CURSO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA - LICENCIATURA EM BIOLOGIA

KARLA BARRETO DA SILVA

RAQUEL DE SOUZA BRAGA

INFLUÊNCIA DA BACTÉRIA Asaia sp. NA SELEÇÃO DE SÍTIOS DE

OVIPOSIÇÃO POR FÊMEAS DO MOSQUITO Aedes aegypti

Campos dos Goytacazes/RJ

2014
 KARLA BARRETO DA SILVA
RAQUEL DE SOUZA BRAGA

INFLUÊNCIA DA BACTÉRIA Asaia sp. NA SELEÇÃO DE SÍTIOS DE OVIPOSIÇÃO

POR FÊMEAS DO MOSQUITO Aedes aegypti

Monografia apresentada ao Instituto Federal de

Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense
como requisito parcial para conclusão do Curso
de Ciências da Natureza – Licenciatura em
Biologia.

Orientadora: Drạ Desiely Silva Gusmão Taouil

Campos dos Goytacazes/RJ

2014
 KARLA BARRETO DA SILVA
RAQUEL DE SOUZA BRAGA

INFLUÊNCIA DA BACTÉRIA Asaia sp. NA SELEÇÃO DE SÍTIOS DE OVIPOSIÇÃO

POR FÊMEAS DO MOSQUITO Aedes aegypti

Monografia apresentada ao Instituto Federal de

Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense
como requisito parcial para conclusão do Curso
de Ciências da Natureza – Licenciatura em
Biologia.

Aprovada em 14 de março de 2014

Banca Avaliadora:

.......................................................................................................................................................
Profạ Desiely Silva Gusmão Taouil (Orientadora)
Doutora em Biociência e Biotecnologia/UENF
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense/Campos-Centro

.......................................................................................................................................................
Profạ Luciana Belarmindo da Silva
Doutora em Biociência e Biotecnologia/UENF
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense/Campos-Centro

.......................................................................................................................................................
Prof. Salomão Brandi da Silva
Especialista em Geografia e Educação Ambiental/ Faculdade de Filosofia Ciências e Letras
Santa Marcelina
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense/Campos-Centro
Dedico esta pesquisa à minha mãe, Amarilda
Campista, por todo esforço e carinho em me
educar e fazer de mim a pessoa que hoje sou. Às
minhas irmãs, Kamila Barreto e Kariny Barreto,
por me ouvirem nos momentos de desespero,
dando sempre os melhores conselhos possíveis; e
ao meu noivo, Mateus Orozimbo, por todo seu
amor, paciência e por me auxiliar de todas as
formas fazendo a diferença em minha vida.

Karla B. da Silva

Dedico esta pesquisa aos meus incomparáveis

pais, Marcos Aurélio da S. Braga e Maria Denise
de S. N. Braga, por me criarem com uma base
sólida e me ensinarem a encarar a vida de frente.
À minha amável e linda irmã Ruth de S. B. Dias
por ser a minha torre forte; e ao meu precioso
amigo e esposo Jainaldo Silva, por ser uma ponte
a partir da qual eu posso ir além.

Raquel de S. Braga
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus porque, com seu amor inigualável e incomparável, tem sido o meu
suporte e socorro nos momentos mais difíceis. Por ter me guiado até onde cheguei, pois
somente com a sabedoria concedida por Ele, pude realizar este trabalho.
À minha amiga Raquel de Souza Braga, por toda paciência e cooperação durante este
trabalho, pois somente assim pude conseguir alcançar o êxito, e por seu amor e carinho, que
me fizeram chegar onde cheguei.
À minha orientadora, Desiely Silva Gusmão Taouil, por sua paciência e disposição em
compartilhar os conhecimentos necessários para realização deste trabalho.
Aos professores, Francisco José Alves Lemos e Richard Ian Samuels, por
disponibilizarem os laboratórios para a realização desta pesquisa.
À professora, Maria Amelia Ayd Corrêa, por me instruir na elaboração deste trabalho.
Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense, pelo suporte
educacional e científico.
Karla B. da Silva

Agradeço, primeiramente, a Deus, que tem cuidado de mim todo tempo e me dado
sabedoria para entender as obras de Tuas mãos. A vida realmente não tem sentido ou razão
sem Ti.
À minha admirável amiga Karla Barreto da Silva, por se fazer presente na busca do
conhecimento e por fazer a diferença em minha vida.
À minha orientadora, Desiely Silva Gusmão Taouil, pelo seu admirável
profissionalismo, por me direcionar com dedicação e por acreditar em meus sonhos.
Aos professores, Francisco José Alves Lemos e Richard Ian Samuels, por
disponibilizarem os laboratórios para a realização desta pesquisa.
À professora, Maria Amelia Ayd Corrêa, por sua dedicação e por me servir de
exemplo.
Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense, por me
incentivar a buscar o saber e me ensinar princípios importantes para a vida acadêmica.

Raquel S. Braga
A mente que se abre a uma nova ideia, jamais
voltará ao seu tamanho original.

Albert Einstein
 RESUMO

A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem. Atinge cerca de 50 a 100
milhões de pessoas por ano em mais de 100 países e causa pelo menos 1,25 bilhões de mortes.
É causada por um arbovírus, que é transmitido aos seres humanos através da picada da fêmea
do mosquito Aedes aegypti. As dificuldades de combater este vetor em grandes e médias
cidades são muitas, por ser de hábito doméstico, com atividade hematofágica diurna e
desenvolve-se preferencialmente em reservatórios artificiais. A incidência de casos de dengue
depende da habilidade de fêmeas de mosquitos escolherem sítios adequados para a oviposição
e desenvolvimento larval. A seleção dos sítios pelas fêmeas é influenciada, além de outros
fatores, pela presença de bactérias nos mesmos. Algumas bactérias podem aumentar a
atratividade dos sítios de oviposição. Também é conhecido que bactérias simbiontes de
mosquitos são passadas através das gerações por meio da transmissão vertical. Isto parece
acontecer com a bactéria Asaia sp. encontrada em intestino e ovos de Ae. aegypti. Com base
nestas informações, esta pesquisa buscou investigar a influência de Asaia sp. na seleção de
sítios de oviposição. Três metodologias foram empregadas: gaiola-campo, semi-campo e
campo; e três tipos de sítios foram disponibilizados (contendo água, contendo meio de cultura
diluído, e contendo cultura de Asaia sp. diluída). Percebeu-se que apenas no ensaio semi-
campo os sítios contendo Asaia sp. apresentaram maior predominância de ovos. Os demais
ensaios mostraram alta contaminação dos sítios contendo meio e cultura de Asaia sp., o que
parece ter influenciado negativamente a seleção destes sítios pelas fêmeas. A partir destes
resultados pode-se concluir que a Asaia sp. pode ter um papel sinalizador para fêmeas, mas
metodologias que evitem a contaminação dos sítios são necessárias para que o efeito de Asaia
sp. não seja mascarado por bactérias contaminantes.

Palavras chave: Dengue. Aedes aegypti. Simbiose. Asaia sp.

 ABSTRACT

Dengue is the most important arboviral disease affecting humans. It reaches about 50 to 100
million people each year in more than 100 countries and causes at least 1.250.000.000 deaths.
It´s caused by an arbovirus which is transmitted to humans through the bite of the female
mosquito Aedes aegypti. The incidence of dengue cases depends on the ability of female
mosquitoes choosing suitable sites for oviposition and larval development. Beside other
factors, the site selection by females is influenced, by the presence of bacteria in themself.
Some bacteria can increase the attractiveness of the oviposition. It is also known that bacterial
symbionts of mosquitoes are passed through generations by vertical transmission. It seems to
happen with the bacteria Asaia sp. that is found in the intestine and eggs of Ae. aegypti. Based
on this information, this research sought to investigate the influence of Asaia sp. in the
selection of oviposition sites. Three methodologies were used: cage-field, semi-field and field,
also three types of sites were available (a site with water, a site with diluted culture medium
and a site with Asaia sp. diluted culture). It was observed that only the semi-field test sites
containing Asaia sp. showed higher prevalence of eggs. The other tests showed high
contamination of sites containing medium and culture Asaia sp., which seems to have
negatively influenced the selection of these sites by females. Through these results, we can
conclude that Asaia sp. may have an attractive effect to female, but methods to prevent the
contamination of the sites are required for the effect of Asaia sp. not be masked by
contaminating bacteria.

Key words: Dengue. Aedes aegypti. Symbiotic. Asaia sp.

 LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- Ciclo de vida do Aedes aegypti ilustrado por fotografias de todas as fases
da vida do inseto. Apenas o 4ọ instar larval é mostrado................................. 18
FIGURA 2- Representação esquemática do trato intestinal de insetos. Observar os
subcompartimentos presentes no intestino médio ......................................... 21
FIGURA 3- Microscopia eletrônica de varredura de seção de IM de Aedes aegypti dis-
-secado 24 h após o repasto sanguíneo............................................................ 26
FIGURA 4- Microscopia eletrônica de varredura de seção oblíqua de IM de Aedes ae-
-gypti dissecado 48 h após o repasto sanguíneo. Bactérias preenchem todo
o lúmen intestinal ......................................................................................... 27
FIGURA 5- Diferença no aspecto de ovos produzidos por fêmeas de Aedes aegypti
tratadas ou não com espectinomicina............................................................ 28
FIGURA 6- Sítios confeccionados para os ensaios de oviposição do mosquito Aedes
Aegypti............................................................................................................ 33
FIGURA 7- Gaiola utilizada no ensaio de atração para oviposição em gaiola-campo....... 34
FIGURA 8- Locais do câmpus Campos-Centro do Instituto Federal Fluminense onde
foram distribuídos os sítios de oviposição para os experimentos no experi-
-mento no campo................................................................................................ 35
FIGURA 9- Sítios distribuídos em um jardim do campus Campos-Centro para o expe-
mento no campo............................................................................................. 36
FIGURA 10- Disposição dos sítios de oviposição na sala de experimentação semi-
campo........................................................................................................... 37
FIGURA 11- Frasco de sacarose contendo uma tira de flanela estéril, utilizado para en-
-saio de alimentação......................................................................................
38
FIGURA 12- Resposta de oviposição de fêmeas de Aedes aegypti nos experimentos rea-
-lizados em gaiola-campo............................................................................. 39
FIGURA 13- Resposta de oviposição de fêmeas de Aedes aegypti nos ensaios realizados
na sala semi-campo....................................................................................... 40
FIGURA 14- Resposta de oviposição de fêmeas de Aedes aegypti nos ensaios para
alimentação realizados na sala semi-campo................................................. 41
FIGURA 15- Estágios de vida do inseto encontrado em sítios contendo meio BHI e cul-
-tura de Asaia sp. nos experimentos campo................................................. 42
FIGURA 16- A, Cochonilha encontrada em sítio do experimento no campo; B, Cocho-
-nilha com ovissaco....................................................................................... 43
FIGURA 17- Insetos encontrados nos sítios do experimento campo.................................. 43
 SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................... 11

1 O MOSQUITO Aedes aegypti E A DENGUE ............................................. 14

1.1 O mosquito Aedes aegypti e a dengue no Brasil ........................................ 14

1.2 Ciclo de vida do Aedes aegypti .................................................................. 17

1.3 Anatomia e fisiologia do sistema digestório de insetos.............................. 19

1.4 Oviposição ................................................................................................. 22

2 SIMBIONTES DE INSETOS ....................................................................... 23

2.1 Tipos de relações simbióticas .................................................................... 23

2.2 Importância nutricional .............................................................................. 24

2.3 Importância na reprodução ........................................................................ 27

2.4 Microrganismos simbiontes e o controle da transmissão de doenças......... 28

2.5 Importância no comportamento.................................................................. 29

3 INVESTIGAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA BACTÉRIA Asaia sp. NA

SELEÇÃO DE SÍTIOS DE OVIPOSIÇÃO DE FÊMEAS DO
MOSQUITO Aedes aegypti........................................................................ 31

3.1 Metodologia................................................................................................ 31

3.2 Resultados .................................................................................................. 38

3.3 Discussão.................................................................................................... 44

CONCLUSÃO ................................................................................................. 50

REFERÊNCIAS ............................................................................................... 51
INTRODUÇÃO

A população brasileira tem sido acometida por algumas doenças tropicais, que tem
adquirido características epidêmicas e atingido milhões de pessoas. Uma dessas doenças é a
dengue, que, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), atinge cerca de 50 a 100
milhões de pessoas por ano em mais de 100 países, gera a hospitalização de cerca de 500 mil
pessoas e causa pelo menos 1,25 bilhões de mortes (WHO, 2012, s.p.). Torna-se, assim, um
grave problema de saúde pública e alvo de diversas pesquisas que visam entender a dinâmica
de transmissão e examinar fatores responsáveis por sua emergência, bem como identificar
novas técnicas de controle, como a eliminação do vetor, que é a forma mais eficiente
disponível para o controle desta doença (VONTAS et al., 2012, p. 130).
A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviridae, que é transmitido aos
seres humanos através da picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti, um vetor
intermediário. O gênero Aedes é o principal da sub-família Culicinae e compreende mais de
1200 espécies (KETLLE,1995, p. 99). O Ae. aegypti vive em habitats urbanos e desenvolve-
se, preferencialmente, em reservatórios artificiais, sendo esta uma adaptação da espécie. Ao
contrário de outros mosquitos o Ae. aegypti possui hábitos diurnos, picando frequentemente
pela manhã e ao entardecer. Humanos infectados são os principais transportadores e
multiplicadores do vírus, servindo como fonte de vírus para mosquitos não infectados (WHO,
2012, s.p.).
O setor de saúde tem o grande desafio de controlar a proliferação do mosquito Ae.
aegypti, que se multiplica rapidamente nos vários recipientes, existentes nos lixos das cidades
(garrafas, pneus, latas) que podem armazenar águas da chuva. As estratégias que tem se
mostrado mais eficazes para diminuição da proliferação do mosquito é a aplicação de
inseticidas e eliminação de locais de oviposição (WHO, 2012, s.p.). A escassez de
conhecimento básico sobre a biologia do vetor é considerada o principal impedimento para o
desenvolvimento de novas estratégias de seu controle (GUSMÃO, 2002, p. 16). Pesquisas tem
dado grande atenção ao estudo de microrganismos associados aos insetos, tanto para
compreender a influência destes na fisiologia e comportamento dos insetos, como para utilizá-
los no controle dos mosquitos.
Os insetos são hospedeiros de um grande número de microrganismos, os quais podem
colonizar, crescer e se reproduzir no trato digestivo, no lúmen e associados ao epitélio
intestinal, e no sistema reprodutivo, desempenhando papéis-chave na fisiologia do

11
hospedeiro. Nas associações permanentes, os microrganismos residem no hospedeiro por
gerações sucessivas e são considerados simbiontes (DOUGLAS; BEARD, 1996, p. 426).
Bactérias simbiontes do trato digestivo de insetos complementam a dieta do
hospedeiro pelo fornecimento de aminoácidos, proteínas e vitaminas (DILLON, 1994, p.
230).
No caso de insetos hematófagos, que se alimentam exclusivamente de sangue de
vertebrados, a presença de microrganismos simbiontes garante a oferta de nutrientes cuja
concentração é deficiente no sangue (ROMOSER, 1996, p. 298). A existência de uma
microbiota intestinal foi constatada em mosquitos, capturados no campo ou criados em
laboratório (DEMAIO et al., 1996, p. 221).
Através de técnicas moleculares, Gusmão identificou alguns microrganismos no
intestino médio e ovos de Ae. aegypti: as bactérias Asaia sp.; Bacillus sp.; Bacillus subtilis;
Enterobacter sp.; Enterococcus sp.; Klebsiella sp.; Serratia sp. e a levedura Pichia ohmeri
(GUSMÃO, 2007, p. 137). Além disso, Gusmão também mostrou que as fezes de mosquitos
contém grande número de bactérias vivas e as mesmas são eliminadas nos sítios utilizados
para a deposição de ovos (GUSMÃO, 2007, p. 132).
O entendimento de como se deu a relação bactéria-mosquito não é simples. Mas
indícios são importantes para iniciar essa investigação. A bactéria Asaia sp., por exemplo,
ocorre em néctar de flores, que é utilizada na alimentação dos mosquitos na natureza. É
provável que a relação mosquito-Asaia sp. tenha iniciado durante suas visitas às flores. Pode-
se sugerir até que esta bactéria oriente os mosquitos até as flores para que os mesmo
obtenham o alimento desejado. Partindo dessas ideias, Gusmão investigou se a presença de
Asaia sp. em soluções de sacarose atrairia os mosquitos para alimentação. O resultado dessa
análise foi positivo. A partir disso, considerando que Asaia sp. deve estar presente em sítios
normalmente usados para a deposição de ovos (Asaia sp. pode ser inoculada nos sítios através
de ovos ou fezes), Gusmão investigou se a mesma atrairia fêmeas grávidas para oviposição
(GUSMÃO, 2007, p. 87). O resultado foi positivo, sendo fortalecido pelos dados obtidos por
Sardinha (2010, p. 43). Com base nestas informações, esta pesquisa deu continuidade à
avaliação de Asaia sp. na atração de fêmeas para oviposição, mas com o uso de metodologias
de campo: gaiola-campo, semi-campo e campo.
Os experimentos na gaiola-campo foram realizados em uma casa no bairro Residencial
Santo Antônio em Campos dos Goytacazes. A gaiola utilizada continha três sítios: 1,
contendo água; 2, contendo meio de cultura diluído; e 3, contendo cultura de Asaia sp. Foram

12
também realizados ensaios em uma sala no Laboratório de Proteção de Plantas do Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro. Esta sala simulou o ambiente de campo (semi-campo). Os mesmos três sítios foram
utilizados.
Para investigação do poder atrativo da bactéria Asaia sp. no campo, em relação à
deposição de ovos do mosquito Ae. Aegypti foram realizados ensaios no Instituto Federal
Fluminense câmpus Campos-Centro. Os sítios foram distribuídos em cinco locais do câmpus
e em cada local foram distribuídos os três sítios descritos acima.
As metodologias foram testadas e comparadas, levando a uma discussão sobre o que
esta pesquisa trouxe de novidade e quais foram suas limitações. Os dados preliminares
contribuirão futuramente para que novas metodologias possam ser empregadas para
maximizar o efeito de Asaia sp. e minimizar as interferências de fatores encontrados no meio.

13
1 O MOSQUITO Aedes aegypti E A DENGUE

1.1 O mosquito Aedes aegypti e a dengue no Brasil

Pertencentes ao filo Arthropoda, os mosquitos estão inseridos na classe Insecta,

considerada a mais diversificada do filo com número superior a 900 mil espécies descritas
(BARNES, 1996, p. 579).
De acordo com a taxonomia, os mosquitos são classificados dentro da família
Culicidae, subordem Nematocera da Ordem Diptera. A família Culicidae possui mais de
3.200 espécies descritas (MUNSTERMANN; CONN, 1997, p. 353). Esta família é
normalmente subdividida em três subfamílias: Anophelinae, Culicinae e Toxorhynchitinae
(KETTLE, 1995, p. 208). A subfamília Culicinae é considerada a maior entre as três,
abrangendo cerca de 3000 espécies em cerca de 24 gêneros, a grande maioria de hábito
hematófago (GWARDS; COLLINS, 1996, p. 319). O principal gênero da subfamília
Culicinae é o Aedes que compreende mais de 1200 espécies (KETTLE, 1995, p. 210). O
mosquito Ae. aegypti é um representante desse gênero e o principal vetor das arboviroses
dengue e febre amarela. Além disso, este mosquito pode transmitir o parasita da malária
aviária, Plasmodium gallinaceum (DEVENPORT; JACOBS-LORENA, 2005 apud
GUSMÃO, 2007, p. 9).
O Ae. aegypti é um mosquito de hábitos domésticos com atividade hematofágica
diurna e utiliza-se preferencialmente de depósitos artificiais de água limpa para oviposição.
Esta espécie tem mostrado uma grande capacidade de adaptação a diferentes situações
ambientais consideradas desfavoráveis (TAUIL, 2002, p. 868).
A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem. Atinge cerca de 50 a 100
milhões de pessoas por ano em mais de 100 países, particularmente em países tropicais onde a
temperatura e a umidade favorecem a proliferação do mosquito vetor (WHO, 2012, s.p.),
sendo esta doença a segunda mais importante transmitida por vetor no mundo, a de maior
impacto é a malária (FIOCRUZ, 2013, s.p.).
No Brasil, o primeiro registro de casos de dengue ocorreu na década de 1920
(CLARO; TOMASSINI; ROSA, 2004, p. 1447). Posteriormente, Oswaldo Cruz implantou
um programa de combate ao Ae. aegypti que se prolongou por anos, visando controlar a
epidemia de febre amarela, doença transmitida pelo mosquito. A erradicação foi conseguida,
pela primeira vez, na década de 1930, contribuindo para o desaparecimento concomitante dos

14
casos de dengue, outra enfermidade transmitida por este vetor. No entanto, em 1976 o Ae.
aegypti foi definitivamente reintroduzido no Brasil, a partir de Salvador, BA, por falhas na
vigilância epidemiológica e pelas mudanças sociais e ambientais propiciadas pela urbanização
acelerada da época (TAUIL, 2002, p. 868).
Com os recentes casos da doença pelo tipo 4 do vírus, todos os sorotipos DEN1,
DEN2, DEN3 e DEN4, que pertencem à família Flaviridae circulam no Brasil (BARRETO;
TEXEIRA, 2008, p. 55). Embora existam relatos da doença desde a década de 1920, a
circulação dos vírus da dengue só foi comprovada laboratorialmente em 1982, quando foram
isolados os sorotipos DEN1 e DEN4, em Boa Vista (RR) ficando o país sem notificação de
casos por quatro anos. Em 1986, foi isolado o DEN-1 no Estado do Rio de Janeiro em Nova
Iguaçu, cidade que compõe a segunda maior região metropolitana do país. A partir daí a
dengue foi disseminada com surpreendente força de transmissão para cidades vizinhas. Nesse
mesmo ano foram notificados mais de 33500 casos (BARRETO; TEXEIRA, 2008, p. 60). Em
1990 o tipo 2 do vírus foi introduzido também em Nova Iguaçu. A incidência no Rio de
Janeiro atingiu 165,7 casos por cem mil habitantes, naquele ano, e em 1991, 613,8 casos por
cem mil habitantes. A entrada do vírus tipo 2 trouxe, também, os primeiros diagnósticos de
dengue hemorrágica no país, quando foram confirmados 462 casos e 8 óbitos. A partir daí os
sorotipos DEN1 e DEN2 foram disseminados para outras áreas do território brasileiro,
acompanhando a expansão de seu mosquito vetor, o Ae. aegypti (TEXEIRA et al., 2005, p.
1312). Em Janeiro de 2001, foi confirmada a introdução do sorotipo DEN3 no país, sendo o
responsável pela epidemia de 2002, quando foram notificados aproximadamente 800 mil
casos, ou seja, quase 80% das ocorrências do continente americano (TEXEIRA, 2008, p.
1663). O sorotipo DEN4 foi reintroduzido no Brasil em 2010, quando surgiram os primeiros casos
na região norte do país, nos estados de Roraima, Pará e Amazonas. Em 2011, foi notificado esse tipo
de vírus no estado do Rio de Janeiro e, mais recentemente, na Bahia e Piauí, em pacientes sem
história de viagens à região norte. Em todo o País, desde o retorno do sorotipo viral, em agosto de
2010, 34 pessoas já foram infectadas pelo vírus, nos estados do Amazonas, Pará, Bahia, Piauí, Rio de
Janeiro e Roraima. Não se detectava o sorotipo DEN4 no território brasileiro desde 1982. Em
relação à dengue hemorrágica no Brasil, em 2006 os casos predominavam na faixa etária de
20 a 40 anos de idade, porém em 2007 verificou-se que 53% dos casos ocorreram entre
menores de quinze anos de idade (BARRETO; TEXEIRA, 2008, p. 61).
Em 2007, quando uma epidemia de dengue atingiu a Malásia, foram coletadas
amostras de soro a partir de pessoas com casos graves de dengue tipo 4. Posteriormente

15
Vasilakis, virologista da Universidade de Medicina do Texas, descobriu por meio de
sequenciamento de genoma que as amostras não correspondiam ao sorotipo 4. Em seguida
Vasilakis e seus colaboradores, determinaram que os anticorpos produzidos em macacos e
seres humanos infectados pelo vírus da dengue da Malásia, diferiam significantemente das
outras quatro linhagens do vírus e que este ocupa um novo ramo na árvore genealógica da
dengue. O novo sorotipo (DEN 5) pode complicar os esforços de controle, especialmente na
busca de uma vacina que proteja contra todos os sorotipos simultaneamente (NORMILE,
2013, p. 415).
A infecção com um sorotipo pode produzir um espectro de enfermidades, variando
desde uma síndrome viral não específica a uma severa doença hemorrágica fatal. Fatores de
risco, importantes para a febre hemorrágica, incluem a linhagem e o sorotipo do vírus
envolvido, a idade, a condição imune e a predisposição genética do paciente (GUBLER;
CLARK, 1995, p. 4).
A dengue é uma doença grave semelhante à gripe que afeta lactentes, crianças, jovens
e adultos. A grande maioria das infecções é assintomática. Quando surgem os sintomas, estes
costumam evoluir em obediência a três formas clínicas: dengue clássica, forma benigna,
similar à gripe; dengue hemorrágica, mais grave, caracterizada por alterações da coagulação
sanguínea; e a chamada síndrome do choque associado à dengue, forma raríssima, mas que
pode levar à morte, se não houver atendimento especializado (WHO, 2013).
A dengue clássica apresenta alguns sintomas característicos como febre alta
(40°C/104°F), dor de cabeça intensa, dor atrás dos olhos, dores musculares e articulares,
náuseas, vômitos, inchaço das glândulas e erupção cutânea. Os sintomas geralmente duram de
2 a 7 dias, depois de um período de incubação de 4 a 10 dias após a picada de um mosquito
infectado. A dengue hemorrágica, mais grave, é uma complicação potencialmente fatal devido
ao extravazamento do plasma, acúmulo de líquido, dificuldade respiratória, hemorragia grave
e comprometimento dos órgãos (NATHAN et al., 2010, p. 12). Os sinais de aviso ocorrem de
3 a 7 dias depois dos primeiros sintomas, em conjunto com uma diminuição na temperatura
(abaixo de 38°C/100°F) e incluem: dor abdominal, vômitos persistentes, respiração rápida,
sangramento das gengivas, fadiga, inquietação, presença de sangue nos vômitos. As próximas
24 a 48 horas após a fase crítica podem ser letais; é necessário cuidado médico adequado, para
evitar complicações e risco de morte. Na síndrome do choque associada à dengue, o potencial
de risco é evidenciado por uma das seguintes complicações: alterações neurológicas (delírio,
sonolência, depressão, coma, irritabilidade extrema, psicose, demência, amnésia), sintomas

16
cardiorrespiratórios, insuficiência hepática, hemorragia digestiva e derrame pleural. As
manifestações neurológicas, geralmente, surgem no final do período febril ou na
convalescença (WHO, 2013, s.p.).
O vírus da dengue é transmitido aos seres humanos através da picada de fêmeas do
mosquito infectado. Após a incubação do vírus por 4 a 10 dias, um mosquito infectado é
capaz de transmitir o vírus para o resto de sua vida. Os humanos infectados são os principais
transportadores e multiplicadores do vírus, que servem como fonte para infecção de outras
fêmeas do mosquito. Os pacientes que já estão infectados com o vírus da dengue podem
transmitir a infecção (por 4 a 5 dias; máximo 12) via Ae. aegypti depois de seus primeiros
sintomas aparecerem. Não há tratamento específico para a dengue. No entanto, a manutenção
do volume de fluido corporal do paciente é fundamental para o cuidado da dengue (WHO,
2013, s.p.).
A aplicação de inseticida e eliminação de locais de oviposição têm sido usadas como
as melhores estratégias para a diminuição da incidência da doença. A resistência aos
inseticidas constitui um limitante no controle das populações de mosquitos (WHO, 2013,
s.p.).
As dificuldades de combater o Ae. aegypti, em grandes e médias cidades, são muitas,
por ser um vetor de hábito doméstico, antropofílico, com atividade hematofágica diurna e
desenvolve-se preferencialmente em reservatórios artificiais (TAUIL, 2002, p. 868).

1.2 Ciclo de vida do Aedes aegypti

Nas regiões tropicais e subtropicais os mosquitos do gênero Aedes se desenvolvem em

poças d’água temporárias, ao longo da costa e em florestas, pântanos e em água acumulada
em reservatórios acidentais de água em inúmeros vegetais. A espécie Ae. aegypti, por sua vez
se desenvolve, preferencialmente, em reservatórios artificiais (MATHESON, 1932 apud
GUSMÃO, 2007, p. 10). Há consenso de que, a partir da população silvestre, devido às
pressões humanas decorrentes da destruição do habitat natural, uma variedade genética desse
mosquito teria encontrado nas áreas alteradas pelas atividades humanas condições favoráveis
para o seu desenvolvimento (NATAL, 2002, p. 206). O mosquito Ae. aegypti tem
demonstrado uma grande capacidade de adaptação a diferentes situações ambientais
consideradas desfavoráveis. Mosquitos adultos já foram encontrados em altitudes elevadas e
larvas em água poluída (TAUIL, 2002, p. 868).

17
 O mosquito sofre uma metamorfose, isto é, do ovo eclode uma larva que se alimenta e
cresce. Todas as larvas de mosquitos sofrem quatro mudas, após a última muda acontece o
momento da pupação. A partir da pupa emerge o adulto alado (Figura 1).

Fêmea de Aedes aegypti

alimentada com sangue

Pupa Ovos

Larva de 4ọ instar

Figura 1: Ciclo de vida do Aedes aegypti ilustrado por fotografias de todas as fases da vida do inseto. Apenas o
4ọ instar larval é mostrado
Fonte: GUSMÃO, 2007, p. 10.

Os ovos do Ae. aegypti são elípticos e têm cor pálida no momento da oviposição,
tornando-se escuros após alguns minutos, sendo que os inférteis geralmente não alcançam a
tonalidade escura dos férteis. Os ovos podem ser colocados isoladamente ou em conjuntos, na
água, próximos a ela ou onde a água provavelmente estará presente algum tempo depois
(CONSOLI; OLIVEIRA 1998, p. 29). É importante ressaltar que após o desenvolvimento do
embrião, que dura por volta de dois a três dias, os ovos tornam-se resistentes à dessecação e
estes continuam viáveis por um período próximo a um ano. Sempre que os recipientes
contendo os ovos em suas “paredes”, receberem água novamente e esta atingir os ovos, esses
serão estimulados a eclodir (NATAL, 2002, p. 206). Geralmente entre 50 a 200 ovos são
produzidos pela fêmea em 2 a 3 dias após a ingestão sanguínea. Estudos indicam que para a
produção normal de ovos é necessário à ingestão de pelo menos dez aminoácidos essenciais
na dieta do mosquito. Em geral, a fêmea adulta dos insetos de metamorfose completa utiliza o
sangue, primordialmente, como uma fonte de aminoácidos necessários para a maturação dos
18
ovos (CONSOLI, OLIVEIRA, 1998, p. 41). Por sua vez, os machos não sugam sangue,
necessitando somente das soluções açucaradas de origem vegetal como fonte primária de
energia. Os insetos hematófagos ingerem grandes quantidades de sangue em uma única
refeição. Os mosquitos, por exemplo, ingerem entre três e quatro vezes o seu peso corporal
em cada refeição. O sangue de vertebrados é um alimento rico em nutrientes, constituído
principalmente das seguintes proteínas: hemoglobina, albumina e imunoglobulina
(ROMOSER, 1996, p. 302).
Os estágios pupal e larval de todos os mosquitos acontecem na água. As larvas
possuem aspecto vermiforme e coloração esbranquiçada. O corpo da larva apresente cerca de
222 pares de cerdas, dispostas de maneira simétrica, estas têm a função sensorial e auxiliam
na movimentação na água (CONSOLI; OLIVEIRA 1998, p. 31). Ao contrário dos adultos que
possuem aparelho bucal adaptado a punção, as larvas de mosquitos têm aparelho bucal do tipo
mastigado-raspador; as peças bucais consistem em epifaringe, mandíbulas, maxilas,
hipofaringe e lábio. As mandíbulas e maxilas são placas robustas, dotadas de dentes e cerdas
fortes, úteis à trituração dos alimentos. As larvas passam por quatro estágios nas quais não se
pode definir facilmente o sexo. Já as pupas tem aspecto de vírgula e, inicialmente, seu corpo
possui a mesma coloração da larva recém-transformada, escurecendo a medida que se
aproxima o momento da emergência do adulto. Durante o estágio de pupa não ocorre à
ingestão de alimento (CONSOLI, OLIVEIRA, 1998, p. 33).
Os mosquitos adultos possuem pernas e antenas longas, coloração marrom escuro,
com listras e manchas brancas (CONSOLI, OLIVEIRA, 1998, p. 33; 36).
O corpo dos adultos é divido em cabeça, tórax e abdômen. Na cabeça encontram-se os
principais órgãos do sentido, como os olhos, antenas (que nos machos são plumosas e nas
fêmeas são pilosas) e os palpos. No tórax estão os apêndices especializados na locomoção,
isto é, as patas e as asas. O abdômen inclui a maior parte dos órgãos internos, dos aparelhos
reprodutor, digestivo e excretor (CONSOLI, OLIVEIRA, 1998, p. 19).

1.3 Anatomia e fisiologia do sistema digestório de insetos

Os insetos, em geral, se adaptaram a todos os tipos de dietas. Porém, a especialização

das peças bucais dos insetos associa-se menos à dieta do que ao método pelo qual o alimento
é obtido (BARNES, 1996, p. 810).

19
 O canal alimentar em insetos é um tubo que se estende da boca até o ânus e é formado
por uma camada de células que tem uma lâmina basal acelular presente no lado da hemocele.
As três maiores regiões do canal são o intestino anterior, o intestino médio e o intestino
posterior. O intestino anterior é comumente subdividido em uma faringe anterior, um esôfago,
um papo e um pró-ventrículo mais estreito (BARNES, 1996, p. 810).
A maioria dos insetos possui um par de glândulas, que geralmente secretam saliva, que
umedece as peças bucais e pode ser um solvente para o alimento; além disso, podem produzir
enzimas digestivas, que são misturadas na massa alimentar antes desta ser engolida
(BARNES, 1996, p. 812).
O intestino médio dos insetos, que também é chamado de ventrículo ou estômago, é
geralmente tubular, formado por células epiteliais colunares que secretam as enzimas
digestivas. Além de ser o principal sítio de digestão e absorção dos alimentos em insetos.
Uma característica típica do intestino médio da maioria dos insetos é a presença da membrana
peritrófica. Essa membrana é composta de uma camada muito fina de proteína e quitina. A
membrana peritrófica é sintetizada em insetos hematófagos, após a ingestão do sangue. Esta
envolve o alimento ingerido e separa o conteúdo luminal em dois compartimentos, o espaço
endoperitrófico (dentro da matriz peritrófica) e o ectoperitrófico (fora da matriz peritrófica)
(PERES; LEMOS; SILVA, 2012, p. 2). A membrana forma uma cobertura ao redor da massa
alimentar que se move através do intestino médio (Figura 2). Esta é permeável a algumas
enzimas. Os produtos iniciais da digestão passam através da membrana, onde são atacados
por uma segunda ordem de enzimas que se restringe ao espaço entre a parede intestinal e a
membrana peritrófica (BARNES, 1996, p. 812). Se um segundo repasto sanguíneo ocorrer
antes que o primeiro tenha sido totalmente digerido, forma-se uma segunda membrana
peritrófica circundando a primeira e o novo sangue ingerido. Por sua vez, os alimentos ricos
em açúcares são direcionados para o divertículo, onde a digestão é iniciada pela ação de
carboidrases oriundas da glândula salivar. Posteriormente, os açúcares são, paulatinamente,
transferidos para o intestino médio onde a digestão é finalizada. Esse mecanismo permite a
fêmea manter vazio o intestino médio, pronto para receber o repasto sanguíneo (CONSOLI,
OLIVEIRA, 1998, p. 40).

20
Figura 2: Representação esquemática do trato intestinal de insetos. Observar os subcompartimentos presentes no
intestino médio
Fonte: PERES; LEMOS; SILVA, 2012, p. 2.

A maioria dos insetos possui bolsas no intestino médio, chamadas de cecos gástricos,
comumente localizados na extremidade anterior do intestino médio. Os cecos gástricos são o
local de digestão final e, junto com a extremidade anterior do intestino, são os principais
locais de absorção alimentar. A região posterior do intestino médio é altamente expansível e é
local de destino, armazenagem e digestão do sangue. O intestino médio é também o principal
sítio de interação entre o inseto e os patógenos que ele transmite. O intestino posterior
funciona na egestão dos resíduos e no equilíbrio hídrico e salino. Na maioria dos insetos, os
coxins retais ou glândulas retais ocorrem no epitélio. Esses órgãos são os principais locais de
reabsorção de água (BARNES, 1996, p. 814).
O metabolismo energético da grande maioria dos mosquitos, machos e fêmeas,
depende da ingestão de carboidratos, usualmente provenientes de seivas, flores e frutos. O
acúmulo de glicogênio e triglicerídeos, que é determinante para o potencial de atividade e
longevidade, depende diretamente dessas reservas. Quanto ao repasto sanguíneo das fêmeas,
este está relacionado primordialmente ao desenvolvimento de ovos (CONSOLI; OLIVEIRA,
1997, p. 39). Como o sangue de vertebrados é rico em proteínas, sua digestão envolve várias
proteases. A digestão das proteínas é iniciada pela clivagem em grandes polipeptídeos pela
ação de endopeptidases como tripsina e quimotripsina. Os polipeptídeos são quebrados em
aminoácidos pelas carboxipeptidases e aminopeptidases. A ingestão de sangue estimula a

21
atividade proteolítica intestinal e 80% das proteínas são digeridas em 24h (NORIEGA;
WELLS, 1999 apud GUSMÃO, 2007, p. 12).
Insetos que dependem estritamente de sangue ao longo da vida, em geral, estão em
estreita associação simbiótica com microrganismos. Certos microrganismos podem estar
associados ao intestino dos insetos, contribuindo para digestão dos alimentos, produzindo
vitaminas, aminoácidos essenciais e proteínas e combatendo microrganismos potencialmente
prejudiciais ao competir com eles por nutrientes (SANCHEZ-CONTRERAS; VLISIDOU,
2008, p. 206).

1.4 Oviposição

A seleção do local de oviposição por parte das fêmeas é o principal fator responsável
pela distribuição dos mosquitos nos criadouros e é da maior relevância para a disribuição das
espécies na natureza. Fatores físicos, químicos e biológicos podem influenciar nessa seleção:
intensidade de luz; as características de coloração apresentada pelo criadouro em potencial;
diferentes temperaturas; graus de salinidade; presença de vegetais ou de seus produtos;
microrganismos ou seus produtos e substâncias relacionadas a formas imaturas de mosquitos
(CONSOLI, OLIVEIRA, 1998, p. 46). Seleção de sítios de oviposição inclui respostas visuais
ou olfativas (atrativos ou repelentes), que resultam na orientação para sítios de oviposição, e
em seguida, as respostas a esses estimulantes ou repelentes químicos podem resultar na
deposição de ovos (BENTLEY; DAY, 1989, p. 411). Algumas pesquisas têm sido realizadas
para investigar a relação entre bactérias e a seleção de sítios de oviposição por fêmeas de Ae.
aegypti.
Na falta de condições adequadas para a oviposição, ou mesmo espontaneamente,
mosquitos podem reter seus ovos por muitos dias. Em Ae. aegypti, a fertilidade de ovos
retidos por mais de 15 dias declina rapidamente. Em muitas espécies, choques físicos
diversos, decapitação, retirada de uma asa ou envenenamento por éter ou inseticidas podem
levar a oviposição, mesmo em ausência de água (CONSOLI, OLIVEIRA, 1998, p. 47).

22
2 SIMBIONTES DE INSETOS

2.1 Tipos de relações simbióticas

Os insetos são o grupo mais diversificado de animais com mais de um milhão de

espécies diferentes encontradas em quase todos os habitats, com exceção do mar (VILMOS et
al., 1998, p. 60). Devido à sua ampla distribuição, os insetos são inevitavelmente associados
com uma grande variedade de formas de vida microscópicas, incluindo vírus, bactérias,
fungos, protozoários e nematodes (SANCHEZ-CONTRERAS; VLISIDOU, 2008, p. 203).
Esses microrganismos podem colonizar, crescer e se reproduzir no trato digestivo, no lúmen e
associados ao epitélio intestinal, e no sistema reprodutivo, desempenhando papéis-chave na
fisiologia do hospedeiro (DOUGLAS; BEARD, 1996 p. 423).
Os microrganismos procarióticos são comuns em todos os ambientes da Terra,
estabelecendo diversas interações com seres eucariotos. Essas interações podem ser
patogênica, simbiótica e de vetorização e podem ocorrer de forma permanente ou transiente.
Nas associações permanentes, os microrganismos são chamados simbiontes, pelo fato de
residir no hospedeiro por gerações sucessivas (DOUGLAS; BEARD, 1996, p. 424). Duas
formas de simbiose podem ser observadas, primeiro exosimbiose: os microrganismos estão
sobre a superfície dos seus hospedeiros e, segundo, endossimbiose: os microrganismos vivem
no interior de seus hospedeiros, como por exemplo, no intestino (extracelular) ou em tecidos e
células (intracelular) de seus hospedeiros (DOUGLAS, 2000, p. 534).
As associações simbióticas podem ser divididas em mutualismo, comensalismo e
parasitismo. O mutualismo é uma assoaciação entre dois organismos ou populações onde
ambos os parceiros se beneficiam. Os línquens são um exemplo de assoaciação vantajosa
mútua entre um fungo e uma alga ou cianobactéria. O comensalismo ocorre quando o
microrganismo se beneficia, sem causar danos aparentes e sem fornecer nenhuma vantagem
ao hospedeiro. Certos microrganismos comensais poderiam ser considerados mutualistas,
como por exemplo, microrganismos associados ao intestino de insetos. O parasitismo é um
tipo de simbiose na qual, um microrganismo retira os nutrientes do hospedeiro,
prejudicando-o (TORTORA; FUNKE; CASE, 2002, p. 396).
Considerando o grau de dependência e o tempo da associação estabelecida entre
insetos e bactéria, os simbiontes podem ser classificados em dois grupos: os endossimbiontes

23
obrigatórios primários (P), que tem uma longa história evolutiva com seus hospedeiros e eles
são necessários para a sobrevivência e fertilidade do hospedeiro, e os simbiontes facultativos
secundários (S), que estabeleceram uma associação mais recente com o hospedeiro, tendo a
capacidade de voltar a uma condição de vida livre (SANCHEZ-CONTRERAS; VLISIDOU,
2008, p. 205).
A maioria dos simbiontes não são cultiváveis fora do seu hospedeiro. Assim, a
caracterização inicial dependia fortemente da observação microscópica, tornando o seu estudo
dificil. Mais recentemente, a aplicação de técnicas de Biologia molecular tem revolucionado o
estudo de endossimbiontes, facilitando a sua identificação, como também o estudo das
relações filogenéticas com outras espécies de vida livre, permitindo o conhecimento de seu
potencial metabólico (SANCHEZ-CONTRERAS; VLISIDOU, 2008, p. 205).

2.3 Importância nutricional

Microrganismos são ubíquos na natureza e os intestinos de animais são locais

particularmente favoráveis para a colonização microbiana (DUNN; STABB, 2005, p. 8786).
Como já dito, os insetos constituem um dos mais diversos grupos de organismos, com
comportamentos e nichos ecológicos amplamente variados. Essa diversidade provavelmente
reflete uma abundância de interações microrganismo-hospedeiro, indicando que
microrganismos desempenham papéis importantes na nutrição, reprodução, desenvolvimento
e comportamento dos insetos hospedeiros (DOUGLAS; BEARD, 1996, p. 423).
Os mosquitos utilizam em sua dieta duas fontes de alimentos, ambas deficientes em
nutrientes essenciais. O néctar que é, primordialmente, uma fonte de carboidratos e o sangue
que é um alimento rico em proteínas e aminoácidos essenciais, mas deficiente em
carboidratos, lipídios e quantidades adequadas de vitaminas do complexo B (RIBEIRO, 1996,
p. 27). Desta forma, muitos insetos que se alimentam exclusivamente de sangue de
vertebrados possuem microrganismos simbiontes (ROMOSER, 1996, p. 305).
Bactérias simbiontes do trato digestivo de insetos complementam a dieta do
hospedeiro pelo fornecimento de aminoácidos, proteínas e vitaminas (DILLON, 1994, p.
234).
A porção do intestino posterior do trato alimentar é a região mais densa e
diversamente povoada por microrganismos. No caso de insetos hematófagos, que se
alimentam exclusivamente de sangue de vertebrados, a presença de microrganismos
24
simbiontes garante a oferta de nutrientes cuja concentração é deficiente no sangue
(ROMOSER, 1996, p. 306). Além disso, as bactérias constituem a principal fonte nutricional
para larvas de mosquitos, sendo indispensáveis para seu desenvolvimento adequado
(WALKER et al., 1988 apud GUSMÃO, 2007, p. 27). A existência de uma microbiota
intestinal foi constatada em mosquitos, capturados no campo ou criados em laboratório
(DEMAIO et al., 1996, p. 222).
Gusmão e colaboradores (2010, p. 278) isolaram e identificaram microrganismos de
divertículo ventral de Ae. aegypti, sendo mostrada uma relação entre a presença de bactérias
simbiontes aeróbicas facultativas e a acidificação do lúmen do divertículo ventral. O
divertículo ventral por armazenar soluções açucaradas ingeridas pelo mosquito apresenta
abundância de moléculas para fermentação microbiana. Esses autores acreditam que
provavelmente os ácidos orgânicos úteis, entre outras moléculas, sejam produzidos pelos
microrganismos e favoreçam a nutrição do mosquito.
A maioria dos estudos referentes à microbiologia do intestino de insetos é feita pela
caracterização da microbiota através do isolamento e cultivo dos isolados, utilizando técnicas
analíticas clássicas. Até recentemente, o progresso nesse campo era lento, principalmente
devido ao fato de muitos simbiontes intestinais serem de difícil cultivo (BAUMAN;
MORAN, 1997, p. 19). Novas abordagens, empregando técnicas moleculares vêm sendo
alternativamente utilizadas, tendo como alvo o gene 16S que codifica para a menor
subunidade do RNA ribossomal, encontrada em todos os procariotos. Este gene é altamente
conservado, mas tem regiões variáveis, as quais são bastante úteis para estudos taxonômicos
(HOGG; LEHANE, 1999, p. 4228). O estudo de microrganismos, incluindo a microbiota
intestinal, tem sido revitalizado pelo avanço das técnicas de Biologia molecular, que provê
ferramentas para classificar e estudar microrganismos em seus habitats naturais.
Gusmão, em sua tese de doutorado, analisou o conteúdo intestinal de fêmeas de
mosquitos Ae. aegypti em diferentes estágios, 24 horas e 48 horas após a ingestão de sangue.
As análises mostraram um aumento do número de bacilos curtos à medida que o sangue foi
digerido (Figura 3). Observação em 48 horas após a ingestão de sangue mostrou o lúmen
intestinal completamente ocupado por bactérias (Figura 4). Estes dados foram compatíveis
com as contagens de bactérias intestinais realizadas em diferentes momentos durante a
digestão sanguínea, sendo que em 48h havia, aproximadamente, 41.148.144 bactérias no
intestino de uma fêmea. Após 48 horas da ingestão sanguínea ocorreu uma redução do
número de bactérias intestinais. A excreção do bolo fecal determinou a diminuição do número

25
de bactérias no intestino. As bactérias são liberadas vivas nas fezes (GUSMÃO, 2007, p.
132).
O estudo da microbiota intestinal, bem como a investigação da presença de
microrganismos simbiontes em Ae. aegypti poderá esclarecer o papel destes organismos para
sua digestão e nutrição, e, consequentemente, a sua interferência na longevidade e fertilidade
das fêmeas. Outros aspectos da biologia do mosquito também devem envolver a associação
do mesmo com os microrganismos.

A B

Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de seção de IM de Aedes aegypti dissecado 24 h após o repasto
sanguíneo. A, Nenhuma bactéria é vista no lúmen intestinal; B, verificou-se a presença de microrganismos na
região mais periférica do bolo. As setas apontam as bactérias
Fonte: GUSMÃO, 2007, p. 118.

26
Figura 4. Microscopia eletrônica de varredura de seção oblíqua de IM de Aedes aegypti dissecado 48 h após o repasto
sanguíneo. Bactérias preenchem todo o lúmen intestinal
Fonte: GUSMÃO, 2007, p. 118.

2.3 Importância na reprodução

Quanto a importância dos microrganismos simbiontes na maturação sexual, Nogge

afirma que ausência destes simbiontes pode impedir a maturação sexual dos insetos ou levar à
esterilidade (NOGGE, 1881 apud GUSMÃO, 2007, p. 27). Por exemplo, a bactéria
Rhodococcus rhodnii, simbionte do triatomíneo Rhodnius prolixus, cresce exponencialmente
no intestino após a ingestão de sangue pelo inseto, sendo essencial para o seu crescimento e
desenvolvimento (BEARD et al., 2002, p. 623). O afídeo Acyrthosiphon pisum, que se
alimenta de secreções açucaradas, contém o simbionte Buchnera aphidicola, que fornece
nutrientes ausentes na dieta do inseto (MORAN et al., 1997 apud GUSMÃO 2007, p. 19).
Apesar disso, microrganismos associados com vetores podem exercer um efeito patogênico
direto sobre o hospedeiro, interferir com sua reprodução ou reduzir a competência do vetor
(BEARD et al.; BALDRIDGE et al., 2004, apud GUSMÃO, 2007, p. 28).
Em pesquisas recentes com mosquitos Ae. aegypti, Gusmão verificou que a
antibióticos como espectinomicina e rifampicina eliminavam as bactérias intestinais de
fêmeas de Ae. aegypti, sendo que as fêmeas que ingeriram espectinomicina morreram durante
os 10 primeiros dias após o tratamento e todas as fêmeas que ingeriram rifampicina morreram
antes da oviposição. Um fato importante observado nesta pesquisa foi que não houve eclosão
larval dos ovos das fêmeas sobreviventes ao tratamento com espectinomicina. Os ovos
ficavam com aspecto murcho, como se estivessem vazios (GUSMÃO, 2007, p. 120). Isto
27
indica que os microrganismos presentes no intestino médio de mosquitos Ae. aegypti
desempenham um papel importante na reprodução destes insetos.

Figura 5. Diferença no aspecto de ovos produzidos por fêmeas de Aedes aegypti tratadas ou não com
espectinomicina. A, ovos de fêmeas que não ingeriram antibiótico; B, Ovos de fêmeas que ingeriram
espectinomicina
Fonte: GUSMÃO, 2007, p. 120.

2.4 Microrganismos simbiontes e o controle da transmissão de doenças

O uso de bactéria transformada para impedir a transmissão de doenças através da

interferência sobre os parasitas no intestino de insetos vetores é chamado paratrangênese. A
introdução de genes em bactérias simbiontes de mosquitos, moscas tsé-tsé e triatomíneos tem
sido empregada objetivando o controle dos insetos e a redução da competência dos vetores
para patógenos humanos e de animais (BEARD et al., 2002, p. 624). Bactérias simbiontes,
modificadas para expressar genes refratários no intestino do vetor, têm sido usadas com
sucesso para impedir a transmissão da doença de Chagas por Rhodnius prolixus (DOTSON et
al., 2003, p. 107). Segundo Yoshida, esta abordagem de paratransgênese é, também,
potencialmente útil, para o desenvolvimento de estratégias para o controle de malária.
Adicionalmente, a transformação genética de um ou mais microrganismos simbiontes do
mosquito Ae. aegypti, capazes de expressar produtos gênicos heterólogos letais ao vírus
responsável pela doença, poderá vir a ser, futuramente, uma forma de bloqueio da transmissão
do vírus para seres humanos (YOSHIDA et al., 2001, p. 44).

28
2.5 Importância no comportamento

Em estudos envolvendo a microbiota de mosquitos Ae. aegypti, diferentes

microrganismos simbiontes foram isolados e identificados do intestino médio e de ovos
recém-depositados do mosquito. À medida que estes microrganismos são identificados, torna-
se necessária a investigação da influência desses simbiontes sobre os mosquitos.
A partir de técnicas moleculares Gusmão isolou e identificou sete espécies diferentes
de bactérias, encontradas no intestino médio do mosquito Ae. aegypti: Asaia sp.; Bacillus sp.;
Bacillus subtilis; Enterobacter sp.; Enterococcus sp.; Klebsiella sp.; Serratia sp. e a levedura
Pichia ohmeri. Os isolados de bactérias e leveduras foram identificados a partir de
sequenciamento de DNA ribossômico 16S e 28S, respectivamente. As sequências obtidas
foram comparadas com as depositadas no GenBank. A fim de saber se as fêmeas transmitem
bactérias à sua prole, fez-se também isolamentos de microrganismos de ovos recém-
depositados. A bactéria Asaia sp. também foi isolada de ovos de Ae. aegypti (GUSMÃO et
al., 2010, p. 278).
Recentemente, bactérias do gênero Asaia encontrada na natureza em plantas, néctar de
flores e frutos em países tropicais, foi descrita como simbionte em A. stephensi (FAVIA et al.,
2007, p. 9048) e Ae. aegypti (CROTTI, 2009, p. 3264). Acredita-se que estas bactérias sejam
importantes para esses insetos, pois colonizam o intestino e trato reprodutivo, e são
transmitidas verticalmente (FAVIA et al., 2007, p. 9049 ). Entretanto, um papel fisiológico
ainda não foi atribuído a Asaia.
O gênero Asaia compreende espécies incapazes de crescer a 37°C, não havendo
registro de infecções causadas por essas bactérias. Esses organismos não tem apresentado
risco à saúde humana, baseado na ausência de associação epidemiológica (MOORE, 1990, p.
4018).
Como Asaia sp. já foi isolada de mosquitos de campo e de diferentes insetários
(MARZORATI et al., 2006 apud FAVIA et al., 2007) acredita-se que esta bactéria tenha
iniciado uma relação com os mosquitos durante a alimentação de néctar de flores (GUSMÃO,
2007, p. 23). Com base nesta ideia, Sardinha realizou experimentos buscando avaliar a
atratividade de soluções de sacarose contendo Asaia sp. Soluções de sacarose contendo Asaia
sp. foram mais atrativas que soluções de sacarose estéreis.(SARDINHA, 2010, p. 33) Estes
resultados fortalecem o pensamento de que a bactéria Asaia sp. seja um simbionte secundário
de Ae. aegypti, já que a mesma não apresenta dificuldade de crescimento em meio de cultivo.

29
Outras investigações de Gusmão e Sardinha mostraram que fêmeas depositam mais ovos em
recipientes contendo cultura diluída de Asaia sp. que recipiente contendo apenas água
(GUSMÃO, 2007, p.145 ); (SARDINHA, 2010, p. 43).
Com base nas informações acima, existem duas possibilidades de contaminação
natural de sítios de oviposição com a bactéria Asaia sp.: através dos ovos, já que Asaia sp. foi
identificada em ovos recém-depositados, e através das fezes que contêm bactérias intestinais
vivas. Portanto, pode-se esperar a presença de Asaia sp. em recipientes comumente utilizados
pelas fêmeas para deposição de ovos, podendo a mesma ter um papel na atração de fêmeas
para oviposição.
Diferentemente do observado com Asaia sp., sítios contendo Serratia sp. repeliram as
fêmeas, sendo observados poucos ovos nos mesmos (GUSMÃO, 2007, p. 147). Estes dados
mostram que há muito ainda para ser descoberto sobre o comportamento de oviposição dos
mosquitos, incluindo o papel das bactérias simbiontes neste processo.

30
3 INVESTIGAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA BACTÉRIA Asaia sp. NA SELEÇÃO DE
SÍTIOS DE OVIPOSIÇÃO DE FÊMEAS DO MOSQUITO Aedes aegypti

3.1 METODOLOGIA

3.1.1 Mosquitos

Os mosquitos Ae. aegypti foram obtidos a partir da colônia do Laboratório de

Biotecnologia (LBT), do Centro de Biociências (CBB) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF), através da colaboração do professor Francisco José Alves Lemos.

3.1.2 Manutenção do Ae. aegypti

A produção de ovos foi induzida a partir da alimentação sanguínea das fêmeas sobre
camundongo imobilizado. Os ovos foram depositados em papel de filtro umedecido entre 2 a
3 dias após a dieta sanguínea. Os ovos depositados no papel foram transferidos para água
destilada para a eclosão das larvas. Após quatro mudas larvais, o estágio de pupa foi
alcançado. As pupas foram coletadas e transferidas para pequenos potes de plástico com água
destilada. Estes potes foram colocados dentro de gaiolas umidificadas contendo uma solução
de sacarose 10%, na qual as pupas se desenvolveram até o estágio de mosquito adulto.
As larvas de mosquito Ae. aegypti foram criadas em bandejas com água destilada a
temperatura ambiente. A alimentação das larvas foi feita diariamente. Sua dieta consistiu de
ração de camundongo triturada.
Os mosquitos adultos eram mantidos a temperatura ambiente em gaiolas umidificadas
contendo uma solução de sacarose 10%.

3.1.3 Preparo e esterilização dos materiais

Todos os materiais necessários ao cultivo de microrganismos, que incluem placas de

Petri, ponteiras, alça de platina, tubos de centrífuga, frascos Erlenmeyer, beckers e tubos tipo
Eppendorf foram autoclavados a 121°C por 20 min. Os meios de cultura empregados para o
cultivo também foram autoclavados nestas condições. Outros materiais, como lupa e pipetas
automáticas, foram sanitizados com etanol 70%, empregando-se chumaços de algodão.

31
3.1.4 Fonte de Asaia sp.

O microrganismo investigado quanto à capacidade de atrair fêmeas de Ae. aegypti para

oviposição foi a bactéria Asaia sp. isolada de intestino de fêmea de Ae. aegypti por Gusmão
(2007). Estoque da bactéria mantido em Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; MgSO4 0,1M; glicerol 65%
a -70oC foi utilizado como fonte dos inóculos de Asaia sp. neste trabalho.

3.1.5 Cultivo da bactéria Asaia sp.

Alíquotas de 50 μL do estoque de Asaia sp. foram inoculadas em tubos de centrífuga

(15 mL) contendo 5 mL de caldo BHI (infusão de cérebro e coração). O processo de
inoculação da bactéria foi realizado no fluxo laminar. Antes de serem colocados no fluxo, os
materiais (pipetas, tubos, descartes) foram sanitizados superficialmente com álcool 70% e
colocados no fluxo, sendo expostos à luz ultravioleta por 15 minutos. O meio de cultura e a
bactéria Asaia sp. foram introduzidos posteriormente. Após o processo de inoculação os tubos
foram mantidos a 28oC por 24 h. Tubos contendo 5 mL de meio BHI estéril também foram
mantidos nas mesmas condições para descartar a possibilidade de uso de meio contaminado
nos experimentos de preferência de sítios de oviposição.

3.1.6 Preparação dos sítios de oviposição

Sítios de oviposição foram confeccionados utilizando inicialmente garrafas PET

(Politereftalato de etileno) cortadas (Figura 6A). Com auxílio de uma tesoura foram feitas
ranhuras, para aumentar o atrito das patas das fêmeas com a superfície do recipiente durante a
oviposição. Esses sítios foram forrados com papel filtro para deposição dos ovos.
Posteriormente, outro tipo de sítio foi confeccionado utilizado vasos de plástico preto com
dimensões 9cmx9cmx8,5cm (Figura 6B). Os vasos foram forrados com folhas plásticas
transparentes. Estas também sofreram ranhuras e foram removidas para contagem dos ovos
(Figura 6C). Três tipos de sítios foram produzidos: sítio 1, contendo apenas 150 mL de água
destilada; sítio 2, contendo 150 mL de água destilada e 5 mL de meio BHI; sítio 3, contendo
150 mL de água destilada e 5 mL de cultura de Asaia sp.

32
Figura 6. Sítios confeccionados para os ensaios de oviposição do mosquito Aedes aegypti. A, Sítio
confeccionado com garrafa PET; B e C, vista frontal e superior do sítio de plástico preto revestido
internamente com folhas plásticas

3.1.7 Alimentação das fêmeas

Vinte cinco a trinta fêmeas foram transferidas, a cada experimento, para gaiolas para
alimentação sobre camundongos imobilizados. Vinte e quatro horas antes do repasto
sanguíneo as fêmeas ficaram desprovidas das soluções de sacarose.

33
3.1.8 Ensaios de atração para a oviposição em gaiola-campo

Os três tipos de sítios foram transferidos para um gaiola cúbica (60cmx60cmx60cm)

confeccionada com madeira e tela (Figura 7). As fêmeas foram transferidas para a gaiola 24h
após a alimentação sanguínea. A ordem dos sítios foi a seguinte: sítio contendo água (1), sítio
contendo meio (2) e sítio contendo cultura de Asaia sp. (3) Os recipientes foram removidos
das gaiolas após 72h para a contagem dos ovos. O experimento foi feito em triplicata, sendo
que no primeiro teste foram utilizados os sítios de garrafa PET e, nos demais, sítios de
plástico preto. A gaiola foi mantida no quintal de uma casa no bairro Residencial Santo
Antônio em Campos dos Goytacazes. Nessa mesma residência utilizada no experimento
gaiola-campo, três conjuntos dos sítios utilizados nos experimentos descritos anteriormente
foram distribuídos em locais diferentes no quintal. Os três sítios foram espaçados em 80 cm,
aproximadamente. Os mesmos foram observados durante 15 dias para verificar a presença de
ovos e/ou larvas de Ae. aegypti ou outra espécie de mosquito.

Figura 7. Gaiola utilizada no ensaio de atração para oviposição em gaiola-campo. A, vista frontal; B, vista
superior mostrando os três sítios

3.1.9 Ensaios de atração para oviposição no campo

Os ensaios ocorreram no câmpus Campos-Centro do Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia Fluminense. Os três tipos de sítios foram distribuídos em cinco locais no
câmpus (Figura 8). Jardins foram preferidos neste ensaio, sendo que um dos locais foi um
corredor do câmpus. Os sítios foram distribuídos de acordo com a Figura 9, seguindo a
34
ordem: sítio contendo água (1), sítio contendo meio (2) e sítio contendo cultura de Asaia sp.
(3). Os ensaios duraram em média duas semanas, sendo os recipientes coletados após esse
período para contagem dos ovos. Os ensaios foram repetidos três vezes, sendo que no
primeiro teste, os sítios de garrafa PET foram utilizados e, nos demais, os sítios de plástico
preto (Figura 9).

A B

C D

Figura 8. Locais do câmpus Campos-Centro do Instituto Federal Fluminense onde foram distribuídos os
sítios de oviposição para os experimentos no campo. A, B, C, E, sítios nos jardins; D sítios no corredor
35
Figura 9. Sítios distribuídos em um jardim do câmpus Campos-Centro para o experimento no campo

3.1.10 Ensaio semi-campo de atração para oviposição

O ensaio foi realizado com a colaboração do Prof. Richard Ian Samuels e do pós-
doutorando Adriano de Paula do Laboratório de Proteção de Plantas, Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias, UENF. Os sítios de oviposição foram distribuídos numa sala de 6
m2 (figura 10) destinada a experimentos cujas condições se aproximem das encontradas no
ambiente domiciliar (campo). Na sala semi-campo foram colocados os três tipos de sítios
distribuídos da seguinte forma: sítio contendo água (1) no canto da sala, sítio contendo meio
(2) no centro junto a uma das paredes e sítio contendo cultura de Asaia sp. (3) no canto
extremo ao sítio 1. Um frasco contendo sacarose foi colocado no chão para alimentação das
fêmeas. Vinte cinco a trinta fêmeas alimentadas com sangue foram liberadas na sala e após
72h as mesmas foram eliminadas através de borrifamento com álcool. Nesta sala ficaram
expostas duas gaiolas para avaliação do poder atrativo da bactéria Asaia sp. para alimentação
com sacarose, na qual uma gaiola continha um sítio com água para oviposição e um frasco
contendo sacarose acrescida de 100 µL do estoque de cultura de Asaia sp.; na outra gaiola
continha o sítio com água para oviposição e o frasco de sacarose sem Asaia sp. Em cada um
dos frascos de sacarose foi inserida uma tira de flanela estéril, permitindo o pouso das fêmeas
para alimentação (Figura 11). Em cada gaiola foi aberta uma pequena passagem de 3 cm de
diâmetro para possibilitar a entrada das fêmeas. Os ovos depositados nos sítios das gaiolas e

36
da sala foram contados após o experimento. Os testes foram feitos em triplicata, sendo que o
primeiro utilizou sítios de garrafa PET (Figuras 10A e 10B) e os demais, sítios de plástico
preto (Figura 10C).

A B

Figura 10. Disposição dos sítios de oviposição na sala de experimentação semi-campo. A e B, sítios PET; C,
sítios de plástico preto

37
Figura 11. Frasco de sacarose contendo uma tira de flanela estéril, utilizado para ensaio de alimentação

3.2 RESULTADOS

3.2.1 Experimento gaiola campo

Os resultados dos ensaios de atração do mosquito Ae. aegypti para a oviposição em

gaiola campo estão resumidos na Figura 12. Os resultados desses experimentos variaram
bastante. Nos dois primeiros ensaios as fêmeas de Ae. aegypti depositaram mais ovos no sítio
contendo apenas água (430 ovos no primeiro ensaio e 880 ovos no segundo ensaio), sendo os
sítios com Asaia sp. o segundo em número de ovos. No terceiro experimento observou-se
maior quantidade de ovos no sítio contendo meio BHI diluído (312 ovos), sendo que os
demais sítios não diferiram entre si.

38
 Experimento gaiola-campo

Experimento 1

Experimento 2 Água
Meio
Asaia sp.
Experimento 3

0 200 400 600 800 1000

Número de ovos

Figura 12. Resposta de oviposição de fêmeas de Aedes aegypti nos experimentos realizados em gaiola-
campo

A turbidez do sítio contendo meio BHI variou ao longo do experimento, à medida que
microrganismos contaminantes proliferavam no mesmo. Apesar do meio BHI estar diluído 30
vezes, o crescimento microbiano foi suficiente para alterar significativamente o odor do meio.
Com base no que foi percebido no sítio com meio BHI, é provável que
microrganismos contaminantes também tenham crescido no sítio contendo a bactéria Asaia
sp. A cada experimento, um conjunto diferente de microrganismos deve ter influenciado o
comportamento das fêmeas. Apesar disso, os sítios contendo Asaia sp. foram o segundo em
número de ovos. Resume-se, então, que nos experimentos 1 e 2, os sítios contendo meio BHI
foi o menos escolhido dos três. A presença de Asaia sp. tornou o meio mais atrativo que o
contendo apenas meio. No experimento 3, o conjunto de microrganismo que cresceu no meio
influenciou positivamente as fêmeas. Utilizando esta metodologia, percebeu-se que como a
gaiola foi mantida no quintal de uma residência, os sítios ficaram expostos a ponto de não
haver impedimento da entrada de microrganismos nos sítios. Como os experimentos foram
realizados em dias diferentes, microrganismos diferentes acessaram os sítios.
Quanto aos sítios mantidos no quintal de residência, nenhum ovo ou larva do mosquito
Ae. aegypti foi observado. Nos sítios contendo meio BHI com ou sem Asaia sp. havia larvas
esbranquiçadas de outro inseto. Estas larvas também foram encontradas nos sítios do
experimento realizado no campus do IFF.

39
3.2.2 Experimento semi-campo

Os resultados dos experimentos realizados na sala semi-campo estão resumidos na

Figura 13. Observou-se que os sítios contendo a bactéria Asaia sp. foram preferidos como o
local de postura de ovos por fêmeas de Ae. aegypti.
A sala semi-campo possuía uma pequena janela de vidro com fechamento justo,
permitindo apenas a iluminação da mesma no período do dia. Após a distribuição dos sítios e
liberação das fêmeas, a sala foi fechada, não havendo geração de corrente de ar. Portanto,
esperava-se menor contaminação dos sítios. Mesmo assim foi observada variação na turbidez
dos sítios contendo meio BHI e cultura de Asaia sp. Apesar de ser esperada maior turbidez no
meio que já continha a bactéria Asaia sp., não houve diferença na turbidez em relação ao sítio
contendo meio BHI. Mesmo havendo contaminação dos sítios, o que continha Asaia sp.
recebeu mais ovos.
Os resultados de dois experimentos semi-campo foram inversos aos obtidos em dois
experimentos gaiola-campo, na qual os sítios contendo BHI apresentaram mais ovos que os
sítios com água. Notou-se que microrganismos contaminantes presentes na sala não tornaram
o sítio menos atrativo que os demais.

Semi-campo

Experimento 1

Experimento2 Água
Meio
Asaia sp.
Experimento 3

0 100 200 300 400 500

Número de ovos

Figura 13. Resposta de oviposição de fêmeas de Aedes aegypti nos experimentos realizados na sala semi-
campo

40
 Na sala semi-campo foram mantidas duas gaiolas contendo sítios de oviposição
isentos de Asaia sp. (somente com água) e frascos contendo solução de sacarose com ou sem
Asaia sp. As gaiolas apresentavam aberturas para permitirem a entrada de fêmeas que
pudessem ser atraídas pela presença de Asaia sp. para sítios de alimentação e permanecessem
na gaiola ovipondo nos sítios disponíveis. Os resultados obtidos mostraram que Asaia sp.
presente em sacarose não determinou a preferência das fêmeas pela gaiola relacionada. No
primeiro experimento houve um número de ovos ligeiramente superior na gaiola contendo
Asaia sp. em sacarose. Enquanto nos demais experimentos não houve deposição de ovos nos
sítios das gaiolas ou a deposição foi maior na gaiola que não apresentava Asaia sp. (Figura
14).

Ensaio de alimentação-gaiola semi-campo

Experimento 1

Experimento 2
Sacarose com Asaia sp.
Sacarose sem Asaia sp.

Experimento 3

0 50 100 150
Número de ovos

Figura 14. Resposta de oviposição de fêmeas de Aedes aegypti nos ensaios para alimentação realizados na
sala semi-campo

3.2.3 Experimento campo

Nos experimentos realizados nos locais do câmpus Campos-Centro do Instituto

Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense, foi observada a presença de larvas de
Ae. aegypti somente no terceiro experimento em um dos jardins (Figura 8B), no sítio controle
(água destilada). Neste mesmo experimento o sítio que continha Asaia sp. estava derrubado,
sendo assim não foi possível observar se havia larvas de Ae. aegypti neste sítio.
41
 Em todos os experimentos foi possível observar nos sítios contendo meio BHI e
cultura de Asaia sp., larvas esbranquiçadas muito ativas de um outro inseto (Figura 15). Estas
larvas ocorreram nos sítios dos jardins onde a vegetação era mais densa, (Figura 8C; 8E),
havendo queda de folhas nos mesmos. A água destes sítios apresentou coloração marrom-
esverdeada devido a degradação das folhas. As larvas esbranquiçadas foram mantidas no
laboratório de biologia do IFF para verificar o ciclo de vida deste inseto. Também foram
encontrados nestes sítios alguns insetos como a cochonilha (Figura 16A) e uma cochonilha
com ovissaco (Figura 16B), além de outros insetos e uma larva negra (Figura 17).

Figura 15. Estágios de vida do inseto encontrado em sítios contento meio BHI e cultura de Asaia sp. nos
experimentos campo. A, estágio larval; B, estágio de pupa; C, inseto adulto

42
Figura 16. A, Cochonilha encontrada em sítio do experimento no campo; B, Cochonilha com ovissaco (*)

Figura 17. Insetos encontrados nos sítios do experimento campo; A e C, fases adultas; B, estágio larval de
um outro inseto.

43
3.3 DISCUSSÃO

O entendimento da ecologia comportamental e química dos mosquitos é importante

para o desenvolvimento de novas técnicas de controle. A elucidação de quais informações
governam os comportamentos-chave, tais como a seleção de hospedeiro e oviposição, pode
fornecer uma ferramenta para a manipulação comportamental de mosquitos no campo. Um
importante elemento na fase reprodutiva dos mosquitos é a seleção de sítios de oviposição por
fêmeas, determinando a distribuição larval no campo. A seleção de sítios de oviposição inclui
respostas a estímulos visuais e olfatórios (atraente ou repelente) resultando na orientação em
direção a sítios de oviposição, e então respostas a estimulantes quimiotácteis ou inibidores
que podem afetar a deposição de ovos (BENTLEY; DAY, 1989, p. 402).
Ponnusamy e colaboradores (2008, p. 9265) postularam que a decisão final de uma
fêmea de Ae. aegypti aceitar ou rejeitar um sítio de oviposição deve envolver um processo de
dois passo. Primeiro, ao fazer contanto com a água do recipiente, ela determina a presença e
medidas de concentrações relativas de várias bactérias e moléculas (que são provavelmente
componentes das estruturas de parede bacteriana) usando quimiorreceptores de contato
presentes em antenas, partes bucais, tarso ou órgão ovipositor. No segundo passo, a fêmea
integra informação sensorial de função estimulatória e inibitória, com outras características
químicas (como por exemplo, pH) e mecânicas para verificar se a água de um recipiente
representa um sítio de oviposição adequado. Há uma forte pressão seletiva sobre fêmeas
grávidas para uma decisão acurada na deposição de ovos, já que a comunidade microbiana
dentro do sítio deve suportar o crescimento e desenvolvimento de sua prole, que depende dos
microrganismos para alimentação (PONNUSAMY et al., 2008, p. 9265).
Pela complexidade existente na seleção de sítios de oviposição, espera-se que durante
a história evolutiva de fêmeas de mosquitos tenha evoluído um comportamento de seleção de
sítios que otimizasse a relação entre a seleção de sítios de procriação e a adequabilidade para
o desenvolvimento larval (MERRIT et al., 1992, p. 350).
Mosquitos do gênero Aedes depositam os ovos sobre o substrato logo acima da
superfície da água. Mosquitos Ae. aegypti têm se adaptado bem ao ambiente urbano e pode se
reproduzir em sítios naturais, tais como buracos em árvores e pequenos alagados; e em
recipientes artificiais, tais como água em pneus velhos (NAVARRO et al., 2003, p. 46).
Entre os fatores citados acima, odores relacionados às bactérias também influenciam o
comportamento de oviposição de Ae. aegypti (NAVARRO et al., 2003, p. 46).

44
 Há uma forte relação entre sobrevivência e comportamento do mosquito e águas
contendo bactérias. Os principais alimentos das larvas na natureza consistem de algas
unicelulares, rotíferos, crustáceos e bactérias (MERRIT et al., 1992 apud NAVARRO et al.,
2003, p. 49). Navarro e colaboradores (2003, p. 49), afirmam que as bactérias são os
principais microrganismos presentes na dieta larval e que o desenvolvimento de larva até
mosquito adulto pode se basear apenas em cultura de bactérias. Além da influência de
microrganismos sobre o comportamento de oviposição de fêmeas, estes podem interferir na
eclosão larval. Ponnusamy e colaboradores (2011, p. 1) mostraram que água tratada com
agentes antimicrobianos pode impedir a eclosão larval. Ovos em contato com um grande
número de bactérias em sua superfície são os primeiros a permitirem a saída das larvas.
O primeiro registro da capacidade de bactérias de atrair mosquitos para sítios de
oviposição foi feito por Hazard et al. 1967 apud Navarro et al., 2003, ao isolar Aerobacter
aerogenes a partir de infusões de capim e testa-la sobre Culex quinquefasciatus.
Benzon e Apperson (1988 apud NAVARRO et al., 2002, p. 49) identificaram a
bactéria Acinitobacter calcoaceticus e Enterobacter cloacae como sendo responsáveis pela
atração para oviposição. Hasselschwert e Rockett (1988 apud Navarro et al., 2002, p. 49)
identificaram Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa como sendo atrativas.
Em ensaios realizados por Trexler et al., foram demonstrados o poder atrativo das
bactérias Psychrobacter immobilis e Sphingobacterium multivorum e um Bacillus não
identificado para sítios de oviposição de fêmeas de Ae. aegypti (TREXLER et al., 2003, p.
841).
Navarro e colaboradores (2003, p. 49) demonstraram através de experimentos de
oviposição, que águas contendo coliformes fecais e coliformes totais são mais atrativas para
oviposição por fêmeas de Ae. aegypti. A preferência por água de poças como sítio de
oviposição desapareceu quando a água foi tratada com tetraciclina, sugerindo que odores de
bactérias devem ser responsáveis pela atração. Novamente fortalecendo a ideia de que a
presença de bactéria pode ser o fator responsável pelo efeito atrativo dos sítios.
A bactéria empregada neste estudo é uma α-proteobacteria pertencente à família
Acetobacteriaceae reconhecida como simbionte de mosquitos. A relação simbiótica entre
Asaia e mosquitos tem sido estudada principalmente em relação ao vetor da malária
Anopheles stephensi. Esta bactéria também foi isolada de Anopheles gambiae, de colônias de
laboratório e mosquitos do campo, sendo identificada em todos os estágios do
desenvolvimento. A Asaia está presente nestas espécies no intestino médio, glândulas

45
salivares e órgãos reprodutivos (DAMIANI et al., 2010, p. 644). Também foi feita
identificação de Asaia em Anopheles maculipennis, como também no inseto Scaphoideus
titanus da ordem Hemiptera (CROTTI et al., 2009, p. 3260). Gusmão (2007, p. 135) isolou
uma espécie de Asaia a partir de intestino médio e ovos de Ae. aegypti. Isto sugere que Asaia
seja um simbionte de distribuição ampla em insetos. Nestes insetos, a Asaia se comporta
como um simbionte secundário, sendo cultivável e transmitida verticalmente e
horizontalmente (CROTTI et al., 2009, p. 3253). Assim, constitui um microrganismo
interessante para ser empregado em estratégias de controle de insetos.
Fêmeas de mosquitos podem utilizar um mesmo recipiente para várias oviposições. É
provável que bactérias presentes nestes sítios sejam fatores atrativos para as mesmas. Uma
parte dessas bactérias pode corresponder à microbiota intestinal das fêmeas, sendo
depositadas nos sítios através de suas fezes. Isto vale para a bactéria Asaia sp. como
observado por Gusmão (2007, p. 132). A utilização de linhagens recombinantes de Asaia sp.
fluorescente em hibridização in situ do trato reprodutivo de fêmeas de Anopheles gambiae
mostraram uma concentração de Asaia na periferia de ovos, sugerindo que a transmissão de
Asaia da fêmea para prole é provavelmente mediada por um mecanismo que se baseia em
cobrir os ovos com a bactéria (DAMIANI et al., 2010, p. 645). Assim, o crescimento desses
microrganismos pode contribuir para o desenvolvimento de larvas de mosquitos. Ponnusamy
e colaboradores (2010, p. 171) verificaram que compostos voláteis obtidos de água onde
larvas se desenvolviam estimularam respostas em experimentos de eletroantenografia,
sugerindo que uma mistura de bactérias foi responsável pela produção de odores atrativos.
Ponnusamy e colaboradores (2010, p. 171) também isolaram bactérias da água onde larvas de
4º. instar cresceram. Isolados bacterianos variaram na capacidade de atrair fêmeas. Alguns
isolados exibiram atração significativa, enquanto outros exibiram atividade repelente. O
mesmo foi verificado em experimentos de Sardinha (2010, p. 37), que mostraram, além da
atividade atrativa de Asaia sp., o efeito repelente de Serratia sp. Isto sugere que a atratividade
de sítios de oviposição utilizados por fêmeas no campo seja resultado de uma interação entre
os microrganismos constituintes.
Gusmão (2007, 145) e Sardinha (2010, p. 37) já tinham observado em seus
experimentos o efeito atrativo de Asaia sp. Gusmão (2007, p. 121) utilizou um sistema
contendo duas gaiolas conectadas através de um túnel. Para as fêmeas havia duas
possibilidades de escolha de sítio de oviposição, um sítio com Asaia sp. e outro sem Asaia
sp., sendo verificados sempre mais ovos no sítio contendo Asaia sp. Sardinha (2010, p. 32)

46
utilizou também um sistema de gaiolas. Este sistema era constituído por seis gaiolas
conectadas a partir de uma gaiola central. Em cada uma das gaiolas havia uma espécie de
microrganismo e em uma delas havia apenas água. A gaiola contendo Asaia sp. sempre
apresentou maior número de ovos. Nos experimentos de Sardinha (2010, p. 37), a presença de
outras bactérias com ação repelente deve ter potencializado o efeito atrativo de Asaia sp.
Como afirmado por Trexler e colaboradores (2003, p. 847), os experimentos conduzidos em
copos de oviposição dentro de gaiolas pequenas, medem atração a curtas distâncias. Outras
metodologias devem ser empregadas para avaliar a atração a longas distâncias. Portanto, este
trabalho utilizou, além do teste em gaiola, sítios distribuídos no campo e em sala semi-campo.
A sala semi-campo imita o ambiente domiciliar ao qual o mosquito Ae. aegypti está adaptado,
assim como experimento de campo no campus do IFFluminense compreende um ambiente
peridomiciliar.
Neste trabalho foram utilizados três tipos de sítios de oviposição: contendo água,
contendo cultura de Asaia sp. e contendo apenas o meio BHI diluído. Na primeira rodada de
experimentos, sítios produzidos com garrafas PET foram testados. Na literatura é descrito que
fêmeas preferem ovipositar em lugares mais sombreados, diminuindo a sua vulnerabilidade
durante o processo, que pode levar vários minutos. Em se tratando de recipientes artificiais, os
que apresentam cores escuras e paredes rugosas são preferidos (BENTLEY; DAY, 1989, p.
406). Partindo disso, os sítios de PET foram substituídos por pequenos vasos de plástico
preto.
Os experimentos mostraram claramente que os sítios contendo meio BHI
(independente de terem ou não Asaia sp.) permitiram intenso crescimento microbiano. Apesar
do meio BHI ter sido diluído na mesma proporção da cultura de Asaia sp., microrganismos
contaminantes cresceram e provavelmente interferiram na escolha dos sítios pelas fêmeas. A
Asaia é uma bactéria de crescimento relativamente lento, tendo um tempo de duplicação de
aproximadamente 2h. Portanto, ela deve ser facilmente mascarada por uma bactéria de
crescimento mais rápido, a menos que fatores de seleção sejam usados. Meio de pH 3,5 tem
sido usado para isolar Asaia de plantas (YAMADA et al., 2000, p. 837). O néctar, que é um
meio natural de crescimento de Asaia tem pH 3,9. Portanto, meios ácidos permitem o
crescimento de Asaia e podem impedir o desenvolvimento de alguns microrganismos.
Gusmão e colaboradores (2007, p.921) verificaram que Asaia acidifica meio de cultura. A
presença de Asaia num sítio de oviposição deve limitar o crescimento de certos
microrganismos, o que não ocorreu nos sítios contendo apenas meio BHI diluído. Apesar da

47
possível interferência causada pelo crescimento de microrganismos contaminantes, todos os
experimento semi-campo mostraram um número maior de ovos em sítios contendo Asaia sp.
A taxa de contaminação nos sítios semi-campo deve ter sido menor que nos sítios gaiola-
campo e campo, pelos mesmos estarem em uma sala fechada.
Mosquitos como Ae. aegypti, vivem em ambientes caracterizados por uma
comunidade microbiana diversa. Esses microrganismos desempenham papéis-chave na
ciclagem de nutrientes e quebra de moléculas como celulose, quitina e lignina em compostos
menores que sejam mais facilmente assimilados. O catabolismo de detritos de folhas por
microrganismos produz metabólitos voláteis e não-voláteis que mediam o comportamento de
oviposição de fêmeas. A biomassa bacteriana e a composição de espécies têm sido sugeridas
como determinantes de ocorrência e abundância de mosquitos (PONNUSAMY et al., 2010, p.
158). Neste trabalho, alguns sítios mantidos entre plantas nos experimentos de campo,
apresentaram folhas em decomposição, o que modificou o aspecto da água. É provável que a
presença das folhas e os produtos de degradação das mesmas, tenham influenciado a escolha
de fêmeas de Ae. aegypti. Larvas de Ae. aegypti só foram encontradas no 3º. experimento, no
sítio contendo água do grupo de sítios mantidos na jardineira, na qual o sítio contendo Asaia
sp. foi derramado. Assim, bactérias Asaia sp. ficaram no solo, diminuindo a prevalência de
bactéria contaminantes junto a Asaia sp. Não se sabe se a presença de Asaia sp. no solo,
determinou a atração de fêmeas para este jardim, levando as mesmas a oviporem no sítio mais
próximo que não havia fatores repelentes (sendo escolhido o sítio contendo água e não aquele
contendo BHI). A influência de Asaia sp. não pode ser desconsiderada, pois a mesma possui
uma matriz extracelular de polissacarídeos que pode protegê-la contra várias condições
adversas (CROTTI et al., 2009, p. 3259). Portanto, é possível que a mesma se mantenha
viável mesmo estando no solo.
Quanto ao outro inseto não identificado encontrado nos sítios, a presença de
microrganismos e de folhas contou com fatores atrativos e estimulantes de oviposição, sendo
estes apenas encontrados em sítios com essas características. A presença de larvas destes
insetos nos sítios contendo meio e cultura de Asaia sp. mantidos em residência, sugere que o
mesmo seja abundante nesta região e dependa de microrganismos para o desenvolvimento
larval. Não se sabe se a presença das larvas desta espécie nos sítios constitui um fator
inibitório para fêmeas de Ae. aegypti. Além das larvas, outros insetos foram encontrados nos
sítios. A repetição dos experimentos no campo permitirá avaliar a influência de Asaia sp.

48
sobre outras espécies, além de mosquitos. A identificação dessas espécies permitirá a
compreensão mais ampla do significado de bactérias nos ciclos biológicos das mesmas.
Infusões feitas com várias espécies de gramíneas e de folhas de carvalho branco
Quercus alba têm sido usadas em armadilhas para monitorar a atividade de oviposição de
mosquitos no campo. Entretanto, a atratividade de infusões é alterada durante o período de
fermentação. Essas mudanças são causadas pela variação da atividade metabólica bacteriana
(PONNUSAMY et al., 2009, p. 159). Isto mostra como é complexa a avaliação dos resultados
de experimentos que envolvem infusões de folhas. Portanto, sugere-se que a avaliação do
efeito de um microrganismo deve ser feita com o mesmo o mais isolado possível inicialmente.
Posteriormente, pode-se investigar formas de potencializar o efeito atrativo/estimulador de
oviposição, que envolva testes com algumas espécies vegetais.
Os experimentos realizados com a gaiola-campo não mostraram uma prevalência de
ovos nos sítios contendo Asaia sp. Sítios contendo água ou apenas meio BHI alternaram na
contagem máxima de ovos. Das três metodologias testadas, esta foi a mais difícil de observar
atração por Asaia sp. O tamanho reduzido da gaiola permitia maior proximidade entre os
sítios, o que pode ter confundido as fêmeas. Pelo fato da gaiola estar no quintal de uma
residência, o acesso de microrganismos contaminantes deve ter sido facilitado. Portanto,
notou-se turbidez elevada nos sítios contendo Asaia sp. e meio BHI.
Nota-se que neste trabalho não foi utilizada análise estatística dos dados. Por serem
preliminares, apresentando variações que sugerem fragilidade na metodologia, optou-se por
apresenta-los sem desvio padrão e testes estatísticos.
Através de dados apresentados neste trabalho, fica claro a importância de se realizar
novas pesquisas com intuito de criar novas metodologias para melhor análise da influência de
bactérias simbiontes de mosquito Ae. aegypti no comportamento de seleção de sítios
oviposição e, assim, ajudar a traçar estratégias que objetivem o controle da população de
mosquitos.

49
CONCLUSÃO

O entendimento do comportamento de fêmeas de mosquitos na seleção de sítios de

oviposição pode servir de base para estratégias eficientes de controle desses vetores de
doenças. As bactérias têm papel importante na caracterização desses sítios, podendo torná-los
altamente atrativos. A Asaia sp. constitui uma bactéria interessante por ser um simbionte,
estando presente em mosquitos Ae. aegypti desde a fase de ovo. Dessa forma, espera-se que
sítios comumente escolhidos pelas fêmeas para oviposição seja naturalmente uma fonte de
Asaia sp.
Este trabalho apresentou dados preliminares da investigação de Asaia sp. como fator a
influenciar a seleção de sítios por fêmeas Ae. aegypti. As metodologias testadas foram
insuficientes para uma afirmação concreta do papel atrativo de Asaia sp. para sítios de
oviposição, sendo que apenas o ensaio semi-campo mostrou a influência positiva de Asaia sp.
Com base na análise dos dados pode-se concluir que a metodologia aplicada em ambiente
controlado, ensaio semi-campo, não se aplica a ambientes dinâmicos, ensaios gaiola-campo e
câmpus IFFluminense. Os sítios contendo nutrientes interferem na análise de dados, pois
permitem o crescimento de outros microrganismos e, em ambientes mais dinâmicos, a
possibilidade de contaminação elevada dos sítios é maior.
Novos ensaios envolvendo Asaia sp. utilizando outras metodologias mais adequadas
aos locais onde serão aplicadas permitirão maior compreensão do papel desta bactéria.

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