Manual de Laboratorio de Química Analítica 228 para Química

EXPERIMENTO # 7

DETERMINACIÓN DE CAFEINA Y ACIDO BENZOICO EN BEBIDAS

REFRESCANTES MEDIANTE HPLC

I. OBJETIVOS

• Entender el fundamento de la cromatografía de líquidos.

• Aprender el manejo de un equipo de HPLC.
• Determinar el contenido de cafeína y ácido benzoico presente en una bebida de Coca
cola.

II. MARCO TEÓRICO

Las bebidas conocidas popularmente como refrescos o bebidas refrescantes son bebidas no
alcohólicas preparadas, principalmente, a base de agua potable o mineral. En función de su
composición atienden a distintas denominaciones. Así, las bebidas de cola se consideran bebidas
refrescantes de extractos y son elaboradas con extractos de frutas o de partes de plantas
comestibles. En las bebidas refrescantes se permite la adición de una cantidad variable de azúcar,
además de un gran número de aditivos.

La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas que se adiciona en algunas bebidas refrescantes
por su acción estimulante. En los refrescos de cola, este compuesto procede del extracto de nuez
de cola. Un fruto tropical que la contiene de modo natural. La cafeína se encuentra además en
muchos alimentos de uso cotidiano como el café, el té y el chocolate. El aspartamo (E951) es un
edulcorante artificial no calórico descubierto en 1965 y comercializado en los años 80. Es un polvo
blanco en incoloro, unas 200 veces más dulce que la sacarosa que se emplean numerosos alimentos
bajos en calorías o "light". Cuando se encuentra seco o congelado es estable pero cuando se
conserva en medio líquido a temperaturas superiores a 30°C se descompone y pierde su poder
edulcorante. El ácido benzoico (E-210) es uno de los conservantes más utilizados. Es un compuesto
que presenta un anillo aromático y es un sólido incoloro poco soluble en agua fría pero bastante
soluble en agua caliente o disolventes orgánicos. Es muy útil contra mohos, levaduras y bacterias en
alimento de carácter ácido, por lo que es muy utilizado como conservante en bebidas refrescantes.

Preparado por: Mariel Monrroy y Lilibeth Miranda

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Cafeína Ácido Benzoico

De entre los distintos métodos existentes para llevar a cabo la determinación cuantitativa de aditivos
en alimentos, cabe destacar las técnicas cromatográficas, como la cromatografía líquida de alta
eficacia y la cromatografía de gases, y las técnicas electro analíticas. En esta práctica se va a llevar
a cabo la cuantificación de cafeína y ácido benzoico en una bebida de cola light mediante HPLC en
fase inversa con detección ultravioleta.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

HPLC-UV, matraces aforados de 10, 50, 250 y 500 mL, pipeta graduada de 1 y 2 mL, probeta de 100
y 50 mL, balanza analítica, columna cromatográfica C 18, jeringas, pipetas aforadas de 5 mL, pipetas
Pasteur, vasos químicos de 100 mL, baño de ultrasonidos, micro jeringa de 100 µL, filtro de
membrana de nylon, ácido benzoico, cafeína, metanol para HPLC, muestra de bebidas refrescantes,
ácido fosfórico para HPLC, agua Milli Q.

IV. FASE EXPERIMENTAL

A. Preparación de disoluciones:

Disolución de ácido fosfórico al 0,5% (v/v). Se transfieren 2,5 mL de ácido fosfórico comercial a
un matraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua Milli Q.

Disolución de la fase móvil metanol/ácido fosfórico 0,5% (30/70, v/v). Se transfieren 75 mL de

la disolución de ácido fosfórico al 0,5% a un matraz aforado de 250 mL y se completan con metanol
para HPLC hasta el enrase. Si la bomba es binaria pueden trabajar las soluciones en recipientes
separados.

Disolución madre de cafeína 1000 ppm (p/v). Se disuelven 0,010 g de cafeína en

aproximadamente 5 mL de agua Milli Q. La disolución resultante se transfiere a un matraz aforado
Preparado por: Mariel Monrroy y Lilibeth Miranda
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de 10 mL y se enrasa con agua Milli Q.

Disolución madre de ácido benzoico 1000 ppm. Se disuelven 0,010 g de ácido benzoico en
aproximadamente 5 mL de agua Milli Q. La disolución resultante se transfiere a un matraz aforado
de 10 mL y se enrasa con agua Milli Q.

A partir de las disoluciones madre de cafeína y ácido benzoico de 1000 ppm se prepararán cinco
disoluciones patrón de 10 mL que contengan concentraciones entre 10 y 50 ppm y se enrasan con la
disolución de la fase móvil. Las disoluciones serán empleadas en la construcción de las curvas de
calibración.

B. Determinación de cafeína y ácido benzoico

Preparación de la muestra

Tipos de muestra a analizar: bebida Coca cola sin purificar y extractos obtenidos por SPE.

• Colocar 5 mL de la muestra sin purificar en un matraz aforado de 10 mL y enrasar con fase

móvil.
• Colocar 2.5 mL de la muestra purificada en un matraz aforado de 5 mL y enrasar con fase
móvil.
• Filtrar la muestra a través de un filtro de 0,22 µm.

C. Condiciones operacionales del HPLC para análisis de carbohidratos

Flujo: 0.5, 0.75 y 1.0 ml/min,

Columna Sorbax SB C18
Temperatura ambiente
Detector UV: 270 nm
Volumen de muestra: 40 µL.

D. Primera semana

• Se variará el flujo (0.5, 0.75 y 1.0 ml/min). Se seleccionará el flujo que presente la mejor
resolución de los analitos y eficiencia de la columna.
• Se inyectarán las disoluciones patrón de cafeína y acido benzoico
Preparado por: Mariel Monrroy y Lilibeth Miranda
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• Se construirá la curva de calibración.

E. Segunda semana

• Se inyectarán las muestras.

• Se determinará el contenido de cafeína y acido benzoico en las muestras

1. Calcular el factor de separación y la resolución entre ambos analitos en las condiciones de

trabajo.

2. Comparar los cromatogramas entre las muestras purificadas y no purificadas.

3. Obtener la concentración de cafeína y ácido benzoico en las bebidas expresada en porcentaje
en a partir de la ecuación de la recta de calibrado.

V. CUESTIONARIO

1. ¿Se puede modificar el espectro de absorción UV de un compuesto en función del pH?

2. Describa el detector y columna empleada en esta experiencia de laboratorio.
3. ¿Qué tipo de bomba se empleó en la práctica de laboratorio?
4. ¿Cómo se puede predecir el orden de elusión de los analitos en cromatografía en fase reversa?
5. ¿Cómo se puede aumentar la fuerza de elución en cromatografía en fase reversa?
6. ¿De qué depende la eficacia de una columna cromatográfica y como se puede mejorar? ¿Qué
variables cromatográficas afectan la eficacia de la columna?
7. ¿Qué significa resolución de la columna cromatográfica y como se puede mejorar?

Referencias

1. Sierra I., Pérez D., Morante S., Pérez Y., Ballesteros R., Sánchez A. 2008. Prácticas de
análisis instrumental. 1era ed. Universidad Rey Juan Carlos. Dykison, SI. Madrid.

Preparado por: Mariel Monrroy y Lilibeth Miranda