Los estudios de salud humana en el campo de la biología molecular requieren el

uso de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y muestras de

proteínas. El uso exitoso de las aplicaciones posteriores disponibles se beneficiará
del uso de ADN de alta cantidad y alta calidad. Por lo tanto, la extracción de ácido
nucleico es un paso clave en los procedimientos de laboratorio necesarios para
realizar más aplicaciones de investigación molecular. Es esencial elegir un método
de extracción adecuado, y hay algunas consideraciones que deben hacerse al
evaluar las opciones disponibles. Estos pueden incluir requisitos técnicos,
eficiencia de tiempo, rentabilidad, así como muestras biológicas que se utilizarán y
sus requisitos de recolección y almacenamiento.
La sangre completa es una de las muchas fuentes diferentes disponibles para
obtener ADN genómico (ADNg), y se ha utilizado ampliamente en instalaciones de
todo el mundo. Por lo tanto, nos centraremos en los protocolos de extracción de
ADN utilizando muestras de sangre completa. Los problemas relacionados con la
recolección, el almacenamiento y la manipulación manual de muestras de sangre
entera humana escapan al alcance de esta publicación y no estarán cubiertos. Sin
embargo, son importantes y deben considerarse, ya que podrían tener un impacto
potencial en el rendimiento y el éxito de cualquier técnica de extracción de ADN
elegida.

Desarrollo inicial de ADN.

técnicas de extracción
Friedrich Miescher fue el primer científico en aislar el ADN mientras estudiaba la
composición química de las células. En 1869, utilizó leucocitos que recolectó de
las muestras en vendajes quirúrgicos frescos y realizó experimentos para purificar
y clasificar las proteínas contenidas en estas células. Durante sus experimentos,
identificó una nueva sustancia en los núcleos, a la que llamó "nucleina" .2 Luego
desarrolló dos protocolos para separar los núcleos de las células del citoplasma y
aislar este nuevo compuesto, hoy en día conocido como ADN, que difería de las
proteínas y otros Sustancias celulares. Este hallazgo científico, junto con los
protocolos de aislamiento utilizados, se publicó en 1871 en colaboración con su
mentor, Felix Hoppe-Seyler2,3. Sin embargo, solo en 1958 Meselson y Stahl3,4
desarrollaron un procedimiento de laboratorio de rutina para la extracción de ADN.
. Realizaron extracción de ADN de muestras bacterianas de Escherichia coli
utilizando un protocolo de centrifugación en gradiente de densidad de sal. Desde
entonces, las técnicas de extracción de ADN se han adaptado para realizar
extracciones en muchos tipos diferentes de fuentes biológicas.
Los métodos de extracción de ADN siguen algunos procedimientos comunes
destinados a lograr la interrupción efectiva de las células, la desnaturalización de
los complejos de nucleoproteína, la inactivación de las nucleasas y otras enzimas,
la eliminación de contaminantes biológicos y químicos, y finalmente la
precipitación del ADN.5 La mayoría de ellos siguen pasos básicos similares e
incluyen el uso de reactivos orgánicos y no orgánicos y métodos de centrifugación.
Finalmente, se han convertido en una variedad de procedimientos automatizados
y kits disponibles comercialmente1,5–7.
Inicialmente, discutiremos los protocolos y los pasos destinados a lograr la lisis
celular, la inactivación de las enzimas celulares, la desnaturalización de los
complejos celulares y la precipitación de ADN, que requieren procedimientos y / o
reactivos similares durante la extracción de ADN de muestras de sangre completa.
Las diferencias clave en los pasos destinados a eliminar los contaminantes
biológicos y químicos se resaltarán cuando analicemos cada protocolo en detalle.
Como se mencionó anteriormente, la lisis de las células es un paso común en la
mayoría de los protocolos de extracción de ADN, y comúnmente se logra mediante
el uso de detergentes y enzimas. El dodecil sulfato de sodio (SDS) y Triton ™ X-
100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) Son ejemplos de detergentes
populares utilizados para solubilizar las membranas celulares. Las enzimas
también se combinan con detergentes para apuntar a la superficie celular o
componentes citosólicos. La proteinasa K es una enzima de uso común utilizada
en varios protocolos para escindir glicoproteínas e inactivar RNasas y DNasas.
Otros desnaturalizantes como la urea, las sales de guanidinio y los caotropos
químicos tienen
También se ha utilizado para alterar las células e inactivar las enzimas celulares,
pero esto puede afectar la calidad y el rendimiento de ácido nucleico1,7–9.
La precipitación de ADN se logra al agregar altas concentraciones de sal a las
soluciones que contienen ADN, ya que los cationes de sales como el acetato de
amonio contrarrestan la repulsión causada por la carga negativa del esqueleto de
fosfato. Una mezcla de ADN y sales en presencia de solventes como el etanol
(concentraciones finales del 70% al 80%) o isopropanol (concentraciones finales
del 40% al 50%) hace que los ácidos nucleicos precipiten. Algunos protocolos
incluyen pasos de lavado con etanol al 70% para eliminar el exceso de sal del
ADN. Finalmente, los ácidos nucleicos se resuspenden en agua o tampón TE (Tris
10 mM, ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] 1 mM). 7–9 El tampón TE se usa
comúnmente para el almacenamiento de ADN a largo plazo porque evita que las
nucleasas lo dañen, inadecuado pH, metales pesados y oxidación por radicales
libres. Tris proporciona un pH seguro de 7 a 8, y el EDTA quelata los iones
divalentes utilizados en la actividad nucleasa y contrarresta el daño oxidativo de
los metales pesados.9
Principales tipos de extracción de ADN.
métodos del todo humano
muestras de sangre
La Tabla 1 muestra las principales categorías y subcategorías de métodos de
extracción de ADN de muestras de sangre completa que generalmente se utilizan
en centros de investigación en todo el mundo. Los reactivos de laboratorio
comúnmente utilizados para cada etapa del protocolo de extracción de ácido
nucleico se incluyen en esta tabla para resaltar las similitudes y diferencias entre
ellos.
Las técnicas de extracción de ADN incluidas en la Tabla 1 se analizarán con más
detalle en las siguientes secciones, junto con un breve resumen de los
antecedentes y antecedentes de la técnica. En los últimos años, algunos de estos
protocolos se han adaptado a microdispositivos que desarrollan sistemas de
análisis químico total miniaturizados o microchips de análisis genético
microfluídico7,10. Sin embargo, limitaremos el alcance de nuestra revisión a
aquellas técnicas que están disponibles para la extracción de ácido nucleico a
macroescala .
Métodos de extracción de ADN basados en soluciones.
Como se mencionó anteriormente, los protocolos basados en soluciones tienen
dos enfoques principales: 1) métodos basados en soluciones que usan solventes
orgánicos y 2) aquellos basados en una técnica de salazón. A continuación se
incluye una descripción adicional de ambos métodos.
Extracción de ADN basada en solución.
métodos que usan solventes orgánicos
Protocolos de extracción de ADN que utilizan solventes orgánicos derivados
originalmente de una serie de métodos de extracción de ARN relacionado
Métodos de extracción de ADN utilizando
sílice y matrices de sílice
Las matrices de sílice tienen propiedades únicas para la unión del ADN. Están
cargados positivamente y tienen una alta afinidad hacia la carga negativa de la
columna vertebral del ADN. Las condiciones de sal alta y el pH se logran utilizando
cationes de sodio, que se unen fuertemente al oxígeno cargado negativamente en
el esqueleto de fosfato del ADN. Los contaminantes se eliminan con una serie de
pasos de lavado, seguidos de la elución del ADN a baja fuerza iónica (pH $ 7)
utilizando tampón TE o agua destilada estéril. Los kits disponibles comercialmente
que utilizan un enfoque basado en sílice son fabricados por Clontech Laboratories,
Inc., Mountain View, CA, EE. UU. (NucleoSpin ™); MO BIO Laboratories, Inc.,
Carlsbad, CA, EE. UU. (UltraClean® BloodSpin®); QIAGEN Pty Ltd, Victoria,
Australia (QIAamp®), Promega Corporation, Fitchburg, WI, EE. UU. (Wizard®);
Epoch Life Science, Missouri City, TX, EE. UU. (EconoSpin®); y Sigma-Aldrich, St
Louis, MO, EE. UU. (GenElute ™), entre otros. En estos protocolos, las muestras
de sangre se incuban durante unos minutos con un tampón de lisis. La mayoría de
los protocolos tardan entre 40 minutos y 1 hora en completarse, produciendo altos
rendimientos de ADN con mínima contaminación1,5,7.
Una sustancia que contiene altas cantidades de sílice (hasta 94%) conocida como
kieselguhr, diatomita o tierra de diatomeas también se ha utilizado para la
purificación de ADN. Inicialmente fue descrito por Boom et al8 en 1990. Se une al
ADN en presencia de agentes caotrópicos, luego se lava con un tampón que
contiene alcohol, y finalmente el ADN se eluye en un tampón bajo en sal o agua
destilada estéril. Quantum Prep® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.)
Es un ejemplo de un producto de extracción de ADN desarrollado con tierra de
diatomeas.7
Los kits de extracción de ADN también han evolucionado, y se incorporan a
equipos semi y totalmente automatizados capaces de realizar protocolos desde la
lisis de muestras hasta algunas aplicaciones posteriores como la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), como BioRobot EZ1® Advanced (QIAGEN) y
Biomek® 4000 Estación de trabajo de automatización de laboratorio (Beckman
Coulter, Inc., Brea, CA, EE. UU.), Entre otros. Menos riesgo de error de pipeteo,
menor número de transferencias de muestras y menos tiempo de protocolo son
algunas de las ventajas de estos dispositivos. Sin embargo, deben considerarse
cuidadosamente, dado el alto costo de algunas de las opciones disponibles de
equipos. También se han incorporado a los sistemas de análisis químico total
miniaturizados, que son microchips de silicio, donde se logra la separación y
detección de purificación de ADN.

Métodos de extracción de ADN en fase sólida.

La purificación de ADN usando el enfoque de fase líquida / sólida se remonta a
1979, cuando Vogelstein y Gillespie35 usaron sílice en forma de polvo de vidrio en
su protocolo para purificar fragmentos de ADN previamente separados por
electroforesis en gel de agarosa. Los métodos de extracción en fase sólida para la
extracción de ADN a partir de muestras de sangre fueron descritos inicialmente en
1989 por McCormick, 36, quien publicó una técnica utilizando partículas insolubles
a base de sílice, químicamente similares al fenol, que interactúan con las
proteínas para permitir la purificación del ADN. Desde entonces se han
desarrollado varios procedimientos diferentes que utilizan el enfoque de extracción
de ADN líquido / sólido y se utilizan en la mayoría de los kits de extracción
disponibles comercialmente.
Estas técnicas absorberán el ADN en condiciones particulares de pH y contenido
de sal a través de cualquiera de los siguientes principios: 1) unión de hidrógeno en
presencia de un agente caotrópico a una matriz hidrófila, 2) intercambio iónico
utilizando un intercambiador de aniones en condiciones acuosas, y 3) Mecanismos
de afinidad y exclusión por tamaño.5,7 La mayoría de estos métodos siguen una
serie de pasos similares para lograr la disrupción celular, la adsorción de ADN, el
lavado de ácido nucleico y la elución final. La mayoría de las técnicas en fase
sólida usan una columna de rotación para unir ácido nucleico bajo fuerza
centrífuga. Las columnas de centrifugación están hechas de matrices de sílice,
partículas de vidrio o polvo, tierra de diatomeas o portadores de intercambio
aniónico, y estos compuestos generalmente necesitan acondicionarse utilizando
soluciones tampón a un pH específico para convertirlos en la forma química
requerida. Las células sanguíneas previamente degradadas usando tampones de
lisis particulares se aplican a las columnas y se centrifugan, y el ADN se une a la
columna ayudado por el pH y las condiciones de concentración de sal
proporcionadas por las soluciones de unión. Algunas proteínas y otros
compuestos bioquímicos también pueden unirse a la columna, y luego se eliminan
usando tampones de lavado que contienen agentes competitivos durante una
serie de pasos de lavado. El ADN finalmente se eluye en agua destilada estéril o
tampón TE1,5,7.