LABORATORIO 01: COLORANTES Y COLORACIONES

Objetivo:

 Conocer la estructura de las bacterias y la diferenciación de estas por los distintos

colorantes empleados y la manera en que reaccionan a cada tipo de estos.

Materiales:

 Colorantes:
 Naturales: carmín, hematoxilina, tornasol
 Artificiales
 Básicos: tionina
 Ácidos: ácido pierico
 Neutros: eosinato azul de metileno
 Indiferentes: sudán III

COLORACIÓN GRAM

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado

en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe
su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en
1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana,como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose bacterias grampositivas a las que se visualizan de color morado,
y bacterias gramnegativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.
  Resultados:
 Bacilos observados con la tinción de verde de malaquita.
 Espora verde, cuerpo bacteriano rojo.

Cuestionario:

1. ¿Qué precaución es fundamental antes de colocar aceite de cedro sobre la

lámina coloreada?

El colorante debe haber secado totalmente.

2. ¿Cuál es la posición del condensador en una observación de una muestra

coloreada en inmersión?

Se debe subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz.

3. ¿Cuál es la posición correcta del condensador en una observación en fresco y a

mediano aumento?

Se debe descender el condensador, pero con mucho cuidado.

4. ¿Cuál es el comportamiento más usual de los cocos y cuál es el de los bacilos

en la coloración Gram?

Cocos Gram (+): como diplococos en forma de collar, racimos, tétrada.

Bacilos Gram (-): son alargados y en forma de bastón.
 LABORATORIO 02: MÉTODO DE MANEVAL

Objetivo:

 Demostrar la presencia de una cápsula en la estructura bacteriana, y conocer la

importancia de la misma.

La cápsula bacteriana es la capa con borde definido formada por una serie de polímeros
orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular.
Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes,
incluyendo polialcoholes y aminoazúcares.
La cápsula es una capa rígida organizada en matriz impermeable que excluye colorantes
como la tinta china. En cambio, la capa de material extracelular que se deforma con
facilidad, es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa
mucosa o glucocalix.

Muestras:

Observación: Staphylococcus aureus

Aumento: 1000x

Coloración: GRAM +

Comentario: Staphylococcus aureus, conocido

comúnmente como estafilococo dorado es el
patógeno humano más importante que coloniza la
piel de la mayoría de los seres humanos, por su
coloración rosa es Gram +
 Observación: Basillus subtilis

Aumento: 1000x

Coloración: MANEVAL

Comentario: Bacillus subtilis es

una bacteria Gram positiva, encontrada en el
suelo, tiene la habilidad para formar una
resistente endospora protectora,
permitiéndole tolerar condiciones
ambientalmente extremas.

Observación: Escherichia coli

Aumento: 1000x

Coloración: GRAM

Comentario: Escherichia coli (E. coli) es una bacteria

que se encuentra normalmente en el intestino del ser
humano y de otros animales. “Aunque no parece que
su presencia tenga una función especialmente
relevante, se ha descrito que la bacteria E. coli favorece
la absorción de algunas vitaminas, especialmente la
vitamina K.

Observación: Klebsiella sp

Aumento: 1000x

Coloración: GRAM

Comentario: Fam. Enterobacteriaceae, bacilos

pequeños gram negativos, no móviles, anaerobios
facultativos, se encuentran como células individuales
no agrupadas, tienen cápsula y forman colonias
mucosas.
 LABORATORIO 03: PREPARACIÓN DEL CALDO COMÚN

Objetivo:

 Conocer las variadas condiciones necesarias para el desarrollo de las distintas

bacterias.

Materiales:

 Cocina: diluir los componentes.

 Probeta: instrumento que sirve para medir un líquido.
 Matraz: instrumento en el que se pueden mezclar los ingredientes.
 Balanza: pesar los ingredientes a utilizarse.

Ingredientes:

o NaCl 0.25gr
o Agua destilada 50ml
o Peptona 0.5gr
o Extracto de carne 0.3gr
o Infusión de carne 1000ml
 LABORATORIO 04: ESTERILIZACIÓN

Se refiere a la acción de destruir los gérmenes patógenos o de hacer estéril e infecundo

algo que antes no lo era.

Objetivo:

 Destruir o separar los gérmenes de un medio determinado y en un aspecto básico

en la técnica bacteriológica.

Procedimientos:

 Calor seco: se requiere altas T° y tiempo prolongado.

 Vapor saturado a presión: es el medio de esterilización más usual y más efectivo.
 Flameado: exposición directa del material a la llama, frecuentemente usado para la
esterilización del asa de platino.
 Ebullición: esterización de jeringas y agujas.
 LABORATORIO 05: SIEMBRA Y AISLAMIENTO

Objetivo:

 Conocer el método para el cultivo de bacterias, la manera de aislarlas y brindar

la experiencia necesaria en el manejo de las técnicas para realizar dichos
procesos.

A. BACTERIAS:

 Shigella
 Proteus
 Pseudomona
 Scherichia coli

B. MEDIOS:

 Úrea
 Caldo pectonado
 Caldo gluconado
 Nitrado
C. SIEMBRA:

1. ÚREA:

 Proteus

 Escherichia coli

2. CALDO PECTONADO:

 Escherichia coli

 Proteus

3. CALDO GLUCONADO:

 Pseudomona
 Scherichia coli
 Siguella
 4. NITRADO

 Scherichia coli
 Pseudomona

D. INOCULACIÓN DE GÉRMENES EN LOS MEDIOS:

1° 2° 3°
Se esterilizó el asa Se sacó al germen Se inoculó al germen
bacteriológica de su frasco en el medio

E. INCUBACIÓN
Cuestionario:

1. ¿Es posible aislar gérmenes en estado de pureza en medios líquidos a partir de

muestras con flora variada?

Si es posible si el medio repite las condiciones adecuadas para la vida de los

gérmenes.

2. ¿Qué importancia tiene el aspecto de una colonia?

El aspecto de colonia tiene importancia de identificación ya que muchas veces es

plenamente característico y pueden distinguirse tipos de bacterias entre si en
cultivos mixtos o contaminados.

3. ¿Qué importancia tiene la capacidad de un germen de desarrollar o no en un

medio simple?

El medio simple consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes
necesarios para permitir en condiciones favorables de Ph y T° el crecimiento de
gérmenes.

4. ¿Qué le indicaría la presencia de un bacilo y un coco en la coloración de una

suspensión hecha a partir de una colonia?

Indicaría contaminación del medio.

 LABORATORIO 06: ACCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SOBRE DIVERSOS SUSTRATOS

Objetivo:

 Demostrar de manera preliminar acciones enzimáticas de los gérmenes sobre

algunos sustratos.

Medios:

1. Úrea:

E.coli: negativo

Proteus: positivo. La hidrólisis de úrea origina Ph

alcalino y el indicador vira a rojo.

2. Caldo pectonado:

E.coli: presencia de HCl negativo. Prueba de indol

positivo, se formó el anillo rojo ya que el organismo
tiene la habilidad de romper el indol.

Proteus: presencia de HCl positivo, se formó el color

negro en la cinta. Prueba de indol positiva,
organismo también tiene la habilidad de romper
indol del triptófano.

3. Caldo glucosado:

Pseudomona: no fermenta a la glucosa

Shiguella: ataca a la glucosa formando ácidos orgánicos,

esto origina disminución del Ph y el indicador vira a
amarillo.
E.coli: ataca a la glucosa, al degradarla forma hidrógeno y
dióxido de carbono que se acumularon en la campana de
Durham.
 4. Nitrado:

E.coli: Se emplearon dos reactivos NO3 A y NO3B. Presencia

de nitritos positiva, el caldo viro a rojo intenso.

Pseudomona: se emplearon dos reactivos NO3A y NO3B.

presencia de nitritos positiva, el cado viro a rojo intenso.

Cuestionario:

1. ¿Qué importancia tiene el estudio de las propiedades bioquímicas de un

microorganismo?

Son importantes porque de esa manera podemos determinar que sustancias

benefician o deterioran al microorganismo.

2. ¿A qué productos se debe la variación de Ph en un medio con hidratos de

carbono?

Esto se debe a la presencia de azúcares, como hexosas y pentosas.

3. ¿Qué entiende usted por hidrólisis de la úrea?

Es el paso de la úrea a CO2 y Amoniaco.

4. ¿Qué productos finales de la degradación de úrea y otras sustancias nitrogenadas

son fácilmente detectables en el laboratorio?

CO2 , H2O , NH3.

5. ¿Qué tipo de peptonas, desde el punto de vista de su composición química,

favorecen la producción de H2S?

Cisteína y Metionina.
 LABORATORIO 07: ACCIÓN DE LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS

Objetivos:

 Demostrar la acción de los agentes físicos y químicos sobre las bacterias.

QUÍMICOS:

A. Desinfectantes:
- Suspensión de Escherichia coli en solución salina.
- Inoculación de desinfectantes en discos embutidos sobre placa Petri con la
suspensión y caldo nutritivo.
- Incubación
Resultados:
FORMOL 10 % : Sensible
ALCOHOL 70 %: Resistente
FENOL 1% : Resistente
LEJÍA: Sensible
ALCOHOL IODADO: Resistente

Se concluyó que como se había

formado un halo alrededor del formol y
la lejía, no se desarrolló el organismo.

FÍSICOS:

A. Ph:
- Se colocó el contenido de cada tubo (caldo de carne+ Escherichia coli ) en pH
diferentes(pH=2/ pH=7/ pH=10) y luego los incubamos.

Resultados:

1° Tubo (pH=2) : No hay desarrollo del

organismo

2° Tubo (pH=7): Si hay desarrollo del

organismo.

3° Tubo (pH=10):Poco desarrollo del

organismo
 Se concluyó que el desarrollo de E.coli se da en un pH básico y no en un ácido.

B. T°
- Calentamos el contenido de cada tubo (caldo de carne + Bacillus subtilis) en
diferentes tiempos (t=1min/ t=5min/ t=10min) y luego los incubamos.

Resultados:
1° TUBO(t=1min) : Mas desarrollo.

2° TUBO(t=5min): Poco desarrollo.

3°(t=10min): No hay desarrollo.

Se desarrolló Bacillus subtilis a una T° baja

y no tiene desarrollo a una elevada.

Cuestionario:

1. Señale el mecanismo por el cual la temperatura produce la muerte bacteriana.

La T° logra producir la muerte de la bacteria debido a que desnaturaliza sus

enzimas.

2. ¿Por qué las placas de cultivo sembradas se incuban a 37°C?

Debido a que esta es su temperatura óptima para desarrollarse.

3. ¿Qué explicación daría usted a la acción de los agentes químicos?

Su acción se debe a que actúan sobre diferentes estructuras bacterianas.

 LABORATORIO 08: ANTIBIOGRAMA

Objetivos:

 Medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de

una infección a uno o varios antibióticos.
 Seguir la evolución de la resistencia bacteriana.

Para un determinado antibiótico una cepa bacteriana es según la NCCLS:

 Sensible: si existe una buena probabilidad de éxito terapeútico en el caso de un

tratamiento.
 Resistente: si la probabilidad de éxito es nula o muy reducida.
 Intermedia: cuando el éxito terapeútico es impredecible.


Materiales:

- Antibióticos:
Cefamansol (ACMA)
Ac. Pipemidico (Pi)
Lincomicina (LL)
Doxiciciclina (Do)
Cefixima (CFM)
Cefatoxima (CTX)
Rimfampicina (R)
Ac. Nalidixico (NA)
Ampiciclina (AM)
Tetraciclina (T)
Cefazolina (Cez)

1. Suspendemos E. coli en solución salina fisiológica.

2. Sembramos en la placa Petri.
3. Colocamos encima del sembrado los antibióticos.
4. Incubamos.
Cuestionario:

1. ¿Qué opinaría usted si dentro de un nítido halo de inhibición desarrollan varias

colonias?

Nos dice las colonias se unieron afectados por los antibióticos en el inicio y más
aun así llegarían a crecer.

2. ¿Qué factor tomaría en cuenta para elegir en atibiótico, además del resultado del
antibiograma?

- Deben impedir formar resistentes.

- No producir efectos colaterales.
- No deben eliminar la flora bacteriana.

3. ¿Qué opinaría si los discos antibióticos pertenecientes a un lote producen un

efecto frente a un germen y discos del mismo antibiótico de otro lote no produce
efecto alguno?

Nos indica que el primer germen posee supceptibilidad a esos antibióticos,

mientras que el segundo germen no.
 LABORATORIO 09: ESPECTRO ANTIBIÓTICO

Objetivo:

 Manejo de técnicas orientadas a determinar “in vitro” la acción de un antibiótico

frente a diversos microorganismos.

El espectro antibiótico se refiere a un antibiótico que actúa contra varios

microorganismos.

- Antibiótico de amplio espectro: actúa contra una amplia gama de bacterias

patógenas.
- Antibiótico de espectro reducido: sólo es eficaz contra bacterias específicas de
bacterias.

Organismos:

 E.coli
 Salmonella
 S.aureus
 B.subtillis
 Pseudomonas

1° 2° 3°

Se colocó el antibiótico Se colocó diagonalmente Se procedió a incubar

rifampicina en el centro cada uno de los

de la placa petri. microorganismos.