1UNIVERSIDAD DE SUCRE

FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS

PROGRAMA DE BIOLOGIA

BIOLOGIA MOLECULAR

INFORME DE LA PRACTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR No. 4

Almanza. Luisa1, Martinez. Andres1,Navarro. Laureano1, Ortega. Jorge1, Rodriguez. Vicente1

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA “PCR”

INTRODUCCION

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas
copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de ADN. Por lo general, el objetivo de la PCR es
producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera (Kary
Mullís, 1986). Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en
gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.

La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el
diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que
produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa
que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló
(Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor
actividad se presenta desde los 70 a 90°C. La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad
térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o
separar sus cadenas.

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 Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y nucleótidos (los
bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima,
y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.

Los pasos básicos son:

1. Desnaturalización (96 °C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN.
Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.

2. Templado (55 a 65°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias
complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.

3. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y
sintetice así nuevas cadenas de ADN.

El objetivo de la práctica fue describir las pautas y recomendaciones generales para la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Para la amplificación de un fragmento de la bacteria (E. Coli.), utilizando cebadores
específicos.[1]

PROCEDIMIENTO

 Se preparó un coctel con un volumen de 10µl por reacción, y donde cada una de estas contenía las
siguientes cantidades de reactivos.

1RX 7RX

1. Agua ultra pura 2.06 µl 14.42µl

2. Buffers PCR 10x 1µl 7 µl
3. dNTPs 2mM 1µl 7 µl
4. MgCl2 0,74µl 5.18µl
5. Cebador 1 FD2 2mM 1 µl 7 µl
6. Cebador 2 RP1 2mM 1 µl 7 µl
7. Taq. Polimerasa 5u/ul 0.2 µl 1.4µl
8. ADN 3 µl 2 µl

Todo esto adicionado en un tubo eppendorf de 0.2 ml como se muestra en la (figura 1).

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Figura 1. Coctel

 Desnaturalización inicial a 94°C 2min

Desnaturalización ---------------- -94°C 15seg

Alineación -------------------------- 52°C 1min

Extensión ---------------------------- 72°C 1min

Extensión final --------------------- 72°C 5min

Entre la desnaturalización, alineamiento y extensión a 30 ciclos, como se muestra en la (figura 2).en el Thermal
Cycler.

Fig.2. Thermal Cycler. BIO-RAD T100TM

 Se preparó 70 ml de Buffer TBE 1X y 20X a una concentración del 2%

 Se realizaron cálculos de cuanto se tenía que pesar de agarosa, volumen de los pozos y buffer TBE. Y se
procedió a pesar lo calculado en la balanza analítica (fig.3)
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 Fig. 3. Balanza analítica modelo fa224
 La agarosa ya pesada se mezcló con el buffer previamente preparado hasta estar totalmente disuelta en un
matraz de ermenleyer (fig. 4).

Figura 4. Adición de agarosa al buffer

 Luego la disolución fue puesta en una plancha de calentamiento y agitación magnética de marca: M57-
h550-5(fig. 5) a una temperatura de 250°C, en el que se le introdujo un magneto para homogenizar la
disolución (fig. 6)

Fig. 5. Plancha de calentamiento fig. 6. Magneto Y agitación (LBPRO)

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  A la mezcla se le agrego 3 µl de buffer de carga Orange (fig. 7 ), luego se depositó en la cámara de
electroforesis que quedo nivelada y tapada con cinta de enmascarar, hecho esto, se vertió la mezcla en ella
dejándola solidificar(fig. 8 )

Fig. 7. Buffer de carga Orange fig. 8. Adición del gel a la cámara de electroforesis

 Después con la muestra ya homogenizada se esperó a que la mezcla bajara su temperatura a 65°C con el
termómetro de la plancha de agitación magnética, una vez baja se agregó SYBER SAFE de marca
invitrogen (fig. 9)

Fig. 9. SYBER SAFE invitroven

 Se procedió a mezclar 8 µl de la muestra de ADN( que se tubo refrigerada en hielo), con 3 µl Orange G
(fig 9), que luego se tomaron 10 µl y sembraron las muestras en el gel que contenía la cámara de
electroforesis con la ayuda de micro pipetas de marca HAMILTON de 1-10 µl (fig. 10)

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Fig. 10. Mezcla del ADN + Orange G

 Se conectó a la cara de electroforesis a la fuente de poder y se esperó el tiempo de recorrido de la muestra

de ADN en el gel, por último, se llevó al trasiluminador para visualizarlo a la luz UV (fig.11).

RESULTADOS
 Se prepararon 70 ml de Buffer TBE 1X y 20X:
𝐶2∗𝑉2 1𝑋∗70𝑚𝑙
V1= = = 3,5 ml
𝐶1 20𝑋

 Determinación de la cantidad de agarosa para un gel de 70 ml al 2 %

𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑙𝑛 ∗ %P/V 70 𝑚𝑙 ∗ %2
Gr de soluto= =
100 100

Gr de soluto = 1.4 gramos de agarosa.

Volumen del pozo= 1.1cm* 0.5 cm *0.1cm

=0.055cm3 / 3 =0.018

Volumen del pozo= 0.018*1000= 0.18µl

Fig.11. Trasiluminador.

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 ANALISIS DE RESULTADOS

La PCR es una técnica que replica enzimáticamente al ADN que una pequeña cantidad de moléculas de ADN
(amplificadas selectivamente de manera exponencial (principales razones por las cuales la PCR es una
herramienta tan poderosa es su simplicidad y especificidad. Al igual que la replicación de ADN en un organismo,
la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las
cadenas existentes como molde. La PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de
ADN o separar sus cadenas. Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si
hay un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN.
En una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada, se determina por los cebadores. En
cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanca (la región
que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de
ADN solo en los extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad
de bases. De esta manera se determinó que para realizar la reacción en cadena de la polimerasa se toma un DNA
molde y el fundamento se basa en 3 pasos en base a las propiedades del DNA, pero fundamentalmente los pasos
comprenden: 1)Desnaturalización: La cual consiste en que se rompen los puentes de hidrógeno y se separan las
cadenas (por temperatura de 90-96°C) 2)Alineamiento: Es la temperatura necesaria para que el “primer” (pequeña
secuencia de oligonucleótidos que flanquean la región de interés y por complementariedad de DNA se pega a la
cadena que esta desnaturalizada) se alinee, renaturalice y se una a su molde para que se vuelvan a formar los
puentes de hidrógeno; el alineamiento es específico dependiendo de la secuencia del primer y la temperatura
depende de los puentes de hidrógeno (a mayores puentes de hidrógeno, mayor temperatura). 3)Extensión: La
polimerasa se activa, toma los nucleótidos y forma la nueva cadena, esto ya que la polimerasa solo reconoce
dobles cadenas y se posiciona en ellas para replicar DNA secuestrando DNTPs(oligonucleótidos o dinucleótidos
trifosfatos para formar nuevas cadenas MP) y forman la nueva cadena;

Para esto se requiere de un cofactor y con cantidad suficiente se activa la polimerasa, para esto se requiere de
una temperatura de extensión de 70.72°C (que es la temperatura necesaria para que la polimerasa lleve a cabo su
función) para que este activo el cofactor y estos pasos se realizan en un termociclador. Estos 3 pasos se generan
muchas veces hasta que se obtienen los resultados deseados para analizar posteriormente la muestra. Para detener
esta secuenciación se utilizan didesoxicitocinas trifosfatos y de esta manera ya no se puede polimerizar más. Para
leer las secuencias resultantes, estas se leen de abajo para arriba dependiendo de cómo se obtengan, es decir en
secuencias con sentido y antisentido(complementaria). [2]

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La electroforesis en gel de agarosa es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas
de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como
la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de
pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo
positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. [3]

CONCLUSION

Esta técnica sirve para amplificar ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más sencillo identificar con una
muy alta probabilidad virus y/o bacterias y hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos
derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el equipo necesario
para llevarla a cabo. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural del ADN polimerasas para replicar hebras
de ADN, usa ciclos de alta y baja temperatura para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada
fase de replicación y dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. En general la técnica
de PCR es básicamente una técnica de amplificación de DNA, por medio de una reacción in Vitro por medio de
un molde de DNA que se amplifica muchas veces. La cual sirve para el diagnóstico molecular, es decir, para saber
el estado de un gen y logra identificar las secuencias génicas,

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los diferentes tipos o variantes de la técnica de PCR y describa la diferencia o
modificación a la técnica inicial? • PCR anidada Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de
una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se
ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se pueden
unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. Este tipo de PCR
tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es
amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro
de la molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de
los cebadores. La desventaja de esta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.
detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de
amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación.
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 • PCR in situ La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones
fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco
y luego
• PCR múltiple PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan
dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en
cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: información
sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de
reactivos, rápida construcción de bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin
errores, se requiere de una cuidadosa optimización del proceso.
• RT-PCR Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer
una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La transcripción reversa genera
una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN complementario (ADNc o DNAc en inglés) el cual
es estable al calor y puede resistir la metodología PCR.
• Los pasos de la RT-PCR son: 1. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de ARN objetivo.
2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante la incorporación
de nucleótidos complementarios. 3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del ADNc
complementario al ARN. 4. PCR. El ARNm es copiado a ADNc (ADN complementario) por la
transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden también utilizar). En PCR en
tiempo real, se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina
el mRNA permitiendo que la segunda hebra de ADN sea formada. Se adiciona una mezcla de PCR que
incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primers específicos para el gen de
interés, los deoxinucleótidos y un buffer conveniente.
El ADNc se desnaturaliza a más de 90ºC (~94ºC), las dos hebras se separan. A 50 o 60ºC los primers
específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de unión a los primers deben
estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando
se usa el PCR en tiempo real. A 72°C la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4
cadenas de ADNc.
Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de ADNc, los productos de reacción son analizados usualmente por
electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de etidio. Los geles de agarosa para analizar

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 los productos de ADNc de la RT-PCR no nos permiten la cuantificación ya que el bromuro de etidio es
muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.
El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de ADN intercalándose entre los pares
de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Sin embargo, la
fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR green, que son mucho más
fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el P
CR en tiempo real. • PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN
presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN
específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting
temperature). Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas
basadas en sondas específicas. En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su
cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia
que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia
por reacción, pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más
económica que la que usa sondas específicas. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una
sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el
inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por
resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están
distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el
cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen. La mayoría de estos
inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que
elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el
momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación
del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de
amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN
formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación
(termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el
mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos",
es decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda
limitado a unos reactivos determinados. [4]
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 2. En la práctica, la pcr puede fallar por varias razones, pero normalmente es debido a su sensibilidad
a la contaminación, que a veces provoca la amplificación de ADN "falso". ¿qué técnicas o procesos
se han desarrollado para optimizar la PCR?
Se han desarrollado un gran número de técnicas y procesos para optimizar la PCR:
•La contaminación con ADNs extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen
las reacciones pre-PCR de los contaminantes potenciales del ADN. Esto normalmente implica la
separación espacial de las áreas de realización de la PCR de las de análisis o purificación de los productos
de PCR, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente.
•Las técnicas de diseño de primers son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y
en evitar la formación de productos falsos, y el uso de componentes alternativos para los buffers o las
enzimas polimerasas pueden ayudar en la amplificación de regiones de ADN largas o, de cualquier otra
forma, problemáticas. [5]
3. ¿En qué consiste la PCR en tiempo real (Q-PCR)?
La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo paso, al
correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de fluorescencia.
Posee características importantes como alta especificidad, amplio rango de detección (de 1 a 107
equivalentes genómicos de la secuencia blanco) y rapidez en la visualización del producto ya que no es
necesario realizar una electroforesis posterior. Los ensayos de la PCR en tiempo real son entre 10,000 y
100,000 veces más sensibles que las pruebas de protección por ARNasa,11,000 veces más sensibles que
la hibridación por Dot blot2 y pueden detectar diferencias de una sola copia del ADN. Durante la
amplificación por la PCR-TR, la sonda adicionada genera una señal de fluorescencia que refleja la
cantidad de producto amplificado. La cinética de amplificación por la PCR se puede dividir en cuatro
fases: 1) inicial o basal, 2) geométrica (conocida como logarítmica o exponencial), 3) lineal y 4) plateau
o estacionaria. [6]
4. ¿Cuáles son las principales aplicaciones en la actualidad de esta técnica y en que campos?
La PCR se ha convertido en una herramienta común utilizada en distintos campos de investigación tales
como, la industria, la agricultura, la medicina forense y la clínica, mismas que se han visto beneficiadas
por la sensibilidad, velocidad y especificidad de este método.
Investigación básica La determinación del nivel de expresión de los genes ha permitido asociar cambios
de ciertas moléculas en una diversidad de procesos fisiológicos como en la inflamación o para predecir
recurrencia del cáncer, Ayuda en la genotipificación de animales knock out, knock in y modelos
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 transgénicos, así como en la determinación de la eficacia del knock down. Diagnóstico molecular El
análisis por (RT) PCR en tiempo real puede realizarse a partir de una amplia variedad de muestras clínicas
como tejidos frescos y fijados en parafina, secreciones corporales, líquido cefalorraquídeo, sangre total,
plasma, leucocitos, material fecal, exudados de garganta, vaginales o anales, etc. Se pueden detectar
diversos microorganismos como virus y bacterias a nivel cualitativo (presencia o ausencia) y cuantitativo
(carga viral). Esta técnica se puede utilizar de guía en la elección del tratamiento apropiado, al determinar
mutaciones que confieren resistencia a medicamentos, como la rifampicina y la isoniazida, y a los
antivirales como ocurre en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1). Monitoreo de patógenos
En aguas residuales pueden detectarse bacterias como Escherichia coli O157 y otros organismos como
Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Straphylococcus
aureus, etc. También pueden detectarse patógenos en plantas y alimentos. Las leyes de control de
alimentos aceptan un nivel tolerable de contaminación por patógenos; por lo tanto, una cuantificación
precisa es muy importante para no sobrepasar los niveles máximos autorizados y para evitar la pérdida de
lotes marcados falsamente como contaminados. Monitoreo de OGM esta técnica se vinculará totalmente
en el diagnóstico de enfermedades, estudios epidemiológicos, estudios foren- 198 Herramientas
moleculares aplicadas en ecología ses, determinaciones de la calidad de agua y/o aire, alimentos, en los
estudios genéticos y, por supuesto, en la investigación básica. Al ser una herramienta poderosa para el
análisis de abundancia o presencia de los ADN específicos, es necesario contar con un diseño experimental
adecuado que optimice la generación de datos y análisis de los resultados, ya que por su sensibilidad es
una técnica que puede dar lugar a resultados erróneos y sobreestimaciones. [7]

BIBLIOGRAFIAS

[1] Kary B. Mullis — Nobel Laureate for procedure to replicate DNA». Proceedings (Mayo Clinic) 77 (7):
606. PMID 12108595. doi:10.4065/77.7.606.

[2] https://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%2
0ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20 AGAROSA.pdf

[3] https://es.scribd.com/doc/93418758/8Interpretacion-de-la-reaccion-en-cadenade-la-polimerasa

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[4-5-6-7] Aguilera, P., Tachiquín, M. R., Graciela, M., Munive, R., & Olvera, B. P. (2014). PCR en tiempo real.
Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y

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