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Consejo Editorial
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QFB Joaquín López
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QFB Alfredo Salazar
Subdirector de Tecnología Farmacéutica
Lic. Antonio Velez Palomar
Comisario
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

La Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas está indizada a

International Pharmaceutical Abstracts, Chemical Abstracts, EMBASE de Excerpta Medica, Latindex

La Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas es el órgano oficial de la Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
Se publica trimestralmente y se distribuye en forma gratuita en México y Latinoamérica.

Los conceptos que en ella aparecen son responsabilidad exclusiva de sus autores. Toda correspondencia deberá enviarse a:
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La reproducción parcial o total del contenido de este número podrá hacerse previa aprobación del editor y mención de la revista.

Tiraje: 2,500 ejemplares: Publicación Trimestral. Dirección General de Derechos del Autor Nº 3028-102.
Certificación de Licitud de Título y Contenido Nº 3222 y 2852 respectivamente. ISSN: 1870-0195

Exp. 1/431”87”/5153 del 8 de febrero de 1988.

Fecha de impresión: Marzo 2005

2
 Contenido
EDITORIAL 04

TRABAJOS CIENTÍFICOS

Actividad antimicrobiana de ácidos grasos aislados de Tubifex tubifex 05

Antimicrobial activity of fatty acids isolated from Tubifex tubifex
Rosa Martha Pérez Gutiérrez

Evaluación toxicológica de productos naturales usando microtécnicas 11

Toxicological evaluation of natural products using microtechnics
Kazuko Aoki M., Rosalba Encarnación-Dimayuga, Alma Rosa Cortés A.

Formación, evaluación y caracterización del complejo de inclusión

piroxicam/hidroxipropil-b-ciclodextrina. 18
Preparation and characterization of inclusion complex piroxicam/hydroxypropyl-b-cyclodextrin
Beatriz Espinosa F., Gabriel Hernández J.

Influencia de los parámetros químico físicos en el diseño de formulación de cremas

de Budesonida al 0.025%. 25
Chemical and physical parameters influence on the formulation design of Budesonida 0.025% creams.
Adriana Muñoz C, Odalys Fernández V, Leopoldo Núñez de la F,
Eylín Jorge A, Janelis Suárez G, Raisa Vega M, Laritza Rodríguez M.

Validación de un método analítico espectrofotométrico para la cuantificación

de metabolitos estables de óxido nítrico en fluidos biológicos. 31
Validation of a spectrophotometric analytical method for quantifying stable
metabolites of nitric oxide in biological fluids.
Fermín A. Tenorio L, Leonardo del Valle M, Gustavo Pastelín H

SECCIONES

¿Qué sabe usted acerca de...Genómica? 42

¿What do you know about...Genomics?

Libros 45
Books

3
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

Editorial

En la actualidad los grandes organismos están conformados por equipos de trabajo multidisciplinarios, en
donde hemos podido observar el desarrollo efectivo de una planeación organizacional, para cumplir con los
objetivos y metas planteadas. El tener personas de diferentes áreas, nos lleva a una visión más amplia de los retos
a vencer, así como también a conservar una línea de acción real y una mejora continua de las actividades.

En este sentido en AFM estamos iniciando una etapa con la consigna de encaminar nuestras labores a una
excelencia operacional de las tareas encomendadas, con el fin de dar cumplimiento al objetivo principal de
nuestra institución: “Promover la superación de los profesionales y estudiantes relacionados con las ciencias
farmacéuticas para contribuir al progreso científico y técnico de las mismas y representar los intereses comunes
de sus asociados, que impacten positivamente en el ámbito de la salud de la población”.

Así mismo queremos retomar y tener como fin común los valores y las acciones que por más de 38 años han
prevalecido en los estatutos de esta asociación, regidos por la ética, la honorabilidad y la transparencia; de esta
manera integramos un equipo confiable para los intereses de la misma, permitiendo así el buen desempeño
de las actividades de este organismo.

Sabemos que estamos enfrentando nuevos retos, lo cual nos compromete con nuestros agremiados a tener una
constante comunicación ágil, flexible y confiable, para detectar las áreas de oportunidad de nuestras tareas, de
esta manera estaremos dispuestos a ofrecer productos y servicios de calidad a la comunidad farmacéutica.

Lic. Juan Antonio Elizarrarás Briseño

Gerente General
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.

4
Trabajo Científico

Actividad antimicrobiana
de ácidos grasos aislados de Tubifex tubifex
Antimicrobial activity of fatty acids isolated from Tubifex tubifex
Rosa Martha Pérez Gutiérrez
Laboratorio de Investigación de Productos Naturales
Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas, IPN.

RESUMEN: a partir del extracto de cloroformo del Tubifex tubifex se aislaron los ácidos grasos linolénico, laúrico, margárico y
esteárico los cuales se identificaron por medio de un análisis de cromatografía de gases (CG). Estos compuestos presentan
actividad antimicrobiana sobre las bacterias Gram-positivos Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Bacillus cereus y las Gram-
negativos: Escherichia coli y Kliebsiella pneumoniae. Para la determinación del efecto antibacteriano se empleó el método de
difusión de disco. También se determinó la actividad mínima inhibitoria de cada compuesto (CIM) la cual se encuentra en el
intervalo de 1.34 a 4.21 mg/mL.

ABSTRACT: the fatty acids linolenic, lauric, margaric and stearic were isolated of chloroform extract from Tubifex tubifex, which
were identified by gas-chromatography analysis (GC). These compounds showed antimicrobial activity against Gram-positive
bacteria Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus and Gram-negative Escherichia coli and Kliebsiella pneumoniae.
Disc diffusion assay was used for antibacterial activity. Was also determined the minimal inhibitory concentration (MIC) of
each compound, the values are in the range of 1.34 to 4.21 mg/mL.

Palabras claves: Tubifex tubifex, ácidos grasos, ácidos linolénico, Key words: Tubifex tubifex, fatty acids, linolenic, lauric, margaric
laúrico, margárico y esteárico and stearic acids

Introducción
Correspondencia:
Tubifex tubifex (Muller) pertenece a la familia Oligochaete,
Dra. Rosa Martha Pérez Gutiérrez
es comúnmente conocido como “tubi”. Este animal tiene un
Punto Fijo No. 16, Col. Torres de Lindavista
grosor de alrededor de un milímetro, la longitud es variable, su
C.P. 07708 México, D.F.
cuerpo está dividido en subunidades denominadas metámeros.
E mail: rmpg@prodigy.net.mx
Una característica fundamental de la clase Oliquetos es la au-
sencia de cabeza lo cual se observa en el T. tubifex ya que ésta
se encuentra como una pequeña estructura con una boca como
órgano principal que constituye el inicio del tubo digestivo. Se
Fecha de recepción: 22 de octubre de 2003
encuentra en aguas dulces contaminadas con baja oxigenación
Fecha de aceptación: 01 de octubre de 2004
donde existe materia orgánica en descomposición, viven parcial-

5
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
mente enterrados en el fango manteniendo una pequeña porción
de la parte superior de su cuerpo en el exterior en contacto con
el agua ondeándose continuamente para facilitar el intercambio
gaseoso en la superficie de su cuerpo ya que carecen de branquias,
manteniendo entre cada individuo una separación entre uno o dos
milímetros, de forma que en la superficie se observan manchas
rojizas lo que indica una colonia de Tubifex.1
Este organismo es usado como alimento de peces y pájaros.
También se ha utilizado ampliamente como indicador biológico
de la contaminación del agua por metales pesados, herbicidas,
insecticidas e hidrocarburos.2,3 Se ha empleado en los ensayos de
evaluación de la toxicidad de varias substancias tales como alca-
loides, saponinas etc. 4 No se ha estudiado el contenido químico
de este organismo así como tampoco se han hecho evaluaciones
sobre sus posibles efectos. Debido a que este organismo vive en
aguas con alto grado de contaminación microbiana consideramos
interesante efectuar un estudio sobre la presencia de substancias
con actividad antibacteriana. En el presente trabajo se reporta la
actividad antimicrobiana producida por los ácidos grasos aislados
del T. tubifex.
Material y Métodos
Material biológico
Especimenes de Tubifex tubifex (Tubificidae) se recolectaron en el
Centro de Investigaciones Biológicas Acuícolas (CIBAC) en Xochi-
milco, taxonómicamente fue identificado por la Doctora Guadalupe
Figueroa del Departamento del Hombre y su Ambiente de la Univer-
sidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Un ejemplar se guardó
como referencia en el Departamento (núm. 4956). Inmediatamente
después de la colecta los organismos se vaciaron sobre cloroformo
para evitar su descomposición.
Organismos
Las bacterias Gram-positivos empleados en este estudio son:
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Bacillus cereus y las
Gram-negativos: Escherichia coli y Kliebsiella pneumoniae. Los
microorganismos fueron proporcionados por el Departamento
de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas,
IPN y por el Departamento del Hombre y su Ambiente
de la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Todos
los medios de cultivo se adquirieron en disco.
Preparación de los cultivos de microorganismos
Todas las bacterias utilizadas en este estudio se incubaron a
30± 0.1 ˚C durante 24 h en un medio estéril Triptico Soya
Broth (TSB). Para la determinación del efecto antibacteriano
6
se empleó el método de difusión de disco,5 para lo cual se
tomaron 0.1 mL de una dilución 1 en 100 del cultivo de cada
bacteria (equivalente a 106-107 células/mL) colocándose
en una serie de cavidades de 8 mm de diámetro, (platos de
Mueller-Hinton).5 En cada una de ellas se adicionaron 0.2 mL
de una solución de 50 mg/mL de cada fracción y 5 mg/mL de
cada compuesto aislado disuelto en cloroformo. Las placas
se incubaron a 37 ˚C durante 24 h, al finalizar este periodo se
midieron los diámetros de las zonas de inhibición alrededor
de cada disco.6 Se usó como control negativo CHCl3 y como
positivo el antibiótico neomicina (1.28 µg/disco). En cada
caso se determinó la actividad mínima inhibitoria de cada
compuesto (CIM) aislado.
Concentración mínima inhibitoria
La CIM (concentración mínima inhibitoria) de cada una de las
substancias aisladas del T. tubifex se determinó por el método
de dilución de agar. 7, 8, 9 Alrededor de 105 células, se inocularon
en cada tubo posteriormente se añadieron los ácidos grasos en
una concentración de 1.0 a 4.5 mg/mL. Los cultivos fueron
incubados durante 24 h a 37˚C, sobre un agitador rotatorio,
posteriormente el crecimiento bacteriano se examinó espec-
trofotométricamente. El tubo que no presentó turbidez o sea
que se produce un crecimiento no visible fue tomada como la
CIM de la sustancia para el microorganismo utilizado. Cada
experimento se realizó por duplicado.10, 11
Extracción y aislamiento de los ácidos orgánicos
Se maceraron 10 kg de material fresco durante 15 días con
cloroformo (20 L). Posteriormente se filtró y las dos fases
(acuosa-cloroformo), se separaron por medio de un embudo
de separación. El disolvente se secó con Na2SO4 anhidro y se
destiló en un rotavapor al vacío quedando un residuo viscoso
de color amarillo oscuro (rendimiento 3.2%) el cual se some-
tió a cromatografía en columna empleando sílica gel (Merck,
malla 230-400) como soporte y una mezcla de CH2Cl2-OAcEt
2:1 v/v como eluyente con lo cual se obtuvieron siete frac-
ciones. Todas las fracciones obtenidas se probaron sobre los
microorganismos previamente mencionados. Las fracciones
2 y 5 que presentaron actividad antibacteriana se mezclaron
y cromatografiaron nuevamente de manera similar, eluidas
con CHCl3-hexano 10:1 v/v produciendo 5 subfracciones de
las cuales las activas 1 y 3 se volvieron a cromatografiar con
CHCl3-acetona-éter de petróleo 3:0.5:4 v/v y acetona-hexano
1.5-10 v/v respectivamente. Finalmente las fracciones que
presentaron efecto antibacterial se pasaron por una columna
de sephadex LH-20 obteniendo 4 compuestos oleosos A1,
A2, A3 y A4 a los cuales se determinó pureza por medio de
cromatografía en placa fina.
Identificación de los ácidos grasos
El análisis de cromatografía de gases (CG) se llevó a cabo en
un aparato Hewlett Packard GC model 5890. Se empleó una
columna capilar DB1 (30 m X 0.32 mm); el programa de la
temperatura de la columna fue de 80˚C durante 5 min, después
se incrementó por 8˚C/min hasta 150˚C manteniéndose du-
rante 3 min, posteriormente se elevó por 2˚C/min hasta 280˚C
permaneciendo por 10 min. La temperatura del inyector
y el detector se mantuvieron a 290˚C. La identidad de los
compuestos estudiados se confirmó usando substancias puras
como estándar.
Resultados y Discusión

Tabla1. Actividad antibacteriana del extracto de cloroformo del Tubifex tubifex

Microorganismos Diametro de la zona de inhibición (mm)

Bacillus subtilis 11
(B) NCTC 8542
Bacillus cereus 13
(B) ATCC 17689
Escherichia coli 12
(B) ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae 17
(A) ATCC 14786
Staphylococcus aureus 15
(B) NCTC 8531
Salmonella typhi 10
(B) ATCC 13310

(A) Departamento de Microbiología de la Escuela Superior de Ciencias Biológicas, IPN. (B) Departamento del Hombre
y su Ambiente de la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco.

El extracto de cloroformo del T. tubifex posee actividad antimi-
crobiana
sobre las siguientes especies de bacterias Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Kliebsiella
pneumoniae y Salmonella Typhi. Las zonas de inhibición obteni-
das se presentan en la Tabla 1. El extracto (150 mg/mL) presentó
una actividad alta (10-17 mm, zonas de inhibición) por lo que con
base en estos resultados el extracto de cloroformo del T. tubifex
fue fraccionado por medio de diversas técnicas de cromatografía ácido linolénico
lo que condujo al aislamiento de cuatro compuestos con acti-
vidad antibacteriana. El análisis de cromatografía de gases del
extracto de cloroformo se presenta en la Fig. 2. Las fracciones
2 y 5 que presentaron actividad antibacteriana se mezclaron y
se sometieron nuevamente a un análisis de cromatografía de
gases (Fig. 3). La caracterización de cada uno de los compuestos
aislados del extracto de cloroformo del T. tubifex se llevó a cabo ácido laúrico ácido margárico
por medio de un análisis por cromatografía de gases empleando
substancias puras como estándares. Los ácidos grasos aislados
(Fig 1) se identificaron como: ácidos linolénico, laúrico, mar-
gárico y esteárico. En la Fig. 4 se muestra el cromatograma
de gases de los compuestos aislados con sus correspondientes ácido esteárico
tiempos de retención.
Los ácidos grasos presentan actividad antimicrobiana en el
método de difusión de disco sobre las bacterias Gram-positivo
Fig.1. Estructura de los ácidos grasos aislados a partir
de Tubifex tubifex

7
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

Figura 2. Cromatograma de gases del extracto de cloroformo del Tubifex tubifex

Figura 3. Cromatograma de gases de la mezcla de las fracciones (F2 y F5) con actividad antimicrobiana

8
 Figura 4. Cromatograma de gases de los compuestos aislados. (1) pertenece al ácido lin (2) ácido laúrico, (3) al
ácido margárico y (4) al ácido esteárico con sus correspondientes tiempos de retención
y Gram negativo probadas. Posteriormente se les determinó la seguido por el ácido linolénico. Los valores obtenidos en este
concentración mínima inhibitoria. Los valores CIM del ácido estudio son semejantes a los reportados previamente12. La neo-
linolénico se encuentran entre 1.50 a 3.40 mg/mL, para el tromicina se empleó como testigo positivo en todos los casos y
ácido laúrico entre 1.70 a 3.89 mg/mL, el ácido margárico la concentración mínima inhibitoria (CIM) se determinó para
presentó valores de 2.12 a 4.21 mg/mL. Los datos obtenidos cada microorganismo (Tabla 2). El compuesto más activo fue
para el ácido esteárico fueron del rango de 1.34 - 2.99 mg/mL. el ácido esteárico seguido del ácido linolénico. El ácido mar-
Los resultados de la actividad antimicrobiana se presentan en la gárico fue el menos activo de los cuatro compuestos probados.
Tabla 2. El compuesto más activo contra los microorganismos Los ácidos aislados resultaron menos activos que la neomicina
Gram positivo y Gram negativo probados fue el ácido esteárico usada como testigo.13

Tabla 2. Actividad antibacteriana de los ácidos linoléico(1), laúrico(2), margárico(3) y esteárico(4)

Microorganismos MIC(mg/mL) (µg/mL)

1 2 3 4 neomicina

Bacillus subtilis 3.18 3.01 2.18 1.34 2.8

(B) NCTC 8542
Bacillus cereus 3.31 2.47 2.87 1.60 3.2 .
(B) ATCC 17689
Escherichia coli 3.18 1.70 2.12 1.79 2.1
(B) ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae 3.15 3.89 3.42 1.54 9.8
(A) ATCC 14786
Staphylococcus aureus 1.54 2.31 4.21 2.76 5.3
(B) NCTC 8531
Salmonella typhi 3.40 3.02 3.98 2.99 4.6
(B) ATCC 13310

(A) Departamento de Microbiología de la Escuela Superior de Ciencias Biológicas, IPN. (B) Departamento del Hombre
y su Ambiente de la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco.

9
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Conclusión
Los datos obtenidos en este estudio conducen a la conclusión
que los ácidos grasos contenidos en el Tubifex tubifex, son los
responsables del efecto antibacteriano sobre un amplio rango
de microorganismos. El compuesto más activo contra algunos
microorganismos Gram positivo y Gram negativo fue el ácido
esteárico. El Tubifex tubifex, vive en aguas dulces contaminadas
con baja oxigenación donde existe una gran cantidad de micro-
organismos, por lo que la presencia de estos ácidos orgánicos lo
pueden ayudar en la defensa a la contaminación microbiana
del medio ambiente.
Referencias Bibliográficas
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editorial Interamericana, pp. 578-579.
2. Elzbieta D. y Casimires P. 1978. The effect of physico-
chemical properties of water and bottom sediments in the
River Nida. Poland, the distribution and number of Oligo-
chaeta. Acta Hidrobiology, 20: 215-232.
3. Ammon H.U. 1985. Worm toxicity test using Tubifex
tubifex. Colloq. INRA, 31: 307-317.
4. Ajar A.L., Stina T. y Joergen M. 1980. Determination
of acute toxicity by the Tubifex method. Pharmaceutica Acta
Helvetiae, 55: 187-188.
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activity of Securingea leucopyros. Fitoterapia, 72: 930-933.
10
6. Bradshaw, L. J. 1992. Laboratory of microbiology, 4th ed.
USA Daunders Publishing, USA, 410-413.
7. Buttiaux R., Beerens H. y Tacquet A. 1969. Manuel de
techniques bacteriologiques. Medicales Flammarion, Paris,
pp. 269-274.
8. Reeves R.S., Phillips, I. y Williams J. D. 1978. Laboratory
methods in antimicrobial chemotherapy, Longman Ltd. Edin-
burgh, pp. 20-22.
9. Twij H.A.A., Salih F.M., Nadir M.T. y Aziz N. K.
1986. Antimicrobial and some pharmacological activity
of Centaurea phyllocephala and C. Behen. Fitoterapia,
LVII: 41-45.
10. Sadik G., Islam R., Rahman M.M., Khondkar P.,
Rashid M.A. y Sarker S.D. 2003. Antimicrobial and
cytotoxic constituents of Loranthus globosus. Fitoterapia,
74: 308-311.
11.- Woldemichael G.M., Wachter G., Singh M. P.,
Maiese W.M. y Timmermann B.N. 2003. Antibacterial
diterpenes from Calceolaria pinifolia. Journal of Natural
Products. 66: 242-246.
12. McGraw L.J., Pager A.K. y Van Staden J. 2002. Iso-
lation of antibacterial fatty acids from Schotia brachypetala.
Fitoterapia, 73: 431-433.
13. Hazme F.A., y Saleh M.M. 1999. Antimicrobial
components of some Cruciferae plants (Diplotaxis harra
Forsk. and Escaria microcarpa Boiss). Phytotherapy Research,
13: 329-332.
Trabajo científico

Evaluación toxicológica
de productos naturales usando microtécnicas
Toxicological evaluation of natural products using microtechnics
Kazuko Aoki M.1, Rosalba Encarnación-Dimayuga2, Alma Rosa Cortés A1.
1
Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana- Xochimilco
2
Departamento de Agronomía, Universidad Autónoma de Baja California Sur

RESUMEN: dado que la toxicidad de las plantas medicinales usadas en la medicina tradicional necesita ser estudiada, se deter-
minaron los efectos tóxicos de diferentes extractos obtenidos de cuatro productos naturales de Baja California Sur (México):
Lepechinia hastata (Lamiaceae), Haplopappus sonorensis (Asteraceae), Lophocereus schottii (Cactaceae) y un animal marino
Lophogorgia rigida (Gorgonaceae), por medio de microtécnicas, usando 2 microorganismos invertebrados: Daphnia magna
(crustáceo) y Panagrellus redivivus (nemátodo). Los resultados se compararon con la toxicidad determinada en ratones CFW,
concluyendo que los micro-bioensayos pueden servir para explorar el grado de afectación o toxicidad de las muestras, o como
una prueba adicional a las realizadas con los métodos clásicos, ya que los resultados analizados muestran que existe cierto
grado de correlación entre la toxicidad determinada usando microtécnicas con respecto a la determinada en ratones CFW.

ABSTRACT: considering that the toxicity of many medicinal plants used in the traditional medicine needs to be studied in a
cheap and quick way, the toxic effect of different extracts from four natural products from Baja California Sur (Mexico): Le-
pechinia hastata (Lamiaceae), Haplopappus sonorensis (Asteraceae), Lophocereus schottii (Cactaceae) and the marine animal
Lophogorgia rigida (Gorgonaceae) were tested by two microtechnics bioassay using two microorganisms, the crustacean
Daphnia magna and the nematode Panagrellus redivivus, which toxicity were compared with in CFW mouse. These bioassays
help in prescreening studies and as additional test, seeing that it perceives some correlation of the toxic effect obtained using
invertebrates and mammals.

Palabras clave: Microtécnicas, evaluación toxicológica, Daphnia Key words: Microtechnics, toxicological evaluation, Daphnia magna,
magna, Panagrellus redivivus, ratones, extractos orgánicos, productos Panagrellus redivivus, mice, organic extracts, natural products.
naturales.

Introducción
Correspondencia:
Durante siglos, los humanos nos hemos auxiliado de la natu-
Alma Rosa Cortés A.
raleza para satisfacer las necesidades básicas como: vestimenta,
Departamento de Sistemas Biológicos,
uso de fertilizantes, condimentos, fragancias, alimentación y
Universidad Autónoma Metropolitana- Xochimilco,
medicamentos. Las plantas han constituido la base para el de-
Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud,
sarrollo de la medicina tradicional aplicada desde hace miles de
CP 04960, México, D.F.
años en países como México.
Teléfono: 5483-7213 Fax: 54837237
Correo electrónico: cortesar@cueyatl.uam.mx
El uso de plantas y de ciertos animales marinos en la práctica
popular para la cura de enfermedades en Baja California Sur ha
sido extensamente documentada y publicada en el año1992 por
Fecha de recepción: 16 de diciembre de 2003
Encarnación1, y han jugado un papel importante en el Sistema
Fecha de aceptación: 27 de junio de 2004
de Atención de la Salud. Recientemente, su uso ha ido incre-

11
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
mentándose tanto en los países en proceso de desarrollo como
en aquellos desarrollados, por lo que ha surgido el interés y la
urgencia por determinar tanto su eficacia real como su seguridad
e inocuidad cuando son aplicados en la medicina tradicional de
diferentes comunidades, por lo tanto, es importante llevar a cabo
el estudio toxicológico de estos recursos.
Estudios publicados en décadas recientes, sugieren que un
primer rastreo toxicológico pudiera llevarse a cabo con pruebas
de toxicidad agudas empleando invertebrados2, lo cual puede ser
útil como un estudio preliminar en la evaluación de la toxicidad
de nuevos y diferentes químicos en mamíferos. La mayor ven-
taja de aplicar estos bioensayos prelimares está relacionada con
la reducción del número de mamíferos que normalmente son
requeridos en la determinación de la toxicidad aguda empleando
ratas o ratones, además de ser, por lo mismo, económico.
Por lo tanto, con base en lo antes expuesto es recomendable
considerar el uso de invertebrados como Daphnia magna2-5 y
micro-lombrices como Panagrellus redivivus 6, 7 en pruebas preli-
minares de toxicidad para posteriormente realizar los bioensayos
finales de toxicidad con un número menor de mamíferos.
El uso de estos micrométodos toxicológicos con invertebrados
representaría una reducción significativa en costo, tiempo, espacio
y número de mamíferos como se mencionó anteriormente, por
lo tanto, debería de implementarse también para propósitos de
regulación de medicamentos.
Considerando que en algunos estados de la República Mexi-
cana, como Baja California Sur (B.C.S.), se siguen utilizando
tanto plantas como ciertos organismos marinos en la medicina
tradicional, nos propusimos en este trabajo evaluar la toxicidad de
algunas plantas medicinales: Haplopappus sonorensis, Lepechinia
hastata, Lophocereus schottii y un organismo marino Lophogorgia
rigida utilizando el crustáceo Daphnia magna, el nemátodo Pa-
nagrellus rigida y ratones CFW.
Las especies anteriores fueron seleccionadas debido a que
son plantas popularmente empleadas en la medicina tradicional
de B.C.S.,1 que al someterse a pruebas de selección para evaluar
su efecto farmacológico, mostraron actividad antimicrobiana y
citotóxica,8-11 por lo que es necesario determinar sus rangos de
toxicidad para poder dar una mejor orientación sobre su empleo.
Además, de ampliar el estudio de estos recursos que ha aportado
interesantes resultados tanto farmacológicos como fitoquímicos
publicados recientemente.
H. sonorensis es una planta medicinal cuyo té preparado
con sus ramas hervida en agua, es tomado para la fiebre, es-
pasmo, escalofríos, postemillas, tos, gripa y de la cual se han
reportado la presencia de varias flavonas con actividad anti-
micobacteriana;8, 9 L. hastata, es utilizada popularmente como
12
remedio contra infecciones vaginales (no urinarias) contiene
como compuesto mayoritarios carnosol, b-hidroxi-carnosol y
metabolitos de estructura diterpenoide con una potente activi-
dad antimicrobiana,10-12 además de ácido ursólico cuya actividad
antiinflamatoria ha sido reportada;13 L. schottii, conocida como
senita o garambullo es empleado comúnmente para la diabetes,
úlceras, llagas, malestares estomacales1 y fue seleccionada por
contener compuestos bioactivos como una tetrahidroisoquinolina
denominada lofocina que presenta actividad anticancerígena;14-16
y el coral marino L. rigida, fuente de una potente neurotoxina,
la lofotoxina, que tiene la propiedad de bloquear la trasmisión
neuromuscular.17, 18
Material y métodos
Plantas
Se utilizaron 3 plantas medicinales de uso popular o común en la
medicina tradicional de Baja California Sur: Haplopappus sonorensis
(Asteraceae), Lepechinia hastata (Lamiaceae) y Lophocereus schottii
(Cactaceae). H. sonorensis fue colectada en Cabo Pulmo, B.C.S., L.
hastata en la Sierra de la Laguna, B.C.S. y L. schottii en La Ventana,
B.C.S. Las plantas fueron clasificadas e identificadas por el M.
en C. Jorge Agúndez Espinosa del Laboratorio Fanerogámico de
la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS) y sus
respectivas muestras de referencia se encuentran depositadas en
el Herbario Nacional del Instituto de Biología de la UNAM y en
el Herbario Fanerogámico de la UABCS.
Animales
El coral blando Lophogorgia rigida (Gorgonaceae) fue colectado
en Cabo Pulmo, B.C.S. e identificado por Martín Sánchez del
Departamento de Biología Marina de la misma Universidad, de
acuerdo a Verril.18, 19
Su muestra de referencia se encuentra depositado en el La-
boratorio de Farmacognosia del Departamento de Agronomía,
UABCS, México.
Preparación de los extractos
Dirigido hacia la búsqueda de los extractos conteniendo
diferentes componentes, se realizó la extracción de las
plantas con disolventes de distinta polaridad, comenzando
las extracciones sucesivas con éter de petróleo que además
de ser un solvente que ayuda a desgrasar y extraer algunos
compuestos de naturaleza lipídica, favorece el que en las
subsecuentes extracciones, con cloruro de metileno, etanol
o cloroformo, se facilite la obtención de compuestos de
diferente naturaleza.
 La planta H. sonorensis (46T) fue sometida a extracción exhaus-
tiva con éter de petróleo, CH2Cl2 y EtOH en un aparato Soxhlet,
los extractos se identificaron como 46TF etéreo (Hs1), CH2Cl2
(Hs2) y EtOH (Hs3) respectivamente. El extracto crudo de esta
planta, designado como 46TE EtOH (Hs4) se obtuvo macerando
10 gramos de material seco con 100 mL x 2 de EtOH.
L. hastata (65T) también fue exhaustivamente extraída en
Soxhlet con éter de petróleo (Lh1), CHCl3 (Lh2) y EtOH (Lh3),
se filtraron y los solventes se evaporaron a presión reducida, obte-
niéndose los respectivos extractos denominados 65TF. L. schottii
(443T), fue extraída por maceración con EtOH (10 g/100mLx2
y el extracto crudo obtenido se identificó como 443T EtOH
(Ls1) y finalmente, L. rigida (WF991) fue sometida a extracción
sucesiva por maceración con CH2Cl2 y EtOH, dando los extractos
respectivos: WF991F CH2Cl2 (Lr1) y WF991F EtOH (Lr2),
los cuales se concentraron posteriormente en rotavapor a 40 °C,
obteniéndose el material libre de solvente.
Animales de experimentación
y evaluación toxicológica
El crustáceo, Daphnia magna se usó como organismo de prue-
ba para investigar la toxicidad aguda. El medio de incubación
utilizado para estos experimentos fue agua reconstituida con
una dureza de 160 mg/L a 180 mg/L de CaCO3, pH entre 7.5
a 8.5, temperatura 20 °C ± 2 °C, fotoperiodo 16 horas luz - 8
horas oscuridad, a una concentración de oxígeno mayor
de 3 mg/L 2, 5, 20. Todos los animales usados para esta serie de
experimentos fueron neonatos de hasta 24 horas de nacidos, los
cuales se incubaron usando 5 diferentes diluciones de los extrac-
tos, 6.25, 12.5, 25, 50 y 100% de la concentración seleccionada
para cada muestra según su actividad. Se calcularon los valores
de CL50 a las 24 y 48 horas.
El otro animal de experimentación utilizado para este estudio
fue un nemátodo silvestre, Panagrellus redivivus, cultivado en el
laboratorio en condiciones estándares sobre un medio de harina
de trigo y mantenido en placas de petri en medio M9-Y, alimen-
tados cada 4-5 días con una suspensión de levadura.
Los extractos probados se disolvieron previamente en una
cantidad mínima de dimetilsulfóxido y posteriormente en el
medio M9-Y (1:100).
Para las pruebas de toxicidad se seleccionaron los nemáto-
dos en la segunda etapa juvenil ( J2) en el medio M9-Y. Para la
evaluación del efecto letal, los animales se dejaron crecer en un
medio conteniendo 250 µg de extracto/mL, durante 96 horas a
22 °C, después de la cual se cuantificó el número de sobrevivien-
tes en cada caso. Para el efecto subletal, se contó el número de
nemátodos que se mantuvieron en las etapas segunda y tercera
juvenil ( J2 o J3) del crecimiento.
El porcentaje de animales que alcanzó la etapa adulta (ma-
duración) y los que se mantuvieron en las diferentes etapas del
crecimiento, se determinaron por medición al microscopio, de la
longitud de los sobrevivientes6, 7 y se clasificaron por el tamaño
de los nemátodos en cada población experimental.
Ratones
Para los estudios toxicológicos preliminares en mamíferos se
usaron ratones, cepa CFW, hembras de 20 a 25 gramos de peso
corporal que fueron mantenidos en condiciones ambientales con-
troladas a 18-22 °C con ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas y
5 cambios de aire por hora, alimentadas con dieta balanceada es-
tándar Lab Diet 5P14 para roedor (Purina México S.A. de C.V.)
y agua ad libitum. Se formaron 10 grupos de 9 ratones cada uno,
3 animales de cada grupo recibieron, por vía oral, dosis de 500,
793 y 1000 mg/kg de los extractos disueltos en agua conteniendo
10% de dimetilsulfóxido (DMSO), en un volumen de 200 µL y
se mantuvieron en observación durante 7 días, durante los cuales
se registraron diariamente su aspecto físico, comportamiento y
número de muertes. Los animales testigo recibieron únicamente
la misma cantidad del vehículo.21 Estas pruebas se llevaron a cabo
por duplicado y en algunos casos por triplicado.
Los animales fueron proporcionados por el bioterio local.
Los procedimientos para el manejo y sacrificio de los animales
cumplieron con los requisitos establecidos en la norma oficial
NOM-062-ZOO-1999.
Análisis estadístico
Los resultados de mortalidad de D. magna, están expresados
en términos de la concentración letal media, que mata el 50%
de los organismos (DL50), dichas concentraciones se calcularon
mediante regresión logística en el programa SPSS v. 10.0.
El grado de afectación a los ratones se expresa con la mediana
de una escala subjetiva gradual de 0 a 10, donde el 0 representa
no-alteración y el 10 alteraciones notorias como la depresión
severa y la muerte.
La asociación de los resultados en roedores e invertebrados se
realizó mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Se
consideraron como significativos valores de p menores a 0.05.
Resultados y discusión
Como se muestra en la tabla 1, el extracto etanólico de L. scottii
(Ls1) fue el más nocivo para Daphnia magna, con un valor de
CL50= 9.1(µ/mL a las 48 horas, seguida por los extractos de éter
de petróleo de H. sonorensis (Hs1) con una CL50= 33.9 (µg/mL
13
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

y de L. hastata (Lh1) con una CL50= 78.7 (µg/mL a las 48
horas. Sin embargo, según el rango de toxicidad en D. magna
publicada en el año 2000 por Guilhermino y col.2, ninguno
de los extractos probados en este estudio puede considerarse
tóxico, ya que los valores de CL50 obtenidos, se encuentran
muy por encima de los considerados tóxicos, por ejemplo: la
concentración letal (CL50) obtenida para L. scottii usando D.
magna (que fue el más afectado) es comparable a los valores
reportados por dichos autores para fenol (CL50= 9.1 (µg/mL)
y ácido acético (CL50= 10.8 (µg/mL), mientras que para sus-
tancias consideradas realmente tóxicas como el paratión, la
CL50 es de 0.0022 µg/mL.

Tabla 1. Toxicidad de los extractos en Daphnia magna

Muestra CL50 (µg/mL) a las 24 horas CL50 (µg/mL) a las 48 horas

H. sonorensis (Hs1) 167.5 33.9*

H. sonorensis (Hs2)+ 242.6 103.2
H. sonorensis (Hs3)+ --- 602.7*

H. sonorensis (Hs4)+ 600.9 98.1

L. hastata (Lh1) 178.3 78.7*

L. hastata (Lh2) --- 169.0*

L. hastata (Lh3) --- ------
L. schottii (Ls1) 342.9 9.1

L. rigida (Lr1) --- 585.0*

L. rigida (Lr2) --- 112.0*
n = 60 ó +30 por dosis
--- sin efecto a dosis de hasta 1000 µg/mL
* correlación significativa con el grado de afectación de ratones

En la tabla 2 se muestran los resultados de los efectos tóxicos del nemátodo en un 16% en estado juvenil J2 y con el que sobrevi-
de los extractos probados sobre el nemátodo Panagrellus redivi- vieron únicamente el 56%. Finalmente, la fracción clorofórmica
vus. En esta prueba, los extractos más nocivos resultaron ser: el de L. hastata (Lh2) inhibió la maduración de un 28% de nemá-
extracto etanólico de L. rigida (Lr2) que inhibió la maduración todos juveniles y permitió una sobrevivencia del 97%.

Tabla 2. Toxicidad de los estractos en Panagrellus redivivus, a concentración única de 250 µg/mL

Muestra Maduración (%) Sobrevivencia (%)

H. sonorensis (Hs1) 81.2 98

H. sonorensis (Hs2) 75.8* 100
H. sonorensis (Hs3) 80.9* 100

H. sonorensis (Hs4) 75.0* 100

L. hastata (Lh1)++ 60.2 97

L. hastata (Lh2)+ 28.1* 97

L. hastata (Lh3) 48.2* 96
L. schottii (Ls1) 96.0 100

L. rigida (Lr1) 94.7* 100

L. rigida (Lr2) 16.4* 56
n = 100, +200, ++300
* correlación significativa con el grado de afectación de ratones

14
 Respecto al estudio en ratones, algunos de los extractos
probados a las dosis administradas de 500 y 793 mg/kg, fueron
ligeramente nocivos, ya que, en las primeras 24 y 48 horas de
administrados los siguientes extractos: éter de petróleo de H.
sonorensis (Hs1), éter de petróleo y de cloroformo de L. hastata
(Lh1 y Lh2) y los extractos etanólicos de L. scottii y L. rigida
(Ls1 y Lr2, respectivamente), les causaron una severa depresión
de la cual llegaron a recuperarse completamente al final del
experimento. Sin embargo, a la dosis máxima probada de 1000
mg/kg de peso corporal, se murieron algunos animales, en un
porcentaje máximo del 20%. Debido a que no fue posible admi-
nistrar dosis mayores por la baja solubilidad de los extractos, no
se determinaron los valores de DL50 y el grado de afectación de
los ratones se midió subjetivamente en una escala gradual de 0
a 10; donde el aumento en la escala representa un aumento en
el daño físico observado en los animales, incluyendo la muerte
de los que recibieron la dosis máxima (figura 1).
Figura 1. Grado subjetivo de afectación (usando una escala
de 0 al 10) que sufren los ratones por administración oral de
las diferentes muestras estudiadas. Los resultados muestran
la respuesta global de las tres dosis empleadas para cada
extracto en al menos 18 animales.
Al comparar los resultados mostrados en las tablas 1 y 2 con
el grado de afectación observado en los ratones (Figura 1), se ve
que las muestras que fueron nocivas para los invertebrados: Ls1,
Hs1 y Lh1 para Daphnia magna y Lr2 y Lh2 para Panagrellus
redivivus, resultaron ser los mismos que afectaron en mayor
grado a los mamíferos. Se encontró que existe una correlación
significativa en algunas de las muestras, las marcadas con asterisco
en las tablas 1 y 2, con lo observado en los ratones; el coeficiente
de correlación de Spearman fue de -0.82 (p = 0.023) y de -0.73
(p = 0.031) para D. magna y P. redivivus, respectivamente. La
correlación mostrada con sólo algunas de las muestras concuerda
con varias publicaciones que reportan la asociación únicamente
para grupos específicos de compuestos.2, 22
Por otro lado, para P. redivivus, el extracto etanólico de L. rigida
(Lr2) fue la muestra que mostró mayor efecto sobre su creci-
miento y sobrevivencia como puede observarse en la tabla 2.
Los resultados obtenidos con este nemátodo sugieren que tanto
la inhibición de su crecimiento como su mortalidad pueden
deberse a efectos sobre su material genético, como lo demues-
tran Samailoff y col.,6, 7 lo que apoya el uso de esta técnica para
identificar mutágenos y realizar ensayos posteriores específicos
al respecto.
Finalmente, se puede advertir la necesidad por parte de los
investigadores de encontrar métodos más baratos, simples y rá-
pidos para la evaluación farmacológica y toxicológica de nuevos
fármacos y compuestos químicos23-27 así como de productos
naturales de uso medicinal.28-30
Conclusiones
El uso de animales invertebrados para la determinación preli-
minar de la toxicidad tanto de los extractos de fuentes naturales
como de productos sintéticos, ofrece varias ventajas:
Se ha demostrado que se reduce significativamente el costo,
tiempo y espacio requerido para la experimentación.
En varios casos existe una correlación significativa entre las
pruebas toxicológicas en invertebrados y en mamíferos.
Lo anterior, debería de tomarse como un signo indicador de
un posible efecto en mamíferos que hay que considerar para rea-
lizar un estudio toxicológico completo, aumentando dosis, tiempo
de exposición, experimentos con administración múltiple, etc.
Además, la utilización de diferentes animales invertebrados
para los estudios toxicológicos, puede ayudar a dilucidar posibles
mecanismos de acción, como lo observado con P. redivivus, que
parece afectar el material genético, en cuyo caso, se podrían pla-
near experimentos para evaluar efectos teratogénicos.
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Agradecimientos
Los autores agradecen a CONACyT-SIMAC (Ref. 20000-
29. García-Mateos R., Soto H.M, Martínez y V.M. 2000.
106006) por el apoyo brindado para la realización de esta inves-
Toxicidad de los extractos de las semillas de Erithryna ame-
tigación, a las Biol. Sara Ramírez, Isabel Romero e I.B.Q. Jesús
ricana. Ciencia Ergosum, 7:133-137.
Iván Murillo por la asistencia técnica.

17
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

Trabajo Científico

Formación, evaluación y caracterización

del complejo de inclusión
piroxicam/hidroxipropil-b-ciclodextrina
Preparation and characterization of inclusion complex
piroxicam/hydroxypropyl-b-cyclodextrin
Beatriz Espinosa F., Gabriel Hernández J.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM.

RESUMEN: se preparó y caracterizó el complejo de inclusión piroxicam-hidroxipropil-b-ciclodextrina, para incrementar la

solubilidad del piroxicam.
Se utilizaron los métodos de coprecipitado, amasado y mezcla física, para formar el complejo, en proporciones 1:1, 1:2 y 1:3 de
ciclodextrina e hidroxipropil-b-ciclodextrina. Se caracterizaron las materias primas y los complejos con técnicas analíticas de
calorimetría diferencial de barrido, espectrofotometría de absorción ultravioleta e infrarrojo. Se evaluó el diagrama de solubi-
lidad de fase del piroxicam y del complejo por el método de Higuchi y Connors.
El mejor método por el cuál se formó el complejo de inclusión fue el de mezcla física en proporción 1:3, donde la mayor parte
del piroxicam se incluyó dentro de la molécula de la hidroxipropil-b-ciclodextrina, demostrándose con los diferentes métodos de
análisis propuestos, principalmente por el de calorimetría diferencial de barrido, donde la endoterma del piroxicam disminuyó
en un 94.81%. A pesar de no incluirse totalmente el fármaco en la ciclodextrina se incrementó la solubilidad del piroxicam por
lo menos en un 59.65%, ya que no se llegó a saturar la solución en la cantidad final utilizada de 60 mg adicionados.

ABSTRACT: the inclusion complex of piroxicam-hydroxypropyl-b-cyclodextrin was prepared and characterized to increase the
solubility of piroxicam.
Three methods were used to prepare the inclusion complex: co-precipitation, kneading and the physical mixing, with 1:1, 1:2
and 1:3 proportions of piroxicam -hydroxypropyl-b-cyclodextrin. The raw materials and the complexes were characterized by
analytic technics like infrared spectroscopy, differential scanning calorimetry and ultraviolet spectroscopy. The phase-solubility
of piroxicam and the complex were evaluated by the Higuchi and Connors’ method.
The complex piroxicam-hydroxypropyl-b-cyclodextrin was prepared by the method of the solid state in mixture proportions 1:3.
Where most of the piroxicam was included inside the hydroxypropyl-b-cyclodextrin molecule, this was shown by analytic tech-
nics and the best method was differential scanning calorimetry where the endothermic peak of piroxicam decrease in 94.81%.
The solubility was increased at least 59.65%, due that 60 mg added the concentration of saturation was not reached.

Palabras claves: ciclodextrina, hidroxipropil--b-ciclodextrina, Key words: cyclodextrin, hydroxypropyl-b-cyclodextrin,

piroxicam, complejos de inclusión. piroxicam, inclusion complex.

Correspondencia: Fecha de recepción: 18 de noviembre de 2003

M. en C. Beatriz Espinosa Franco Fecha de aceptación: 12 de octubre de 2004
Calle 39 No. 132 Col. Ignacio Zaragoza C.P. 15000
Tel: 57-84-86-53
E-mail: beatrize@avantel.net

18
Introducción
Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos formados por 6,
7 y 8 unidades de D-glucosa unidos a través de enlaces gluco-
sídicos a-1-4, llamadas a, b y g ciclodextrinas respectivamente
recientemente se han reconocido como excipientes de uso far-
macéutico. Su estructura molecular en el exterior es hidrofílica
y relativamente lipofílica en la cavidad interior y de acuerdo a
estas características son capaces de formar complejos de inclu-
sión por medio de enlaces no covalentes los cuales estabilizan a
una gran variedad de moléculas en medios tanto líquidos como
sólidos, principalmente la b- ciclodextrina, en cuya cavidad puede
incluirse una parte o la molécula completa.1,2,3,4,5
La b- ciclodextrina presenta una solubilidad de 1.85 g/100mL
y un alto grado de toxicidad, por tal motivo se restringe su uso
para la vía parenteral. La hidroxipropil-b-ciclodextrina (HP-
b-CD) se obtiene por hidroxilación de la b-ciclodextrina, cuya
sustitución puede darse en las posiciones 1, 2 o 3 (Fig. 1), su
solubilidad es mayor de 500 mg/mL en agua a temperatura
ambiente, y no es tóxica después de una administración oral en
dosis menores a 500 mg/kg por vía intravenosa.6,7
Figura 1. Estructura química de la
hidroxipropil-b-ciclodextrina
Las ciclodextrinas se utilizan para enmascarar olores y sabores
desagradables, disminuir la incompatibilidad fármaco-excipiente,
mejorar la estabilidad física y química de compuestos volátiles
y de principios activos que sean hidrolizables, oxidables o fo-
tosensibles; para convertir fármacos líquidos en sólidos para su
formulación en tabletas y una muy importante para incrementar
la solubilidad en agua y la velocidad de disolución de fármacos
poco solubles, lo que aumentará la biodisponibilidad, existiendo
la posibilidad de reducir la dosis; así como mejorar la absorción
percutánea y rectal al reducirse el carácter hidrofóbico del fár-
maco.7-10
Los antiinflamatorios no esteroidales, son el grupo de medi-
camentos que más se han estudiado al respecto como: naproxén,
ibuprofén, ketoprofén, flurbiprofén, los cuales mostraron una
mayor velocidad de disolución y una mayor biodisponibilidad
cuando se evaluó en animales tales como conejos y perros. 9
El piroxicam es un analgésico antiinflamatorio no esteroi-
dal, conocido como inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-1;
se recomienda para el tratamiento de desordenes reumáticos y
otros síntomas de artritis crónica. Al administrarse por vía oral
presenta una lenta absorción debido a su pobre solubilidad en
agua, por tal razón la formación de complejos de inclusión con
varias ciclodextrinas se han estudiado extensamente. Al formar el
complejo con b-ciclodextrina se mejoró la solubilidad del piroxi-
cam en aproximadamente 5 veces, encontrándose este complejo
disponible en una forma farmacéutica oral para propósito médico
en el mercado. Considerando que la b-ciclodextrina es menos
soluble que la hidroxipropil-b-ciclodextrina, si se formará un
complejo con esta ciclodextrina podría incrementarse en una
mayor proporción su solubilidad y disminuir su toxicidad para
poderla formular en otras formas farmacéuticas, como: para
vía intravenosa, vía sublingual o para liberación controlada; así
como mejorar su tolerabilidad gastrointestinal. A pesar de esa
extensa investigación no se encuentra un complejo de piroxicam
con hidroxipropil-b-ciclodextrina disponible para ser comer-
cializado. 2-5
El espectro de Infrarrojo del piroxicam presenta bandas en las
regiones de 1635-1625 cm-1, 1525 cm-1, 1440 cm-1, 1155-1070 cm-1
ó 1050-1070 cm-1 y 770 y 730 ó 740 cm-1.
Su espectro de ultravioleta se caracteriza por dos máximos
en ácido clorhídrico 0.1M: 242 nm y 339 nm, y tres en metanol,
256 nm, 290 nm y 358 nm11-13.
Por las características fisicoquímicas del piroxicam y por
la mayor solubilidad y menor toxicidad de la (HP-b-CD) se
propone formar y caracterizar el complejo de inclusión del pi-
roxicam-HP-b-CD con el objetivo de incrementar la solubilidad
del piroxicam
Material y métodos
Estudios de solubilidad (diagrama de solubilidad de fase) del
piroxicam y del complejo, se realizó como lo describe el método
de Higuchi y Connors14. Se pesaron por triplicado cantidades de
10, 20, 30, 40, 50 y 60 mg de piroxicam y su equivalente en el
complejo, se colocaron en ampolletas de vidrio, se adicionaron
10 mL de metanol a cada una y se sellaron. Las ampolletas se
colocaron en el disolutor de liberación prolongada (ELECSA)
a 50 rpm en un baño de agua a 25°C ± 2°C durante 36 horas.
El contenido de las ampolletas se centrifugaron a 3000 rpm
19
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
durante 5 minutos, del sobrenadante se tomaron alícuotas de 1
mL y se aforaron a 25 con metanol, se tomó 1 mL de cada una
y se aforaron a 10 mL con agua. Cada una de las muestras se
leyeron en un espectrofotómetro UV-Visible, en un intervalo de
200 a 400 nm, empleando una solución 1:10 de metanol-agua
como blanco, en celdas de 1cm de longitud.
Preparación del complejo de inclusión
piroxicam-HP-b-CD por el método de coprecipitado
Se disolvieron en 5 mL de metanol al 50% una mezcla (1:1), (1:2)
y (1:3) de piroxicam e HP-b-CD, se evaporó el disolvente a 50°C y
se pulverizó en mortero durante 30 minutos.
Preparación del complejo de inclusión
piroxicam-HP-b-CD por amasado
Se realizó una mezcla (1:1), (1:2) y (1:3) de piroxicam e HP-b-CD
y metanol al 50% para obtener una pasta homogénea. La mezcla se
transfirió a un mortero y se amasó durante 15 minutos, se secó a 50°C
por aproximadamente 6 horas y se pulverizó durante 30 minutos.
Preparación del complejo de inclusión
piroxicam-HP-b-CD por mezcla física
Se colocaron independientemente en un mortero proporciones
1:1, 1:2 y 1:3 de piroxicam e HP-b-CD; se maceraron por 30
minutos, se pasaron a través de mallas del No. 80 y 100. Se
continuó mezclando el producto por espacio de 15 minutos de
manera constante, hasta obtener una mezcla homogénea.
Figura 2. Solubilidad de fase de Piroxicam en metanol
20
Caracterización de materias primas
y del complejo de inclusión
Análisis por espectrofotometría ultravioleta
El espectro de absorción del piroxicam, HP-b-CD y de los
complejos se determinaron en un espectrofotómetro UV-Visible
(Marca Perkin Elmer Lambda 2) en un rango de 200 a 400 nm,
empleando metanol-agua (1:10) como blanco de referencia, en
celdas de 1cm de longitud. Se prepararon soluciones de piroxi-
cam materia prima y estándar a una concentración de 16 mg/mL
utilizando metanol-agua (1:10) como disolvente. De la misma
manera se preparó la solución de HP-b-CD en concentración
de 0.1g/mL.
Análisis por espectrofotometría de infrarrojo
Los espectros de infrarrojo del piroxicam, HP-b-CD y de los
diferentes complejos se determinaron en un espectofotómetro
IR (Marca Perkin Elmer), en forma de pastillas de bromuro de
potasio, a una concentración del 1%.
Calorimetría diferencial de barrido
El comportamiento térmico del piroxicam, HP-b-CD y de
los diferentes complejos se determinaron en un calorímetro
diferencial de barrido (Perkin Elmer DSC 7) en un intervalo
de 50 a 240°C a una tasa de calentamiento de 15°C/minuto,
bajo atmósfera de nitrógeno a un flujo de 20 mL/minuto.
Se realizó el enfriamiento bajo las mismas condiciones. Se
pesaron con exactitud aproximadamente 4 mg de piroxicam,
6 mg de HP-b-CD y una cantidad equivalente a 2 mg de
piroxicam de cada uno de los complejos, en porta muestras
de aluminio.
Resultados y discusión
El valor de la solubilidad se obtuvo al graficar las medias de
los mg disueltos del piroxicam (recuperados en solución) (Y )
contra los mg adicionados a cada ampolleta (X), del fármaco
y del complejo, extrapolando el punto donde se forma la
meseta al eje Y, para el piroxicam fue So= 40.69 mg/10mL
de solución en metanol (Fig. 2), y para el complejo fue de
So = 64.96 mg/mL observándose un incremento en la solu-
bilidad (59.65%), a los mismos mg finales adicionados. El
tipo de diagrama que se obtuvo con el complejo, representa
un comportamiento donde la solubilidad no se encuentra
limitada en las concentraciones utilizadas, por esta razón
el incremento de la solubilidad del piroxicam es mayor al
determinado (Fig. 3).
 Connors menciona que la solubilidad de un fármaco en un
disolvente determinado, es una constante y cualquier modificación
Figura 3. Solubilidad de fase comparativo entre piroxicam y el complejo de inclusión piroxicam/HP-b-CD. Piroxicam
So=40.69 Complejo de inclusión piroxicam/HP-b-CD So=64.96
El espectro de absorción ultravioleta del piroxicam presentó
máximos de absorción a 293 nm y a 358.2 nm, no absorbiendo
a estas longitudes de onda la HP-b-CD, por lo que no interfiere
en la cuantificación del piroxicam del complejo de inclusión
(Fig. 4 y 5).
El espectro de infrarrojo del piroxicam, mostró bandas a
una frecuencia de: 1630 cm-1 presencia de una carbonil amina,
1525 cm-1 amina secundaria, 1434 cm-1 grupos metilo y dobles
enlaces carbono-carbono, 1155-1070 cm-1 sulfona y 770 y 730 cm-1
la señal de un fenilo orto di sustituido. El espectro de la HP-
b-CD, presentó bandas a 3420 cm-1 de polímeros, 2900 cm-1
grupos hidroxilo primarios y secundarios, y 1420 cm-1 la región
que pertenece a los alquilos (Fig. 6 y 7).
En el análisis por calorimetría diferencial de barrido, el piroxi-
cam presentó una endoterma a 203°C, mientras que la HP-b-CD
la mostró aproximadamente a 90°C (Fig. 8 y 9).
Los espectros de absorción ultravioleta de las muestras
elaboradas por los métodos de complejación de coprecipitado
y amasado en las diferentes proporciones no mostraron modi-
ficaciones de consideración en los máximos de absorción del
piroxicam. Así como en los espectros de infrarrojo las bandas
de los grupos funcionales principales no cambiaron. De tal
forma que al no haber un cambio en la longitud de onda, ni en
la intensidad de absorción, los métodos antes mencionados se
consideran métodos no formadores de enlaces entre las especies
participantes.
será causa de la formación de un complejo de inclusión, sin afectar la
naturaleza misma de él, ya que sólo interacciona de manera parcial.
En el análisis por calorimetría diferencial de barrido las
endotermas que corresponden a los métodos de coprecipitado y
amasado en diferentes proporciones no mostraron cambios para el
piroxicam, pues presentó la misma señal e intensidad a los 200°C
que corresponde únicamente al fármaco y no así a la ciclodextrina
cuya endoterma aparece en pequeña intensidad aproximadamente
a 80°C. Por esta razón concluimos que por estos métodos no se
lleva a cabo la complejación (Fig 10 y 11).
Por el método de mezcla física se presentaron cambios desde
la proporción 1:1, acentuándose las modificaciones conforme
la proporción de HP-b-CD se incrementaba, por tal razón la
relación estequiométrica 1:3 piroxicam/HP-b-CD, fue la ele-
gida para elaborar el complejo de inclusión. En el espectro de
absorción UV del complejo formado por este método, desaparece
la señal de los 290 nm y disminuye la absorción a los 358.2
nm, presentándose un efecto batocrómico, esto se puede deber
a que no se incluyó en la ciclodextrina todo el piroxicam; pero
es indicativo de la formación de un complejo de inclusión entre
las especies participantes (Fig. 12).
En el espectro de IR del complejo anterior, las bandas a 1434 cm-1
que corresponden al grupo metilo y al doble enlace carbono-
carbono, así como de la carbonil-amina a 1630 cm-1, disminuyen
su absorción. Estos cambios se atribuyen probablemente a la
inclusión de la molécula del piroxicam en la HP-b-CD for-
mando enlaces no covalentes, además de registrar con mayor
intensidad las señales que corresponden a la molécula de la
HP-b-CD (Fig. 13).
21
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

Caracterización del complejo de inclusión piroxicam-HP-b-CD

Figura 4. Espectro UV de piroxicam Figura 5. Espectro UV de HP-b-CD

Figura 6. Espectro IR Piroxicam en KBr Figura 7. Espectro IR de HP-b-CD en KBr

Figura 8. Termograma de Piroxicam Figura 9. Termograma de HP-b-CD

22
En el análisis por calorimetría diferencial de barrido del complejo, endoterma que corresponde a la HP-b-CD. Un comportamiento
la endoterma de fusión del piroxicam, disminuye de 107.52 J/g de este tipo representa la mejor evidencia de que el complejo se ha
a 5.58 J/g a medida que la proporción se incrementa, desde la formado, pues cualquier modificación a éste se debe a la inclusión
relación estequiométrica (1:1) hasta (1:3), permaneciendo la del fármaco en la cavidad de la HP-b-CD (Fig. 14).

Figura 10. Termograma del complejo formado Figura 11. Termograma del complejo formado
por el método de coprecipitado por el método de amasado

Figura 12. Espectro de UV del complejo formado Figura 13. Espectro de IR del complejo formado
por el método de mezcla física por el método de mezcla física

Conclusiones
El método por el cuál se formó el complejo de inclusión fue el
de mezcla física en proporción (1:3), en donde la mayor parte
del piroxicam se incluyó dentro de la molécula de la HP-b-
CD, demostrándose con los diferentes métodos de análisis
propuestos, principalmente por el de calorimetría diferencial
de barrido, en donde la endoterma del piroxicam disminuyó
en un 94.81%; pero a pesar de no incluirse totalmente el
fármaco en la ciclodextrina se incrementó la solubilidad del
piroxicam por lo menos en un 59.65%, ya que no se llegó a
saturar la solución en la cantidad final utilizada de 60 mg
adicionados.
Figura 14. Termograma del complejo formado
por el método de mezcla física

23
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Como la solubilidad de fase no se realizó en agua por la poca so-
lubilidad del piroxicam en ella, se espera que si se realiza la prueba
con el complejo formado, la solubilidad en agua sea mayor a la del
piroxicam solo y si es así, poder utilizar el complejo formado para
elaborar preparaciones intravenosas, debido a que la HP-b-CD
es menos tóxica y más soluble que la b-CD para esta vía.
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Trabajo Científico

Influencia de los parámetros químico físicos

en el diseño de formulación de cremas
de Budesonida al 0.025%
Chemical and physical parameters influence on the formulation design
of Budesonida 0.025% creams
Adriana Muñoz C, Odalys Fernández V, Leopoldo Núñez de la F,
Eylín Jorge A, Janelis Suárez G, Raisa Vega M, Laritza Rodríguez M.
Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).

RESUMEN: en el presente trabajo se realizó el diseño de dos formulaciones de crema de budesonida al 0.025%, utilizando un
intervalo de pH diferente en cada una de ellas.
Para ambas formulaciones fueron realizadas pruebas microbiológicas y toxicológicas, así como el estudio de estabilidad física
y química durante doce meses en tres tipos de envase y dos temperaturas de almacenamiento.
Las dos cremas mostraron parámetros tecnológicos satisfactorios durante el estudio en tubos de aluminio y frascos plásticos, a
temperatura ambiente y de refrigeración, mientras se afectó la cuantificación del principio activo en el envase de vidrio ámbar.
Estos resultados permitieron establecer que el pH no influyó en la estabilidad química de Budesonida en las cremas estudiadas
a ambas temperaturas, pero sí existió influencia del tipo de envase utilizado.

ABSTRACT: in the present paper the design of two formulations of Budesonida 0.025% creams was carried out, using a different
range of pH in each of them.
Microbiological and toxicological tests were done for both formulations, as well as the physical and chemical stability study in
three different types of packages and two temperatures of store during twelve months.
Both creams showed satisfactory technological parameters during the study in aluminum tubes and in plastic flasks, at room
temperature and in refrigeration, while the quantify of the active principle in amber glass flasks was affected.
These results allowed us to establish that the pH did not have influence on the chemical stability of Budesonida in the creams
studied at both temperatures, but there was influence of the type of package used.

Palabras claves: Budesonida, pH, cremas, sistema envase. Key words: Budesonida, pH, creams, packing system.

Correspondencia: Fecha de recepción: 24 de septiembre de 2003

Lic. Adriana Muñoz Cernada. Fecha de aceptación: 18 de diciembre de 2004
Calle San Lázaro No.773, apto. 4, entre San Mariano
y Vista Alegre. Municipio 10 de Octubre.
Ciudad de La Habana, Cuba.
Teléfono: 99-1666.
E- mail: cinfa@infomed.sld.cu

25
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Introducción
La budesonida es un corticosteroide sintético no halogenado
de potente actividad glucocorticoide y pobre actividad minera-
locorticoide, que se absorbe escasamente por vía dermica y es
rápidamente metabolizado por el hígado, de ahí que muestre
efectos sistémicos prácticamente irrelevantes y una buena tole-
rancia local casi desprovista de efectos secundarios1.
Este fármaco fue usado primeramente por inhalación en el
tratamiento del asma bronquial y la rinitis alérgica. Sin embargo,
estudios clínicos y preclínicos han demostrado su elevada potencia
antinflamatoria local, que posibilita el empleo efectivo de lociones,
ungüentos y cremas con una baja concentración de principio activo
(0.025%) para el tratamiento de diversas afecciones de la piel. Está
indicado en varios tipos de dermatitis y psoriasis, liquen plano y
simple, lupus eritematoso discoide y otras manifestaciones infla-
matorias, pruriginosas, alérgicas y eczematosas que responden a
la corticoterapia. Se considera al menos 10 veces más potente que
la triamcinolona acetónida, la prednisona y la hidrocortisona en la
inhibición de la inflamación, siendo de 4-7 veces menos potente
para producir efectos sistémicos2-4.
En cuanto a su estabilidad química, se ha encontrado que
depende en gran medida del pH cuando la budesonida se en-
cuentra en forma de solución. Se plantea que la estabilidad de
las soluciones aumenta cuando el pH decrece, siendo el intervalo
de 3.5 a 5.0 el de mayor estabilidad5.
Teniendo en cuenta lo anterior, nos trazamos como objetivo
diseñar dos formulaciones de crema de budesonida al 0.025%,
evaluando la influencia del pH en el tiempo, además de los
parámetros físicos, químicos, microbiológicos y toxicológicos
de los ensayos realizados, considerando diferentes envases y
condiciones de almacenamiento.
Materiales y Métodos
Se elaboraron dos formulaciones de crema de base emulsiona-
da aceite en agua (o/w), por el método de fusión de la base y
posterior incorporación de budesonida (comercializado por la
firma Madex, Suiza) al 0.025% disuelto en propilenglicol. Para
ambas formulaciones se utilizó una base lavable de composición
cualitativa y cuantitativa muy similar, solamente difieren en que
el emulgente empleado para la formulación A es polisorbato 80
y para la formulación B sodio lauril sulfato. Las formulaciones
fueron ajustadas a dos intervalos de pH diferentes, para estudiar
la influencia que puede tener este parámetro en la estabilidad
química del principio activo y determinar si la degradación re-
portada en soluciones se observaba en una forma farmacéutica
semisólida. La formulación A se ajustó en un pH de 5.5 a 6.5
y la formulación B de 4.0 a 5.0.
26
Estas formulaciones fueron evaluadas microbiológicamente
mediante el Conteo Microbiano y la Prueba de Efectividad de
Preservativos Antimicrobianos6,7, así como toxicológicamente
mediante las Pruebas de Irritabilidad Dérmica y Oftálmica8.
Se elaboraron tres lotes de cada crema para los estudios de
estabilidad física y química, en los que se evaluaron por triplicado
diferentes parámetros a los lotes recién elaborados y luego de
envasados en frascos de vidrio ámbar, por 30 g, frascos plásticos
de polietileno de baja densidad, por 30g y tubos de aluminio
ciegos, laqueados interiormente, por 25 g.
Para el estudio de estabilidad química se utilizó un cromató-
grafo líquido KNAUER compuesto por desgasificador, bomba
de doble pistón reciprocante, Detector UV-VIS de longitud
de onda variable y autoinyector KONTRON. Las condiciones
cromatográficas se establecieron para un sistema isocrático de
fase reversa, fase móvil agua : acetonitrilo 40% (Merck), columna
RP-18 5µm (250 x 4 mm) y longitud de onda de 240 nm. La
técnica analítica fue debidamente validada, demostrándose la
linealidad, exactitud, repetibilidad, reproducibilidad y especifi-
cidad. El método empleado fue el de vida de estante a muestras
almacenados a temperatura ambiente y de refrigeración (2 - 8°C)
durante 12 meses.
Los parámetros evaluados fueron: características organo-
lépticas; pH (pHmetro Metrohm, modelo 691); cuantificación
del principio activo; área de extensibilidad, a una temperatura
de 28 ± 1°C, por el método de Suñé 9 y el comportamiento
reológico (rotoviscosímetro Haake RV-20, sensor M5/PK5 1°,
gradiente de velocidad de 0-50 s-1, en ambiente termostatado
de 30 ± 0.1°C).
Los resultados obtenidos fueron comparados para evaluar el
comportamiento físicoquímico de las formulaciones, incluyendo
el análisis estadístico de los datos de la extensibilidad empleando
el programa estadístico Statistic for Windows10. Se realizó un
análisis de varianza (ANOVA), clasificación simple, para ambas
formulaciones en cada tipo de envase y temperatura, previa
comprobación de la homogeneidad de varianzas por la Prueba
de Levene. Para comprobar las diferencias entre los promedios
de las subpoblaciones se utilizó la Prueba de Duncan. En todos
los casos se trabajo con un nivel de significación del 5%.
Resultados y Discusión
Como resultado de la evaluación microbiológica se obtuvo
en ambas formulaciones un conteo menor de 102 UFC/g de
bacterias, hongos y levaduras, sin existencia de microorganismos
patógenos. En la efectividad de preservativos antimicrobianos no
se detectó contaminación a partir de los 14 días después de la
primera siembra. Estos resultados demostraron que los preser-
vativos antimicrobianos empleados fueron efectivos y protegen
al producto de la contaminación a la que se expone este tipo de
formulación.
En la prueba de irritabilidad oftálmica, en ambas formula-
ciones se observaron algunas alteraciones en la hora posterior
a la administración, las que disminuyeron gradualmente hasta
desaparecer a partir de las 24 a 72 horas. El índice de irritación
primario (IIP) tuvo un valor de 5.91 para la formulación A y 5.75
para B. En el caso de la irritabilidad dérmica no se evidenciaron
signos de irritación sobre la piel, obteniéndose un IIP con valor
de 0.0 en ambos casos. Teniendo en cuenta esos valores las dos
cremas se clasifican como No Irritantes, por lo que son aptos
para su uso en humanos.
Los tres lotes de cada una de las dos formulaciones mantuvieron
adecuadas propiedades organolépticas en todos los envases y
temperaturas durante el tiempo de estudio. Estas propiedades
corresponden a cremas blancas, homogéneas, con brillo, libres
de grumos o arenosidad y que se extienden bien sobre la piel.
Los valores de pH se mantuvieron durante todo el estudio en
el intervalo planteado para cada formulación, es decir, 6.0 ± 0.5
para la formulación A y 4.5 ± 0.5 para la B, observándose para la
primera una menor variación de este parámetro en las muestras
almacenadas a temperatura de refrigeración.
Los resultados de la cuantificación del principio activo, el
pH y el área de extensibilidad durante el tiempo de estudio,
en los 3 tipos de envase, se presentan en la tabla 1 para la
formulación A, a temperatura ambiente y la tabla 2 para la
temperatura de refrigeración, mostrándose los valores promedio
de los tres lotes y su desviación estándar. De igual forma, los
valores correspondientes a la formulación B se presentan en
las tablas 3 y 4.

Tabla 1. Formulación A, temperatura ambiente

PARÁMETROS INICIO 3 MESES 6 MESES 12 MESES

VALORACIÓN T 105.1±7.8 104.5±5.5 103.3±5.6

QUÍMICA 106.0±5.4 P 106.5±5.5 104.4±5.5 103.2±4.9
V 115.3±5.5 - -

T 5.8 ± 0.08 5.8 ± 0.1 5.7 ± 0.03
pH 5.9 ± 0.08 P 5.7 ± 0.12 5.7 ± 0.09 5.6 ± 0.12
V 5.7 ± 0.08 5.6 ± 0.08 -

EXTENSIBILIDAD T 32.50±0.62a 29.46±0.69a 26.97±1.01a

(cm2) 34.82±0.41a P 29.89±0.40a 28.23±0.67a 25.64±0.68a

a: Significancia p<0.05, con todos los tiempos.

Leyenda: T: Tubo. P: Frasco plástico. V: Frasco de vidrio ámbar.

Tabla 2. Formulación A, temperatura de refrigeración

PARÁMETROS INICIO 3 MESES 6 MESES 12 MESES

VALORACIÓN T 106.0±5.7 104.6±5.5 103.4±5.6

QUÍMICA 106.0±5.4 P 106.6±5.5 104.5±5.6 103.3±4.9
V 108.0±5.5 - -

T 5.85 ± 0.07 5.85 ± 0.07 5.90 ± 0.03
pH 5.9 ± 0.08 P 5.75 ± 0.07 5.80 ± 0.03 5.85 ± 0.05
V 5.85 ± 0.09 5.80 ± 0.09 -

EXTENSIBILIDAD T 35.76±0.58a 37.08±0.68b 34.16±0.69

(cm2) 34.82±0.41a P 35.79±0.58 37.23±0.78b 33.53±0.63b

a: Significancia p<0.05, con los 6 y 12 meses; b: Significancia p<0.05, con todos los tiempos.

27
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

Tabla 3. Formulación B, temperatura ambiente

PARÁMETROS INICIO 3 MESES 6 MESES 12 MESES

VALORACIÓN T 107.8±1.3 107.7±0.6 108.6±0.3

QUÍMICA 108.0±0.6 P 107.7±0.2 107.8±0.5 108.4±0.4
V 116.8±0.4 - -

T 4.4 ± 0.10 4.6 ± 0.03 4.6 ± 0.07
pH 4.5 ± 0.03 P 4.4 ± 0.07 4.5 ± 0.09 4.6 ± 0.07
V 4.3 ± 0.12 4.5 ± 0.09 -

EXTENSIBILIDAD T 29.24±0.55 27.45±0.68a 28.45±0.75

(cm2) 29.33±0.52 P 29.70±0.59 26.96±0.48a 26.02±0.55a

a: Significancia p<0.05, con el inicio y los 3 meses.

Tabla 4. Formulación B, temperatura de refrigeración

PARÁMETROS INICIO 3 MESES 6 MESES 12 MESES

VALORACIÓN T 107.9±1.3 107.8±0.6 108.6±0.3

QUÍMICA 108.0±0.6 P 107.8±0.2 107.9±0.5 108.5±0.4
V 110.7±0.4 - -

T 4.5 ± 0.10 4.60 ± 0.03 4.60 ± 0.07
pH 4.5 ± 0.03 P 4.4 ± 0.09 4.55 ± 0.09 4.60 ± 0.12
V 4.4 ± 0.03 4.50 ± 0.09 -

EXTENSIBILIDAD T 29.88±0.35 28.30±0.79a 26.24±0.87b

(cm2) 29.33±0.52 P 28.55±0.26 27.86±0.63c 25.77±0.75b

a: Significancia p<0.05, con los 3 y los 12 meses; b: Significancia p<0.05, con todos los tiempos; c: Significancia p<0.05, con el inicio y los 12 meses.

El mantenimiento de las características organolépticas
y del pH es una muestra de la estabilidad físicoquímica de
las preparaciones. El pH tiene una gran importancia en este
estudio, pues por referencias encontradas del comportamiento
de la budesonida en soluciones acuosas esperábamos que la
formulación B, que contenía el pH óptimo mostrara una ma-
yor estabilidad desde el punto de vista químico. Sin embargo,
como puede observarse en las tablas, en ambas formulaciones
la cuantificación del principio activo se mantuvo dentro de los
límites establecidos (90-115%), tanto en tubos como en frascos
plásticos para las dos temperaturas de almacenamiento.
En el envase de vidrio se obtuvo a los 3 meses a temperatura
ambiente una valoración superior al límite máximo establecido,
de ahí que se descartara este tipo de envase y, por tanto, no se
continuaran en este caso las mediciones correspondientes. Este
incremento en la valoración del principio activo pudo estar
provocado por la pérdida de agua de la crema en contacto con el
medio, pues los frascos de vidrio no tienen un cierre hermético,
mientras que los tubos son ciegos y los frascos plásticos tienen
un liner, además de una tapa con sello de seguridad.
Después de este análisis puede plantearse que no hubo una
influencia del pH en la estabilidad química de la budesonida en
forma de crema, y sí influyó el tipo de envase empleado.
En cuanto a la extensibilidad, se observan valores que reflejan
una consistencia característica de las cremas. De la evaluación
estadística se obtuvieron los siguientes resultados. Para la for-
mulación A, a temperatura ambiente, en el Análisis de Varianza
(ANOVA) para las áreas de extensibilidad, se encontraron dife-
rencias significativas entre las medias con un nivel de significación
de un 5%, tanto en tubos como en frascos plásticos. La prueba
de Duncan mostró diferencias significativas entre las áreas para

28
todos los tiempos en ambos envases. Esto indica que las áreas
de extensibilidad disminuyen significativamente en el tiempo, lo
que refleja un incremento en la consistencia de la crema. No se
realizó el análisis para frascos de vidrio, por cuanto este tipo de
envase fue descartado como se explicó anteriormente. El aumento
de la consistencia observado es característico de la estructuración
de la crema después de su elaboración, por lo que puede decirse
que se mantiene estable físicamente.
A temperatura de refrigeración se obtuvieron diferencias
significativas en el ANOVA, tanto en tubos como en frascos
plásticos. Para tubos, en la prueba de Duncan no se observaron
diferencias significativas entre los valores de las áreas al inicio con
los valores a los 3 y 12 meses, aunque se observaron diferencias
entre los 3 y los 12 meses entre sí, todos los valores son diferentes
estadísticamente de la media obtenida a los 6 meses.
En los frascos plásticos se obtuvo que no existen diferencias
significativas entre los valores de inicio y 3 meses; pero éstos son
diferentes estadísticamente de los valores de 6 y 12 meses, así como
estos dos últimos entre sí. Estos resultados demuestran que las
áreas de extensibilidad presentan un aumento significativo a los 6
meses en ambos tipos de envase, lo que representa una disminu-
ción en la consistencia de la crema a dicho tiempo. Sin embargo,
a los 12 meses, en el caso de los tubos, la consistencia se recupera
nuevamente, ya que se obtuvo un valor similar del área de exten-
sibilidad respecto al inicio; en el caso de los frascos plásticos se
obtuvo un valor inferior del área de extensibilidad, lo que redunda
en una mayor consistencia. Estos resultados nos muestran que
ocurrió una desviación del comportamiento esperado a los 6 meses.
Los resultados obtenidos a los 12 meses, sin embargo, nos hacen
pensar que esta desviación pudo estar provocada por errores de
manipulación o cambio en las condiciones ambientales.
Esto indica que se produce un incremento de la consistencia
de la preparación en los dos tipos de envase.
En esta formulación, al igual que en el caso de A, no se realizó
el análisis estadístico de la extensibilidad para frascos de vidrio,
por cuanto fue descartado este tipo de envase. El aumento en
la consistencia es característico de la estructuración propia de la
crema después de su elaboración, como se mencionó anterior-
mente para la formulación A, por lo que podemos plantear que
esta formulación también permanece estable físicamente.
Los resultados del comportamiento reológico, (figura 1),
muestran las curvas de fluidez obtenidas para ambas formula-
ciones al iniciarse el estudio. La curva ascendente del gráfico de
fluidez se ajustó por el método de los mínimos cuadrados, los
mejores coeficientes de correlación se obtuvieron con la curva
potencial (Ostwald), con un R2 de 0.98 para la fórmula A y de
0.94 para la fórmula B. También se observó en ambos casos un
esfuerzo cortante inicial (to) con valores muy próximos a 0. Estos
resultados nos permitieron concluir que las cremas presentaron un
comportamiento de flujo no newtoniano de tipo pseudoplástico.
Además, se determinaron las áreas tixotrópicas, obteniéndose
para el caso de la formulación A, un valor de 328 Pa/s y para
la formulación B, de 974 Pa/s. El comportamiento observado
es característico de este tipo de forma farmacéutica. La formu-
lación B muestra una mayor área tixotrópica que la formulación
A, por lo que se puede decir que está más estructurada, y por
tanto, presentó una mayor consistencia en estado de reposo
que garantiza mayor estabilidad física de la preparación, y una
disminución de la viscosidad al extender la crema sobre la piel,
para facilitar su aplicación.

Para la Formulación B, a temperatura ambiente, en el

análisis estadístico de la extensibilidad se obtuvo que existían
diferencias significativas entre las medias en el ANOVA, tanto
en tubos como en frascos plásticos. La prueba de Duncan para
tubos mostró diferencias significativas de los valores de inicio y 3
meses respecto al de 6 meses, siendo similares al de 12 meses. En
frascos plásticos se obtuvo diferencias significativas de los valores
de inicio y 3 meses respecto a los de 6 y 12 meses, mientras que
entre estos dos últimos tiempos no se observó diferencias. Estos
resultados indicaron que en los dos tipos de envase se produce
una disminución significativa del área de extensibilidad a partir
de los 6 meses y que se mantiene hasta los 12 meses, lo que refleja
un incremento en la consistencia de la crema.

En la Formulación B a temperatura de refrigeración, se encontró,

en el ANOVA para la extensibilidad, que existían diferencias
significativas tanto en tubos como en frascos plásticos. En la
prueba de Duncan para ambos envases se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre la media obtenida a los 12 Figura 1. Curvas de fluidez, tiempo inicial.
meses con respecto a todos los tiempos.

29
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Conclusiones
Las formulaciones evaluadas cumplieron con los requerimientos
microbiológicos y toxicológicos establecidos para este tipo de prepa-
ración y se presentaron estables física y químicamente durante todo
el tiempo de estudio en tubos de aluminio y frascos plásticos a las
dos temperaturas de almacenamiento. Por ello, podemos plantear
que el pH no influyó en la estabilidad química de budesonida en las
cremas estudiadas, así como en el resto de los parámetros tecnológi-
cos correspondientes; pero sí existió influencia del tipo de envase, no
siendo adecuada la utilización de frascos de vidrio ámbar.
En el estudio reológico, se observó una mayor estructura-
ción en el caso de la formulación B, debido al mayor valor de su
tixotropía, lo que concuerda con la información obtenida en el
estudio de su consistencia a través de los ensayos de evaluación de
la extensibilidad. Desde el punto de vista físico, esta formulación
mostró un mejor comportamiento por lo que fue elegida para
proceder a su registro sanitario.
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http: // www.statsoft.com.
Trabajo Científico

Validación de un método analítico

espectrofotométrico para la cuantificación
de metabolitos estables de óxido nítrico
en fluidos biológicos
Validation of a spectrophotometric analytical method for quantifying stable
metabolites of nitric oxide in biological fluids
Fermín A. Tenorio L, Leonardo del Valle M, Gustavo Pastelín H.
Departamento de Farmacología, Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez”

RESUMEN: En este trabajo reportamos la validación de un método espectrofotométrico por espectrometría de UV-Vis para la
cuantificación de metabolitos estables de óxido nítrico (NO3-) en muestras biológicas (suero) utilizando la reacción colorimé-
trica de Griess modificada a un coeficiente de extinción de A572-A587 nm. Bajo estas condiciones, el método analítico mostró ser
selectivo, lineal (en el intervalo de concentración de 0 a 40µM, con un porcentaje de recobro analítico promedio del 101.9%
y un coeficiente de variación del 1.4%), exacto (con un porcentaje de recobro analítico promedio del 102.2% y un coeficiente
de variación del 0.2%) y preciso (con un porcentaje de recobro analítico promedio del 101.1% y un coeficiente de variación
del 1.9%), un límite de detección de 0.69 pM y un límite de cuantificación de 2.10 pM.

ABSTRACT: In this work we report the validation of a spectrophotometric UV-Vis method for quantifying stable metabolites
of nitric oxide (NO3-) in biological samples (serum) using a modified Griess reaction at an extinction coefficient of A572-A587 nm.
Under these conditions, the analytical method showed to be selective, linear (within the concentration interval of 0-40 µM, with
an average analytical recovery percentage of 101.9% and a variation coefficient of 1.4%), accurate (with an average analytical
recovery percentage of 102.2% and a variation coefficient of 0.2%) and precise (with an average analytical recovery percentage
of 101.1% and a variation coefficient of 1.9%), a detection limit of 0.69 pM and a quantification limit of 2.10 pM.

Palabras claves: óxido nítrico, espectrometría, UV-Vis, validación. Key words: nitric oxide, spectrometry, UV-Vis, validation.

Correspondencia:
Fermín Alejandro Tenorio López
Departamento de Farmacología.
Juan Badiano No. 1, Col. Sección XVI, 14080.
Tlalpan, México, D.F.
Tel: 55 73 29 11. Ext. 1317 ó 1344. Fax: 55 73 09 26.
E-mail: ft24@hotmail.com, fatl@att.net.mx
Fecha de recepción: 24 de noviembre de 2003
Fecha de aceptación: 28 de mayo de 2004
Introducción
El óxido nítrico (NO) es un gas incoloro escasamente soluble
en agua (menos de 2 mmol bajo condiciones de temperatura,
presión y humedad estándares, es decir, 25 °C, 1 atm de pre-
sión y humedad ambiente) con un electrón no apareado en su
capa de valencia externa, lo que lo convierte en una molécula
paramagnética con naturaleza de radical libre que participa en
procesos fisiológicos y patológicos. Es producido en las células
por 3 isoformas de la óxido nítrico sintasa (tipo I, dependiente
de Ca2+; tipo II, no regulada por Ca2+; y tipo III, dependiente

31
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

del sistema Ca2+-calmodulina), actuando como activador de la
guanilato ciclasa produciéndose incrementos en la concentra-
ción del guanosín monofosfato cíclico (GMPc), facilitando así
la transmisión neuronal, promoviendo la relajación vascular,
inhibiendo la proliferación de células de músculo liso vascular,
la agregación y la adherencia de plaquetas y leucocitos.1,2
El NO puede ser cuantificado por métodos directos (cromato-
grafía de gases acoplada a espectrometría de masas, cromatografía
de líquidos de alta eficiencia acoplada a detectores electroquímicos,
resonancia electrónica paramagnética quimioluminiscencia) y por
métodos indirectos (espectrometría de masas, espectrometría de
UV-Vis y métodos electrométricos),3,4,5,6 las concentraciones de éste
en un organismo vivo se encuentran entre 10 nM a 1 µM y su vida
media en disolución acuosa (entre 3.8 a 6.2 s)7 reducen la aplicabi-
lidad de estos métodos para la evaluación de muestras biológicas.
Debido a lo anterior, las dificultades inherentes a la cuantificación
del NO pueden ser reducidas cuantificando a sus metabolitos esta-
bles NO2- y NO3-, pero en muestras plasmáticas, el NO es oxidado
completamente a NO3-, el cual es estable durante varias horas (figura
1). En contraste, el NO2- es convertido rápidamente a NO3- en la
sangre mediante la oxidación de la hemoglobina por el NO2- bajo
condiciones aeróbicas mediante la transferencia de un electrón del
NO2- hacia la oxihemoglobina unida (figura 2).8

Nox exógeno inhalado NO endógeno sintetizado por las NOS

PULMÓN SANGRE RIÑON ORINA

NO NO NO2- NO3- NO3- NO3-

SALIVA INTESTINO HIGADO

NO2. N2 NO3- NO2- NH3 NH3

HECES
AIRE NH3/NO2-/NO3-
N2

Figura 1. Biotransformación del óxido nítrico (NO) y sus N-óxidos (NOx) relacionados en mamíferos. NOS = Sintasa de Óxido Nítrico.

Factores extravasculares (1) Incremento (alimentos, saliva, estómago e intestino);

(2) Decremento (hígado, pulmones y riñón)

NO3-

HbO2/Hb
HbO2
H+ NO2-

RSH
ONOO* RSNO

O2*

NO*

Figura 2. Diagrama simplificado de las posibles rutas metabólicas del NO en sangre circulante. HbO2= Oxihemoglobina; Hb = Hemo-
globina; RSH = Tiol; NO* = Radical libre Óxido Nítrico; RSNO = Nitrosotiol; O2* = Anión Superóxido; ONOO = Peroxinitrito

32
 Se han reportado varias técnicas para la detección de los me-
tabolitos estables del NO (NO3- y NO2-), siendo la más utilizada
la detección colorimétrica con reactivos de Griess.9 Esta reacción
Figura 3. Reacción de Griess para la detección de NO3- y NO2-. En esta reacción, el Cd2+ puede sustituirse por V3 + cmo agente reductor.
Debido a que la reacción de Griess no detecta al anión NO3-, se
ha propuesto la reducción de NO3- a NO2- con metales reductores
tales como el cadmio (Cd), o bien, mediante métodos enzimáti-
cos tales como la reducción con nitrato reductasa bacteriana.10,11
La reducción con Cd requiere de mucho tiempo y de un paso
de separación adicional, siendo, además el Cd, un metal tóxico
implicado en el desarrollo de patologías tales como enfermedad
pulmonar obstructiva, enfisemas, nefropatías diversas, hiperten-
sión esencial y en cáncer (pulmonar, prostático y testicular).12
El vanadio, en su estado de oxidación 3+, es un agente reductor
mucho menos tóxico que el Cd, además, es más selectivo, por lo
que las reducciones efectuadas con éste reportan buenos resul-
tados. Respecto al uso del Cd como metal reductor en la técnica
de Griess, es necesario separarlo mediante cromatografía de
intercambio iónico, utilizando para ello columnas de cobre (Cu)
pues se ha visto que interfiere en la detección3 de NO3- y, debido
a la separación requerida, se incrementan los costos y tiempos
de análisis, aspectos que se solventan utilizando V3+ como agente
reductor.13
involucra la formación de un cromóforo mediante la diazoación
de la sulfanilamida con ácido nitroso, seguido de una copulación
con una amina bicíclica (figura 3).
Por otra parte, la validación de un método analítico puede
definirse como la evidencia, obtenida mediante estudios de labo-
ratorio, que el método satisface los requerimientos para los cuales
fue diseñado. Para ello, se evalúan parámetros de desempeño tales
como la selectividad, linealidad, precisión y exactitud.14,15
La Food and Drug Administration de los Estados Unidos
de Norteamérica establece que un método bioanalítico es aquel
que se utiliza en estudios de farmacología clínica en humanos,
en biodisponibilidad, bioequivalencia y en evaluaciones farma-
cocinéticas. Las técnicas analíticas empleadas usualmente en
estos estudios son cromatografía de gases (CG), cromatografía
de líquidos de alta resolución (CLAR) y combinaciones de CG
y CLAR acopladas a espectrometría de masas (EM) tales como
CLAR-EM, CLAR-EM-EM, CG-EM y CG-EM-EM para
la determinación cuantitativa de fármacos y/o metabolitos en
matrices biológicas tales como sangre, suero u orina. Los paráme-
tros fundamentales mínimos para la validación de estos métodos
incluyen a: (1) exactitud, (2) precisión y (3) selectividad.16
33
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Materiales y Métodos
Preparación de las disoluciones
Los reactivos requeridos para la preparación de las disoluciones
procedieron de Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co, St. Louis
Mo.). Se preparó una disolución de cloruro de vanadio (III)
(VCl3) al 0.8 % (% p/v) en H3PO4 (Merck, Darmstadt, Alema-
nia, grado RA) 1 M. También, una disolución de sulfanilamida
al 2 % (% p/v) en H3PO4 (Merck, Darmstadt, Alemania, grado
RA) al 5 % (% v/v) y una disolución de diclorhidrato de N-(1-
naftil)etilendiamina al 0.2 % (% p/v) en agua destilada. Todas
las disoluciones se filtraron con un filtro para jeringa (Millipore,
Molsheim, Francia) con membrana de ésteres mixtos de celu-
losa con un tamaño de poro de 0.22 µm y se almacenaron en la
oscuridad bajo refrigeración (4 - 8 ºC).
Procedimiento experimental para disoluciones acuosas
Como anión de prueba, se utilizó una disolución stock de
nitrato de sodio (NaNO3, Spectrum Quality Products, Inc.,
Gardena CA), como agente reductor al VCl3, y como agentes
reaccionantes y copuladores, a la sulfanilamida y al diclorhidra-
to de N-(1-naftil)etilendiamina. Se evaluó la selectividad del
sistema analítico frente a la presencia de otros aniones tales
como sulfato, fosfato y sulfito así como también la influencia
de la fuerza iónica, para lo cual se empleó una disolución de
Krebs-Henseleit, cuya composición se detalla en la tabla 1),
realizando un barrido comprendido entre los 0 a 1100 nm en
un espectrofotómetro de doble haz SLM-AMINCO modelo
DW-2000 (SLM Instruments, Urbana IL.) para corroborar
experimentalmente la longitud de onda de máxima absorción
(lmax) del diazocompuesto formado con microceldas de cuarzo
Tabla 1. Composición de la disolución de Krebs-Henseleit
Reactivo Concentración (mM)
NaCI 11.78
NaH2PO4•H2O 0.12
Na2EDTA 0.0027
KCI 0.6
CaCI2•2H2O 0.16
MgSO4•7H2O 0.12
34
de 1 cm de paso óptico, registrando la presencia o ausencia de
una banda a una longitud de onda de máxima absorción. Así, se
preparó una serie de curvas patrón de NaNO3, en el intervalo
de concentración de 0 a 100 µM, en donde de la disolución
stock de NaNO3 se realizaron las diluciones pertinentes. De
éstas, se tomó una alícuota de 20 µL y se adicionó de manera
secuencial 100 µL de VCl3 al 0.8% (p/v) en H3PO4 1 M, 50
mL de sulfanilamida al 2% (p/v) en H3PO4 al 5% (v/v) y 50
µL de diclorhidrato de N-(1-naftil)etilendiamina al 0.2% (p/
v), incubándose a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Bajo estas condiciones, se evaluó la linealidad del sistema y
del método utilizando como documentos guía a las Guías de
Validación de Métodos Analíticos editadas por la Conferencia
Internacional de Armonización (ICH)14, 15.
Procedimiento experimental para fluidos biológicos
Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes sanos (donadores
calificados) y pacientes con diversas afecciones cardiovasculares
hospitalizados en el Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio
Chávez” de la Ciudad de México, las cuales fueron centrifuga-
das a 14000 rpm durante 3 minutos a una temperatura de 4
ºC y almacenadas a -70 ºC hasta el momento de su análisis. Se
evaluó el método analítico bajo 2 parámetros de obtención de
muestras biológicas: (1) sueros sin desproteinizar y (2) sueros
desproteinizados, en donde se consideró el efecto de 2 sistemas de
desproteinizacion (metanol-éter dietílico en proporción 3:1 (v/v)
y H3PO4 al 10%), evaluando con ello la selectividad y la linealidad
del método analítico (no se muestran los datos). Para evaluar
la selectividad del sistema analítico, se emplearon aniones con
estructura química similar al NO3-, como lo son sulfato, fosfato y
sulfito. Se determinó por triplicado la absorbancia obtenida bajo
las condiciones de análisis óptimas determinadas experimen-
talmente. Así, una vez obtenidos los sueros humanos, se llevó a
cabo un estudio espectrofotométrico de UV-Vis comprendido
entre los 500 y 600 nm, como resultante de un estudio previo
efectuado de la estabilidad y convergencia espectrofotométrica de
la reacción a diferentes concentraciones de un estándar de NO3-,
de donde se obtuvo el coeficiente de extinción expresado como la
resultante de la diferencia de absorbancias (A) obtenidas a 572
y 587 nm (A572 - A587). Se determinó experimentalmente como
volumen de muestra un volumen de 20 µL de suero en donde
se adicionó de manera secuencial 100µL de VCl3 al 0.8% (p/v)
en H3PO4 1 M, 50 µL de sulfanilamida al 2% (p/v) en H3PO4 al
5% (v/v) y 50 µL de diclorhidrato de N-(1-naftil)etilendiamina
al 0.2% (p/v), incubándose a temperatura ambiente durante
45 minutos. Posteriormente, se evaluó la linealidad, exactitud
y precisión del método analítico, utilizando como documento
guía al Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation,
editado por el U.S. Department of Health and Human Services,
la Food and Drug Administration (FDA), el Center for Drug
Evaluation and Research (CDER) y el Center for Veterinary
Medicine (CVM).16
 la reacción de Griess se observa en la figura 5. La superposición
Resultados de estos espectros de absorción en la región ultravioleta-visible
UV-Vis se contrastan en la figura 4. El diazocompuesto formado
Selectividad del sistema analítico presenta una banda de absorción en la región UV-Vis a una lon-
para disoluciones acuosas gitud de onda de 540 nm, por lo que la ausencia de una banda en
la longitud de onda de máxima absorción (540 nm) en todos los
Se obtuvieron, para cada anión, los resultados mostrados en la espectros de UV-Vis obtenidos para cada anión diferente al analito
figura 4. El espectro de absorción del diazocompuesto formado por de interés permite inferir que el sistema analítico es selectivo.

Figura 4. Espectro de UV-Vis de los aniones utilizados (SO42-, PO43- y SO32- (espectros A, B y C respectivamente) en el intervalo de 0 a 1100 nm

Figura 5. Evaluación de la selectividad del método analítico para disolución acuosa.

Se superponen los espectros de absorción de UV-Vis de los reactivos utilizados y los aniones utilizados (SO42-, PO43- y SO32-)
con el diazocompuesto colorido formado en la reacción, nfiriéndose así que el método analítico es selectivo

35
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

acuosas muestra un límite de detección de 0.01 µM y el límite

Linealidad del sistema y método analítico
en disoluciones acuosas fuertemente electrolíticas
(disolución de Krebs-Henseleit)
Se obtuvieron las gráficas mostradas en las figuras 6 y 7. Para el
sistema analítico, se cumple con que el coeficiente de determina-
ción (r2) es mayor a 0.98, por lo que el sistema analítico es lineal.
Bajo estas condiciones, el sistema analítico para disoluciones
de cuantificación de 0.04 µM, respectivamente.
Respecto a la linealidad del método analítico para disolu-
ciones acuosas, se obtiene un coeficiente de recobro analítico
promedio del 100.3% un coeficiente de variación del 1.4%, una
pendiente cercana a la unidad y una ordenada al origen cercana
a cero, con un r2 de 0.9996. Así, el método analítico puede con-
siderarse lineal bajo los criterios de aceptación de la ICH.

Figura 6. Evaluación de la lineallidad del sistema analítico en disolución acuosa.

Cada punto de la gráfica es el promedio de los datos obtenidos (n=9), obteniendo una ecuación de regresión lineal simple promedio igual a
y=0.0015x + 0.0068 (r2 = 0.9915). Límite de detección = 0.01 µM; Límite de cuantificación = 0.04 µM. Debido a que las barras de error
estándar son más pequeñas respecto al símbolo, éstas se omiten.

Figura 7. Evaluación de la linealidad del método analítico en disolución acuosa.

Cada punto de la gráfica es el promedio de los datos obtenidos (n=9), obteniendo una ecuación de regresión lineal simple promedio igual a
y=1.0187x + 0.3112 (r2 = 0.9996). Debido a que las barras de error estándar son más pequeñas respecto al símbolo, éstas se omiten.

36

Linealidad del sistema
y método analítico en fluidos biológicos
Como muestra biológica, se utilizó suero humano, obtenido
según se describe en Materiales y Métodos. Bajo las con-
diciones de análisis establecidas, se obtuvo la linealidad del
sistema analítico mostrada en la figura 8, obteniéndose un r2
de 0.9997, en el intervalo de concentración de 0 a 40 µM, un
límite de detección de 0.69 pM y un límite de cuantificación
de 2.10 pM, por lo que el sistema analítico para fluidos
biológicos es lineal.
Respecto al método analítico (figura 9), se observa que es lineal,
con un porcentaje de recobro analítico promedio del 101.9% y un
coeficiente de variación del 1.4511%, cumpliéndose, además, que la
gráfica respectiva de cantidad recuperada en función de la cantidad
adicionada muestra una pendiente aproximadamente igual a la
unidad y una ordenada al origen aproximadamente cero. Por ello, el
método analítico para fluidos biológicos se considera lineal.

Figura 8. Evaluación de la linealidad del sistema analítico para el análisis de fluídos biológicos.
Cada punto de la gráfica es el promedio de los datos obtenidos (n=9), obteniendo una ecuación de regresión lineal simple promedio igual a
y=0.0004x - 1x10-4 (r2 = 0.9973). Límite de detección = 0.69 pM; Límite de cuantificación = 2.10 pM. Debido a que las barras de error
estándar son más pequeñas respecto al símbolo, éstas se omiten.

Figura 9. Evaluación de la linealidad del método analítico para el análisis de fluídos biológicos.
Cada punto de la gráfica es el promedio de los datos obtenidos (n=9), obteniendo una ecuación de regresión lineal simple promedio igual a
y=1,047x + 0.0148 (r2 = 1.0000). Debido a que las barras de error estándar son más pequeñas respecto al símbolo, éstas se omiten.

37
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

Análisis de la exactitud del método analítico
para el análisis de fluidos biológicos
Bajo las condiciones de análisis establecidas para fluidos
biológicos, se obtienen los resultados mostrados en la tabla
2. Como se observa, se cumplen con los requisitos necesarios
para que un método analítico sea considerado como exacto
pues se obtiene un porcentaje de recobro analítico promedio
entre 80.0-120.0%, además de un coeficiente de variación
menor o igual al 15%.16

Tabla 2. Exactitud de método analítico. Análisis de fluidos biológicos

C.A.(µM) C.R. 1 (µM) C.R. 2 (µM) C.R. 3 (µM) P.R. 1(%) P.R. 2(%) P.R. 3(%) P.R.P. (%) Sx Es CV (%)

0 0.0 0.0 0.0 100.0 100.0 100.0 100.0 0.0000 N.C. N.C.
5 5.2 5.1 5.1 103.0 102.8 102.4 102.7 0.3055 0.1764 0.3
10 10.3 10.3 10.2 103.0 102.5 102.0 102.5 0.5000 0.2887 0.5
15 15.9 16.3 16.0 103.0 103.0 103.0 102.5 0.0000 0.0000 0.0
20 20.7 20.7 20.7 103.5 103.4 103.3 103.4 0.1258 0.0726 0.1
30 31.7 32.9 32.0 103.5 103.5 103.5 103.4 0.0000 0.0000 0.0
40 40.3 40.3 40.3 100.6 100.7 100.8 100.7 0.0629 0.0363 0.1

P.R.P(%) = 102.2

Sx = 0.1420 C.A. = Cantidad adicionada; C.R. = Cantidad Recuperada; P.R. = Porcentaje de recobro analítico;
CV (%) = 0.2 Sx = Desviación estándar; ES = Error estándar; CV (%) = Coeficiente de variación; N.C. = No calculado

Análisis de la precisión del método analítico
para el análisis de fluidos biológicos
Bajo las condiciones de análisis ya estipuladas en la sección de
Materiales y Métodos, se obtienen los resultados mostrados en
la tabla 3. Como se observa, se cumple con lo estipulado para
que un método analítico sea considerado como preciso pues se
obtiene un porcentaje de recobro analítico comprendido entre
80.0-120.0%, así como un coeficiente de variación menor o
igual al 15%.16
Discusión
Como se observa en la figura 1, la reacción colorimétrica de
Griess para la detección y cuantificación de nitritos (NO2-) y
nitratos (NO3-) involucra un paso de reducción previo con algún
metal reductor (como el Cd), o bien, una reducción enzimática.
Debido a que el Cd es un metal sumamente tóxico y, dado que
el costo de los kits comerciales es elevado, proponemos el uso
de vanadio, en su estado de oxidación 3+ como agente reductor.
Respecto a las propiedades químicas del vanadio, se sabe que
los estados de oxidación más altos del vanadio son 3+, 4+ y 5+
y éstos tienen importancia biológica. El estado de oxidación 3+
es demasiado reductor como para existir a pH neutro, pero a
pH fuertemente ácido, el vanadio se encuentra predominante-
mente en un estado de oxidación 3+. Desde luego, se encuentran
presentes otras especies debido a la aparición de equilibrios de
protonación y oligomerización que ocurren simultáneamente en
disolución acuosa, a cierta proporción, la cual depende del pH y
de la concentración total de vanadio.17 Respecto a su toxicidad,
ésta se presenta principalmente con la exposición a su óxido
(V2O5), que en forma de polvo está presente en varios procesos
industriales.18 Los órganos que se ven afectados con ello son hí-
gado y bazo.19 La inyección de 20 mg/kg de peso en ratas produce
necrosis severa en el tejido linfático y hemorragia pulmonar,20
pero la toxicidad va en aumento conforme se incrementa su estado
de oxidación. Así, el V5+ es más tóxico que el V3+.21
En el análisis de muestras biológicas, particularmente en el
caso de suero, la reacción de Griess convencional tiene limita-
ciones respecto a la sensibilidad (1 a 5 µM) por lo que se han
realizado varias modificaciones a este respecto. El límite de
cuantificación puede incrementarse utilizando dapsona en vez
de sulfanilamida, seguido de una ultracentrifugación (el límite
de cuantificación bajo estas condiciones es de 0.2 µM),22 o bien,
adicionando de manera secuencial los reactivos de Griess a una
temperatura de 4 °C.23 Bajo las condiciones de análisis para
fluidos biológicos propuestas en el presente trabajo, en el que se
realiza la adición secuencial de reactivos a temperatura ambiente,
el límite de cuantificación es 0.69 pM y el límite de detección es

38
 Tabla 3. Precisión del método analítico. Análisis de fluidos biológicos

C.A.(µM) C.R. 1 (µM) C.R. 2 (µM) C.R. 3 (µM) C.R.P. P.R. 1(%) P.R. 2(%) P.R. 3(%) P.R.P. (%) Sx Es CV (%)

0 0.0 0.0 0.0 0.0 N.C. N.C. N.C. N.C. N.C. N.C. N.C.
5 5.1 5.1 5.0 5.0 101.0 100.0 99.6 100.2 0.7195 0.4154 0.7
5 5.1 5.1 5.1 5.1 101.6 100.2 100.6 100.8 0.7239 0.4179 0.7
5 5.1 5.1 5.1 5.1 102.6 99.8 100.4 100.9 1.4740 0.8510 1.5
10 10.3 10.3 10.2 10.3 103.0 99.5 99.5 100.7 2.0130 1.1622 2.0
10 10.3 10.2 10.2 10.3 103.2 99.1 99.8 100.7 2.1821 1.2598 2.2
10 10.2 10.3 10.2 10.2 102.0 100.5 99.9 100.8 1.0820 0.6247 1.1
15 15.9 16.3 16.0 16.1 106.0 102.5 98.2 102.2 3.9283 2.2680 3.8
15 15.4 15.8 16.0 15.7 102.7 102.6 101.3 102.2 0.7895 0.4558 0.8
15 15.7 15.5 15.3 15.5 104.7 98.7 98.7 100.7 3.4345 1.9829 3.4
20 20.7 20.7 20.7 20.7 103.5 99.9 99.9 101.1 2.0906 1.2070 2.1
20 20.7 20.7 20.7 20.7 103.6 100.0 99.7 101.1 2.1686 1.2521 2.1
20 20.7 20.6 20.7 20.7 103.3 99.9 100.4 101.2 1.8087 1.0443 1.8
30 31.7 32.9 32.0 32.2 105.7 103.8 97.3 102.2 4.4095 2.5458 4.3
30 31.6 32.5 31.9 32.0 105.3 102.8 98.2 102.1 3.6459 2.1050 3.6
30 31.4 32.0 31.8 31.7 104.7 101.9 99.4 102.0 2.6466 1.5280 2.6
40 40.3 40.3 40.3 40.3 100.6 100.1 100.0 100.2 0.3252 0.1878 0.3
40 40.2 40.3 40.3 40.3 100.6 100.1 99.9 100.2 0.3612 0.2085 0.4
40 40.3 40.3 40.3 40.3 100.7 100.0 100.0 100.2 0.3946 0.2278 0.4

P.R.P(%) = 101.1 C.A. = Cantidad adicionada; C.R. = Cantidad Recuperada; P.R. = Porcentaje de recobro analítico;
Sx = Desviación estándar; ES = Error estándar; CV (%) = Coeficiente de variación; N.C. = No calculado
Sx = 1.8999
CV (%) = 1.9

2.10 pM. Respecto al porcentaje de recobro analítico de varios
kits comerciales, se reporta que generalmente oscila entre el 82.0
y el 94.0%,3 por lo que es evidente la necesidad de mejorar los
porcentajes de recobro analítico. Bajo las condiciones de análisis
propuestas, hemos encontrado que el vanadio, en su estado de oxi-
dación +3, permite obtener un método analítico cuyo porcentaje
de recobro analítico, en el análisis de muestras biológicas, oscile
entre 101.1 a 102.2% Respecto al coeficiente de variación, en
kits disponibles en el mercado, éste oscila entre el 2.2 al 6.7%,9
mientas que el coeficiente de variación para el método validado
en nuestro laboratorio se encuentra entre el 0.2 al 1.9%, lo que,
en conjunto, constituye una mejora sustancial respecto a los kits
disponibles actualmente en el mercado.
La elección de nitrato (NO3-) como analito radica en dos
hechos experimentales: (1) después de la inyección intravenosa de
una disolución de nitrito de sodio, la concentración en sangre de
nitrito disminuyó rápidamente siguiendo una cinética de primer
orden23 y (2) cuando se adiciona una disolución 5 µM de NO2-,
es convertido completamente a NO3- en aproximadamente 10
minutos.7 Adicionalmente, la vida media del anión nitrito en la
sangre es de 110 segundos, siendo su conversión dependiente
del pH y de la temperatura, pero independiente de la cantidad
de hemoglobina libre.24
Respecto al tratamiento de la muestra biológica, en la li-
teratura3,9,10 se sugiere llevar a cabo un tratamiento previo de
desproteinización para llevar a cabo la lectura a una longitud de
onda analítica de 540 nm. Utilizando un coeficiente de extinción
de A572-A587 nm, este paso de desproteinización no se requiere
(no se muestran los datos), lo que agiliza la corrida de análisis.
Adicionalmente, recientemente se ha demostrado que los an-
ticoagulantes (EDTA, citrato de sodio y heparina) interfieren
con la reacción de Griess puesto que se cuantifícan cantidades
mayores de aniones NO3-/NO2-.25 Respecto a las condiciones de
estabilidad de la muestra analítica, se ha podido establecer que,
una vez obtenida la sangre del paciente, es necesario centrifugarla
inmediantamente, y una vez separado el suero, almacenarlo a una
temperatura de -70 °C, permaneciendo así estable la muestra por
más de tres meses.

39
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Conclusiones
El método de Griess, modificado para los fines experimentales
de nuestro laboratorio y validado de acuerdo a la Guía de valida-
ción de métodos bioanalíticos editada conjuntamente por el U.S.
Department for Health and Human Services, la FDA, el CDER
y el CVM, ha mostrado ser un método analítico lineal, exacto y
preciso, con un porcentaje de recobro analítico y un coeficiente
de variación superiores a los calculados para kits disponibles
actualmente en el mercado, por lo que representa una alternativa
viable y rentable para la cuantificación de metabolitos estables
de óxido nítrico (NO3- y NO2-).
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41
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

1ra. PARTE

¿Qué sabe usted acerca de...Genómica?

¿What do you know about...Genomics?

Marisol López-López 1, Antonio Ulises López Gutiérrez1,

Teresita Del Rosario Sainz Espuñes1, Ana María Rosales Torres 2.
Departamento de Sistemas Biológicos1, Departamento Producción Agrícola y Animal2,
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco.

Preguntas

1.- ¿Qué es el genoma?

2.- ¿Qué es la genómica?
3.- ¿Qué es la genómica estructural?
4.- ¿Qué es la genómica funcional?
5.- ¿Qué es la genómica comparativa?
6.- ¿Qué es el proteoma y la proteómica?
7.- ¿Qué es el metaboloma y la metabolómica?

Respuestas
1.-El Genoma

El genoma comprende todo el material genético de un organismo y está constituido por ácido desoxirribonucleico o ADN. El
genoma es el manual de instrucciones para la vida donde se encuentran los genes a partir de los cuales se forman las proteínas, que
a su vez llevan a cabo las funciones de un organismo. Su tamaño es variable y generalmente se da en el número total de pares de
bases. Por ejemplo, el genoma humano (Homo sapiens) y el del ratón (Mus musculus) contienen 3000 millones de pares de bases,
mientras que el de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) contiene 180 millones de pares de bases y el de la bacteria Esche-
richia coli contiene 4.7 millones de pares de bases. El tamaño del genoma no correlaciona con el status evolutivo, ni es proporcional
al número de genes. El humano, el ratón, la mosca de la fruta y E. coli contienen aproximadamente 35,000, 30,000, 13,600 y 3,200
genes, respectivamente. La frase ADN genómico se usa para distinguirlo de otros tipos de ADN, como el ADN contenido en un
plásmido o en una mitocondria.

2.-Genómica

La genómica es una ciencia que se enfoca al estudio de los genomas así como los genes que contienen, sus funciones, las interacciones entre
ellos y con los factores ambientales. El estudio de los genomas incluye los mapas genómicos, las secuencias genómicas y las funciones génicas.
La genómica, por lo tanto, se puede considerar una rama de la genética que estudia los organismos en términos de sus genomas.

42
El Proyecto del Genoma Humano es el primer paso para el conocimiento de los humanos a nivel molecular. A partir de la fi-
nalización de la fase de secuenciación de los nucleótidos que lo constituyen, han surgido muchas preguntas que permanecen sin
respuesta, incluyendo la función de los 30, 000-35, 000 genes humanos estimados. Tampoco se sabe la función de los polimorfismos
de nucleótido sencillo (SNP, single nucleotide polymorphism), o de las regiones no codificantes y repetidas del genoma humano. Si la
era genómica pudiera tener una fecha precisa de nacimiento correspondería al 14 de abril del 2004. En esta fecha el Proyecto del
Genoma Humano puso fin a la era pregenómica con el anuncio de que había completado la última meta que se había propuesto,
la secuencia completa del genoma humano. La marcha del progreso de la genómica es ilustrada por el hecho de que esta meta se
alcanzó antes de lo previsto.

3.-Genómica estructural

La genómica estructural se enfoca a la identificación y estudio de las variantes estructurales de secuencia en los genomas. Dichas va-
riantes pueden ser polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), mutaciones, o cambios como repeticiones o inserciones de nucleótidos.
La genómica estructural estudia también las estructuras tridimensionales hasta ahora conocidas, de las proteínas y la función que éstas
realizan en los procesos bioquímicos de un organismo, utilizando técnicas experimentales y simulación por computadora.

4.-Genómica funcional

La genómica funcional es la rama de genómica que determina la función biológica de los genes y sus productos.

5.-Genómica comparativa

La genómica comparativa se enfoca al estudio comparativo de los genomas estructural y funcionalmente en organismos como el
humano, el ratón, la mosca de la fruta o bacterias como Escherichia coli. El propósito de esta rama de la genómica es obtener un
mejor entendimiento de cómo han evolucionado las especies y también es útil para determinar la función de los genes y de las
regiones no codificantes de los genomas. Los investigadores en genómica comparativa han aprendido sobre la función de los genes
humanos al examinar sus contrapartes en organismos modelos más simples como el ratón. Al comparar los genomas, estas inves-
tigaciones se enfocan a diferentes aspectos como son: similitud en las secuencias de las bases, localización de los genes, tamaño y
número de regiones codificantes (exones) en los genes, cantidad de DNA no codificante en cada genoma, y regiones altamente
conservadas que son mantenidas en organismos simples como bacterias y complejos como el humano. Los organismos modelo
ofrecen una forma barata y efectiva de estudiar la herencia de genes, similares a los genes humanos, a través de varias generaciones
en un tiempo relativamente corto.

En la jerga genómica, el término sintenia se ha usado para referirse a la conservación del orden de los genes entre segmentos
cromosómicos de uno o más organismos. Los mapas físicos proveen la forma más directa para caracterizar la magnitud de la sintenia,
ya que los loci (regiones de genes ordenados que codifican para una función determinada) altamente conservados que pueden verse
como homólogos (es decir, que derivan de un ancestro común) sirven de marcas de anclaje. Sin embargo, se deben usar métodos
filogenéticos apropiados para distinguir entre homólogos verdaderos -propiamente llamados ortólogos- y parálogos, que son genes
similares que surgieron como resultado de duplicaciones en una o ambas líneas subsecuentes a una división evolutiva. En muchos
casos, complejos de genes completos han sufrido duplicaciones múltiples, lo que vuelve difícil distinguir entre ortología y paralogía.
Esto puede ser crucial cuando los mapas físicos comparativos se emplean para sugerir la localización de un locus con efectos médicos
o de otros tipos basados en el ligamiento a una región de loci sinténicos. La magnitud de la conservación del orden de los genes es
una función inversa del tiempo transcurrido desde su divergencia de un locus ancestral, ya que se requieren rearreglos cromosómicos
para romper ligamientos génicos.

La genómica comparativa implica el uso de programas computacionales que pueden alinear genomas múltiples y buscar regiones
similares entre ellos. Algunas de estas herramientas de similitud entre secuencias están disponibles al público a través de internet.
Una de las más utilizadas es BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que es accesible a través del NCBI (Nacional Center for
Biotechnology Information), y que comprende una serie de programas diseñados para realizar búsquedas de similitud en todas las
bases de datos de las secuencias reportadas disponibles.

43
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

6.-Proteoma y la Proteómica

El proteoma es el conjunto de proteínas de una célula. A diferencia del relativamente invariable genoma, el proteoma es dinámico
y cambia minuto a minuto en respuesta a miles de señales ambientales intra y extra celulares. La estructura y el comportamiento de
una proteína están especificados por la secuencia génica y por el número e identidades de otras proteínas producidas en la misma
célula al mismo tiempo, y con las cuales se asocia y reacciona. La proteómica es el área científica que estudia y analiza la estructura y
función de las proteínas de una célula en forma global. La proteómica será la meta de muchas investigaciones futuras que ayudarán
a elucidar las bases moleculares de la salud y enfermedad.

7.-Metaboloma y la Metabolómica

El metaboloma se puede definir como la suma total de los sustratos, metabolitos, y otras pequeñas moléculas que están presentes
en una población de células, mientras que la metabolómica estudia la estructura y distribución de estas moléculas.

44
 Libros
Books

Surface Activity in Drug Action Capítulo 3. Teoría de acción de fármacos

Eds. R.C. Srivastava y A.N. Nagappa 3.1. Términos comúnmente usados
Elsevier 2005
3.2. Teoria de acción de fármacos

La actividad de superficie se presenta en los sistemas vivos, por 3.3. Teoría de ocupancia
ejemplo en los fluidos corporales, en el plasma celular en donde
la naturaleza de la actividad superficial de las macromoléculas
es crucial para su comportamiento y organización. El presente
Capitulo 4. Hipótesis de la membrana líquida
libro “Surface Activity in Drug Action” propone el estudio de
la interacción fármaco-receptor en los dominios de una mem- de la acción de fármacos
brana líquida donde se presentan las interacciones moleculares
generando así la respuesta farmacológica. 4.1. La hipótesis de la membrana líquida

Este libro se encuentra organizado en 8 capítulos, del primero 4.2. La hipótesis de la membrana líquida en la acción de
al séptimo se aboca al desarrollo de los conceptos teóricos de la fármacos
hipótesis plantada y el capitulo 8 contiene una serie de aplica-
ciones de actividad de superficies en la terapéutica. El contenido
y la presentación del presente libro permiten considerarlo de gran Capítulo 5. Membranas líquidas
interés para estudiantes e investigadores implicados en actividad como sistema biomimético
de superficies
5.1. Introducción

Contenido 5.2. Membranas líquidas para colesterol. Lecitina y mezclas

de colesterol lecitina
Capítulo 1. Introducción y panorama general 5.3. Transporte mimetizante fotoinducido

5.4. Rutas metabólicas hidrofílicas

Capítulo 2. Actividad superficial de fármacos
5.5. Excitabilidad eléctrica mimetizante de membranas
2.1. Analgésicos líquidas de bicapa

2.2. Antimicrobiales
Capítulo 6. Regla de membranas líquidas
2.3. Acción de fármacos sobre sistema nervioso autónomo en estudios experimentales de acción de fármacos
2.4. Antihistamínicos 6.1. El diseño de experimentos.

2.5. Fármacos que afectan la función renal y cardiovascular 6.2. Estudios experimentales

2.6. Acción de fármacos sobre sistema nervioso central

2.7. Misceláneos Capítulo 7. Establecimiento de la Hipótesis

45
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

7.1. Implicaciones de la hipótesis de xenobióticos no solo a nivel funcional, sino también a nivel
celular sobre el buen estado de los peces, lo cual resulta ser un
7.2. La hipótesis de la membrana líquida contrastada con tema clave en cuestión de salud ambiental y crítica para las
la teoría de acción de fármacos futuras poblaciones de peces.

Capítulo 8. Aplicaciones de actividad superficial Específicamente el presente volumen está dirigido al gremio
farmacéutico, sector industrial, investigadores y estudiantes,
en la terapéutica
debido a que se considera el impacto ambiental sobre esta espe-
cie de animales como monitoreo, de agentes emitidos al medio
8.1. Absorción de fármacos ambiente.

8.2. Agentes solubilizadores

Contenido
8.3. Disolución

8.4. Estabilización de fármacos

Prefacio

8.5. Sulfactantes en fármacos dirigidos Contribuciones

8.6. Sulfactantes como agentes humectantes
Abreviaturas
8.7. Efecto de sinergismo
1. Generalidades - Modelos y Técnicas
8.8. Pro fármacos
1. La utilidad del pez cebra como modelo para investiga-
8.9. Sulfactantes y liberación de fármacos ciones toxicológicas (M. J. Carvan III, T. K. Heiden, H.
Tomasiewicz).
8.10. Misceláneos
2. El uso de lineas celulares de peces en la toxicología y
ecotoxicología de peces (N. C. Bols et al.).

Environmental Toxicology 3. Avances en proteómica y geonómica para ecotoxicología

(N. D. Denslow, I. Knoebl, P. Larkin).
Eds T. P. Mommsen y T.W. Moon
Elsevier 2005
2. Biotransformaciones/Toxicocinética
Este libro es el sexto volumen de una serie que se aboca al
1. Interaciones entre lipidos y contaminantes orgánicos
estudio de las respuestas bioquímicas de peces a diferentes
persistentes (POPs) en peces (A. A. Elskus, T. K. Collier,
factores ambientales y ecológicos. Environmental Toxico-
E. Monosson).
logy aborda aspectos vitales que afectan la respuesta de los
peces a los químicos circundantes en el medio ambiente. Los
2. Metabolismo de lípidos (nonilfenoles) y compuestos
capítulos incluidos en este volumen identifica los sistemas
fenólicos relativos en peces ( J.-P. Cravedi, D. Zalko).
encontrados en peces para tratar con Xenobióticos, sistemas
de prueba para estudios toxicológicos, interacciones con
3. Biotransformación de pesticidas en peces (D. Schlenk).
hormonas en presencia de agentes químicos, así como se
discute el mecanismo empleado por los peces para ajustar los
7. Receptores de xenobióticos en peces: diversidad estruc-
agentes químicos presentes en el medio y su importancia en
tural, funcional y perspectivas devolución (M. E. Hahn, R.
el aspecto ecológico.
R. Merson, S. I. Karchner).
También incluye una profunda revisión de nuevos métodos
aplicados en sistemas de peces para el entendimiento de efectos
3. Cambios Celulares

46
 8. Impactos del medio ambiente tóxico y variables naturales b. Tiroides y Retinoides
sobre el sistema inmune de peces. (K. G. Burnett).
14 . Hormonas tiroideas ( J. G. Eales, S. B. Brown).
9. Modelos de carcinogénesis en peces (G. K. Ostrander, J.
M. Rotchell). 15. La biología y toxicología de retinoides en peces (D.
Alsop et al).
10. Metalotioneinas: estructuras y regulación (P. Kling,
P.-E. Olsson). c. Reproducción

11. Muerte celular: Investigación y aplicación en toxicolo- 16. Vitelo génesis y disrupción endocrina (N. Hirama-
gía de peces (A. W. Wood, D. M. Janz, G. Van der Kraak). tsu et al.).

5. Áreas emergentes
4. Aspectos endocrinológicos
17. La industria farmacéutica en el medio ambiente :
a. Estres y HPI axis Peces drogados? (V. L. Trudeau et al.).

12. Estrés y axis hipotálamo-pituitaria-interrenal: toxi- 18.Transporte de efluentes de P-glicoproteinas y xeno-

cología adrenal: efectos de la contaminación del medio bióticos en peces (A. Sturm, H. Segner).
ambiente sobre la estructura y función del HPI axis (A.
Hontela).
Índice por especies.
13. Impacto xenobiótico sobre la señalización de corti-
costeroides (M. M. Vijayan, P. Prunet, A. N. Boone). Índice por temas.

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Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005
Instrucciones a los autores
Generalidades
La Revista Mexicana de Ciencias Farma-céuticas
acepta para su publicación trabajos científicos, co-
municaciones técnicas originales e investigaciones
bibliográficas que sean de interés para la comunidad
farmacéutica.
Los trabajos recibidos serán turnados para
su evaluación inicial al Consejo Editorial y una
vez aceptados por éste se someterán a un arbitraje
externo. Los árbitros externos serán expertos reco-
nocidos en su campo, seleccionados por el Consejo
Editorial.
La Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas se
reserva todos los derechos de programación, impresión
o reproducción (copyright) total o parcial del material
que reciba, dando en todo caso el crédito correspon-
diente a los autores. Los trabajos se corregirán en
caso de contener errores sintácticos u ortográficos.
Los artículos deberán enviarse a la dirección
de la Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas:
Nicolás San Juan 1511, CP 03100 México, D.F.,
sede de la Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
Los trabajos deberán presentarse mecano-
grafiados a doble espacio en hojas de papel blanco
grueso tamaño carta (21.5 x 28 cm, aproximadamen-
te), escritos exclusivamente por un lado, dejando
márgenes de 2.5 cm. El tipo de letra empleado deberá
ser Times New Roman de 12 puntos. Las páginas
deberán numerarse en forma consecutiva anotando el
número en la parte central inferior de cada hoja. Se
comenzará con la página del título. Cada sección
se iniciará en página nueva. Las letras mayúsculas
deberán acentuarse.
Los trabajos deberán enviarse por tripli-
cado (un original y dos copias) y una copia adicional
en disquete de 3.5” indicando el procesador de textos
y la versión utilizados. Los trabajos se acompañarán
de una carta firmada por todos los autores donde se
establezca que el trabajo ha sido revisado y aprobado
por los participantes y que se cuenta con la autori-
zación de la institución donde se realizó el trabajo,
para su publicación.
Contenido
I. Trabajos científicos
Son informes de resultados de investigaciones
relacionadas con las siguientes áreas: tecnología
farmacéutica, farmacia clínica, desarrollo farmacéu-
tico, desarrollo analítico, química farmacéutica,
biofarmacia, validación, farmacología, toxicología,
microbiología farmacéutica, productos biológicos y
biotecnología, obtención de fármacos (de productos
naturales o por síntesis) e investigación en educación
farmacéutica.
El trabajo deberá dividirse en las siguientes secciones:
48
1. Título en español y en inglés.
2. Resumen en español.
3. Resumen en inglés.
4. Introducción.
5. Material y métodos.
6. Resultados y discusión.
7. Conclusiones.
8. Referencias bibliográficas.
9. Reconocimientos (optativo).
1. Título.
En esta hoja se anota:
–Título del trabajo en español y en inglés.
–Clasificación del trabajo presentado (trabajo científico,
comunicación técnica o revisión bibliográfica).
– Nombre, apellido paterno e inicial del apellido
materno de los autores.
– Nombre y dirección de la institución donde
trabajan los autores.
– Nombre del autor responsable de la publicación,
dirección completa, número telefónico, número de
fax y, de ser posible, dirección de correo electrónico.
2. Resumen en español.
En la siguiente hoja se anotará un resumen del trabajo
de 130 palabras como máximo, donde en forma clara
y precisa se describa el objetivo del trabajo, el método
empleado, los principales resultados obtenidos y
las conclusiones finales, así como las palabras clave.
3. Resumen en inglés.
Traducción al inglés del resumen en español,
incluyendo palabras clave.
4. Introducción.
En esta sección debe indicarse el propósito del trabajo y
los antecedentes que fundamentan el estudio.
5. Material y métodos.
Deberá especificar el material y los aparatos
empleados con el nombre del fabricante entre
paréntesis, así como los reactivos utilizados con sus
marcas comerciales respectivas.
Se deberá describir en forma clara la metodología
seguida en el desarrollo del trabajo, con el detalle su-
ficiente para permitir a otros investigadores reproducir
el mismo estudio.
6. Resultados y discusión.
Aquí se describen todos los resultados obtenidos,
procurando agruparlos en tablas o en figuras, que
faciliten su interpretación y evitando utilizar ambas
para ilustrar los mismos resultados. Se emplearán
números arábigos para designarlas. Los resul-
tados mostrados deberán tener una secuencia lógica
con el texto.
La discusión deberá incluir las impli-caciones de los
resultados y relacionar las observaciones obtenidas
con otros estudios relevantes.
7. Conclusiones.
Se describirán en forma concisa las principales
conclusiones que puedan inferirse de manera objetiva
a partir de los resultados obtenidos.
8. Referencias bibliográficas.
Las referencias bibliográficas deberán contener
únicamente trabajos publicados y artículos en pren-
sa, y se ordenarán numéricamente de acuerdo
con la secuencia de aparición en el texto, donde
figurará solamente el número arábigo progresivo
correspondiente. A continuación se muestran algunos
ejemplos:
Revistas:
Hurtado de la P. M., Medina L. J. R. y Domínguez
R. A. M. 1995. Validación de un método analítico
para la cuantificación de acetaminofén en orina.
Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas,
25(6): 21-24.
Libros:
Yeung E. S. 1995. Optical detectors for capillary
electrophoresis. En: Brown P. R. y Grushka E. (eds.),
Advances in Chromatography. Marcel Dekker,
Nueva York, vol. 35, pp. 1-52.
Lachman L., Lieberman H. y Kaning J. L. 1986. The
theory and practice of industrial pharmac., 3a. ed. Lea
& Febiger, Filadelfia, p. 170.
9. Reconocimientos (optativo).
Mención de la institución u organismo que apoyó
la realización del trabajo. En este rubro podrán
incluirse agradecimientos a personas que de alguna
manera hayan colaborado con el trabajo.
II: Comunicaciones técnicas
Son artículos donde se describen los avances lo-
grados en alguna rama de las ciencias farmacéuticas
o en algún campo de interés para los lectores de la
revista. En este rubro se pueden incluir, entre otros,
artículos sobre educación, administración y legislación
farmacéutica.
Estos trabajos deberán contar con los rubros 1, 2,
3, 4, 7 y 8 descritos para los trabajos científicos,
además del desarrollo del tema.
III. Revisiones bibliográficas
Son trabajos en los que se describe, clasifica y
analiza lo publicado sobre un tema en particular.
Deberán incluir un mínimo de 30 citas bibliográficas
y contar con los rubros 1, 2, 3, 4, 7 y 8 descritos para
los trabajos científicos, además del desarrollo del
trabajo. Estos trabajos deberán ser de gran interés
para la comunidad farmacéutica.