Sunteți pe pagina 1din 20

1.Antibiograma difuzimetrica. Principiu, interpretari.

Antibiograma este o metodă care stabilește pe o cultură bacteriană de laborator sensibilitatea


sau rezistența unei bacterii față de un antibiotic.
Există 2 metode prin care se poate determina sensibilitatea germenilor la antibiotice: metoda
difuzimetrică (Kirby-Bauer) și metoda diluțiilor (MIC — concentrația minimă inhibitorie). Cea
mai frecvent utilizată datorită simplității și costului redus este metoda difuzimetrică.
1. Tehnica difuzimetrica Kirby Bauer:
* Materiale necesare:
- germenul de studiat (inocul),
- geloza Mueller Hinton (valoarea nutritiva permite dezvoltarea majoritatii germenilor, nu
contine inhibitori ai actiunii substantelor antimicrobiene),
- substante antimicrobiene: antibiotice si chimioterapice (microcomprimate de 6 mm,
impregnate cu anumite cantitati, diferite, de substanta antibacteriana activa,

* Principiul metodei : consecutiv depunerii de microcomprimate impregnate cu antibiotic


pe suprafata unui mediu solid insamantat cu cultura bacteriana, au loc urmatoarele procese fizico
– chimice :
- microcomprimatul absoarbe apa din mediu- necesara dizolvarii substantei antimicrobiene
active, care, ajunsa in solutie, va difuza in mediu conform legilor fizice ce conditioneaza
difuziunea moleculelor in gelul de agar, prezentand o scadere constanta a gradientului de
concentratie, de la marginea discului spre periferie. Sensibilitatea bacteriei la un anumit
antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii, din jurul
microcomprimatului impregnat cu antibioticul de testat.
Cu tehnica difuzimetrica nu se pot testa decat germenii cu crestere rapida si constanta.
* Standardizarea conditiilor tehnice si a reactivilor de lucru :
Fiecare din componentele ce concura la efectuarea antibiogramei pot influenta diametrul
zonei de inhibitie si, deci, criteriile de interpretare.

1. Mediul de cultura : geloza Mueller - Hinton


- asigura o dezvoltare buna a majoritatii germenilor patogeni cu crestere rapida,
- nu exercita antagonism fata de agentii antimicrobieni,
- contine concentratii adecvate de Ca si Mg,
- este izotonic pentru sangele care trebuie adaugat in anumite situatii (testarea sensibilitatii
streptococilor beta – hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, geloza Mueller- Hinton se
suplimenteaza cu sange berbec 5- 10%),
- pentru testarea sensibilitatii hemofililor, se utilizeaza pentru antibiograma un mediu
special, care contine factori de crestere, X, V,
- compozitie definita,
- asigura reproductibilitate de la lot la lot,
- compozitie standard si consistenta corespunzatoare,
- pH : 7,2 – 7,4,
- grosimea stratului de geloza : 4 mm (25 ml mediu pentru diametrul placii de 90 mm),
2. Germenul de testat :
- agentul etiologic de testat sa fie in cultura pura,
- contraindicata efectuarea antibiogramei din flora bacteriana mixta,
- efectuarea antibiogramei indicata pentru acele specii bacteriene a caror CMI nu e o
constanta dinainte previzibila,
- se testeaza numai bacteriile cu dezvoltare rapida, uniforma, si indeosebi, acelea care au
tendinta de a castiga rapid rezistenta fata de medicamentele de uz clinic,
- antibiograma direct din produs se face in cazul produselor biologice normal sterile si
contaminate cu un singur germen ( LCR, hemocultura, lichid pleural, urina),
- antibiograma efectuata imediat ce se izoleaza si identifica germenul ; stocarea
indelungata duce la aparitia determinantilor de rezistenta.

* Inoculul : - sa fie reprezentativ, preparat din 4 – 6 colonii identice,


- marimea inoculului riguros standardizata nefelometric (turbiditate standard : 0,5 unitati
MacFarland),
- insamantarea inoculului pe placi se face la max 15 min de la momentul prepararii,
- cu ajutorul unui tampon steril de vata se inoculeaza placa, prin rotare in 3 directii diferite,
pana la acoperirea uniforma a suprafetei mediului,
- placile insamantate se lasa la temperatura camerei pentru uscarea inoculului inainte de
depunerea microcomprimatelor,
- daca inoculul si insamantarea placilor s-a efectuat corect, se obtine o cultura bacteriana
uniform confluenta.

3. Substante antimicrobiene :
- sunt comprimate cu diametrul de 6 mm, iar pe fata este imprimat simbolul respectiv
(simbolul denumirii antibioticului: A, TE, CIP, NOR etc, eventual incarcatura de
antibiotic pe microcomprimat : 1μg, 5μg…30 μg),
- conservarea microcomprimatelor : la adapost de lumina, caldura, umiditate,
- inainte de utilizare, se mentin la temperatura camerei 30 min pentru echilibrare termica,
- interzisa folosirea comprimatelor cu termen de valabilitate depasit,
- selectionarea setului de microcomprimate pentru antibiograma :
- 2 sau 3 seturi prin combinarea truselor de microcomprimate distribuite :
- unul pentru germeni Gram – pozitivi,
- unul pentru germeni Gram – negativi,
- unul pentru infectii urinare,
- set de microcomprimate pentru bacili Gram (-) izolati din infectii digestive,
- asezarea spatiala a microcomprimatelor se face pe grupe de agenti antimicrobieni,
- depunerea microcomprimatelor se face cu pensa oftalmologica, tip Iris, presand usor
fiecare microcomprimat, pentru a ajunge toata suprafata lui in contact cu cultura sau cu
ajutorul unui dispozitiv numit « dispencer »,
- se va respecta o distanta de 15 mm de la marginea placii si aprox. 24 mm intre marginile
comprimatelor sau 30 mm distanta intre centrele lor,
- pe o placa de 90 mm diametru se pot pozitiona 8 comprimate.
Placile de antibiograma se incubeaza la 37ºC, timp de 18- 20 ore, in aerobioza, dupa
care se efectueaza citirea.
Placile cu mediu Mueller Hinton cu 5- 10 % sange de berbec, folosite pentru testarea
sensibilitatii streptococilor, pneumocilor, meningococului etc, se incubeaza in atmosfera
aeroba, suplimentata cu 5% CO2 (exicator cu lumanare sau plicuri geeneratoare de CO2).
In Laboratorul de Microbiologie Clinica se folosesc seturile mentionate, ale
caror antibiotice sunt strict necesare, in functie de felul germenilor si localizarea
infectiei.

* Citirea, exprimarea si interpretarea rezultatelor :

- se supun citirii numai placile care prezinta o cultura corespunzatoare dpdv al puritatii si
densitatii,
- citirea se efectueaza cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie, in mm, de 2-3
ori, in diferite directii, cu o rigla,
- pe mediile fara sange masurarea diametrului se face direct pe fundul placii, in lumina
reflectata,
- daca s-a adaugat sange, zona de inhibitie se determina prin masurarea la suprafata, in
lumina reflectata, dupa indepartarea capacului cutiei Petri.
- exprimarea rezultatelor se face in acord cu standardul CLSI, prin incadrarea marimii
diametrului de inhibitie a cresterii culturii, in categoriile: sensibil/ S, intermediar/ I, rezistent/
R.
- se foloseste programul WHONET de interpretare si raportare a rezistentei germenilor la
antibiotice, bazat pe interpretarea conform Standardului CLSI 2008.

* Se iau in consideratie :
- colonii mari, bine dezvoltate, aparute in zona de inhibitie, colonii ce reprezinta mutante
rezistente in cadrul unei populatii microbiene, predominant sensibile.
- astfel de colonii se vor rerepica, identifica, retesta sensibilitatea la antibiotice.

Control de calitate : tulpini de referinta – Staphylococcus aureus ATCC


25923, E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

* Surse de eroare :
- alt mediu decat geloza Mueller – Hinton,
- mediu necontrolat din punct de vedere al pH – ului,
- folosirea microcomprimatelor cu termen de valabilitate depasit,
- inocul nestandardizat,
- depasirea intervalelor de timp intre prepararea inoculului si insamantare, intre
insamantare si aplicarea comprimatelor, intre aplicarea lor si incubare,
- perioada de incubare prea scurta,
- testarea pe culturi mixte, produse pluricontaminate, pe germeni cu dezvoltare lenta,
- citire inexacta a diametrelor zonelor de inhibitie sau transcrierea lor eronata,
lipsa controlului de calitate, cu tulpini de referinta.

2.Exudatul faringian. Mod de recoltare, insamantare, interpretare.


Un exudat faringian este un examen care identifica prezenta unei infectii bacteriene, fungice sau
virale la nivelul regiunii faringiene. Cu ajutorul unui tampon steril se va preleva o mostra de
secretii de la nivelul partii posterioare a faringelui, din jurul amigdalelor si de la nivelul oricarei
zone inflamate a cavitatii bucale. Examenul microscopic nu are relevanta ( cu exceptia faringitei
necrozante pentru ca este produsa de 2 bacterii: fuzobacterium si o spirochete. Are denumirea de
angina Claud-Vincent) deoarece streptococii orali au aceeasi structura ca cei beta-hemolitici.
Diferentierea are loc pe geloza sange, formand colonii mari, translucide, mucosae, cu o zona de
beta-hemoliza in jur.

Nu exista crestere a microorganismelor la nivelul


Normal (rezultat negativ) culturii (bacterii, fungi sau virusuri)

a.Exista crestere bacteriana la nivelul culturii. Cel


mai frecvent exista infectii cu bacterii care produc:

- infectii faringiene streptococice, scarlatina sau


febra reumatica (streptococ B hemolitic de grup A)
- meningita (Neisseria meningitidis)
- difteria (Corynebacteriae diphteriae)
- tuse convulsiva (Bordetela pertussis)
Anormal (rezultat pozitiv)
b.Fungii (Candida albicans) care produc afte, pot
creste de asemenea la nivelul culturii faringiene.
c.Virusurile care pot creste la nivelul culturii sunt:

- enterovirusul
- virusul Epstein-Barr
- herpesvirusuri

Se însămânţează proba pe agar Columbia cu 5% sânge de berbec şi, la cerere, când medicul
clinician solicită şi flora, pe agar Chocolate.
Se incubează aerob în atmosferă cu 5% CO2, 24 h la 37°C, cu prelungire până la 48 h dacă la
prima citire a plăcilor nu se observă coloniile caracteristice germenului urmărit.
Coloniile caracteristice se repică în vederea obţinerii culturii pure pentru identificare.
Se realizeaza testul sensibilitatii la bacitracina si catalaza unde este negativ. De asemenea s
realizeaza si latex aglutinare pentru identificarea serogurpurilor si antibiograma pentru
macrolide.
3.Urocultra. Mod de lucru, insamantare, interpretare.

Modul de lucru: Insamantarea este directa cu ansa calibrate, de unica folosinta, pe care o
incarcam cu 1 microlitru de urina. Cultivarea are loc pe geloza sange pentru stafilococul
saprofiticus, streptococcus agalactiae si enterococcus, iar pentru E. coli, Proteus si alte
enterobacterii cultivarea se face pe geloza lactozata.
Patologii: infectii urinare
Recoltarea:
1. Proba curate prinsa din jetul mijlociu:
Inainte de administrarea de antibiotic sau antiseptic
Dupa toaleta riguroasa a roganelor genital externe
Prima urina dimineata sau la minim 3 ore dupa ultima mictiune
Jet mijlociu
Volum de 20ml, in recipient steril cu capac etans.
2. In cazuri special- probe recoltate invaziv
Urocultura poate fi efectuata prin metoda dilutiilor sau metoda ansei calibrate.
Tehnica de insamantare: se face un striu diametral si alte 10 perpendiculare pe acesta. Pe
geloza sange este realizata insamntarea cu ansa prin dispersie. Pentru obtinerea unei colnii pure
se realizeaza repicarea: trecerea coloniei cu ansa de pe un mediu geloza sange pe alt mediu
geloza sange.
Interpretare: Se numara coloniile iar daca numarul este peste 100.000 atunci diagnosticul este
de infectie urinara doar daca sunt prezente si leucocite, in cazul absentei acestora proba este
posibil sa fie contaminate.
Germenii cel mai frecvent intalniti sunt:
a.bacili Gram negativi glucozo-fermentativi (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter,
Citrobacter, Morganella, Providencia);
b.bacili Gram negativi glucozo-nefermentativi (Pseudomonas, Acinetobacter);
c.coci Gram pozitivi (Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,
Streptococcul hemolitic grup B).

4.Coprocultura. Mod de lucru, insamantare, interpretare.

Recoltare materii fecale. Recipiente speciale cu lopatica si mediu de transport Carry Blaire.
Examen macroscopic: scaune moi, apoase, frecvente, cu mucus, culoare si miros
Dupa recolatre nu are loc cultivarea ci se face suspensie in ser fiziologic steril. Se face dispersie
cu pensa pe medii de cultura:
a.diferentiale – geloza lactozata (AABTL), CLED
b.solide selective - slab selective:MacConkey,
- moderat selective: ADCL, SS, Kektoen,
- inalt selective: Wilson Blair (pentru Salmonella typhi)
Imbogatire: selenit acid de sodium, mediu Rappaport
- timp de incubare in etapa de imbogatire: 18- 20 ore
- raport 1/10 intre volumul de materii fecale si volumul de mediu de imbogatire
(1 ml scaun + 9 ml mediu lichid/selenit)

Incubare 24-48 ore la 37 grade

Identificare:
* caractere microscopice: bacilli Gram (-), nesporulati, necapsulati,
* caractere culturale:
- pe mediul ADCL, Salmonella spp, se dezvolta sub forma de colonii lactozo (-), necolorate sau
de culoarea mediului, transparente sau usor opace, rotunde, cu suprafata bombata, lucioasa, tip
“S”, cu sau fara H2S,
- pe mediul Wilson Blair, Salmonella typhi realizeaza colonii negre, rugoase, cu luciu metalic si
halou negru, brun, colonii tip “R”.
Etiologie: – Enterobateriaceae patogene: Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli
enteropatogen, enterotoxigen, enterohemoragic, enteroinvaziv, enteroaderent, enteroagregativ,
Yersinia enterocolitica
– Enterobacteriaceae conditionat patogene: Klebsiella spp. (sindromul diareic al
noului nascut), Serratia marcescens (“sindromul scutecului rosu” – prin colonizare anormala cu
aceasta bacterie la nou nascuti)
– Vibrio cholerae, Vibrio parahaemoliticus
– Alti bacili Gram negativi: Aeromonas, Alcaligenes, Plesiomonas
– Coci Gram pozitivi: Staphylococcus aureus
- Bacillus cereus, Clostridium difficile (enterocolita pseudomembranoasa post
antibioterapie), Clostridium perfringens, Clostridium botulinum
- Campylobacter
- Candida
Salmonella:

MEDIUL SUBSTRATUL MODUL DE OBSERVATII


COMPORTARE
GLUCOZA ACID (galben-
(partea dreapta) fermentarea -
TSI glucozei))
LACTOZA- ALCALIN
ZAHAROZA (culoarea mediului,
(partea inclinata) roz – rosu, -
nefermentarea
lacozei si/ sau
zaharozei)
GAZ din + Salmonella typhi
fermentareaglucozei cu rare exceptii nu produce gaz
+ S. typhi poate fi
H2S cu rare exceptii neproducatoare de
H2S
MOBILITATE +
MIU INDOL -
UREE -
LIZIN – + (-)
MILF DECARBOXILAZA La S. paratyphi A
FEN-ALA -
Shigella

Mediul Substrat Modul de Observatii


comportare
Acid (galben – -
Glucoza (partea fermentarea
dreapta) glucozei)
Alcalin (culoarea -
mediului-
Lactoza, zaharoza nefermentarea
TSI lactozei si
zaharozei)
Exceptie :
Formare gaz din - unele tulpini de
glucoza Shigella flexneri 6
H2S - -
Mobilitate - -
MIU Indol +/- -
Uree - -
Lizin- - -
MILF decarboxilaza
Fenil- - -
alanina

5.Hemocultura. Mod de lucru, insamantare, interpretare.

Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange.


Recoltare: 5-10 ml la copil, 20 ml la adult, sangele este prelevat in conditii de stricta asepsie,
este insamantat in flaconul de hemocultura a carui compozitie favorizeaza dezvoltarea
germenilor.

Flacoanele sunt puse intr-un aparat timp de 7-14 zile. Acesta functoneaza pe baza de
spectrofotometrie, prezentand indicatori ce indica virajul culorii si al pH-ului in prezenta
bacteriilor ce cultiva.

Sangele este scos din aparat si este cultivat pe geloza sange si geloza lactozata, insamantarea
avand loc cu ansa.
Staphylococcus aureus, Escherichia coli si alte enterobacterii, stafilococ
Septicemie coagulazo-negativ (SCN), Pseudomonas spp, Streptococcus spp, bacterii
anaerobe, levuri

Endocardita Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp

Pneumopatii Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae

Meningite Neisseria meningitidis

6.Dg. de laborator in infectiile produse de Staphylococcus aureus

Recoltarea produsului patologic - in functie de sdr clinic: puroi, sange, sputa, materii
fecale si/sau alimente, LCR etc.
• infectii cutanate, osteomielita – puroi
– colecţie inchisa - prelevare chirurgicala,
– colectii deschise sau fistulizate - recoltarea cu tampoane sterile;
• infectii purulente ale seroaselor - punctionarea cavitatiii respective cu o seringă sterilă şi
introducerea produsului patologic (lichid pleural, articular etc.) in eprubete sterile;
• infectii urinare - urocultura
• septicemii - hemocultura
• toxiinfecţii alimentare - materii fecale, varsaturi, resturi alimentare;
Ex microscopic al frotiului din produsul patologic – doar pentru produse necontaminate:
leucocite şi coci sferici gram pozitivi, dispuşi în grămezi, în perechi sau izolat, intra şi
extracelular
• Izolare – la 37 C, 18 ore
– produse necontaminate - geloza sange – colonii S, obisnuit β hemolitice, pigmentate
– produse contaminate - mediu selectiv hiperclorurat (m. Chapman) – inhiba
multiplicarea altor bacterii; coloniile S aureus manitol pozitive (diferentiere de
alti stafilococi)
• Testul catalazei
– permite diferentierea stafilococilor (catalazo pozitivi) de streptococi (catalazo negativi)
Testul coagulazei
• coagulaza legata (clumping factor) – testul coagulazei pe lama – suspensie tulpina de
testat si o picatura de plasma; citire 1-2 min.
in cazul tulpinilor S. aureus neproducatoare de coagulaza legata (5%) este necesar testul
coagulazei la tub
• coagulaza libera – testul coagulazei la tub – necesita plasma citratata de iepure
diluata 1:5 si cultura de stafilococi in mediu lichid; citire dupa incubare la 37 C, 1-4
ore
• Identificare S. aureus
– caractere microscopice
– caractere de cultura
– Testul catalazei pozitiv (diferentiere de Streptococi)
– Testul coagulazei pozitiv (diferentiaza S aureus de stafilococii
coagulazo-negativi)
– Alte teste biochimice
– Identificarea ADN – prin metode moleculare (Real-time PCR)
– in toxiinfectii alimentare – izolarea S. aureus producator de enterotoxine, ex serologic
ofera rar informatii utile
• Alte metode – in scop epidemiologic
– Lizotipare – utilizarea unor seturi de bacteriofagi
– Genotipare – prin metode moleculare (PCR, PFGE etc.)
Testarea sensibilitatii la Atb

• Antibiograma difuzimetrica – pentru toate izolatele cu semnificatie clinica


• Determinarea CMI si CMB – pentru izolate din septicemii
• MRSA – cauza frecventa de infectii nosocomiale
• Identificarea tulpinilor MRSA (izolate din infectii sau pentru supravegherea
colonizarii) - metode
– Real-time PCR - gena mecA
– Latex aglutinare – PBP2A
– Antibiograma difuzimetrica pe mediu cu 6.5% NaCl si incubare la <35° C – testare cu
oxacilina 6ug/mL
– medii selective cromogene
Identificarea tulpinilor cu sensibilitate scazuta la vancomicina – prin determinarea CMI

7. .Dg. de laborator in faringita streptococica.

Norme de recoltare:

- recoltare cat mai aproape de debutul bolii,


- inaintea administarii de antibiotice,
- ex faringian se recolteaza dimineata, inainte de ca pacientul sa manance, inainte de a se
spala pe dinti sau de a face gargarisme cu substante antiseptice,
- respectarea conditiilor de asepsie si antisepsie in recoltarea produsului patologic,
- folosirea echipamentului de protectie pentru prevenirea contaminarii personalului de
laborator,

Transport
rapid (max 1 – 2 ore) si utilizarea mediilor de conservare si transport: Stuart, Amies, Pike (mediu
de imbogatire si selectiv, numai pentru izolarea Str. Beta hemolitic grup A/ Str. pyogenes in
perioada de triaj epidemiologic al anginelor streptococice in colectivitati: bulion glucozat 0,2%,
hematii de berbec, azida de sodiu si cristal violet, care inhiba stafilococul si bacilii Gram
negativi)

Examen macroscopic al prodului patologic: aspectul purulent, culoare, miros, consistenta


etc.,

Examen microscopic:

- examinarea unui frotiu colorat Gram din scretie faringiana (de ex.) pune in evidenta
prezenta cocilor Gram pozitivi alungiti, in diolo, lanturi scurte, dar nu ofera nicio relatie despre
caracterele de patognitate; pot fi streptococi viridans, saprofiti. Singurul diagnostic bacteriologic
care se pune pe frotiu colorat Gram este prezenta asocierii fuzo- spirilare (bacili fuziformi +
bacili spiralati Gram negativi, anaerobi) care determina angina ulcero-necrotica Plaut- Vincent.

Detectie directa in produs patologic a antigenului de grup A, ce apartine Str. beta hemolitic
grup A/ Str. pyogenes. Exista kituri comerciale pentru aceasta detectie. Alte metode: ELISA,
latex- aglutinare, co- aglutinare. Aceste teste au doar valoare orientativa, diagnosticul
bacteriologic se impune in toate infectiile streptococice.

Insamantarea produselor patologice. Izolare bacteriana.

- medii de cultura: streptococii necesita pentru dezvoltare medii cu sange (le lipseste catalaza).
Se utilizeaza medii imbogatite cu glucoza (le stimuleaza inmultirea), si cu lichide organice
(sange iepure, cal, berbec, lichid de ascita, care asigura aportul de aminoacizi si vitamine).

* medii de cultura solide pentru izolarea streptococilor:

- geloza/ sange berbec 5-10%,

- mediul SSP (mediu selectiv pentru streptococ si pneumococ, care contine geloza, acid nalidixic,
cristal violet, glucoza, sange defibrinat de berbec)

* medii de cultura lichide pentru izolare streptococi:

- bulion glucozat 0,2%,

- bulion Todd- Hewitt.


Exudatele faringiene recoltate se pot insamanta in prima zi in mediul Pike (imbogatire
streptococi beta hemolitici), si se incubeaza 4 ore pana la 24 ore, la 37 ºC. Apoi se descarca pe
placi de geloza – sange, cu incubare 18- 20 ore la 37ºC, in atmosfera imbogatita cu 5-10% CO2.

Identificare bacteriana:

* pe baza caracterelor culturale:

- Caractere culturale: pe mediu geloza- sange berbec, streptococul se dezvolta sub forma de
colonii mici, transparente sau translucide, bombate, cu marimea de la un varf de ac la 0,5- 1 mm,
cu zona larga de hemoliza completa, β, in jur (hemoliza depaseste de 2-4 ori diametrul coloniei).

- Coloniile pot avea mai multe aspecte: colonii mucoase “M” (rotunde, convexe, mucoase, cu
tendinta la confluare), colonii “matt” (plate, cu suprafata mamelonata, translucide, confluente),
colonii “glossy” (mici, rotunde, lucioase, cu centrul ridicat, consistenta apoasa), colonii “R”
(rugoase, plate, margini neregulate).

- Primele 2 tipuri de colonii sunt caracteristice streptococilor virulenti, iar ultimele apartin
streptococilor lipsiti de antigen “M” (necapsulati, nevirulenti). Aceste aspecte culturale variaza
in functie de mediul utilizat si atmosfera de incubare.

- In cursul insamantarii, pe laturile poligonului obtinut in urma dispersiei, trebuie intepat mediul
de cultura cu ansa, in profunzime, astfel incat, actiunea hemolizinei “O” sa fie stimulata, in
atmosfera anaeroba (streptolizina inactivata de prezenta oxigenului).

- Caractere culturale in mediu de cultura lichid (bulion glucozat 0,2%), dupa incubare 18-20 ore
la 37°C, streptococii se dezvolta sub forma de depozit grunjos, pe fundul tubului si pe peretii
acestia, lasand mediul clar deasupra.

* pe baza caracterelor biochimice:

- Testul sensibilitaii la bacitracina: metoda simpla, care diferentiaza streptococii piogeni/ grup A
(bacitracina- sensibili) de celelalte grupe de streptococi beta hemolitici, grup non-A (bacitracina-
rezistenti). Procent subunitar de tulpini de Streptococi beta hemolitici grup A sunt rezistenti la
bacitracina si exista tulpini de streptococi beta hemolitici grup non- A sensibili la bacitracina
(exceptii).

Tehnica: pe o placa cu mediu geloza- sange se efectueaza cu ansa bacteriologica sectoare de


cultura pura, prin insamantare striu langa striu, dens (dintr-o singura colonie caracteristica de
streptococ beta hemolitic se obtine un sector). In mijlocul sectorului se aplica un disc de
bacitracina si se incubeaza placa la 37°C, pana a doua zi. Daca tulpina de cercetat apartine
grupului A, cresterea culturii va fi inhibata in jurul discului de bacitracina pe o suprafata cu
diametrul de cel putin 10 mm. Daca cresterea bacteriana se produce pana in marginea discului de
bacitracina (tulpina este rezistenta), aceasta nu apartine grupului A, ci altui grup serologic.
- Testul PYR pozitiv (streptococul beta hemolitic grup A/ Streptococcus pyogenes este
producator de pirolidonil- amidaza).

- Rezistenta la trimethoprim- sulfamethoxazol: diferentierea intre streptococii beta hemolitici


grupurile A si B (rezistenti) de streptococii beta hemolitici ce apartin grupurilor serologice C si
G (sensibili).

- Testul CAMP: test de identificare a tulpinilor de Streptococ grup B (Streptococcus agalactiae).


Str grup B prezinta pe mediu geloza- sange berbec, o hemoliza incompleta, tip α', care, in
prezenta hemolizinei B stafilococice (determina hemoliza incompleta, tip α, “cald-rece”, la
stafilococ) are loc insumarea efectelor celor doua hemolizine (care, separat determina hemoliza
incompleta) ducand la aparitia hemolizei complete tip ß. Se efectueaza un sector de cultura pura
de Str. Grup B in centrul caruia se plaseaza un disc de hartie de filtru imbibata cu hemolizina B
stafilococica: in jurul discului, dupa 18-20 ore de termostatare, apare un halou de hemoliza
completa, ß.

- Producerea de pigment: Streptococii de grup B, au capacitatea de a produce un pigment


portocaliu, carotenoid, in geloza Columbia.

- Diagnostic diferential intre Str. beta hemolitici gr. B– Str. beta hemolitici gr. D:

- insamantarea pe mediu cu bila/ esculina:

• Str. grup B- cresc pe mediu cu bila, dar nu hidrolizeaza esculina.

• Str. grup D- cresc pe mediu cu bila si hidrolizeaza si esculina.

- Diagnostic diferential Str. Grup D- Enterococi:

• Enterococii:

- cresc pe medii hiperclorurate/ 6,5% NaCl;

- rezista 30 min la 60°C;

- sunt rezistenti la oxacilina,

- se dezvolta la 45°C.

• Str grup D: cresc pe mediu cu bila, hidrolizeaza esculina, dar nu cresc pe mediu hiperclorurat/
6,5% NaCl.

* pe baza caracterelor antigenice:

Determinarea grupului serologic, se face prin reactii de aglutinare (latex- aglutinare, co-
aglutinare) sau reactii de precipitare. Aceste reactii antigen- anticorp impun contactul direct
dintre antigenul de grup (polizaharidul C) si anticorpul omolog (ser anti- grup A, B, C, F, G etc).
Deoarece antigenul de grup se gaseste in profunzimea peretelui celular al streptococilor, trebuie
extras fie chimic (extractie cu HCl la cald), fie enzimatic.

- Reactia de precipitare: metoda Lancefield este o reactie de precipitare in inel, in care, se


pune in contact Ag de grup (polizaharidul C, extras cu HCl la cald) cu seruri anti- streptococice
specifice de grup. Este o metoda rar utilizata, pentru ca exista tehnici mai simple si mai precise.

- Reactii de aglutinare: dupa testul sensibilitatii la bacitracina, sunt cele mai frecvent utilizate
teste.

a) reactia de latex- aglutinare: reactie de aglutinare pe lama, in care, Ac specifici de grup au ca


suport, particule inerte de latex- polistiren. Antigenul de grup extras enzimatic, in contact cu Ac
specific de grup vor produce in cateva secunde, pana intr-un minut, o reactie de aglutinare
vizibila cu ochiul liber pe lama.

b) metoda co- aglutinarii (testul “STREPTIC”): este tot o reactie de aglutinare pe lama, in care,
serurile anti- streptococice specifice de grup (Ac) sunt reprezentate de imunglobuline IgG,
cuplate cu suspensie de Staphylococcus aureus. Pe fragmentul Fc al IgG, exista receptorul pentru
proteina A stafilococica. La nivelul fragmentului Fab se cupleaza specific polizaharidul C,
antigenul specific de grup streptococic (Ag). Reactia are loc pe lama, intre cele doua
componente, Ag/Ac, si devine vizibila in mai putin de 1 min.

Vizualizarea reactiei se imbunatateste prin contributia suspensiei de stafilococ sau prezenta


particulelor de latex.

- Streptococcus pyogenes se imparte in serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 80) prin
reactia de precipitare in tuburi capilare si pe baza antigenelor proteice T (28 serotipuri), prin
reactii de aglutinare pe lama. Aceste incadrari in serotipuri se fac doar in centre nationale de
referinta, in scop epidemiologic (se determina fluctuatia serotipurilor intr- o anumita perioada de
timp si intr-o anumita zona geografica, precum si filiatia cazurilor intr-un focar).

- Teste imunologice: teste rapide de identificare a Ag streptococice direct in produs patologic, in


mai putin de 10 min. Desi sunt specifice si sensibile, nu pot inlocui metoda clasica a
diagnosticului bacteriologic direct.

Antibiograma: streptococii piogeni isi mentin sensibilitatea cunoscuta la penicilina, dar s-au
descris tulpini cu “toleranta” la penicilina G (inhibate dar nu distruse de penicilina G, necesita
dze mai mari de antibiotic). Pentru pacientii cu alergie dovedita la penicilina, se recomanda
tratamentul cu macrolide (eritromicina, claritromicina, azitromicina). Se descriu azi, tulpini de
Streptococcus pyogenes rezistente la eritromicina. Asadar, este din ce in ce mai utila
antibiograma, datorita necesitatii alegerii clasei de antibiotic si evitarea unui tratament la care
tulpina incriminata poate fi rezistenta sau toleranta.
In general, antibiograma se face in scop epidemiologic, de incadrare a unei tulpini in
antibiotip.

DIAGNOSTIC SEROLOGIC: datorita faptului ca in evolutia complicatiilor post- streptococice


tardive, germenii nu se mai izoleaza in cultura, se urmareste determinarea anticorpilor
antistreptococici, prin teste serologice. Se pun in evidenta anticorpii prezenti in ser atat fata de
componentele endocelulare, cat si fata de produsii extracelulari, streptococici.

REACTIA ASLO

Reactia de seroneutralizare este utilizata in Diagnosticul microbiologic indirect.

Reactia ASLO se pracica pentru:

- diagnosticul serologic al infectiilor streptococice si post- streptococice,


- diagnosticul complicatiilor tardive post- streptococice,
- urmarirea evolutiei unei infectii streptococice,
- urmarirea eficientei tratamentului.
* O reactie ASLO (-) nu infirma diagnosticul de infectie streptococica.

* In 80% din cazurile de infectii streptococice reactia ASLO este pozitiva,

* In 20% dintre infectiile streptococice reactia ASLO este negativa - cauze:

- infectii cu tulpini de Streptococcus pyogenes slab productive sau neproductive de streptolizina


O,
- infectii in organisme imunodeprimate,
- in cazul in care tratamentul antibiotic este instituit foarte precoce,
- in sangele bolnavului exista mucine care blocheaza anticorpii antistreptolizina O, determinand
reactii ASLO fals negative.
* Reactii ASLO fals pozitive – cauze:

- prezenta in serul bolnavilor a unor inhibitori nespecifici ai streptolizinei O, α – si β-


lipoproteine, in boli asociate ca: hepatite, nefroze, boli autoimune (lupus eritematos
diseminat, poliartrita reumatoida), tuberculoza etc.

Pentru a indeparta inhibitorii nespecifici, care determina reactii fals pozitive, o etapa
obligatorie a reactiei ASLO este tratarea serului de bolnav cu solutie 0,4% Rivanol, care precipita
α – si β- lipoproteinele. Aceste precipitate se inlatura prin centrifugare.

- alta sursa de reactii fals pozitive, o constituie suprainfectarea serurilor de bolnav cu


Pseudomonas sau Bacillus, care elaboreaza enzime ce oxideaza streptolizina O si o inactiveaza.
Streptolizina O este oxigen – labila; in forma inactivata nu actioneaza asupra hematiilor si reactia
se interpreteaza ca fals pozitiva.

PRINCIPIU: dozarea anticorpilor antistreptolizina O se bazeaza pe efectul neutralizant al acestora asupra


streptolizinei O (hemolizina O). Seroneutralizarea streptolizinei O (SLO) prin existenta in ser a
antistreptolizinei O, este vizualizata prin absenta hemolizei unor eritrocite – test, care constituie
substratul celular indicator.

In absenta anticorpilor antistreptolizina O, streptolizina O isi exercita efectul litic pe hematii, efect
tradus prin prezenta hemolizei.

MATERIALE SI REACTIVI NECESARI:

- ser de cercetat (sau seruri- pereche, recoltate la interval de 2 saptamani),


- SLO liofilizata (standardizata de catre producator),
- Sange defibrinat de iepure/ berbec,
- Solutie salina izotona, solutie de Rivanol 0,4%,
- Eprubete, pipete gradate,
- Baie apa, centrifuga.

TEHNICA DE LUCRU:

* prima etapa a reactiei ASLO:

- serul de bolnav recoltat in conditii sterile, se inactiveaza 30 min la 56°C si se trateaza cu Rivanol 0,4%,
pentru indepartarea inhibitorilor nespecifici,

- se efectueaza dilutia 1/ 10 a serului si se mentine 30 min la 56°C,

- se realizeaza dilutii succesive, binare, de ser si se pun in contact cu SLO (cantitate constanta, cate 0,5
mL/ tub);

- se agita tuburile si se mentin 15 min la 37°C (REACTIA DE NEUTRALIZARE),

* a II-a etapa a reactiei:

- se adauga suspensia de hematii (5%), cantitate fixa, 0,5 mL in fiecare tub,

- se agita pentru omogenizare si se incubeaza 45 min la 37°C plus peste noapte la 4°C,

- citire finala a doua zi.


Schema reactiei ASLO:

Dil. ser 1/100 1/ 500

Ser dil 1 0,8 0,6 0,4 0,3 1 0,8 0,6 0,4 0,2
bolnav

NaCl 0,9% - 0,2 0,4 0,6 0,7 - 0,2 0,4 0,6 0,8

SLO 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

15 min la la baie de apa, 37°C (reactia de neutralizare)

Hematii 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Iepure 5%

45 min la baie de apa 37°C

Unitati 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500
ASLO/mL

TITRUL

Titrul este dat de tubul cu dilutia cea mai mare de ser de testat in care lipseste hemoliza, ceea ce
exprima prezenta unei cantitati suficiente de anticorpi ASLO, capabili sa neutralizeze intrteaga cantitatte
de SLO din amestec.

INTERPRETARE:

- daca infectia streptococica (cu streptococ beta hemolitic grup A) a fost corect tratata se ajunge la
sterilizarea bacteriologica a bolnavului si la scaderea in timp a titrului anticorpilor ASLO, pana la valori
normale (0- 200 UI/mL),
- titruri crescute de anticorpi, persistente, urmarite in dinamica, corelate si cu alte teste imunobiologice,
precum si cu aspectul clinic, atrag atentia asupra unor complicatii post – streptococice, ca Sindrom
poststreptococic (reumatism articular acut, cardita reumatismala, glomerulonefrita acuta).

Control de calitate: Martor pentru hematii, tub martor pentru SLO.


8. Diagnosticul de laborator in pneumonia pneumococica

• Prelevate – in functie de sdr clinic: sputa, puroi otic, exsudat pleural


• Ex microscopic direct
• Teste rapide (identificarea Ag capsular prin latexaglutinare in sange sau urina, detectia
ADN prin PCR)
• Cultivare – (insamantare precoce, fara refrigerare!) geloza sange, la 37 C, in atmosfera cu
5-10% CO2 (colonii verzi mucosae) si pe geloza chocolat
• Identificare
– Caractere microscopice (frotiu
din produs/cultura)
– Caractere de cultura
– Sensibilitate la optochin (S. pneumoniae –
sensibil, streptococii orali - rezistenti)
– Biloliza (pozitiv pentru S. pneumoniae)
• Interpretarea semnificatiei clinice a S pneumoniae – izolare din produse
– Necontaminate (sange, LCR, l pleural, puroi articular, l ascita etc)
– Contaminate (sputa)
• Criteriul asocierii cu celule inflamatorii
• Criteriul cantitativ (cel putin 10 diplococi ovali, Gram pozitivi,
capsulati)
• Testarea sensibilitatii la Atb - obligatorie
– pentru penicilina – testare cu disc de oxacilina (1µg)
• Tulpini sensibile (≥20 mm diam zonei de inhibitie)
•Tulpini rezistente (<20 mm diam zonei de inhibitie) – se determina CMI
pentru diferentierea tulpinilor cu rezistenta joasa de cele cu rezistenta inalta
25 PMN/camp

9. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN MENINGITA BACTERIANA


1. Meningite cu lichid clar-date de Mycobacterium tuberculosis si cele cu origine virala

2. Meningite purulente – date de Neisserie, Pneumococi, Lysteria monocitogenes (este


hemolitica). Se face dilutie si se numara PMN-uri (parca). Apoi se centrifugheaza, din sediment
se fac cultura si frotiu, iar in supernatant apar Ag libere de pneumococ. Transportul se face de
urgenta (eventual cu mediu Stuart)

3. Meningite micotice – date de Cryptococcus

http://www.romedic.ro/meningita-bacteriana-acuta
10. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN TUBERCULOZA PULMONARA

Diagnosticul de laborator al tuberculozei urmareste evidentierea, izolarea si identificarea


Mycobacterium tuberculosis (M. t. ). In tuberculoza pulmonara se recolteaza sputa. Se recolteaza
aspirat toracic. Niciodata cu tampon steril (acizii micolici adera foarte puternic de tamponul de
bumbac si nu mai scoti bacteria de acolo). Se eliminia floar de asociate cu NaCl 20%

Mediul alcalinizat este apoi titrat cu HCl si se verifica pH-ul cu hartie de Ph (trebuie sa fie
neutru). Se centrifugheaza si din sediment se face frotiu Ziehl Neelsen si cultivare 60 zile pe
mediu Lowenstein-Jensen.

Se pot recolta secretii bronsice in cursul bronhoscopiei, lichid de spalatura bronsica. In


tuberculoza extrapulmonara: lichid cefalo-rahidian, urina, secretii vaginale, lichid de punctie etc.
M. t. apare ca bacil fin, usor incurbat, colorat uniform sau neuniform. Cultivarea se face pe
mediul Loewenstein-Jensen sau prin inocularea cobaiului. In ultimii ani au fost dezvoltate
metode rapide de diagnostic al tuberculozei:
- Sisteme bifazice de izolare si identificare

- Sisteme respirometrice

- Metode chimice, cromatografice de analiza a acizilor micolici din peretele bacterian permit
identificarea de specie.

- Reactii de tip PCR

- Metode de hibridare a ADN-ului si ARN-ului bacterian.

Diagnosticul imunologic presupune detectarea starii de sensibilizare fata de proteinele bacilului


tuberculos prin intradermoreactii. Starea de alergie tuberculinica este prezenta la persoanele care
au venit in contact cu Mycobacterium tuberculosis prin boala sau vaccinare.

11. CARACTERIZATI COMPORTAMENTUL BIOCHIMIC AL UNEI


ENTEROBACTERII INSAMANTATE PE MEDII DIFERENTIALE

E. Coli- TSI-glucozo +, lactozo +, nu produc H2S, produc gaz, dar in cantitate mica

MIU mobile, indol + (banda de hartie: rosie), ureaza- (ureaza + ar fi rosu in


mediu)

Citrat –

Klebsiella glucozo+, lactozo +, imobile, nu prod H2S, produc gaz: descompun lactoza
pana la CO2 (se vede bine in TSI), indol variabil (K. pneumoniae negativ, K oxitocae pozitiv),
ureaza +, citrat + (albastru. Citratul – e verde)
Proteus: glucozo +, lactozo -, de obicei nu prod gaz, produce H2S (se vede chiar si pe
ADCL/Hecktoen), mobile, ureaza +, citrat -, indol variabil