Pre Informe c3

“AÑO DE LA CONSOLIDACIÓN DEL MAR DE GRAU”
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
TITULO:
INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES
PROFESOR:
AUGUSTO CASTILLO CALDERON
GRUPO:
C – C3
CURSO:
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
CICLO:
VII
ALUMNOS:
 JAVIER VILLANUEVA, Magda Isabel
 PURISACA OSORIO, Almendra
 QUEZADA ARTEAGA, Rosa María
Nuevo Chimbote, Perú

Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia Stipitis NRRL Y-
7124,utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono
INDICE
I. OBJETIVOS................................................................................................................ 3
1.1. Objetivos generales: ........................................................................................ 3
1.2. Objetivos específicos: ...................................................................................... 3
II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ............................................................................ 4
2.1. Diseño de medios de cultivo ............................................................................. 4
2.2. Preparación de medios………...……………………………...……...........….7
2.3. Cultivo de m.o. montaje del equipo experimental………………................13
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:………………………………..20
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ..................................................................... 24

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................ 27
VI. ANEXOS ..............................................................................................................................28
INDICE DE ILUSTRACIONES
A. Ilustración 1Procedimiento del método directo ................................................34

B. Ilustración 2Procedimiento de experimentos y Cultivos en condiciones de
aireación y micro aireación ................................................................................. 35
INDICE DE TABLAS
A. Tabla 1 Concentración de nutrientes para el medio de mantención (100 ml) ............... 5

B. Tabla 2 Concentración de nutrientes para el medio de activación (50 ml) ................... 5
C. Tabla 3 Concentración de nutrientes para el medio de fermentación (200ml)……….6
D. Tabla 4 Tabla de medio de composición del medio de cultivo ...................................... 6
E. Tabla 5 Composición de las sales utilizadas en los medios de cultivo ........................... 7
F. Tabla 6 Tiempos de duplicación característicos ........................................................... 29
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TITULO:
“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES”
I. OBJETIVOS
1.1. Objetivos generales:
 Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

matraces empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y – 7124.
 Determinación de los parámetros cinéticos de la cepa Pichia stipitis
NRRL Y – 7124.
1.2. Objetivos específicos:
 Diseñar el medio líquido de cultivo.

 Activación celular y desarrollo del inóculo
 Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa.
 Determinar de la cinética de consumo de la fuente de carbono.
 Determinar la cinética de generación de Etanol.
 Determinación del  M y k s ; los rendimientos del nutriente
limitante en células y en etanol además de las respectivas

productividades en células y en etanol.
 Evaluar el valor del pH durante la cinética.
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II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO
El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de

los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de
productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe
tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del
proceso.
Para la formulación del diseño de cultivo se tiene en cuenta los siguientes
requerimientos nutricionales para el cultivo Pichia stipitis NRRL Y-7124.
La Levadura utiliza para el cultivo celular es Pichia Stipitis NRRL Y-7124 ,

siendo el sustrato a utilizar una mezcla de xilosa más 4 g/L de glucosa
Su fórmula química es: CH1.79O0.6N0.17
2.1.1. Requerimientos para el diseño del medio de cultivo:
Macronutrientes C, N, Mg, K y P
Micronutrientes: Zn, Ca, Fe, Cu, Co y Mn
Estado Medio líquido
Medio sintético o químicamente
Composición definido
2.1.2. Requerimientos nutricionales:
Se utiliza un medio de cultivo mínimo
Fuente de carbono y energía : xilosa (C5H10O5) + 4 g/L de glucosa

Fuente de N : Sulfato de amonio.
Fuente de Mg : Sulfato de magnesio.
Fuente de S : Sulfato de amonio.
Fuente de K : Fosfato diácido de potasio
Fuente de P : Fosfato diácido de potasio.
Fuente de S : Sulfato de magnesio heptahidratado.
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2.1.3. Condiciones de cultivo:

 Temperatura : 30°C
 Velocidad de agitación (shaker): 180 rpm
 Concentración celular final : 2g/L
 PH: 4.5
 Volumen del medio : 30- 40 % del volumen del matraz
2.2. COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

2.2.1. Medio Sólido De Mantención (Pgy- Agar)
Tabla 1 Concentración de nutrientes para el medio de mantención (100 ml)
Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Glucosa 10 0.5
xilosa 10 0.5
Extracto de levadura 3 0.15
Extracto de malta 5 0.25
Solución de sales 5 ml/L 0.25 ml
DATO:
* Matraz a utilizar: 250 ml – 40%
2.2.2. Medio de Activación
Tabla 2 Concentración de nutrientes para el medio de activación (50 ml)
Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)
Extracto de levadura 3 0.3

Peptona de caseína 5 0.5
Agar 20 2
Extracto de malta 3 0.3
T: 30ªC
N: 220 rpm
DATO:
*Matraz a utilizar : 125 ml – 40%
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2.2.3. Medio de Fermentación
 Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz.

 Para una concentración final: 2 g/l.
Tabla 3 Concentración de nutrientes para el medio de fermentación (200ml)
Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)
Glucosa 4 0.8
Xilosa 14 2.8
(NH4)2SO4 3 0.6
KH2PO4 2 0.4
MgSO4-7H2O 1.1 0.22
Solución de sales 5 ml/L 1ml
Tampón citrato
Ajustar pH 4.5
T° 30°C
N 180 rpm
DATO:
Matraz a utilizar: 500 ml – 40%
Tabla 4 Tabla de medio de composición del medio de cultivo
% en % en Yx/s So S'o
Elemento Nutriente P.M.
Célula Nutriente (g/g) (g/l) (g/l)
C C5H10O5 150 46.57 48 0.52 3.49 3.49
C C6H12O6 180 46.57 40 0.43 4.19 8.38
N (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.30 0.78 1.57
S (NH4)2SO4 132 0.55 24.24 44.07 0.04 0.08
K KH2PO4 136 2.75 28.68 10.43 0.17 0.35
P KH2PO4 136 2.5 22.78 9.11 0.20 0.40
Mg (MgSO4.7H2O) 246 0.3 9.87 32.90 0.05 0.11
S (MgSO4.7H2O) 246 0.55 12.99 23.62 0.08 0.15
 Fuente de carbono: xilosa + 4g/L glucosa

 Nutriente Limitante: Xilosa
 𝛍𝐌𝐚𝐱 = 0.277
 Tiempo de fermentación: 8 horas , 31 minutos
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2.2.4. Solución de sales concentradas para el medio de fermentación:
Tabla 5 Composición de las sales utilizadas en los medios de cultivo
Fuente Nutriente Concentración (g/l)

Ca CaCl2.2H2O 2.9
Zn ZnO 0.4
Fe FeSO4.7H2O 6.42
Cu CuSO4.5H2O 0.25
Co CoCl2.6H2O 0.24
Mg MgSO4.7H2O 2.2
HCl HCl 0.06
Fuente: Bibliografía
2.3. PREPARACION DE MEDIOS
La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una

etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de
naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que
deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de
productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las
siguientes categorías de componentes:
- Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg
- Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe,
Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de
miligramos o microgramos por litro
- Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por
componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no
son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a
estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas,
algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.
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2.3.1. Condiciones de asepsia
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza

para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo.
Matraz
-Nombre de cepa
-Fecha ROTULAR
-Nombre del grupo
Previamente desinfectado el área

Mechero bunsen ENCENDER de trabajo con alcohol de 96º
Si los matraces tienen un tapón de

algodón, aflojar un poco de SOSTENER Matraces
manera que no esté muy apretado
La boca de ambos matraces para matar

FLAMEAR cualquier microorganismo presente en
el aire y que pueda contaminar en la
práctica.
Tapar con el meñique RETIRAR
FLAMEAR La Boca de ambos matraces
Posición inclinada (riesgo de

MANTENER
contaminación sea mínimo)
Matraz estéril
Inóculo SEMBRAR
FLAMEAR Boca de los matraces

taparlos de nuevo
Matraces en el
caldo sembrado MEZCLAR
FLAMEAR Los tapones antes que los

coloques en los matraces.
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2.3.2. Preparación del medio solido de mantención
Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de

cultivo de mantención para Pichia stipitis NRRL Y-7124
Agua destilada MEDIR En una matraz

Cantidades de 250
de cada ml.
compuesto.
Cantidades de cada compuesto. PESAR
Hasta llegar a los 50 ml Agua destilada

que se requiere.
MEDIR
En un Mechero Bunsen (lograr una

CALENTAR
coloración celeste)
Constantemente con un varilla

por un minuto (aparición de la AGITAR
primera burbuja).
5 tubos de ensayo con tapa. PREPARAR
6-7 ml de la mezcla en caliente a

AGREGAR cada tubo de ensayo, con pipeta
de 10 ml.
Una vez tapados los tubos

de ensayos, por 1 hora. ENFRIAR
En un vaso precipitado, y llevarlos

COLOCAR a la olla a presión (auto clave).
121 ºC / 20 min CALENTAR
A posición inclinada
COLOCAR
a T. Ambiente.
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2.3.3. Preparación del medio de activación
Componentes para el
PESAR
medio de la tabla Nº02
Por separado.
- Extracto de levadura en una
matraz. ESTERELIZAR
- Glucosa en un matraz de 125 ml.
- Las sales en un tubo de ensayo.
DISOLVER Por separado los componentes.
El volumen de las sales

minerales. ALISTAR
Al matraz que contiene el

extracto de levadura, con la ayuda AGREGAR Sales minerales
de la micro pipeta.
AJUSTAR EL pH a 7 de la solución que

contiene glucosa y xilosa.
121ºC – 15 min. ESTERILIZAR
Con los demás componentes en un

ambiente aséptico, para evitar la
MEZCLAR
contaminación.
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2.3.4. Preparación del medio de fermentación
Componentes para el
PESAR medio de la tabla Nº03
Cada compuesto en agua destilada:
- Glucosa en un matraz de 1 L con
agua destilada.
- (NH4)2SO4 en un matraz con agua DISOLVER
destilada
- Solución de sales, KH2 PO4,
(MgSO4).7H2O en un matraz con
agua destilada. ESTERELIZAR Las disoluciones por separado.
ENFRIAR
2.3.5. Preparación de solución de sales concentradas
TABLA 02: Composición de la solución de sales, utilizadas en los

medios de cultivo (g/l).
Nutriente Concentración (g/l)
CaCl2.2H2O 2.9
ZnO 0.4
FeSO4.7H20 6.42
MgSO4.7H2O 2.2
CuSO4.5H2O 0.25
CoCl2.6H2O 0.24
H3BO3 0.06
HCl 1
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Las sales que conforman la PESAR

solución de sales concentradas
En un vaso precipitado con DILUIR Con 100 ml de agua

ayuda de un agitador magnético destilada
Con agua destilada hasta

En una fiola ENRAZAR completar 1 litro
REFRIGERAR Para su posterior utilización
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III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
3.1. PREPARACION DEL TAMPON CITRATO
a) Materiales
2 fiolas de 100 ml
Varilla de vidrio
2 pipetas de 10 ml
Vaso precipitado
2 tubos de ensayo
Agua destilada
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b) Instrumentos y equipos
Balanza analítica
Shaker
Agitador magnético
Ph metro
c) Reactivos
Ácido cítrico

Citrato de sodio
Hidróxido de sodio
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3.2. PREPARACION DEL MEDIO DE ACTIVACION
a) Materiales
Matraz de 125 ml
2 tubos de ensayo
Pipetas de 10 ml
Varilla de vidrio
Gradilla
Espátula
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Balanza analítica
Shaker
Ph metro
Autoclave
c) Reactivos
Extracto de levadura
Glusoca
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3.3. PREPARACION DEL MEDIO DE FERMENTACION
a) Materiales
Matraz de 125 ml
2 tubos de ensayo
Pipetas de 10 ml
Varilla de vidrio
Gradilla
Algodón
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Mechero Bunsen
Autoclave
c) Reactivos
Sacarosa
KH2PO4
Concentración de
sales
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3.4. Cinética de cultivo:

a) Materiales:
 Alcohol 96º
 Algodón
 Jabón
 Pipetas de 5 ml y 10 ml
 Viales
 Tubos de celda
 Papel toalla
 Taper de plástico
b) Instrumentos y equipos:
 Mechero bunsen
 Centrifuga
 Espectrofotómetro
 Refrigeradora
c) Reactivos
 Agua destilada
3.5. Determinación de la concentración celular por D.O
3.5.1. DILUCIONES
a) Materiales
 Matraz con el medio rico

 Pipetas de 5ml y 2ml
 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Tubos de celda
c) Reactivos:
 Agua destilada
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3.5.2. PESO SECO:

a) Materiales
 Capachos de aluminio
 Matraz con el medio rico
 Pipetas de 5 ml
 Celdas
 Tubos de ensayo
 Centrifuga
 Estufa
 Balanza analítica
c) Reactivos
 Agua destilada
3.6. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SACAROSA:
3.6.1. Hidrolisis de la sacarosa:

a) Materiales
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Micropipetas con puntas
 Pipetas para NaOH y HCl
 Vasos precipitados(50 ml y 100 ml )
 Olla con trípode
 Hielo
 Agitador
 Baño María
c) Reactivos
 Sobrenadantes – medio
rico
 HCl cc
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 NaOH 1.7 M
 Agua destilada
3.7. DNS
a) Materiales
 Tubos de ensayo sin tapa

 Micropipetas
 Vasos precipitado
 Olla con trípode
 Hielo
 Celdas
b)Instrumentos y equipos
 Mechero bunsen
 Agitador
c) Reactivos
 DNS
 Muestra de la hidrolisis de la sacarosa
 Agua destilada
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CUADRO DE RESUMEN: MATERIALES A UTILIZAR
Instrumentos MANTENCION ACTIVACION FERMENTACION

Asa x
bacteriológica
Matraces x x x
Tubos de ensayo x x
Mechero x x
Rejilla de x
asbesto
Trípode x x
Pipeta x
Shaker x x
Refrigeradora
Estufa eléctrica x
Incubadora x
eléctrica
Olla a presión x x
(autoclave)
Algodón x
Gasa x x
Balanza analítica x x
pH-metro x x
Papel aluminio x
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CUADRO DE RESUMEN: REACTIVOS QUE UTILIZAREMOS
MEDIO NUTRIENTE
Peptona de caseína
Solido de mantención
Agar
(PGY- Agar)
Extracto de malta
Extracto de peptona
Peptona de caseína
Activación
K2HPO4
Glucosa
Glucosa
Xilosa
(NH4)2SO4
Fermentación KH2PO4
MgSO4-7H2O
Solución de sales
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IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ABRIL MAYO
ACTIVIDADES SEMANA 2 SEMANA 3 SEMANA 4 SEMANA 5 SEMANA 6
18 19 20 21 22 25 26 27 28 29 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 16 17
- Presentación del pre
informe x
-Preparación de medio de
mantención agar nutriente y x
esterilización
-Colocar la cepa una hora

antes de inoculación en x
estufa
-Resembrado de células en el
medio de mantención agar x x x
sólido y observación del
crecimiento
-Esterilización de materiales
de vidrio necesario x
-Preparación y esterilización
del medio rico líquido para x
inoculo o medio de
activación
-Inoculación con asa
bacteriológica a medio rico. x
-Preparación de los medios
de fermentación y
esterilización del medio
líquido para cinética de x
crecimiento microbiano
-Inoculación de medios y
seguimiento de la cinética de x x x x
crecimiento microbiano
-Determinación de la curva
de calibrado de biomasa x x x x
-Evaluación y supervisión del
medio x x x x
-Determinación de las
cinéticas de crecimiento, x x x x
consumo utilizando el
espectrofotómetro
-Semana extra x x x x x
-Presentación del informe x
final
-Sustentación del informe x
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PROGRAMACION DE CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES
DÍA Martes 22/04/16

ACTIVIDAD HORARIO
INICIO TÉRMINO
 Preparación de materiales para la
inoculación en medo de activación y el 7:30 a.m. 8:00 a.m.
medio rico para la cinética de
fermentación.
 Inoculación con aza bacteriológica 8:00 a.m. 8:20 a.m.
desde la cepa en Agar a medio rico de
activación.
 Tiempo de referencia para le activación 8:20 a.m. 11:20 a.m.
del inoculo en el medio de activación.
 Inoculación de medios para cinética 11:20 a.m. 11:40 a.m.

(fermentación)
 Seguimiento de la cinética por cada 11:40 a.m. 7:40 p.m.

hora ( programación y registro de
datos)
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CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: B2
Día de la experiencia:
……………………………………………………………………………………………
Micro-organismo: …………………………………………………………… Fuente
Carbono: ………………….………….pH……………… T °C……………………..
N rpm………………………
Nº HORA TIEMPO Absorbancia Nombre del Observaciones
(horas) (640 nm) alumno
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V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Biotecnología de la fermentación,Principios, Procesos y

Productos . Owen P.Ward.1989 . Editorial Acribia
S.A.Zaragoza-España
 Principios de la Ingeniería de los bioprocesos, Pauline

M.Doran 1998,Editorial Acribia S.A. Zaragoza-España
 “Determinación de parámetros de co-cultivo de

scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae para la
fermentación de residuos lignocelulosicos para la obtención
de bioethanol” Ana Karina Castillo Plata
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VI. ANEXOS
ANEXO 1
A. HALLANDO EL % EN CÉLULAS: se sabe la fórmula del m.o.:
CH1,79 O0,6 N0,17
Peso % por
ELEMENTO Cantidad Peso (g)
molecular elemento
C 12 1 12 46.57
H 1 1.79 1.79 6.95
O 16 0.6 9.6 37.25
N 14 0.17 2.38 9.24
TOTAL(g) 25.77
Peso (g) = peso molecular * cantidad

𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔) ∗ 100
% 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 =
𝑇𝑂𝑇𝐴𝐿
 Calculando el porcentaje por elemento por tablas para bacterias:

Elemento Porcentaje PROMEDIO
S 0.1 – 1 0.55 %
Mg 0.1 – 0.5 0.3%
K 1 – 4.5 2.75%
P 2-3 2.5%
Fe 0.02-0.2 0.11%
B. HALLANDO EL % EN NUTRIENTE:
PM del componente ∗ cantidad

%NUTRIENTE = X 100
PM del compuesto
C. HALLANDO EL % Y X/S: (solamente para el carbono multiplicar la

fórmula de rendimiento por 0.5)
% nutriente
Y x/s =
% celula
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D. HALLANDO EL % S0:
∆Biomasa
So =
Y x/s
Dato:
C0= 10%Cf= 10% (2) =0.2
Cf-Co=Δ biomasa=2-0.20=1.8
E. HALLANDO EL % S´0: menos al limitante

So´ = So ∗ 2
F. HALLANDO EL TIEMPO DE FERMENTACIÓN
- Hallando el 𝝁𝑴𝒂𝒙 mediando te Td

𝑙𝑛2
𝑇𝑑 =
𝜇𝑀𝑎𝑥
- Tiempo de duplicación:
Tabla 6 Tiempos de duplicación característicos
Tipo de celula Td (h-1)

Bacterias 0.3 – 2.5
Levaduras 1.0 – 4.0
Hongos 1.5 – 7.0
Fuente: Guía de prácticas
- Hallando 𝝁𝑴𝒂𝒙
𝑙𝑛2
𝜇𝑀𝑎𝑥 =
(1 + 4)/2
𝜇𝑀𝑎𝑥 = 0.277
- Hallando tiempo de fermentación
𝑋
Ln ( ) = μMax ∗ t
𝑋𝑜
2
Ln ( ) = 0.277 ∗ t
0.2
t = 8 horas, 31minutos
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ANEXO 2
EQUIPOS A UTILIZAR EN EL TRANSCURSO DE LA EXPERIENCIA
1. BALANZA ANALÍTICA:
Marca: Adventurer
Descripción
Una balanza analítica es una clase de balanza de laboratorio

diseñada para medir pequeñas masas, en un principio de un
rango menor del miligramo (y que hoy día, las digitales, llegan
hasta la diezmilésima de gramo: 0,00001 g o 0,01 mg).
2. CENTRIFUGA
Marca: P-Selecta
Descripción
Una centrifugadora es una máquina que pone en rotación una

muestra para (por fuerza centrífuga) acelerar la decantación o
la sedimentación de sus componentes o fases (generalmente
una sólida y una líquida), según su densidad. Es muy usada en
laboratorios de control de calidad y en fábricas que elaboran
zumos a base de cítricos, para controlar el nivel de pulpa fina,
mediante separación del zumo exprimido.
3. ESPECTROFOTOMETRO
Marca: Sigma
Modelo: 2-16PK
Descripción
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis

químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda,
la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica
relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o
reacciones químicas que se miden en una muestra. También es
utilizado
4. en los laboratorios de química para la cuantificación de
sustancias y microorganismos
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5. PHMETRO
Marca: Inolab
Descripción
Un agitador magnético consiste de una pequeña barra magnética

(llamada barra de agitación) la cual está normalmente cubierta por
una capa de plástico (usualmente Teflón) y una placa debajo de la
cual se tiene una magneto rotatoria o una serie de electromagnetos
dispuestos en forma circular a fin de crear un campo magnético
rotatorio. Es muy frecuente que tal placa tenga un arreglo de
resistencias eléctricas con la finalidad de dotarle de calor necesario
para calentar algunas soluciones químicas.
6. AGITADOR MAGNETICO
Marca: Thermolyne
Modelo: Maxi-mix II
Descripción
El pH-metro es un sensor utilizado en el método electroquímico para

medir el pH de una disolución. La determinación de pH consiste en
medir el potencial que se desarrolla a través de una fina membrana
de vidrio que separa dos soluciones con diferente concentración de
protones. En consecuencia se conoce muy bien la sensibilidad y la
selectividad de las membranas de vidrio delante el pH. Una celda
para la medida de pH consiste en un par de electrodos, uno de
calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos
en la disolución de la que queremos medir el pH.
7. OLLA A PRESIÓN – AUTOCLAVE

Descripción
La olla a presión es un recipiente hermético para cocinar que no permite

la salida de aire o líquido por debajo de una presión establecida. Debido a
que el punto de ebullición del agua aumenta cuando se incrementa la
presión, la presión dentro de la olla permite subir la temperatura de
ebullición por encima de 100 °C . La temperatura más alta hace que los
alimentos se cocinen más rápidamente llegando a dividirse los tiempos de
cocción tradicionales por tres o cuatro. Generalmente, se utiliza para
conseguir en un corto periodo de tiempo los mismos efectos de la cocción
a fuego lento.
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8. AUTOCLAVE
Descripción
Una autoclave es un recipiente de presión metálico de paredes

gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión
para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización
con vapor de agua. Su construcción debe ser tal que resista la presión
y temperatura desarrollada en su interior. La presión elevada permite
que el agua alcance temperaturas superiores a los 100 °C. La acción
conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulación de las
proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la
vida y la reproducción de éstos, hecho que lleva a su destrucción
9. REFRIGERADORA DOMESTICA
Marca: Phillips
Descripción
La función de una máquina de refrigeración es tomar el calor de un

ambiente a baja temperatura (en este caso un armario cerrado y aislado
térmicamente) y cederlo en el ambiente exterior (para el refrigerador
doméstico sería la cocina), empleando una fuente de energía externa
para mantener el proceso. Un refrigerador es una bomba de calor
(como las de agua, bombea calor de un lugar a bajo nivel térmico a otro
de mayor nivel), impulsada generalmente por un motor eléctrico. Es
asimismo posible emplear sales eutécticas o absorción.
10. ESTUFA ELECTRICA
Marca: P-Selecta
Modelo: 209
Descripción
Equipo de 75 litros de capacidad, con una cavidad de 500 x 400 x 400

mm, que permite el secado de muestras en un rango de temperatura útil
comprendido entre 0 y 200 °C. La estufa de secado se emplea para
esterilizar o secar el material de vidrio y metal utilizado en los exámenes
o pruebas, que proviene de la sección de lavado, donde se envía luego de
ser usado en algún procedimiento. La esterilización que se efectúa en la
estufa se denomina de calor seco y se realiza a 180 °C durante 2 horas;
Página 32 de 35
11. INCUBADORA ELECTRICA

Marca: P-Selecta
Modelo: 206
Descripción
Una incubadora es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer

cultivos microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la
temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales
como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su
atmósfera interior. Las incubadoras son esenciales para una gran
cantidad de trabajos experimentales en biología celular, la microbiología
y en biología molecular y se utilizan para cultivos celulares, tanto
bacterianos como de células eucariotas.
12. SHAKER
Modelo: SAROTIUS STEDIM
Descripción
l
El agitador orbital modelo SAROTIUS STEDIM está diseñado para usos

generales en laboratorios de análisis clínicos, industriales, de física, química
y en todo tipo de ensayos que requieran agitar, mezclar, disolver casi todo
tipo de líquidos y soluciones con distinto grado de viscosidad. Están
diseñados ergonómicamente para ser funcionales y confiables ahora y en el
futuro. Su sistema microprocesado, permite un control exacto de la
velocidad de giro, independiente de la carga, puesto que supervisa
constantemente la velocidad corrigiendo automáticamente cualquier
variación de la misma. Posee además un time que permite controlar con
precisión en el tiempo de la experiencia a realizar. El dispositivo mecánico
de agitación está formado por una base amplia, metálica, con fuertes
nervaduras, y una plataforma móvil.
Página 33 de 35
ANEXO 3
CONDICIONES DE CULTIVO DE LAS PICHIA STIPITIS

Para el proceso de acondicionamiento hacia un determinado medio de cultivo y
fermentación se debe tener cuidado cuando se trabaja con levaduras, estas pueden
contaminarse y reportar valores errados, se cuenta con las cepas Pichia stipitis NRRL
Y-7124 ésta fue sometida a diferentes condiciones ya sea aeración y sustrato
(glucosa y xilosa).
Ilustración 1Procedimiento del método directo
Página 34 de 35
Ilustración 2: Procedimiento de experimentos y Cultivos en condiciones de aireación y

micro aireación
Página 35 de 35

Pre Informe c3

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“AÑO DE LA CONSOLIDACIÓN DEL MAR DE GRAU”

Nuevo Chimbote, Perú

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:………………………………..20

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ..................................................................... 24

A. Ilustración 1Procedimiento del método directo ................................................34

A. Tabla 1 Concentración de nutrientes para el medio de mantención (100 ml) ............... 5

“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES”

1.1. Objetivos generales:

 Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

1.2. Objetivos específicos:

 Diseñar el medio líquido de cultivo.

limitante en células y en etanol además de las respectivas

II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de

La Levadura utiliza para el cultivo celular es Pichia Stipitis NRRL Y-7124 ,

Su fórmula química es: CH1.79O0.6N0.17

2.1.1. Requerimientos para el diseño del medio de cultivo:

2.1.2. Requerimientos nutricionales:

Se utiliza un medio de cultivo mínimo

Fuente de carbono y energía : xilosa (C5H10O5) + 4 g/L de glucosa

2.1.3. Condiciones de cultivo:

2.2. COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Tabla 1 Concentración de nutrientes para el medio de mantención (100 ml)

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

2.2.2. Medio de Activación

Tabla 2 Concentración de nutrientes para el medio de activación (50 ml)

Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)

Extracto de levadura 3 0.3

*Matraz a utilizar : 125 ml – 40%

2.2.3. Medio de Fermentación

 Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz.

Tabla 3 Concentración de nutrientes para el medio de fermentación (200ml)

Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)

MgSO4-7H2O 1.1 0.22

Solución de sales 5 ml/L 1ml

Matraz a utilizar: 500 ml – 40%

Tabla 4 Tabla de medio de composición del medio de cultivo

 Fuente de carbono: xilosa + 4g/L glucosa

2.2.4. Solución de sales concentradas para el medio de fermentación:

Tabla 5 Composición de las sales utilizadas en los medios de cultivo

Fuente Nutriente Concentración (g/l)

2.3. PREPARACION DE MEDIOS

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una

2.3.1. Condiciones de asepsia

Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza

Previamente desinfectado el área

Si los matraces tienen un tapón de

La boca de ambos matraces para matar

Tapar con el meñique RETIRAR

FLAMEAR La Boca de ambos matraces

Posición inclinada (riesgo de

FLAMEAR Boca de los matraces

FLAMEAR Los tapones antes que los

2.3.2. Preparación del medio solido de mantención

Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de

Agua destilada MEDIR En una matraz

Cantidades de cada compuesto. PESAR

Hasta llegar a los 50 ml Agua destilada

En un Mechero Bunsen (lograr una

Constantemente con un varilla

5 tubos de ensayo con tapa. PREPARAR

6-7 ml de la mezcla en caliente a

Una vez tapados los tubos