BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

TALLER No 1: METODOS DE EXTRACCION DE ADN

1. Describa y fundamente en un cuadro comparativo los siguientes métodos de

extracción de ADN
 Métodos basados en soluciones
 Métodos basados en solidos
Métodos basados en soluciones
Tecnología de intercambio aniónico
Este método se basa en la interacción
específica entre los fosfatos cargados
negativamente presentes en los ácidos
nucleicos y moléculas de superficie
cargadas positivamente en el substrato.
Métodos basados en solidos
Separación magnética
Este método está basado en la unión
reversible del ADN a una
superficie/esferas/partículas sólidas
magnéticas, las cuales han sido recubiertas
con un anticuerpo que une ADN o un grupo
funcional que interactúa específicamente
con el ADN. Tras la unión del ADN, las
esferas son separadas de otros componentes
celulares contaminantes, lavadas y
finalmente el ADN purificado es eluído
utilizando extracción con etanol.

Extracción con disolventes orgánicos Ultrafiltración

Este método se puede usar para moléculas La muestra se carga directamente sobre la
de ADN de alto peso molecular, obteniendo membrana de ultrafiltración y mediante
buenos rendimientos de moléculas vacío o centrifugación, se eliminan todos
relativamente puras, siempre teniendo en los contaminantes mientras que la muestra
cuenta que hay que controlar el pH de la fase con los ácidos nucleicos permanecen
acuosa y la concentración de sales, que son retenidos en la superficie de la membrana.
los factores que aseguran una buena
separación. Las desventajas de este método
son el uso de disolventes orgánicos dañinos
para la salud humana y que pueden quedar
como trazas en la muestra de ADN y luego
actuar como interferentes en técnicas como
el PCR, que es largo, en ocasiones puede dar
rendimientos poco reproducibles y requiere
de varios trasvases que aumentan la
posibilidad de contaminación de la muestra.
yoduro de sodio como agente caotrópico
en un único tubo
Se yoduro de sodio como agente
caotrópico, que tienen la ventaja de que la
extracción se realiza en un único micro
tubo de centrifugado. El yoduro de sodio
además de provocar la lisis celular rompe
la capa de hidratación que rodea el ADN y
logra que las cargas negativas de los
grupos fosfatos del ADN queden más
expuestas. En estos kits después del
tratamiento de la muestra con yoduro de
sodio en el mismo tubo se adicionan
detergentes aniónicos como es el caso del
N-lauril sarcosinato de sodio, proteinasa K
y/o otros reactivos que permiten separar las
proteínas y lípidos contenidos en las
muestras biológicas del ADN.
Precipitación mediante sales y alcoholes
Método que permite la obtención de ADN
de gran pureza y presenta la ventaja de que
las soluciones utilizadas son muy seguras
para la salud del personal técnico que
realiza la extracción.
Cromatografía de absorción
Se basa en la adsorción y desorción de los
ácidos nucleicos en presencia de sales cao
trópicas, bajo las condiciones nativas, los
ácidos nucleicos están recubiertos de una
capa hidratante de moléculas de agua que
mantienen la solubilidad del DNA en
soluciones acuosas.
Cromatografía de intercambio iónico
Una modificación de este método es la
extracción en fase sólida, en la que se utiliza
una matriz intercambiadora de aniones
empaquetada en columnas de polipropileno,
la unión se produce bajo condiciones de baja
salinidad y durante los pasos de lavado y
elución se va incrementando la
concentración de sales en los tampones
correspondientes.
2. En el proceso de extracción de ácidos nucleicos se pueden identificar y diferenciar
fases propias del procedimiento, tales como: lisis celular, denaturación de nucleoproteínas /
inactivación de enzimas celulares, remoción de contaminantes y precipitación del DNA. En
este contexto, para llevar a cabo este proceso, se emplean diferentes reactivos, cada uno
confunciones particulares particulares y pueden ser clasificados en alguna de las fases antes
mencionadas.

A continuación se presenta un listado de reactivos, con respecto a los cuales usted debe
determinar cuál es su función, acción física, acción química o bioquímica en las células
durante el proceso de extracción de ADN; así como la fase del proceso a la cual pertenece.
Para realizar esta actividad, debe completar el cuadro que se presenta en seguida,
clasificando los siguientes reactivos: Proteínasa K, Lisozima, Dodecil sulfato de Sodio o
SDS, Tris-HCl, EDTA, NaCl, Fenol –cloroformo, alcohol Isoamíllico, Isopropanol, Etanol

absoluto, Etanol 70%, CTAB, Cloruro de Amonio, Bicarbonato de Potasio, Acetato de

Amonio, TE, Acetato de Sodio, columnas de afinidad e intercambio iónico, Chelex, PVP,
nitrógeno líquido. El primer (Proteinasa K) punto se realiza a manera de ejemplo.

REACTIVO CLASIFICACIÓN ACCIÓN EN LA CÉLULA FASE DEL

QUÍMICA PARA PROCESO DE
EXTRACCIÓN
EXTRAER EL ADN

Proteinasa Enzima Ruptura de enlaces Lisis celular

K proteolítica peptídicos en la célula de la
cual se va a extraer el
ADN, para
separar el núcleo de las
proteínas que lo
acompañan.

Lisozima Enzima Desestabiliza la capa de Lisis de la pared

peptidoglucano de las gram celular
positivas actuando sobre los
enlaces glucosídicos N-
acetilmuramico y N-
acetilglucosamia
Dodecil sulfato de Detergente Solubiliza proteínas y Desnaturalización
Sodio o SDS aniónico (TÓXICO) membranas. de las proteínas
surfactante

Tris-HC Buffer Estabiliza el pH de la Dilución tampón

solución (entre 7,0 y mantener Ph
8,0) estable

EDTA Quelante Toma el Mg y el Ca Desestabiliza la

desestabilizando la membrana
membrana celular

NaCl Sal A altas Estabilizar ADN

concentraciones precipitación
solubiliza al ADN.

Fenol – Solvente orgánico Fenol: Separación de los

cloroformo (tóxico) Denatura proteínas ácidos nucleicos y
las proteínas
Cloroformo:
Denatura proteínas.
Remueve lípidos.
Solubiliza al fenol y lo
elimina de la solución.

alcohol Isoamíllico solventes orgánicos separa las proteínas y Separación de

los lípidos ya que estas proteínas y lípidos
se separan mediante del ADN
solventes orgánicos. La
fase acuosa y la
orgánica se separan
por centrifugación lo
que permite aislar al
ADN.

Isopropanol alcohol El isopropanol precipita Precipitación del

el DNA porque compite ADN
con este por el agua,
deshidratando y
llevándolo al fondo del
tubo.

Etanol absoluto precipita eficientemente precipitar el adn de

los ácidos nucleicos la fase acuosa
poliméricos dejando
 atrás ácidos nucleicos
monoméricos y de
cadena corta,
incluyendo los
ribonucleótidos del
tratamiento con RNAsa
en solución

Etanol 70% lavar cualquier sal eliminar sales y

residual del ADN pequeñas moléculas
granulado. por medio orgánicas que
de la atracción de los podrían aún estar
compuestos presentes en la
eléctricamente muestra
haciendo que el ácido
nucleico sea menos
hidrófilo

CTAB (hexadecil Detergente catiónico Solubiliza facilita la separación

trimetil bromuro polisacáridos. de los polisacáridos
de amonio) durante la
purificación,

Cloruro de sal mejora la precipitación remoción de los

Amonio de las proteínas contaminantes
precipitacion de
proteinas

Bicarbonato sal produce la lisis de la membrana lisis celular

de Potasio celular por las propiedades que
posee

Acetato de sal inorgánica precipitacion de proteinas por remoción de los

Amonio altas concentraciones de sal ya contaminantes
que disminuye su solubilidad precipitación de
proteínas

TE Buffer protege al ADN/ARN volviendolo lisis celular

soluble , precipita iones de Mg el
tris interactúa con los
lipopolisacáridos de la membrana
desestabilizando . el EDTA
,inactiva la nucleasa el TE inhibe
la DNAsa
Acetato de Sal Precipita el ADN se le agrega SDS
Sodio para formar sólidos
de los restos
celulares y así
separar el ADN
plásmido de ADN
cromosómico

columnas de cromatografía hay una elevación de la remoción de

afinidad e iónica columna de PH por el contaminantes
intercambio intercambio de grupos precipitacion de
iónico positivos con ácidos nucleicos proteinas

Chelex resina preferentemente captura iones remoción de

quelante metálicos polivalentes en contaminantes y
soluciones. El efecto de esta precipitación de
sustancia es prevenir a través de proteínas
su acción quelante la ruptura del
ADN a altas temperaturas
catalizada por los iones
involucrados en las muestras de
trabajo.

Polivinilpirrolidona Polímero Forma enlaces de hidrógeno con los Eliminar los

(PVP) compuestos fenólicos. fenólicos de
las muestras

Nitrógeno líquido Gas El nitrógeno líquido, congela de Ruptura de

inerte inmediato la muestra y evita que se tejidos y
formen cristales en el interior de la paredes
célula que rompen la estructura celular celulares
e inicie el proceso de degradación del
ADN por acción de las DNasas.

3. Busque por internet un kit de extracción de ADN, que usted puede adquirir en el
mercado comercial de diagnóstico actual, en donde solo mencionan el nombre de la
solución, es decir, solución de lisis, solución de precipitación, etc. Averigüe o
deduzca del punto anterior, que reactivos podrían contener cada una de esas
soluciones. Se le sugiere algunas de las casas comerciales que distribuyen estos kits:
Roche, Roche Biocare, Promega, Invitrogene, Bioline, Merck, Sigma, Bioline.

Código del producto Descripcion

A1120 Wizard® Genomic DNA Purification Kit

Componentes:
 A793 Solucion de lisis celular (solucion de lisis de globulos rojos)

A794 Solución de lisis de núcleos

A796 Solución de rehidratación de ADN

A797 RNAsa y solución

A795 Solución de precipitación de proteínas

Solución de lisis celular (RBC):155 mM NH4Cl

12 mM NaHCO3
0.1 mM EDTA
0.2
Solución de lisis de nucleos : 75 mM NaCl
24 mM EDTA (pH 8.0)

Solución de rehidratación de AND 10mM Tris-HCl (pH 7.4)

1mM EDTA (pH 8.0)

RNAsa y solution :Tris-Cl (10 mM, pH 7.5)/NaCl (15 mM)

Solución de precipitación de proteínas: Sales

4. Averigüe que cuidados se deben tener para evitar contaminación cruzada en el

laboratorio al manejar o extraer ácidos nucleicos, sobretodo DNA. Existen equipos
especializados que reduzcan el riesgo de contaminación?, Como funcionan?.

El análisis molecular debe llevarse a cabo por personal altamente capacitado en el área de
la biología molecular. Sin embargo, los resultados que se obtengan no sólo dependerán de
la calidad del análisis molecular per se, sino que en gran medida también dependerán de la
calidad de la muestra analizada. De esta manera, la metodología utilizada, sea simple o
sofisticada, económica o costosa, no brindará los resultados esperados si no se tiene como
punto de partida una muestra manejada de forma correcta. Por lo general, para que una
muestra llegue desde el sitio de la toma hasta el laboratorio, se requiere de la participación
de un equipo de trabajo, por lo que es importante que cada individuo implicado en el
proceso conozca las recomendaciones elementales para el manejo adecuado de muestras.
Éste implica tres pasos fundamentales: selección, toma y preservación de la muestra..

A menudo, los distintos procedimientos que se realizan en el laboratorio pueden afectarse

negativamente entre sí. Por ejemplo: las técnicas moleculares, como la PCR, se deben hacer
en una sala distinta a los cultivos. Si se realizaran en la misma sala, el cultivo podría
contaminar las muestras de PCR y provocar resultados positivos falsos. Las zonas deben
estar separadas si se llevan a cabo actividades incompatibles.
Tener en cuenta
 La zona principal para recogida de muestras primarias debe estar separada del
laboratorio. Se debe garantizar que esta zona permita la recogida adecuada de
muestras sin que haya riesgo de infectar a los pacientes (que ya están
inmunodeprimidos y son hipersensibles a los patógenos presentes en el laboratorio).
 El cultivo se realiza en una sala aparte. El cultivo de resistencia a fármacos puede
estar separado del cultivo inicial.
 Haga una lista de todas las medidas que deberían tomarse para evitar la
contaminación cruzada y las situaciones inseguras. Si algún aspecto relacionado con
la bioseguridad no le queda claro, solicítele al encargado de bioseguridad que le
proporcione una aclaración.

5. Qué condiciones diferenciales se pueden identificar en la extracción de DNA

proveniente de plantas y hongos, en comparación con DNA de bacterias o células
sanguíneas. Argumente con base en la literatura disponible.

 Para la detección de genomas exógenos como bacterias y virus de ADN , la muestra

dependerá de la historia natural del microorganismo infectante por ejemplo, en la
detección del virus de la hepatitis B (VHB), se sabe que éste es un virus hepatotrófi co que
al replicarse produce lisis celular y que los virus se diseminan por todo el organismo a
través del torrente sanguíneo; por ello, la muestra de elección es sangre periférica sin
anticoagulante para la obtención de suero mediante centrifugación.
 Los métodos de uso mas general del aislamiento de la DNA de la planta utilizan los
productos quimicos toxicos y peligrosos fenol, cloroformo3, que requieren el
equipo especial reducir al minimo la exposición y pueden limitar su uso en ciertos
ambientes.
Bibliografía
 Bibliografía: (2019). Retrieved 16 September 2019, from
http://www.annardx.com/productos/images/productos/diagnostica/biologia-
molecular/anyplextm-ii-hpv-28-detection-hp7s00x.pdf
 En el texto: (Salazar, Rodriguez & Armendáriz, 2019) Bibliografía: Salazar, A.,
Rodriguez, A., & Armendáriz, J. (2019). Biologia molecular. Fundamentos y
aplicaciones en las ciencias de la salud (pp. 93-99). Mexico.
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