Sunteți pe pagina 1din 50

Cromatografie

Cromatografia reprezintă un un şir de procedeu prin care un amestec de


substanţe complexe în fază gazoasă sau lichidă , cu compoziţii asemănătoare,
este separat pe componente. La folosirea cromatografiei în scop analitic imediat
după separarea componentelor amestecului acestea sînt analizate cu
aparatură spectroscopică, termoc-onductometrică, ion - conductometrică,
polarimetrică sau refractometrică în scopul determinării compoziţieie chimice
şi/sau a concentraţiei. La toate separările cromatografice proba de analizat se
solvă într-o fază mobilă care este fie un gaz fie un lichid fie un fluid supracritic.
Fenomenul separării componentelor amestecului fazei mobile într-un
cromatograf se datorează frînării diferenţiate a deplasării acestora de către o
fază staţionară ce se găseşte fixată pe o coloană sau pe o suprafaţă plană. La
cromatografie toate componentele amestecului de substanţe analizate pleacă
concomitent şi ajung la detector pe rînd. Natura fazei mobilă şi a fazei
staţionară se alege în aşa fel încît separarea componentelor în timp să fie cît mai
avansată. Componentele frînate mai puternic de faza staţionară se deplasează
cu viteză mai mică iar cele frînate mai puţin se deplasează cu viteză mai mare
şi corespunzător ultimele sosec primele la capătul sistemului cromatografic de
separare unde se găseşte şi detectorul. Pe baza acestor mobilităţi diferite
componentele amestecului lichid sau gazos se separă în eşantioane de
substanţe pure ce ocupă fiecare un interval bine definit de timp de ieşire din
coloană. Sistemul de detecţie cromatografică plasat la ieşirea coloanei
cromatografice trebuie să prezinte o viteză de răspuns suficient de mare pentru
a nu exista pericolul ca anumite fracţiuni de concentraţie mică (interval scurt de
sosire la capătul coloanei) să rămînă nedectate. La ora actuală cromatografia
ocupă un loc important în chimia organică, chimia anorganică, în biochimie, în
chimia alimentară, în chimia mediului, în expertiza criminalogică ş.a. În figura de
mai jos este redată schema de principiu a cromatografiei.

Fig. Schema de principiu a cromatografiei


Etapele analizei cromatografice sînt:
- realizarea curgerii fazei mobile ,
- injecţia probei în faza mobilă,
- separararea componentelor amestecului
- detectarea componentelor amestecului

Curgerea fazei mobile se realizează prin urmatoarele modalităţi:


gravitational, prin forţe capilare, prin gradient de presiune realizat de pompe
hidraulice, pompe turbomoleculare, butelii cu gaze sub presiune sau prin
gradient de potenţial electric.
Injecţia amestecului de substanţe în faza mobilă se realizează fie înainte
de realizarea curgerii fazei mobile ( ex. cromatografia în strat subţire) fie în timpul
curgerii fazei mobile . La analiza unui număr mare de probe sînt folosite sisteme
de injecţie şi de măsurarea automată aşa numite “Autosampler”.
Separarea componentelor se face în coloana cromatografică care se
prezintă sub forma unui tub metalic sau din alt material rezistent mecanic şi
chimic. La cromatografia de lichide coloanele capilare au lungimi de ordinul
centimetrilor sau a zecilor de centimetrii şi diametre de ordinul milimetrilor
acestea fiind umplute de regulă cu o faza staţionară granulară rugoasă. În cazul
cromatografiei de gaze aşa numitele coloane cromatografice sînt nişte tuburi
capilare speciale cu lungimi de ordinul metrilor sau a zecilor de metrii şi
diametre foarte mici de ordin submilimetric, iar faza staţionară este
reprezentata de un film subtire sau de un strat solid depuse pe pereţii interiori
ai tubului capilar de retenţie.
Detecţia componentelor fazei mobile se realizează imediat după
părăsirea sistemului cromatografic de către componente. Cromatografele dispun
fie de detectoare proprii de tip termo-conductometric , fotometric, ion -
conductometric, refractometric, polarimetric. Sau sînt folosite sisteme modulare
în care sistemul cromatografic este o unitate separată iar sistemul de analiză o
altă unitate separată. În această situaţie sistemele de analiză sînt spectrometre,
refractometre, polarimetre analizoare ion- conductometrice sau altele. La
cromatografele moderne după detecţie este folosit un sistem colector de
componente cu scopul de a imobiliza aceste componente în vase sau butelii în
vederea neutralizării sau distrugerii lor ca o masura de protectie a mediului. Prin
înregistrarea semnalelor electrice ale detectorului unui cromatograf în funcţie de
timp sau în funcţie de volumul fazei mobile se obţine o cromatogramă care
este formată dintr-o sucesiune de peak-uri de diferite înălţimi şi suprafeţe.In
figura 2 este ilustrată sugestiv separarea componentelor într-o coloană
cromatografică urmată de detecţia pe rînd a acestora şi de reprezentare a
acestor componente sub forma unei cromatograme .
Fig.2 Ilustrarea fenomenului de separare a componentelor intr-un sistem
cromatografic şi reprezentarea acestora sub forma unei cromatograme.

Definiţia unor noţiuni specifice cromatografiei

- Fază staţionară - fază imobilă ce intră în interacţiune fizică cu amestecul


de substanţe supus analizei, ea avînd rolul frînării diferenţiate a
deplasării componentelor acestuia.
- Fază mobilă - fază ce conţine substanţa de analizat şi substanţa
purtătoare şi se deplasează in lungul sistemului de separare. Fazele
mobile se deosebesc prin capacitatea lor de eluţie (capacitate de
transport) ceea ce determină selectivitate diferenţiată a componentelor
amestecului.

- Retenţie - întîrzierea deplasării componentelor individuale ale


amestecului de substanţe ca urmare a interacţiunii cu faza staţionară.

- Timp de retenţie - timpul necesar unei substanţe pentru a parcurge


întregul sistem de separare

- Eluţie - transportul unei substanţe printr-o coloană cromatografică prin


adăugare continuă de fază mobilă proaspătă la capătul sistemului de
separare.

- Eluent - faza mobilă (solvent) purtătoare

- Eluat - fază mobilă ce a traversat în totalitate sistemul de separare

- Şir eluotrop – aranjament, în ordine crescătoare sau descrecătoare după


puterea de eluţie , a diluanţilor uzuali raportaţi la o substanţă de referinţă
(ex. gel de silice, oxid de aluminiu)

- Coloană (tub capilar) cromatografică - corpul care formeaza suportul


pentru faza solidă în cazul separării cromatografice a amestecurilor lichide
sau a amestecurilor gazoase sub presiune

Analiza calitativa
Din punct de vedere calitativ cromatografia oferă pentru componentele
unui amestec o singură informaţie calitativa care să permită identificarea naturii
subsţantei şi anume timpul de retenţie (t r) ce poate fi determinat cu o precizie şi
o rezoluţie mult mai mică decît lungimea de undă in cazul folosirii metodelor
spectroscopice la analiză calitativă. Afară de aceasta conţinutul informativ ce se
poate obţine dintr-o cromatograma este mai redus decît cele ce se pot obţine
dintr-o spectrogramă de masă atomică sau de rezonanţă magnetică de spin.
Acest lucru nu înseamnă însă ca metodele cromatografice nu au aplicaţii
calitative. La ora actuală metodele cromatografice folosesc ca principale
detectoare sisteme spectroscopice mergînd de la detectoare fotoelectrice simple
pîna la detectoare de masă atomică sau detectoare de rezonanţă magnetică de
spin . În felul acesta se îmbină capacitatea metodelor cromatografice de a face
ca diferitele componente ale amestecurilor, de multe ori cu peak-uri foarte
apropiate din punct de vedere a lungimilor de undă, cu pericol avansat de
confuzie , să sosească la timpi diferiţi la detector ceea ce permite identificarea
lor fără eroare. Mai trebuie adaugat că de foarte multe ori aspectul identificării
cromatografice calitative se rezumă nu la identificarea prezenţei unui anumit
compus dintr-un amestec ci la dovedirea faptului că un anumit compus nu se
gaseşte într-un anumit amestec unde ar putea fi bănuit că există. In acest sens
în prima fază se realizează o separare cromatografică cu un amestec etalon
obţinut în conditii de laborator cu substanţe pure. In faza a doua se compară
cromatograma amestecului analizat cu cromatograma amestecului etalon.
Dacă la timpul de retenţie corespunzător peak-ului substanţei vizate de pe
cromatograma analizată nu apare un peak cu acelaşi timp de retenţie ca cel
de pe cromatograma etalon rezultă că acea substanţă lipseşte din amestecul
analizat sau că ea este intr-o concentraţie situată sub limita de detecţie a
metodei folosite.

Analiza cantitativă

In cazul cromatografiei cu coloană de gaze sau de lichide) analiza


cantitativă se bazează pe compararea înalţimii sau suprafeţei unui peak a unei
substanţe cu aceleaşi mărimi ale unui sau mai multor Peak-uri obţinute cu
concentraţii etalon ale acelei substanţe. În cazul cromatografiei planare
parametrul cantitativ este dat de suprafaţa petei substanţei analizate separată
pe faza staţionară planară. În acest caz se compară optoelectronic
cromatogramă (pata) substanţei analizate, de concentraţie necunoscută,
cu o cromatograma (pată) etalon de concentraţie cunoscută, concentraţia
primeia calculîndu-se prin regula de trei simple. Atît analiza peak-urilor, în cazul
cromatografiei cu coloane, cît şi a suprafeţei petelor, în cazul cromatografiei
planare, se poate efectua fără erori numai atunci cînd parametrii ce le definesc
variază liniar cu concentraţia. Avînd în vedere importanţa mare a analizei
cantitative în cromatografie se vor discuta în continuare mai detaliat tehnicile
acesteia:
Analiza pe baza măsurării înălţimii peak-ului este o metodă comodă şi
rapidă ce poate fi efectuată cu precizie ridicată. Inălţimea unui Peak se
determină unind cu o perpendiculară linia ce uneşte cele două parţi ale liniei de
bază , figura 1 este prezentat modul de determinare a înlăţimii un peak .

Fig.1. Peak cromatografic şi modul Fig.2. Raportul intre înălţimea peak-ului şi lăţimea
cum se determină înălţimea acestuia acestuia. a- peak obţinut la o viteză mare de
curgere a eluentului , a- peak obţinut la o viteză
micăde curgere a eluentului

Trebuie menţionat însă că înălţimea peak-ului este într-un raport invers cu


lăţimea lui, figura 2, iar cea din urmă depinde de temperatura coloanei, de viteza
de curgere a eluentului, de viteza de injecţie a probei. Abia atunci cînd aceşti
parametri sînt absolut constanţi se poate vorbi de precizie ridicată la
determinarea concentraţiei pe bază măsurării înalţimii peak-ului

Analiza pe baza pe măsurarea suprafeţei peak-ului este o metodă


ceva mai complicată decît cea bazată pe măsurarea înălţimii peak-ului în schimb
rezultatele determinării nu depind de parametrii ce influentează lăţimea peak-
ului pentru simplul motiv că în momentul lăţirii peak-ului scade înălţimea lui,
numărul unităţilor de suprafaţă din interiorul lui rămînînd constant. La peak-uri
foarte înguste metoda bazată pe măsurarea înălţimii peak-ului dă însă
totdeauna rezultate mai precise. Cromatografele moderne dispun de
integratoare electronice bazate pe numărarea pixelilor suprafeţei peak-ului. La
aparatele mai vechi, fără integrator, se inmulţeste înălţimea cu semilâţimea
peak-ului, fig. 1.

Etalonarea constă in prima fază în realizarea unei cromatograme etalon


cu concentraţii cunoscute , apropiate de concentraţia analizată , măsurarea
înălţimii sau suprafeţei peak-urilor şi reprezentarea valorii acestora în funcţie
de concentraţie în vederea obţinerii curbei etalon . In faza a doua extrapolează
valoarea înălţimii sau a suprafeţei peak-ului substanţei analizate de pe ordonata
curbei etalon pe abscisa curbei etalon în vederea determinării concentraţie
acesteia . Pentru determiari de mare precizie curba etalon trebuie să fie dată de
o linie dreaptă ce trece prin origine. Principala sursă de erori la etalonare o
reprezintă imprecizia dozarii exacte a volumului probei analizate avînd în vedere
că valoarea acestui volum se situează la nivelul de cca 1 µl. Deosebit de
pregnant se manifestă această sursă de erori la cromatografia de gaze unde
evaporarea în unei cantitaţii necunoscute de pe vîrful acului de injectie in camera
de evaporare modifică sensibil rezultatele. Eroarea de dozare poate fi
redusă sensibil prin folosirea unui bucle de dozare cu volum constant şi
cunoscut, formată dintr-un tub capilar, umplut complet cu probă, ce este injectat
ulterior în totalitate în faza mobilă prin intermediul unui ventil special cu şase
căi atunci cînd acesta este rotit spre buclă cu cele două căi care realizează
comunicarea cu traseul fazei mobile. Imprecizia dozarii probei este redusă mult
e prin folosirea unui standard intern de calibrare. Toate cromatografele moderne
sînt echipate practic cu un asemenea standard şi dispun de un sistem automat
de extragere şi injectie, vasul cu standardul intern găsindu-se montat în interiorul
cromatografului. La folosirea standardului intern fiecărei probe etalon sau probe
de măsurat se adaugă un volum precis din standardul intern. Raportul dintre
valoarea înălţimii sau suprafeţei peak-ului probei analizate şi valorile
corespunzătoare ale standardului intern foloseşte ca parametru analitic de
referinţă. Pentru ca această metodă să poată fi folosită cu rezultate bune este
nevoie ca peak-ul standardului intern să se distingă clar de cel al probei să nu
fie insă situat la o distanţă prea mare de aceasta în aceste condiţii putîndu-se
asigura erori situate sub 1%.
O altă metodă de reducere a erorilor legate de volumul de injecţie este
cea de normare a suprafeţei . Pentru aceasta este nevoie de eluarea completă a
tuturor componentelor amestecului analizat (traversarea completă a sistemului
cromatografic de către componentele amestecului analizat). Se măsoară
suprafaţa tuturor peak-urilor şi se corectează valorile individuale în funcţie de
sensibilitatea detectorului faţă de fiecare component al probei analizate.
Concentraţia substanţei se determină din raportul dintre suprafaţa peak-ului
şi suprafaţa tuturor peak-urilor amestecului.

Mărimi caracteristice ale cromatografiei

Una din mărimile importante ce definesc eficienţa unui sistem


cromatografic de separare il reprezintă viteza relativă cu care sint eluaţi
( separaţi) doi componenţi . Aceasta viteză depinde de echilibrele de
repartiţie ale componentului (A) intre faza mobilă (A m) şi faza staţionară
(As) :

(Am) → (As)

c
s
K
c
m

Factorul de separare α indică randamentul separării a două substanţe şi se


bazează pe timpii de retenţie tR a componentelor din coloană. Timpul de retenţie
este timpul de care arer nevoie componentul respectiv pentru a traversa coloana.
Timpul de retenţie este indicat punctul de intersectie a liniei ce uneste virful
Peak-ului cu abscisa ( axa timpului):

cu factorul de retenţie definit prin:

unde : t0 poartă denumirea de timp de traversare a coloanei şi este timpul de


care are nevoie solventul sau gazul purtător pentru a traversa coloana. Inainte se
folosea pentru acest termen noţiunea de timp mort, din motive de iritaţie pe care
o produce această denumire ea este evitată.

Înălţimea treptei de separare

Înălţimea treptei de separare a unei coloane cromatografice este o măsură


pentru capacitatea de separare a coloanei. Ca treaptă de separare se poate lua
segmentul coloanei de separare în care se instalează echilibrul cromatografic.
Cu cît se instalează mai multe asemenea echilibre pe coloană cu atit mai mică
este înălţimea treptei de separare şi cu atît mai mare este randamentul coloanei.
Pentru atingerea unei trepte joase de separare în condiţii analitice sînt necesare
următoarele presupuneri:

1. este de aşteptat o instalare rapidă a echilibrului a absorbţiei sau a


distribuţiei. În acest sens diametrul (d) al particulelor ar trebui să fie cît mai
redus.
2. temperatură constantă în întreaga coloană. În acest scop se va folosi un
termostat de coloană.

3. viteză constantă de curgere. În acest sens se foloseste o pompă cu piston


cu presiune de pînă la 400 ata.

4. domeniu liniar de absorbţie. Faza staţionară nu ar trebui să fie


supraîncărcată în timpul desfăşurării separării cromatografice.

5. ar fi de dorit o neglijare a difuziei , din păcate acest lucru este greu


realizabil experimental , motiv pentru care se urmăreşte folosirea unor
încărcături cu particule de umplutură de dimensiuni extrem de mici.

Pentru determinarea înălţimii treptei de separare în dependenţă de viteza de


curgere a eluentului pentru cromatografia HPLC este folosită ecuaţia Van-
Deemter;
unde:

 H înălţimea treptei de separare,


 ux viteza liniară de curgere.

A- termen ce respectă difuzia Eddy ce apare ca urmare a distanţelor de


curgere prin pachetul de umplutură, este valabilă relaţia :

unde:

o p Factor de compactizare,
o d diametrul particulelor,

B- termen ce respectă difuzia longitudinală care este difuzia moleculară a


moleculelor analitice în ambele direcţii a treptei de separare. Este
valabilă relaţia

unde:

 D - constanta de difuzie în faza mobilă


 L – factorul de labirint ce respectă struvctura poroasă a fazei
staţionare

C- termen ce respectă lărgirea Peak-ului prin instalarea lentă a


echilibrului între faza mobilă şi faza staţionară . Mai trebuie luată în calcul şi
constanta de difuzie de-a lungul porilor fazei staţionare, este valabilă relaţia:
Clasificarea metodelor cromatografice

Metodele cromatografice se pot clasifica după următoarele criterii :

- după principiul de separare din faza mobilă


- după modul de contact între faza staţionară şi cea mobilă

- după după starea de agregare a fazei mobile folosită

Clasificarea cromatografiei după principiul de separare din


faza mobilă

Principiul fundamental al tuturor procedeelor cromatografice este realizarea


repetată a unui echilibru între faza staţionară şi faza mobilă. Echilibrul se poate
stabili pe baza diferitelor efecte fizico -chimice. Se deosebesc astfel:
- Cromatografie de absorbţie - separarea diferitelor componente se face pe
baza absorbţiei diferite faţă de faza în repaus. Faza mobilă poate fi un
solvent polar sau nepolar iar la substanţe gazoase poate fi un un gaz
purtător.
- Cromatografia de repartiţie - separarea se face pe baza solubilităţii
diferite a componentelor. Solventul rămîne fixat ca fază imobilă pe
materialul fazei staţionare. Ca şi în cazul precedent faza mobilă poate fi
o soluţie sau un gaz purtător.
- Cromatografia schimbătoare de ioni - faza mobilă este de regulă o soluţie
de ioni ce trebuie separaţi. Faza solidă este un schimbător de ioni solid .
Schimbătorii de ioni formează între diferiţii ioni ai fazei solide legături cu
stabilitaţi diferite. La cromatografia schimbătoare de ioni cu efect de sită-
la faza staţionară se folosec substanţe ce separă componentele pe baza
dimensiunii lor. În principal se folosesc site moleculare şi site filtrante cu
gel.
- Cromatografia de afinitate- ca fază staţionară este folosită o combinaţie
chimică specifică fiecărui analit ce provoacă o separare în componente
pe baza unor forţe necovalente. Este vorba de o metodă de înaltă
selectivitate. Metoda IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity
Chromatography) este folosită special pentru proteine.
- Cromatografie Chirală – este folosită pentru separarea moleculelor
chirale. Faza staţionară conţine un enantiomer care intră într-o
interacţuine diferită cu fiecare din cei doi enantiomeri ai Racematului în
felul acesta enantiomerii sînt separaţi diferenţiat în timp.
Clasificarea cromatografiei după după modul de contact
între faza staţionară şi cea mobilă

După acest criteriu cromatografia se împarte în:

- cromatografie cu coloană
- cromatografie planară

La cromatografia cu coloană faza staţionară se găseşte intr-un tub prin care


faza mobilă este trimisă prin suprapresiune sau pe baza forţei gravitaţionale.
La cromatografie planară faza staţionară este fixată pe o placă netedă sau
în porii unei hîrtii speciale iar faza mobilă se deplasează prin faza staţionară pe
baza acţiunii forţei capilare sau sub acţiunea forţei gravitaţionale.
Echilibrele pe care se bazează aceste două procedee cromatografice sînt
identice , teoria capilară dezvoltată pentru cromatografie cu coloană putînd fi
aplicată fără probleme şi asupra cromatografiei planare. Trebuie menţionat că
tehnica cromatografiei planare este specifică numai cromatografiei de lichide, pe
cînd tehnica cromatografiei cu coloană este specifică cromatografiei de gaze, de
lichide şi cromatografiei cu fluide supracritice.

Clasificarea cromatografiei după starea de agregare a


fazei mobile folosită

După acest criteriu cromatografia se clasifica in:

- Cromatografia de lichide
- Cromatografia de gaze

- Cromatografie cu fluide supracritice

Cromatografie de lichide (LC)

Cromatografia de lichide se referă la separarea componentelor unei faze mobile


lichide urmată de analiza chimică a acestora. După după modul de contact între
faza staţionară şi cea mobilă cromatografia de lichide se clasifică în:
Cromatografia planară

- Cromatografie pe hîrtie - ca fază solidă este folosită hîrtie specială


poroasă aşezată în poziţie verticală (mai rar pe orizontală) într-un vas de
sticlă. Ca şi în cazul cromatografiei în strat subţire deplasarea fazei
mobile se realizează pe baza forţei capilare.
- Cromatografie în strat subţire - ca fază solidă se foloseşte un strat
subţire uniform de silicagel aplicat pe sticlă sau pe plastic

Cromatografia pe coloană

- Cromatografie de joasă presiune- coloanele de separare folosite au


diametre de la unu pînă la mai mulţi centimetri. Această formă a
cromatografiei lichide se foloseşte mai ales pentru separare de
preparate.

- Cromatografia de presiune - denumită azi şi cromatografie de


lichide de înaltă performanţă (engl. HPLC High Performance Liquid
Chromatography) reprezintă astăzi metoda de separare cel mai des
folosită azi în analitică. Fază mobila este deplasată cu presiuni de
pînă la 400 atmosfere şi debite de pînă la 5 ml/min

- Electrocromatografia - deplasarea fazei mobile se realizează prin


aplicarea unei tensiuni electrice. Această metodă se găseşte încă în
stadiu de dezvoltare şi nu se foloseşte la determinări curente.
Procedeul nu trebuie confundat cu electroforeza.

- Cromatografie pe membrană - în locul unei coloane cu umplutură se


foloseşte ca fază fixă una sau mai multe membrane într-o incintă
închisă. Faza lichidă este pompată prin membrană la presiuni de
max 6ata şi la debite de cca 20 ori mai mari decît la cromatografia
cu coloană.

Cromatografia de gaze (GC)


Cromatografia de gaze este o metodă fizico- chimica de separare a unui
amestec gazos distribuit intre doua faze nemiscibile. Una din cele doua faze este
mobila si una stationară. Faza mobila parcurge in amestec cu amestecul de
analizat in timp faza staţionară pe baza absorbtiei si desorbtiei diferentiate a
moleculelor sau radicalilor liberi are loc separarea in timp a componentelor
amestecului gazos acestea sosind pe rind la capatul tcoloanei sau tubului capilar.
După separarea componentelor acestea trec în ordinea sosirii lor printr-un sistem
de detecţie cu scopul realizării analizei chimice calitative şi cantitative a
componentelor amestecului. Ametecul de gaze supus analizei poate exista iniţial
direct în fază gazoasă sau componentele amestecului se pot găsi iniţial în fază
lichidă sau fază solidă de unde sînt aduse prin evaporare în fază gazoasă.
După modul de contact între faza mobilă şi cea staţionară cromatografia de
gaze se clasifică în:

- Cromatografie cu coloane umplute - interiorul coloanei este umplut cu un


material granular fin.
- Cromatografie cu coloane capilare - peretele interior a coloane capilare
este acoperit de o fază staţionară subţire care se poate prezenta sub
formă lichidă sau sub formă solidă.

Cromatografie cu fluide supracritice

Cromatografia cu fluide supracritice (engl. SFC Supercritical Fluid


Chromatography ) foloseşte ca fază mobilă o subsatanţă în stare supracritică
(stare situată între starea gazoasă şi starea lichidă). De regulă este vorba de
bioxid de carbon. La această metodă sînt folosite în exclusivitate coloane ca
suport pentru faza staţionară.

Weblinks
 http://vs-
c.de/beispiele/Chemie/Analytische_00032Chemie/Chromatographie/
 http://www.uni-saarland.de/fak8/iaua/chrom/CHROBEGR97.pdf
 http://dfa.leb.chemie.tu-muenchen.de/~wolfy/Seminar/Chromatographie/
 http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-
Environ/CHROMO/chromintro.html
 http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Chromatography/
 http://www.ntk-landau.de/chromatographie/Sitemap.htm
 http://www.bio-faqs.de/ts_downl/CH-AB-Trennen-hom3.pdf /Arbeitsblatt für
SI

Von "http://de.wikipedia.org/wiki/Chromatografie"
Cromatografia de gaze
La cromatografia de gaze faza mobilă este constituită dintr-un gaz
purtator in care este injectat amestecul substantelor de analizat sub formă
lichidă. Dupa incălzirea gazului purtător care contine amestecul de analizat sub
forma de fază lichidă ultimul trece si el in fază gazoasă (conditia este ca
substanta de analizat sa poată fi evapora fără a se descompune chimic) rezultînd
un nou amestec constituit din faza mobilă si amestecul substantelor de analizat.
Acest amestec este trimis sub presiune printr-o coloană cu umplutură granulară
sau printr-o coloană goală sub forma unui tub lung de un anumit diametru. Cel
mai adesea coloanele goale sînt tuburi capilare cu lungimi ce pot ajunge la zeci
de metri lungime şi diametre interioare ce au valori de fracţiuni de milimetru.
Materialul coloanelor capilare de tip vechi este metalic iar cel al coloanelor de
tip nou din sticlă de cuarţ acoperită de poliamidă pentru a reduce fragilitatea
acestora. Pe peretele interior al coloanelor capilare se găseşte depusă faza
staţionară lichidă sau solidă a cărei scop este frînarea diferenţiată a diferitelor
componente din amestecul analizat. Avînd în dedere lungimile de ordinul zecilor
de metri ale coloanelor capilare precum şi necesitatea termostatării lor în limite
strînse de temperatură acestea se execută sub forma unor pachete cilindrice în
care tubul capilar este înfăsurat elicoidal de jos in sus. La coloanele capilare
Mărimile caracteristice ale coloanelor sînt diametrul coloanelor şi lungimea
coloanelor. Astăzi se lucrează aproape exclusiv cu coloane capilare goale .
Aceste coloane au diametre înterioare între 0,2 pînă la 0,75mm şi lungimi între
25 şi 60 m ( pentru separarea acizilor graşi se folosesc şi coloane cu lungimi de
peste 100 m). Avantajul unor coloane capilare de mare lungime constă într-o
separare extrem de avansată imposibil de atins cu coloane clasice cu umplutură.
Separarea cromatografică a unui amestec de gaze are loc în cel mai simplu caz
pe baza temperaturilor de fierbere diferite ale componentelor de analizat din
amestec. În acestă situaţie nu se ajunge la o interacţiune specială între faza
mobilă şi faza staţionară ci este vorba mai ales de o evaporare şi o condensare
repetată (de multe mii de ori) pe lungimea coloanei a componentelor individuale
din amestecul de substanţe. În cazuri mai complicate se urmăreşte special o
interacţiune între substanţa de analizat şi faza staţionară frînarea diferenţiată
introdusă folosind la separarea avansată a componentelor amestecului. Aşa de
exemplu pot fi separaţi enantiomeri , care nu se deosebesc prin punctele lor de
fierbere dar care pot fi separaţi prin interacţiunea lor cu derivate speciale de
ciclodextrine depuse ca fază staţionară subţire pe tubul capilar. Pentru
transportul amestecului gazos de analizat prin coloana capilară este folosit un
gaz purtător inert sau inactiv chimic cu bune proprietăţi de curgere. Hidrogenul
de înaltă puritate este gazul purtător ideal . Afară de hidrogen ca gaz purtător
mai este folosit Heliul şi azotul. Folosirea hidrogenului în locul heliului duce la o
dublare a rezoluţiei Peak-ului (la timpi de retenţie nemodificaţi). Hidrogenul nu
poatre fi în schimb folosit drept gaz purtător dacă el însăşi este un component
gazos a unui amestec de gaze ce urmează a fi analizat.
Cromatografe de gaze. Un cromatograf de gaze , figura , este format din
cinci părţi principale.

Fig. Schema de principiu a unui gaz cromatograf

1. Sursă de gaz purtător. Gazul purtător pentru gazcromatografie se găseşte


în butelii de inaltă presiune şi trebuie să fie inert din punct de vedere
chimic:heliu, argon, bioxid de carbon, azot şi hidrogen. Natura gazului
purtător folosit este hotărîtă de cele mai multe ori de tipul de detector din
gazcromatograf. Butelia de gaz este prevăzută cu un reductor de înaltă
presiune urmat de un reductor de joasă presiune ambele montate pe
butelie şi de un regulator de debit montat pe cromatograf. Presiunile de
lucru sînt cuprinse între 1,5- 3,5 bar presiuni care duc la viteze de
curgere de 25-150 ml/min-1 la coloanele cu umplutură şi 1-25 ml/min -1 la
coloanele capilare. Se consideră în general că debitul gazului nu se
schimbă dacă presiunea este constantă. Pentru controlul constanţei
acestuia se foloseşte un rotametru la intrarea în coloana cromatografică.
Pe traseul gazului purtător se mai găseşte o sită moleculară pentru
reţinerea apei şi altor impurităţi
2. Sistemul injector cu ajutorul căruia o proba de analizat, diluată puternic
cu un solvent cu punct de fierbere scăzut, este introdusă în fluidul
purtător. Pentru a obţine o evaporare rapidă injectorul este încălzit (200-
250 °C).

3. Coloana cromatografică este un tub cu diametrul cuprins între 10 - 30 cm,


înfăşurată sub formă spirală şi montată într-un cuptor. În scopul
asigurării unei separări cît mai avansată şi precisă a componentelor
amestecului cuptorul este termostatat cu o precizie de (±0,1 °C).
Temperatura optimă a coloanei cromatografice depinde de temperatura
de fierbere şi de gradul de separare dorit. De regulă temperatura optimă
de încălzire a coloanei trebuie să se situeaze puţin peste temperatura de
fierbere a probei. O asemenea temperatură duce la o rezoluţie bună şi
un timp de eluţie destul de acceptabil de 2-30 minute. În cazul unor probe
cu interval mare de fierbere este recomandat un program automat de
lucru prin care temperatura este crescută progresiv. Actualmente în
gazcromatografie se mai folosesc încă şi coloane cu umplutură . Aceste
coloane au lungimi de 2-3 m , au diametre interioare de 2-4 mm şi sînt
umplute cu material granular fin ( Kieselgur) acoperit cu un film subţire de
fază staţionară lichidă (0,05 - 1µm) . Utilizarea coloanelor cu umplutură
este în scădere locul lor fiind luat de coloane capilare fără umplutură cu
eficienţă mai mare decît primele. Coloanele capilare au lungimi mari ce
pot ajunge la peste 100 m şi au diametre interioare cuprinse între 100µm
- 750µm. Coloanele capilare se fabrică în două execuţii: cu peretele
interior neted acoperit cu un film subţire lichid de fază staţionară sau
coloane cu peretele interior acoperit cu un material solid poros subţire
( Kieselgur) impregnat cu faza staţionară (cca 30 µm). Coloanele
cromatografice sînt confecţionate din oţel inoxidabil, sticlă, sau teflon. La
ora actuală sînt folosite la scară tot mai mare capilarele din cuarţ de înaltă
puritate cu pereţi subţiri peste care sînt trase încă de la fabricare tuburi
subţiri de poliamidă pentru mărirea rezistenţei mecanice. Asemenea tuburi
capilare sînt deosebit de flexibile putînd fi rulate pe mosoare cu diametre
de numai cîţiva cm.

4. Detectorul La capătul coloanei cromatografice se găseşte detectorul


care furnizează un semnal electric, proporţional cu cantitatea substanţei
detectate, care trece mai departe la un integrator sau la cromatografele
moderne la un computer unde este prelucrat prin intermediul unui soft
adecvat. Pentru rezolvarea unor probleme mai dificile cu substanţe greu
de separat se folosesc şi detectoare cuplate în serie ( principiul de lucru
în tandem). Condiţia de bază în sistem tandem este aceea ca primul din
detectoare să nu fie de tip distructiv- flacără , pasmă, laser, etc.
Detectoarele folosite în Gazcromatografie sint prezentate detaliat în
capitolul ……….
Înregistratorul. În urma înregistrării grafice a evoluţiei semnalelor ( Peak-
urilor) în funcţie de timp se obţin cromatograme, figura.

Fig. Gazcromatograma…….

O gazcromatogramă conţine informaţii despre compozitia calitativă şi cantitativă


a amestecului gazos analizat. Distribuţia în timp a Peak-urilor reprezintă
ordinea sosirii componentelor amestecului la detector în sensul că primele sosite
sînt moleculele mici ce se deplasează mai uşor prin coloana capilară iar
ultimele sosite sînt moleculele mari a căror deplasare prin coloana capilară se
realizează mai anevoios. La cromatografele moderne cromatograma este
interpretată automat printr-un soft specific

Analiza gaz- cromatografică calitativă şi cantitativă

Cromatografia de gaze este o metodă foarte sensibilă pentru analiza


amestecurilor de substanţe. Cu ajutorul ei pot fi separate şi analizate după
componente amestecuri extrem de complexe. Pentru identificarea naturii unei
substanţe din amestec ( analiză calitativă) în condiţii date este folosit produsul
dintre debitul gazului purtător şi timpul de retenţie , produs ce poartă denumirea
de volum de retenţie . Timpul de retenţie este timpului ce trece de la injecţia
substanţei pînă la traversarea coloanei de către aceasta. La cromatografele cu
integrator timpul de retenţie se determină în dreptul punctelor de inflexiune din
gazcromatograme, figura a, iar la cromatografele diferenţiale timpul de reţinere
se determină în dreptul Peak-ului substanţei respective, figura b.

Fig. II141 Fig. II142


Pag.136
A.I.

Fig. Gazcromatogramă integrală Fig. Gazcromatogramă diferenţială

Integrala suprafeţei Peak-ului substanţei este o măsură a concentraţiei


substanţei din probă. Prin combinarea unui cromatograf cu un spectrometru de
masă ( metoda GC/MS) pot fi determinate cantităţi extrem de mici de substanţă,
totodată se poate realiza şi interpretare de structură imposibil de realizat prin alte
metode. Alte combinaţii gascromatograf- spectroscop sînt cu spectroscoape cu
transformată Fourier (GC/FTIR), sau cu spectroscoape de absorbţie moleculară
cu şir fotodiode sau spectroscoape de emisie atomică cu plasmă cuplată
inductiv ( GC/ICP).

Detectore folosite în gazcromatografie

La cromatografia de gaze sînt folosite următoarele tipuri de detectoare:


- detector de ionizare cu flacără
- detector de conductivitate termică
- detector cu capcană ionică
- detector de emisie atomică
- detector termoionic
- spectrometru de masă

Prezentăm în continuare detectoarele cele mai folosite în cadrul cromatografiei


de gaze.

Detector de ionizare cu flacără ( FID)

Detectorul de ionizare cu flacără este un detector folosit pentru


substanţe organice ( hidraţi de carbon) ce are aplicaţia de bază la
cromatografele de gaze deoarece îmbină o sensibilitate ridicată cu
robusteţea. Un detector de ionizare cu flacără este de cca 1000 ori mai
sensibil decît un detector de conductivitate termică. Alte domenii de aplicare
ale acestui detector sînt la supravegherea apelor privind prezenţa de
hidrocarburi volatile precum şi la supravegherea poluării atmosferei şi a
aerului din spaţii interioare cu hidrocarburi gazoase. Într-un arzător
special, figura , gazul care iese din coloana cromatografică este amestecat
cu hidrogen şi aer şi aprins electric .

Fig. Detector de ionizare cu flacără

Majoritatea compuşilor organici produc prin ionizare termică ioni şi electroni în


flacăra de hidrogen ceea ce face ca ea să devină conducătoare electric.
Între partea de sus a arzătorului metalic şi un electrod metalic colector ce
se găseşte deasupra flăcării se aplică o tensiune de citeva sute de volţi. În
funcţie de numărul de electroni şi ioni din flacără (concentraţie) se instalează
un curent electric proporţional, a cărui ordin de mărime este de cca 10 -12 mA ,
care este condus la un amplificator electronic cu impedanţă mare de intrare.
Curentul amplificat este înregistrat sub formă unor vîrfuri (Peak-uri) în
funcţie de timp. Intensitatea semnalului electric (înălţimea maximă a Peak-
ului) al detectorului este liniar şi proporţional cu conţinutul de hidrocarbură
într-un domeniu foarte larg de concentraţie , cu aplicaţii în analiză
cantitativă. Din acest motiv concentraţia unei hidrocarburi poate fi
determinată direct din semnal fără a se folosi curbe de etalonare. Avînd în
vedere că detectorul de ionizare este sensibil la numărul de atomi de
carbon ce ajung în detector în unitate de timp este vorba de un detector de
măsurare a debitului masic şi nu un detector de concentraţie. Acesta este
motivul pentru care modificări ale debitului fazei mobile influenţează foarte
puţin semnalul detectorului.
Unele substanţe organice ( de ex. Acidul formic, acetaldehida, grupările:
carbonil , hidroxil, aminice ) au detectabilitate slabă . Alte substanţe precum:
gaze nobile, H2 , N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legături
de halogen , halogenuri de siliciu au detectabilitate foarte slabă sau nu sînt
deloc detectate în flacără.

Detector de conductivitate termică

Unul din cele mai importante ale cromatografiei de gaze este detectorul de
conductivitate termică bazat pe măsurarea continuă a conductivităţii
termice, cu ajutorul unei punţi Wheatstone cu rezistori încălziţi, a
amestecului de gaze compus din gazului purtător şi amestecul gazos de
analizat figura

Fig. Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul punţii Wheatstone

Detectorul este format dintr-un bloc metalic compact bine termostatat în care se
găsesc patru celule de gaz identice în care se găsesc filamente de platină
sau de wolfram , sub formă de sîrmă, legate electric într-o punte de tip
Wheatstone. În detector se realizează o măsurare comparativă de
compensaţie. În acest scop prin două celule, situate pe două laturi opuse ale
braţelor punţii, trece gazul purtător pur, iar prin celelalte două braţe ale
punţii trece gazul purtător ce conţine şi amestecul de gaze pentru analizat.
Toate filamentele sînt parcurse de un curent electric şi încălzite de acesta
prin efect Joule-Lenz. Temperatura sîrmelor şi prin aceasta şi rezistenţa lor
electrică depinde de conductivitatea termică a gazelor ce trec prin celule.
Modificări ale compoziţiei gazelor provoacă modificări de temperatură şi
prin această modificări ale rezistenţei electrice a filamentelor de sîrmă .
Diferenţele de temperatură a filamentelor în celzule de măsurare şi în
celulele de referinţă duc la un dezechilibru electric măsurabil al punţii
Wheatstone. Mărimea dezechilibrului punţii este proporţional cu
concentraţia probei din gazul purtător. Detectorul de conductivitate termică
este un detector universal utilizabil la aproape toate substanţele. Singurele
îngrădiri sînt la substanţe puternic corozive care distrug filamentele.

Von "http://de.wikipedia.org/wiki/W%C3%A4rmeleitf%C3%A4higkeitsdetektor"

Detector cu capcană de electroni (ECD)

Detectorul cu capcană de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este


un detector specific pentru gazcromatografie folosit în analiza substanţelor
sulfuroase, substanţelor cu azot şi a substanţelor halogenate ( ex. PCB,
Lindan, etc). Aplicaţiile de bază sănt în analiza urmelor ţi în chimia mediului.

Detectorul este format dintr-o cameră de ionizare cu un catod şi un anod .


Camera mai dispune de o intrare şi o ieşire pentru fluxul de gaz. Ca sursă de
radiaţii (ß) este folosită o sursă radioctivă al izotopului Ni 63 sub forma unei folii
foarte subţiri. Această sursă de electroni constituie totodată şi catodul.
Descompunerea radiaţiei (ß) duce la emisia de electroni primari care se

Fig. Schema de principiu a detectorului cu captură de electroni

ciocnesc cu moleculele N2 ale gazului purtător. Iau naştere ioni N2 încărcaţi


pozitiv şi electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni apare un cîmp
electric prin care electronii secundari liberi se deplasează spre anod. În felul
acesta apare un curent electric , numit curent de ionizare de bază, de cîţiva
nanoamperi. Dacă în amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare faţă de
electroni atunci această substanţă colectează o mare parte din electronii liberi
ceea ce duce la micşorarea curentului de ionizare de bază. Această micşorare
reprezintă semnalul detectorului. Acest lucru înseamnă în practică că detectorul
cu capcană de electroni reacţionează la substanţe cu afinitate de electroni
cumsînt de exemplu substanţe halogenate precum şi anumite pesticide. Acest

sistem clasic de lucru are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv pentru
care în aparate moderne se foloseşte alt sistem de lucru. Astfel se aplică un
impuls de tensiune cu frecvenţă variabilă . În momentul în care există semnalul
de tensiune (0,5 bis 1μs), electronii care nu au reacţionat cu substanţele
amestecului de gaze din gazul purtător sînt colectaţi de anod. Timpii de pulsare
a semnalului electric s-au ales aşa de scurţi pentru ca ionii grei rezultaţi ca
urmare a absorbţiei de electroni să nu poată ajunge la anod. Frecvenţa nu este
ţinută constant ci variată în sensul asigurării unei intensităţi de curent
constante. Dacă în detector intră prin amestecul de gaze un număr mare de
molecule electrofile pentru compensare se măreşte frecvenţa întrucît pe anod
ajunge un număr mai mic de electroni şi ca atre scade intensitatea curentului. In
acest mod de lucru semnalul detectorului nu mai este micşorarea curentului de
ionizare de bază ci frecvenţa tensiunii aplicate în scopul menţinerii constante a
intensităţii curentului deoarece frecvenţa semnalului este proporţională cu
concentraţia moleculelor captoare de electroni. Prin timpul de pauză între
semnale numărul de electroni liberi este în limite largi constant, ceea ce
însemnă că şi la concentraţii mari ale substanţei de analizat sînt suficienţi
electroni la dispoziţie pentru ionizare. Numărul de electoni se adaptează
concentraţiei substanţei de analizat prin acesta extinzîndu-se sensibil şi domeniul
liniar.

Tab. Sensibilitatea aproximativă pentru diferite clase de compuşi organici

Gruparea chimică Sensibilitatea relativă


Hidrocarburi 1
eteri, esteri 10
Alcoli alifatici, cetone, amine 100
Legături mono-Cl- şi mono-F-, mono-Br-, legături di-Cl şi di-F 1000
Aldehide şi legături tri-Cl 104
Legături mono-J-, di-Br- şi legături nitro 105
Legături di-J-, tri-Br-, legături poly-Cl şi poly-F 106
Valorile din tabel sînt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al
ierarhizării. Sensibilitatea variază destul de mult chiar în cadrul aceleiaşi grupări
chimice deoarece sensibilitatea depinde de structura legăturilor .
Fotomultiplicatorul

Fotomultiplicatoarele sînt tuburi electronice speciale pentru amplificarea unor


semnale slabe de lumină şi transformarea lor în semnale electrice proporţionale.
Un fotomultiplicator este format dintr-un fotocatot urmat de un multiplicator de
electroni secundari, figura .

Fig. Schema de principiu a unui fotomultiplicator

Fotonii cad pe fotocatod şi extrag prin efect fotoelectric electroni din suprafaţa
acestuia. Fotoelectronii eliberaţi sînt acceleraţi în cîmp electric şi ajung la
alţi electrozi, aşa numitele dinode, din suprafaţa cărora fiecare electrod
extrage 3..10 electroni secundari. În felul acesta numărul de electroni
generaţi creşte în cascadă de la dinodă la dinodă. Pentru ca acest lanţ
multiplicator de electroni să funcţioneze este necesar ca potenţialul
electropozitiv să fie crescător de la dinodă la dinodă (în schemă de la
stînga la dreapta). Acest lucru se realizează de regulă printr-un lanţ divizor
cu rezistori. La sfîrşit electronii ajung pe anod şi se scurg la masă
provocînd o cădere de tensiune proporţională cu intensitatea fasciculului
incident de fotoni. Factorul de multiplicare creşte exponenţial cu numărul
dinodelor. Multiplicatoare tipice au cca 10 dinode. Dacă la fiecare dinodă se
extrag 5 electroni secundari de către un electron incident se obţine o
amplificare a numărului de electroni (adică a curentului) cu un factor de 5 10
Numărul de de electroni secundari produşi este proporţional cu numărul de
fotoni de intrare atîta timp cît nu se depăşeşte un prag de saturaţie, prag ce sxe
situează la cca 10% din " curentul transversal" ( curentul care curge prin lanţul
divizor de tensiune). În acest fel şi înălţimea semnalului de tensiune de ieşire, în
acest domeniu de lucru liniar, este proporţional cu numărul de fotoni incidenţi,
deci cu intensitatea luminii. Concluzionînd se poate spune că se pot măsura
fotoni individuali prin numărarea impulsurilor, sau se poate măsura energia
fotonilor prin determinarea înăţimii impulsului.
Utilizarea fotomultiplicatoarelor este în primul rînd ca detectoare pentru
radiaţii electromagnetice şi particule elementare (radiaţii gama- spectrometre
gamma, lumină- spectroscoape UV-VIS).
Cromatografia de lichide

Cromatografia de lichide este o metodă cromatografică de separare şi de


identificare a substanţelor din amestecuri de lichide. Ca şi la cromatografia de
gaze deplasarea fazei lichide este frînată diferenţiat de o fază staţionară astfel
încît la capătul sistemului cromatografic componentele sosesc pe rînd în funcţie
de mărimea moleculelor si a afinităţii acestora cu faza staţionară. Fază mobilă
este constituită dintr-o fază lichidă compusă din lichidul purtător în care se
găseşte dizolvat amestecul de substanţe lichide de analizat. Ca fază staţionară
sînt folosite materiale solide precum: silicageli modificaţi sau nemodificaţi ,
copolimeri polistiren- divinilbenzol s.a. Cromatografia de lichide se clasifică în:

Cromatografie pe coloană
Cromatografie de joasă presiune
Cromatografie de înaltă performanţă (HPLC)
Electroforeză
Cromatografie pe hîrtie
Cromatografie pe strat subţire

Cromatografie pe hîrtie, cromatografie pe strat subţire şi electroforeza pe strat de


hîrtie sînt metode cromatografice planare. Ele apelează la un strat plan, relativ
subţire, dat de un material portant poros sau de un strat subtire poros sau
capilar intins pe un material suport din sticlă, metal sau masă plastică .
Deplasarea fazei mobile prin faza staţionară se bazează pe efecte capilare,
efecte gravitaţionale sau cimp electric

Folosirea uneia din metodele enumerate mai sus pentru separare , identificarea
şi dozarea cantitativă a unui amestec de substanţă depinde în cea mai mare
măsură de faptul dacă toate substanţele amestecului pot fi dizolvate în faza
mobilă precum şi de existenţa unei faze mobile cu o selectivitate suficient de
mare pentru componentele amestecului.

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă ( engl. HPLC - High


Performance Liquid Chromatography ) cunoscută în literatură şi sub denumirea
de cromatografie de înaltă presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografică cea performantă şi este folosită în separarea şi
identificarea calitativă şi cantitativă a substanţelor din amestecuri lichide.
Separări şi analize de substanţe imposibul de realizat prin alte metode pot fi
realizate uşor prin HPLC. Pe de altă parte la această tehnică pot fi făcute şi
multe greşeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experienţă
practică bogată dar şi de cunostiinţe stiinţifice fundamentale.
La cromatografia HPLC faza mobilă purtătoare denumită "Eluent"
împreună cu substanţele lichide de analizat este pompată cu ajutorul unei
pompe printr-o coloană de separare ce conţine faza staţionară. În mod obişnuit
înaintea coloanei de separare propriu zise se cuplează o coloană premergătoare
de separare pentru reţinerea impurităţilor, coloană care este sensibil mai ieftină
decît coloana de bază. O coloană de separare într-un cromatograf HPLC are
lungimea cuprinsă între 5 şi 30 cm. O substanţă din faza lichidă mobilă care
interacţionează puternic cu faza staţionară solidă rămine un timp mai
îndelungat în coloană decît o substanţă care interacţionează mai slab cu faza
staţionară. Corespunzător substanţele din amestec prezintă timpi de retenţie
diferiţi şi ajung pe rînd la capătul coloanei de separare locul unde se găseşte
detectorul. În cadrul cromatografiei HPLC se folosesc două metode de lucru:

a) cu fază normală
b) cu fază inversă

Metoda cu fază normală foloseşte o fază staţionară polară (ex silicagel) .


Puterea de eluţie (putere de separare) a fazei mobile este dependentă în
general de polaritate. Diferiţii solvenţi sînt clasificaţi în funcţie de creşterea
polarităţii în şiruri elutrope. Cu cît mai polară este este o fază mobilă cu atît
mai repede este eluată o substanţă. Molecule polare sînt reţinute pe coloană
un timp mai îndelungat decît molecule nepolare şi ca atare părăsesc
coloana cu întîrziere.

Metoda cu fază inversă este folosită la scara cea mai largă în practică, cca
70% din separările analitice sînt separări cu fază inversă. La această
metodă se foloseşte o fază staţionară nepolară , iar puterea de eluţie scade
cu creşterea polarităţii. Faza staţionară se obţine din reacţia dintre silani
substituiţi cu hidrocarburi cu lanţuri lungi . În felul acesta suprafaţa polară a
particulelor de silicagel este acoperită de un strat nepolar din alcani , deci
polaritatea este “inversată” de unde şi denumirea de fază inversă. Ca faze
mobile se folosesc de obicei amestecuri din apă sau soluţii tampon şi
acetonitril, tetrahidrofuran sau methanol. O aplicaţie deosebită pentru
metoda cu fază inversă o reprezintă separarea de substanţe care prin
metoda cu fază normală prezintă timpi de retenţie prea mari.

Detectoare folosite in cromatografia de lichide de tip HPLC

La cromatografia de lichide de înaltă performanţă sînt folosite în funcţie


de cerinţele de separare şi de identificare următoarele tipuri de detectoare:

- de absorbţie în ultraviolet
- şir de fotodiode (diode - Array)
- de fluorescenţă
- electrochimic
- refractometric
- de masă

Rezoluţia detectoarelor este cu atît mai mare cu cît este mai lungă coloana de
separare.

Detectoare de absorbţie în ultraviolet. Aceste detectoare sint de natură


semiconductoare şi sînt cei mai folosiţi senzori in cromatografia de lichide
datorită faptului că foarte multe molecule organice absorb in ultraviolet iar
detectorul este fiabil şi ieftin. Sensibilitatea maxima a acestor detectoare este
situată în domeniul radiatiei ultraviolete 200-300 nm. In figura 1 este
reprezentată o asemenea caracteristică.

LINSAY

Fig. Caracteristica de sensibilitate a unui detector de absorbţie în ultraviolet

Faza mobilă ce iese din coloana cromatografică este trecută printr-o


celula de masurare etanşa , figura 2, prin care trece fasciculul ultraviolet .
Lungimea drumului optic prin asemenea celule este de 10 mm iar diametrul
interior al tubului este de 1 mm. Selectivitatea acestui detector este dat de faptul
ca pot fi detectate calitativ si analizate cantitativ numai molecule ce absorb in
domeniul ultraviolet. Asemenea substanţe sînt alchene, hidrocarburi aromatice,
sau compusi cu legături multiple intre C, O, sau S. Faza mobila nu trebuie să
prezinte absorbţie in ultraviolet.
Fig.1. Schema de principiu a unei de absorbţie dintr-un detector cu ultraviolete

Absorbţia radiatiei ultraviolete de către moleculele probei de analizat este dată


de legea Lambert - Beer şi este o funcţie de concentraţie a acestora .

Detectoare şir de fotodiode (Diode - Array) . Radiaţia policromatica,


trimisa printr-o celula speciala ermetica prin care circula faza mobila ce iese
din coloana cromatografică , figura 3, cade pe o oglinda de reflecţie totala si
de aici pe o reţea de difracţie unde este descompusă după componentele
spectrale acestea fiind reflectate pe detectorul sir de fotodiode.
( vezi şi cap….)

Fig. 3. Schema de principiu a detectorului cromatografic tip şir de fotodiode

În situaţia clasică se lucrează cu o singura fotodioda sau cu un fotomultiplicator


ca detector, diferitele lungimi de undă fiind aduse in dreptul fantei detectorului
prin rotaţia automata a reţelei de difracţie. Marele avantaj al detectorului cu şir de
fotodiode constă in faptul ca spectrul este obţinut instantaneu şi in mod continuu
neexistînd pericolul ca unii compusi de concentraţie mică să nu fie surprinşi de
detector. In cazul clasic al scanarii lungimilor de undă cu un monocromator si a
folosirii unui detector cu un singur canal acest pericol există deoarece in
momentul ieşirii din coloana cromatografică scanarea lungimilor de undă se
poate găsi la alte lungimi de undă decît cele unde absorbţia este maximă pentru
acea specie moleculară ea nefiind sesizată în amestecul substanţei de analizat.
Alt avantaj al folosirii detectorului şir de fotodiode constă in faptul că pentru
fiecare peak cromatografic se poate inregistra si reda ulterior spectrul fiind
posibilă compararea ulterioară cu alte spectre. Este posibilă o identificare mai
avansată a peak-urilor precum şi găsirea lungimii de undă optime pentru
detecţia lungimilor de undă individuale., găsirea peak-urilor de sensibilitate
maximă sau gasirea peak-urilor ce deranjează. Rezultatele masurătorilor cu
detector şir de fotodiode pot fi redate prin curbe de contur, figura , care
reprezintă secţiuni în peak-uri la diferite absorbţii, figura 4.

Fig.4. Spectrogramă de absorbţie clasică pentru două substanţe x şi y - (a), cromatograma celor
două substanţe - (b) şi spectrul de absorbţie in trei dimensiuni avînd curbe de contur
pentru cele două substanţe - (c)

Reprezentarea este asemănătoare cu cea care redă prin curbe de nivel inălţimi
de dealuri sau munţi pe harţi geografice. In cazul concret al aplicaţiei
cromatografice acest tip de reprezentare este foarte sugestiv reuşind să redea o
imagine sintetică in trei dimensiuni a legăturilor dintre absorbţie , lungime de
undă şi timp cu posibilităţi largi de interpretare inclusiv privind identificarea de
impurităţi care nu pot fi evidenţiate prin alte metode. In figura 4a este
reprezentat un spectru de absorbţie clasic pentru doua substanţe x şi y, in figura
4b cromatograma celor doua substanţe a şi b , iar in figura 4c diagrama in
coordonate lungime de undă - timp avînd curbe de contur care leagă puncte ce
reprezintă aceeaşi absorbţie.

Detectoare de fluorescenţă. La iluminare cu lumină ultraviolretă unele


substanţe sint în măsură să absoarbă radiaţie ultravioletă si ca urmare a
acestei absorbtii să emită lumină vizibilă pe o lungime de undă mai mare decît
cea absorbită. Dacă emisia de lumină are loc imediat după iradiere fenomenul
poartă denumirea de fluorescenţă , iar dacă emisia are loc cu întîrziere se
vorbeşte de fosforescenţă. Raportul intre energia luminii emise si energia
radiaţiei absorbită este subunitar şi pentru majoritatea substanţelor este atit de
mic încît nu poate fi valorificat instrumental. Abia pentru substanţele la care
valoarea acestui raport se situeaza la valori intre 0,1 şi 1 este posibilă detecţia
prin fluorescenţă. Exista substanţe care prezintă în mod natural fluorescenţă.
Asemenea substanţe au o structură ciclică conjugată aşa cum prezintă de
exemplu hidrocarburile aromatice policiclice. Multe substanţe ce nu prezintă în
mod natural fluorescenţă , tratate cu reactivi corespunzători pot fi transformte în
derivate fluorescente. În figura 5 este reprezentată schema de principiu a unui
detector de fluorescenţă.

Fig. 5. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip de fluorescenţă


1- sursă de radiaţie, 2- fantă, 3- lentilă , 4- filtru, 5- celulă cu soluţie de analizat, 6- lentilă, 7-
fantă, 8-filtru, 9-detector de radiaţie,

Radiaţia emisă de o sursă de radiaţie de deuteriu (1) este trecută printr-un


filtru (4) şi cade pe celula cromatografică specială cu soluţia de analizat unde
generează radiaţie de fluorescenţă pe toate direcţiile, măsurarea acesteia se
face însă la 90 0 faţă de radiaţia incidentă ea fiind trecută printr-un filtru (8)
înainte de a cădea pe detectorul (9). Avînd in vedere aranjamentul de masurare
a fluorescenţei are loc la 90 0 faţă de radiaţia incidentă unele aparate permit
masurarea concomitenta si a absorbţiei cea din urmă fiind măsurată pe direcţia
radiaţiei incidente ( Fig. -linie punctata cu săgeată) după ce aceasta a traversat
celula de măsurare cromatografică (5). Avantajul mare al detectoarelor de
fluorescenţă faţă de alte detectoare este sensibilitatea lor deosebită.
Edificatoare în acest sens este figura 5 unde [ ] este prezentată cromatograma

Fig.6. Cromatograme pentru substaţe aromatice policiclice efectuate in ultraviolet (a) şi în


fluorescenţă (b)
unor substanţe aromatice policiclice, prezente ca toxine în aer in cantităţi mici ,
efectuată în UV (a) şi cromatograma pentru aceleaşi substanţe efectuată în
fluorescenţă (b). De asemenea detectoarelor de fluorescenţă au şi o selectivitate
foarte mare, deosebit de utilă în analiza urmelor, dată de faptul prin filtre
adecvate poate fi variată atît lungimea de undă incidentă cît şi lungimea de undă
detectată după generarea fluorescenţei. În condiţiile în care cantitatea de
radiaţie absorbită de probă nu depăşeşte 10% răspunsul detectorului dă un
răspuns liniar pe plaja 103-104 [ Lindsay]

Detectoare refractometrice. Acest tip de detector se bazează măsurarea


indicelui de refracţie a eluentului ce soseşte din coloana ca reprezentînd
diferenţa între indicele de refracţie a substanţei analizate şi indicele de refracţie
a fazei mobile pure. Detectoarele refractometrice au marele avantaj de a putea fi
folosite la aproape toate substanţele sînt fiabile iar indicaţiile lor nu depind de
viteza de curgere în schimb indicaţia este influenţată de variaţii de temperatură.
Detectoarele refractometrice au o sensibilitate mai mică decît detectoarele de
ultraviolete. Cele mai scăzute nivele de zgomot care se pot obţine se situează
la 10-7 unitati de refracţie ceea ce corespunde pentru majoritatea compuşilor
unei concentraţii echivalente de 10-6 g/ml [ Lindsay]. In ce priveşte liniaritatea
aceasta se situează in jurul valorii de 104. Dacă se doreşte o sensibilitate inalta
este necesara termostatarea aparatului şi un control foarte bun al compoziţiei
fazei mobile.
In figura 7 este prezentata schema de principiu a unui detector refractometric.

Fig.7. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip refractometric

Radiaţia luminoasă trece printr-o celulă paralelepipedică specială (1) cu două


compartimente despărţite de un geam de sticlă (2). Unul din compartimente
este pentru proba de analizat şi unul pentru soluţia etalon. După traversarea
celulei radiaţia luminoasă cade pe o oglindă semitransparentă (3) şi este
despărţită in două fascicule, unul cade pe fotocelula (4) iar celălalt pe fotocelula
(5). Atunci cînd indicele de refracţie se modifică se modifică unghiul de incidenţă
al radiaţiei ce cade pe oglinda (3) şi ca atare se modifică şi cantităţile de radiaţie
ce cad pe cele două fotocelule (4) şi (5), şi proporţional şi fotocurenţii celor două
celule. Fotocurenţii sînt trecuţi într-un amplificator diferenţial (6) ce dă un semnal
de eroare (  ) proporţional cu modificarea indicelui de refracţie. Semnalul de
eroare comandă un servomotor (7) care roteşte oglinda semitransparentă (3)
pînă cînd semnalul de eroare are valoarea zero.Oglinda semitransparentă este
legată de un ac inregistrator astfel încît deplasarea acesteia este inregistrată în
timp sub forma unei cromatograme ce are pe ordonată indicele de refracţie iar
pe abscisă timpul.

Detectoare electrochimice. Aceste detectoare există într-o varietate mare


şi se bazează pe principii electroanalitice diferite precum:
- amperometrie
- coulometrie
- conductometrie
Detectoarele electrochimice sînt simple, au limite de detecţie scăzute şi
aplicabilitate la un număr extrem de mare de substanţe. Pentru a putea fi
detectabile prin amperometrie şi coulometrie substanţele trebuie să fie uşor
oxidabile respectiv uşor reductibile. Pentru a putea fi detectate pe cale
conductometrică substanţele trebuie să existe sub formă ionică.
La metodele electrocimice de tip amperometric sau conductometric
cromatogramele au pe ordonată curentul şi pe abscisă timpul. Din punct de
vedere constructiv detectoarele amperometrice sau coulometrice sint relativ
simple, in figura 8 este reprezentată o asemenea celulă.

LINSAY p.71

Fig.8 Detector cromatografic de tip amperometric


1 - corpul celulei, 2-electrod de lucru, 3- electrod auxiliar, 4 - electrod de referinţă,

Aşa cum se observă detectorul nu este altceva decît o celulă electrochimică


clasică cu trei electrozi adaptată pentru condiţii de masurare sub presiune.
Folosirea detecţiei amperometrice sau coulometrice presupune cunoastera
exactă a potenţialului unde specia respectivă are activitate maximă. În acest
sens de un real folos sînt curbele curent -tensiune care se pot trasa pentru
diferitele specii ionice cu celule electrochimice cu trei electrozi. Dacă se se
aplică unei asemenea celule tensiuni progresiv crescătoare atunci prin
înregistrarea parametrilor curent- tensiune intre electrodul de lucru (2) şi
electrodul de referinţă se obţine o curbă specifică ce dă infomaţii valoroase
despre activitatea electrochimică a speciei respective. In figura 9 este
reprezentată o asemenea curbă pentru trei substanţe diferite X,Y, Z:
Lindsay p69

Fig.9. Curba curent tensiune pentru trei specii moleculare X, Y, Z active electrochimic

Dacă se pleacă din poziţia (O) de curent zero si se aplică o tensiune negative
crescătoare in poziţia (E1) se instalează un curent la care specia (Z) este
redusă. Din palierul crescător al curbei electrocinetice se observă creşteri mari
mari de curent la creşteri mici de potenţial. Acest lucru se manifestă pînă în
zona curentului limită -corespunzător tensiunii (E 2). După această tensiune la
creşteri relativ mari de potenţial cresterea de curent este nesemnificativă.
Situaţia se schimbă după depăşirea potenţialului (E 3) cînd din nou la variaţii
mici de potential corespund creşteri mari de intensitate, in acest caz este vorba
însă de descărcarea (reducerea) altei substanţe respectiv solventul. Acelaşi
raţionament se face pentru substanţele (X) şi (Y) care sînt oxidate atunci cînd
potenţialul se deplasează din punctul (O) spre dreapta ceea ce corespunde unui
potenţial pozitiv. Substanţa (X) este oxidată mai uşor ( oxidarea începe la E 4)
decît substanţa (Y) (oxidarea începe la E 5), oxidarea solventului necesită
potenţilaul cel mai ridicat şi începe la (E 6). Importanţa interpretării acestei curbe
constă în posibilitatea alegerii potenţialului de descărcare care dă sensibilitatea
cea mai ridicată pentru o anumită specie ionică moleculară prezentă într-un
amestec. Aşa cum se observă din figură dacă potenţialul celulei cromatografice
ar fi cel corespunzător poziţiei (O) nu ar putea fi identificata nici una din cele trei
substante deoarece peak-ul de pe cromatogramă ar avea valoarea zero. La
stînga sau la dreapta acestui punct cele trei substanţe pot fi identificate cu
sensibilităţi diferite în funcţie de valoarea potenţialului aplicat celulei. Situaţia
alegerii potenţialului de descărcare pentru obţinerea unei sensibilitati maxime
este analoga cu modificarea lungimii de undă în romatografia cu detectoare UV
pentru obţinerea sensibilităţii maxime pentru o anumită specie. Linia punctată din
figura de mai sus reprezintă curba curent- tensiune reziduală
corespunzătoare solventului atunci cînd ar lipsi cele trei substanţe (X),(Y) şi (Z)
La metoda electrochimică conductometrică este folosită o celulă cromatografică
relativ simplă, figura 10. Pentru evitarea apariţiei transportului ionic şi a

James , p820
Fig.11. Detector cromatografic de tip conductometric
1 celula conductometrică, 2,3- electrozi de platina, 4- generator de frecventă, 5- amplificator , 6-
inregistator

fenomenului de polarizare intre cei doi electrozi pentru alimentarea lor este
folosit un curent alternativ cu frecvenţa cuprinsă între 1000 Hz şi 5000 Hz.
Cromatogramele cu celule conductometrice au în ordonată conductivitatea
electrolitică si pe abscisă timpul. Pot fi analizate pe această cale numai
substanţe care disociază ionic.

Thermal Conductivity Detectors (TCD)

Introduction

A TCD detector consists of an electrically-heated wire or thermistor. The temperature of


the sensing element depends on the thermal conductivity of the gas flowing around it.
Changes in thermal conductivity, such as when organic molecules displace some of the
carrier gas, cause a temperature rise in the element which is sensed as a change in
resistance. The TCD is not as sensitive as other dectectors but it is non-specific and non-
destructive.

Instrumentation

Two pairs of TCDs are used in gas chromatographs. One pair is placed in the column
effluent to detect the separated components as they leave the column, and another pair is
placed before the injector or in a separate reference column. The resistances of the two
sets of pairs are then arranged in a bridge circuit.
Schematic of a bridge circuit for TCD detection

The bridge circuit allows amplification of resistance changes due to analytes passing over
the sample thermoconductors and does not amplify changes in resistance that both sets of
detectors produce due to flow rate fluctuations, etc.

Related Topics

 Other GC detectors
 Encyclopedia of analytical chemistry and instrumentation

Further Information

Science Hypermedia Home Page

Copyright © 1996 by Brian M. Tissue

updated 3/4/96

II.5.2. Cromatografia

Cromatografia reprezintă o tehnică de separare a unor compusi din amestecuri


urmată după caz, de identificarea calitativă sau cantitativă a acestora.
Denumirea provine de la faptul ca primii compusi separati prin acest procedeu
erau substante colorate. La ora actuală majoritatea compusilor tratati prin, asa
zise tehnici comatografice nu mai sunt si nu trebuie sa fie colorati ,existând
metode moderne , bazate pe un important suport de aparatură , ce permit
identificarea si dozarea compusilor. Principiul cromatografic se bazează pe
absorbtia unui compus A, dizolvat într-un solvent (faza mobila), pe o fază fixă ,
urmată de o realimentare cu solvent pur la început, se stabileste un echilibru
între cantitatea de compus A absorbit si cantitatea rămasă în solutie (faza
mobila):

[A] m [A] f

(II.81)

indicii (m) si (f) se referă la faza mobilă si fixă, constantă de echilibru K - poartă
denumirea de constantă de repartitie si are expresia :

[ A] f
Kr  (II.82)
[ A] m

Dacă la început concentratia compusului A în faza mobilă era CA după


atingerea echilibrului (2) concentratia lui scade la valoarea [A] m ,se poate spune
că pe faza fixă s-a absorbit o cantitate :

Af = CA - [A] m (II.83)

In aceste conditii constanta de repartitie (3) are expresia :

C A  [ A] m
Kr  (II.84)
[ A] m

Cromatografie lichid-lichid
Exemplificarea fizică cea mai bună pentru lămurirea unor probleme de
principiu se poate face pe o Cromatografie
coloana cromatografică
de lichide cu absorbant solid fig.8 .
După lăsarea materialului absorbant în coloană se introduce prin partealichid - solid
Cromatografie
superioară a coloanei un volum de compus (A) dizolvat în solvent faza mobila.
Faza mobilă la intrarea în coloană poartă denumirea de developant sau
eluent iar la iesirea din coloana de eluat sau efluent . AreCromatografie
loc o absorbtie
gaz a- lichid
compusului A pâna când se atinge echilibrul descris de relatiile (2), (3), (4). Pe
Cromatografie de lichide
coloana compusul va fi absorbit în zona1(a) . Dacă se adaugă în continuare un
alt volum de solvent pur, acesta obligă faza mobilă initial introdusă să coboare
Cromatografie lichid - solid
într-o zonă inferioară (2) situată imediat sub zona (1) (b) . Sub influenta
solventului pur introdus în zona (1) o parte din compusul (4) fixat initial pe faza
fixă trece în faza mobilă până când sunt indeplinite conditiile constantei de
echilibru , descrisă de relatia (3) iar în zona ( 2) are loc o absorbtie egala cu [ A]
m a compusului A. Descriind sintetic se poate spune că are loc o migrare din
faza fixă în faza mobilă (zona 1) si o migrare din faza mobilă în faza fixă (zona
2).Fig.II.125
Dacă se -Clasificarea metodelor
adaugă la capătul cromatografice
coloanei dupã starea
cantităti crescânde fizicã aatunci
de solvent fazei mobile
fenomenul se amplifică, concentratia compusului A la intrarea coloanei scazând,
aceasta mărindu-se în schimb la partea inferioară a coloanei. Viteza cu care
specia A coboară de-a lungul coloanei cromatografice este în functie de
constanta de repartitie Kr si în functie de conditiile experimentale (cele din urma

trebuiesc bine definite si mentinute constant. Faptul că viteza de migrare a


speciilor analitice depinde de constanta de repartitie care la rândul ei este o
constantă ce tine cont de natura speciei, permite separarea mai multor specii
A,B,C,........ pe cale cromatografică pe baza vitezelor diferite de migrare pe care
aceasta le au. Separarea acestora în coloană ,respectiv evacuarea (eluarea) lor
se face în ordinea crescatoare a constantelor de repartitie .
II.5.2.1. Clasificarea metodelor cromatografice

In functie de starea fizică a fazei mobile metodele cromatografice se clasifică


astfel :

Metode
cromtografice

In tabelul II.1 este redată o clasificare a metodelor cromatografice cu


specificarea principiului pe care se bazează metoda :

Tabel nr.II.1
Clasificarea metodelor cromatografice

Metoda Principiul pe care se bazeaza


Absorbtia pe coloană Distributia substantelor o fază solidă
si una lichidă ,pe coloană
Repartitia pe coloana cromatografică Distributia (repartitia )substantelor
între două faze lichide pe coloană
Cromatografia pe strat subtire . Absorbtia sau repartitia pe strat
subtire (coloana deschisă )
Cromatografia pe hârtie Repartitia pe hârtie specială de filtru
(cromatografica)
Cromatografia de lichide la înaltă Cromatografia de lichide pe coloană
presiune la înaltă presiune (de înalta
performantă )
Cromatografia de schimb ionic Schimb de ioni pe coloană cu
schimbători de ioni
Site moleculare Marimea diferită a substantelor
dizolvate
Gel-filtrare Marimea diferită a particulelor de
substante
Gaz- cromatografia Distributia unei substante volatile
(gazoase) între un gaz (purtator) si o
fază lichidă
Cromatografie de sau solidă
absorbtie
Electroliza zonală Separarea pe hârtie cromatografică
sub actiunea curentului electric.
Procedee de separare
Rezultatele unei cromatografii ,se regasesc
cromatografica pe cromatograme,
Cromatografie de repartitie fig.II.126

Cromatografie de schimb ionic

Fig.II.127 Casificarea cromatografiei in faza lichida în functie de mecanismul de separare

de separare

Fig.II.126-Cromatografie : a) pe hârtie; b) pe strat subtire; c) pe coloana; d) gaz


cromatograma;

II.5.2.1.1. Cromatografia de lichide

In functie de mecanismul de separare la cromatografia în faza lichidă se disting


3 procedee diferite fig.II.127.
Cromatografia de absorbtie este un procedeu cromatografic la care un
curent de lichid provoacă o migrare diferentiată a componentilor unui amestec
într-un mediu poros cu proprietăti de absorbtie.
Cromatografia de repartitie reprezintă un procedeu la care fază fixă este
un lichid, nemiscibil cu faza mobilă, imobilizat pe un suport solid.
Cromatografia de schimb ionic este un procedeu la care faza este o
substantă solidă cu grupări ionice sau ionizabile. Conditia aplicarii acestui
procedeu este ca substantele de analizat să fie cu structură ionică sau să fie
ionizabile si să se dizolve într-un solvent.
In ce priveste natura fazei fixe metodele cromatografice uzuale la
cromatografia de lichide sunt:

Cromatografia pe coloană
Cromatografia pe hârtie
Cromatografia pe strat subtire
Electrocromatografia (electroforeza )
I.5.2.1.1.1. Cromatografia pe coloană

Coloanele cromatografice
sunt confectionate din tuburi de
sticlă (1) în pozitie verticală umplute cu
material absorbant (2) material poros
filtrant (3), rezervor de alimentare (4) si
dispozitiv de mentinere a nivelului
constant (5).

Fig.II.128 Structura unei coloane


cromatografice cu alimentare se sus
Fig.II 129 Structura unei coloane Fig.II.130 Coloana cromatografică
cromatografice cu alimentare de jos cu alimentare de jos în sus cu
în sus schimbător de căldură
In fig.II.129 este reprezentată o instalatie cromatografică cu alimentare de jos în
sus formată dintr-un rezervor de eluent (1), un rezervor (2), pentru proba de
analizat ,coloana cromatografică (3), si vasul (4), de colectare a fractiunilor
cromatografice . In fig.II.130 este reprezentat acelasi tip de instalatie cu
posibilitatea efectuarii cromatografiei la temperaturi mai ridicate decât cea a
mediului ambiant. În acest scop coloana (1), este îmbrăcată de un schimbător de
căldură (2) racordat la un termostat (3). Tehnicile de lucru pentru cromatografia
de lichide sunt: prin elutie, prin deplasare, frontală.
Tehnica prin elutie constă în colectarea continuă a fazei mobile ce trece prin
coloană până la separarea completă a substantelor ce ies din coloană pe rând.
Dacă se întrerupe elutia înainte ca substantele separate să iasă din coloană,
eluentul se numeste developant, iar separarea cromatografica developare.
Pentru separarea substantelor din coloană se extrage coloana din tub si se
sectionează după componenti iar după caz se determină concentraţia.
Tehnica prin deplasare utilizează o substantă capabilă să deplaseze substanta
de analizat deci cu o afinitate mai mare fată de faza fixă decât substanta
dizolvată.
Tehnica analizei frontale se bazeaza pe trecerea continua a substantei de
analizat prin coloană până când aceasta se saturează. Acest tip de separare se
utilizează mai rar din cauza preciziei scazute.
În fig. II.131 este reprezentat un cromatograf de lichid cu detector UV-VIS.
Fig. II.131 Cromatograf cu lichid cu detector UV-VIS

Detectarea componentilor pe coloana se face pe cale vizuală în cazul


componentilor colorati. La substantele necolorate se poate folosi metoda
măsurări conductivitatii în înaltă frecventă sau măsurarea căldurii de absorbtie.
Detectarea componentilor după ce aceştia au parăsit coloana se poate face
continuu la iesirea din coloană sau în fractiuni colectate la anumite intervale de
timp.Fractiunile se colectează cu ajutorul colectoarelor de fractiuni care de regulă
sunt fie benzi de hârtie de filtru ce se deplasează continuu prin fata orificiului de
iesire a efluentului din coloană, colectând pe rând picăturile urmată de o
developare cu reactivi specifici de culoare si compararea cu etalonul, fie flacoane
de sticlă ce sunt manipulate şi analizate automat.

II.5.2.1.1.2. Cromatografia pe hârtie.

Drept fază fixă poate fi folosită si o fâsie de hârtie absorbantă . Solventul fazei
mobile urcă si coboară prin capilaritate .Indiferent dacă este vorba de
cromatografie de absorbtie, de repartitie sau schimbatoare de ioni, succesiunea
operatiilor se desfasoară după o anumită organigramă, fig.II.132.

Depunerea cu o pipetă a unei cantităti de


substantă de analizat în dreptul liniei de start.

Se usucă pata lăsată pe hârtie de volumul


probei de analizat

Se introduce extremitatea benzii de hirtie intr-un


vas cu solvent, are loc coborirea sau urcarea
acestui, dizolvarea compusilor de analizat si
deplasarea acestora proportional cu viteza de
migrare.

La o deplasare suficienta a frontului de solvent,


operatia este oprita, se usuca hirtia si se pun in
evidenta fie pe cale chimica, prin pete diferit
colorate ce sunt puse in corespondenta. Cu
concentratia prin probe etalon de culoare, fie pe
cale fizica: fluorescenta, inregistrare
radioautografica etc.

Fig.II.132 Organigrama succesiunilor de operatii la cromatografia pe hârtie.


Tehnicile de lucru la cromatografia pe hârtie sunt :
-developarea descendentă
-developarea ascendentă
-developarea bidimensională
Developarea descendenta este cel mai des utilizată.

O bandă cromatografică fig.II.133 pe


care s-a dozat si uscat, proba de analizat sub forma unei pete (spot) este
introdusă într-un montaj experimental format dintr-un vas închis (1) , ce contine
un recipient (2), cu solvent ce asigură o atmosferă de vapori saturati în vasul (1),
si un alt recipient (3), ce contine solvent pentru conectarea si alimentarea cu
faza mobilă a hârtiei cromatografice (4), sprijinită pe două baghete de sticlă (5) si
(6) . Prin intermediul unei placi de sticlă (7), se poate apasă banda de hârtie în
solvent exact în dreptul sau. Vasul de lucru este acoperit cu un capac etanş (8).
Avantajul acestui mod de lucru îl reprezintă faptul că se obtin două
cromatograme ce se pot studia comparativ.
Fig.II.133 Principiul cromatografiei
Descendente

1 -vas închis, 2,3-recipient cu solvent,


4-hârtie cromatografică, 5,6-baghete
de sticlă, 7-placă de sticlă, 8 -capac

Developarea ascendentă fig.II.134 apelează la un vas de sticlă


închis (1), în care se găseste un alt vas (2), cu solvent. Hârtia cromatografică (3)
se introduce în vas sub formă de sul simplu până la atingerea solventului. Are
loc migrarea prin capilaritate de jos în sus, atât a solventului cât si a speciilor
de analizat. Pentru a împiedica evaporarea vasul este acoperit cu un capac
etanş (4).

Fig.II.134 Principiul cromatografiei ascendente


1-vas închis, 2-vas cu solvent, 3-hârtie cromatografică, 4-capac etanş
La developarea bidimensională se realizează mai întâi developarea pe o
directie, (fig.II.135 a) si apoi pe o directie perpendiculară prin rotirea hârtiei cu
900( fig.II.135 b ). Se obtine astfel o selectivitate mai ridicată .

Fig.II.135 Developarea bidimensionala

Spoturile S1-S5 reprezentate în fig.II.135 reprezintă cinci substante diferite.

II.5.2.1.1.3. Cromatografia în strat subtire

Are faza fixă dispusă sub forma unui strat subtire pe o suprafată plană.
Principial si fenomenologic acest tip de cromatografie este identică cu cea pe
hârtie, are însă avantajul ca poate fi folosită în medii agresive. Ca fază
stationară, se poate utiliza alumină si silicagel ,iar ca liant amidon, ipsos,
gelatină, carboximetil celuloză ,s.a.

Electrocromatografie (electroforeză) reprezintă o metodă de


separare si identificare calitativă si cantitativă bazată pe migrarea particulelor
încărcate electric sub influenta unui câmp electric continuu si a unui solvent .Prin
electroforeza pot fi separate substante polarizabile cum ar fi: peptidele,
aminoacizii s.a . Dupa cum electroforeza se desfasoara in absenta sau in
prezenta unui mediu stabilizant aceasta se clasifica in :

- electroforeza in mediu liber


- electroforeza in medii stabilizante

Electroforeza in mediu liber sau frontala constituie procedeul de separare


bazat pe electromigrarea speciilor intr-o coloana de lichid in care deplasarea
are loc in mod liber . In final diferite specii ionice ce au acelasi comportament
electroforetic se grupeaza in fractiuni delimitate de frontiere care despart spatii
corespunzatoare numarului de componenti . Separarea se poate urmari prin
determinarea unor proprietati fizico - chimice ale speciilor care migreaza . De
obicei se foloseste metoda determinarii indicelui de refractie . In fig. II.136 este
reprezentata separarea unui amestec de trei specii ionice (A+B+C) prin
electroforeza libera intr-o celula verticala (Tiselius).

Fig.II.136 Separarea unui amestec tricomponent, A+B+C prin electroforeza


libera

Dupa cuplarea curentului se realizeaza separarea spatiilor A, A+B, A+B+C,


B+C, C de catre fronturi. Mobilitatile ionice ale speciilor descresc in ordinea
A>B>C. La analiza unui amestec din substante anionice diferite,
compartimentul anodic trebuie sa contina un electrolit care sa aiba in compunere
o specie anionica cu o mobilitate superioara celor corespunzatoare
componentilor. Electroforeza libera este eficienta numai in conditii izoterme
folosindu-se solutii tampon a caror pH nu variaza. De asemenea procedeul este
aplicabil substantelor ce au masa moleculara mare intrucit acestea prezinta
conductibilitati moderate neinfluentind valoarea cimpului aplicat.
Electroforeza in medii stabilizante se desfasoara intr-un mediu eterogen pe
suporturi solide de migrare. Principalul rol al suportului de migrare este cel de
stabilizare a zonelor de migrare si de fixare a lor in pozitii corespunzatoare
vitezei de migrare . Alte avantaje sint date de :
- posibilitatea folosirii unor cantitati foarte mici de substante de analizat (sub 1
ml)
- posibilitatea folosirii unei game largi de electroliti tampon caracterizate prin
diferite tarii ionice si compozitii complexe
Ca medii stabilizante se pot folosi benzi, granule sau geluri. Mediile cele mai
folosite sint benzile de hirtie speciala (cromatografica) In fig.II.136 este
reprezentata structura de principiu a unei celule de electroforeza iar in fig.II.137
vederea unei celule de electroforeza moderne cu banda de hirtie .
Fig. II.137 Principiul constructiv si de functionare a unei celule electroforetice
orizontale cu banda de hirtie

Celula este formata dintr-un vas paralelepipedic (1) ce contine un


comportament anodic (a) si un comportament catodic (c) in care se gasesc cei
doi electrozi, respectiv anodul (2) si catodul (3). Tot in aceste compartimente se
toarna in parti egale si electrolitul. de analizat (4). Banda de hirtie (5) umectata
cu o solutie tampon este asezata pe suportul orizontal (6) avind capetele
imersate in cele doua compartimente, anodic si catodic. Pentru a minimaliza
efectul produselor de electroliza care se formeaza (electroliza nu poate fi evitata
in totalitate) asupra componentelor active, cele doua compartimente sint
separate de un perete (7) a carui parte superioara se situeaza sub nivelul
lichidului din compartiment astfel incit sa se poata realiza comunicarea intre
compartimente. Alimentarea celulei se face de la o sursa de curent continuu (8).
In unele situatii este nevoie sa se lucreze cu tensiuni relativ mari, motiv pentru
care trebuie realizate masuri de protectia muncii corespunzatoare. Pentru a
preveni evaporarea electrolitului din celula de electroforeza aceasta este
acoperita cu un capac transparent .
Fig. II.138.Celula de electroforeza

Modul operator este urmatorul : dupa aşezarea benzii de hirtie în celulă se


pipeteaza solutia de analizat pe banda intr-o zona in care sa fie posibila
migrarea, de obicei in centrul benzii. Se acopera celula si se porneste sursa de
curent. Dupa un timp speciile ionice se separa pe baza mobilitatii diferite in
cimpul electric. Schematic acest fenomen este reprezentat in fig.II.139 a ,b .

Fig.II.139 Principiul separarii componentilor pe zone in cazul electroforezei pe


medii stabilizante in cazul a trei specii cationice A,B,C, si a unei specii
anionice D in electrolitul purtator E+ F- a) momentul aplicarii solutiei de
analizat b) situatia dupa momentul separarii speciilor ionice .

Banda de hirtie electroforetica este scoasa din celula uscata si apoi tratata cu
reactivi pentru a scoate in evidenta zonele separate. Dupa evidentiere se
realizeaza analiza calitativa si cantitativa .

II. CROMATOGRAFIA

Analiza chimica cromatografica include mai multe metode de separare si totodata


de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie între
doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula într-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila, denumită și eluent , se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea speciilor chimice dintr-un amestec se petrece în coloana
cromatografica, piesa cheie a întregii metode. Faza mobila,– se scurge continuu, cu
viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoacă migrarea,
cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la începutul coloanei,
folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la
gazcromatografie și pompă de înaltă presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si
se afla initial fixat într-o zona îngusta de la începutul coloanei. Spalati de eluent, o parte
din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se
datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu
orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenție si
aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza în
grupuri, în fiecare grup existând doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila
sesizarea componentilor, pe rând, la parasirea coloanei, de catre un instrument, în
grupurile respective - denumite uneori zone.
Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (în mod
ideal la oricare) dintre componenti ce ies din coloana si care este plasat în eluent,
imediat dupa iesirea din coloana. Acest analizor, denumit detector este capabil sa dea
un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza
mobila. În consecinta, dispozitivul, "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce
formeaza initial proba, similar cu o fotocelula care înregistreaza trecerea concurentilor la
sosire în atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme

În orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu


concentratia, alteori cu masa componentului aflat în celula de masura, semnal ce poate
fi înregistrat în functie de timp. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de
eluent se numeste cromatograma. Pe cromatograma distingem o serie de maxime,
numite picuri (peak = vârf în l. engleza), care se produc deasupra liniei de baza sau a
portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. Aceasta apare ori de câte ori în
detector nu apare nici un component, în afara eluentului evident. Oricare pic are, în
cazul ideal, forma distributiei normale Gauss. Sa consideram cea mai simpla
cromatograma posibila: cazul introducerii unui singur component, într-un gaz, C, care
contine urme de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei cromatograme
este cel prezentat în figura II.1. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de
eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a
ordonatelor, semnalul detectorului - în unitati arbitrare.
Distingem urmatoarele elemente de baza ale unei cromatograme:
3. Picurile cromatografice. În cazul prezentat în fig. 1, cele doua semnale
sau vârfuri sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile în analiza
calitativa si cantitativa în toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde
unui component inert (aerul de exemplu în CG) - care nu este retinut de loc - iar cel de-al
doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic în cazul de fata) al probei
considerate si este datorat moleculelor care se distribuie pe parcursul migrarii prin
coloana între faza mobila si cea stationara si care, în consecinta, ies mai târziu din
coloana.
4. Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet neretinut de
catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pâna la detector. Acesta
nu poate fi zero. În cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al
aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la
injectarea (introducerea) probei în coloana si aparitia maximului de concentratie în
detector, pentru componentul neretinut.
5. Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component
al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în
fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pâna la
verticala prin vârful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau în amestec.
6. Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de
retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe):

VR = tR·Fe

7. Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea


compara timpii masurati pe coloane diferite, în cazul aceluia si component - este dat de
diferenta:
tR' = tR - tM

8. Corespunzator exista si un volum de retentie ajustat,

VR' = VR – VM

unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
VM = tM·Fe
si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.

ANALIZA CROMATOGRAFICA

Cromatografia reprezintă un un şir de procedeu prin care un


amestec de substanţe complexe în fază gazoasă sau lichidă , cu
compoziţii asemănătoare, este separat pe componente. La folosirea
cromatografiei în scop analitic imediat după separarea
componentelor amestecului acestea sînt analizate cu aparatură
spectrometrică, termoc-onductometrică, ion - conductometrică,
polarimetrică sau refractometrică în scopul determinării compoziţieie
chimice şi/sau a concentraţiei. La toate separările cromatografice
proba de analizat se solvă într-o fază mobilă care este fie un gaz fie
un lichid fie un fluid supracritic. Fenomenul separării componentelor
amestecului fazei mobile într-un cromatograf se datorează frînării
diferenţiate a deplasării acestora de către o fază staţionară ce se
găseşte fixată pe o coloană sau pe o suprafaţă plană. La
cromatografie toate componentele amestecului de substanţe
analizate pleacă concomitent şi ajung la detector pe rînd. Natura
fazei mobilă şi a fazei staţionară se alege în aşa fel încît separarea
componentelor în timp să fie cît mai avansată. Componentele frînate
mai puternic de faza staţionară se deplasează cu viteză mai mică iar
cele frînate mai puţin se deplasează cu viteză mai mare şi
corespunzător ultimele sosec primele la capătul sistemului
cromatografic de separare unde se găseşte şi detectorul. Pe baza
acestor mobilităţi diferite componentele amestecului lichid sau gazos
se separă în eşantioane de substanţe pure ce ocupă fiecare un
interval bine definit de timp de ieşire din coloană. Sistemul de
detecţie cromatografică plasat la ieşirea coloanei cromatografice
trebuie să prezinte o viteză de răspuns suficient de mare pentru a nu
exista pericolul ca anumite fracţiuni de concentraţie mică (interval
scurt de sosire la capătul coloanei) să rămînă nedectate. La ora
actuală cromatografia ocupă un loc important în chimia organică,
chimia anorganică, în biochimie, în chimia alimentară, în chimia
mediului, în expertiza criminalogică ş.a. În figura de mai jos este
redată schema de principiu a cromatografiei.

Rezultatul cromatografiei unui amestec de substanţe este o


cromatogramă, ca cea din figura de mai jos, ce este compusă dintr-
o succesiune de peak-uri in timp
Elementele unei cromatograme

La orice tip de cromatografie inălţimea peak-ului este


proportională fie cu concentratia fie cu masa componentului
analizat şi constituie baza analizei cantitative, iar timpul de
sosire este o măsură a naturii specieiei respective şi constituie
baza analizei calitative

CROMATOGRAFIA DE GAZE

Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate


amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau
există în stare gazoasă şi care nu se descompun la încălzire în
alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiză este acela în
care amestecurile supuse analizei sînt în stare lichidă din care
sînt aduse în stare gazoasă prin evaporare. Singura restrictie
pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la
substanţele la care temperatura de vaporizare este mai mare
decît temperatura de descompunere a substantelor de analizat.
In urma încălzirii acestor substanțe rezultă alţi compuşi decît
cei supuşi analizei. In aceste cazuri Înainte de introducerea
probei în cromatograf se pot realiza niste derivati (compusi noi),
volatili, utilizând anumite reactii chimice specifice, procedeu
denumit derivatizare. Uşurinta cu care se pune la punct o analiza
noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si
largile posibilitati de aplicare sunt avantajele principale ale
acestei metode. Printre domeniile în care GC si-a cucerit un loc
de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protectia
mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica. Un
gazcromatograf respectă schema bloc din figura de mai jos
avînd particularităţi specifice pentru analiza unei faze gazoase
schema lui de principiu arată ca în figura

Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purtător, 2-


reductor de presiune, 3 - manometru de înaltă presiune, 3- manometru
de joasă presiune, 5- regulator de presiune şi debit, 6- seringă de
injecţie pentru substanţe de analizat în stare iniţială lichidă, 7-dispozitiv
de evaporare rapidă , 8-cuptor termostatat de încălzire, 9- coloană
cromatografică tubulară, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12-
sistem electronic de achiziţie prelucrare şi afişare date, 13 – calculator,
14- imprimantă