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Sequenciamento de DNA: Desvendando o código da vida

18
Mai, 2018

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Sequenciamento de DNA: Desvendando o código da vida

O que é o sequenciamento de DNA (ácido desoxirribonucleico)?

O sequenciamento de DNA é o processo realizado para se determinar a sequência exata de nucleotídeos em

uma molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico). Isso signi ca que, ao sequenciar um fragmento de DNA, será
possível conhecer a sequência em que as quatro bases nucleotídicas (Adenina, Guanina, Citosina e Timina)
ocorrem dentro dessa molécula de ácido nucleico.

A sequência nucleotídica é a base para o conhecimento de um gene ou genoma. Ela contém as informações
sobre as propriedades hereditárias e bioquímicas da vida. Através dela é possível compreender a construção e
estrutura das células e organismos.

O sequenciamento do DNA foi fundamental para que as informações genéticas começassem a ser desvendadas.
Por essa razão, é indispensável para a pesquisa biológica.

 
 

Tipagem HLA: A importância no processo do

transplante de medula óssea
Leucemias e HLA Para portadores de leucemias, o TMO (transplante de medula óssea) se
torna a única forma de tratamento quando outras alternativas não apresentaram
sucesso. A histocompatibilidade entre doador e receptor é um dos fatores cruciais para
o sucesso do transplante. Muitos pacientes não encontram o doador ideal na família,
tendo como opção a … Continue a ler

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A história do sequenciamento de DNA

Os últimos 100 anos testemunharam uma verdadeira revolução no entendimento de como a informação
genética é armazenada, usada e transmitida.

Os trabalhos de Mendel, em 1850, foram capazes de demonstrar que as características são transmitidas por
hereditariedade ao longo das gerações. Em 1944, o grupo do pesquisador Oswald Avery demonstrou que a
transferência de informações entre organismos (no caso, bactérias) é viável e que ocorre pelo material genético,
o DNA.

Já em 1953, a estrutura de dupla-hélice do DNA foi desvendada por James Watson e Francis Crick. Isso ajudou no
desenvolvimento da biologia molecular e da engenharia genética.

Na década de 1970, Fred Sanger e Walter Gilbert desenvolveram as tecnologias de sequenciamento de DNA.
Assim, tornaram possível que a informação genética começasse a ser desvendada.

Até então, a manipulação de genes individuais ou de pequenos trechos do DNA parecia uma tarefa insuperável. 
O sequenciamento permitiu compreender melhor a estrutura e a função dos ácidos nucleicos. Esse foi o ponto
de partida para hoje ser comum isolar e estudar um trecho de DNA.

 
O legado de Frederick Sanger 
Frederick Sanger foi responsável por dois dos mais importantes avanços técnicos na área de genética. Primeiro,
no início da década de 50, ele desenvolveu um método para determinar a sequência de aminoácidos de um
polipeptídio e o fez funcionar no sequenciamento de aminoácidos da insulina.

Este trabalho, nalizado em 1955, forneceu a primeira prova de que os aminoácidos em uma proteína estão
presentes em uma sequência constante e geneticamente determinada. Isto deu aos biólogos moleculares a
con ança em atacar outros problemas, tais como o código genético.

Então, em 1977, Sanger aperfeiçoou um método rápido de sequenciamento do DNA. Por essa razão, cou
conhecido como método de sequenciamento de Sanger. Abriu assim a porta para a análise da estrutura do gene
e sua organização. Ambos os avanços foram valiosos e reconhecidos com prêmios Nobel, em 1958 e 1980.

O método desenvolvido por Sanger foi crucial para desenvolvimento do Projeto internacional do Genoma
Humano.

O Projeto Genoma Humano

O Projeto Genoma teve como objetivo determinar a sequência de todo o genoma humano. Esse esforço de
pesquisa internacional, custando mais de US $ 3 bilhões e levando 13 anos para ser concluído. A primeira
sequência completa foi determinada em abril de 2003.

O DNA sequenciado no Projeto Genoma Humano foi obtido a partir de 21 doadores, homens e mulheres, de
diferentes grupos étnicos. O resultado possibilitou avaliar muitas informações sobre as diferenças entre os
indivíduos de uma mesma espécie.

Esse mapeamento abriu diversas fronteiras e forneceu meios para identi car mutações e doenças genéticas
especí cas. Pode determinar quais trechos de DNA contêm genes e quais trechos carregam instruções de
regulação, ligando ou desligando os genes. Também abriu caminho para uma medicina mais personalizada,
permitindo aos cientistas examinar até que ponto a resposta de um paciente a um medicamento é determinada
pelo seu per l genético.

Essas conquistas exigiram o desenvolvimento e aprimoramento de novas tecnologias, com a intenção de

melhorar a e cácia dos cuidados de saúde e promover a saúde humana. Claro que a medicina totalmente
personalizada ainda está longe de ser uma realidade para todos, mas estes já são os primeiros passos.

O método de sequenciamento de Sanger

O método de sequenciamento de DNA mais usado, até os dias de hoje, é o de Sanger. Também chamado de
método didesoxi ou método de terminação de cadeia.

Nesse procedimento, uma molécula de DNA cuja sequência deve ser determinada é convertida em tas simples
que são utilizadas como molde para sintetizar uma série de tas complementares. Cada uma dessas tas
termina aleatoriamente em um nucleotídeo especí co diferente. A série resultante de fragmentos de DNA é
separada por eletroforese e analisada para revelar a sequência do DNA.


Con ra todas as etapas do método de Sanger

Nesse método são preparados quatro tubos de reação de sequenciamento (A, C, G, T), correspondendo a cada
um dos quatro nucleotídeos. Cada tubo contém:

1. O molde de DNA a ser sequenciado;

2. A sequência do iniciador (primer);

3. DNA-polimerase;

4. Os quatro desoxinucleotídeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

5. Um didesoxinucleotídeo trifosfato marcado radiotivamente ou por um corante uorescente (especí co

para cada tubo: tubo A tem ddATP, tubo G tem ddGTP, etc.);

6. O primer ou iniciador marcado é adicionado ao DNA uni lamentar cuja sequência é desconhecida.

7. A enzima DNA-polimerase adiciona bases livres ao DNA uni lamentar, usando o pareamento de bases
complementares.

Ocorrem quatro reações diferentes, correspondendo aos quatro didesoxinucleotídeos marcados (ddATP, ddCTP,
ddGTP e ddTTP). Eles terminam a sequência de DNA sempre que são incorporados, ao contrário do
desoxinucleotídeo normal (dATP, dCTP, dGTP e dTTP, correspondentes às bases A, C, G e T, respectivamente).

Isso produz fragmentos com comprimentos variáveis, que podem ser separados por eletroforese.

A posição de cada fragmento no gel é indicada pela emissão de partículas radioativas do marcador, o que
permite a leitura direta da sequência de DNA.

Embora o mesmo método básico seja ainda utilizado, vários aperfeiçoamentos ocorreram. O sequenciamento de
DNA automatizado foi um deles.

 
 

ORGES-OSÓRIO, Maria Lucena, ROBINSON, Wanyce Miriam. Genética Humana. ArtMed, 2013. pg. 572

Automação do método de Sanger

Os avanços técnicos possibilitaram automatizar o sequenciamento, trazendo melhorias para o método de
Sanger.

Os equipamentos são capazes de misturar os reagentes, aplicá-los, fazer correr e ler a ordem das bases de
nucleotídeos a partir de um gel. O uso de nucleotídeos terminadores de cadeia, marcados com agentes
uorescentes de cores diferentes, facilita esse processo.

As quatro reações de síntese podem ser realizadas no mesmo tubo e os produtos podem ser separados em uma
única canaleta de gel por eletroforese capilar. Um detector lê e grava a cor do marcador uorescente em cada
banda à medida que ela passa. Assim a sequência pode ser analisada.
 


ORGES-OSÓRIO, Maria Lucena, ROBINSON, Wanyce

Miriam. Genética Humana. ArtMed, 2013. pg. 574

Sequenciamento de Nova Geração: Next-Generation Sequence (NGS)

Apesar de o método de Sanger ser utilizado até hoje, novas técnicas têm sido desenvolvidas para o
sequenciamento de DNA. A mais recente é o sequenciamento de nova geração, também chamada de
sequenciamento de segunda geração ou ainda Next-Generation Sequencing (NGS).
Através do NGS é possível realizar o sequenciamento de um genoma inteiro em questão de dias. A sua

velocidade, capacidade de gerar dados em larga escala e precisão, a um custo inferior aos métodos tradicionais
ganha, a cada dia, mais espaço.

O princípio básico das plataformas de NGS está em sequenciar várias moléculas diferentes (ou vários fragmentos
diferentes provenientes do mesmo genoma) em paralelo. Logo, elas diferem fundamentalmente das
metodologias de Sanger, em que uma única sequência de DNA, oriunda de um trecho especí co, é obtida em
cada reação. Isso é possível graças à integração de ferramentas de nanotecnologia, robótica e informática em
aparelhos de alto desempenho.

A importância do sequenciamento
Hoje é possível, portanto, determinar mais rapidamente uma sequência completa de um genoma humano,
diferente do período inicial do Projeto Genoma. Os pesquisadores agora são capazes de comparar grandes
extensões de DNA (1 milhão de bases ou mais) de indivíduos diferentes, com mais agilidade.

Essas comparações podem gerar uma enorme quantidade de informações sobre o papel da herança na
suscetibilidade a doenças e em resposta a in uências ambientais. Abrem-se assim novas perspectivas para a
medicina baseada nas características genéticas de cada indivíduo, criando um vasto potencial para diagnósticos e
terapias.

Da mesma forma, é possível determinar todo o conjunto de microrganismos presente em um ambiente

(microbioma) a partir do sequenciamento de todo o DNA ali encontrado. Ou até mesmo comparar as sequências
do genoma de diferentes tipos de animais e organismos, fornecendo insights sobre a biologia do
desenvolvimento e da evolução.

Referências

https://www.genome.gov (https://www.genome.gov/12011239/a-brief-history-of-the-human-genome-project/)

http://www.sanger.ac.uk/  (http://www.sanger.ac.uk/)

https://pt.khanacademy.org (https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-

electrophoresis/a/dna-sequencing)

http://www.ib.usp.br/biologia (http://www.ib.usp.br/biologia/projetosemear/diferentes/qual-e-a-importancia-do-

sequenciamento.html)

Heather, J. M., & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA.  Genomics,  107(1), 1–

8.http://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003 (http://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003)

KLUG, William S., CUMMINGS, Michael R., SPENCER, Charlotte A., PALLADINO, Michel A. Conceitos de Genética. ArtMed, 2010. 

BROWN, Terence A. Genética – Um Enfoque Molecular, 3ª edição. Guanabara Koogan, 1999. 

 SCHAEFER, G. Bradley, THOMPSON, James. Genética Médica. AMGH, 2015. 


OSÓRIO, Maria Lucena, ROBINSON, Wanyce Miriam. Genética Humana. ArtMed, 2013. 

MENCK, Carlos M. Genética Molecular Básica. Guanabara Koogan, 2017. 

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