RECHERCHE

Puces à ADN
par Pascal SOULARUE* et Xavier GIDROL**

Nouveaux outils d’étude des composants moléculaires de la cellule, les puces à ADN
ont permis la mesure massivement parallèle de la concentration à l’équilibre des ARNm.
Un grand nombre d’applications peuvent être envisagées comme l’étude des réseaux
génétiques au sein d’une cellule ou l’obtention de signatures moléculaires caractéristiques
d’un type de cellule, d’une pathologie ou d’un patient.

1. De la notion de cellule Ainsi l’ADN présent dans une cellule de levure est * Ingénieur
Responsable de la plate-
constitué d’un enchaînement de 14 millions de
à celle de transcriptome nucléotides, 170 millions de nucléotides dans une
forme Biopuces du SGF

cellule de mouche et 3 000 milliards de nucléotides ** Docteur en biologie

1.1 La cellule dans une cellule humaine. Ces nucléotides sont eux-
moléculaire et cellulaire
Chef du service de
Tous les organismes vivants sont constitués d’un mêmes des molécules complexes résultant de l’asso- génomique fonction-
nombre variable de cellules : d’une cellule pour les ciation d’un sucre, d’un groupement phosphate et nelle (SGF)
bactéries et les levures à plusieurs milliers de mil- d’une base azotée. Seules 4 bases azotées sont utili-
liards pour les organismes supérieurs. Mais, quel que sées, ne donnant ainsi naissance qu’à 4 nucléotides CEA Evry.
soit l’organisme auquel elles appartiennent, ces cel- différents : l’adénine (A), la cytosine (C), la guanine
lules présentent des caractéristiques communes (G) et la thymine (T). Ces 4 nucléotides, et ces
quant à leur composition, leur architecture ou leur 4 seuls, constituent la molécule d’ADN de tous les La membrane cellu-
mode de fonctionnement. laire délimite la cellule.
êtres vivants. Elle est perméable,
Ainsi chez de nombreux organismes complexes, les permettant ainsi les
échanges entre cellules
eucaryotes, l’information génétique est comparti- On peut ainsi comparer l’ADN à une gigantes- ou avec le milieu exté-
mentée dans le noyau (figure 1). que encyclopédie (de plus de 2 millions de pages rieur.
Le cytoplasme est un
dans le cas de l’ADN humain), encyclopédie dans compartiment semi-
1.2 L’ADN laquelle ne figurerait que les seuls caractères : A, liquide dans lequel se
trouvent différents
C, G et T. organites et où se tien-
nent toutes les réac-
1.2.1 Composition tions métaboliques
participant au bon
L’ADN, présent dans le noyau de chacune des cel- 1.2.2 Structure fonctionnement de la
cellule (respiration,
lules, est une molécule gigantesque composée d’un synthèse protéique,
enchaînement linéaire de millions d’unités appelées La molécule d’ADN, in vivo, ne se présente que dégradation des méta-
bolites...).
nucléotides. sous la forme d’un double brin enroulé en double La membrane nuclé-
hélice, où les deux brins ont une séquence parfaite- aire délimite le noyau
qui renferme l’ADN
ment complémentaire (un A est toujours complé- (acide désoxyribonu-
mentaire d’un T, un C d’un G). Cette complé- cléique), forme de
stockage de l’informa-
mentarité est fondamentale pour la cohésion de la tion génétique de tout
molécule d’ADN. Elle est à la base de la plupart des être vivant.
techniques d’analyse de l’ADN en biologie molécu-
Membrane laire (figure 2).
cellulaire
Pour une espèce donnée, la séquence de la molé-
Cytoplasme cule d’ADN, c’est-à-dire l’enchaînement des nucléoti-
des, est globalement semblable. Il existe cependant,
Membrane au sein d’une même espèce, des variations entre les
nucléaire séquences d’ADN de chaque individu : c’est le poly-
Dans les Techniques
morphisme. Ce polymorphisme peut être silencieux de l’Ingénieur :
ou se manifester par la modification d’un caractère Analyse des macromo-
observable (résistance à un antibiotique chez une lécules biologiques et
applications [P 3 305],
bactérie, couleur des yeux chez la mouche ou forme par J.-M. Chéron et al.
Figure 1 – La cellule eucaryote du nez chez l’homme). Il peut quelquefois être à l’ori- (1992).

06-2002 © Techniques de l’Ingénieur RE 6 - 1

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C C
A T
G G
A C
T A
C G
G complémentaires
T T
G C
Liaison hydrogène Squelette sucre-phosphate
Figure 2 – Structure de l’ADN
gine d’un dysfonctionnement grave de l’organisme
(maladie génétique chez l’être humain).
Si l’on reprend l’analogie entre la molécule
d’ADN et une encyclopédie, le polymorphisme
peut être assimilé à des « fautes de frappe ».
Certaines de ces fautes peuvent n’avoir aucune
incidence sur la compréhension du texte (ex :
baktérie, bactèrie ou bactéri pour « bactérie »),
d’autres peuvent, au contraire, en modifier com-
plètement le sens et le rendre totalement incom-
préhensible (douche, souche moche, moiche,
mouhe en lieu et place de « mouche »).
1.3 Notion de génome
L’ADN est la forme de stockage de l’information
génétique de tout être vivant. L’unité de base de
cette information est le gène. Un gène est une petite
séquence d’ADN particulière qui va être utilisée par la
cellule pour synthétiser les protéines, les enzymes
qui lui sont nécessaires pour assurer le bon fonction-
nement de la machinerie cellulaire : respiration, divi-
sion et croissance, échanges avec les autres cellules,
lutte contre les agressions extérieures, dégradation
ou transformation de différents métabolites...
Ces gènes présentent différentes caractéristiques :
— ils sont disséminés le long du double brin d’ADN
de chacune des cellules ;
— leur taille, et donc leur séquence, présente une
longueur variable (de quelques centaines de nucléo-
tides à quelques milliers) ;
— chez les organismes supérieurs, ils sont morce-
lés en de nombreux fragments informationnels appe-
lés exons, séparés par des morceaux de séquences
dont le rôle est pour l’instant indéterminé nommés
introns ;
— leurs séquences mises bout à bout ne représen-
tent qu’une infime partie de la totalité de la molécule
d’ADN : de l’ordre de 5 % seulement chez l’homme,
voire moins.
L’ensemble de ces gènes, dont le nombre varie de
quelques milliers chez la levure (6 200) à une tren-
RE 6 - 2 © Techniques de l’Ingénieur
C T
A G
G A
C A
T
C A
Nucléotides
T
G
taine de milliers chez la souris ou l’homme, constitue
le génome des êtres vivants.
La molécule d’ADN est en fait analogue à une
encyclopédie dans laquelle on trouverait 95 % de
ponctuation (séquences non codantes) et seule-
ment 5 % de texte. Ce texte serait une succes-
sion d’informations (les gènes), composées
exclusivement des 4 lettres A, C, G et T. Chaque
information comprend des paragraphes, les
exons, interrompus par des messages publicitai-
res, les introns : l’information TACTACTACTAC-
TAC peut ainsi y être représentée par la
séquence suivante : ... ...
..gcagacggcatcgTACTAgttgacgtgaCTACTAtgtgc-
tacatgacataaatgggaatCTACccgaactg... ....
Les gènes sont disséminés le long du génome, il
est par conséquent très difficile d’en localiser sur la
molécule d’ADN, et encore plus de l’identifier, de lui
attribuer sa fonction exacte dans la cellule. Caracté-
riser l’ensemble des gènes d’un organisme supérieur
est donc un projet titanesque. Pouvoir attribuer à
chaque gène une fonction exacte dans la cellule,
pouvoir établir de manière fine comment ils inter-
agissent entre eux est un enjeu considérable pour la
médecine de demain.
Même si les grands projets de cartographie des
génomes, réalisés dans les années 1990, et l’avance-
ment du séquençage total de génomes d’organismes
supérieurs (1998-2000) ont déjà permis de caracté-
riser un nombre important de gènes, ces outils ne
donnent que peu d’informations sur la fonction
exacte de ces gènes ainsi que sur leurs interactions
fines. L’ère de l’après-gène, ou post-génomique,
commence seulement !
1.4 Du génome au transcriptome
En fonction de leurs différents besoins, les cellules
vont utiliser tout ou partie de ces informations (les
gènes) pour réaliser la synthèse des protéines
nécessaires aux grandes fonctions cellulaires.
Le passage du gène (unité informationnelle pré-
sente dans le noyau) à la protéine (unité fonction-
nelle synthétisée dans le cytoplasme) se fait en deux
06-2002

Gène A
Exon 1 Exon 2
Exon 1 Exon 2 Exon 3
ARN messager
ARN messager
Protéine
Figure 3 – Passage du gène à la protéine
étapes dites de transcription puis de traduction, pas-
sant par la synthèse d’un intermédiaire important :
l’ARN messager, selon le principe décrit sur la
figure 3.
À partir d’un même gène, plusieurs copies d’ARN
messagers peuvent être produites simultanément en
fonction de l’activité de la cellule.
Le noyau de la cellule est comparable à une
bibliothèque où serait stockées toutes les infor-
mations vitales pour la cellule. Comme dans tou-
tes les bibliothèques, les originaux ne peuvent
sortir. Seules les photocopies y sont autorisées.
L’ADN est donc photocopié en un nombre d’exem-
plaires variable à l’intérieur du noyau au cours de
l’étape dite de transcription. Les photocopies,
ici les ARNs messagers, sont ensuite distribuées
dans le cytoplasme aux unités de production pro-
téique que sont les ribosomes : c’est l’étape de
traduction.
On appelle transcriptome l’ensemble des ARN
messagers transcrits. Plusieurs milliers de transcrits
différents sont présents dans le cytoplasme de la cel-
lule à un instant donné.
06-2002
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Chromosome
Gène B
Exon 3
Transcription
AAAAA
Noyau
Cytoplasme
AAAAA
Traduction
Ce transcriptome est le reflet instantané de l’acti-
vité cellulaire. Il peut donc varier :
— d’un type cellulaire à l’autre (neurone, cellule
sanguine, cellule de la peau...) ;
— pour un type cellulaire donné, il varie au cours
des différentes phases de la vie de la cellule ;
— il varie également lorsque les cellules sont sou-
mises à des conditions particulières de stress (modi-
fications environnementales : changement de milieu,
radiations, stress chimique ou provoqué par des
médicaments...) ;
— il diffère enfin entre un état sain de la cellule et
un état pathologique de celle-ci.
Pouvoir comparer le transcriptome de différents
types cellulaires, dans différentes conditions de
stress, pouvoir analyser l’ensemble du transcriptome
d’une cellule à différents stades de son cycle cellu-
laire ou dans des conditions « pathologiques » per-
mettrait de mieux comprendre le fonctionnement
cellulaire sur le plan fondamental. Cette analyse du
transcriptome offre également beaucoup d’intérêt en
termes d’applications comme nous le verrons ci-
après.
© Techniques de l’Ingénieur RE 6 - 3
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Addition de A
Cette analyse simultanée de milliers de trans- A
crits en parallèle n’était pas envisageable il y a
seulement une dizaine d’années. Le développe- A
ment, au début des années 1990, d’un nouvel A
outil d’analyses, les PUCES à ADN, l’a rendue
désormais possible.

A Masque
2. Les puces à ADN T A C A G
C G C C T A
2.1 Principe A G T G G G
Comme décrit précédemment, l’ADN est présent A T G T G A
dans la cellule sous forme d’un double brin, la
séquence de chaque brin (c’est-à-dire la succession
des nucléotides) étant parfaitement complémentaire a synthèse « in situ » base par base,
de la séquence du brin en vis-à-vis (cf. figure 2). utilisant des masques successifs
C’est ce principe qui sert de base au concept des
puces à ADN, comme à beaucoup d’autres techni-
C
ques utilisées en biologie moléculaire, d’ailleurs.
C
Les puces à ADN sont en fait des supports fonction-
nalisés en verre ou en silicium, de petite taille (la T
taille d’une lame de microscope : 25 mm × 75 mm) T G G
sur lesquels vont être synthétisées directement, ou A G
C
greffées après synthèse, des milliers de séquences
d’ADN nucléiques, appelées sondes, caractéristiques A C T
d’autant de gènes (entre 5 000 et 12 000) (figure 4). A C A
La synthèse directe sur la lame est très onéreuse C T C
et peu souple car elle nécessite la conception de T G C
masques différents pour chaque étape de couplage A T
G
entre deux nucléotides. Aussi la méthode de greffage
des sondes après synthèse se révèle être la plus cou-
ramment utilisée : moins coûteuse, elle permet de Puce
déposer n’importe quelle sonde déjà synthétisée. Ces
puces à ADN sont ensuite mises en contact avec b greffage des sondes après synthèse
l’ensemble des transcrits issus d’une cellule, les
cibles, marqués par un fluorochrome. C’est l’étape Figure 4 – Greffage des sondes sur la puce
d’hybridation. Pendant cette étape, les séquences
cibles marquées du fluorochrome reconnaissent,
parmi les séquences sondes greffées sur la puce, cel- met, pour chaque gène que l’on veut voir figurer sur
les qui leur sont complémentaires et s’y apparient. la puce, de déterminer de courtes séquences nucléo-
Après hybridation, les hybrides cibles/sondes, sont tidiques le caractérisant. Juste avant l’hybridation, on
repérés et quantifiés grâce à leur fluorescence. dénature l’ADN pour qu’il se trouve sous la forme
Outre le fait que l’on peut, grâce aux puces à ADN, simple brin sur la puce, ce qui lui permettra de
analyser en un même temps un nombre considérable s’accrocher au brin complémentaire contenu dans la
de séquences, l’utilisation de 2 fluorochromes diffé- cible. Ces séquences vont servir d’amorces à une
rents [un rouge (Cy5) et un vert (Cy3) par exem- enzyme, la polymérase, qui synthétise par des réac-
ple] permet de comparer les niveaux d’expression tions en chaîne des copies rigoureusement identi-
relatifs de 2 transcriptomes différents sur une même ques caractéristiques du gène en question afin
Dans les Techniques puce. On obtient alors, en une seule étape et donc d’obtenir une quantité suffisante de sonde : c’est la
de l’Ingénieur : dans des conditions rigoureusement identiques technique de PCR (polymerase chain reaction)
Analyse des acides d’hybridation, 2 images : une rouge et une verte (figure 6).
nucléiques [P 3 315],
par B. Parfait et représentatives chacune d’un transcriptome. Ces Après 35 ou 40 cycles, l’ADN ainsi synthétisé (ou
D. Vidaud (2002). 2 images sont ensuite superposées « in silico » pour sonde) est purifié et quantifié. Il est alors quantita-
analyser le différentiel d’expression (figure 5). tivement et qualitativement prêt à être déposé
mécaniquement sur le support : la puce.
2.2 Les différentes étapes
de la réalisation d’une puce à ADN ■ Dépôt des sondes sur le support
fonctionnalisé
sur lame de verre
Après la synthèse, la purification et le contrôle des
■ Production des sondes milliers de sondes, celles-ci sont déposées sur la
Les sondes sont des séquences d’ADN double brin puce : une lame de verre de 25 mm × 75 mm recou-
caractéristiques des gènes dont on cherche à déter- verte d’une fine couche de polymère (du silane ou de
miner la fonction ou l’implication dans un processus la l-polylysine), permettant de « fixer » les sondes
métabolique. L’accès à des bases de séquences per- génomiques par de simples liaisons électrostatiques.

RE 6 - 4 © Techniques de l’Ingénieur 06-2002

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Transcriptome modifié
marqué au Cy5 (rouge)
Puce ADN

Image Cy5
635 nm

Scanner Image
résultante

Hybridation
compétitive

Image Cy3
532 nm
Transcriptome témoin
marqué au Cy3 (vert)

Figure 5 – Principe de l’hybridation compétitive

ADN double brin

96 °C Dénaturation

ADN dénaturé

55 à 60 °C Appariement
des amorces

Amorçage

72 °C Élongation

Synthèse des brins …

complémentaires

Fin du 1er cycle Fin du 2e cycle Fin du 3e cycle

Figure 6 – Production des sondes par PCR

Le dépôt est effectué par des robots dont la précision
est de l’ordre de la dizaine de micromètres.
Le dépôt proprement dit peut être réalisé par con-
tact grâce à des aiguilles qui prélèvent un infime
volume de sonde et qui viennent au contact de la
lame, ou par une technique de « jet d’encre ». Dans
ce cas, la sonde, prélevée par une buse, est projetée
sur la lame, sans contact direct avec celle-ci. Le dia-
mètre des dépôts peut varier de 80 à 300 µm. La dis-
tance entre 2 dépôts sur la lame est de l’ordre de
250 µm (centre à centre) dans les 2 directions. Le
volume de sonde déposé est lui de l’ordre de 2 nL.

06-2002 © Techniques de l’Ingénieur RE 6 - 5

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Dans notre laboratoire, nous réalisons en routine des

spots de 180 µm de diamètre avec un espacement de A A T
centre à centre de 250 µm. T T T
250 µm A A A Cible marquée
■ Préparation et marquage des cibles T A C complémentaire
de la sonde
À un instant donné, des milliers de transcrits diffé- A—T T T

180 µm
greffée
rents sont présents dans les cellules. Leur abondance T—A A A
relative est révélatrice de l’activité cellulaire du T—A A A
moment. Afin d’analyser l’ensemble de ces transcrits T—A A—T A—T
qui serviront de cibles pour l’étape d’hybridation, il A—T T—A T—A
faut les extraire, puis leur incorporer un marqueur T—A A—T T—A
fluorescent qui permettra d’évaluer et de quantifier A—T A—T A—T Sonde greffée
Schéma de dépôt T—A A—T G—C
des sondes l’appariement sonde/cible. L’extraction de ces trans-
A—T T—A T—A
crits se fait à partir de quelques millions de cellules
A—T T—A C—G
(provenant de cultures cellulaires ou de biopsies), T—A A—T A—T
par les techniques physico-chimiques classiques de
séparation (lyse de la cellule et séparation sélective
Si l’on réalise le mar- Puce
quage au jour J, l’hybri- des ARN messagers).
dation de la puce se fait
sur la nuit, l’acquisition Comme il n’existe aucune technique de marquage
de l’image survient le direct de ces ARN, le marquage de ces derniers à Figure 7 – Hybridation spécifique cibles marquées/
jour suivant (J+1). sondes
L’analyse de l’image l’aide de marqueurs fluorescents nécessite une étape
peut se faire dans la supplémentaire : pour réaliser le marquage, on
journée J+1 voire J+2
(selon le nombre de effectue une transcription inverse pour revenir de
spots à analyser). l’ARN messager à la séquence nucléotidique du gène obtenir des valeurs relatives ou ratio d’expression,
de départ. C’est durant cette réaction de synthèse pour chacun des gènes présents sur la puce.
inverse que sont incorporés les marqueurs fluores-
cents (rouge Cy5 ou vert Cy3). On obtient ainsi un
mélange de cibles marquées qui seront ensuite mises
3.1 Localisation des spots
en contact avec les sondes greffées sur la puce pour Pour localiser les spots, il faut utiliser un
l’étape d’hybridation. « masque », une grille théorique définie par des cri-
tères précis pour la disposition des lignes et colon-
■ Étape d’hybridation
nes, en fonction du plan de dépôt. Ce masque est
Elle consiste à mettre en présence les séquences placé sur l’image pour repérer chacun des spots. Ce
cibles marquées et les séquences sondes greffées sur repérage doit être simple, rapide, automatique et
la puce. Du fait de la complémentarité A-T et G-C, les précis.
séquences complémentaires s’apparient (figure 7).
En effet, si l’expérimentateur devait réajuster
La réaction d’hybridation dure quelques heures en manuellement 10 000 spots par puce, cela pourrait
milieu liquide favorisant les liaisons entre séquences prendre énormément de temps. Il faut donc trouver
complémentaires. Les lames, après hybridation, sont le juste équilibre entre la précision du repérage et le
rincées pour se débarrasser des cibles ne s’étant pas gain de temps, car une bonne localisation des spots
fixées ou s’étant fixées de manière non spécifique. est essentielle pour la suite de l’analyse.
Après séchage, les lames sont scannées afin d’établir
le profil d’hybridation.
3.2 Segmentation des spots
3. Acquisition de l’image La segmentation est un processus de classification
des pixels d’une image, en fonction de leurs proprié-
et analyse des données tés. Pour les puces à ADN, la segmentation permet
d’identifier chaque pixel « bruit de fond » ou
Après la lecture des lames par un scanner qui per-
« signal ». Le bruit de fond n’est jamais uniforme sur
met de mesurer la fluorescence de chaque spot sur la
une lame, il varie en fonction de la surface, de l’auto-
lame, il convient d’analyser les images obtenues pour
fluorescence du support ou de l’hybridation non spé-
pouvoir en extraire une indication sur le différentiel
cifique. Il est donc indispensable d’évaluer le bruit de
d’expression pour chacun des gènes présents sur la
fond pour chaque spot. Il existe plusieurs méthodes
puce.
de segmentation qui peuvent être classées en quatre
L’analyse d’image se fait en trois étapes : catégories en fonction de la définition du spot : cercle
— localisation des spots, c’est-à-dire déter- fixe, cercle adaptable, histogramme et forme adapta-
mination des coordonnées de chaque spot sur la ble [1] (figure 9).
puce ;
■ Segmentation en cercle fixe
— segmentation des spots qui permet de discri-
miner, pour chaque spot, les pixels « signal » des Le contour du spot est défini par un cercle de dia-
pixels « bruit de fond » ; mètre constant, identique pour tous les spots de
l’image. Les pixels à l’intérieur du cercle correspon-
— extraction des données : elle consiste à défi- dent au signal, ceux à l’extérieur au bruit de fond.
nir, pour chaque spot, des paires d’intensités du Cette méthode décrite pour la première fois par
signal Cy3 et Cy5. (figure 8) l’équipe d’Eisen de l’université de Stanford [2] est
Les valeurs brutes obtenues à l’issue de l’analyse particulièrement efficace lorsque les spots sont
d’image sont ensuite filtrées et normalisées pour homogènes et parfaitement localisés. En revanche,

RE 6 - 6 © Techniques de l’Ingénieur 06-2002

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SO–
3 SO–
3

–O S
3 SO–
3
N+ N

O O N

O
a formule chimique du fluorochrome Cy3TM

SO–
3 SO–
3

–O S
3 SO–
3
N+ N
Le spot est délimité par un cercle rouge
O
Figure 9 – Image illustrant les différentes méthodes
O N de calcul de bruit de fond
O

b formule chimique du fluorochrome Cy5TM

pixels situés dans cette zone tampon entre la zone
signal et la zone bruit sont éliminés de la mesure.
Cette méthode est plus robuste ; toutefois comme
pour les cercles fixes, il existe une perte d’informa-
Émission de fluorescence normalisée

tion sur les spots très irréguliers.

100
Cy3 Cy5
■ Histogramme
80
Cette méthode utilise un masque beaucoup plus
60 large que les spots, en général une surface carrée,
autour des spots. Le signal et le bruit de fond sont
40 déterminés à partir d’un histogramme de distribution
des intensités de chaque pixel de la surface considé-
20 rée autour du spot. Plusieurs approches statistiques
peuvent être alors utilisées pour différencier les deux
0 populations de pixels. Les pixels qui dépassent une
500 550 600 650 700 750 800 850 valeur seuil sont classés en tant que signaux, les
Longueur d'onde (nm) autres sont définis comme bruit de fond. L’avantage
majeur de cette méthode est sa simplicité et la pos-
c émission de fluorescence des deux sibilité de traiter n’importe quelle forme de spot. En
fluorochromes a et b revanche, la quantification est instable car elle
dépend du test et de la valeur seuil utilisée pour la Pour le calcul du bruit
de fond, les logiciels
Figure 8 – Formule chimique et émission segmentation. Quantarray, Scanalyse,
de fluorescence de Cy3 et Cy5 et Spot tiennent
compte respectivement
■ Forme adaptative des zones délimitées en
vert, en bleu ou en
mauve sur la figure 9.
elle est très sensible aux irrégularités de taille et de Dans le but de pallier les problèmes d’irrégularité
forme des spots. des spots, on a défini des algorithmes de segmenta-
tion prenant en considération la forme de chaque
■ Cercle adaptable spot. Deux méthodes sont couramment utilisées
Le diamètre de chaque spot est estimé par une dans l’analyse d’image : « ligne de partage » et
méthode automatique et le contour des spots varie « tête de série croissante ». Ces deux approches
donc en fonction du diamètre. De la même manière nécessitent la localisation d’une origine pour définir
que pour les cercles fixes, les pixels à l’intérieur du le spot « tête de série », avant de définir son contour
cercle correspondent au signal. Les pixels et d’analyser de proche en proche les niveaux
« brillants » à l’extérieur du cercle peuvent fausser la d’intensité autour du pixel initial. Dans l’analyse des
mesure et entraîner des erreurs. Afin de les diminuer, puces, la position de spots étant connue a priori, ce
une zone tampon est définie par l’algorithme. Les type d’approche paraît justifié.

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3.3 Extraction des données
■ Sélection des gènes significatifs
Le niveau d’expression d’un gène correspond en
fait à une mesure relative des intensités de fluores-
cence en Cy5 et Cy3. Un filtrage des données est
réalisé pour sélectionner les gènes présentant une
variation d’expression significative. Le tri des spots
est basé sur une valeur seuil définie pour plusieurs
critères de qualité. Les spots obtiennent un bon score
s’ils possèdent des valeurs supérieures aux seuils.
Les intensités des signaux, les bruits de fond et le
nombre de pixels d’un spot dont l’intensité est au
moins supérieure à une ou deux fois le bruit de fond
moyen sont, en règle générale, les critères considé-
rés. Les gènes répondant à ces critères de qualité
sont alors analysés pour définir le ratio d’induction
ou de répression, c’est-à-dire ceux dont le ratio est
significativement différent de 1 ; en effet, on établit
pour chaque gène le rapport : fluorescence essai/
fluorescence témoin :
— si ce rapport est inférieur à 1, le gène est dit
réprimé (on parle de ratio de répression) ;
— si ce rapport est égal à 1, le gène est dit
invariant ;
Bases de données Préparation et Conception des
Analyses de contrôle des plans de dépôt
séquences sondes
Choix des sondes
Dépôt des sondes
Analyses résultats Conservation
dans bases
de données
Figure 10 – Plate-forme du Génopôle d’Evry
RE 6 - 8 © Techniques de l’Ingénieur
— si ce rapport est supérieur à 1, le gène est dit
surexprimé ou induit (on parle alors de ratio d’induc-
tion).
■ Normalisation des données brutes
Pour pouvoir comparer des données entre plu-
sieurs expériences, il est essentiel de les normaliser.
Il convient donc de corriger si nécessaire les intensi-
tés en Cy3 et Cy5 pour éliminer les artefacts dus
au protocole expérimental, comme par exemple : la
qualité des lames, la quantité d’ARN, la différence de
marquage des ARN avec les fluorophores. La plupart
des logiciels d’analyse normalisent à partir de la
médiane ou de la moyenne des intensités. Toutefois
cette approche est peu satisfaisante. Sachant que
l’expression de la majorité des gènes reste stable,
une méthode alternative consiste à calculer la droite
de régression des intensités après analyse graphique
des résultats. Une translation par rapport à
l’ordonnée à l’origine et/ou au coefficient de corréla-
tion peut être ainsi effectuée. Plus récemment, les
utilisateurs de puces s’orientent vers une normalisa-
tion par bloc de dépôt, chaque aiguille du robot ayant
un comportement différent.
Le cycle complet d’une expérience réalisée au
moyen d’une puce à ADN sur la plate-forme du
Génopôle d’Evry est décrit figure 10.
Échantillonnage
Marquage
des cibles
Hybridation
sondes/cibles
Lecture
(numérisation)
Analyse
d'image
06-2002

Figure 11 – Image de la totalité du transcriptome de la levure (6 300 gènes)
4. Principales utilisations
des puces à ADN
4.1 Dynamique du transcriptome
Pour la première fois au milieu des années 1990,
les puces à ADN ont permis d’analyser l’expression
de milliers de gènes en parallèle. Cette approche a
été particulièrement utilisée chez la levure, car tous
les gènes étant connus, la totalité du génome de la
levure peut être déposé sur une seule puce. Ces pre-
mières expériences, qui ont consisté à générer des
profils d’expression de systèmes biologiques déjà
bien connus tels que le cycle cellulaire de la levure ou
la simulation des fibroblastes par le sérum chez
l’homme, ont aussi permis de valider la technologie
[3] [4].
Une bonne concordance a été observée entre les
variations de gènes connus mesurées par les métho-
des traditionnelles (northern RT-PCR, etc.) et les
puces à ADN. Depuis, de véritables recueils de pro-
fils d’expression ont été réalisés chez la levure [5]
avec plus de trois cents conditions expérimentales
différentes. Grâce aux études cinétiques réper-
toriées, il devient possible d’avoir une idée de la
dynamique du transcriptome et des réseaux géné-
tiques impliqués (figure 11).
4.2 Signatures moléculaires
Les profils d’expression caractéristiques d’un tissu,
d’un type cellulaire, ou bien encore d’un patient
deviennent des signatures moléculaires de cette con-
dition. Des recueils de signatures moléculaires ont
été récemment établis à partir de dix-neuf types de
tissus humains [6] ou des cellules de l’immunité chez
l’homme [7].
Ces signatures moléculaires permettent aussi la
classification des patients. Ainsi, la distinction entre
une leucémie myéloïde aiguë (LMA) et une leucémie
lymphoïde aiguë (LLA) est essentielle afin de pouvoir
orienter correctement le traitement des patients. Or,
06-2002
RECHERCHE
l’identification des deux pathologies par les techni-
ques d’anatomopathologie ou de cytopathologie est
difficile et demande une grande expertise. L’analyse
de l’expression de 6 000 gènes humains sur ces
patients a permis de différencier les LMA des LLA par
une centaine de gènes, signature de l’une ou l’autre
des pathologies [8]. La valeur prédictive de cette
signature (ensemble de 100 gènes) est proche de
100 %, alors qu’aucun gène en particulier ne peut
prédire à lui seul l’appartenance à telle ou telle
classe. En outre, un troisième type de patients,
jamais identifié auparavant, a été caractérisé par
cette technologie.
4.3 Analyse des voies biochimiques
Les approches globales telles que les puces à ADN
permettent d’étudier la mise en place de voies méta-
boliques. Chez la levure, les puces à ADN ont permis
d’étudier la réorientation du métabolisme suite à un
changement des conditions de culture [9].
De même, Fambrough et ses collègues [10] ont
étudié la cascade de signalisation des récepteurs à
activité tyrosine-kinase dans les cellules NIH3T3. Ces
récepteurs membranaires jouent un rôle clé dans la
signalisation de la membrane vers le noyau. Cette
analyse a révélé une redondance fonctionnelle consi-
dérable et surprenante entre les différents mutants
de cette voie de signalisation.
L’étude a également montré que ces récepteurs
initiateurs de la transmission de signaux peuvent
remplir d’autres fonctions dans la cellule, telles que
la simulation de la production d’interleukine. Ces
voies biochimiques alternatives n’auraient pas pu
être découvertes sans l’utilisation des puces à ADN
contenant des milliers de gènes.
4.4 Génomique fonctionnelle
Toutes les applications que nous avons considérées
jusqu’à présent consistent à classer les patients ou
les situations biologiques en fonction de gènes. Il est
possible de faire l’inverse pour explorer la fonction
© Techniques de l’Ingénieur RE 6 - 9
 RECHERCHE
des gènes in silico et déterminer la fonction d’un
gène inconnu. Ainsi, à partir d’un compendium de
profils d’expression chez C. elegans on a pu identifier
quelques grandes fonctions de gènes [11].
4.5 Action des médicaments
C. elegans est un ver
Les puces à ADN peuvent aussi être utilisées pour
nématode de 959 cellules
de son vrai nom Caenor- l’identification de nouvelles cibles pour les médica-
habditis elegans.
ments. La plupart des médicaments agissent en inhi-
bant leur molécule cible, enzyme ou récepteur. Par
conséquent, une mutation du gène correspondant
devrait avoir un effet similaire sur le transcriptome
de la cellule. Marton et al. [12] ont utilisé une puce à
ADN contenant le génome de la levure pour montrer
l’existence d’une corrélation entre le profil obtenu
lors d’une simulation médicamenteuse antimicro-
bienne et le profil d’expression d’une levure portant
un gène muté et impliqué dans le métabolisme
d’action de ce médicament.
Bien entendu, cette approche pourrait être réalisée
en aveugle pour rechercher le mode d’action d’un
médicament en comparant le profil obtenu avec ce
dernier à une base de données répertoriant les profils
d’expression de centaines de mutants. Cette appro-
che pourrait permettre de trouver les groupes de
gènes modulés par différentes classes de médica-
ments. De même des banques de données
répertoriant les profils d’expression engendrés par
les médicaments pourraient permettre d’évaluer et
prédire l’efficacité et la toxicité de ces médicaments
[13].
Contact auteur
5. Conclusion
SOULARUE Pascal : Les puces à ADN ont permis de réaliser un saut
SOULARUE@dsvidf.cea.fr
quantique dans l’analyse biologique. Il est mainte-
nant possible d’analyser l’expression de milliers de
gènes en parallèle et à haut débit. Des déve-
Références bibliographiques
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Functional discovery via a compendium of expression
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compendium of gene expression in normal tissues.
Physiol Genomics 7 p. 97-104 (2001).
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– Signature of the immune response. Immunity 15
p. 375-85 (2001).
RE 6 - 10 © Techniques de l’Ingénieur
loppements similaires commencent à apparaître pour
l’analyse massivement parallèle des protéines ou
d’autres composantes cellulaires.
Cette révolution technologique, ce changement
d’échelle de la recherche biologique, va de pair avec
une utilisation croissante de la robotique et de l’infor-
matique. Les biologistes, traditionnellement confron-
tés à quelques dizaines de données expérimentales,
vont devoir désormais apprendre à gérer des centai-
nes de milliers de données. Grâce à ces technologies,
il est vraisemblable que la biologie prendra une
dimension théorique plus marquée.
Mots clés : puces à ADN, génomique fonction-
nelle, bio-informatique, profils d’expression,
transcriptome.
Keywords : DNA chips, functional genomics,
bioinformatic, expression profiles, transcriptome.
Sites à consulter
National Human Genome Research Institute,
National Institute of Health http://nhgri.nih.gov
Affymetrix http://www.affymetrix.com
National Institute of Environmental Health Scien-
ces Microarray Center
http://dir.niehs.nih.gov/microarray/bioinfor.htm
DNA Microarray (Genome chips)
http://www.gene-chips.com/
European Bioinformatics Institute
http://www.ebi.ac.uk/microarray/
De Risi Lab. Department of Biochemistry and Bio-
physics
http://www.microarrays.org/protocols.html
The Institute for Genomic Research
http://www.tigr.org/tdb/microarray/
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prediction by gene expression monitoring. Science
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grated genomic and proteomic analyses of a systema-
tically perturbed metabolic network. Science 292
p. 929-34 (2001).
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by growth factor receptors induce broadly overlapping
rather than independent set of genes. Cell 97 p. 727-
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expression map fo Caenorhabditis elegans. Science
293 p. 2087-92 (2001).
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Drug traget validation and identification of secondary
drug target effects using DNA microarray. Nat Med 4
p. 1293-301 (1998).
[13] SCHERF (U.), ROSS (D.T.), WALTHAM (M.) et al. – A
gene expression database for the molecular pharmaco-
logy of cancer. Nat Gen 24 p. 236-44 (2000).
06-2002