Objetivo: Identificar molecularmente especies de Umbelopsis y Mortierella en plantas de

Arandano.

Descripciones y ecologia de hongos endófitos del genero Umbelopsis y Mortierella

Los endófitos fúngicos viven ampliamente dentro de los tejidos vegetales y se ha revelado
que algunos brindan beneficios a su huésped y al medio ambiente ecológico. Teniendo en
cuenta el hecho de que los endófitos participan en interacciones a largo plazo notablemente
estables con el huésped durante todo su ciclo de vida, es concebible que ambos socios
tengan una influencia sustancial en los procesos metabólicos del otro. (Dan
Quin,2018).Algunos hongos endofíticos coexistentes se consideran mutualistas de plantas:
reciben nutrición y protección de la planta huésped para proliferar, mientras que la planta
huésped puede beneficiarse de capacidades competitivas mejoradas y mayores tolerancias
a patógenos, herbívoros y diversas tensiones abióticas ( Schulz y Boyle , 2005 ; Kusari et al.,
2012 ). Sin lugar a dudas, la clave para comprender las funciones endofíticas es dilucidar los
mecanismos involucrados en las interacciones planta-endofito (Herre et al., 2007 ). Sin
embargo, los mecanismos de interacción hongo-planta no se han discernido completamente
debido a la complejidad y diversidad de los socios relacionados (Rodríguez et al., 2009 ; de
Siqueira et al., 2017 ). Es esencial emplear sistemas simplificados para investigar las
interacciones de hongos y plantas hospederas . Algunos informes han demostrado que los
hongos endofíticos pueden afectar significativamente la formación de productos metabólicos
en las plantas, como inducir el metabolismo del huésped y transformar los componentes del
huésped, y viceversa ( Qawasmeh et al., 2012 ; Tian et al., 2014 ; Ludwig-Müller, 2015 ). Se
estima que solo un 5% de las especies fúngicas existentes han sido registradas y descritas
(Hawksworth, 2001). Mortierelliales es uno de los órdenes más abundantes y diversos de los
hongos basales y hay cerca de 100 especies descritas en 13 géneros de la familia
Mortierellaceae (Yadav et al., 2014).Las especies que pertenecen a este género se
caracterizan por la producción de un micelio principalmente coenocítico pero de tabique
irregular. Los esporangióforos son simples o de diversas ramas, terminan con esporangios y
ocasionalmente con una hinchazón en la base. Los esporangios son globosos, con múltiples
o pocas esporas, o una sola espora. Especies deMortierella se aísla frecuentemente del suelo
y de tejidos vegetales muertos o moribundos, agua dulce o de muestras fecales de animales.
En varios estudios se ha demostrado que algunas especies de Mortierella pueden acumular
ácidos araquidónico, gamma-linolénico, eicosapentaenoico y docosahexaenoico en el micelio
(Ho et al.,2007; Dedyukhina et al., 2014) Estos compuestos están involucrados en la
inducción de resistencia a fitopatógenos en plantas de importancia agrícola (Zlotek and
Wojcik, 2014). En la taxonomía basada en la morfología, el género Mortierella se divide en
nueve secciones: Actinomortierella , Alpina , Haplosporangium , Hygrophila , Mortierella ,
Schmuckeri , Simplex , Spinosay Stylospora [ 16 ]. Sin embargo, los análisis moleculares
recientes no respaldan este sistema de clasificación. Sobre la base de las secuencias de las
regiones de ADNr espaciador transcrito interno (ITS), Wagner et al. [ 5 ] reclasificó este género
a siete grupos: " selenospora y parvispora ", " verticillata- humillis "," lignicola "," mutabillis ,
globulifera y angusta "," estrangulado y wolfii "," alpina y polycephala "y" gamsii ".

Aislamientos

Aislamiento de Mortierella
Se utiliza usualmente Agar Dextrosa Papa(PDA) y agr V8, asi como sustratos naturales para
aislar Mortierella. como peras maduras y hojas de azalea, como sustratos trampa. La siguiente
metodologia es para ailsar Mortierella. Se utilizo dos medios de cultivo (Agar Dextrosa Papa
y agar V8). Los medios agar-dextrosa-papa (PDA; BD Bioxon) y agar V8 [jugo V8, carbonato
de calcio (CaCO3 ) - agar] contenían antibióticos [oxitetraciclina, 0.01 g/L; rifampicina, 0.03
g/L; pimaricina, 0.01 g/L, y 66.8 µL/L de un formulado fungicida con hymexazol (Summit
Agro, México]. El aislamiento de cepas de Mortierella en agar V8 se llevó a cabo con y sin
frutos de pera (Pyrus communis L.) y hojas de azalea (Rhododendron simsii Planch.) como
sustratos trampa. Para el aislamiento en PDA y agar V8 sin sustratos trampa, se prepararon
diluciones seriadas (1:10) en tubos de ensayo con 9 mL de agua estéril de peptona (peptona al
0.1% y NaCl al 0.85% en agua destilada), a las que se agregó 1 g de suelo previamente tamizado
para generar diluciones de 10(3) , 10(4) y 10(5) . Utilizando la técnica de difusión, las alícuotas
(50 µL) de cada suspensión se distribuyeron por triplicado en cajas de Petri de 90 mm que
contenían uno de los medios. Posteriormente, las cajas de Petri se incubaron a 28 ± 1 °C por
72 h en una cámara ambiental sin luz (Precision Scientific, Winchester, VA, EUA).

Extracción de DNA genómico de Mortierella y su identificación molecular

La extracción de ADN genómico (ADNg) se realizó de acuerdo con el método de Raeder y

Broda (1985) y Ruiz-Cisneros et al. (2017). El ADNg se utilizó para amplificar la región
espaciadora interna transcrita (ITS) del gen 18S ADNr con iniciadores universales ITS5 (5’–
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG–3’) e ITS4 (5’–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3’)
(White et al., 1990)). La amplificación se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita por
Ruiz-Cisneros et al. (2017). Los productos de PCR fueron examinados por electroforesis en gel
de agarosa al 1%. Posteriormente, los productos fueron secuenciados por Macrogen Company
(Rockville, MD, EUA). Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del NCBI
mediante el algoritmo de BLAST (Altschul et al., 1990) para verificar el porcentaje de
identidad correspondiente a las especies analizadas. Además, se construyó un árbol
filogenético, por el método de máxima verosimilitud, a fin de observar el agrupamiento de los
hongos Mortierellales, para lo cual se utilizó el software Mega versión 6.0 (Tamura et al.,
2013).). La amplificación se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita por Ruiz-
Cisneros et al. (2017). Los productos de PCR fueron examinados por electroforesis en gel de
agarosa al 1%. Posteriormente, los productos fueron secuenciados por Macrogen Company
(Rockville, MD, EUA). Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del NCBI
mediante el algoritmo de BLAST (Altschul et al., 1990) para verificar el porcentaje de
identidad correspondiente a las especies analizadas. Además, se construyó un árbol
filogenético, por el método de máxima verosimilitud, a fin de observar el agrupamiento de los
hongos Mortierellales, para lo cual se utilizó el software Mega versión 6.0 (Tamura et al.,
2013).
Fuente:

En el siguiente articulo tambien identifican molecularmente especies de Mortierella a traves de

los ITS 4 y IT5, ademas de las sub unidades grandes(LSU) de secuencias de DNArib.

Confirmación molecular y morfológica de tres especies no descritas de Mortierella de

Corea
Thuong TT Nguyen , Parque Se Won , Monmi Pangging ,y Hyang Burm Lee

Se descubrieron tres aislamientos de hongos designados como CNUFC-YR329-1, CNUFC-

PTS103-1 y CNUFC-PTS2-1 durante un estudio de la diversidad de hongos del orden
Mortierellales de muestras de suelo de rizosfera de agua dulce y pino en Corea. Las cepas se
analizaron morfológicamente y filogenéticamente en base al espaciador transcrito interno (ITS)
y la subunidad grande (LSU) de secuencias de genes de ADN ribosómico. Según su morfología
y filogenia, los tres aislamientos se identificaron como Mortierella elongata , M. horticola y M.
humilis , respectivament

Extracción de ADN, PCR y secuenciación

El ADN genómico se extrajo directamente del micelio de los aislamientos fúngicos, utilizando
el Kit de preparación de ADN genómico (Solgent Co. Ltd., Daejeon, Corea del Sur). La región
ITS y el ARN ribosómico de la subunidad grande (LSU) se amplificaron con los pares de
cebadores ITS4 e ITS5 [ 22 ], y LROR y LR5F [ 23 ], respectivamente. La mezcla de
amplificación por PCR (volumen total, 20 μL) contenía una plantilla de ADN fúngico, 5 pmol
/ μL de cada cebador y Accupower PCR Premix ( Taq ADN polimerasa, dNTP, tampón y un
tinte de rastreo; Bioneer Corp., Daejeon, Corea) . Los productos de PCR se purificaron usando
el kit de purificación de PCR Accuprep (Bioneer Corp.) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La secuenciación de ADN se realizó en un secuenciador de ADN automatizado ABI
3700 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE. UU.). Análisis filogenético

Las secuencias fúngicas ( Tabla 1 ) se alinearon inicialmente utilizando el software Clustal_X

v.2.1 [ 24 ] y Bioedit v. 7.2.6 [ 25 ]. Los análisis filogenéticos se realizaron con MEGA 6 con
la configuración predeterminada [ 26 ]. Los árboles filogenéticos se construyeron utilizando el
análisis de máxima verosimilitud (ML) con las secuencias ITS y LSU. Las secuencias de
Mortierella wolfii y Umbelopsis isabellina se utilizaron como grupos externos. La identidad de
la secuencia se determinó utilizando la herramienta de búsqueda de alineación local básica de
nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (BLASTn).

Tabla 1.

Tablas, números de colección, secuencias y números de acceso de GenBank utilizados en este estudio.

GenBank no.

Nombre del taxón N. ° de colección (N. ° de aislamiento) SUS 28S

Mortierella alpina CBS 219.35 KC018359

M . bisporalis CBS 145.69 JX975857 KC018377

M . camargensis CBS 221.58 JX975949 HQ667408

M . clonocystis CBS 357.76 JX975899 HQ667395

M . elongata FSU 823 KC018279

M . elongata FSU 822 JX975978

 M . elongata CBS 276.89 JX976111 KC018452

M . elongata CBS 126.71 JX976101

M . elongata CBS 279.62 JX976089 KC018417

M . elongata CBS 110517 KC018348

M . elongata IHBF 2303 MF326586

Identificación molecular de Umbelopsis

Extracción de ADN, amplificación por PCR, secuenciación y análisis filogenético

El hongo endofítico SWUKD3.1410 se inoculó en caldo de papa dextrosa (PDB) y se cultivó
a 28 ° C durante 3 días. Luego, el hongo rejuvenecido se volvió a inocular en matraces
Erlenmeyer de 250 ml que contenían 70 ml de caldo y se incubaron a 180 rpm a 28 ° C durante
7 días. Finalmente, el cultivo se cosechó por centrifugación a 12,000 rpm durante 10 min. El
ADN genómico se extrajo de 0,5 a 1 g de micelios refrigerados en nitrógeno líquido utilizando
el método CTAB ( Zhang et al., 2006 ). Los fragmentos fúngicos ITS (ADNr ITS1-5.8S-ITS2)
se amplificaron utilizando los cebadores universales ITS1 e ITS4 ( White et al., 1990 ). Las
mezclas de reacción de PCR (25 μL) contenían 1 μl de ADN genómico, 2.5 μl de tampón de
PCR, 2 μl de MgCl 2, 2 μl de cebadores directo e inverso, 2 μl de desoxirribonucleótido
trifosfato (dNTP), 0.25 μl de rTaq polimerasa (TaKaRa Biotechnology, Ltd., China) y 13.25 μl
de agua doblemente destilada. La reacción de PCR se compuso de una etapa de
desnaturalización inicial a 94 ° C durante 3 minutos, seguida de 32 ciclos de amplificación a
94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 90 s, y una extensión final a 72 ° C
durante 10 min. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa
y se purificaron utilizando un kit de extracción de gel de ADN (Omega Biotechnology, Ltd.,
China). El producto de PCR purificado se secuenció usando los mismos cebadores (BGI-
Beijing, Beijing, China)

Alternativo método.

DNA techniques DNA extraction The harvested mycelium was ground in a mortar with a pistil
in liquid nitrogen. Genomic DNA was isolated using a previously described protocol (Meyer
& Mitchell 1995), dissolved in deionized water, quantified spectrophometrically and stored at
4 xC or at x20 x. rDNA amplification The internal transcribed spacer regions of the rDNA gene
cluster, consisting of ITS-1, the 5.8S rDNA gene and ITS-2, were amplified with primers,
homologous to conservative sequences within the small subunit (SSU) rDNA gene (primer
SR6R: 5k AAGTATAAGTCGTAACAAGG 3k) and the large subunit (LSU) rDNA gene
(primer LR1: 5k GGTTGGTTTCTTTCCT 3k). To amplify the ITS1 region alone, the primer
SR6R in combination with a primer located in the 5.8S rDNA gene (primer 5.8S: 5k
CGCTGCGTTCTTCATCG 3k) were used. For the RFLP analysis, a fragment of the rDNA
gene cluster, including the ITS1, 5.8S gene, ITS2 regions as well as the 5k end of the LSU
gene, were amplified as a single fragment with the primers SR6R and LR7 (5k
TACTACCACCAAGATCT 3k) located 3 prime to the D2 region of the LSU gene (all LSU
primers developed by Rytas Vilgalys (Duke University, Durham, NC;
www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/ primer.htm). Amplification of the rDNA gene
fragments was performed as described previously (Vilgalys & Hesters 1990, Gams & Meyer
1998).

Estrategia:

Amplificar los ITS5 e ITS4:

ITS5 (5’–GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG–3’) e ITS4 (5’–
TCCTCCGCTTATTGATATGC–3’)

Y el RLU de la subunidad Ribosomañ

5GGTTGGTTTCTTTCCT 3.
5TACTACCACCAAGATCT3 –Rev 1448-1422, 24S RNA

Los productos de PCR se purificaran usando el kit de purificación. Luego se manda a

secuenciar el DNA purificado. Se hace un procesamiento del ruido en la secuenciacion.

Las secuencias fúngicas se alinearan inicialmente utilizando el software Clustal_X v.2.1 y

Bioedit v. 7.2.6 Los análisis filogenéticos se realizaron con MEGA 6 con la configuración
predeterminada [ 26 ]. Los árboles filogenéticos se construyeron utilizando el análisis de
máxima verosimilitud (ML) con las secuencias ITS y LSU