Edición Genética

“Obesity-associated variants within FTO form long-

range functional connections with IRX3”

Fig 0: Imagen obtenida de: [1]

 Biotecnología en Salud 2019
Taller # 2

Elaborador por:
Maria Fernanda Saavedra Grimaldo
Jose Alejandro Marulanda
Karol Andrea Arevalo
Valentina Araque Ruiz

Presentado A:
Nathalia Maria Vanessa Florez Zapata

Universidad Escuela de Ingeniería de Antioquia

Ingeniería Biomédica
Envigado-Antioquia
25/10/2019
1. Objetivo de investigación
• Demostrar la relación directa que existe entre la obesidad y la expresión del gen
homeobox IRX3.
1.2 . Experimentos realizados
1.2.1 Para trazar directamente los circuitos reguladores en regiones de ADN no codificante
(cis) dentro de la dirección genética especifica del FTO (locus), se utilizó la captura de
conformación cromosómica circular seguida de secuenciación de alto rendimiento (4C-seq).
El anterior proceso se llevó acabo en embriones de ratón completos y en cerebros de ratones
adultos, ya que el trabajo anterior sugería que la expresión de FTO cerebral armoniza los
parámetros metabólicos.
Para 4C-seq, la cromatina se digirió con DpnII y Csp6I. El ADN capturado se amplificó usando
cebadores específicos del promotor y secuenció en profundidad. El procesó se realizó para
obtener aproximadamente 10 millones de células aisladas, que se trataron con tampón de lisis
(Tris-HCl 10 mM). pH 8 y cóctel inhibidor de proteasa, Se realizaron dieciséis PCR con el
sistema Expand Long Template PCR System y se purificaron
1.2.2 Se perfilo las interacciones genómicas con promotores de genes ubicados dentro de una
ventana de 1 megabase (Mb) alrededor de los SNP asociados a la obesidad incluidos Fto y
Rpgrip1l e Irx3-.Se confirmó las interacciones entre Irx3 y la región asociada a la
obesidad Fto utilizando la captura de conformación de cromatina (3C) en cerebros de
ratones adultos. Fig 1
 Fig 1: Interacciones de largo alcance en el locus FTO-IRX3 .

El proceso 3C se llevó acabo de la siguiente manera, se procesó tejido cerebral de ratón para
obtener muestras de células individuales. Se trataron diez millones de células aisladas con
tampón de lisis, cóctel inhibidor de proteasa 1X y los núcleos se digirieron con endonucleasa
HindIII. Posteriormente, el ADN se ligó con ADN ligasa T4. Se diseñó un conjunto de
cebadores específicos. Los valores de PCR se normalizaron mediante cebadores de control
diseñados en el locus del gen Ercc3 .
1.2.3 Conservación de locus
Para evaluar el nivel de conservación de alto nivel del locus FTO-IRX5 , utilizaron elementos
y puntuaciones phastCons 40 como medida de conservación.
1.2.4 Experimentos de fenotipo metabólico
El gasto energético se evaluó mediante calorimetría indirecta (Sistema Oxymax, Columbus
Instruments) durante períodos de 24 h. Para las pruebas de tolerancia a la glucosa y la insulina,
los ratones fueron sometidos a una inyección intraperitoneal de después de ayunar durante la
noche.
1.2.5 Análisis de expresión de genes y proteínas.
El ARN total se extrajo de los tejidos grasos o el hipotálamo usando el kit de tejido lipídico
RNeasy (Qiagen), y el ADN complementario se sintetizó a partir de 2 µg de. El ensayo de
expresión génica se realizó utilizando métodos SYBR Green en Viia7 (Applied Biosystems),
y los valores de umbral de ciclo relativo (CT) se normalizaron mediante β-actina.
1.26 Estadística
Todos los resultados se expresaron como media ± sem. La significación estadística de las
diferencias entre los grupos se determinó mediante la prueba t de Student o el análisis de
varianza (ANOVA) con análisis post-hoc, Student – Newman – Keuls utilizando Sigma Stat
(SPSS).
1.2.7 Ratones
Todos los protocolos experimentales de animales aprobados por el Comité de Cuidado de
Animales del Centro de Fenogenómica de Toronto se ajustaban a los estándares del Consejo
Canadiense de Cuidado de Animales. Los ratones se mantuvieron en ciclos de luz-oscuridad
de 12 h y se les proporcionó comida y agua a voluntad.. Para los estudios de obesidad inducida
por la dieta, ratones machos de 8 semanas de edad fueron sometidos a una dieta rica en grasas
al 45% durante 10 semanas. El peso corporal se midió cada semana de 4 a 18 semanas de edad,
y la composición corporal se analizó utilizando un dispositivo EchoMRI a las 18 semanas de
edad. El índice de masa corporal (IMC) se calculó dividiendo el peso corporal (g) por la
longitud corporal (mm) al cuadrado (IMC = peso corporal / longitud corporal
Fig 2 Los ratones machos Irx3- knockout son más delgados con adiposidad reducida.Imagen
extraida de [1]

1.3 Aplicación de la tecnología

En este artículo investigativo se utiliza captura de la conformación de los cromosomas, este

método utiliza la tecnología del ADN recombinante, en donde su fin es el de hacer una nueva
posición para la cromatina en una dimensión 3-D, dejando interactuar diferentes regiones locus
(posición fija de una región del cromosoma). Hay diferentes tipos de métodos experimentales
(fig2), que varía según el tipo de interacciones que queremos evaluar o reconocer.

Fig 3: Método de captura de la conformación de los cromosomas [5]

1.4.Resultados obtenidos

➔ Las interacciones de largo alcance entre el intrón FTO asociado con la obesidad y el
IRX3 representan una característica conservada en los genomas de vertebrados. En la
Fig.1 se tiene una vista màs detallada de la asociación. Contiene las ubicaciones
ortólogas de los SNP (polimorfismo de nucleótido libre) asociados a la obesidad
(pepitas negras), la expresión endógena de Irx3 se muestra en pulmón y cerebro en Irx3
lacZ (dos imágenes superiores) y en las tres últimas se muestra tres potenciadores que
impulsan la expresión del reportero en los pulmones y el cerebro.[1]
 Fig 4: Interacciones de largo alcance en el locus IRX3 - FTO .[1]
➔ El análisis calorimétrico indirecto muestra un mayor gasto de energía en ratones Irx3:

Fig 5: Los ratones con deficiencia de Irx3 son más delgados y están protegidos contra la
obesidad inducida por la dieta.[1]

➔ La expresión hipotalámica de Irx3 regula la homeostasis energética y es un

determinante importante de la masa corporal y la composición.
➔ Los SNP asociados a la obesidad dentro de FTO están funcionalmente conectados con
la regulación de la expresión de IRX3 .[1]

1.5. Conclusiones del estudio

Los polimorfismos de un solo nucleótido asociados con la obesidad están coligados con la
expresión de IRX3 , pero no con FTO, en cerebros humanos.

Se expone un vínculo directo entre la expresión de IRX3 y la regulación de la masa corporal y

la composición mediante una reducción en el peso corporal del 25 al 30% en ratones con
carencia de Irx3 especialmente a través de la pérdida de masa grasa y el acrecentamiento de la
tasa metabólica basal con el pardeamiento del adiposo blanco

IRX3 puede tener papeles importantes que regulan el metabolismo más allá de los que
describimos asociados con la expresión de Irx3 en el hipotálamo

2. Ensayos clínicos

2.1 Tratamiento del melanoma metastásico con clones específicos de CTL Melan-A /
MART-1 autólogo

El estudio tuvo en cuenta que los melanomas HLA-A2 expresan el antígeno Melan-A / MART-
1 y son reconocidos por los linfocitos T específicos de Melan-A reactivos al tumor.[2]

Primero se usó sangre de pacientes con melanoma HLA-A2, con el objetivo de producir clones
de células T (linfocitos t) específicas para Melan-A reactivo al tumor, luego se realizó un
ensayo clínico haciendo una infusión de miles de millones de linfocitos t específicos del
paciente dentro de 3 a 6 meses después de que se haya tomado la muestra de sangre, para lograr
inducir una inmunidad pasiva contra el antígeno. Durante la producción del clon de linfocito t
el paciente se trata con deticeno por vía intravenosa durante 4 días cada mes hasta la
transfección.[2] Finalmente se realiza un seguimiento del paciente para evaluar los cambios
producidos por el tratamiento.

3. Empresas o productos basados en nuevas tecnologías

3.1. Neobona

Es un test prenatal no invasivo desarrollada por la compañía Synlab, empresa pionera en el

diagnóstico molecular prenatal. Su uso se debe aplicar después de la décima semana de
 gestación y se realiza
analizando una muestra de
sangre materna con fin de
encontrar cualquier
anomalía genética en el
feto. Usa tecnología de
última generación
secuenciación, aplicando
lecturas paired-end, esto
permite secuenciar ambos
Fig 6: Imagen obtenida de [3]. Neobona
extremos de un fragmento
de ADN además de que
generan datos de alta calidad, de esta forma se puede determinar una fracción fetal, luego se
diferencia el ADN fetal y Materno al determinar el tamaño de fragmentos, después se utiliza
un algoritmo que genera un valor conocido como Trisomy Score, para finalmente obtener
resultados confiables aunque se cuente con una baja fracción fetal.[3]

Con dicha prueba se puede detectar la trisomía 21, 13 y 18 además de conocerse el sexo del
feto. La prueba no representa ningún riesgo para la madre ni el fet. Los resultados se conocen
5 días después de ser realizado el test. [4]

Referencias

[1] Nature, “Obesity-associated variants within FTO form long-range functional

connections with IRX3”, vol. 507, pp. 371-375, 2014.

[2] B. D. Hospital de la universidad de Nantes, “Tratamiento del melanoma

metastásico con clones específicos de CTL Melan-A / MART-1 autólogo,” 2010.
https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00720031?term=cloning&rank=1.

[3] neobona, “SYNLAB QUALITY DIAGNOSTICS,” 2019.

http://www.neobona.com.co/.

[4] Synlab, “soluciones en diagnostico,” 2019. https://www.synlab-

sd.com/es/exame/nipt/.

[5] Li, G., Cai, L., Chang, H., Hong, P., Zhou, Q., Kulakova, E. V, … Ruan, Y.
(2014). Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag (ChIA-PET)
sequencing technology and application. BMC Genomics, 15(12), S11.
https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-S12-S11