PCR convencional y Electroforesis

Daniela Alejandra Valdez Tresierras

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas más

modernas de análisis genéticos, el objetivo de esta técnica es la amplificación in
vitro de una sección de interés de DNA de manera exponencial, logrando obtener
varios millones de veces la misma sección de DNA, con la finalidad de reproducir
cantidad suficiente de dicha sección para su evaluación. Cuando se realiza una
reacción de PCR lo que sucede es la simulación de la síntesis de DNA que sucede
dentro de las células. Para llevar a cabo esta técnica es necesario contar
principalmente con un termociclador, aparato que sirve para calentar o enfriar a
temperaturas muy precisas, además también se necesitan microtubos, placas de
PCR, micropipetas, agua bidestilada y hielos para mantener los reactivos a bajas
temperaturas, además también se necesita conocer, al menos parcialmente, la
secuencia del fragmento de DNA a amplificar. Tras la extracción del DNA de interés
a partir de un tejido se trata de disponer en un microtubo, además de añadir también
en el mismo tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para la
DNA polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos es crucial dado que han de
delimitar la región a amplificar. En el mismo tubo también se mezclan dinucleótidos
(dNTPs) y se establecen las condiciones para que la enzima polimerasa trabaje
adecuadamente. Una vez que todos los componentes necesarios están mezclados
en el tubo, se tiene que favorecer la síntesis de DNA, por lo que se procede a
introducir el tubo en un termociclador, y es aquí, dentro del termociclador, donde
ocurre la amplificación del DNA y consta de tres etapas: desnaturalización,
alineamiento y extensión. Estas tres etapas en conjunto conforman un ciclo de PCR,
y la técnica consta de 25 a 35 ciclos. Lo primero que ocurre en el termociclador es
que calienta o enfría el tubo a tres temperaturas distintas que se repiten una y otra
vez (conocido como ciclos de reacción), la primer temperatura es de 95°C: es aquí
donde ocurre la desnaturalización del DNA, donde las dobles cadenas del DNA se
abren quedando en forma de cadenas sencillas. Después el termociclador regula
por segunda vez su temperatura, pero esta vez dentro de un intervalo de 40° a 60°C:
a estas temperaturas ocurre el alineamiento, donde se forman y se rompen
constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el DNA, y
aquellas uniones más estables (las que son complementarias) durarán mayor
tiempo, quedando los oligonucleótidos alineados formando una pequeña región de
doble cadena, aquí es donde entra en acción la polimerasa, ya que se une a este
pequeño pedazo de DNA de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5´ a 3´,
al agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases
estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el
siguiente paso. Finalmente el termociclador sube la temperatura a 72°C: en este
paso ocurre la extensión del DNA, a esta temperatura la polimerasa tiene su máxima
actividad y de esta forma continua la síntesis de los fragmentos de DNA a partir de
los oligonucleótidos que ya se habían alineado. En este primer ciclo se sintetizan
los primeros fragmentos de DNA genómico, pero estos fragmentos serán más
grandes de lo esperado, ya que la polimerasa copiará hasta donde le sea posible.
Después se realiza un segundo ciclo con las mismas tres temperaturas, pero esta
vez, los oligonucleótidos, además de unirse al DNA presente desde el inicio,
también se unirán a los fragmentos recién sintetizados del primer ciclo, por lo tanto
en este ciclo la polimerasa sintetizará dos fragmentos largos copiados directamente
del DNA inicial y dos fragmentos del tamaño realmente esperado, que es el tamaño
que hay entre los dos oligonucleótidos usados. Es así como, con cada ciclo, se va
aumentando el número de fragmentos del tamaño que se esperan. Es muy
importante tener en cuenta que previamente a cada ciclo de PCR se llevan a cabo
dos etapas, una de desnaturalización inicial manteniendo una temperatura de 95°C
por 5 minutos, y otra etapa de extensión a una temperatura de 72°C por 10 minutos,
esto para que la enzima pueda terminar de sintetizar todos los fragmentos que
pudieran haber quedado incompletos. Para este tipo de PCR es indispensable que
uno de los oligonucleótidos tenga la misma secuencia de una de las cadenas del
DNA inicial, y el segundo oligonucleótido deberá llevar la secuencia complementaria
que estará al final del fragmento que se pretende amplificar, para que, de esta
forma, uno sea complementario de la cadena que forme el otro, de lo contrario sería
imposible amplificar el sitio que se necesita.
La electroforesis: Método para visualizar el PCR.
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla de
aplicación de un campo eléctrico donde las moléculas disueltas se desplazan en el
campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa. Ahora
bien, una vez realizada por completo la PCR, la idea es analizar los fragmentos
obtenidos, y la electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida, permite
separar estos fragmentos de acuerdo al tamaño de cada uno. Tanto la agarosa
como la acrilamida forman una especie de red con agujeros de distintos tamaños,
es por esta red donde los fragmentos de DNA son atraídos, a través de corriente
eléctrica, hacia el polo positivo, ya que la carga de una molécula de DNA es negativa
por la presencia de grupos fosfato. Los fragmentos más pequeños lograran pasar a
través de la red, mientras que los fragmentos más grandes se quedaran atorados
formando una banda en el gel. Básicamente esto es como una especie de filtración.
Una vez que los fragmentos se han separado, se puede examinar el gel y saber el
tamaño de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un
pigmento que se une al DNA y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de DNA brillan,
haciendo visible el DNA presente en distintos lugares a lo largo del gel. Cada línea
de DNA bien definida se le conoce como banda, y cada banda contiene un gran
número de fragmentos de DNA del mismo tamaño. Finalmente, al comparar una
banda en una muestra con el marcador del peso molecular, se puede determinar la
cantidad aproximada de pares de bases presentes.
Referencias
 Espinoza Asuar, L. Guía práctica sobre la técnica de PCR. Capitulo 17. Recuperado
de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/530/cap17.pdf
 Lodish, H., Berk, A. & cols. 2006. Biología Celular y Molecular 5ta edición. Editorial
Medica Panamericana. España. Pág. 87. Recuperado de
https://books.google.com.mx/books?id=YdyMSxY2LjMC&pg=PA87&dq=electrofore
sis&hl=es-
419&sa=X&ved=0ahUKEwjb1cGpgNnkAhWTr54KHeP0CS4Q6AEIOTAD#v=onep
age&q=electroforesis&f=false
 Pérez de Castro, A. M. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain
Reaction, PCR). Recuperado de
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%c3%b3n%20en%20ca
dena%20de%20la%20polimerasa.pdf?sequence=1&isAllowed=y