Pipettes

Contrôle métrologique
par METTLER-TOLEDO S.A.

1. Évaluation métrologique........................................................................ P 1 331 – 2

1.1 Matériel nécessaire...................................................................................... — 2
1.2 Opérations préliminaires ............................................................................ — 3
1.3 Mode opératoire .......................................................................................... — 3
1.4 Calculs .......................................................................................................... — 5
2. Incertitude de mesure ............................................................................ — 6
2.1 Méthodes d’évaluation................................................................................ — 7
2.2 Sources d’incertitude .................................................................................. — 7
2.3 Incertitude élargie........................................................................................ — 7
2.4 Analyses des erreurs ................................................................................... — 8
2.5 Analyses des causes d’incertitudes ........................................................... — 9
2.6 Analyse des erreurs humaines ................................................................... — 9
3. Mesurande.................................................................................................. — 9
3.1 Instruments .................................................................................................. — 11
3.2 Incertitude type du système gravimétrique .............................................. — 12
3.3 Coefficients de sensibilité et approximations d’évaluation ..................... — 12
3.4 Incertitudes liées à la balance..................................................................... — 12
3.5 Incertitudes liées à la pipette ...................................................................... — 13
3.6 Incertitudes liées à la masse volumique de l’air ....................................... — 13
3.7 Incertitudes liées à la masse volumique de l’eau pure ............................ — 13
3.8 Incertitude type du processus de distribution........................................... — 14
4. Exemple de calcul d’incertitude .......................................................... — 14
4.1 Conditions de mesure ................................................................................. — 14
4.2 Résultats ....................................................................................................... — 14
4.3 Exploitation des résultats............................................................................ — 14
4.4 Constat de vérification ................................................................................ — 14
5. Maintenance, contrôles, calibrage et ajustage ............................... — 14
5.1 Contrôles ...................................................................................................... — 15
5.2 Ajustage........................................................................................................ — 15
5.3 Calibrage ...................................................................................................... — 16
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 332

es contraintes auxquelles les pipettes doivent faire face n’ont cessé

L d’augmenter ces dernières années : dosage de volumes de plus en plus
petits et exigences plus sévères en matière d’ergonomie. En raison de l’augmen-
tation du nombre moyen d’échantillons, il faut pouvoir effectuer le travail sans
fatigue. L’utilisation de réactifs très coûteux, surtout dans le domaine des
sciences de la vie, nécessite de réduire au minimum les volumes traités.
Les systèmes d’assurance qualité modernes demandent un contrôle gravimé-
trique périodique et, le cas échéant, l’ajustage des pipettes. Pour effectuer les
contrôles de façon efficace et fiable, il faut des balances de haute qualité, un
support logiciel et des accessoires parfaitement adaptés. Tout cela constitue,
avec les pipettes et les pointes, un système indissociable, une sorte de chaîne
dont la qualité dépend de celle du chaînon le plus faible.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur P 1 331 − 1
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

En plus de la qualité de la pipette et de la pointe, les connaissances et l’habilité

de l’opérateur sont déterminantes. L’objectif de cet article est de présenter les
aspects théoriques du pipetage avec les pipettes à colonne d’air.

1. Évaluation métrologique
(0)

Tableau 1 – Exigences minimales de la balance

Fidélité Justesse
Volume de la micropipette
La méthode de contrôle la plus utilisée est la méthode gravimé- (mg) (mg)
trique. Une autre méthode existe cependant, c’est la méthode colo- > 1 à 10 µL
0 ,002
0 ,002
rimétrique.
> 10 à 100 µL
0 ,02
0 ,02
■ L’étalonnage basé sur la méthode gravimétrique consiste à déter- > 100 à 1 000 µL
0 ,2
0 ,2
miner le volume d’eau délivré par la pipette automatique. Ce
> 1 à 10 mL
0 ,2
0 ,2
volume d’eau est notamment obtenu à partir de la connaissance de
la masse mesurée et de sa masse volumique, après intégration des > 10 à 100 mL
2
2
corrections dues à l’influence des paramètres environnementaux et
de l’évaporation éventuelle.
■ Thermomètre
■ L’étalonnage basé sur la méthode colorimétrique consiste à faire
entrer l’élément à doser dans une réaction aboutissant à un Le thermomètre, gradué au moins par 0,1 ˚C, mesure la tempéra-
composé coloré. ture au début et à la fin de l’étalonnage. Ce thermomètre est certifié
avec une incertitude de 0,1 ˚C au maximum.
L’absorption lumineuse est déterminée pour une longueur ■ Baromètre
d’onde bien définie, par l’intermédiaire d’un appareil mesurant
l’intensité de la lumière transmise. Pour effectuer le dosage, il suf- Pour contrôler la pression atmosphérique, le technicien dispose
fit de se reporter à une courbe d’étalonnage établie préalablement d’un baromètre avec une incertitude de 5 hPa au maximum.
à partir d’une série de solutions de concentrations connues. Selon ■ Traçabilité des moyens de mesure
la longueur d’onde de la lumière utilisée, on parlera de colorimé-
trie (ou spectrophotométrie dans le domaine visible), de spec- Les moyens de mesure utilisés (masse, température, pression,
trophotométrie infrarouge (IR) ou de spectrophotométrie dans humidité relative) sont certifiés par un Service d’étalonnage natio-
l’ultraviolet (UV). nal, signataire de l’accord de reconnaissance multilatéral EA (Euro-
pean cooperation for Accreditation of laboratories) sur l’équivalence
Le calcul d’incertitude pour cette méthode n’a pas fait l’objet de des certificats d’étalonnage.
publication par des organismes de normalisation (international, ■ Correction des mesures
européen ou national).
Les moyens de mesure étant certifiés, l’opérateur corrigera les
valeurs mesurées de l’erreur indiquée dans le certificat d’étalon-
Nous ne traiterons donc dans cet article que l’étalonnage basé nage.
sur la méthode gravimétrique.
■ Récipient pour liquide
Il doit pouvoir contenir tout le liquide susceptible d’être utilisé
pour les séries complètes d’essais.

1.1 Matériel nécessaire ■ Piège à évaporation

Les essais doivent être réalisés dans un local exempt de courants
d’air avec un environnement stable.
La répétabilité des résultats est liée à la régularité d’exécution de
l’opérateur et à la maîtrise de sa gestuelle.
■ Balance
L’utilisation d’une balance pour l’étalonnage des pipettes suppose
un entretien et une vérification périodique comme un raccordement
aux étalons nationaux. En fonction des volumes sélectionnés, la
balance doit avoir une erreur ou un écart inférieur ou égal aux
valeurs présentées dans le tableau 1.
Pour les volumes inférieurs à 50 µL, les erreurs dues à l’évapora-
tion au cours du cycle de pesée doivent être prises en compte. En
dehors de la conception du récipient de pesée, la durée du cycle est
importante.
Pour que l’erreur d’évaporation soit aussi minime que possible
lors des tests de volumes inférieurs à 50 µL, les éléments suivants
peuvent être pris en considération :
— disposer un piège à humidité sur le plateau de la balance
(figure 1) ;
— ou distribuer l’eau dans un tube capillaire. Comme cette
méthode ne correspond pas à l’utilisation normale de la pipette, il
convient que l’utilisateur s’assure qu’une corrélation existe.
Sans tenir compte de ces éléments, une compensation mathéma-
tique de l’erreur due à l’évaporation au cours de la série de mesures
peut être appliquée.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 2 © Techniques de l’Ingénieur
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES
Récipent pes
cipent de pesée
+ piège
pi ge à évaporation
vaporation
Container
Récipent annexe
Figure 1 – Balance avec piège à évaporation
■ Liquide d’essai
Pour vérifier les micropipettes, il est nécessaire d’utiliser de l’eau
distillée ou désionisée, eau de « qualité 3 » conforme à la norme
ISO 3696, dégazée ou équilibrée en air. L’eau doit être à température
ambiante.
■ Cônes
L’utilisation systématique du consommable d’origine est préconi-
sée pour respecter l’homogénéité du système. Les pipettes automa-
tiques sont conçues et calibrées en usine avec des cônes d’origine.
L’utilisation de cônes différents de ceux du constructeur peut être
validée par comparaison des résultats obtenus avec les résultats
fournis par les cônes d’origine. Dix cônes au moins sont nécessaires
dans ce cas.
1.2 Opérations préliminaires
L’opérateur s’assurera que les opérations de maintenance (veille
fonctionnelle, nettoyage, remplacement de pièces) ont été effec-
tuées conformément aux recommandations du constructeur.
Avant l’étalonnage de la pipette, il est nécessaire de calibrer la
balance et d’effectuer un essai de justesse. Pour ce contrôle, deux
points de mesure suffisent ; ces points encadrent le plus petit et le
plus grand volume de micropipette à vérifier. Les exigences du
tableau 1 sont à respecter.
Les opérations suivantes ont pour but d’assurer la validité de la
vérification de la balance :
— la balance est mise de niveau ;
— le zéro est réglé, si nécessaire, au début de chaque essai.
■ Isothermicité
Tous les éléments intervenant lors de l’étalonnage : eau, récipient
de pesée, piège à évaporation, pipette, cône et balance (connectée
au secteur) sont mis en température et stabilisation, pendant un
minimum de 2 h.
■ Durée du cycle de pesée
La durée du cycle de pesée (temps nécessaire pour effectuer la
pesée d’un volume aspiré ou délivré) doit être la plus faible possi-
ble. Idéalement, il convient qu’elle ne dépasse pas 60 s. Il est impor-
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur
tant qu’elle soit régulière, à la fois au sein de chaque cycle et, dans
la mesure du possible, d’un cycle à l’autre, de sorte qu’une compen-
sation mathématique fiable de l’erreur due à l’évaporation au cours
de la série de mesures puisse être appliquée.
1.3 Mode opératoire
Les formules à utiliser dans ce paragraphe sont données
tableau 2.
1.3.1 Volume d’essai
Dans le cas d’un appareil à volume fixe, le volume des essais est
le volume nominal.
Dans le cas d’une pipette à volume variable (volume choisi par
l’utilisateur), au moins trois volumes doivent être soumis à essai :
— le volume nominal (cf. définitions dans l’article [P 1 330]) ;
— environ 50 % du volume nominal ;
— la limite inférieure de la plage de volume ou 10 % du volume
nominal (la valeur la plus élevée des 2).
Les essais de volumes supplémentaires sont facultatifs. Les dis-
positifs de réglage des appareils (par exemple les cadrans, les échel-
les) doivent permettre de sélectionner le volume à tester.
Un prérinçage du cône est effectué juste avant de commencer la
série.
Procéder aux tests comme suit.
1. Positionner un cône et vérifier l’affichage du volume désiré.
2. Aspirer l’échantillon depuis le container, régulièrement et en
veillant à respecter la profondeur d’immersion du cône quand elle
est recommandée par le constructeur.
3. Distribuer l’échantillon dans le récipient de pesée placé sur le
plateau de la balance, en prenant soin d’expulser la totalité de
l’échantillon.
4. Délivrer la dernière fraction de volume par contact sur la paroi.
5. Attendre l’extinction du voyant d’instabilité de la balance pour
noter la valeur de pesée m1.
Répéter ces étapes 10 fois et calculer la moyenne selon
l’équation (1) du tableau 2 :
avec m masse moyenne,
mi pesées individuelles,
n nombre de pesées (n = 10).
Conserver le même cône durant la série de mesure.
Noter la température de l’eau ainsi que la température, l’humi-
dité relative et la pression atmosphérique de l’air en début et en fin
d’étalonnage.
1.3.2 Pertes par évaporation
Si, malgré les précautions de manipulation et l’utilisation du
piège à évaporation, l’évaporation n’est pas négligeable, il est pos-
sible de la mesurer pour l’intégrer aux calculs.
Ces pertes sont mesurées en effectuant les étapes 2) à 4) comme
pour une pesée d’échantillon, mais sans faire aucun ajout dans le
récipient de pesée.
P 1 331 − 3
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

(0)

Tableau 2 – Formules de calcul à utiliser dans le paragraphe 1.3

Numéro Numéro du
Unité
de Paramètres Symbole sous- Formule (1) Unité SI
usuelle
formule paragraphe

1
Masse moyenne du volume m 1.3.1 ∑m kg mg
délivré par la pipette m = --------------
n

2 Évaporation moyenne e 1.3.2

∑ ei kg mg
e = -------------
n

1 ρb – ρa
V 20 = ( m + e ) × ⎛ ------ × --------------------⎞ × ( 1 – α c ( t d – t d20 ) )
3 Volume de la pipette V20 ⎝ ρ b ρ W – ρ a⎠ m3 µL
V 20 = ( m + e ) × Z × Y
1.4.1
1 ρb – ρa
4 Facteur Z Z Z = ⎛ ------ × --------------------⎞ µL · mg−1
⎝ ρ b ρ W – ρ a⎠

5 Facteur Y Y Y = 1 − αc(td − td20)

4
6 Masse volumique de l’eau ρW 1.4.2 ρW = ∑ i
ai tW kg · m−3
i=0

k1 pa + ϕ ( k2 ta + k3 )
7 Masse volumique de l’air ρa 1.4.3 ρ a = -------------------------------------------------- kg · m−3
t a + t a0

8 Volume moyen délivré par la V

∑ Vi
pipette V = --------------
n m3 µL
1.4.4
9 Biais systématique de la pipette es es = V – Vs

Biais systématique (%) de la

10
pipette
es% e s% = 100 (V – V s ) ⁄ V 0

11
Écart-type du volume délivré par
s ∑ (V – V i ) 2 m3 µL
la pipette i=1
1.4.4 s = -----------------------------------
n–1
Coefficient de variation du
12
volume
CV CV = 100s ⁄ V
(1) Pour les symboles non définis dans ce tableau, se reporter au texte.

Le volume d’eau contenu dans le récipient de pesée correspond à
environ 5 fois le volume à vérifier :
1. Positionner un cône et vérifier l’affichage du volume désiré.
2. Aspirer régulièrement l’échantillon depuis le container.
3. Exécuter exactement les mêmes gestes que pour un dépôt
d’échantillon classique (ouverture de porte, etc.) mais distribuer
l’échantillon dans un récipient annexe (cf. figure 1).
4. Attendre la stabilisation pour noter la valeur de pesée e1.
Répéter ces étapes au moins 4 fois pour calculer une valeur
moyenne de perte par évaporation.
Ce test peut être effectué avant et après l’étalonnage. Dans ce cas,
la valeur moyenne e (équation (2) du tableau 2) est prise en compte
dans les calculs qui vont suivre.
1.3.3 Pipettes multicanaux
Les pipettes à piston multicanaux sont semblables aux pipettes
monocanaux dans le sens où elles sont constituées d’une série
d’unités de pipetage monocanal, actionnées ensemble à l’aide d’un
même mécanisme. Pour les besoins de l’essai, chaque canal doit
être considéré comme une pipette et soumis à essais.
Tous les canaux de la pipette multicanal doivent être remplis lors
de l’aspiration de l’eau d’essai. Seule l’eau d’essai soumise à essai
est recueillie dans le récipient de pesée.
Les constructeurs ont développé des balances spéciales permet-
tant de peser le volume délivré de chaque canal et de réduire ainsi
les difficultés liées au contrôle de ce type de pipette.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 4 © Techniques de l’Ingénieur
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES

1.4 Calculs αc coefficient de dilatation thermique du cône de la pipette

à piston,
ρW masse volumique de l’eau,
ρa masse volumique de l’air,
Les formules à utiliser dans ce paragraphe sont données dans
le tableau 2. ρb masse volumique de la masse étalon utilisée pour
calibrer la balance (selon l’OIML, ρb = 8 000 kg/m3 pour
des masses en acier),
1.4.1 Calcul du volume moyen V20 td température du dispositif,
td20 température de référence (20 ˚C).
L’équation pour le volume V20 de l’eau transférée à 20 ˚C est don-
née par la formule (3) du tableau 2 :
avec m masse moyenne (cf. § 1.3.1), La formule (3) peut être simplifiée en posant les équations (4) et
e perte moyenne de masse par évaporation et par cycle, (5) du tableau 2 où Z est un facteur combiné pour tenir compte de la
déterminée pour permettre l’application d’une correction de poussée de l’air et de la conversion de la masse en
correction à la mesure (cf. § 1.3.2), volume (tableau 3).
(0)

Tableau 3 – Valeurs typiques du facteur Z (1)

Pression d’air (hPa)
Température
(˚C)
800 850 900 950 1 000 1 013 1 050
15,0 1,001 7 1,001 8 1,001 9 1,001 9 1,002 0 1,002 0 1,002 0
15,5 1,001 8 1,001 9 1,001 9 1,002 0 1,002 0 1,002 0 1,002 1
16,0 1,001 9 1,002 0 1,002 0 1,002 1 1,002 1 1,002 1 1,002 2
16,5 1,002 0 1,002 0 1,002 1 1,002 1 1,002 2 1,002 2 1,002 2
17,0 1,002 1 1,002 1 1,002 2 1,002 2 1,002 3 1,002 3 1,002 3
17,5 1,002 2 1,002 2 1,002 3 1,002 3 1,002 4 1,002 4 1,002 4
18,0 1,002 2 1,002 3 1,002 3 1,002 4 1,002 5 1,002 5 1,002 5
18,5 1,002 3 1,002 4 1,002 4 1,002 5 1,002 5 1,002 6 1,002 6
19,0 1,002 4 1,002 5 1,002 5 1,002 6 1,002 6 1,002 7 1,002 7
19,5 1,002 5 1,002 6 1,002 6 1,002 7 1,002 7 1,002 8 1,002 8
20,0 1,002 6 1,002 7 1,002 7 1,002 8 1,002 8 1,002 9 1,002 9
20,5 1,002 7 1,002 8 1,002 8 1,002 9 1,002 9 1,003 0 1,003 0
21,0 1,002 8 1,002 9 1,002 9 1,003 0 1,003 1 1,003 1 1,003 1
21,5 1,003 0 1,003 0 1,003 1 1,003 1 1,003 2 1,003 2 1,003 2
22,0 1,003 1 1,003 1 1,003 2 1,003 2 1,003 3 1,003 3 1,003 3
22,5 1,003 2 1,003 2 1,003 3 1,003 3 1,003 4 1,003 4 1,003 4
23,0 1,003 3 1,003 3 1,003 4 1,003 4 1,003 5 1,003 5 1,003 6
23,5 1,003 4 1,003 5 1,003 5 1,003 6 1,003 6 1,003 6 1,003 7
24,0 1,003 5 1,003 6 1,003 6 1,003 7 1,003 7 1,003 8 1,003 8
24,5 1,003 7 1,003 7 1,003 8 1,003 8 1,003 9 1,003 9 1,003 9
25,0 1,003 8 1,003 8 1,003 9 1,003 9 1,004 0 1,004 0 1,004 0
25,5 1,003 9 1,004 0 1,004 0 1,004 1 1,004 1 1,004 1 1,004 2
26,0 1,004 0 1,004 1 1,004 1 1,004 2 1,004 2 1,004 3 1,004 3
26,5 1,004 2 1,004 2 1,004 3 1,004 3 1,004 4 1,004 4 1,004 4
27,0 1,004 3 1,004 4 1,004 4 1,004 5 1,004 5 1,004 5 1,004 6
27,5 1,004 5 1,004 5 1,004 6 1,004 6 1,004 7 1,004 7 1,004 7
28,0 1,004 6 1,004 6 1,004 7 1,004 7 1,004 8 1,004 8 1,004 8
28,5 1,004 7 1,004 8 1,004 8 1,004 9 1,004 9 1,005 0 1,005 0
29,0 1,004 9 1,004 9 1,005 0 1,005 0 1,005 1 1,005 1 1,005 1
29,5 1,005 0 1,005 1 1,005 1 1,005 2 1,005 2 1,005 2 1,005 3
30,0 1,005 2 1,005 2 1,005 3 1,005 3 1,005 4 1,005 4 1,005 4
(1) Facteur combiné Z (µL · mg−1) pour la correction de poussée de l’air sec et la conversion de la masse en volume en fonction de la température et de la pression
d’air.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur P 1 331 − 5
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

1.4.2 Calcul de la masse volumique et avec les constantes (échelle de température ITS-90) :
de l’eau pure ρW k1 = 0,348 444 kg · m−3 · ˚C · hPa−1
k2 = − 0,002 52 kg · m−3
k3 = 0,020 582 kg · m−3 · ˚C
L’équation (6) du tableau 2 donne les valeurs de masse volumi-
On obtient ainsi :
que de l’eau pure exprimée en kg · m−3, pour une plage de tempéra-
ture de 5 à 40 ˚C : [ 0 ,348 444 × p a ] – [ ( 0 ,002 52 × t a – 0 ,020 582 ) × ϕ ]
avec t W température de l’eau pure en degrés Celsius ; ρ a ≈ -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-
et avec les constantes (échelle de température ITS-90) : 273 ,15 + t a
a0 = 999,853 08 kg · m−3
Cette équation est applicable avec les limites suivantes :
a1 = 6,326 93 × 10−2 ˚C−1 · kg · m−3 (0)

a2 = − 8,523 829 × 10−3 ˚C−2 · kg · m−3

a3 = 6,943 248 × 10−5 ˚C−3 · kg · m−3 Grandeur Limites de mesure
a4 = − 3,821 216 × 10−7 ˚C−4 · kg · m−3
Pression atmosphérique 940 hPa
p a
1 040 hPa
Des exemples numériques de valeurs de masse volumique sont
Température de l’air 10 ˚C
t a
30 ˚C
donnés dans le tableau 4.
(0) Humidité de l’air ϕ
80 %

Tableau 4 – Valeurs de la masse volumique de l’eau 1.4.4 Calcul du biais systématique es

en fonction de la température et du coefficient de variation du volume CV

Température de l’eau tW Masse volumique de l’eau ρW Le biais systématique es de la pipette est calculé en microlitres à
(˚C) (kg · m−3) l’aide des équations (8) et (9) ou en pourcentage à l’aide de
l’équation (10) du tableau 2 où Vs est le volume d’essai choisi et V0
21,5 997,881 le volume nominal.
21,0 997,991 Le coefficient de variation du volume de la pipette est calculé en
microlitres à l’aide de l’équation (11) du tableau 2 où n est le nom-
20,5 998,098 bre de mesures. Le coefficient de variation CV est calculé en pour-
centage à l’aide de l’équation (12).
20,0 998,203
19,5 998,305

2. Incertitude de mesure
1.4.3 Calcul de la masse volumique de l’air
Les formules à utiliser pour ce paragraphe sont décrites dans
L’équation (7) du tableau 2 donne les valeurs de masse volumi- le tableau 5.
que de l’air ρa en kg · m−3 :
avec pa pression atmosphérique (en hPa),
ϕ humidité relative (en %), Pour rendre compte de la confiance qu’un utilisateur peut avoir en
ta température de l’air (en ˚C), un résultat de mesure, il faut donner une indication sur sa qualité :
ta0 = 273,15 ˚C ; c’est l’incertitude de mesure qui intégrera sa justesse et sa fidélité.
(0)

Tableau 5 – Formules de calcul à utiliser dans le paragraphe 2

Numéro Numéro du
Unité Unité
de Paramètres Symbole sous- Formule
SI usuelle
formule paragraphe

1 2
Loi de probabilité --- ( a – a )
13 u2(x) 2.1.2 2 i+ i– a2
rectangulaire u 2 ( x ) = ---------------------------------------- = -----i-
3 3

Loi de propaga- ∂F 2 ∂F 2 ∂F 2 ∂F 2
14 u(V20) u ( V 20 ) = ⎛ --------⎞ × u 2 ( m ) + ⎛ ---------⎞ × u 2 ( t ) + ⎛ -------⎞ × u 2 ( t ) + ⎛ ---------⎞ × u 2 ( p ) + ...
tion des variances ⎝ ∂m⎠ ⎝ ∂t W⎠ W ⎝ ∂t a⎠ a ⎝ ∂p a⎠ a

Incertitude com- 2.2

posée du volume m3 µL
15 délivré par la uc(V20) u c ( V 20 ) = u 2 ( V 20 ) + s proc
2

pipette
16 2.3 U = k × uc(V20)
Incertitude élargie U
17 2.5 U = es + 2s

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 6 © Techniques de l’Ingénieur
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES
La méthode idéale d’évaluation et d’expression de l’incertitude
finale du résultat doit être :
— universelle, pour s’appliquer à tous les types de mesures ;
— logique, pour être déduite directement des facteurs
d’influence ;
— transférable, pour être utilisée à son tour comme une compo-
sante d’incertitude.
Il est de plus nécessaire de fournir un intervalle de confiance qui,
associé à l’incertitude permettra d’estimer si toutes les possibilités
ou probabilités du résultat sont réalistes.
2.1 Méthodes d’évaluation
La description détaillée de l’incertitude comprend une liste
complète de ses composantes et indique pour chacune la méthode
utilisée pour l’évaluer et lui attribuer une valeur numérique. Ces
méthodes sont groupées en deux catégories :
— les méthodes de type A ⇒ elles suivent une méthode
statistique ;
— les méthodes de type B ⇒ elles utilisent d’autres moyens.
2.1.1 Méthode de type A
Les composantes estimées par une méthode de type A sont carac-
térisées par les variances estimées s i2 (ou les « écarts-types » esti-
més si).
Il est possible de déterminer les incertitudes types de mesurage
en effectuant des étalonnages dans des conditions répétables de
façon à obtenir l’écart-type expérimental associé avec la répéta-
bilité.
2.1.2 Méthode de type B
Les composantes estimées par une méthode de type B sont carac-
térisées par les variances estimées u j2 , qui peuvent être considé-
rées comme des approximations de variance dont on admet
l’existence.
Les termes u j2 sont traités comme des variances et les termes uj
comme des écarts-types.
Exemple : les spécifications d’un constructeur sont souvent don-
nées comme un intervalle couvrant la valeur de mesure. Dans cet inter-
valle, toute valeur a la même probabilité ; on dit que la distribution des
valeurs possibles est uniforme.
Cette loi de probabilité est appelée rectangulaire. La variance de
cette loi pourra être utilisée pour donner l’intervalle selon
l’équation (13) du tableau 5 où ai+ et ai− fournissent les limites supé-
rieure et inférieure de l’intervalle de la pipette i.
ai est la moitié de cet intervalle ; typiquement l’intervalle est noté
comme ± ai dans ce cas. L’incertitude type est la racine carrée de la
variance.
2.2 Sources d’incertitude
L’étalonnage d’une pipette est affecté par deux sources
d’incertitude :
— l’incertitude type de mesure du volume distribué par la
méthode gravimétrique u(V20) (composantes de type B) ;
— l’incertitude type du processus de distribution liée à la pipette
sproc (composante de type A).
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur
L’estimation de u(V20) est obtenue à partir de l’équation (3) du
tableau 2 en appliquant la loi de propagation des variances
(équation (14)).
Les composantes retenues pour u(V20) sont décrites dans les
paragraphes 3.4, 3.5, 3.6 et 3.7.
L’incertitude du processus de distribution sproc est décrite
paragraphe 3.8.
Pour l’évaluation de l’incertitude composée (équation (15) du
tableau 5) du volume délivré par la pipette, les deux contributions
sont prises en considération.
2.3 Incertitude élargie
L’incertitude élargie U s’obtient en multipliant l’incertitude type
composée uc(V20) par un facteur d’élargissement k (équation (16)).
La valeur k = 2 est recommandée pour un niveau de confiance
d’environ 95 %, ce qui signifie que 95 % des mesurages se situent
dans l’intervalle V20 ± U (k = 2).
Le résultat de mesure est exprimé sous la forme Y = y ± U qui
s’interprète comme signifiant que la meilleure estimation de la
valeur attribuée à la grandeur mesurée Y est y et qu’on peut s’atten-
dre à ce que l’intervalle de y − U à y + U comprenne une fraction éle-
vée de la distribution des valeurs qui pourraient être attribuées
raisonnablement à Y. Un tel intervalle s’exprime aussi par
y–U
Y
y+U.
Le résultat de mesure sera ainsi donné par :
V20 ± U (k = 2)
Le facteur d’élargissement k doit toujours être indiqué.
2.4 Analyses des erreurs
De nombreuses erreurs peuvent se produire au cours de l’utilisa-
tion de pipettes et de l’étalonnage. Le tableau 6 donne des sources
d’erreurs possibles pour les pipettes à piston à déplacement d’air.
Selon leur origine, ces sources d’erreur peuvent provoquer des
erreurs allant de 0,3 % à 50 %.
Les plus significatives sont les suivantes :
— mauvaise qualité des pointes (cf. article [P 1 330], § 4) ;
— réutilisation des pointes ;
— non-respect de la technique de pipetage (cf. article [P 1 330],
§ 6) ;
— défaut d’étanchéité des cônes et du piston/cylindre.
Pour réussir l’étalonnage et l’utilisation de sa pipette, l’opérateur
veillera à les éliminer pour ne pas engendrer d’erreur.
2.5 Analyses des causes d’incertitudes
L’analyse de la méthode d’étalonnage conduit à retenir les causes
d’incertitudes suivantes :
— incertitudes liées à l’utilisation de la balance ;
— incertitudes liées à la détermination du volume ;
— incertitudes liées à la pipette à étalonner ;
— incertitudes liées à la mesure de la masse volumique de l’eau ;
— incertitudes liées à la mesure de la masse volumique de l’air.
P 1 331 − 7
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

(0)

Tableau 6 – Paramètres d’influence, erreurs résultantes de mesure et mesures correctives

Paramètres d’influence Effet (1) Pouvant être influencé par Pouvant être déterminé par
Variations de la pression barométrique à l’usage Mesures constructives pri- Observation du baromètre sur le lieu de
en fonction de l’utilisation de la pipette Jusqu’à 0,2 % ses par le fabricant mesure ou de travail
Écart entre la masse volumique du liquide à pipe- Jusqu’à 1,0 % Observation des informa- Comparaison de la masse volumique du
ter et celle de l’eau utilisée pour l’ajustage tions pour l’utilisateur liquide à pipeter à celle de l’eau
Écart entre la pression de vapeur du liquide à Humidification préalable Fuite au niveau de la pointe ou goutte à
pipeter et celle de l’eau utilisée pour l’ajustage Jusqu’à 2,0 % suffisante du cône l’orifice de la pointe

Viscosité et/ou caractéristiques de débit et carac- Observation des informa- Contrôle visuel des gouttelettes ou des
téristiques de mouillage du liquide à pipeter (2) tions pour l’utilisateur traces de liquide au cours de la distribu-
tion du liquide
Contrôle régulier de la
Étanchéité piston/cylindre 1 % à 50 % pipette et des volumes Fuite au niveau de la pointe, les erreurs
aspirés maximales tolérées sont dépassées

Fonctionnement sans à-
Course de piston irrégulière Jusqu’à 0,5 % coups du piston ; observa- Observation de sa propre technique de
tion des informations pour pipetage
l’utilisateur
Technique de pipetage
Rythme et synchronisation irréguliers au cours régulière ; observation des Les erreurs maximales tolérées sont
Jusqu’à 1,5 %
du pipetage informations pour l’utilisa- dépassées
teur
Maintien de la pipette en
Profondeur d’immersion de la pointe et de l’angle position verticale, obser- Contrôle visuel de la profondeur
Jusqu’à 1,0 % d’immersion et de l’angle de manipula-
de manipulation au cours du pipetage vation des informations tion
pour l’utilisateur
Dans la mesure du possi-
Variations de la température de la pipette, de la ble, il convient que la tem- Mesure de la température de l’air et du
pérature de la pipette, la
température ambiante et de la température du Jusqu’à 0,3 %/K milieu ; mesure de la température de la
liquide à pipeter température ambiante et
la température du liquide à pipette impossible
pipeter soient identiques

Changements d’humidité relative de l’air ambiant Jusqu’à 3,0 % Humidification préalable Observation de l’hygromètre
suffisante de la pointe

Défaut d’humidification de la pointe Jusqu’à 2,0 % Humidification préalable Les erreurs maximales tolérées sont
de la pointe dépassées
Essuyage de la pointe sur
Défaut d’essuyage de la pointe sur la paroi du Jusqu’à 3,0 % la paroi du récipient (dis- Les erreurs maximales tolérées sont
récipient tance d’essuyage de 8 mm dépassées
à 10 mm)

Utilisation des pointes Fuite au niveau de la pointe ou les

Pointes non étanches/mal fixées 0,5 % à 50 % d’origine recommandées erreurs maximales tolérées sont dépas-
sées

Réutilisation des pointes Jusqu’à 4,0 % Utilisation des pointes une Les erreurs maximales tolérées sont
fois seulement dépassées
Contrôle visuel après le positionnement
Rectitudes des pointes Jusqu’à 10 % Utilisation uniquement de des pointes sur la pipette à piston multi-
pointes appropriées
canal
(1) Les éventuelles erreurs de mesure sont estimées et spécifiées en % du volume nominal
(2) L’indication d’une éventuelle erreur de mesure n’est pas réaliste puisqu’elle dépend du liquide à pipeter

Les contributions de ces incertitudes doivent être prises en
considération pour établir le bilan d’incertitude de l’étalonnage. Ce
bilan est requis pour comprendre comment améliorer les points les
plus critiques du processus de mesure.
L’expérience montre que la contribution au bilan d’incertitude
résultant de la mesure du volume par la méthode gravimétrique est
faible comparée à celle résultant du processus de distribution, à
condition que les instruments de mesure (balance, baromètre, ther-
momètre, etc.) soient utilisés conformément aux informations don-
nées dans cet article. Ainsi, il est d’usage de négliger cette contribution
dans le bilan d’incertitude, et de donner uniquement le biais systéma-
tique et l’erreur aléatoire de mesure résultant de 10 mesures du
volume distribué afin de caractériser le dispositif de transfert.
Il convient de garder à l’esprit que le biais systématique de
mesure n’influe pas sur le budget d’incertitude du volume mesuré
avec le système de mesure gravimétrique. C’est le résultat de la
mesure, avec sa fidélité, qui est la mesure caractérisant le volume
distribué par l’appareil de distribution.
Dans ces conditions, l’équation (17) du tableau 5 pourrait être uti-
lisée pour évaluer l’incertitude d’une mesure U avec une probabilité
de 95 %.
Cependant une démarche plus détaillée est nécessaire, par exem-
ple pour les très faibles volumes, et cette simplification n’est plus
valable ; une évaluation complète de l’incertitude doit être effectuée.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 8 © Techniques de l’Ingénieur
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES

■ Balance — des erreurs de manipulation ;

L’affichage de la balance peut être altéré pour les raisons — des erreurs de calcul, etc.
suivantes :
La seule possibilité d’intervention sur ces points consiste à pren-
— défaut de justesse, de pérennité, de fluage ;
dre des mesures préventives. Pour cela, il est fortement recom-
— défaut d’excentration des charges ;
mandé de mettre en place :
— défaut de fidélité ;
— défaut de sensibilité. — une formation et un soutien pour les opérateurs ;
● Le défaut de justesse et de pérennité correspond à l’erreur — une procédure d’étalonnage et de vérification détaillée ;
maximale tolérée de la balance prise en compte lors de sa vérifica-
— un support informatique (tableur) pour l’acquisition des mesu-
tion avant l’étalonnage de la pipette.
res, les calculs et l’édition des résultats.
● Pour minimiser le défaut de fluage, l’acquisition de la mesure
est réalisée en laissant s’écouler un délai constant après le dépôt de La validation indispensable du tableur portera notamment sur :
la charge de manière à permettre l’amortissement des oscillations
générées par le dépôt de la charge. — le transfert des valeurs lues sur l’affichage de la balance vers
celles affichées et éditées par le PC (liaison informatique entre
● Pour minimiser le défaut d’excentration des charges, l’opéra-
balance et tableur du PC), les formules et les résultats de calcul.
teur utilise un récipient ou un piège à évaporation permettant de
toujours délivrer le volume sur la même partie du plateau de la
balance.
● Le défaut de fidélité correspond à l’erreur de répétabilité de la
balance. L’écart-type s des mesures obtenues durant l’étalonnage
3. Mesurande
permet d’évaluer ce défaut.
● La sensibilité de la balance est vérifiée en déposant, sur son pla-
teau, une masse de 100 d selon la balance utilisée. Si la variation de Les formules à utiliser pour ce paragraphe sont décrites dans
masse ainsi provoquée est supérieure à ± 1 d, la cause du défaut est le tableau 7.
recherchée et corrigée, ensuite une nouvelle vérification est effectuée.
Pour toute balance à affichage numérique, la mesure de la masse
est donnée par la lecture de l’indication (résolution) avec une erreur La formule (3) du tableau 2 représentant le mesurande, combine
de lecture liée à l’erreur d’arrondissage. les résultats de mesure délivrés par la balance (m, e), les masses
volumiques de l’air et de l’eau, produits par les mesures de tempé-
La dérive en température de la balance n’est pas retenue car sa rature de l’air et de l’eau, la pression atmosphérique et l’humidité
composante d’incertitude n’est pas significative comparée à celles relative de l’air conjointement avec les équations pour la correction
retenues pour la balance. de poussée de l’air « facteur (Z) » et les paramètres de la pipette.
■ Volume
Les températures de l’eau, de l’air et de la pipette sont supposées
Les incertitudes liées au volume V20 déterminées à la température être non corrélées, car les valeurs actuelles de l’eau et de la pipette
t W, sont une combinaison : ne dépendent pas uniquement de l’air, mais dépendent fortement
— des incertitudes liées à la correction de poussée de l’air ; de la manipulation de l’opérateur. Les effets considérables de l’éva-
— des incertitudes liées à la masse volumique de l’eau ; poration/refroidissement et de l’échauffement dû à la main pour les
— des incertitudes liées à la répétabilité. appareils manuels doivent être pris en compte.

■ Pipette Les différences de température résultante sont souvent plus

Les incertitudes types sont estimées à partir de l’incertitude : importantes que l’incertitude dans la température de mesure.
— du thermomètre utilisé pour mesurer la température de l’air ; L’équation (3) du tableau 2 montre que le volume mesuré V20 est
— du coefficient de dilatation du cône de la pipette. fonction de :
■ Masse volumique de l’eau — la masse m ;
Les incertitudes types sont estimées à partir de l’incertitude : — la température de l’eau t W ;
— du thermomètre utilisé pour mesurer la température de l’eau ; — la température de l’air ta ;
— de la variation de la température de l’eau entre le début et la fin
— la pression atmosphérique de l’air pa ;
des essais.
— l’humidité relative de l’air ϕ ;
■ Correction de poussée de l’air
— le coefficient de dilatation αc ;
Les incertitudes types sont estimées à partir des incertitudes :
— la température de la pipette td ;
— du thermomètre utilisé pour mesurer la température de l’air ;
— du baromètre utilisé pour mesurer la pression atmosphérique — des constantes.
de l’air ; V20 = F(xi) = F(m, t W, ta, pa, ϕ, αc, td ; constantes)
— de l’hygromètre utilisé pour mesurer l’humidité relative de
l’air ;
— de la variation de la masse volumique de l’air entre le début et
la fin des essais.
3.1 Instruments

2.6 Analyse des erreurs humaines ■ Étalonnage

Les instruments utilisés ont fait l’objet d’un certificat d’étalon-
Cette cause d’incertitude n’est ni maîtrisable et ni quantifiable nage. L’incertitude indiquée UE est donnée pour une probabilité de
puisqu’elle peut provenir : 95 % (k = 2). La composante de l’incertitude d’étalonnage (u étalonnage)
— d’une méconnaissance des méthodes ; est déterminée de la façon suivante : u étalonnage = U E

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur P 1 331 − 9
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

(0)

Tableau 7 – Formules à utiliser dans le paragraphe 3

Numéro Unité SI
de Paramètres Symbole Numéro de Formule (Unité
paragraphe usuelle)
formule

18 Incertitude type de l’instrument uinstrument 3.1 u instrument = 2

u étalonnage 2
+ u pérennité

Coefficient de sensibilité pour la ∂F V 20 1

19 cb 3.4 c b = -------- = --------- ≈ -------- m3 ⋅kg−1
masse ∂m m ρW

20 Incertitude type d’une balance ub1 3.4 u b1 = u instrument ⁄ 3

étalonnée
Incertitude type d’une balance
21 vérifiée ub2 3.4 u b2 = emt ⁄ 3

22 Incertitude type de l’évaporation ub3 3.4 u b3 = emt ⁄ 3

kg
(mg)
23 Incertitude type de la résolution ud 3.4 ud = d ⁄ 2 3

24 Incertitude type de répétabilité ub4 3.4 u b4 = s constructeur ⁄ 3

25 Incertitude type de la linéarité ub5 3.4 u b5 = linéarité constructeur ⁄ 3

Incertitude type d’une balance kg

26 vérifiée u(b) 3.4 u(b) = 2 + 2 × u2
u b2 d (mg)
Incertitude type du coefficient de ˚C−1
27 dilatation αc up1 u p1 = 0 ,1 × α c ⁄ 3

3.5
Coefficient de sensibilité relatif ∂F m ρb – ρa m
28 au coefficient de dilatation αc c αc c α = --------- = – ------ × -------------------- × ( t d – t d20 ) = – -------- × ( t d – t d20 ) m3 ⋅kg−1 ⋅˚C−1
c
∂α c ρb ρW – ρa ρW

Incertitude type de la tempéra-

29 ture de la pipette up2 u p2 = ∆t d ⁄ 3 ˚C

3.5
Coefficient de sensibilité relatif à ∂F m ρb – ρa m
30 la température de la pipette ct c td = ------- = – ------ × -------------------- × α c ≈ – -------- × α c m3 ⋅kg−1 ⋅˚C−1
d ∂t d ρb ρW – ρa ρW

Incertitude type de la pression u pa = u instrument ⁄ 3

31 atmosphérique de l’air u pa hPa

∂F m ρb – ρa k1
c p = --------- = ------ × ( 1 – α c × ( t d – t d20 ) ) × --------------------------- × ------------------
Coefficient de sensibilité relatif à 3.6 a
∂p a ρb ( ρ – ρ ) 2 t a + t a0
m3 ⋅kg−1 ⋅˚C−1
W a
32 la pression atmosphérique de c pa
l’air ∂F m k1
c pa = --------- ≈ -------- × ------------------
∂p a ρ W 2 t a + t a0

33 u ta = 0 ,5 ⁄ 3
Incertitude type liée à la mesure u ta ˚C
de la température de l’air
34 u ta = u instrument ⁄ 3

3.6 ∂F m ρb – ρW ϕ k 2 t a0 – k 1 p a – ϕ k 3
c t = ------- = ------ × ( 1 – α c × ( t d – t d20 ) ) × --------------------------
- × ---------------------------------------------------
a
∂t a ρb (ρ – ρ ) 2
(t + t )
2
W a a
35 Coefficient de sensibilité relatif à c ta a0
m3 ⋅kg−1 ⋅˚C−1
la température de l’air
∂F m ϕ ( k 2 t a0 – k 3 ) – k 1 p a
c ta = ------- ≈ -------- × -----------------------------------------------------
∂t a ρ W 2
( t a + t a0 )
2

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 10 © Techniques de l’Ingénieur
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES

Tableau 7 – Formules à utiliser dans le paragraphe 3 (suite)

Numéro Unité SI
de Paramètres Symbole Numéro de Formule (Unité
paragraphe usuelle)
formule

Incertitude type de l’humidité

36 relative uϕ u ϕ = u instrument ⁄ 3 %

∂F m ρb – ρa k2 ta + k3
c ϕ = ------ = ----- × ( 1 – α c × ( t d – t d20 ) ) × ------------------------- × --------------------
3.6 ∂ϕ ρb ( ρ W – ρ a ) 2 t a + t a0
37 Coefficient de sensibilité relatif à cϕ m3 ⋅kg−1 ⋅%−1
l’humidité relative de l’air
∂F m k 2 t a + k 3
c ϕ = ------ ≈ -------- × -----------------------
∂ϕ ρ W 2 t a + t a0

38 Incertitude type de la stabilité de ustabilité u stabilité = ( ρ adébut – ρ afin ) ⁄ 3 kg⋅m3

la masse volumique de l’air

∂F 1 ( ρb – ρW )
3.6 c ρa = --------- ≈ m × ------ × --------------------------- × ( 1 – α c × ( t d – t d20 ) )
Coefficient de sensibilité relatif à ∂ρ a ρb ( ρ – ρ ) 2
39 la stabilité de la masse volumi- c ρa W a m3 ⋅kg−1
que de l’air ∂F 1
c ρa = --------- ≈ m × --------
∂ρ a ρW 2

Incertitude type de la masse kg⋅m−3

40 u(ρa) 3.6 u ( ρa ) = u (2t ϕ, p a )
2
+ u stabilité
volumique de l’air a, air

41 u tW = 0 ,2 ⁄ 3
Incertitude type liée à la mesure ut ˚C
de la température de l’eau W
42 u tW = u instrument ⁄ 3

4
ρb – ρa ⎛ ⎞
c tW = --------- = – ------ × --------------------------- × [ 1 – α c × ( t d – t d20 ) ] × ⎜ ∑ ia i t W
3.7 ∂F m i–1
⎟
∂t W ρb ( ρ – ρ ) 2 ⎝i = 1 ⎠
Coefficient de sensibilité relatif à W a
43 la température de l’eau ct m3 ⋅kg−1
W
4
m ∂ρ W m ⎛ ⎞
c tW = --------- ≈ – -------- × ----------- = – -------- × ⎜ ∑ ia i t W
∂F i – 1⎟
∂t W ρW 2 ∂t W ρW 2 ⎝i = 1 ⎠

44 Incertitude type de la variation uvariation 3.7 u variation = ( t Wdébut – t Wfin ) ⁄ 3 ˚C

de température de l’eau
Incertitude type de la masse kg⋅m−3
45 volumique de l’eau u(ρW) 3.7 u ( ρW ) = u t2W + u stabilité
2
eau

46 s proc = s ⁄ n
Incertitude type de la répétabilité sproc 3.8 kg
de mesure de V20 (mg)
47 s proc = W ⁄ n avec W = Max V20 – Min V20

■ Pérennité 3.2 Incertitude type du système

Les instruments utilisés pour mesurer les températures de l’eau et gravimétrique
de l’air, la pression et l’humidité relative sont susceptibles de déri-
ver dans le temps. La pérennité correspondra à la plus grande varia-
tion de valeurs entre 2 étalonnages, sur la base d’au moins L’incertitude type u(V20) du système de mesure par la méthode
3 certificats d’étalonnage. Il est donc nécessaire de la prendre en gravimétrique associée au volume V20 peut être exprimée comme :
compte avec cette restriction : u pérennité  u étalonnage .
2
En l’absence d’historique, la composante de la pérennité peut
aussi être calculée à partir de UE de la façon suivante : upérennité = UE u 2 ( V 20 ) = ∑ c i2 × u 2 ( x i ) = ∑ ∂F ⎞
⎛ ------
⎝ ∂x ⎠
- × u 2 ( xi )
i i i
■ Incertitude type de l’instrument
avec u2(xi) composantes d’incertitude type se rapportant à
L’incertitude type de l’instrument utilisé est calculée selon la mesure de chaque quantité contribuant au
l’équation (18) du tableau 7. résultat final (décrit dans le modèle),
Les incertitudes types liées à la résolution des thermomètres, du c i2 coefficients de sensibilité donnant l’importance
baromètre et de l’hygromètre sont négligées, car leur contribution à de chaque composante individuelle d’incertitude
l’incertitude totale sont très faibles. type.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur P 1 331 − 11
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________
3.3 Coefficients de sensibilité et
approximations d’évaluation
■ Coefficients de sensibilité
Les coefficients de sensibilité sont déterminés en calculant les
dérivées partielles comme l’indique l’équation (14) du tableau 5.
Les incertitudes des formules (6) et (7) du tableau 2 et des cons-
tantes pour ρa et ρW sont très faibles comparées aux autres incerti-
tudes. Elles peuvent être négligées dans l’évaluation de l’incertitude
composée.
■ Approximations d’évaluation
L’évaluation de l’incertitude de mesure ne nécessite pas de
valeurs ou de solutions exactes du mesurande [équation (3) du
tableau 2], comme la détermination de volume V20 elle-même. Les
approximations ne peuvent être utilisées que pour l’évaluation de
l’incertitude.
Les approximations suivantes :
ρW − ρa ≈ ρW
ρb − ρa ≈ ρb
ρW ≈ 1 000 kg/m3
[1 − αc(td − td20)] ≈ 1
ρb − ρW ≈ ρb
peuvent être utilisées sans notation spéciale. En proportion, les pre-
mières approximations sont d’ordre 10−3 ou inférieures et la der-
nière est d’ordre 10−1, ce qui est justifié car elle n’affecte que la
correction de poussée de l’air ambiant.
3.4 Incertitudes liées à la balance
Il existe de nombreuses composantes d’incertitudes liées à la
balance, en voici les principales quantifiables :
— l’incertitude de la balance (valeur issue de son certificat d’éta-
lonnage, quand il existe) ;
— l’erreur maximale tolérée emt (valeur appliquée pour sa
vérification) ;
— la correction de la perte par évaporation ;
— la résolution (échelon réel d, ou précision d’affichage) ;
— la répétabilité (valeur fournie par le constructeur) ;
— la linéarité (valeur fournie par le constructeur) ;
— la dérive en température de la balance (valeur fournie par le
constructeur).
Pour transformer une mesure de masse en mesure de volume,
dans tous les cas, on utilisera le coefficient de sensibilité cb calculé
selon l’équation (19).
■ Incertitude type de l’étalonnage
Quand la balance a fait l’objet d’un étalonnage, on devra retenir
son incertitude et sa pérennité [équation (18)].
L’incertitude type est calculée selon l’équation (20).
■ Incertitude type de la vérification
Dans la majorité des situations, plutôt qu’un étalonnage, on effec-
tue une vérification de la balance (comparaison de l’erreur de
mesure avec l’erreur maximale tolérée emt). Cette vérification sert
de base pour déterminer l’exactitude de la mesure de masse. Dans
ce cas, l’incertitude type est calculée selon l’équation (21).
Nota : les résultats indiqués dans un certificat d’étalonnage de balance ne prennent pas
en compte les conditions ambiantes d’utilisation d’une balance, ni le produit à peser.
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 12 © Techniques de l’Ingénieur
■ Incertitude type de l’évaporation
Un plan d’expérience prenant en compte, notamment, les diffé-
rents récipients, cycles de mesure, opérateurs, conditions de
mesure, permet d’évaluer la correction de la perte par évaporation
du liquide délivré dans le récipient.
En l’absence de plan d’expérience, on l’estime par l’exactitude de
la mesure, connue par l’emt de la balance. L’incertitude type est cal-
culée selon l’équation (22).
■ Incertitude type de la résolution
La composante d’incertitude type sur le résultat, due à la résolu-
tion d de la balance, est calculée selon l’équation (23).
Nota : la détermination du volume fait toujours intervenir la résolution deux fois, une
fois lors de la première pesée (zéro) et une seconde fois lors de la pesée du volume délivré
dans le récipient. Il faudra donc prendre en compte deux fois cette composante.
■ Incertitude type de répétabilité
La plupart des constructeurs de balances d’analyse indique cette
caractéristique dans le mode d’emploi de leur balance et aussi dans
leurs dépliants commerciaux. Cette caractéristique est donnée par
un écart-type.
La composante d’incertitude type sur le résultat, due à la répéta-
bilité de la balance, est calculée selon l’équation (24).
Pour ne pas tenir compte de cette composante, il faut vérifier la
répétabilité de la balance :
— régulièrement ;
— ou avant de débuter l’étalonnage.
Dans tous les cas, l’étendue des mesures observées sera infé-
rieure à l’emt à la charge concernée [1].
■ Incertitude type de la linéarité
Cette caractéristique est aussi fournie par le constructeur de la
balance.
L’incertitude type de la linéarité de la balance est calculée selon
l’équation (25).
Pour ne pas tenir compte de cette composante, il faut vérifier la
justesse de la balance :
— régulièrement ;
— ou avant de débuter l’étalonnage.
Dans tous les cas, l’erreur observée sera inférieure à l’emt à la
charge concernée [1].
■ Incertitude type de la balance
Pour l’exemple de calcul d’incertitude présenté en [Doc. P 1 332],
l’incertitude type de la balance utilisée est calculée selon
l’équation (26). On ne prend en compte que sa résolution et son
erreur maximale tolérée, partant du principe que la balance est véri-
fiée avant son utilisation.
3.5 Incertitudes liées à la pipette
Pour la pipette, voici les composantes d’incertitude retenues :
— influence de la dilatation du cône ;
— influence de la température.
■ Incertitude type de la dilatation du cône
Si le coefficient de dilatation cubique n’est pas fourni par le
constructeur, on sait que celui des matières plastiques varie entre 3
et 6 × 10−4 °C−1. On pourra prendre une valeur moyenne, soit
αc = 4,5 × 10−4 °C−1.
Ce coefficient de dilatation est connu avec une incertitude de
10 %. Son incertitude type est calculée selon l’équation (27). Son
coefficient de sensibilité cαc est calculé selon l’équation (28).
Nota : αc n’est pas une valeur bien définie pour un système composé.
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES
■ Incertitude type de la température
La température td de la pipette à piston n’est ni une constante spa-
tiale ni une constante temporaire en raison de l’échauffement de la
main au milieu et en haut et de l’évaporation / refroidissement en
son sommet.
On l’estimera à : ∆td = ± 2 ˚C
La composante d’incertitude liée à la température de la pipette est
calculée selon l’équation (29).
Le coefficient de sensibilité ctd, relatif à la température de la
pipette, est calculé selon l’équation (30).
3.6 Incertitudes liées à la masse
volumique de l’air
La masse volumique de l’air ρa est déterminée à partir de la
formule (7) du tableau 2 en fonction de la température de l’air (ta),
de la pression atmosphérique (pa) et de l’humidité de l’air (ϕ). Les
paramètres (ta, p et ϕ) nécessaires à la détermination de celle-ci sont
mesurés avec leur propre incertitude (mesurage, précision d’affi-
chage, pérennité).
■ Incertitude type de la pression
On utilise l’incertitude et la pérennité [cf. équation (18)] du
baromètre. L’incertitude type est calculée selon l’équation (31).
Le coefficient de sensibilité cpa relatif à la pression atmosphérique
de l’air pa est calculé selon l’équation (32).
■ Incertitude type de la température
En raison de son défaut d’homogénéité et de stabilité, il n’est pas
possible de mesurer la température de l’air avec une incertitude
type meilleure que 0,5 ˚C.
Quand l’incertitude de thermomètre [cf. équation (18) du
tableau 7] est inférieure à 0,5 ˚C, l’incertitude type liée à la mesure
de la température de l’air sera calculée selon l’équation (33).
Quand l’incertitude de thermomètre est supérieure à 0,5 ˚C,
l’incertitude type liée à la mesure de la température sera calculée
selon l’équation (34).
Le coefficient de sensibilité cta relatif à la température de l’air ta
est calculé selon l’équation (35).
■ Incertitude type de l’humidité relative
On utilise l’incertitude et la pérennité (cf. équation (18) du
tableau 7) de l’hygromètre. L’incertitude type est calculée selon
l’équation (36).
Le coefficient de sensibilité cϕ relatif à l’humidité relative de l’air ϕ
est calculé selon l’équation (37).
■ Incertitude type de la stabilité de l’air
La stabilité de l’air est la différence de masse volumique de l’air
entre le début et la fin des essais.
La composante d’incertitude liée à la stabilité de l’air est calculée
selon l’équation (38).
Le coefficient de sensibilité relatif à la stabilité de l’air est calculé
selon l’équation (39).
■ Incertitude type de la masse volumique de l’air
L’incertitude type de la masse volumique de l’air est calculée selon
l’équation (40).
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur
3.7 Incertitudes liées à la masse
volumique de l’eau pure
■ Incertitude type du thermomètre
On utilise l’incertitude et la pérennité données par l’équation (18)
du tableau 7 pour le thermomètre. La masse volumique de l’eau
pure ρW est déterminée à partir de la formule (6) du tableau 2 en
fonction de la température de l’eau t W. Le paramètre t W nécessaire
à la détermination de celle-ci est mesuré avec sa propre incertitude
(mesurage, précision d’affichage, pérennité).
Cette incertitude de mesure est estimée à ± 0,2 ˚C car la tempéra-
ture de l’eau est plus homogène et plus stable que celle de l’air.
Quand l’incertitude de thermomètre est inférieure à 0,2 ˚C, l’incer-
titude type liée à la mesure de la température sera calculée selon
l’équation (41).
Quand l’incertitude de thermomètre est supérieure à 0,2 ˚C,
l’incertitude type liée à la mesure de la température sera calculée
selon l’équation (42).
Le coefficient de sensibilité ctW relatif à la température de l’eau t W
est calculé selon l’équation (43).
Il est possible d’utiliser l’expression :
∂ρ W
- = – 2 ,1 × 10 – 4 ˚C –1 × ρ W
----------
∂t W
à la place de la somme donnée dans l’équation précédente pour
l’étendue de température de 19 ˚C à 21 ˚C avec suffisamment d’exac-
titude.
Nota : la chaleur de la main peut affecter la température de l’eau t W dans la pointe de la
pipette par évaporation et échauffement/refroidissement.
■ Incertitude type de la variation de température de l’eau
La température de l’eau est mesurée au début et à la fin des mesu-
res. La composante d’incertitude liée à la variation de la tempéra-
ture de l’eau est calculée selon l’équation (44).
On prend ctW, calculé selon l’équation (43) du tableau 7, comme
coefficient de sensibilité relatif à la variation de température de
l’eau.
■ Incertitude type de la masse volumique de l’eau
L’incertitude type de la masse volumique de l’eau est calculée
selon l’équation (45).
3.8 Incertitude type du processus
de distribution
L’incertitude type du processus de distribution sproc est calculée à
partir de l’écart-type s (cf. équation (11) du tableau 2) du volume V20.
Cette estimation pour n déterminations est calculée selon
l’équation (46) avec n = 10.
Pour un nombre de mesures inférieur (ex : 4), il est possible de
remplacer l’écart-type s par l’étendue W du volume V20.
L’incertitude type sera calculée selon l’équation (47), avec n = 6 ou
4 (selon le nombre de mesures effectué).
P 1 331 − 13
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

4. Exemple de calcul Pour le détail des résultats se reporter en [Doc. P 1 332].

• Incertitude type du système gravimétrique :
d’incertitude u(V20) = 0,059 µL
• Incertitude type du processus de distribution :
sproc = 0,091 µL
4.1 Conditions de mesure • Incertitude composée :
uc(V20) = (58,92 + 91,32)1/2 nL = 108,6 nL ≈ 0,109 µL
• 10 mesures fermées, c’est-à-dire sans ajout ni rejet d’aucune, • Incertitude de l’étalonnage pour le volume délivré :
pour un volume nominal de 100 µL d’eau, délivrées par une pipette
à piston. V20 = 100,3 µL ± 0,22 µL (k = 2)
• Balance : Max = 200 g, d = 10 µg Un seul volume délivré est pris en compte dans cette formule,
l’écart-type expérimental (91,3 nL) n’est pas divisé par n .
• Mesure des conditions ambiantes (ta, pa, ϕ et t W) au début et à la
fin des mesures.
Commentaires sur la détermination de l’incertitude
• Certaines valeurs des coefficients de sensibilité sont four-
4.2 Résultats nies pour un volume précis ; elles ne doivent pas être utilisées
pour d’autres volumes.
• L’incertitude associée avec la mesure gravimétrique est prin-
• Volume moyen : V20 = 100,26 µL cipalement attribuée à l’incertitude associée avec le résultat
• Biais systématique de mesure : V20 − Vs = 0,26 µL donné par la balance.
• Bien que le coefficient de dilatation et la température de la
• Erreur aléatoire de mesure (écart-type expérimental) : s(Vi ) = 0,29 µL pipette à piston soient pris en compte, d’autres effets ne sont
• Écart-type expérimental de la moyenne : pas considérés (ex : effet de l’interface de l’air qui n’est pas
s ( V 20 ) = s ( V i ) ⁄ n = 0 ,09 µ L saturé de vapeur d’eau).

(0)

Tableau 8 – Limites autorisées pour les pipettes de type A, selon ISO 8655-2
Volume nominal Limites de biais systématiques autorisées (1) Limites d’erreurs aléatoires autorisées

(µL) (± %) (± µL) (± %) (1) (± µL) (1)

1 5,0 0,05 5 0,05
2 4,0 0,08 2 0,04
5 2,5 0,125 1,5 0,075
10 1,2 0,12 0,8 0,08
20 1,0 0,2 0,5 0,1
50 1,0 0,5 0,4 0,2
100 0,8 0,8 0,3 0,3
200 0,8 1,6 0,3 0,6
500 0,8 4,0 0,3 1,5
1 000 0,8 8,0 0,3 3,0
2 000 0,8 16 0,3 6,0
5 000 0,8 40 0,3 15,0
10 000 0,6 60 0,3 30,0
(1) Exprimées comme l’écart de la moyenne de 10 mesures effectuées par rapport au volume nominal ou au volume sélectionné
(2) Exprimées comme le coefficient de variation de 10 mesures effectuées
(3) Exprimées comme l’écart-type de répétabilité de 10 mesures effectuées
Remarque
Pour les pipettes dont le volume nominal est intermédiaire entre deux valeurs de volume données dans ce tableau, leurs limites d’erreurs autorisées sont égales
aux valeurs absolues des erreurs définies pour le volume nominal immédiatement supérieur. Cela signifie que la limite de biais systématique autorisée d’une
pipette à piston d’un volume nominal de 25 µL est de ± 0,5 µL et que sa limite d’erreur aléatoire autorisée est de ± 0,2 µL.
Lors de l’essai de conformité, les erreurs maximales tolérées définies pour les volumes nominaux de ce tableau s’appliquent à tous les volumes choisis dans la
plage de volume de la pipette à piston ; c’est-à-dire, les biais systématiques maximaux tolérés des pipettes à piston à volume variable de type A avec une plage de
volume allant de 10 µL à 100 µL sont de ± 0,8 µL et les erreurs aléatoires maximales tolérées sont de ± 0,3 µL pour chaque volume mesuré.
Les biais systématiques maximaux et les erreurs aléatoires maximales des pipettes à piston multicanal sont égaux à deux fois les valeurs spécifiées pour les
pipettes à piston monocanal dans ce tableau. Chaque canal de la pipette à piston multicanal est considéré individuellement et doit satisfaire à ces spécifications.
Dans le cas de pipettes à piston multicanal à volume variable, les biais maximaux tolérés pour le volume nominal s’appliquent à tous les volumes choisis à tra-
vers la plage de volume.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 14 © Techniques de l’Ingénieur
____________________________________________________________________________________________________________________________ PIPETTES

4.3 Exploitation des résultats 5.1 Contrôles

L’incertitude type associée au volume V20 mesuré avec le système
de mesure gravimétrique (cf. équation (14) du tableau 5) devrait
être inférieure au tiers de l’incertitude type (attendue) associée au
volume délivré par la pipette qui vient d’être étalonnée. Cela permet
de s’assurer que l’incertitude obtenue pendant l’étalonnage est prin-
cipalement due à l’incertitude causée par la pipette.
Si la valeur moyenne des erreurs absolues obtenues, augmentée
de l’incertitude élargie pour chaque volume d’eau, est inférieure ou
égale à l’erreur maximale tolérée de chaque volume (tableau 8),
alors l’instrument est déclaré conforme. Dans le cas contraire, la
pipette est déclarée non conforme. Elle est alors réparée ou
déclassée. Si la réparation n’a pas apportée d’amélioration, elle est
réformée.
Les résultats obtenus sont consignés dans la fiche signalétique
de l’instrument (cf. [Doc. P 1 332]).
4.4 Constat de vérification
Le constat de vérification permet d’assurer la traçabilité et le trai-
tement des résultats bruts associés à une incertitude. Il comporte au
moins les informations suivantes :
— l’identification de la pipette ;
— la méthode et la date ;
— le (ou les) volumes contrôlés ;
— le biais systématique et l’erreur aléatoire ;
— le coefficient de variation ;
— l’incertitude de mesure.
Un exemple de constat est présenté en [Doc. P 1 332].
Pour une utilisation régulière, il convient :
— de vérifier l’absence de rayures ou de dommages sur l’embout
et d’assemblages lâches. Si l’un de ces défauts est constaté ou si la
pipette est très sollicitée mécaniquement, il faut procéder à un
contrôle gravimétrique.
— d’aspirer le volume nominal maximal avec l’eau distillée et de
placer verticalement et délicatement la pipette sur son support.
Après 1 min, aucune goutte ne doit apparaître à la pointe.
5.2 Ajustage
Une pipette à piston doit être entretenue et ajustée par son fabri-
cant en vue de la distribution (Ex) de son volume nominal (ou du
volume choisi, dans le cas d’un modèle à volume variable), pour une
température de référence de 20 ˚C, une humidité relative de l’air de
50 % et une pression barométrique de 1 013 hPa, en utilisant de
l’eau pure de qualité 3.
Certaines pipettes à piston sont conçues pour pouvoir être
ajustées par l’utilisateur lorsque, par exemple, la vérification révèle
que le volume distribué se trouve en dehors des spécifications. Cet
ajustage par l’utilisateur doit être effectué conformément aux ins-
tructions du fabricant en se référant à la méthode d’essai gravimé-
trique.
L’ajustage d’une pipette repose sur plusieurs calibrages, au mini-
mum un calibrage avant et après l’ajustage. Un ajustage permet de
corriger un défaut d’exactitude trop important. Mais il peut aussi
servir à adapter une pipette à la mesure régulière d’un liquide ayant
une densité nettement différente de celle de l’eau (par exemple,
solutions salines concentrées, cf. tableau 10).

5. Maintenance, contrôles, La plupart des fabricants, propose un service combiné de cali-

calibrage et ajustage
La gestion moderne de la qualité (ISO 9001, ISO 17025, textes BPL
et BPF) exige le contrôle et l’entretien périodique des instruments de
mesure. Indépendamment de ces référentiels, les techniciens de
laboratoire consciencieux ont de tout temps considéré comme évi-
dent de contrôler périodiquement leur jeu de pipettes (cf. fiche de
vie en [Doc. P 1 332]).
Le tableau 9 présente la périodicité du contrôle et les actions à
entreprendre.
(0)
brage/ajustage, ce qui nécessite évidemment un réseau d’agences
de maintenance bien développé. Les pipettes modernes sont cepen-
dant conçues de manière à pouvoir également être ajustées par l’uti-
lisateur.
Les manipulations nécessaires à l’ajustage d’une pipette varient
beaucoup d’un produit à l’autre, raison pour laquelle cet aspect ne
sera pas traité ici. En règle générale, la démarche à suivre est décrite
en détail dans la documentation technique de l’instrument. Avant de
choisir une pipette, il est par conséquent avantageux de vérifier avec
quelle facilité et sécurité elle se laisse ajuster.

5.3 Calibrage
Tableau 9 – Contrôle périodique de la pipette
Contrôle Niveau Test
Par calibrage on entend la comparaison du volume effectif et du
Quotidien Test de Étanchéité, contrôle visuel, volume cible des pipettes. Le calibrage est un ajustage particulier, il
fonctionnement fonctionnalité est décrit dans le mode d’emploi de la pipette.
Hebdomadaire Test rapide Comme test de fonctionnement ; Un calibrage devrait être effectué périodiquement, en tout cas
vérifier de plus l’exactitude par
contrôle gravimétrique (chaque après chaque nettoyage ou remplacement de pièces.
fois 4 pipetages de 10, 50 et
100 % du volume nominal) Les grandeurs pour l’exploitation et l’évaluation du calibrage sont
les valeurs tirées de l’étalonnage pour le biais systématique es et le
Trimestriel ISO 8655 Nettoyage, test de fonctionne- coefficient de variation CV.
ment, contrôle gravimétrique
selon ISO 8655. Conservation Ces valeurs peuvent être illustrées à l’aide d’une cible. Les figures
des résultats du test. montrent trois catégories typiques de résultats de mesure.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur P 1 331 − 15
PIPETTES _____________________________________________________________________________________________________________________________

(0)

Tableau 10 – Recommandations pour contourner les difficultés des substances à pipeter

Concentration Masse volumique Pression de vapeur Viscosité
Substance Recommandation (1)
(%) (mg/µL) (mbar) (mPa ⋅ s)
Acétone 100 0,79 240 0,3 SP
Acide acétique 100 1,05 15 Normal
Acide chloracétique 100 1,60 Ajust.
Acide chlorhydrique 98 1,84 29,0 Ajust.
Acide fluorhydrique 60 1,13 Ajust.
Acide formique 10 1,23 42 Ajust.
Acide nitrique 70 1,41 0,9 Ajust.
Acide phosphorique 85 1,69 Ajust.
Acide sulfurique 30 1,15 1,4 Ajust.
Acide trichloroacétique 50 1,62 Ajust.
Butanol 100 0,81 7 Ajust.
Chloroforme 100 1,47 213 0,6 Ajust./SP
Diéthyléther 0,79 584 ---
Eau --- 1,00 23 1,0 Normal
(1,3)
Éthanol 96 0,79 59 1,2 Ajust./SP
Glycérol 1,26 1 470,0 ---
Hexane 160 SP
Huile d’olive 0,91 84,0 SP
Hydroxyde de potassium 30 1,29 Ajust.
Hydroxyde de sodium 30 1,33 Ajust.
Isopropanol 100 0,78 43 Ajust.
Méthanol 100 0,79 128 1,2 PM
Pentane 0,62 ---
Plasma sanguin 1,5 SP
Sang 2,0 à 3,0 SP
(1) Ajust. : ajuster à la masse volumique différente
Normal : sans problème
SP : surpipetage
PM : prémouillage
--- ne convient pas pour les pipettes à colonne d’air

■ Mauvaise répétabilité, bonne justesse (figure 2 a)

Les valeurs individuelles (impacts sur la cible) sont très disper-
sées mais uniformément réparties autour de la valeur cible, la
moyenne est, par conséquent proche de la valeur cible.

■ Bonne répétabilité, mauvaise justesse (figure 2 b)

Les valeurs sont groupées, leur moyenne s’écarte cependant
nettement de la valeur cible.
a b c
■ Bonne répétabilité, bonne justesse (figure 2 c)
Les valeurs sont groupées et leur moyenne est proche de la valeur Figure 2 – Calibrage d’une pipette
cible.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 1 331 − 16 © Techniques de l’Ingénieur