TÉCNICA DEL SUDÁN III

La técnica del sudán III es un método utilizado generalmente para demostrar la presencia de
grasas mediante tinción de triglicéridos, aunque también tiñe otros lípidos.

Pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que no tienen afinidad por
estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen aquellas sustancias que tienen
un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.

FUNDAMENTO
Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que
van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante, éste tiende a disolverse en la
grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en
solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.

TEJIDO CONTROL Y DIANA

El tejido diana para esta técnica es el tejido adiposo y lípidos en general. El fijador ideal es el
formol 10%, y el grosor óptimo de corte es de 4 a 6 micras.

REOS
1. Sudán III.
2. Escarlata.
3. Hematoxilina o carmín.

PROCEDIMIENTO
1. Desparafinar e hidratar.
2. Lavar en agua destilada.
3. Añadir sudán III + 40 gotas de rojo escarlata, de 1 a 24 horas.
4. Lavar con agua corriente.
5. Añadir hematoxilina o carmín (para el contraste), 5-10 minutos.
6. Lavar en agua corriente, 5 minutos.
7. Montar.

RESULTADOS
Color inicial:

 Grasa: rojo.
 MÉTODO DE BIURET
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es
bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es
muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).

PROTOCOLO A REALIZAR
Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras problemas preparadas como
se indica en la Tabla III. Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.

- Representa la curva estándar.

- Calcula el coeficiente de extinción.

- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2.

RESULTADOS ESPERADOS
El método de Biuret (poco sensible) permitirá cuantificar la cantidad de proteínas en la
muestra M1 pero no en la M2.

REACTIVO DE BIURET

Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700
ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante.
Guardar en frasco de plástico.
 PRUEBA DEL YODO
La prueba del yodo es una reacción química usada para determinar la presencia o alteración de
almidón u otros polisacáridos. Una solución de yodo - diyodo disuelto en una solución acuosa
de yoduro de potasio - reacciona con almidón produciendo un color púrpura profundo.

Este tipo de prueba puede realizarse con cualquier producto que contenga almidón como ser
patatas, pan o determinados frutos.

Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción

del almidón con el yodo presente en la solución de un reactivo llamado Lugol. La amilosa, el
componente del almidón de cadena lineal, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo,
formando un color azul oscuro a negro. La amilopectina, el componente del almidón de cadena
ramificada, forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse,
obteniéndose un color entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el almidón en
unidades más pequeñas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. En consecuencia, esta
prueba puede determinar el final de una hidrólisis, cuando ya no hay cambio de color
constituyendo una evidencia experimental ampliamente utilizada.

La solución de yodo también reacciona con el glucógeno, aunque el color producido es más
castaño y mucho menos intenso.

Esta prueba se utiliza como indicador del grado de madurez de los frutos. El fruto cuando está
inmaduro contiene altas cantidades de almidón, que son detectadas a través de la tinción con
la prueba de almidón, apareciendo como grandes zonas en el fruto teñidas de azul. Mientras
que cuando un fruto esta maduro, ese almidón se ha transformado en azúcares y por lo tanto
no se tiñe en la prueba.

En la industria, la hidrólisis del almidón es ampliamente utilizada para producir glucosa a partir
del almidón presente en la pulpa del fruto de banano verde. El proceso consta de tres etapas:

1. Gelatinización:

Consiste en calentar los gránulos de almidón en agua y separar la amilosa de la amilopectina.

(Lixiviación).

2. Dextrinización:

Luego de la gelatinización del almidón, se procede a obtener polisacáridos de bajo y alto peso
molecular (maltodextrinas) aplicando una hidrolización parcial.

Las dextrinas también pueden experimentar cambio de coloración cuando reaccionan con una
solución de yoduro de potasio. La coloración obtenida va a depender del grado de hidrólisis de
la molécula, (en este caso se trata de macromoléculas las cuales están conformadas por una
cantidad importante de átomos en su estructura).

3. Sacarificación:
En esta etapa, se hidrolizan totalmente las maltodextrinas a glucosa, completándose el proceso.

En el procedimiento industrial anteriormente detallado, puede utilizase la prueba de yodo para

realizar seguimiento de las reacciones de hidrólisis. Cuando el almidón se degrada totalmente a
glucosa, ya no se obtiene la coloración azul oscura que caracteriza a la reacción entre el almidón
y la solución de yodo-yodurada.