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Producción de acetil-CoA
En los organismos aeróbicos, la glucosa y otros azucares, los ácidos grasos y la mayor parte
de los aminoácidos se oxidan finalmente a CO 2 y H2O a través del ciclo del ácido cítrico y la cadena
respiratoria. Antes de entrar a dicho ciclo, los esqueletos carbonados deben ser degradados al grupo
acetilo del acetil-CoA, la forma en que el ciclo del ácido cítrico acepta la mayor parte del combustible
aportado.
La reacción global catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa es una
descarboxilación oxidativa, un proceso de oxidación irreversible en el que el piruvato pierde un
grupo carboxilo en forma de CO2 y los dos carbonos restantes se transforman en el grupo acetilo del
acetil-CoA. El NADH formado en esta reacción libera un ion hidruro a la cadena respiratoria, que
transporta los dos electrones hasta el oxígeno o, en los microorganismos anaeróbicos, hasta un
aceptor de electrones alternativo tal como el nitrato o el sulfato. La transferencia de electrones
desde el NADH hasta el oxígeno genera en última instancia 2,5 moléculas de ATP por cada par de
electrones.
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Piruvato deshidrogenasa
La deshidrogenación y descarboxilación combinadas del piruvato para formar el grupo acetilo
del acetil-CoA requiere la acción secuencial de tres enzimas diferentes, así como de cinco coenzimas
o grupos prostéticos diferentes: tiamina pirofosfato (TPP), flavina adenina dinucleótido (FAD),
coenzima A (CoA), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y lipoato.
La coenzima A contiene un grupo tiol reactivo (–SH), de importancia fundamental dentro de
su papel como transportador de grupos acilo en diversas reacciones metabólicas. Los grupos acilo se
unen covalentemente al grupo tiol, formando tioésteres, los cuales tienen un elevado potencial de
transferencia de grupos acilo que les permite ceder estos grupos a diversas moléculas aceptoras.
Puede considerarse que el grupo acilo unido a la coenzima A, esta “activado” para la transferencia
de grupo.
El quinto cofactor de la PDH, el lipoato, tiene dos grupos tiol que pueden experimentar una
oxidación reversible hasta formar un
enlace disulfuro, similar al que se
produce entre dos residuos Cys en
proteínas. Gracias a esta capacidad de
experimentar reacciones de
oxidación-reducción, el lipoato puede
actuar a la vez como transportador de
electrones y de acilos.
El complejo de la PDH está
formado por copias múltiples de tres
enzimas: piruvato deshidrogenasa
(E1), dihidrolipoil transacetilasa (E2) y
dihidrolipoil deshidrogenasa (E3). El
número de copias de cada enzima, y
por lo tanto el tamaño del complejo,
varia de un organismo a otro. El
complejo de la PDH aislado a partir de
mamíferos tiene un diámetro de
aproximadamente 50 nm, más de
cinco veces el tamaño de un ribosoma
y suficientemente grande para
visualizarse a través del microscopio
electrónico. En la enzima bovino hay
60 copias idénticas de E2 que forman
un decaedro pentagonal con un
diámetro de unos 25 nm. E2 es el
punto de conexión del grupo
prostético lipoato, unido a través de
un enlace amida al grupo ε-amino de
un residuo Lys. E2 tiene tres dominios
funcionalmente distintos: el dominio
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lipoilo amino-terminal, que contiene el residuo lipoiol-Lys; el dominio de unión a E1 y E3 central, y el
dominio aciltransferasa del núcleo interior, que contiene el sitio activo de la acetiltransferasa. El
complejo PDH de levadura tiene un único dominio lipoilo con un lipoato unido, pero el complejo de
mamíferos tiene dos y el de E.coli tiene tres. Los dominios de E2 están separados por conectores,
secuencias de 20 a 30 residuos aminoácidos, ricos en Ala y Pro y entremezclados con residuos
cargados.
El sitio activo de E1 contiene TPP unido y el de E3 contiene FAD unido. Existen además dos
proteínas reguladoras, una proteína quinasa y una fosfoproteína fosfatasa, que también forman
parte del complejo.
Las reacciones de descarboxilación y deshidrogenación del piruvato llevadas a cabo por la
piruvato deshidrogenasa son:
1) El C-1 del piruvato se elimina en forma de CO 2, y el C-2 que en el piruvato se encuentra en el
estado de oxidación correspondiente a un aldehído, se une al TPP en forma de grupo
hidroxietilo. Este paso es el más lento por lo que limita la velocidad de la reacción global.
2) El grupo hidroxietilo se oxida para dar lugar a un ácido carboxílico (acetato). Los dos
electrones eliminados en esta reacción de oxidación reducen el –S–S– de un grupo lipoilo en
E2 para dar lugar a dos grupos tiol (–SH).
3) La porción acetilo producida en la reacción anterior se esterifica en primer lugar con uno de
los grupos –SH del lipoilo, y a continuación se transesterifica con el CoA para dar acetil-CoA.
4) y 5) Las reacciones de estos pasos son transferencias electrónicas necesarias para la
regeneración de la forma oxidada (disulfuro) del grupo lipoilo de E 2, preparando así el complejo
enzimático para otro ciclo oxidativo. Los electrones extraídos del grupo hidroxietilo procedente
del piruvato pasan a través del FAD al NAD.
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Los brazos basculantes lipoil-lisilo de E2 desempeñan un papel central en el mecanismo del
complejo de la PDH al aceptar de E1 los dos electrones y el grupo acetilo procedentes del piruvato y
pasarlos a E3. Todas estas enzimas y coenzimas se encuentran agrupadas, lo que permite a los
intermedios reaccionar rápidamente sin difundir fuera de la superficie del complejo enzimático. La
secuencia de estas cinco reacciones es un ejemplo de canalización de sustratos. Los intermedios de
la secuencia de varios pasos nunca abandonan el complejo, con lo que la concentración local del
sustrato de E2 se mantiene siempre muy alta.
El carbono metílico del grupo acetilo se une al grupo carbonílico (C-2) del oxalacetato. El citril-CoA es
un intermediario transitorio que se forma en el sitio activo de la enzima y que se hidroliza
rápidamente a CoA y citrato libres, que a continuación abandonan el sitio activo. La hidrolisis de este
intermediario tioéster de elevada energía hace que la reacción directa sea muy exergónica. El CoA
liberado en esta reacción se recicla para participar en la descarboxilación oxidativa de otra molécula
de piruvato a cargo del complejo de la PDH.
2) Formación de isocitrato vía cis-aconitato. La enzima aconitasa cataliza la transformación
reversible del citrato en isocitrato a través de la formación intermedia del ácido tricarboxílico
cis-aconitato. La aconitasa puede promover la adición reversible de H 2O al doble enlace del
cis-aconitato unido a la enzima mediante dos vías diferentes, de las que una conduce al citrato
y la otra a isocitrato. La aconitasa contiene un centro ferro-sulfurado, que actúa tanto en la
fijación del sustrato en el sitio activo como en la adición o eliminación catalíticas de H 2O.
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3) Oxidación del isocitrato a α-cetoglutarato y CO2. La isocitrato deshidrogenasa cataliza la
descarboxilación oxidativa del isocitrato, dando lugar a la formación de α-cetoglutarato. El
Mn2+ del sitio activo interacciona con el grupo carbonilo del intermedio oxalsuccinato que se
forma fugazmente sin dejar el sitio de unión hasta que la descarboxilación lo convierte en α-
cetoglutarato.
Hay dos formas diferentes de isocitrato deshidrogenasa en todas las células, una de
las cuales requiere NAD como aceptor de electrones, mientras que la otra requiere NADP.
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5) Conversión de succinil-CoA en succinato. El succinil-CoA, al igual que el acetil-CoA, tiene un
enlace tioéster con una energía libre estándar de hidrolisis altamente negativa. La energía
liberada en la rotura de este enlace se utiliza para promover la síntesis de un enlace
fosfoanhídrido del GTP o del ATP. En el proceso se forma succinato:
La enzima que cataliza esta reacción reversible se conoce como succinil-CoA sintetasa.
Esta reacción conservadora de energía presenta un paso intermedio en el que la misma
molécula de enzima queda fosforilada en un residuo de His en el sitio activo. Este grupo
fosforilo, que posee un elevado potencial de transferencia de grupo, es transferido al ADP (o
bien GDP) para formar ATP (o GTP).
La formación de ATP (o GTP) a expensas de la energía liberada por la descarboxilación
oxidativa del α-cetoglutarato es una fosforilación a nivel de sustrato. El GTP formado por la
succinil-CoA sintetasa puede donar su grupo fosfato terminal al ADP para formar ATP, en una
reacción reversible catalizada por la nucleósido difosfato quinasa:
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6) Oxidación del succinato a fumarato. El succinato formado a partir de succinil-CoA se oxida a
fumarato por la flavoproteína succinato deshidrogenasa:
7) Hidratación del fumarato a malato. La hidratación reversible del fumarato a malato esta
catalizada por la fumarasa. El estado de transición en esta reacción es un carboanión:
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8) Oxidación del malato a oxalacetato. En la última reacción del ciclo del ácido cítrico, la malato
deshidrogenasa ligada a NAD cataliza la oxidación del malato a oxalacetato:
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En organismos aeróbicos, el ciclo del ácido cítrico es una ruta anfibólica, sirve tanto para
procesos anabólicos como catabólicos. Aparte de su papel en el catabolismo oxidativo de glúcidos,
ácidos grasos y aminoácidos, el ciclo proporciona precursores para muchas vías biosintéticas, a través
de reacciones que cumplían el mismo propósito en nuestros antepasados anaeróbicos. El α-
cetoglutarato y el oxalacetato pueden servir como precursores de los aminoácidos aspartato y
glutamato por simple transaminación. A través del aspartato y el glutamato, los átomos de carbono
del oxalacetato y del α-cetoglutarato se utilizan para sintetizar otros aminoácidos así como
nucleótidos de purina y pirimidina. El oxalacetato se convierte en glucosa mediante la
gluconeogénesis. El succinil-CoA es un intermediario central en la síntesis del anillo de porfirina de
los grupos hemo, que actúan como transportadores de oxígeno (en la hemoglobina y mioglobina) y
de transportadores de electrones (en los citocromos). El citrato producido por algunos organismos
se utiliza comercialmente para una multitud de usos.
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Reacciones anapleróticas
A medida que los intermediarios del ciclo del ácido cítrico son retirados para servir como
precursores biosintéticos, son repuestos mediante reacciones anapleróticas.
La reacción anaplerótica más importante en hígado y riñón de mamíferos es la carboxilación
reversible del piruvato por el CO2 para formar oxalacetato, catalizada por la piruvato carboxilasa.
Cuando el ciclo del ácido cítrico carece de oxalacetato o de algún otro intermediario, se carboxila
piruvato para producir más oxalacetato. La adición enzimática de un grupo carboxilo al piruvato
requiere energía, que es aportada por el ATP.
La piruvato carboxilasa es una enzima reguladora y se encuentra prácticamente inactiva en
ausencia de acetil-CoA, su modulador alostérico positivo. Siempre que el acetil-CoA está presente en
exceso, se estimula la reacción de la piruvato carboxilasa para producir más oxalacetato, lo que
permite que el ciclo utilice más acetil-CoA en la reacción de la citrato sintasa.
Las otras reacciones anapleróticas están también reguladas para mantener el nivel de
intermediarios suficientemente elevado como para sostener la actividad del ciclo. La
fosfoenolpiruvato carboxilasa, es activada por el intermediario glucolítico fructosa 1,6-bifosfato, que
se acumula cuando el ciclo opera demasiado lentamente para poder procesar el piruvato generado
en la glucólisis.
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Biotina
La reacción de la piruvato carboxilasa requiere la presencia de la vitamina biotina, que actúa
como grupo prostético de la enzima. Es un transportador especializado de grupos monocarbonados
en su forma mas oxidada: CO2. Los grupos carboxilo son activados en una reacción que consume ATP
y une CO2 a la biotina ligada a la enzima. Este CO2 “activado” se transfiere entonces a un aceptor (en
este caso piruvato) en una reacción de carboxilación.
La piruvato carboxilasa se compone de cuatro subunidades idénticas, cada una de las cuales
contiene una molécula de biotina unida covalentemente a través de un enlace amida al grupo ε-
amino de un residuo específico Lys en el sitio activo de la enzima. La carboxilación del piruvato tiene
lugar en dos pasos: primero, un grupo carboxilo procedente del HCO 3- se une a la biotina y a
continuación el grupo carboxilo se transfiere al piruvato para formar oxalacetato. Estos dos pasos
tienen lugar en sitios activos diferentes; el brazo largo y flexible de la biotina transfiere grupos
carboxilo activados desde el primer sitio activo al segundo, actuando de modo muy similar al del largo
brazo lipoil-lisina en E2 en el complejo de la PDH y al largo brazo de la porción tipo CoA de la proteína
portadora de acilos que interviene en la síntesis de ácidos grasos.
La biotina es una vitamina necesaria en la dieta humana; es abundante en muchos alimentos
y es sintetizada por bacterias intestinales. La carencia de biotina es rara, pero puede aparecer a veces
cuando se consumen grandes cantidades de huevos crudos.
El complejo de la PDH de mamíferos es fuertemente inhibido por el ATP, así como por el acetil-
CoA y el NADH. La inhibición alostérica de la oxidación del piruvato se incrementa cuando se hallan
disponibles ácidos grasos de cadena larga, AMP, CoA y NAD, los cuales se acumulan cuando fluye
poco acetil-CoA hacia el ciclo del ácido cítrico, activando alostéricamente el complejo de la PDH.
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Esta actividad
enzimática es anulada
cuando se dispone de una
gran cantidad de
combustible en forma de
ácidos grasos y de acetil-
CoA y cuando las razones
[ATP]/[ADP] y
[NADH]/[NAD] de la célula
son elevadas, y es activada
cuando las demandas
energéticas son grandes y
las células necesitan un
flujo mayor de acetil-CoA
hacia el ciclo.
En mamíferos, estos
mecanismos de regulación
alostérica se
complementan por un
segundo nivel de
regulación: la modificación
covalente de proteínas. El
complejo de la PDH es
inhibido mediante la
fosforilación reversible de
un residuo Ser específico
en una de las dos
subunidades de E1. Además
de las enzimas E1, E2 y E3, el complejo de la PDH de mamíferos contiene dos proteínas reguladoras,
cuyo único propósito es el de regular la actividad del complejo. Una proteína quinasa especifica
fosforila y de este modo inactiva E1, y una fosfoproteína fosfatasa específica elimina el grupo fosforilo
por hidrolisis y así activa E1. La quinasa es activada alostéricamente por ATP: cuando la [ATP] es
elevada, el complejo de la PDH es inactivado por fosforilación de E1. Cuando la [ATP] desciende, la
actividad de la quinasa disminuye y la acción de la fosfatasa elimina los grupos fosforilo de E1
activando el complejo.
El complejo de la PDH de plantas, localizado en la matriz mitocondrial y en los plástidos, es
inhibido por sus productos NADH y acetil-CoA. La enzima mitocondrial de plantas también está
regulada por fosforilación reversible; el piruvato inhibe la quinasa, activando así el complejo de la
PDH, y el NH4+ la estimula, lo que causa la inhibición del complejo.
Cada una de las tres etapas altamente exergónicas en el ciclo, las catalizadas por la citrato
sintasa, la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa, puede llegar a ser la etapa
limitante de la velocidad bajo determinadas circunstancias. La disponibilidad de los sustratos para la
citrato sintasa varía con el estado metabólico de la célula y limita en ocasiones la velocidad de
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formación de citrato. El NADH, un producto de la oxidación del isocitrato y el α-cetoglutarato, se
acumula bajo ciertas condiciones, y a elevada [NADH]/[NAD] ambas reacciones de deshidrogenación
resultan inhibidas por la acción de masas. Dentro de la célula la reacción de la malato deshidrogenasa
esta esencialmente en equilibrio, y cuando [NADH]/[NAD] es alta, la concentración de oxalacetato es
baja, lo que enlentece el primer paso del ciclo. La acumulación de productos inhibe los tres pasos
limitantes del ciclo: el succinil-CoA inhibe la α-cetoglutarato deshidrogenasa; el citrato bloquea la
citrato sintasa, y el producto final, ATP, inhibe tanto la citrato sintasa, como la isocitrato
deshidrogenasa. La inhibición de la citrato sintasa por parte del ATP es mitigada por el ADP, un
activador alostérico de esta enzima.
En condiciones normales, la velocidad de la glucólisis y del ciclo del ácido cítrico están
integradas de manera que solo se metaboliza a piruvato la glucosa necesaria para suministrar al ciclo
del ácido cítrico su combustible, los grupos acetilo del acetil-CoA. Piruvato, lactato y acetil-CoA se
mantienen a concentraciones de estado estacionario.
Sistemas de lanzadera
Una función de la cadena respiratoria es regenerar NAD para su uso en la glucólisis, pero el
NADH no puede introducirse en las mitocondrias para oxidarse mediante la cadena transportadora
de electrones por que la membrana mitocondrial interna es impermeable tanto al NAD como al
NADH. La solución consiste en que sean los electrones del NADH, y no el propio NADH, quienes
atraviesen la membrana mitocondrial. Una de las diversas maneras de conducir los electrones del
NADH hacia el interior de la mitocondria es mediante un sistema de lanzaderas.
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aspartato se desamina y origina oxalacetato, con lo que el ciclo comienza de nuevo.
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Ciclo del glioxilato
En plantas, ciertos invertebrados y algunos microorganismos, el acetato puede servir como
combustible altamente energético y también como fuente de fosfoenolpiruvato para la síntesis de
glúcidos. En estos organismos, enzimas del ciclo del glioxilato catalizan la conversión neta de acetato
en succinato o en otro intermediario de cuatro átomos de carbono del ciclo del ácido cítrico:
En el ciclo del glioxilato, el acetil-CoA se condensa con el oxalacetato para formar citrato y el citrato
se convierte en isocitrato, exactamente igual que en el ciclo del ácido cítrico. El siguiente paso, sin
embargo, no consiste en la degradación del isocitrato por la isocitrato deshidrogenasa, sino en la
rotura de isocitrato por la isocitrato liasa, formando succinato y glioxilato.
El glioxilato se condensa entonces con una segunda molécula de acetil-CoA para dar malato
en una reacción catalizada por la malato sintasa. El malato se oxida posteriormente a oxalacetato, el
cual puede condensarse con otra molécula de acetil-CoA para empezar otra vuelta del ciclo. Cada
vuelta del ciclo del glioxilato
consume dos moléculas de acetil-
CoA y produce una molécula de
succinato, disponible para fines
biosintéticos. El succinato puede
convertirse a través del fumarato
y malato en oxalacetato, el cual
puede convertirse en
fosfoenolpiruvato por la PEP
carboxiquinasa, y así hasta
glucosa por la gluconeogénesis.
Los vertebrados no poseen las
enzimas específicas del ciclo del
glioxilato y, por lo tanto, no
pueden sintetizar glucosa a partir
de lípidos.
En las plantas, las enzimas
del ciclo del glioxilato se
encuentran secuestradas en
orgánulos denominados
glioxisomas, que son peroxisomas
especializados. Éstos no están
presentes en todos los tejidos de
las plantas siempre. Se
desarrollan en semillas ricas en
lípidos durante la germinación,
antes de que las plantas en
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desarrollo adquieran la capacidad de sintetizar glucosa por la fotosíntesis.
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