“Año Del Diálogo y Reconciliación Nacional”

E.A.P: Biotecnología

CICLO: VIII

DOCENTE: Ángel Castro Alvarado

CURSO: Investigación I

GRUPO: A

INTEGRANTES:

● Arroyo Achu Gabriel (A1)

● Bartolo Paredes Pamela (A2)
● Laguna Milla Leslie (A2)
● Lizano Villanueva Carlos (A3)
● Moncada Chavez Alexis (A3)
● Sánchez Castillo Carlos (A1)
 “Año Del Diálogo y Reconciliación Nacional”

E.A.P: Biotecnología

CICLO: VIII

DOCENTE: Ángel Castro Alvarado

CURSO: Investigación I

GRUPO: A

INTEGRANTES:

● Arroyo Achu Gabriel (A1)

● Sánchez Castillo Carlos (A1)
Semana 10

1. Ver José Supo - Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos

https://www.youtube.com/watch?v=e-zOqfXN14Y

Realizar un resumen

Para poder realizar una investigación es necesario la recolección de datos, así mismo
saber diferenciar entre recolectar (obtener la información) y medir (analizar). Un dato
es el resultado de una evaluación de una unidad de estudio, esta es de interés a
estudiar, las técnicas de estudio pueden ser sujetos u objetos, los datos son
conceptos abstractos, susceptible de ser percibidos de manera directa o indirecta.
Los datos recolectados están enlazados con las variables de estudio y con los
objetivos planteados, estos son cualitativos (busca recolectar datos numéricos
exactos, tiene una gran aplicación en biología y química), cuantitativos (busca obtener
información de contexto y características de fenómenos sociales) o mixtos (recolecta
información cualitativa y cuantitativa a la vez).

Población y muestra | Metodología de la investigación científica

https://www.youtube.com/watch?v=dOnHe83CF68.

Realizar un resumen

La finalidad de todo investigador es estudiar a la población y nunca a la muestra,

aunque a veces la población es inalcanzable por esto se elige un conjunto de sus
unidades para conformar la muestra, a este procedimiento se denomina muestreo y
se espera que sea extrapolable hacia la población ya que este es el interés del
investigador, a esto se denomina inferencia.
La población es el conjunto de todas las unidades de estudio (sujeto u objetos), cuya
características observable expresa interés de estudio, las poblaciones deben situarse
claramente en torno a sus características de contenido, lugar y tiempo a lo cual se le
denomina marco muestral, indispensablemente en los estudios exploratorios y
descriptivos, a diferencia de estudios analíticos que tiene mayor importancia en el
ámbito de recolección de datos, el cual representa cualitativamente a la población, la
medición completa de todos los elementos que forman la población se denomina
censo y no puede ser ejecutado mediante muestreo, sin obviar que el interés es la
población. La muestra es una estrategia metodológica y estadística que es usada
cuando no se puede acceder a la población como cuando la población es
desconocida, la población es inaccesible, la población es inalcanzable. Una muestra
es representativa si cumple dos condiciones: El cálculo del tamaño de la muestra y la
técnica de muestreo. El tamaño de la muestra se calcula en función al objetivo
estadístico y a la naturaleza de a la variable aleatoria, existen métodos aleatorios
simples, estratificados, sistemáticos. También podemos elegir a las unidades
muestrales mediante técnicas no probabilísticas como muestra por conveniencia, el
de juicio, por cuotas y muestreo en bola de nieve.

2. Señale en su PTI de cada subgrupo que está elaborando contiene problema,

objetivo general, objetivo específico, hipótesis, diseño experimental, material y
métodos apropiados y cronograma detallado para investigación II y III (incluye
organismo usado. Técnicas de evaluación. reactivos, equipos presentes en la
UNS y por adquirir. Indicar microbio (aislado, identificación molecular, de
colección), medio de cultivo de aislamiento, en producción, etc)

PTI: Recuperación de cobre utilizando diferentes concentraciones de

Acidithiobacillus ferrooxidans partir de residuos de celulares

2.1. Problema

¿Cuál es el Efecto de las concentraciones de Acidithiobacillus ferrooxidans

para la Recuperación de cobre a partir de residuos de celulares?

2.2 Objetivo general

● Restituir el cobre a partir de residuos celulares empleando Acidithiobacillus

ferrooxidans a condiciones de laboratorio.

2.3. Objetivos específicos

● Biolixiviación de cobre en los residuos proveniente de los celulares a nivel de

laboratorio.
● Evaluar cambios de concentración de Acidithiobacillus ferrooxidans en el
proceso de biolixiviación.
● Determinar la cinética del Acidithiobacillus ferrooxidans a diferentes
concentraciones y tiempo.
● Cuantificar el cobre por métodos bioquímicos como la yodometría u otro
método como gravimetria

2.4 Hipótesis

Restituir 10% de cobre a partir de residuos celulares o celulares en desuso empleando

Acidithiobacillus ferrooxidans por el proceso de la biolixiviación a condiciones de
laboratorio.

Restituir 20% de cobre a partir de residuos celulares o celulares en desuso empleando

Acidithiobacillus ferrooxidans por el proceso de la biolixiviación a condiciones de
laboratorio

Restituir 30% de cobre a partir de residuos celulares o celulares en desuso empleando

Acidithiobacillus ferrooxidans por el proceso de la biolixiviación a condiciones de
laboratorio

2.5 Diseño experimental

Ensayos de biolixiviación

Los ensayos de biolixiviación se realizarán con 15 g/L de residuos e inoculados al

10% v/v con cepas crecidas en medio Norris pH 1,7 ajustado con EBD.
Los cultivos serán suplementados con: 6 g/L de FeSO4 •7H2O para el cultivo puro de
A. ferrooxidans; Por otro lado, se realizará un control abiótico que contendra sólo
medio Norris. Estos se incubarán aeróbicamente a 28ºC con agitación constante de
180 rpm por 240 horas. Todos los cultivos serán realizados en triplicado los cultivos.

Determinaciones analíticas

Las determinaciones diarias de tiempo y concentración de A. ferrooxidans. Se

realizará cada 12 horas a 5ml de concentración de A. ferrooxidans en cada 1 gramo
de residuo de celulares por 10 días para así lograr identificar el cobre con la ayuda de
A. ferrooxidans.

El análisis de las muestras de residuos de celulares y EBD será realizado mediante

espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES).
Para las determinaciones diarias de pH, se extraerá una alícuota de 1,5 ml a las 240
de incubación, para la determinación del contenido metálico por Fluorescencia de
Rayos X por Reflexión Total (TXRF) (S2 PICO SIFOX Bruker).
Para la observación de la adherencia sobre la superficie de los residuos, por
microscopía de epifluorescencia se utilizará 4’,6’-diamino-2-fenilindol (DAPI)
(González et al., 2012), las muestras de scraps se extrajeron a las 120 y 240 horas
de incubación desde los cultivos de A. ferrooxidans. Las muestras extraídas serán
lavadas con agua ácida pH 1,5 y fijadas con formaldehído al 4% y posteriormente
teñidas con DAPI al 0,05% para su posterior visualización (Zeiss Axiovert 200 M).
El análisis químico de los residuos y EBD determinarán la presencia y cantidad del
cobre. (Sandoval et al., 2015)

2.6 Material y métodos.

2.6.1. Materiales

 6 placas petri
 6 matraces
 9 botellas frugos liber (1L)
 5 botellas de vidrio (500ml)
 etanol 70%
 Autoclave
 Incubadora
 Shaker
 pHmetro
 Agua destilada
 Asa bacteriológica
 Microscopio
 Mechero
 Sulfato de Amonio
 Cloruro de Potasio
 Fosfato de potásico
  Sulfato de Magnesio Heptahidratado
 Nitrato de Calcio
 Sulfato ferroso heptahidratado
 Sacarosa
 Agar
 Cristal violeta
 Lugol
 Safranina
 Aceite de inmersión
 Laminas y laminillas
 Celulares en desuso

2.6.2. Métodos

Aislamiento del Acidithiobacillus ferrooxidans

Toma de muestra de Acidithiobacillus ferrooxidans de las aguas ácidas de la

mina de Áncash-Huaraz “Pierina”

Las muestras bacterianas serán obtenidas a partir de los drenajes ácidos de minas
(pH alrededor de 4.0),de las paredes y techos que presentan puntos de oxidación de
sulfuros, estas serán almacenadas en botellas de vidrio que posteriormente se
adaptará e identificar y aislará Acidithiobacillus ferrooxidans.

Crecimiento, aislamiento y adaptación de Acidithiobacillus ferrooxidans

Para el aislamiento de microorganismos con capacidad oxidativa de hierro se utiliza

el medio de cultivo 9K líquido a pH 1.8 (Silverman y Lundgren, 1959), suplementado
con FeSO4.7H2O (44 g/L) como fuente de energía, y la purificación del aislamiento
se realizará mediante subcultivos sucesivos de colonias individuales desde medio
liquido a solido. El medio de cultivo sólido se gelificará con agarosa (5 g/L), y se
sembrará con agotamiento de estrías. El crecimiento se registrará semanalmente
mediante recuento directo en cámara Neubauer. Se seleccionará colonias con distinta
morfología que presentan oxidación de hierro, y se incubarán en medio líquido 9K a
30 °C, con agitación constante a 180 rpm, durante cinco días.

COMPOSICIÓN

Solución A: Sales 9K para 300 ml de medio

 TABLA N° 01 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO 9K

Compuesto Fórmula 300 ml

Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 0.9g

Cloruro de Potasio KCl 0.03 g

Fosfato de potásico K2HPO4 0.15 g

Sulfato de Magnesio Heptahidratado MgSO4 7H2O 0.15 g

Nitrato de Calcio Ca(NO3)2 0.003g

Solución B: Solución de Sulfato Ferroso Heptahidratado

TABLA N° 02 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO 9K

Compuesto Fórmula 300ml

Sulfato ferroso heptahidratado FeSO . 7H O

4 2 13,2 g

Se preparará cada solución por separado. Se pesarán las cantidades señaladas para
la solución A y se van disolviendo de 1 en 1 en agua destilada, se agregará Sacarosa
0.3 𝑔/𝐿; finalmente se completa a 210 𝑚𝐿. El 𝑝𝐻 se ajusta a 1.8 con ácido sulfúrico 10
𝑁 y se esteriliza a 121 ℃ durante 15 minutos. La solución B se disuelve en 90 𝑚𝑙 de
agua destilada. El 𝑝𝐻 se ajustará a 1.8 con ácido sulfúrico 10 𝑁 y se esterilizará a 121
℃ durante 15 minutos. Se mezclarán estérilmente a temperatura ambiente la solución
A y B antes de usar.

𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒 𝟏𝟎𝑵 La densidad del ácido sulfúrico es 5,52 𝑦 1 𝑁 de ácido sulfúrico es 14,712
𝑔. Como 𝑑 = 𝑝/𝑉 para tener 1 𝑁 se agregará 7,995 𝑚𝑙 Para tener 𝐻2𝑆𝑂4 10𝑁 se
agregará 2,665 𝑚𝐿 a agua hasta 3 00 𝑚𝐿.
CONDICIONES Y CICLOS DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

Para la Etapa de Enriquecimiento se inoculará en condiciones asépticas 10 𝑚𝐿 de la

muestra problema contenido en matraz de 250 𝑚𝑙 de Medio 9M (M9K) modificado
estéril. El cultivo se incubará con agitación constante de 150 𝑟𝑝𝑚 usando un agitador
magnético, temperatura de 30 °𝐶 durante 3 días. Sucesivamente se realizarán cuatro
réplicas adicionales de cultivo de enriquecimiento en M9K modificado con las mismas
condiciones, pero usando como inóculo una muestra de 1,0 𝑚𝑙 del cultivo anterior
para cada caso.

MEDIO DE AISLAMIENTO DE CEPAS

COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN

Se empleará como base el M9K modificado, usando agar como agente solidificante,
compuesto por:

Solución A: Sales 9M + Sacarosa 0.3 𝑔/100ml

Solución B: Solución de Sulfato Ferroso 4.4 𝑔/100m𝐿
Solución C: Agar Soya Tripticasa (TSA) 2 𝑔/100ml

Las Soluciones A y B se acidificarán hasta pH 1.8 con 𝐻2𝑆𝑂4 10𝑁 y se disolverán

hasta 50 𝑚𝑙 y 20 𝑚𝑙 respectivamente con agua destilada; la Solución C se disuelve
hasta 30 mL con agua destilada. Todos los componentes se esterilizarán por
separado a 121°𝐶 durante 15 minutos y posteriormente se mezclarán estérilmente a
60 ℃ aproximadamente con agitación constante, para su posterior vaciado
asépticamente en placas Petri.

CONDICIONES DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE CEPAS

En placas de M9K modificado sólido (M9Kms), se inoculará usando la técnica

aséptica de agotamiento por estriamiento, previo toque con masa del M9M modificado
líquido inoculado, correspondiente al último Ciclo de Enriquecimiento para cada caso,
incubándose durante tres días a 30 ℃. Sucesivamente se realizarán cuatro réplicas
de Aislamiento de Cepas, mediante repiques y selección constante desde la placa
anterior para su aislamiento, purificación y posterior caracterización preliminar, a fin
de emplearlas en los ensayos de adaptación y posterior biolixiviación.

SELECCIÓN DE CEPAS Y CARACTERIZACION PRELIMINAR

CARACTERIZACION

La caracterización de los microorganismos aislados se basará en el crecimiento en

medio líquido posteriormente en medio sólido , los cuales serán evaluados durante
las diversas réplicas de cultivo de enriquecimiento y aislamiento, para ser usados
como carácter de selección, con la finalidad de ser determinados tipos morfológicos,
denominados cepas tipo, sin tener que llegar a su identificación taxonómica, siendo
empleados posteriormente en los ensayos de biolixiviación.
MORFOLOGIA BACTERIANA

Generalmente se hace necesario el uso de colorantes biológicos para visualizar

adecuadamente las bacterias y demostrar su presencia en una muestra, su
morfología o quizás el fino detalle de estructuras internas; esta información contribuye
también a su identificación taxonómica, se identificara a A. ferrooxidans por tinción
gram.

Recolección de residuos de celulares

Se recolectarán distintos celulares desechados, los cuales serán desmantelados y

separadas extrayendo los scraps o circuitos del resto de la chatarra (plásticos,
baterías, conectores, cables y cerámicos). Para el uso experimental, los residuos se
trituran obteniendo una fracción homogénea de 0,2-2 mm.

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Las cepas que se utilizaran corresponden a bacterias A. ferrooxidans, para el

crecimiento de los microorganismos se utilizara medio Norris a pH 1,7 acidificado con
EBD, el medio contiene (g/L): (NH4)2SO4 0,4; KCl 0,4; KH2PO4 0,2 y MgSO4 x 7H2O
0,5. Como fuente energética para cada cepa se utilizara g/L: 10 S0 A. ferrooxidans
y 6 FeSO4 x 7H2. Una vez obtenido el cultivo en fase exponencial, se transfiriran
inóculos al 10% v/v a medio fresco con una concentración de residuos de 0,75 g/L. El
crecimiento se registrará semanalmente mediante recuento directo en cámara
Neubauer.

2.7 cronograma detallado para investigación II y III (incluye organismo usado.

Técnicas de evaluación. reactivos, equipos presentes en la UNS y por adquirir.
Indicar microbio (aislado, identificación molecular, de colección), medio de
cultivo de aislamiento, en producción, etc)

INVESTIGACIÓN II

SEMANAS
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Toma de muestra de X
Acidithiobacillus
ferrooxidans de las
aguas ácidas de la
mina de Áncash-
Huaraz ´´Pierina´´

Crecimiento del x
Acidithiobacillus
ferrooxidans

Aislamiento del X
Acidithiobacillus
ferrooxidans

Adaptacion e X
identificación del
Acidithiobacillus
ferrooxidans

Resiembra de la cepa x
obtenida de
Acidithiobacillus
ferrooxidans y
almacenaje para su
posterior uso

Preparación de x
distintas
concentraciones de
Acidithiobacillus
ferrooxidans por
diluciones seriadas
Preparación de medio x
donde se usará como
fuente de carbono
para
Acidithiobacillus
ferrooxidans

Incubar en shaker a x
x°C por x días en
agitación por un
periodo de x,
recogiendo y
evaluando muestra y
cambios de pH

Ensayos I de
biolixiviación x

Ensayos II de x
biolixiviación

Ensayos III de x
biolixiviación

Determinaciones x
analíticas I

Determinaciones
analíticas II x

Determinaciones x
analíticas III

Análisis Estadístico
x

Análisis Estadístico x
INVESTIGACIÓN III

SEMANAS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Resiembra de la cepa X
obtenida de
Acidithiobacillus
ferrooxidans y
almacenaje para su
posterior uso

Ensayos I de x
biolixiviación

EnsayosII de X
biolixiviación

Ensayos III de X
biolixiviación

Ensayos IV de x
biolixiviación

Determinaciones X
analíticas I

Determinaciones X
analíticas II

Determinaciones X
analíticas III

Determinaciones X
analíticas IV

Determinaciones X
analíticas V

Análisis Estadístico X
Análisis Estadístico X

Redaccion de informe X

Redaccion de informe X

Exposición X

Exposición X
 “Año Del Diálogo y Reconciliación Nacional”

E.A.P: Biotecnología

CICLO: VIII

DOCENTE: Angel Castro Alvarado

CURSO: Investigación I

GRUPO A: Subgrupo A2

TEMA: Práctica - semana 10

INTEGRANTES:

● Bartolo Paredes Yomira

● Laguna Milla Leslie
 1. RESUMEN (Videos)

❏ José Supo - Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos

En el video José explica en lo que consiste un instrumento de recolección de datos que viene
hacer un principio de cualquier recurso de que pueda valerse el investigador para acercarse a
los fenómenos y extraer de ellos información. De este modo el instrumento sintetiza en sí toda
la labor previa de la investigación, resume los aportes del marco teórico al seleccionar datos
que corresponden a los indicadores y, por lo tanto a las variables o conceptos utilizados.
También dice que son un conjunto de mecanismos, medios y sistemas de dirigir, recolectar,
conservar, reelaborar y transmitir los datos a través de los cuales se hace posible la obtención
y archivo de la información requerida para la investigación. Las técnicas de recolección de
datos se clasifican en cualitativas, cuantitativas y mixtas.

➢ La investigación cuantitativa, busca recolectar datos numéricos o exactos. Sus

técnicas son estandarizadas, sistemáticas y buscan obtener datos precisos. Por esta
razón tienen mayor aplicación en estadística o en las ciencias exactas como biología
o química.
➢ La investigación cuantitativa, en cambio, busca obtener información sobre el
contexto y las características de los fenómenos sociales.
➢ Las técnicas mixtas, como su nombre lo indica, son aquellas que permiten recolectar
información cualitativa y cuantitativa a la vez.

❏ Población y muestra | Metodología de la investigación científica.

En una investigación las estadísticas de por sí no tienen sentido si no se consideran o se
relacionan dentro del contexto con que se trabajan. Por lo tanto es necesario entender sobre
población y muestra para lograr comprender mejor su significado en la investigación educativa
o social que se lleva a cabo. Entonces población es todo conjunto de individuos que tienen las
características (variables), que se quieren estudiar; cuando se vaya a llevar a cabo alguna
investigación debe de tenerse en cuenta algunas características esenciales al seleccionarse
la población bajo estudio. Entre éstas tenemos:

➢ Homogeneidad: que todos los miembros de la población tengan las mismas

características según las variables que se vayan a considerar en el estudio o
investigación.
➢ Tiempo: se refiere al período de tiempo donde se ubicaría la población de interés.
➢ Espacio: se refiere al lugar donde se ubica la población de interés.
➢ Cantidad: se refiere al tamaño de la población. El tamaño de la población es
sumamente importante porque ello determina o afecta al tamaño de la muestra que se
vaya a seleccionar.

En la muestra es un subconjunto fielmente representativo de la población, de la cual hay diferentes

tipos de muestreo. El tipo de muestra que se seleccione dependerá de la calidad y cuán representativo
se quiera sea el estudio de la población (aleatoria, estratificada, sistemática). En la investigación
experimental, por su naturaleza y por la necesidad de tener control sobre las variables, se recomienda
muestras pequeñas.
2. Señale en su PTI de cada subgrupo que está elaborando contiene
problema, objetivo general, objetivo específico, hipótesis, diseño
experimental, material y métodos apropiados y cronograma detallado para
investigación II y III (incluye organismo usado. Técnicas de evaluación.
reactivos, equipos presentes en la UNS y por adquirir. Indicar microbio
(aislado, identificación molecular, de colección), medio de cultivo de
aislamiento, en producción, etc).

A. Problema
¿Cual es la concentración óptima de 1%, 3% y 5% de nitrato de potasio para obtener
una mayor concentración de Capsaicina como metabolito secundario en un cultivo
celular del genero Capsicum annuum?

B. Objetivo General
Evaluar y determinar el efecto de concentración de nitrato de potasio a 1 %, 3 % y 5
%, en un cultivo celular líquido a partir de callos de Capsicum annuum (paprika) para
la obtención de capsaicina en un cultivo por lote.

C. Objetivo Específico
● Obtener plantas in vitro a partir de semillas de Capsicum annuum proveniente
del distrito de Cajay provincia de Huari.
● Inducir callos a partir de hojas de planta in vitro con hormona 2,4-D de 1 ppm.

● Realizar una suspensión celular a partir de los callos en medios con los
diferentes concentración de nitrato de potasio.
● Analizar la concentración de capsaicina en espectrofotometría.

●
D. Hipótesis
Se espera que la concentración de 3% de nitrato de potasio sea la óptima en la
obtención de Capsaicina en un medio de cultivo celular.

E. Diseño Experimental
➢ Serie Cronológica

C = cultivo celular
X = concentración (X1 = 1%, X2 = 3% y X3 = 5% de nitrato de potasio)
P = Producción de capsaicina

[] Dia 1 Dia 2 ... Dia12

CX1 1% P1 P2 ... P12

CX2 3% P1 P2 ... P12

CX3 5% P1 P2 ... P12

F. Material
 Material Biológico: semillas de Capsicum annuum del distrito de Cajay provincia de
Huari.

❖ Materiales
- Probeta
- Matraz
- Vaso precipitado
- Viales (frascos de penicilina)
- Mecheros
- Micropipetas
- Pinzas
- Bisturí
- Papel aluminio
- Fósforo
- Timer

❖ Reactivos
- Agar
- 2, 4 - D (diclorofenoxiacético )
- Nitrato de Potasio
- Sacarosa
- MS
- Alcohol
- Lejía

❖ Equipos
- Biorreactor
- Balanza analítica
- Cocina eléctrica
- Estufa
- Autoclave
- Cabina de flujo laminar

G. Métodos

❖ Esterilización de los materiales.

Antes de empezar el trabajo, se pondrá en autoclave los materiales de vidrio como pipetas,
placas petri, agua estéril, vasos precipitados y los medios a emplear. Las pinzas se forraran
con hojas bond y se esteriliza en horno a 80ºC por 15 minutos.

❖ Desinfección de la semillas de Capsicum

El fruto Capsicum annuum del distrito de Cajay provincia de Huari se lavará con agua corriente.
Luego se bañara en ron de quemar para eliminar posibles contaminantes externos. Se cortará
y sacara todas las semillas.

❖ Preparación de medio MS
En 100 ml de agua destilada se agregara 0.48 gr de medio MS, 3% de sacarosa y 1.5 gr de
agar en un matraz y se calentara hasta el primer hervor en una cocina. Después de enfriar, se
 vaciara el medio a viales y se cubrirá con papel aluminio. Se llevará a autoclavar el medio a
121ºC por 15 minutos. Finalmente se dejará enfriar.

❖ Siembra de la semillas de Capsicum

Colocar dentro de la cabina de flujo laminar las semillas, pinzas y los viales con el medio. En
cada vial agregar con la pinza dos semillas y volver a cerrar con la misma tapa de papel
aluminio. Se dejará germinar por 30 días.

❖ Preparación de medio para inducción de callos

En 100 ml de agua destilada agregar 0.48 gr de medio MS, 3% de sacarosa, 1 ppm de hormona
2,4-D y 1.5 gr de agar en un matraz y calentar hasta el primer hervor en una cocina. Autoclavar
el medio a 121ºC por 15 minutos. Dejar enfriar.

❖ Inducción de callos
De las plántulas provenientes de un medio MS excepto de hormonas serán cortadas en dos
partes. Con la pinza agregar las hojas cortadas y colocarlas en el medio MS con hormona 2,4-
D. Se mantendrán los viales en un ambiente sin luz por algunos días, hasta obtener la
formación de callos.

❖ Inducción de capsaicina
Los callos obtenidos se pesarán aproximadamente 0.4 gr y serán evaluados en un medio
líquido de MS, 3% de sacarosa y concentraciones de 1%, 3% y 5% en 100 ml de agua
destilada. Cada 24 horas se tomará una muestra para elaborar un curva de crecimiento de
obtención de capsaicina.
B.8.- Cuantificación de los extractos y determinación del contenido de capsaicinoides
Para la cuantificación de capsaicinoides expresados como capsaicina, se emplea una solución
patrón de capsaicina preparada de la siguiente forma: pesar 250 mg de capsaicina y diluir en
exactamente 25 mL de metanol. Leer la solución en el espectrofotómetro UV, empleando
blanco de disolvente, en un rango de 250 a 290 nm, con el fin de obtener el valor de máxima
absorbancia. Una vez obtenida la longitud de onda de máxima absorbancia, preparar
diluciones de capsaicina a las siguientes concentraciones: 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4 mg/mL las cuales
serán leídas en el espectrofotómetro a la longitud de onda de máxima absorbancia, con el fin
de obtener una curva de calibración. Preparar una dilución 1:1000 de los dos extractos
obtenidos (por Soxhlet y por lixiviación), tomar 5 mL de esta solución y determinar su
absorbancia en el espectrofotómetro UV, a la longitud de onda determinada previamente,
tomar como blanco metanol.

H. Cronograma

❏ Investigación II
❏ Investigación III
 “Año Del Diálogo y Reconciliación Nacional”

E.A.P: Biotecnología

CICLO: VIII

DOCENTE: Angel Castro Alvarado

CURSO: Investigación I

INTEGRANTES:

● Lizano Villanueva Carlos(A3)

● Moncada Chavez Alexis(A3)

Perú, Ancash 2018

Semana 10

1.Ver José Supo - Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos

https://www.youtube.com/watch?v=e-zOqfXN14Y. Realizar un resumen

Un instrumento de recolección de datos es en principio cualquier recurso de que

pueda valerse el investigador para acercarse a los fenómenos y extraer de ellos
información. De este modo el instrumento sintetiza en si toda la labor previa de la
investigación, resume los aportes del marco teórico al seleccionar datos que
corresponden a los indicadores y, por lo tanto a las variables o conceptos utilizados

Conjunto de mecanismos, medios y sistemas de dirigir, recolectar, conservar,

reelaborar y transmitir los datos sobre estos conceptos Fernando Castro Márquez
indica que las técnicas están referidas a la manera como se van a obtener los datos
y los instrumentos son los medios materiales, a través de los cuales se hace posible
la obtención y archivo de la información requerida para la investigación.
Resumiendo tenemos que los instrumentos son:

Cualquier recurso que recopile información referente a la investigación.

Es un mecanismo recopilador de datos.

Son elementos básicos que extraen la información de las fuentes consultadas.

Son los soportes que justifican y de alguna manera le dan validez a la investigación.

Como instrumentos de investigación son amplios y variados y van desde una simple
ficha hasta un compleja y sofisticada encuesta.

16. Población y muestra | Metodología de la investigación científica

https://www.youtube.com/watch?v=dOnHe83CF68. Realizar un resumen

Para la realización de una investigación científica es necesario tener en cuenta las

tecnicas de recoleccion de datos para ello se tiene que diferenciar entre técnicas e
instrumentos de recolección de datos . Una técnica es una forma para recolectar y el
instrumento es el medio para la recolección de datos . Así también además de la
recolección de datos podemos obtenerlos por medio de la medición .Se tiene que
tener en cuenta que existen cinco técnicas de recolección de datos pero se puede
utilizar una o más de ellas en la investigación , esto si la unidad de estudio es un
individuo , las cuales son la documentación, la entrevista, , la encuesta , la
observación y la psicometría.Sin embargo cuando la unidad de estudio es un objeto
las tecnicas de recoleccion de datos se dividen en técnicas de observación o
documentación , esto según el tipo de investigación .
2.Señale en su PTI de cada subgrupo que está elaborando contiene problema,
objetivo general, objetivo específico, hipótesis, diseño experimental, material y
métodos apropiados y cronograma detallado para investigación II y III (incluye
organismo usado. Técnicas de evaluación. reactivos, equipos presentes en la
UNS y por adquirir. Indicar microbio (aislado, identificación molecular, de
colección), medio de cultivo de aislamiento, en producción, etc)

Problema: ¿Cuál sería la concentración de Pseudomonas aeruginosa ( 104 ,106 , 108 ) en su

capacidad biodegradadora de n-alcanos en suelos contaminados por aceite residual de
lavadero automotriz.

Objetivo general: Evaluar diferentes concentraciones (104 ,106 ,108 ) de Pseudomonas

aeruginosa para la evaluación de la capacidad biodegradadora de n-alcanos en suelos
contaminados por aceite residual de lavadero automotriz.

Objetivos específicos
· Aislar e identificar bioquímicamente a la Pseudomonas sp.
· Evaluar la cinética de crecimiento de Pseudomonas sp, Utilizando la ecuación de monod.
·Evaluar la capacidad de biodegradación de n-alcanos utilizando diferentes
concentraciones de Pseudomonas sp en suelos contaminados por aceite residual de
lavadero automotriz.

Hipótesis: Se utilizará Pseudomonas sp a diferentes concentraciones(104 ,106 ,108 ) en la

muestra de suelo contaminado para verificar que concentración es la más óptima para
degradar n-alcanos en el aceite residual de lavadero automotriz.

Diseño Experimental :

Se realizará un diseño experimental de bloques al azar de 3 tratamientos y 3 repeticiones

Luego, se incubará a 35°C por 24 y 48 horas. Las colonias compatibles con pseudomonas
fueron resembradas en Agar Glutamato para diferenciar características de la especie, este
medio de cultivo se incubó a 42°C.

MATERIAL Y MÉTODOS:
 Materiales
• 1 Frascos de vidrio de 250ml
• 1 Kg de Suelo contaminado con aceite residual automotriz
• 1 Espátula
• 10 Bolsas
• 12 Placas Petri
• 1 Matraz de 500ml
• Probeta
• Pipeta
• Asa Bacteriológica
• 1 Lámina Portaobjeto
• 1 Rollo de Papel Aluminio
• Algodón

Reactivos
Agar Glutamato
● Glutamato sódico 10,00 g
● Almidón soluble 20,00 g
● Dihidrógenofosfato K 2,00 g
● Sulfato de Magnesio 0,50 g
● Rojo Fenol 0,36 g
● Agar‑ Agar 12,00 g
(Fórmula por litro) pH final: 7,2 ± 0,2

Agar Citrimida
Peptona de gelatina 20.0g
Cloruro de Magnesio 1.4g
Sulfato de Potasio 10.0g
Agar 13.6g
Cetrimida 0.3g
Glicerina 10ml
Agua Purificada 1000ml
(Fórmula por litro) pH final: 7,2 ± 0,2

•Tinción de Gram
Solución Safranina
Violeta de Cristal
Solución de Lugol

EQUIPOS
•Cromatografía de Gases
•Microscopio
•Autoclave
•Incubadora
•Cocina de Laboratorio
•Horno (Estufa)
•Cámara de Neubauer
•Mechero de Bunsen
Tubos mcfarland

Muestra
Pseudomona aeruginosa, Aislada de un lavadero de automóviles, Nuevo Chimbote-Santa, e
identificada en el laboratorio de investigación de la UNS

Colección de la muestra
Se obtuvo aceite residual automotriz (ARA). en un lavadero de automóviles en nuevo
Chimbote-Santa
Las muestras se colectaron en frascos de 250 ml estériles con tapón, se transportaron y
almacenaron en refrigeración.

Aislamiento de P. aeruginosa
Las tres muestras de aceite residual fueron homogeneizadas y sembradas en la superficie de
Agar Cetrimide, que es un medio selectivo para especies de pseudomonas; Luego, se incubó
a 35°C por 24 y 48 horas. Las colonias compatibles con pseudomonas fueron resembradas
en Agar Glutamato para diferenciar características de la especie, este medio de cultivo se
incubó a 42°C.

Preparación del inóculo

Se procedió a preparar una suspensión de P. aeruginosa en solución salina fisiológica y se
tomó como referencia al tubo Nº 3 del nefelómetro de Mcfarland (aproximadamente 9x
UFC/mL). Luego, se sembró por duplicado las diluciones(104 ,106 ,108 ) para estandarización
del inóculo.

Identificación de alcanos por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG /

EM)

Para analitos volátiles los límites de detección están por debajo de 1-5 µg L-1 para agua y 20
µg kg-1 para suelo. Para analitos semi volátil Manual de técnicas de análisis de suelos 113
es los límites de detección están por debajo de 5 µg L-1 para agua y 50 µg kg-1 para suelo.

Método
El método (US EPA 8270DC, 1996) es utilizado para determinar la concentración de
compuestos orgánicos semivolátiles en extractos preparados de muchos tipos de matrices
sólidas residuales, suelos, medios muestreados de aire y muestras de agua. Esta
metodología contiene los criterios para verificar el método global del desarrollo del sistema
de CG/EM.

Las muestras son preparadas para su análisis por CG/EM y si es necesario se realiza hasta
una limpieza de la muestra. El extracto de la muestra es introducido en el cromatógrafo de
gases/espectrómetro de masas por inyección del extracto de la muestra dentro del CG. La
columna del CG es programada a cierta temperatura para separar los analitos, los cuales son
entonces detectados con una interfase del EM al CG. Los analitos eluidos en la columna
capilar son introducidos en el EM. La identificación de los analitos es alcanzada por
comparación de su espectro de masas con el espectro de electrones de estándares o base
de datos disponibles.

Cronograma de Bioensayos
 Actividades Abril Mayo Junio Julio

Semana 3

Semana 4
Semana 3

Semana 2
Semana 2

Semana 3
Semana 4
Semana 3

Semana 2

Semana 1
Semana 1

Semana 2

Semana 4

Semana 1
Semana 1
Recolección del X
suelo contaminado
Preparación del X
suelo contaminado
para la extracción
del aceite residual
Cromatografía X
HPLC
Preparación de X
medios
Aislamiento de las X
bacterias
Siembra de la X
muestra en agar
cetrimide
Determinación de X
unidades
formadoras de
colonias : cámara
de Neubauer y
tinción Gram
Selección de la cepa X
bacteriana
Pseudomona
aeruginosa
Preparación de X X
tratamientos
Bioensayo en
botellas de vidrio
Aplicación de X X X X
tratamientos

Cromatografía
HPLC

Envío de la muestra X
al laboratorio :
Caracterización
molecular