INTRODUCCIÓN

En el presente laboratorio abordaremos dos temas fundamentales para el curso de

Microbiología: MICROSCOPIO COMPUESTO Y TINCION GRAM o
COLORACIÓN DE BACTERIAS.

El uso adecuado de un microscopio es una de las destrezas más importantes que debe
aprender un estudiante microbiología. Los microscopios se desarrollaron a finales del siglo
XVII y hoy en día, continúan siendo importantes para la identificación de hongos y algunos
otros microorganismos. Es por eso que los estudiantes debemos aprender como utilizarlos y
cuidarlos adecuadamente.Y en cuanto al tema de Tinción de Bacterias, definiremos el uso de
colorantes, del método Gram, y utilizando las muestras hechas en la semana anterior con los
medios de cultivo, hallaremos los tipos de Bacteria y que Bacterias son específicamente.
 OBJETIVOS

MICROSCOPIO COMPUESTO

• Manejar correctamente el microscopio conociendo la función de cada parte del

microscopio.
• Conocer, mediante la observación de las muestras, cual es el objetivo apropiado para
observarlas (1Ox; 43x; 97x).
• Enseñar el cuidado y mantenimiento apropiado de los microscopios.
• Aprender los pasos de un adecuado manejo del enfoque y observación de muestras
con el microscopio.

TINCIÓN DE LAS BACTERIAS (Método Gram)

• Mediante este método podemos teñir las bacterias, para su mejor descripción
• Determinación de bacterias Gram (+) ó Gram (-)
• El método de tinción de bacterias sirve para diferenciar entre distintas formas
de microorganismos.
• Podemos usar amplificaciones mayores.
FUNDAMENTO TEORICO

MICROSCOPIO COMPUESTO

Un microscopio compuesto tiene más de un lente objetivo. Los microscopios compuestos se

utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas
que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y
organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por tres
sistemas:

* El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y
detener los instrumentos a observar.
* El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal
manera que producen las ranuras de luz.
* El sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los
objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".
Sabemos que existen dos tipos de microscópicos: Simple y Compuesto.

MICROSCOPIO SIMPLE
Consiste en una lente o cristal de aumento montado en una armazón graduable provisto de un
soporte para la conveniente colocación del objeto y de un espejo que refleja la luz.

MICROSCOPIO COMPUESTO
Se diferencia del simple por que consta de dos juegos de lentes, uno conocido como objetivo,
y el otro por ocular; montado en un tubo (como observaremos a continuación en la figura
siguiente). Podemos conseguir un enfoque preciso con la ayuda de un tornillo micrométrico.
Los microscopios compuestos dan un aumento mayor que los simples; y son necesarios para
ver y examinar objetos tan minúsculos como las bacterias.
Un microscopio compuesto se divide en dos partes: Mecánica y óptica. A continuación
veremos cada una de las partes.
PARTE MECÁNICA

Principales componentes de los microscopios, descripción general y usos

Componente Descripción
Parte de metal o plástico sobre la cual descansa el resto de las partes
Base
del microscopio.
Columna en forma de “C” que se proyecta de la base y que sostiene a
Brazo
la platina y a los componentes ópticos.
Plataforma plana unida a la parte inferior del brazo sobre la cual se
Platina
colocan los portaobjetos o muestras a observar.
Manija debajo de la abertura de la platina que consiste de un grupo de
Cierre del Diafragma o
piezas de metal a manera de obturador que regula la cantidad de luz
Condensador
que atraviesa al portaobjetos colocado en la platina.
No está presente en todos los microscopios – colecta los rayos de luz
Condensador del iluminador y los enfoca – incrementa la resolución, aumenta el
contraste de la muestra.
Botón de ajuste del
Sube y baja el condensador.
condensador knob
Parte cilíndrica/vertical unida en la parte superior del brazo que
Cabezal
sostiene el sistema óptico.
Plato giratorio que sostiene los objetivos (lentes), unido a la parte
Revólver inferior del cabezal, puede dársele la vuelta para cambiar los lentes
(objetivos).
Ajuste del Botón grande que mueve el cabezal hacia arriba y abajo para observar
macrométrico la muestra en el enfoque macrométrico.
Botón pequeño que mueve el cabezal a distancias más cortas, de
Ajuste del
manera más lenta y es usado para observar a la muestra con un
micrométrico
enfoque más nítido.
Iluminador, Fuente
Controla la cantidad de luz que se transfiere a la muestra.
lumínica
Tubo de metal corto, removible que contiene lentes ubicados en la
Oculares
parte superior del tubo, generalmente de 10X, 43X, 97X de aumento.
 Principales componentes de los microscopios, descripción general y usos

Componente Descripción
Ajuste de Dioptría Ajuste usado para compensar la diferencia de observación de los ojos.
Tubos de metales pequeños, atornillados dentro del revólver que
Objetivos (lentes) incrementa el aumento de la muestra (a menudo se refieren sólo como
objetivos).
Espejo Usado para reflejar la luz a través de la muestra.
Usado para ajustar el espejo para que refleje la luz a través de la
Eje giratorio del espejo
muestra.
También se les refiere como lentes suplementarios, pueden ser
Lentes auxiliares encontrados en microscopios de disección en la base de la cubierta de
los objetivos o cabezal.
TINCIÓN DE BACTERIAS

DEFINICIÓN DE COLORANTES O TINTES

Un tinte se define como una sustancia o compuesto orgánico que tienen los grupos cromóforo
y auxocromo ligados al núcleo bencénico.

Existen varios métodos de tinción pero estos están agrupados en tres tipos de tinción
específicos, los cuales pasaremos a mencionar.

Los tipos de tinción son:

A. Tinción simple: 1. Colorantes básicos
2. Colorantes ácidos
3. Colorantes indiferentes
B. Tinción compuesta: 1. Tinción de Gram
2. Tinción de ácidos resistentes
C. Tinción de estructuras: 1. Feulgen (para material nuclear)
2. Tinción de endósporas
3. Tinción de pared celular
4. Tinción de flágelos
5. Tinción de cápsulas

El método que usaremos para estudiar para la descripción de bacterias es el método de

Tinción de Gram.

TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva
a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se
visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la
tinción de Gram.

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una
enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si
hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son
leucocitos atacando la infección.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales de vidrio:
- Portaobjetos
- Tubo de ensayo

Medios de cultivo:
- Agar nutritivo
- Caldo nutritivo

Colorantes:
- Cristal violeta (azul o morado)
- Lugol
- Safranina (rojo)
- Alcohol – Acetona

Equipo:
- Mechero
- Inoculador
- Microscopio
 PROCEDIMIENTO

1. Secamos el portaobjetos pasando por el fuego

2. Preparamos el frotis de Agar nutritivo y Caldo nutritivo.
3. Dejamos secar al ambiente.
4. Fijamos al calor ( 3 veces)
5. Teñimos con cristal violeta por 20 segundos.
6. Lavamos con agua por 2 segundos.
7. Cubrimos el frotis con lugol durante 1 minuto.
8. Decoloramos con agua por 2 segundos.
9. Contracolorear con safranina y dejar que se tiña por 20 segundos.
10. Lavamos con agua y lo secamos con papel filtro.
11. Examinamos en el Microscopio con objetivo de 97X luego de secarse.

MICROSCOPIO COMPUESTO
CONCLUSIONES
- Pudimos determinar el
tipo de Bacteria presente en las muestras que preparamos.
- Los resultados que se obtuvimos en su mayoria de la coloración Gram fueron
Streptococos.
- Conluimos que es necesario seguir el procedimiento con el debido cuidado pues al
inicio no logramos los resultados esperados.

RECOMENDACIONES

- Es necesario realizar correcta y minuciosamente los procedimientos del frotis y la

fijación para obtener los resultados correctos.
- Es recomendable tener en cuenta saber el manejo del microscopio correctamente para
no dañar el microscopio.
- Se recomienda seguir el procedimiento minuciosamente, pues si no se corre el riesgo
de no obtener ningún resultado.
 CUESTIONARIO

1. Establecer la diferencia entre poder de resolución y abertura numérica.

- Resulta evidente que el poder de resolución de un Microscopio óptico está restringido

por los valores limitados de la abertura numérica y la longitud de onda de la luz
visible.

2. Completar:
Partes del Microscopio Funcion(es)
Ocular lFunción del ocular es presentar al ojo dicha imagen de la forma
más legible posible, agrandándola lo que sea necesario
Objetivo Función principal de un cualquier objetivo es obtener una
imagen del objeto observado lo más nítida y luminosa posible
Condensador Es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación
hacia la preparación
Diafragma de Iris Es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes
eliminando los rayos demasiado desviados
Tornillo Macrometrico Sirve para alejar o acercar el tubo y la platina. Se obtiene la
imagen de la muestra (enfoque o ajuste grueso).
Tornillo Micrometrico Sirve para dar claridad a la imagen. Se logra el ajuste fino

3. Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son transmitidas por el
aire, agua y alimento.
 ENFERMEDAD SÍNTOMAS ALIMENTOS MODO DE TRANSMISIÓN
PRINCIPALES TÍPICOS
Salmonelosis Diarrea, dolor Huevos, carnes y Comienzan entre las 8 y 48 horas
abdominal, dolor de productos lácteos sin después de comer el alimento
cabeza, fiebre y náuseas pasteurizar. contaminado y dura entre 1 y 8 días.

Escherichia coli Dolor de cabeza, diarrea Leche sin pasteurizar, Comienzan entre 3 y 9 días después de
y dolor abdominal vegetales crecidos con ingerir el alimento contaminado, dura de
severo. estiércol, etc. 2 a 9 días si no hay complicaciones.
Listeria Leche sin pasteurizar y Fiebre repentina, Comienza dentro de las 24 horas
monocytogenes quesos blandos, carnes escalofríos, dolor de después de comer el alimento
de ave, paté de carne, espalda, dolor contaminado. Dura entre 2 y 7 días.
ensaladas, etc. abdominal y diarrea.

4. Responder
a) ¿Existen diferencias químicas entre las paredes celulares de las Bacterias gram
positivas y gram negativas?

- Las bacterias gram negativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las
bacterias gram positivas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas son
también más delgadas que las de las gram positivas; las paredes de las bacterias gram
negativas tienen una cantidad mucho menor de peptido-glucano con ligaduras
cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias gram positivas.
 b) Afecta la edad del cultivo a la reacción de Tinción de Gram.

- La edad del cultivo afecta a la reacción de tinción Gram pues cultivos viejos de
algunas bacterias gram positivas pierden la facultad de retener el cristal violeta y se
tiñen con la safranina.

5. Hacer una lista de Bacterias Gram positivas y Gram negativas con las enfermedades
que provocan.

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Bacillus subtilis Achromobacter
Clostridium tetani Brucella ovis
Corynebacterium diphtheriae Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus acidophilus Escherichia coli
Streptococcus pyogenes Salmonella typhi
-

BIBLIOGRAFÍA

1. Wesley A. Volk Microbiología Basica

Ed. Harlon – Año 1996
 México (sexta edición)

2. A. J. Salle Bacteriología
Ed. Gustavo Gili – Año 1960
Barcelona (cuarta edición)

3. Harry Seeley Microbiología en Acción

Ed. Blume – Año 1973

ANEXOS
Estafilococos

Muestra Nº 01
Muestra Nº 02