupo de hongos verdaderos también se encuentra el
Phylum Basidiomycota con enfermedades como royas y carbones, además de también
encontrar los hongos macro como los champiñones, anacates, ostra, etc. El Phylum
Zygomycota y Chytridiomycota son los agentes fitopatógenos en menor proporción
dentro del grupo de hongos verdaderos. El phylum Zygomycota en su mayoría se
encuentra en el ambiente y son contaminantes, representan problemas en Post-
cosecha. Dentro del phylum Chytridiomycota el género que resalta es Olpidium spp
que es vector de virus en cultivo de melón.
Objetivos
Materiales y Equipo
• Estereoscopio
• Microscopio
• Pinzas
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul o rojo
• Agua destilada
• Material vegetal infectado con hongos verdaderos
Desarrollo de la práctica:
Conteste lo siguiente:
Bibliografia
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Cummins, G; Hiratsuka, Y. (2003). Illustrated Genera of Rust Fungi. 3rd. Edition. APS
Press. St Paul, Minnesota. 225p.
Williams, J. (2006). Simplified Identification Key for Plant Pathogenic Fungi. Extension
Plant Pathologist. University of Georgia. 11p
Practica No. 8
IDENTIFICACION DE HONGOS ANAMÓRFICOS
Introducción
Objetivos
Materiales y Equipo
• Estereoscopio
• Microscopio
• Pinzas
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul o rojo
• Agua destilada
• Material vegetal infectado con hongos anamórficos
Desarrollo de la práctica:
o Forma conidios o no
o Donde forma los conidios (conidióforos libre, acérvulos, picnidios)
o Micelio septado o cenocítico
o Forma, agrupación y coloración de las conidias
o Forma del conidióforo
o Lugar de formación de las conidias
• Fotografíe todo lo observado
• Utilice la clave de identificación de géneros proporcionada por el catedrático
Conteste lo siguiente:
Bibliografía
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Barnett, H; Hunter, B; (1999). Illustrated Genera of Imperfect Fungi. 4th Edition. APS
Press. St Paul, Minnesota. 218p
Williams, J. (2006). Simplified Identification Key for Plant Pathogenic Fungi. Extension
Plant Pathologist. University of Georgia. 11p
Practica No. 9
IDENTIFICACION DE ORGANISMOS SIMILARES A HONGOS (REINO CROMISTA)
Introducción
Los hongos cromistas son organismos parecidos a los hongos, anteriormente estaban
ubicados dentro de los Phycomycetes ahora son parte del Phylum Oomycota y se
caracterizan por tener micelio cenocítico, formar esporangios y zoosporas flageladas
en su fase asexual, y oosporas en su fase sexual. Son hongos con gran importancia
en la agricultura ya que dentro de este grupo se puede encontrar Phytophthora spp
que es un organismo que puede causar muchas perdidas económicas en diferentes
cultivos y que en altas severidades puede haber perdida total de rendimiento.
Objetivos
Materiales y Equipo
• Estereoscopio
• Microscopio
• Pinzas
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul o rojo
• Agua destilada
• Material vegetal infectado con hongos cromistas
Desarrollo de la práctica:
Bibliografia.
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Schmitthenner, A & Bhat, R. (1994). Useful Methods for Studying Phytophthora in the
Laboratory. OARDC Special Circular 143. Department of Plant Pathology. The
Ohio State University.
Practica No. 10
AISLAMIENTO DE BACTERIAS FITOPATOGENAS
Introducción
Otros organismos que afectan comúnmente a los cultivos son las bacterias
fitopatógenas. Se puede encontrar diferentes géneros de bacterias, provocando
distintas sintomatologías e infectando diversos órganos de la planta. Estos organismos
pueden causar muchas perdidas en los cultivos y su manejo es complicado. Una forma
de identificación de bacterias es através del aislamiento, purificación y caracterización
en medios de cultivo.
Es importante caracterizar los síntomas que causan las bacterias para poder dirigir el
diagnostico a estas. El aislamiento es sencillo pero se debe tener mucha asepsia en el
proceso ya que en el ambiente se encuentran gran variedad de bacterias
contaminantes y en los tejidos vegetales se pueden encontrar las bacterias endofíticas
que pueden causar confusión al momento del aislamiento. Hay ciertos métodos de
aislamiento para algunos géneros de bacteria en especifico, por ejemplo con Ralstonia
solanacearum se puede realizar el método de flujo bacteriano o con Pectobacterium
spp una inoculación en chile pimiento o papa. Los medios de cultivo más utilizados
para el aislamiento y purificación es el medio Agar Nutritivo (AN) o el medio 523,
posteriormente se utilizan otros medios diferenciales para caracterizar las bacterias.
Objetivo
Materiales y Equipo
• Medio AN
• Alcohol al 95% y al 70%
• Hipoclorito de sodio al 1%
• Agua estéril
• Cajas petri pequeñas
• Vidrios de reloj
• Varilla de vidrio
• Beakers de 100ml y 250 ml
• Tijeras
• Pinzas
• Asa
• Mechero
• Incubadoras
• Chile pimiento (fruto)
• Marcadores permanentes punta fina
• Material vegetal enfermo con bacteriosis
Desarrollo de la práctica:
Figura 10. Diagrama del metodo de flujo bacteriano para aislamiento de Ralstonia
solanacearum. Fuente: SAFRINET, 2000.
Para enterobacterias fitopatogénicas (Pectobacterium):
Conteste lo siguiente:
Bibliografía
Introducción
Objetivos
Materiales y Equipo
• Medio AN
• Medio KB
• Medio YDC
• Medio (O – F)
• KOH al 3%
• Cristal violeta
• Solución Lugol
• Alcohol al 95%
• Safranina al 1%
• Agua estéril
• Pipetas
• Aceite mineral
• H2O2
• Medios de cultivo con colonias de bacterias fitopatógenas
Desarrollo de la practica:
Por tinción:
KOH:
1 Gram (+)…………………………………………………..………..……………….. 2
1’ Gram (-)………………………………………………..……….…………..……….. 3
Investigue lo siguiente:
Bibliografía
Introducción
Objetivos
Materiales y Equipo
Desarrollo de la practica:
• Repita los pasos del método tamizado y recupere los nematodos de los últimos
dos tamices en tubos de centrifuga (puede distribuir la muestra en varios
tubos).
• Agregue a los tubos una pequeña porción de caolín (1g/50ml).
• Agite bien y proceda a centrifugar por 4 a 5 minutos.
• Con la ayuda del caolín los nematodos quedaran atrapados con el suelo al
fondo del tubo de la centrifuga.
• Descarte el sobrenadante y llene los tubos con una solución azucarada (1:1).
• Agite bien y centrifugue por 1 minuto (los nematodos no deben pasar mucho
tiempo en la solución azucarada ya que pueden plasmolizarse).
• Recupere el sobrenadante en un tamiz 500 mesh y lave con abundante agua
para eliminar la solución azucarada.
• Recupere los nematodos del tamiz en un recipiente.
Método de Incubación:
Conteste lo siguiente:
Bibliografía
Introducción
Los nematodos a pesar de lo pequeño que son, pueden causar muchos problemas en
diferentes cultivos. Estos se pueden encontrar en todos los suelos donde se cultiva y
llegan a provocar síntomas característicos como clorosis, falta de desarrollo, daños en
raíz y perdidas en rendimiento. Algunos nematodos están en constante interacción con
patógenos en suelo.
Objetivos.
Materiales y Equipo
• Estereoscopio
• Microscopio
• Cajas petri pequeñas
• Agua destilada
• Solución de Formalina Glicerina (Formalina (40% formaldehido) 10ml +
Glicerina 1ml + agua destilada 89ml)
• Material para pescar nematodos
• Soluciones con nematodos
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Bisturí #15
• Gillettes
• Aceite de inmersión
Desarrollo de la práctica:
8 Hembra vermiforme……………………………………………………………..…………..9
8’ Hembra hinchada……………………………………………………………....…………19
.
9 Estilete muy largo; región cefálica diferenciada redondeada…………..…………….10
9’ Estilete moderadamente largo a corto…………………………………..………………11
10 Cola redondeada………………………………………………………..……Benololaimus
10’ Cola con punta………………………………………………………….……Dolichodorus
15 Con escutelos…………………………………………………………………….………16
15’ Con fásmidos………………………………………………………..…………..……….17
20 Quiste redondo…………………………………………………..………………Globodera
20’ Quiste con forma de limón……………………………………..……………..Heterodera
Bibliografía.
Siddiqi, M. (2000). Tylenchida parasites of plants and insects. 2nd Edition. CABI
Publishing. London, UK. 813p.
UNL Nematology Lab. (1977). Interactive Diagnostic Key to Plant Parasitic, Freeliving
and Predaceous Nematodes. Disponible:
http://nematode.unl.edu/key/nemakey.htm
Practica No. 14
TRANSMISIÓN Y RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS DE VIRUS
FITOPATOGENOS
Introducción
Los virus fitopatógenos son entidades subcelulares que provocan ciertas distorsiones
en la fisiología de las plantas. La sintomatología que provocan estas entidades son
características, por ejemplo, mosaicos, deformaciones en hojas, enanismos, clorosis,
necrosis, entre otros. Los virus pueden trasmitirse atraves de organismos vectores
entre estos, en su mayoría insectos. También pueden transmitirse atraves de injertos,
por semillas y por polen.
Objetivo
Materiales y equipo:
Desarrollo de la práctica:
Conteste lo siguiente:
Bibliografia
Introducción
Objetivo
Materiales y Equipo
• Bolsas plásticas
• Marcadores
• Libreta de notas
• Lápiz
• Regla
• Cartulina blanca
• Cultivo afectado con enfermedad foliar
Desarrollo de la práctica:
En campo:
En laboratorio:
• Tome las hojas con el daño y colóquelas hojas sobre la cartulina blanca.
• Fotografíe cada hoja por separado (si hay 50 hojas tiene que tomar 50 fotos).
• No debe perder el orden con el que fotografío las hojas ya que se procederá a
tomar datos y cada dato debe corresponder correctamente a cada fotografía.
• Con ayuda de una regla mida el área total de cada hoja.
• Ahora mida el área de daño de cada hoja (No se olvide que cada dato debe
corresponder a cada fotografía).
• Con ayuda del programa 2Log v2.0 genere los intervalos de las escalas de
severidad.
• Coloque los intervalos (la escala) y una fotografía representando el valor del
área afectada.
• Con la escala elaborada proceda validarla en grupos de trabajo (consulte al
catedrático).
Conteste lo siguiente:
Bibliografía