Henry

Laboratorio
en el

Diagnostico
Clinico
Homenaje a Todd-Sanford & Davidsohn
John Bernard Henry, M.D.
Distinguised Service Professor
Director. Pathology 200 College of Medicine
Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program
Attending Pathologist, University Hospital
Siale University of New York
Upstate Medical University
Syracuse, New York

Frederick R. Davey, M.D. Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D.

Prolessor and Chair. Department ot Pathology.
State University ot New York Upstate Medical
University. Syracuse. New York
Chester J. Herman, M . D , Ph.D.
Professor ot Pathology, Emory University
School ol Medicine: Director. Pathology. Grady
Health System, Atlanta. Georgia
Richard A. McPherson, M.D.
Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot
Clinical Pathology. Department ot Pathology.
Medical College ot Virginia. Virginia
Commonwealth University; Director. Clinical
Pathology. Medical College ot Virginia
Hospitals, Richmond. Virginia
Prolessor ol Pathology. State University of New
York Downstate Medical Center; Chair.
Department ot Pathology and Laboratory
Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical
Center. Brooklyn. New York
Gregory A.Threatte, M.D.
Professor ot Pathology; Director ot Core
Laboratories and Outreach. Upstate Medical
University. Syracuse, New York
Gail L. Woods, M.D.
Prolessor ot Pathology; Director. Clinical
Microbiology. University of Texas Medical
Branch. Galveston. Texas
Contenido

Sección I. Patología clínica / Medicina de laboratorio

Gregory A. Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.

1. L a b o r a t o r i o clínico: o r g a n i z a c i ó n , objetivos y p r á c t i c a 3
John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec, M S.HIASCPI DiM.WiUam K Dcnwyler.M.7

2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m é d i c a ... 50
Gregory A. Threatte, M o

3. Principios de i n s t r u m e n t a c i ó n . . 60
Andy N.D. Nguyen. MSMÍ. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.

4. A u t o m a t i z a c i ó n d e l l a b o r a t o r i o clínico 79
Rodney S. Markin, /no, cft.O.

5. I n t e r p r e t a c i ó n de los resultados de l a b o r a t o r i o 92
Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. «i o.
6. I n f o r m á t i c a , t r a t a m i e n t o de i m á g e n e s e i n t e r o p e r a b i l i d a d 108
Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD

7. Estadística e x p e r i m e n t a l 138
Gregory A. Tetrault. M.D.

8. G a r a n t í a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clínico 148

Gregory A. Tetrault, M.D.

Sección II. Química clínica

Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.

9. Evaluación de la función r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r ó l i t o s ,
e q u i l i b r i o ácido-base y gases sanguíneos 159
D. Roben Dufour, M D

10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b ó l i c o s , ionesinorgánicos y m a r c a d o r e s b i o q u í m i c o s
del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o 180
Elena Níkolova Hrístova, M D, John Bernard Henry. M D

11. H i d r a t o s de c a r b o n o 21 I
Paul £. Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD

12. Lípidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a 224

Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . ¿van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP

13. P r o t e í n a s específicas 249

Richard A. McPherson. M o

14. E v a l u a c i ó n de la f u n c i ó n y el d a ñ o h e p á t i c o 264
D. Roben Dufour. M D

/5. E n z i m o l o g í a clínica 281

D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD

16. Evaluación de la f u n c i ó n e n d o c r i n a 304

Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o

17. Toxicología y m o n i t o r i z a c i ó n t e r a p é u t i c a de f á r m a c o s 335

Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.

•••
III
Sección III. Orina y otros fluidos
Gregory A. Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.

18. E x a m e n básico de la o r i n a 367

Christine £ Füller, Mí), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D

19. L í q u i d o c e f a l o r r a q u í d e o , sinovial y líquidos serosos del o r g a n i s m o 403

Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D

20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g í a y la e v a l u a c i ó n de la f e r t i l i d a d 425
Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D

21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologías de r e p r o d u c c i ó n asistida 432

AndréVan Steirteghem.MD.PhD.

22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de la gestación 446

Robert £ Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi.ü.

23. D i a g n ó s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s
gastrointestinales y pancreáticas 462
David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.

Frederick R. Davey, MD., John Bernard Henry, M.D.

24. E x a m e n básico de la sangre 479

Michael W. Morris. M S , DLMIASCPISH., Frederick R. Davey. M D

25. H e m a t o p o y e s i s 520
Frederick R. Davey. Mo, Robert £. Hutchison. MD
26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s 542
M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D
27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos 586
Robert £. Hutchíson, M D, Frederick R. Davey, M.D
28. P l a q u e t a s en sangre 623
Jonathan L Miller, MO.Ph.D.

29. C o a g u l a c i ó n , fibrinólisis e h i p e r c o a g u l a c i ó n . . 642

Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .
30. I n m u n o h e m a t o l o g í a 660
WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,¡ohn Bernard Henry, Mo
31. M e d i c i n a transfusional 718
Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO
32. H e m a f é r e s i s . . 776
Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D
33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y células m a d r e 806
Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISBÍ. John Bernard Henry, M D

Sección V. Inmunología e inmunopatología

Richard A. McPherson, M.D., John Bernard Henry, M.D.

34. V i s i ó n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o r n o s inmunológicos 817

Richard A. McPherson, M.D.
35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u í m i c a 821
Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M D

36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l u l a r 850
He/ene MA Paxton. M.S„MTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, гьв. Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc.РЛ.О.D/ABMUI

¡V
Contenido

37. E v a l u a c i ó n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b u l i n a s

y la i n m u n i d a d h u m o r a l 878
Richard A. McPherson, MD
38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i ó n 892
Ene Wagner, pt¡o. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD
39. C i t o c i n a s y m o l é c u l a s de a d h e s i ó n 914
H Dons Massey, MD. FI¡ D. DO S . Richard A. McPherson, M D
40. A n t í g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o r
de histocompatibilidad del h o m b r e 927
Armead H. Johnson. «iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,¡udnh A.Wade. 8 k
41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e r m e d a d 949
julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD
42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s 963
Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.
43. Evaluación clínica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s
r e u m á t i c a s sistémicas 974
Carlos Alberto Yon Múhlen, MO.F*D.. Roben M. Nakamura. M O

44. Vasculitis 990

Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.

45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecíficas 1000

David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D

46. E n f e r m e d a d e s alérgicas 1016

Henry A. Homburger.MD.
47. D i a g n ó s t i c o y m a n e j o d e l c á n c e r m e d i a n t e m a r c a d o r e s
t u m o r a l e s serológicos 1028
Jomes T.Wu. rto

Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD

48. Infecciones víricas 1045

Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD
49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsías y m i c o p l a s m a s 1072
Gail L Woods, « D . David H. Walker, MD
50. B a c t e r i o l o g í a m é d i c a 1088
barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O
51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s 1119
Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo
52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s 1131
Michael 8. Sm;(íi, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D
53. M i c o b a c t e r i a s 1144
Gail L Woods. MD
54. E n f e r m e d a d e s m i c ó t i c a s 1158
Washington C.Wmn.jr, MD.MRA, Fred W.Westenfeld. MIIASCPISM

55. P a r a s i t o l o g í a m é d i c a 1196
Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,¡ames W. Smith, MD.
56. P a t o l o g í a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas 1241
Martín G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D

57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnóstico
de las e n f e r m e d a d e s infecciosas 1254
Gail L. Woods, MD

V
Contenido

Chester, J. Hermán. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.

58. I n t r o d u c c i ó n a la p a t o l o g í a m o l e c u l a r 1273
Chester / Hermán. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D

59. Diagnósticos m o l e c u l a r e s : técnicas y principios básicos 1275

Ehzabelli R. Unger. PIo. MD, Margaret A. Piper. PhD.MP.H.

60. R e a c c i ó n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologías de amplificación 1287

james C. Zimring, MD. PI¡D. Frederick S. No/te, n¡o.

61. Tecnologías de la h i b r i d a c i ó n en serie 1296

jacques Scnrenzet. Mo Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.

62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n é t i c a en la p a t o l o g í a m o d e r n a 1304
Constance K. Stein, PhD.

63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnóstico m o l e c u l a r 1333

Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coríeton T. Garren, MD..PÍI.D.

64. O n c o p r o t e í n a s y d e t e c c i ó n t u m o r a l p r e c o z . 1344
Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.

65. T é c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnóstico de neoplasias h e m a t o p o y é t i c a s 1355

David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD

66. D i a g n ó s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genéticas 1372

Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.

67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m o r f i s m o
y o t r o s m a r c a d o r e s genéticos 1390
Herbert F. Polesky, M D.

68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e análisis d e l A D N 1402

Víctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H

1. Soluciones fisiológicas, t a m p o n e s , indicadores ácido-base,

m a t e r i a l e s de r e f e r e n c i a e s t á n d a r y t a b l a de conversión de t e m p e r a t u r a s 1417
2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l e índice de m a s a c o r p o r a l ( I M C ) 1420
3 . C á l c u l o a p r o x i m a d o d e l v o l u m e n sanguíneo t o t a l ( V S T ) 1424
4. Tabla p e r i ó d i c a de los e l e m e n t o s .. 1425
5 . U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a l ( S I ) ... 1426
H. Peter Lehmann. Pít 0, jolin Bernard Henry, MD

VI
 Autores
Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D.
Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center;
Assistant Professor. State University of New York
Upstate Medical University, Syracuse. New York
R a y m o n d D. Aller, M.D.
Clinical Professor. Department of Pathology and
Laboratory Medicine. Emory University School of
Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical
Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services
(United States). Nashville. Tennessee
W i l l i a m A p p r u z z e s e , Ph.D.
Staff Member and Clinical Assistant Professor.
Department of Environmental Sciences. Columbia
College of Physicians and Surgeons.
New York. New York
Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D.
General Manager. Research Laboratories. Fujirebio
Incorporated. Tokyo. Japan
Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D.
Professor (retired). The Johns Hopkins University
School of Medicine. Baltimore. Maryland
Ulysses J . Balis, M O
Instructor in Pathology. Harvard Medical School and
Massachusetts General Hospital.
Boston. Massachusetts
W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B
Assistant Professor. Department of Clinical Laboratory
Science, State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse, New York
M i r i a m Blitzer, Ph.D.
Professor and Chief, Division of Human Genetics.
Department of Pediatrics. University of Maryland,
Baltimore. Maryland
L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A.
Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine
and Pathology, University of Medicine and Dentistry of
New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore
Medical Center, Neptune. New Jersey
Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.D., D.P.H.
Professor. Department of Environmental Sciences.
Columbia College of Physicians and Surgeons,
New York, New York
D a v i d J . B y l u n d , M.D.
Laboratory Director. Scripps Reference Laboratory.
San Diego. California
Laura C o o l i n g , M . D . M.SC.
Assistant Professor. Department of Pathology.
University of Michigan Medical School; Assistant
Director, Blood Bank and Transfusion Medicine,
University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan
vii
M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D.
Professor of Bacteriology (Medical Microbiology).
Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit,
National University of Ireland, Galway; Consultant
Microbiologist. University College Hospital Galway.
Galway. Ireland
M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D.
Technical Director. Advocate Shared Services
Laboratory. Park Ridge, Illinois
C h a r l o t t e C u n n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D.
Professor, Departments of Medicine. Pediatrics, and
Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine.
New York. New York
S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D.
Professor of Immunology: Vice. Chair of Academic
Affairs, Department of Pediatrics; Director. The
Immunology Research Laboratory, Weill Medical
College of Cornell University, New York. New York
F r e d e r i c k R. Davey, M.D.
Professor and Chair, Department of Pathology. State
University of New York Upstate Medical University.
Syracuse. New York
J u l i o C. D e l g a d o , M.D.
Instructor. Department of Pathology. Harvard Medical
School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory.
Dana-Farber Cancer Institute, Boston. Massachusetts
M a r g o A . D e n k e , M.D.
Associate Professor. University of Texas Southwestern
Medical Center. Dallas. Texas
W i l l i a m K. D e t t w y l e r , M.T.
Senior Consultant. Health Systems Concepts.
Incorporated. Longwood. Florida
D. R o b e r t D u f o u r , M.D.
Professor of Pathology. George Washington University
Medical Center, Washington. DC; Clinical Professor of
Pathology. Uniformed Services University of the Health
Sciences. Bethesda. Maryland; Chief. Pathology and
Laboratory Medicine Service. Veterans Affairs Medical
Center. Washington. DC.
M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D
Associate Professor and Vice Chairman. Department of
Pathology. University of Texas Medical Branch,
Galveston. Texas
A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z , Ph.D.
Associate Professor. Medical College of Virginia.
Virginia Commonwealth University; Technical Director
of Molecular Diagnostics. Medical College of Virginia
Hospitals, Virginia Commonwealth. University.
Richmond. Virginia
M i c h a e l M. F r a n k , M.D.
Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics,
and Professor of Immunology and Medicine, Duke
University Medical Center, Durham. North Carolina
T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D.
Associate Professor, Department of Laboratory
Medicine, University of Washington; Head, Clinical
Microbiology Division. University of Washington
Medical Center. Seattle. Washington
C h r i s t i n e E. Fuller, M D .
Fellow, Department of Pathology, Washington
University School of Medicine; Fellow. Department of
Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri
C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D., Ph.D.
Professor of Pathology, Medical College of Virginia,
Virginia Commonwealth University; Medical Director,
Molecular Diagnostics Laboratory, Department of
Pathology, Medical College of Virginia Hospitals,
Richmond. Virginia
W a y n e W . G r o d y , M.D., P h . D
Professor. Divisions of Molecular Pathology and
Medical Genetics, Departments of Pathology and
Laboratory Medicine and Pediatrics, UCLA School of
Medicine: Director, Diagnostic Molecular Pathology
Laboratory, UCLA Medical Center,
Los Angeles, California
R o b e r t J . H a r t z m a n , C A P T , M C , U S N , M.D.
Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment
Program and Research Program, Naval Medical and
Research Insitute, Bethesda. Maryland
R a n d a l l T. H a y d e n , M.D.
Director. Clinical Microbiology, St. Jude Children's
Research Hospital. Memphis, Tennessee
D a v i d G. H e i s i g , M.D.
Associate Professor of Medicine. Department of
Medicine, State Universit of New York Upstate Medical
University Syracuse. New York
J o h n B e r n a r d H e n r y , M.D.
Director, Pathology 200, College of Medicine;
Distinguished Service Professor; Director, Transfusion
Medicine & Transfusion Medicine Fellowship;
Hemapheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage
Testing Laboratories; Attending Pathologist, University
C a r l R. K j e l d s b e r g , M.D.
Hospital. State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse, New York
C h e s t e r J. H e r m a n , M.D.. Ph.D.
Professor of Pathology, Emory University School of
Medicine; Director. Pathology, Grady Health System,
Atlanta. Georgia
viii
J o n a t h a n R. H i b b s , M.D.
Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center.
New York State Department of Health. David Axelrod
Institute, Albany, New York
H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D.
Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical
School and Mayo Graduate School of Medicine.
Rochester, Minnesota
J o a n H . H o w a n i t z , M.D.
Vice Chair, Department of Pathology. State University
of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings
County Hospital Center, Brooklyn. New York
E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D.
Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State
University of New York Upstate Medical University,
Syracuse. New York
C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S„ MT<ASCP)SBB
Adjunct Assistant Professor, Clinical Laboratory
Science, College of Health Professions; Supervisor,
Histocompatibility, Immunogenetics and Progenitor Cell
Bank, State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse, New York
C a r o l y n K a t o v i c h H u r l e y , Ph.D.
Professor. Department of Microbiology. Georgetown
University Medical Center. Washington. DC
R o b e r t E. H u t c h i s o n , M.D.
Professor of Pathology. Director of Clinical Pathology,
and Director of Hematopathology, State University of
New York Upstate Medical University.
Syracuse, New York
H a i x i a n g J i a n g , M . D , Ph.D.
Assistant Research Professor. Department of
Pediatrics. Duke University Medical Center, Durham,
North Carolina
A r m e a d H. J o h n s o n , Ph.D.
Professor, Department of Pediatrics, Georgetown
University Medical School, Washington. DC
Y a s u s h i K a s a h a r a , Ph.D., D.M.SC
Visiting Professor. Kyorin University School of Public
Health: Research Fellow. Keio University of Medicine.
Tokyo, Japan
Professor and Chair. Department of Pathology,
University of Utah: University Hospital (Laboratory
Services) Chairman and Pediatric Pathology
(Laboratory Services) Chairman. University of Utah
Hospital and Primary Children s Medical Center.
Salt Lake City, Utah
 Autores

Paul E. K n u d s o n , M.D. R i c h a r d A . M c P h e r s o n , M.D.

Associate Professor of Medicine, Division of Professor of Pathology; Chair. Division of Clinical
Endocrinology. Diabetes and Metabolism: Joslin Pathology, Department of Pathology. Medical College
Diabetes Center. State University of New York Upstate of Virginia. Virginia Commonwealth University; Director.
Medical University. Syracuse, New York Clinical Pathology. Medical College of Virginia
Hospitals. Richmond. Virginia
W i l l i a m K o s l o s k y , M.D.
Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center. J o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D.
Brooklyn. New York Professor of Pathology; Director of Academic Aftairs.
A n t h o n y S. K u r e c , M.S., H ( A S C P ) D L M Department of Pathology: Director of Special
Clinical Associate Professor. Department of Clinical Hematology Laboratory. University Hospital, State
Laboratory Science, College of Health Professions: University of New York Upstate Medical University.
Administrator for Pathology Marketing and University Syracuse, New York
Pathologists Laboratories, State University of New York
M i c h a e l W. M o r r i s , M.S.. D L M I A S C P I S H
Upstate Medical University. Syracuse. New York
Professor. Department of Clinical Laboratory Science;
M i c h a e l L a p o s a t a , M.D.. Ph.D. Manager. Department of Pathology. University Hospital.
Professor. Department of Pathology: Director of Clinical State University of New York Upstate Medical
Laboratories. Harvard Medical School. University, Syracuse. New York
Boston, Massachusetts
R o b e r t M . N a k a m u r a , M.D.
R i c h a r d S. L a r s o n , M.D.. Ph.D. Professor. Departments of Immunology and
Assistant Professor, Department of Pathology, Experimental and Molecular Medicine. The Scripps
University of New Mexico School of Medicine;
Research Institute: Senior Consultant and Chairman
Laboratory Director, University Hospital Rapid
Emeritus, Department of Pathology. Scripps Clinic and
Response Laboratories. University Hospital.
Research Foundation. La Jolla. California
Albuquerque. New Mexico
A n d y N.D. N g u y e n , M S M E , M.D.
H. Peter L e h m a n n , Ph.D.
Associate Professor. Department of Pathology.
Professor Emeritus. Department of Pathology.
University of Texas Medical School at Houston;
Louisiana State University Medical Center.
New Orleans. Louisiana Director. Hematology Laboratory and Chemistry
Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director.
J o h n A. Lott, Ph.D. Coagulation Laboratory. Memorial Hermann Hospital.
Professor. Department of Pathology, The Ohio State Houston, Texas
University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio
State University Hospitals, Columbus. Ohio W a l t e r W . N o l l , M.D
Professor of Pathology. Dartmouth Medical School.
R o d n e y S. M a r k i n , M . D . Ph.D.
Hanover. New Hampshire; Director. Clinical Chemistry
Professor and Vice Chair, Department of Pathology
and Molecular Genetics Diagnostic Laboratories,
and Microbiology: Associate Dean for Clinical Aftairs.
Dartmouth-Hitchcock Medical Center,
College of Medicine, University of Nebraska Medical
Lebanon. New Hampshire
Center. Omaha. Nebraska
F r e d e r i c k S. N o l t e , Ph.D.
H. D a v i s M a s s e y , M . D , Ph.D., D.D.S.
Associate Professor. Pathology and Laboratory
Chief Resident in Pathology. Medical College of
Virginia, Virginia Commonwealth University, Medicine, Emory University School of Medicine;
Richmond, Virginia Laboratory Director, Clinical Microbiology and
Molecular Diagnostic Laboratories. Emory Medical
Rex M. M c C a l l u m , M.D. Laboratories, Atlanta. Georgia
Associate Clinical Professor of Medicine. Division of
Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke M a u r i c e R . G . O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi)
University School of Medicine; Vice Chair for Clinical Associate Professor-Pediatrics. Northwestern
Services. Department of Medicine. Duke University University Medical School; Director. Diagnostic
School of Medicine and Hospital. Durham. Immunology and Flow Cytometry Laboratories. The
North Carolina Children's Memorial Hospital. Chicago. Illinois

ix
 Autores
H e l e n e M.A. P a x t o n , M.S., M T I A S C P )
Vice President of Manufacturing. Regulatory Affairs
and Research and Development, PanBio InDx,
Incorporated. Baltimore. Maryland
D a v i d H. P e r s i n g , M.D.. Ph.D.
Medical Director. Infectious Disease Research Institute;
Vice President, Diagnostics Research. Corixa
Corporation, Seattle. Washington
M i c h a e l A. Pfaller, M.D.
Professor. Department of Pathology; Director,
Molecular Epidemiology and Fungus Testing
Laboratory, University of Iowa College of Medicine.
Iowa City, Iowa
M a t t h e w R. P i n c u s , M . D , Ph.D.
Professor of Pathology. State University of New York
Downstate Medical Center; Chair. Department of
Pathology and Laboratory Medicine, Harbor Veterans
Affairs Medical Center. Brooklyn. New York
A l v a r o A . P i n e d a , M.D.
Professor of Laboratory Medicine and Director of
Transfusion Medicine Fellowship Program. Mayo
Medical School and Mayo Graduate School of
Medicine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo
Clinic. Rochester. Minnesota
M a r g a r e t A. Piper, Ph.D.. M . R H .
Senior Consultant. Technology Evaluation Center.
BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois
H e r b e r t F. Polesky, M.D.
Professor (retired), Department of Laboratory Medicine
and Pathology, University of Minnesota School of
Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Director,
Memorial Blood Centers of Minnesota,
Minneapolis, Minnesota
B a r b a r a S. R e i s n e r , Ph.D.
Assistant Professor, Department of Pathology:
Associate Director. Clinical Microbiology Laboratory,
University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas
Basil M. R i f k i n d , M.D., F.R.C.P.
Special Assistant for Clinical Studies, National Institutes
of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute.
Division of Heart and Vascular Diseases,
Bethesda. Maryland
R h o n d a K. Roby, M . R H
Senior Forensic Specialist, Human Identification,
Applied Biosystems. Foster City, California
x
S i d d h a r t h a Sarkar, Ph.D.
Clinical Professor, Department of Pathology: Director.
Andrology Service. University Hospital, State University
of New York Upstate Medical University.
Syracuse, New York
Jacques Schrenzel, M.D
Assistant Professor. Geneva University Medical School:
Consultant. Division of Infectious Diseases, Geneva
University Hospital. Geneva, Switzerland
G r e g o r y P. S m i t h , M.D.
Assistant Clinical Professor. Department of Pathology.
University of Utah; Staff Pathologist, Department of
Pathology. St. Mark's Hospital. Salt Lake City. Utah
J a m e s W . S m i t h , M.D.
Professor Emeritus. Department of Pathology and
Laboratory Medicine, Indiana University School of
Medicine, Indianapolis, Indiana
M i c h a e l B. S m i t h , M.D.
Assistant Professor; Associate Director, Clinical
Microbiology and Laboratory Information System.
University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas
C o n s t a n c e K. S t e i n , Ph.D.
Associate Professor of Pathology and Pediatrics;
Director of Cytogenetics and Associate Director of
Molecular Diagnostics. University Hospital. State
University of New York Upstate Medical University,
Syracuse, New York
E v a n A . S t e i n , M . D , Ph.D.. F.C.A.P
Voluntary Professor. Pathology and Laboratory
Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio:
President and Chief Executive Officer, Medical
Research Laboratories, Highland Heights, Kentucky
R o b e r t L. S u n h e i m e r , M.S., M T ( A S C P ) S C
Associate Professor in Clinical Laboratory Science.
State University of New York Upsate Medical University,
Syracuse, New York
G r e g o r y A. Tetrault, M.D.
Medical Director, Shared Laboratory Services. L.C..
Chesapeake, Virginia
G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D.
Professor of Pathology; Director of Core Laboratories
and Outreach, Upstate Medical University,
Syracuse, New York
E l i z a b e t h R. U n g e r , Ph.D., M.D.
Acting Chief, Human Papillomavirus Section. Centers
for Disease Control and Prevention; Clinical Associate
Professor, Department of Pathology and Laboratory
Medicine, Emory University School of Medicine.
Atlanta. Georgia
 Autores
E l i z a b e t h M . V a n C o t t , M.D.
Director, Coagulation Laboratory, Massachusetts
General Hospital, Harvard Medical School.
Boston. Massachusetts
A n d r e V a n S t e i r t e g h e m , M.D.. Ph.D.
Full Professor, Medical School; Scientific and
Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine,
Medical School and University Hospital, Dutch-
Speaking Brussels Free University.
Brussels. Belgium
D a v i d S . V i s w a n a t h a , M.D
Assistant Professor. Department of Pathology,
University of New Mexico School of Medicine; Staff
Hematopathologist. University of New Mexico Health
Sciences Center. Albuquerque. New Mexico
C a r l o s A l b e r t o Von M i i h l e n , M.D.. Ph.D.
Full Professor of Rheumatology and Internal Medicine,
Pontifical Catholic University School of Medicine,
Porto Alegre, RS, Brazil
J u d i t h A. W a d e , B Sc.
Professor, Department of Surgery, and Faculty of
Medicine, University of Toronto; Formerly Head,
Histocompatibility Laboratory, Toronto Hospital
University Health Network, Toronto.
Ontario. Canada
Eric W a g n e r , Ph.D.
Immunologist, Ste-Justine Hospital, Montreal.
Quebec, Canada
D a v i d H. W a l k e r , M.D.
Professor and Chairman. Department of Pathology;
Director, World Health Organization Center for Tropical
Diseases. University of Texas Medical Branch.
Galveston, Texas
Victor W . W e e d n , M . D , J.D.
Principal Research Scientist and Director of
Biotechnology and Health Initiatives, Carnegie Mellon
University, Pittsburgh. Pennsylvania
R u t h S. W e i n s t o c k , M . D , Ph.D.
Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes
and Metabolism; Medical Director. Joslin Diabetes
Center. State University of New York Upstate Medical
University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs
Medical Center, Syracuse, New York
E d u a r d o D e l a f l o r W e i s s , M.D.
Attending Pathologist and Director, Transfusion Service,
Monmouth Medical Center, Long Branch, New Jersey
R o b e r t E. W e n k , M.D.. M.S.
Clinical Professor of Pathology. Pennsylvania State
University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate
Professor of Human Genetics, University of Maryland;
Attending Pathologist, Division Head of Clinical
Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland
F r e d W. W e s t e n f e l d , M T ( A S C P > S M
Clinical Faculty. University oí Vermont: Microbiology
Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health
Care. Burlington. Vermont
D a v i d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D.
Professor and Chairman, Department of Pathology;
Professor of Health Administration. Medical College of
Virginia Campus. Virginia Commonwealth University.
Richmond, Virginia
W a s h i n g t o n C . W i n n , Jr., M . D , M.B.A.
Professor of Pathology. University of Vermont College
of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory,
Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont
J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D.
Assistant Professor. Department of Pathology and
Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood
Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center:
Associate Medical Director. Central Kentucky Blood
Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive
Division of the Veterans Affairs Medical Center,
Lexington, Kentucky Hemapheresis
Gail L. W o o d s , M.D.
Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology,
University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas
J a m e s T . W u , PhD
Professor of Pathology, University of Utah Health
Science Center; Director of Special Chemistry
Laboratory. Associate Regional University Pathologists
(ARUP). Salt Lake City. Utah
M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D.
Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern
University Medical School. Chicago: Staff Pathologist,
St. Francis Hospital. Evanston, Illinois
E d m o n d J . Y u n i s , M.D.
Professor, Department of Pathology. Harvard Medical
School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer
Institute. Boston. Massachusetts
J a m e s C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D.
Pathology Resident, Department of Pathology and
Laboratory Medicine, Emory University.
Atlanta. Georgia
 CAPÍTULO 33 • A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E 811

de la sangre periférica tanto de pacientes como de donantes normales e
incluso de placenta o sangre de cordón.
Células madre de sangre periférica
El impulso para el desarrollo de tecnologías que permitieran la recogida
de CMH de sangre pentérica fue su uso potencial para trasplante autólogo,
en que el riesgo de contaminación de la médula con células tumorales es
alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de médula ósea por hemafé-
resis, las células madre obtenidas de sangre periférica se usan de forma
creciente en el entorno alogénico. Un área de gran importancia puede ser
la donación de no familiares o voluntarios, en la que más individuos pueden
prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donación
pudiera realizar en el mismo día y que determinara el número de muestras de
hemaféresis necesarias. El método más aceptado para valorar las muestras
de células madre de sangre periférica es la cuantificación del número de célu-
las con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuen-
tra limitado a las células primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La reco-
gida de productos de hemaféresis utilizando el recuento de células CD34-
como índice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hemato-
poyético (Berenson. 1991). La estandarización de la valoración de las células
CD34 y la disponibilidad de los análisis de citometria de flujo han ocasionado
que la medida de las células CD34+ se utilice por la mayor parte de los pro-
gramas para determinar el número y adecuación de las muestras de células
madre de sangre periférica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras
f

de médula cuando la hemaféresis se ofrece como opción frente a la recogi-
da tradicional de médula ósea. El procedimiento e instrumentación utiliza-
dos para la recogida de células madre de sangre periférica se describen el
Capitulo 32.
De forma clara, la mayor ventaja de las células madre obtenidas de sangre
periférica frente a la médula ósea es el tiempo de injerto de neutrófilos y pla-
quetas, con una media de 8 a 12 días para las células madre de sangre peri-
férica frente a las dos a cuatro semanas de la médula ósea (Gianm, 1989).
Esta rápida recuperación claramente reduce la morbimortalidad asociada por
neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia
hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y demás.
Se sabía que las CMH estaban presentes en sangre periférica tras la recu-
peración de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el
desarrollo de sistemas de hemaféresis que permitieran una recogida segura
de un adecuado número de estas células para proporcionar el injerto al
receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de
pacientes para trasplante autólogo. se ha establecido actualmente la recogi-
da de un gran volumen de aféresis I14-201/ procedimiento) como un proce-
dimiento eficaz para recoger un número adecuado de CMH en un razonable
número de procedimientos para proporcionar una recuperación hematopo-
yética adecuada.
Las CMH son morfológicamente indistinguibles de otras células mononu-
cleares de la médula ósea o sangre periférica, por lo que resulta esencial la
recogida de un número adecuado de células para asegurar el injerto medular
en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de
médula ósea perseguía obtener un número suficiente de células nucleadas
que permitiera asegurar un número mínimo de células madre. Los injertos de
médula ósea pueden también ser evaluados para la actividad de células
madre mediante el uso de técnicas de unidades formadoras de colonias
(UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de células mononucleares del injerto se
cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimien-
to hematopoyéticos y aminoácidos esenciales durante 10 a 14 días. Al final
de este periodo, se examinan las placas buscando el número y característi-
cas de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblásticas
(BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Uni-
dades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y
megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen más de 50
: trasplante autogénico.
células se valoran como una colonia. Las muestras con más de 1 x 10 UFC
por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la reco-
gida de células madre evolucionó hacia el uso de procedimientos de hemafé-
resis de sangre periférica, se hizo necesario desarrollar un método que se
de células madre de sangre periférica con mas de 3 x 10 células CD34+ por
kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir
el injerto de neutrófilos entre 8 y 10 días.
La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requeriría
múltiples procedimientos de recogida y aféresis, dado que el número de
CMH en sangre periférica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del número de
células en la médula. En consecuencia, se requieren terapias de "movili-
zación" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficien-
cia de la recogida por hemaféresis. Richman (1976) descubrió que mien-
tras hay una caída en el número de células CD34+ circulantes después de
la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el
porcentaje de células CD34+ a medida que el recuento absoluto de neu-
trófilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 14 y 21 días después
de la terapia. Este aumento en células CD34+ circulantes es mayor con
agentes quimioterápicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por
hemaféresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar gran-
des números de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso
aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el
periodo de aumento de células CD34+ circulante es breve (dos a tres
días), son críticos un estrecho control del recuento de leucocitos y células
CD34+ circulantes del paciente, así como el control de los tiempos de reco-
gida por hemaféresis. Además, algunos investigadores han señalado que
la recogida de CMH en la fase de recuperación tras quimioterapia reduce
la probabilidad de contaminación por células tumorales en el producto de
aféresis. El uso de factores de crecimiento hematopoyético como el Factor
Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrófago (GM-CSF) y el Factor
Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un
aumento significativo en el número de células CD34+ en sangre periférica
(Siena, 1989). Dosis de 5 a 10 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 días
causan un aumento de 5 a 10 veces en el número de CMH en sangre peri-
férica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser más eficiente que el ceba-
do con quimioterapia para la recogida de células CD34*. La combinación
de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en espe-
cial G-CSF) provoca la máxima movilización de células madre pluripoten-
ciales en sangre periférica, así como la necesidad de menor número de
procedimientos de hemaféresis para recoger una dosis de CMH para tras-
plante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de
Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alogénico sano para
movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor óseo y cefalea, resulta bien
tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes

Tabla 33-6 Comparación de las tuentes y productos de células madre hematopoyéticas. Lugar de recogida y complicaciones
Autólogas Alogénicas
Sangre de cordón (CMSC) (CMMO + CMSP) (CMMO + CMSP)
Tipo de donante Sangre de cordón umbilical Paciente Donante compatible familiar o no
Producto Célula madre de sangre de cordón Médula ósea o CMSP Médula ósea o CMSP
Lugar de recogida Cordón umbilical de placenta Médula intraoperatona o Médula intraoperatona o hemaféresis
en el nacimiento hemaféresis
Complicación principal Insuficiencia de células madre Recurrencia de la enfermedad Enfermedad injerto contra huésped
original
CMSP= células madre en sangre periférica; CMMO= células madre en medula Osea; CMSC= c é l u l a s madre en sangre d e cofdon
 812 S E C C I Ó N IV • H E M A T O L O G Í A , C O A G U L A C I Ó N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL
están utilizando sangre periférica como fuente de CMH en lugar de médula
ósea, tanto para trasplantes alogénicos como autogénicos.
Sangre de cordón umbilical
Durante muchos años, se sabía que gran cantidad de unidades formado-
ras de colonias o células madre estaban presentes en la sangre del cordón
umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos
para utilizar células recuperadas de cordón umbilical de placenta para el
trasplante hematopoyético (Gluckman. 1989). El éxito aparente de muchos
de estos trasplantes precoces de sangre de cordón ha dado lugar a la orga-
nización de diferentes bancos de células de cordón en EE.UU. y en Europa
en un intento por proporcionar otra fuente de células madre para los pacien-
tes que necesitan un trasplante alogénico. Además, como las células madre
se obtienen de sangre del cordón, parece haber un mayor grado de toleran-
cia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin
que aparezcan los grados 3 ó 4 de la GVH. Como consecuencia, el tras-
plante podría estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no
tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las células madre de cordón
umbilical se obtienen por canulación de los vasos placentarios, con la pla-
centa todavía in útero o más frecuentemente, después del parto o por expre-
sión directa de la sangre del cordón de la placenta después del mismo. El
número de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de
sangre de cordón recogido, lo que depende del tamaño del niño/placenta y
también de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992).
Volúmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto
6
permitirá obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 10 células
nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (<40 mi) se suelen des-
cartar. Generalmente, las muestras de sangre de cordón umbilical no se pro-
cesan para reducir el volumen, congelándose directamente en DMSO y
almacenándose en nitrógeno líquido. Los trabajadores de banco con entre-
namiento específico no sufren distracción por el cuidado de la madre y/o el
niño en la sala de partos, y reducen el riesgo de contaminación bacteriana
de la sangre del cordón.
Una cuidadosa selección de la historia médica y pruebas a la madre son
esenciales para asegurar la calidad del producto de sangre de cordón, asi
como la ausencia de enfermedad genética. Además de las pruebas de labo-
ratorio habituales para enfermedades de transmisión serológica, se realizan
más pruebas para enfermedades bacterianas y víricas.
Mientras el almacenamiento de la sangre de cordón umbilical resulta una
alternativa para grados menores de histocompatibilidad y. en consecuencia,
una oferta real para un mayor número de pacientes, presenta como limitación
la necesidad de aumentar el número de CMH adecuadas para receptores de
mayor tamaño, asi como la de optimizar los costes de inicio y mantenimiento
de bancos de células de cordón.
Depuración
Una vez recogidas las células madre hematopoyéticas. bien de médula
o de sangre periférica, a menudo resulta ventajoso realizar un procesado
ulterior de las CMH recogidas con el objeto de reducir una posible conta-
minación por células tumorales o, en los trasplantes alogénicos. reducir el
número de células T CD3+. Se han realizado dos aproximaciones no exclu-
yentes entre sí. La primera desarrolla técnicas que persiguen eliminar las
células tumorales, también llamadas técnicas de depuración o selección
negativa. La segunda utiliza métodos para separar y recoger tan sólo las
células madre hematopoyéticas CD34-. descartando la fracción celular
restante que. presumiblemente, contiene células tumorales contaminantes:
estos métodos se denominan habitualmente técnicas de selección positiva
(Tabla 33-7).
Las técnicas originales de depuración empleaban una variedad de méto-
dos específicos e inespecílicos para eliminar la población celular no desea-
da En aquella época se utilizaban fármacos citotóxicos como la 4-hidroxi-
peroxiciclofosfamida (4-HC) y etopisida (VP-16) para eliminar las células
tumorales contaminantes (Yeager, 1986). Estos métodos son los equivalen-
tes in vitro de altas dosis de quimioterapia, por lo que el mayor efecto nega-
tivo es el daño a las CMH. Otras técnicas incluyen el uso de lectinas y/o for-
mación de rosetas para eliminar poblaciones celulares no deseadas, en
especial las células T. En fecha reciente se han utilizado anticuerpos mono-
clonales dirigidos a un receptor específico de célula junto con complemen-
to o ligadas con inmunotoxmas como el ricino para producir una lisis de la
población de células tumorales contaminantes. Ademas, con la llegada de
la tecnología de esferas inmunomagnéticas (immunomagnetic bead techno-
logy). los anticuerpos monoclonales se pueden ligar a una de estas esteras.
El complejo anticuerpo-esfera-célula tumoral se elimina al pasar la suspen-
sión celular por un campo magnético donde la población de células no
deseadas quedará retenida y las CMH son eluidas y recogidas.
Las técnicas de selección positiva se dirigen a la presencia selectiva del
marcador CD34 en las células madre hematopoyéticas y la disponibilidad de
anticuerpos monoclonales dirigidos al mismo. Mientras la tecnología original
utilizaba una columna a la que se ligaban anticuerpos monoclonales. en el
momento actual se utilizan técnicas de esferas inmunomagnéticas. La frac-
ción de células mononucleares obtenidas bien de la médula ósea, bien por
hemaféresis de células madre, se incuba con el monoclonal anti-CD34 u
otros monoclonales de interés. Se añade una suspensión de esferas inmu-
nomagnéticas marcadas con un segundo anticuerpo. Este último se liga al
monoclonal anti-CD34 creando un complejo esfera-célula diana marcado.
Cuando la suspensión celular se somete a un campo magnético, el com-
plejo célula CD34»-esfera magnética quedará retenido y la suspensión de
células mononucleares que contiene tanto células tumorales no deseadas
como células T CD3+ será desechada. Las células madre CD34+ son
entonces liberadas de las esferas magnéticas mediante un agente liberador
y las esferas se eliminan mediante un nuevo campo magnético, dejando una
suspensión celular que contiene aproximadamente un 90% de células
CD34-. La reducción del numero total de células T CD3+ llega hasta una
reducción de 3.5 log,,. La mediana de recuperación para las células CD34+
es de aproximadamente el 50% de la cantidad inicial de células CD34+ pre-
sentes en el producto obtenido por hemaféresis. Aunque todavia está per-
mitido el uso para la selección positiva de células CD34+. esta tecnología
también se encuentra bajo activa investigación para aplicaciones de selec-
ción negativa.
Depleción de células T
Las técnicas para reducir el número de linfocitos CD3+ en los injertos
hematopoyéticos alogénicos, generalmente de médula, se han dirigido a
reducir la incidencia y severidad de la reacción del injerto contra el huésped
(GVH). Muchas de las técnicas descritas para depurar células tumorales,
como la selección positiva de células CD34+, han sido también aplicadas
para la reducción de células T en el injerto (Tabla 33-8). Otras técnicas espe-
cíficamente dirigidas a las células T han incluido aglutinación con lectma de
soja, formación de rosetas E. combinaciones de ambas y diluciones a con-
tracorriente. La lectina de soja produce una aglutinina especifica frente al
receptor CD2 del linfocito. Añadiendo un paso de formación de rosetas con
eritrocitos de oveja, se consiguen eliminar las células T restantes no agluti-
nadas por la lectina de soja Este método produce una depleción de células
T de 2 a 3 log., (Reisner, 1982).
Tabla 33-7 Métodos de depuración de células madre
Selección positiva
Selección de células CD34.
Columnas en fase sólida
Esteras magnéticas
Selección negativa
Farmacológicos
4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC)
Etopósido (VP-16)
Inmunológicos
Células tumorales + AcMo + toxina"
Células tumorales + AcMo + lase sólida"
• Toxina = complemento ricino, oíros
'" Fase sólida = esleras magnéticas.
 CAPÍTULO 33 • A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E
Tabla 33-8 Métodos de depleción de linfocitos
Leclinas
Lectina de soja con formación de rosetas E
Centrifugado a contracorriente
Inmunológicos
Anticuerpos + complemento
Anticuerpos + lase sólida
Selección positiva
La dilución a contracorriente es un método utilizado para la depleción de
células T que utiliza la separación característica de células en un campo de
centrifugado, de acuerdo con el tamaño y densidad de las diversas pobla-
ciones celulares. Una de las ventajas del sistema es que no se añaden
agentes quimioterápicos o anticuerpos a la población de células madre
hematopoyéticas, por lo que no se deteriora su función celular. Los concen-
trados de capa leucocítica a partir de médula ósea se introducen en la cen-
trífuga a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fraccio-
nes celulares de diferentes tamaños y densidades. El sistema posee una
alta eficiencia en la separación de la fracción rica en CFU-GM de la fracción
de linfocitos CD3+. Como no se provocan cambios en las células, la frac-
ción CD3+ puede ser cuantificada y parcialmente añadida de nuevo a la
facción CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de células CD3+.
si se desea clínicamente (Noga, 1990). La recuperación celular es alta y.
como los medios de dilución son biocompatibles. los productos se pueden
redifundir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del proce-
dimiento es el coste del equipo necesario y la necesidad de personal expe-
rimentado.
La introducción de técnicas con esferas inmunomagnéticas para la selec-
ción positiva de células CD34+ ha llevado al uso de estas técnicas en el tras-
plante alogénico para la depleción resultante de células T CD3+, en especial
de muestras obtenidas de células madre de sangre periférica. La tecnología
con esferas inmunomagnéticas se aplica con facilidad a las células madre
obtenidas por hemaféresis así como a los productos de médula ósea de gran
volumen. Muchos centros han comunicado éxitos con estos nuevos métodos
en la reducción de células T CD3+ en trasplantes alogénicos. en especial
cuando donante y receptor no son totalmente HLA-compatibles (Henslee-
Downey, 1997).
Otra ventaja adicional tanto de las técnicas de depuración como de selec-
ción positiva es que ambas producen un volumen significativamente inferior
de células madre para congelación, recuperación y reinfusión al paciente.
Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada con la difusión de pro-
ductos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes derivados de la
congelación y almacenamiento para el laboratorio de células madre. En el
momento actual, las técnicas autorizadas para la depuración y/o selección
positiva para reducir la contaminación por células tumorales son costosas, y
se necesitan datos adicionales para valorar la eficacia clínica de estos proce-
dimientos en la reducción de células tumorales. Algunos centros han comuni-
cado un mejor pronóstico mediante el empleo de una combinación de ambas,
depuración y técnicas de selección positiva (Clarke, 1998).
Las técnicas de selección tanto positiva como negativa producen una pérdi-
da concomitante de hasta un 50% en el número original de células CD34+, tan-
to por toxicidad de diversos agentes (quimioterápicos, complemento), atrapa-
miento de complejos en esferas magnéticas, o pérdida durante etapas
necesarias de lavado. Para solucionar este problema, el número de células
CD34+ recogidas en la hemaféresis inicial y en la extracción de médula ósea
debe aumentarse para contrarrestar la pérdida posterior durante el procesado.
Esto puede ser difícil de cumplir en pacientes que son difíciles de "movilizar".
La principal desventaja de la depleción de células T es el aumento resul-
tante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de GVH
parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que
no muestran GVH. La presencia de la población de células T del donante
parece ser crítica en la reacción "injerto contra leucemia", en el reconoci-
miento de los antigenos del huésped por las células del donante que genera
una respuesta inmune que elimina las células tumorales de huésped. Estu-
813
dios más recientes también han demostrado un papel de las células asesinas
naturales (NK) en la reacción "injerto contra leucemia". Otros han empleado
combinaciones de técnicas como la selección de CD34+ y dilución a contra-
corriente para crear dos poblaciones celulares, una rica en células CD34+ y
otra rica células NK con depleción de células T, aprovechando el hecho de
que las células NK parecen tener efecto antitumoral pero no contribuyen a la
GVH (Skiera, 1999).
Criopreservación de injertos hematopoyéticos
Los injertos de CMH de origen autogénico y muchas muestras alogénicas
se criopreservan y almacenan antes de su uso. El protocolo más frecuente uti-
liza DMSO al 10% como agente protector, congelación a ritmo controlado y
almacenamiento en nitrógeno liquido, tanto en fase liquida como vapor. El uso
de DMSO proporciona una importante mejora en la viabilidad tras la descon-
gelación frente a agentes como el glicerol. Dado que existe una toxicidad aso-
ciada con la infusión de productos de células madre con DMSO, otros inves-
tigadores se han dirigido al uso de bajas concentraciones, adición de
hidroxietilalmidón u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en la mayo-
ría de los programas. Al intentar lavar los productos después de la desconge-
lación para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una pérdida
significativa de células madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a
reducir el volumen del producto antes de su congelación, reduciendo de esta
forma la cantidad necesaria de DMSO.
Reinfusión de productos de células madre
Independientemente de la fuente del injerto de células madre, las CMH se
infunden al paciente de forma similar a la transfusión de cualquier producto
sanguíneo. Las células madre pluripotenciales. dotadas de un receptor de
membrana único, se dirigirán al espacio medular, reinjertándose y replicán-
dose. Los productos que han sido criopreservados con DMSO, en su mayor
parte son descongelados e inmediatamente remfundidos sin lavar. Las CMH
recogidas por hemaféresis sin procesado ulterior pueden contener gran can-
tidad de eritrocitos. La criopreservación con DMSO no conserva la integridad
de la membrana del glóbulo rojo, por lo que estos productos contienen una
gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en
el receptor oscilan desde leves caracterizadas por náusea, escalofríos o cefa-
lea, hasta reacciones más graves, que pueden incluir hipotensión, sepsis,
insuficiencia renal o incluso parada cardíaca (Stroncek, 1991). Estas reaccio-
nes se muestran en la Tabla 33-9. Los receptores de células madre criopre-
servadas generalmente reciben premedicación con antihistaminicos y/o
antieméticos. También la hidratación y el uso de diuréticos están indicados
para reducir los efectos secundarios producidos por la administración de
hemoglobina libre y el volumen de líquido infundido.
Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes
transfundidos con productos de células madre
criopreservadas
Frecuentes
Escalofríos
Náuseas
Vómitos
Fiebre
Cefalea
Disnea
Inlrecucntes
Insuficiencia renal
Parada cardiaca
Hipotensión
Sepsis
Factores asociados
Volumen de tejido reinfundido
Tipo y cantidad de crioprotector reinlundido
Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alogénicos)
Contaminación bacteriana
 814 SECCIÓN IV • HEMATOLOGÍA, COAGULACIÓN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL
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 S E C C I Ó N V

Inmunología e inmunopatología
Richard A. McPherson, M.D.
John Bernard Henry, M.D.
 C A P Í T U L O
" Visión general del sistema inmune
y de los trastornos ¡nmunológicos
• RICHARD A. MCPHERSON, M.D.
CÉLULAS LINFOIDES 817
Linfocitos T
Linfocitos B
Células presentadoras de antígeno
Células NK
CÉLULAS NO LINFOIDES 819
Neutrófilos y eosinófilos
Basófilos y mastocitos
FACTORES HUMORALES 819
Inmunoglobulinas
Complemento
Citocmas
El sistema inmunológico está estructurado para reconocer, responder y
destruir a una amplia variedad de organismos invasores como las bacterias,
virus, hongos y parásitos, que de otro modo, serían capaces de promover
infecciones dañinas para el cuerpo. El descubrimiento de los componentes
del sistema inmune a menudo ha venido del estudio de infecciones serias y
de las reacciones específicas que emplea el cuerpo para combatir los orga-
nismos patógenos. En general, esta función inmunológica se puede resumir
como la búsqueda de antigenos extraños que no pertenecen al cuerpo y su
destrucción. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de
la aparición de antígenos nuevos extraños en células tumorales y trata de
destruirlas dejando ilesos los antígenos normales presentes en células sanas.
Los estados de enfermedad pueden surgir debido a que diversos aspectos de
la función inmunológica se vean afectados. Éstos incluyen reacciones de
hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, trasplantes alogénicos de órga-
nos o tejidos, la enfermedad de injerto contra huésped: la búsqueda de la tole-
rancia en los trasplantes continúa. Este capitulo resalta los componentes del
sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clínicas de la
inmunidad mas significativas.
CÉLULAS LINFOIDES
Las células linfoides del cuerpo incluyen las células de los ganglios linfáti-
cos, bazo, células de las superficies mucosas y células circulantes de la san-
gre. Derivan de células madre hematopoyéticas multipotentes. que se produ-
cen progresivamente desde el saco vitelino en el embrión, al hígado en el feto,
y la médula ósea en el niño y durante las fases adultas (Weissman, 1994). Las
diferentes células linfoides se identifican por la presencia de marcadores pro-
teicos únicos presentes en su superficie y que permiten a esas células des-
empeñar determinadas funciones.
34
ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD 820
MECANISMOS DE DAÑO INMUNOLÓGICO 820
APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS
INMUNOLÓGICO 820
BIBLIOGRAFÍA 820
Linfocitos T
Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la médula ósea,
pasan de la corteza a la médula timica y durante este proceso sufren la madu-
ración. Este proceso implica una selección, de modo que las células que reac-
cionan con antígenos propios se eliminarán, mientras que se retienen otras
células capaces de reconocer antígenos mediante interacciones con molécu-
las del complejo de histocompatibilidad (MHC) (von Boehmer, 1994; Nossal.
1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y un 70% de todos los linfo-
citos en la sangre, y se encuentran también en zonas paracorticales de gan-
glios linfáticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo. Durante su
maduración, sufren una programación genética, en la cual el gen para el
receptor de antígeno de la célula T (TCR) se reordena para dar receptores
proteicos que son invariantes en su especificidad antigénica, durante toda la
vida de ese linfocito y de sus células descendientes.
La mayoría (>95%) de los linfocitos T tienen receptores de antígeno com-
puestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disulluro, formando un
heterodímero que se encuentra en la membrana exterior asociado al comple-
jo molecular CD3 (CD3 es un marcador para células T). Las subunidades pro-
teicas </. y \i del TCR poseen regiones variables, de unión y constantes (la
cadena a también contiene una región de diversidad), con sus correspon-
dientes secuencias en el gen del TCR, el cual sufre un reordenamiento que
produce una elevada especificidad en la unión de un determinado antígeno.
Las proteínas CD3 asisten en la Iransducción de la señal al interior de la célu-
la cuando un antígeno se une al TCR en la superficie linfocitana (Janeway.
1994; Weiss. 1994). Un pequeño porcentaje de linfocitos T presentan un TCR
compuesto por subunidades y y ó que interaccionan de forma similar con
CD3: estas células se encuentran generalmente en la superficie de mucosas
de los tractos grastrointestinal y respiratorio. Las proliferaciones de células T
se pueden dividir en neoplásicas (clónales) o benignas (policlonales). según
su ADN muestre de forma predominante una sola forma de reordenamiento
 818 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

génico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y
como ocurre normalmente en una población linfocitaria heterogénea.
El análisis de linfocitos T mediante citometria de flujo emplea una variedad
de marcadores de superficie. El CD4 se encuentra en un 60% de células
CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/inductores que dirigen la función
de otras células del sistema inmune secretando citocinas que estimulan
varias funciones. Existen dos subpoblaciones de células CD4+: T 1, que H antigénica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reordenamiento, en
secreta interleucma 2 (IL-2) e interferón-y (IFN-y); y T„2. que secreta IL-4 e IL-5.
Las células T„1 facilitan las actividades de los macrófagos como la hipersen-
sibilidad y la producción de anticuerpos con acción opsonizante; las células
T,,2 dirigen la síntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en
un 30% délas células T (asi, la relación de células CD4 y CD8 en sangre es
típicamente 2:1). Estas células T CD8+ presentan actividad citotóxica y supre-
sora en la respuesta inmune.
El mecanismo de reconocimiento antigénico es diferente entre los dos sub-
tipos de linfocitos T. Las moléculas CD4 se unen a las moléculas de MHC de
clase II presentes en las células presentadoras de antigeno, mientras que las
moléculas de CD8 interaccionan con moléculas de MHC de clase I. De acuer-
do con esto, las células CD4+ reconocen antigenos sólo en el contexto de
MHC de clase II, y las células CD8+ los reconocen sólo a través de MHC de
clase I.
Linfocitos B
Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de
los linfocitos periféricos en sangre, y además se pueden encontrar en la
médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros tejidos linfáticos. En el bazo y
ganglios se agregan para formar los folículos Imfoides. La diferenciación de
células B se produce tanto en la médula ósea, donde tiene lugar una selec-
ción negativa y positiva, como en localizaciones periféricas. La estimulación
antigénica de las células B desencadena la formación de células plasmáticas
que secretan inmunoglobulinas como base de la especificidad en la inmuni-
dad humoral. El complejo receptor de antigeno de la célula B utiliza la inmu-
noglobulina M (IgM) como componente de unión al antígeno. La especificidad
el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. La cadena
pesada se divide en región variable, de diversidad, de unión y constante,
mientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unión y
constantes. La maduración de la respuesta mediada por anticuerpos implica
el cambio de IgM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reor-
denamiento génico, aunque el tipo de cadena ligera de una célula B perma-
nece fijado.
Las células B también presentan en su superficie receptores para el com-
plemento (CD21. que es también el receptor para el virus de Epstein-Barr
[EBV] y hace que estas células sean susceptibles de una infección por EBV)
y para la región Fe de las inmunoglobulinas: también presentan COI9 y
CD20. que se usan a menudo para la identificación inmunológica de las célu-
las B.
Células presentadoras de antígeno
Los macrófagos funcionan como fagocitos mononucleares en procesos de
inflamación, y también procesan los antígenos ingeridos y los presentan aso-
ciados a moléculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las células T no se
activan con antígenos solubles y. por tanto, la presentación de antígenos de
este modo es necesaria para la estimulación de células T y la inducción de la

Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las células presentadoras de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o
miemos y presentan los fragmentos peptídicos del antígeno, asociados a una molécula de MHC, a las células T. En la célula T, un TCR espe-
cífico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el complejo antigeno-MHC. La activación celular tiene lugar a través del complejo CD3
y la activación de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la célula B está compuesto por una molécula de Ig unida a la membrana que se encuen-
tra formando un complejo con otras proteínas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconocimiento antigénico. las
TK celulares también se activan. La activación coeslimuladora de células T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligan-
dos (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulación de la célula T a través de las moléculas CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la molé-
cula CD40 de la célula B). (Adaptado de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y Weiss A. Littman D:
Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994; 76:263, con permiso).
 CAPÍTULO 34 • VISIÓN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS I N M U N O L Ó G I C O S
inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrófagos también secretan citoci-
nas como la IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar
directamente células tumorales en su papel de inmunovigilancia. y además,
son también células efectoras en algunos tipos de inmunidad celular (por ej.
la hipersensibilidad retardada).
Las células dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones
intersticiales de otros órganos) y las células de Langerhans (presentes en la
epidermis) poseen numerosas extensiones citoplasmáticas enriquecidas en
moléculas de MHC de clase II. Por tanto, son muy eficientes en la presenta-
ción antigénica (aunque probablemente no sean fagocrticas) y se consideran
muy importantes para esta función en todo el sistema inmune.
Células NK
Las células NK (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los
linfocitos en sangre periférica. No son células T ni B y anteriormente se las lla-
maba células nulas. Las células NK tienen la función de lisar otras células sin
necesidad de una previa sensibilización. Pueden atacar células tumorales. infec-
tas con virus y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a células abe-
rrantes. Las células NK se caracterizan por los marcadores de superficie CD16
y CD56, los cuales se emplean habitualmente para su identificación. CD16 es el
receptor para la región Fe de la IgG y por tanto las células NK son capaces de
lisar selectivamente aquellas células que se encuentran recubiertas de anticuer-
pos (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-depen-
dent cell-mediated cytotoxicity], importante en algunas reacciones de hipersensi-
bilidad). Las células NK también secretan cilocinas como el IFN-y.
Curiosamente, las células NK se pueden reconocer en una preparación de un
frotis de sangre tenido, como linfocitos grandes y granulosos.
CÉLULAS NO LINFOIDES
Estas células no están programadas genéticamente para reconocer antí-
genos específicos o interaccionar con células linfoides en la inducción de una
respuesta inmune. En su lugar, son electores de reacciones inmunes desen-
cadenadas por diversos factores.
Neutrófilos y eosinófilos
Los neutrófilos llegan a las regiones de inflamación por la acción de qui-
mioatrayentes; entonces vierten sustancias tóxicas y enzimas de sus granu-
los que digieren indiscriminadamente estructuras celulares; los neutrófilos
también ingieren restos celulares al igual que los eosinófilos. retirándolos de
los tejidos.
Basófilos y mastocitos
Los basófilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en
su superficie receptores que se unen a IgE. La unión de IgE en la membrana
de los basófilos no es específica del antígeno que reconoce la IgE. sino que
es el resultado de la suma de la acción de la cantidad total de IgE y los basó-
filos disponibles. Cuando el antígeno (o alérgeno) entra en contacto con su
IgE especifica presente en la superficie del basófilo. la célula se activa y
secreta sustancias como las histaminas que median algunas hipersensibilida-
des. Asi, la especificidad de un basófilo está dirigida por la IgE que tiene unida
a su superficie desde la sangre; teóricamente, un basófilo podría tener múlti-
ples moléculas de IgE diferentes en su superficie y podría, por tanto, reaccio-
nar con muchos alérgenos diferentes.
FACTORES HUMORALES
Inmunoglobulinas
Las moléculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de célu-
las B para estimular la secreción de más inmunoglobulinas: también pue-
den circular por la sangre y aparecer en las superficies mucosas de los
tractos respiratorio y gastrointestinal, donde es probable que entren en
contacto con microorganismos patogénicos. Las principales inmunoglobu-
819
linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la
exposición continuada a multitud de antígenos extraños y pueden perma-
necer durante años mediante una secreción continuada para sustituir a
aquellas moléculas que se pierden mediante la limpieza normal de proteí-
nas circulantes. En las superficies mucosas, el principal tipo de anticuerpo
es la IgA en una forma dimérica especial que resulta de su secreción a ese
lugar (véase Capítulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD (que resi-
de en la superficie de células B donde puede estar involucrada en la trans-
ducción de la señal inmunológica. pero no adquiere concentraciones
importantes como moléculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a
través de su unión a la superficie de basófilos y estimula la secreción de
sustancias vasoactivas de esas células en presencia de alérgenos especí-
ficos).
Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan uniéndose a los antigenos
invasores en la superficie de células extrañas, bacterias, virus, etc. y facili-
tando su destrucción mediante efectores inespecíficos como el complemen-
to y las células NK. La monitonzación de enfermedades mediante el análi-
sis de inmunoglobulinas incluye un análisis cualitativo para la detección clo-
nal frente a la policlonal (p. ej., para el diagnóstico de mieloma múltiple) y
análisis cuantitativo tanto para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA
(para detectar posibles deficiencias selectivas o combinadas o la sobrepro-
ducción de tipos de inmunoglobulinas) y para títulos de anticuerpos especí-
ficos frente a antigenos individuales (como las isohemaglutininas, neumo-
cocos, Haemophilus. tétano, difteria u otros microorganismos)
Complemento
Este conjunto de proteínas que interaccionan entre si tiene el papel de des-
truir enzimáticamente las dianas (p. ej.. células, bacterias) a las que les diri-
gen los anticuerpos u otros medios (véase Capítulo 38). La medida de los
componentes del complemento tiene dos utilidades fundamentales en el diag-
nóstico clínico: detectar deficiencias congénitas (que son relativamente infre-
cuentes) que pueden suponer una predisposición a ciertas enfermedades
como infecciones o la progresión hacia enfermedades autoinmunes) y para
detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad en el momento de
análisis de una enfermedad autoinmune sistémica como puede ser el lupus
eritematoso sistémico.
Citocinas
Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las res-
puestas inmunes celulares; son mediadores que actúan a corto plazo y que
son elaborados por algunas células y difunden a otras células donde actú-
an (Paul, 1994). Muchas citocinas son pleiotrópicas en el sentido de que
pueden aduar sobre muchos tipos celulares diferentes. Pueden actuar de
forma endocrina estimulando células a una cierta distancia; pueden actuar
sobre células que se encuentran en el espacio inmediato (estimulación
paracrina); también pueden estimular a las propias células que las han
secretado (autocrina). Las acciones específicas de las citocinas incluyen la
hematopoyesis mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que
inducen la producción de granulocitos y macrófagos. respuestas de inmu-
nidad natural (mediante IL-1. factor de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], inter-
ferones e IL-8), estimulación de la multiplicación y activación de linfocitos
(mediante IL-2 y otros), y la activación inespecifica de células inflamatorias
(véase Capítulo 39). Todavía se están descubriendo nuevas citocinas a
medida que van apareciendo más detalles sobre la comunicación célula-
célula.
El uso clínico de las citocinas incluye tanto la supresión de la respuesta
inmune en el trasplante de órganos alogénico mediante fármacos como la
ciclosponna que inhibe la producción de IL-2, y la estimulación de la res-
puesta inmune en terapias frente al cáncer o a infecciones. Estos últimos tra-
tamientos son en su mayoría experimentales, aunque trabajos recientes han
demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frente al TNF-u puede pre-
venir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del tratamiento con
antibióticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fekade. 1996).
Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias median-
te las cuales las respuestas inmunes se estimularán o inhibirán selectiva-
mente de acuerdo con las necesidades clínicas concretas.
 820 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
El MHC (también denominado complejo antigénico leucocitario humano.
HLA) se encuentra codificado en el cromosoma 6 e incluye moléculas de la
Clase I (HLA A, B y C). moléculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las
moléculas de la Clase III que incluyen algunos componentes del sitema del
complemento y el TNF-u y TNF-|i (véase Capítulo 40). Las funciones de los
antigenos de las clases I y II ya se han analizado brevemente en cuanto a su
participación en la presentación antigénica a células T. Estos antígenos fue-
ron descubiertos y su naturaleza altamente polimórfica fue descrita en eslu-
dios de tolerancia inmunológica y en el rechazo de trasplantes de órganos
alogénicos. En consecuencia, una de las utilidades clínicas más importantes
del tipo HLA reside en el emparejamiento de donantes potenciales de órga-
nos o tejidos con receptores que necesitan dicho trasplante. Otra aplicación
clínica significtiva es el tipo de pacientes afectados y de miembros de sus
familias para establecer el riesgo de desarrollar algunas enfermededades que
se encuentran asociadas a tipos de HLA concretos (p. ej., la espondilitis
anquilosante con HLA B27) (véase Capítulo 41). Otra aplicación más del tipo
HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes que se han hecho
refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la formación de anti-
cuerpos anti-HLA tras ser expuestos a múltiples donantes (p. ej., tras las
transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplan-
tes de células progenituras hematopoyéticas (HPC) (véase Capítulo 31).
MECANISMOS DE DAÑO INMUNOLÓGICO
Las respuestas inmunologías pueden dañar tejidos normales además de
los organismos invasores que han desencadenado una respuesta. Estas res-
puestas se clasifican en cuatro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de natu-
raleza anafiláctica o alérgica: está mediada por la IgE unida a la superficie de
basófilos y mastocitos. Cuando antígenos específicos (o alérgenos) se unen
a la IgE de superficie, los basófilos se estimulan y liberan la histamina y otras
sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de las reacciones
alérgicas. Estrategias clínicas para el tratamiento de asma y alergias han
empleado distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar
los efectos de la histamina hasta la desensibilización. Un estudio reciente
empleó con éxito un anticuerpo monoclonal humanizado frente a la IgE para
el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terapia podría, en el
futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentración de IgE en
suero.
El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antígenos presentes
en la superficie celular; el daño puede ocurrir mediante la unión y activa-
ción del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicídad
celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de células tumorales o de
parásitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los anti-
cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la
miastenia gravis).
El tipo III resulta de la formación de inmunocomplejos, entre antígenos exó-
genos como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantígenos endóge-
nos y autoanticuerpos. El daño tisular típico ocurre en órganos que contienen
numerosos vasos sanguíneos pequeños donde los inmunocomplejos circu-
lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma natural los anti- Nossal G: Negative selection of lymphocytes Cell 1994; 76:229
genos endógenos.
El tipo IV está mediado por células, también se denomina hipersensibilidad
retardada, y depende del funcionamiento de las células T CD4+ o de la cito-
toxicidad de células T CD8+. El tipo IV es la base de la reacción inmune fren-
te a virus, hongos, protozoos, parásitos y también microbios intracelulares
como mycobacterias. Los pacientes con el síndrome de la mmunodeficiencia
adquirida (sida) son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes
oportunistas cuando pierden sus células T CD4+.
APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS
INMUNOLÓGICO
Las principales áreas de aplicación clínica de los ensayos inmunológicos
son las enfermedades autoinmunes, el trasplante de órganos/tejidos y su
rechazo, las inmunodeficiencias y las alergias
La enfermedad autoinmune puede ser sistémica (véase Capitulo 43), estar
restringida a órganos específicos (véase Capítulo 45) o puede implicar vas-
culitis (véase Capítulo 44). Muchos de los ensayos se basan en técnicas que
emplean anticuerpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con
autoantigenos específicos como puede ser el ADN de doble hebra. Otros
autoanticuerpos se pueden identificar mediante ensayos de inmunofluores-
cencia indirecta que emplean secciones de órganos para identificar autoanti-
cuerpos específicos como aquellos que se dirigen frente al músculo liso, mito-
condnas. células parietales y demás. Los avances tecnológicos han propor-
cionado fuentes purificadas de muchos autoantígenos importantes que for-
marán parte de ensayos futuros para autoanticuerpos más específicos y que
permitan una automatización más eficaz.
La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes alogénicos y las
mmunodeficiencias se basan en la búsqueda de subpoblaciones linfocitarias
con una particular importancia de las células T y de las CD4+. Ademas, los
estados de inmunodeficiencia congénita requieren un análisis más detallado
de los elementos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando
generalmente con una batería de ensayos convencionales para analizar la
presencia y (unción de linfocitos. inmunoglobulinas y complemento, y pasan-
do, cuando es necesario, a ensayos muy esotéricos en la búsqueda de des-
órdenes menos frecuentes (véanse Capítulos 36 y 42).
Los trastornos alérgicos se evalúan típicamente a través de ensayos en la
piel, medida de la concentración total de IgE en suero, y la cuantificaaon de
la reactividad específica de la IgE en suero con alérgenos comunes de la
comida, el polen y otros factores ambientales (véase Capitulo 46).
A medida que surjan nuevos descubrimientos sobre las funciones inmuno-
lógicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios de diagnóstico clínico
probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos mas
factores y actividades, para establecer diagnósticos correctos y monitorizar y
ajustar los tratamientos.
BIBLIOGRAFÍA
Fekade D. Knox K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy
treatment with antibodies against tumor necrosis lactor c«. N Engl J Med 1996:
335:311.
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76:263.
Weissman I: Developmental switches in the immune system Cell 1994; 76:207.
 CAPÍTULO 35

Inmunoensayos e inmunoquímica
• Yoshihiro Ashihara, Ph.D.
• Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc.
• Robert M. Nakamura, M.D.

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA 821 Ensayo inmunofluorométrico por partición radial

Características generales de la reacción Fluoroinmunoensayo en tiempo real
antígeno-anticuerpo Inmunoensayo fluorescente homogéneo
Características de los antígenos Ensayo de polarización de la fluorescencia
Características de los anticuerpos Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia
Cinética de la reacción antigeno-anticuerpo de excitación
Inmunoensayo de fluorescencia protegida
VISIÓN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES
DE LOS INMUNOENSAYOS 823 INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE 841
Tipos de inmunoensayos Origen
Química de conjugación Inmunoensayo quimioluminiscente usando esteres
Características de la fase sólida de acridinio como marcadores
INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Inmunoensayo electroquimioluminiscente
Y NEFELOMÉTRICOS 824 AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN
Origen y principios de la reacción de precipitina DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO 842
INMUNOENSAYOS DE PARTÍCULAS 825 Sistemas de ensayo homogéneos
Principio de aglutinación de partículas Sistemas de inmunoensayo heterogéneos
Resumen Secuencia práctica del inmunoensayo
en el sistema analítico
RADIOINMUNOENSAYO 830
Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo
Origen
heterogéneo
Principios y métodos del ensayo
Nuevos sistemas para la próxima generación
Resumen
(sistemas modulares)
INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO 833 SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA
Origen y clasificación SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE 845
Inmunoensayos enzimáticos heterogéneos Origen
Inmunoensayos enzimáticos homogéneos Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de
Resumen ensayo por inmunofiltración)

INMUNOENSAYO FLUORESCENTE 839 Tiras reactivas

Origen y clasificación Instrumentos inmunocromatográficos

Resumen
Inmunoensayo fluorescente heterogéneo
Método fluoroinmunométhco BIBLIOGRAFÍA 848

Los inmunoensayos se pueden utilizar para la detección tanto de anti-

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
Características generales de la reacción
antígeno-anticuerpo
Los ligandos inmunológicos se basan en la afinidad entre moléculas, como la
enzima y el sustrato, la hormona y su receptor, el antígeno y el anticuerpo, y jue-
gan un papel importante en los seres vivos. Las características de reconoci-
miento específico de los inmunoensayos (reacciones antígeno-anticuerpo) han
pasado a ser ampliamente utilizadas como herramientas analíticas, a pesar de
la amplia gama de métodos disponibles para el análisis clinico en un laboratorio.
geno como de anticuerpos. Para la delección de antigenos, el anticuer-
po específico correspondiente debe prepararse como uno de los reacti-
vos. Lo contrario se aplica para la detección de anticuerpos. La sensibi-
lidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante el desarrollo de
nuevos tipos de sistemas para la detección de la señal y la tecnología
de fase sólida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar
menos de 0,1 pg.'ml de antígeno presente en la sangre. Se pueden apli-
car a la detección de haptenos como moléculas pequeñas: proteínas y
complejos proteicos como las macromoléculas: y también para cualquie-
ra de los anticuerpos frente a alérgenos, agentes infecciosos y antige-
nos autólogos.
 822 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
Características de los antigenos
Los antígenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede
representar sitios antigénicos (epítopos) para producir los correspondientes
anticuerpos, desde moléculas pequeñas como los haptenos y hormonas,
hasta macromoléculas como proteínas, glícoproteínas, glicolipidos y otros
productos naturales. Algunos compuestos químicos artificiales también pue-
den ser antígenos actuando como haptenos. Los antígenos deben tener al
menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos
incluyen secuencias de aminoácidos de peptidos presentes en proteínas y
estructuras proteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.
Características de los anticuerpos
La inmunoglobulma. una proteína plasmática importante, se refiere a anti-
cuerpos en el contexto de funciones biológicas de inmunoglobulmas específi-
cas de antígeno. Los anticuerpos, por tanto, se producen en respuesta a
estimulaciones antigénicas. Los anticuerpos se componen de moléculas fun-
cionales y heterogéneas que unen antígenos mediante un dominio de unión
al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina: IgG, IgM. IgA. IgD
e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tanto la IgA como la IgM
presentan dos subgrupos. Todas las moléculas de anticuerpo conocidas pre-
sentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura mole-
cular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones
variables. El dominio hipervaríable (sitio de unión al epitopo) puede ensam-
blarse para interaccionar con una amplia variedad de epítopos (determinan-
tes antigénicos). En un laboratorio de medicina se pueden distinguir dos cate-
gorías de anticuerpos: anticuerpos como reactivos o anticuerpos como anali-
tos. Los anticuerpos como analitos a menudo se clasifican por los subtipos
IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reactivos se preparan a partir de anti-
sueros obtenidos a través de la inmunización con un antígeno purificado.
Anticuerpos policlonales
Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunización con un
antígeno, que presenta varios epítopos. En otras palabras, se generan anti-
cuerpos específicos frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo poli-
clonal por un antígeno complejo generalmente es mayor que la de un simple
anticuerpo monoclonal. Para la inmunización con moléculas relativamente
pequeñas, como los haptenos o las hormonas, pueden ser necesarias prote-
ínas transportadoras o carner.
Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales (Kóehler. 1975) se han desarrollado emple-
ando las siguientes biotecnologías: fusión somática de células, selección del
hibridoma resultante y dilución límite para obtener monoclonales. Se definen
como anticuerpos homogéneos uniformes dirigidos a epitopos específicos.
Una linea celular establecida permite la secreción de todas las inmunoglobuli-
nas especificas que reaccionan frente a un solo antígeno. Los anticuerpos
monoclonales han permitido el análisis de moléculas, epitopo por epitopo. gra-
cias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales
no tienen la habilidad de reconocer la molécula completa, en comparación con
los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distintos antí-
genos con un epitopo común parecen el mismo antígeno. El anticuerpo CA19-
9 (Magnaní, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas
y tamaños moleculares que poseen epilopos comunes formados por carbohi-
dratos. Los anticuerpos monoclonales permiten la identificación de isoenzimas.
subtipos, isotipos de proteina y cambios conformacionales de las moléculas,
puesto que pueden distinguir la mínima diferencia entre moléculas.
Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones cruzadas con distin-
tos antígenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar por la probable
existencia de la misma secuencia de aminoácidos, hidratos de carbono o lípi-
dos en distintas moléculas. La tecnología de los anticuerpos monoclonales ha
permitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo muy útiles y práctica-
mente ideales para un laboratorio de diagnóstico clínico.
Los métodos de producción y las aplicaciones de los anticuerpos monoclo-
nales se han analizado exhaustivamente (Nakamura. 1983: Zola, 1987). Las
ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguientes:
1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo muy bien definido.
2. La producción de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad
ilimitada de reactivo homogéneo con una afinidad y especificidad muy
constante.
3. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmuniza-
ción con un antígeno sin purificar.
Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para su uso.
que son las siguientes:
1. Reactividad insuficiente para la precipitación o aglutinación debido a que
la formación del entramado del inmunocomplejo es débil o no ocurre cuan-
do se emplean anticuerpos monoclonales.
2. Los antigenos con múltiples epítopos heterogéneos son más difíciles de
caracterizar inmunoquímicamente con un solo anticuerpo monoclonal.
Producción de anticuerpos mediante tecnología
recombinante
Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresión para el frag-
mento F de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosfo-
v
rilcolina empleando tecnología recombinante en Escherichia colí. Esta técnica
hace posible producir un anticuerpo quimérico fusionado con una enzima.
Ha aparecido una técnica lamada phage display (una traducción podría ser
muestra de fagos) para la producción de anticuerpos (Wmter. 1994). En este
método fragmentos de anticuerpo de una especificidad de unión previamente
determinada se construyen de un repertorio de genes V de anticuerpo, elimi-
nando asi la necesidad de inmunización y generación de hibridomas. Los
genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por
unión al antígeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias
infectadas Además, la afinidad de la unión de los anticuerpos se mejora
mediante mutación. En un futuro próximo esta técnica permitirá el uso de anti-
cuerpos específicos de alia avidez.
Cinética de la reacción antigeno-anticuerpo
Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de acción de masas de la
química se pueden aplicar a la reacción antígeno-anticuerpo. La cinética de
una reacción Ag-Ab reversible es la siguiente (Steward. 1986):
K
Ag + Ab AgAb
2
K
Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anti-
cuerpo libres. AgAb representa la concentración del complejo antigeno-anti-
cuerpo, y K' y K son las constantes de asociación y disociación, respectiva-
mente. El ritmo de formación del complejo antigeno-anlicuerpo se representa
de la siguiente forma:
K'|Ag][Ab]-K^[AgAb|
y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi.
*' _ [AgAb]
? 11
K ~[Ag][Ab]~
(constante de asociación en el equilibrio o constante de afinidad).
K es el parámetro limitado a las reacciones de sitio en sitio, a pesar de
a
que los antígenos y los anticuerpos a menudo poseen múltiples dominios de
unión en la molécula. La constante de asociación para múltiples reacciones
antígeno-antícuerpo se puede denominar avidez en lugar de afinidad. El
valor de K se puede obtener de las siguientes ecuaciones y de datos expe-
a
rimentales:
[Ab] = [Ab],-[AgAb]
donde [Ab] es la concentración del anticuerpo en el equilibrio y [Ab]. repre-
senta la concentración total de anticuerpo inicial.
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
a
"([Ab],-B)F
donde F es el anlígeno libre o analito, y B es el antígeno unido o analito.
Una representación de Scatchard se produce cuando la cantidad de antí-
geno unido (B) se representa en eje el X y la relación de los analitos B/F se
representa en el eje Y. Dos parámetros que se pueden determinar de una
representación de Scatchard son la constante de disociación o afinidad, de la
pendiente de la línea, y la concentración de los sitios de unión al anticuerpo
por el punto de corte de la recta con el eje X (Scatchard. 1949).
VISIÓN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES
DE LOS INMUNOENSAYOS
Tipos de inmunoensayos
Una breve clasificación y una lista de las características de vanos inmuno-
ensayos aparecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitación pro-
porcionan el método más sencillo por el que los antígenos y anticuerpos reac-
cionan entre ellos sin necesidad de una señal de detección. El complejo anti-
geno-anticuerpo en un gel o en fase líquida puede observarse cualitativamente
como un precipitado a simple vista, y cuantitativamente mediante un detector.
El inmunoensayo de aglutinación de partículas (Kasahara, 1992b) emplea
partículas inertes como sonda, en lugar de la precipitación directa de los com-
plejos antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antígenos unidos a partículas
como eritrocitos, látex o un sol metálico reaccionan con el analito de la mues-
tra. Como resultado de esta reacción inmune, las partículas grandes presen-
tan un patrón de aglutinación significativo que puede verse a simple vista.
Yalow (1959) describió el desarrollo de un RÍA empleando isótopos radiacti-
vos como sonda. Este avance permitió la detección cuantitativa de niveles
residuales de analitos y contribuyó al avance de la investigación básica y la
medicina clínica. La insulina, por ejemplo, se cuantificó mediante un RÍA, y
sustituyó al inmunoensayo de la insulina. El RÍA se puede preparar como un
procedimiento en fase sólida para una separación fácil de la sonda libre de la
unida. Desde el desarrollo de los RÍA, la búsqueda de sondas alternativas a
los isótopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desarrollar
inmunoensayos no isotópicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y
otros grupos de respuesta.
El inmunoensayo enzimático (EIA), que emplea enzimas como sondas, se
desarrolló al principio de la década 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y
rápidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las
señales dependiendo de la actividad catalítica de la enzima. En un intento de
mejorar los sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-
Tabla 35-1 Clasificación de los inmunoensayos y sus características
Señal de detección Separación B/F*
Inmunoensayos de precipitación No necesarias
Inmunoensayos de partículas Células sanguíneas.
partículas artificiales (gelatina.
partículas de látex, etc.)
3
Radiommunoensayos Radioisótopos ('»1, H)
Inmunoensayos enzimáticos Enzimas
Inmunoensayos fluorescentes Fluoróforos
Inmunoensayos
quimioluminiscentes Compuestos quimioluminiscentes
'Paso de lavado para la separación do la sonda unida en el inmunocomple¡o de la sonda que queda
separación B/F.
Dalos de Ritchie (1978)
:
Datos de Aux (1988).
'Oatos de Isomura (1994)
'Datos de Sgoulas (1989)
823
puestos cromóforos, fluoróforos. y más tarde, compuestos quimioluminiscen-
tes. Dependiendo del sustrato elegido, el método de ensayo se puede definir
como un inmunoensayo enzimático fluorescente o quimioluminiscente
(Thorpe. 1984).
Los inmunoensayos fluorescentes (FIA) emplean fluoróforos como sondas.
Los fluoróforos requieren de una longitud de onda óptima para que su excita-
ción produzca una emisión de luz detectable. La sensibilidad del FIA normal-
mente desciende debido al fondo inespecífico presente en las muestras bio-
lógicas. Existen fluoróforos que poseen un retraso en la emisión de fluores-
cencia de 100 ns (nanosegundos) y son apropiados para el uso en un FIA en
tiempo real. El empleo de un nuevo tipo de compuestos fluorescentes ha
resultado en una mejora del FIA, como puede ser la eliminación del ruido de
fondo. Se han introducido instrumentos sofisticados de modo que se pueden
15
detectar concentraciones bajas de analitos (10 M) mediante FIA.
Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean compuestos quimiolumi-
niscentes como sonda. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen molé-
culas sintetizadas químicamente y productos naturales como la aequorina. A
diferencia de los fluoróforos. la mayoría de los compuestos quimioluminis-
centes requieren una estimulación química, en lugar de energía lumínica,
para generar la emisión de luz. La reacción de reducción-oxidación es un pro-
ceso común a todos los ensayos quimioluminiscentes. La amplificación de la
señal no se espera de las sondas quimioluminiscentes porque las moléculas
quimioluminiscentes generan un solo fotón por descomposición molecular.
Han aparecido una serie de compuestos innovadores para la quimioluminis-
cencia que han resultado útiles para su aplicación en inmunoensayos. Un
metal quelado con grupos tri-bifenilo emite luz a través de una reacción con-
tinua de reducción-oxidación en la superficie de los electrodos (Blackburn,
1991).
En los diversos tipos de ensayos mencionados anteriormente, los principa-
les factores que afectan a la sensibilidad de un ensayo son la constante de
asociación (afinidad o avidez) del reactivo, la intensidad de la señal de las
sondas y la relación señal/fondo de la señal de detección reducida por el
fondo de la propia reacción o por una reacción inespecifica.
,25
Los isótopos de yodo 125 ( l) requieren unos 7 millones de moléculas
para generar 1 fotón/segundo, basado en el cálculo de la vida media de isó-
topos radiactivos (Bounaud. 1987). Los sustratos quimioluminiscentes de
enzimas pueden incrementar el número de eventos en una orden de magni-
l2S
tud 6 veces mayor que el l. Esto se atribuye a la capacidad de amplificación
catalítica que poseen las enzimas.
Química de conjugación
En función del ensayo elegido, el método de conjugación que une una molé-
cula con otras, como enzimas (o cofactores) a antígenos (o anticuerpos) o antí-
genos (anticuerpos) a una fase sólida puede variar. La reacción de acopla-
Detección de la señal Sensibilidad
No necesaria A simple vista, turbidez. ~10|jg/m|t
nefelometría
No necesaria A simple vista, analizador de -5 ng/mM
patrones, espectrofotometría.
cómputo de de partículas
Necesaria Cómputo de fotones -5 pg/ml
Necesaria Espectrofotometría. fluorimetria. -0,1 pg/m|6(CL-EIA)
cómputo de fotones
11
Necesaria Cómputo de fotones -5 pg/ml
1
Necesaria Cómputo de fotones -5 pg/ml
libre Los ensayos homogéneos que se incluyen no requieren la
 824 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
miento aplicada se debería llevar a cabo en condiciones que eviten la reducción
de las propiedades biológicas de la proteína. En el método del glutarakJehido
(Avrameas, 1978). el glutaraldehido, con dos (o posiblemente más) grupos
aldehido como agente de acoplamiento, se ha empleado para la conjugación de
grupos amino proteicos. Este método se basa en reacciones mixtas, incluida la
condensación aldólica a elevado pH (la pKa del residuo NH es de 8.6 a 10.8).
En este método, mostrado en la Figura 35-1. el conjugado resultante presenta
formas diferentes por la existencia de múltiples dianas de unión. El método de
la oxidación con periodato (Nakane. 1966) para la conjugación de anticuerpos,
emplea la peroxidasa de rábano, que contiene grupos de hidratos de carbono
en su molécula. Los métodos mencionados anteriormente no son apropiados
para la regulación de reacciones especificas de diana, como ocurre cuando se
requiere la estereoespecificidad configuracional del conjugado.
Como se muestra en la Figura 35-2, se han desarrollado métodos de con-
jugación nuevos (Kato. 1975; Kitagawa. 1978) empleando un reactivo de
conjugación sofisticado, el éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimí-
da (MBS). El MBS es un reactivo bivalente que consiste en un éster activo
y la maleimida. que pueden reaccionar con un grupo NH, y un grupo SH,
respectivamente. El grupo carboxilo también puede ser utilizado como una
diana específica para la conjugación con un residuo a- o i-NH presentes
en una proteina empleando N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivo de
conjugación. El reactivo NHS también conjuga proteínas o el grupo carbo-
xilo introducido en una fase sólida.
Características de la fase sólida
Todos los inmunoensayos heterogéneos que emplean conjugados con son-
das, incluidos los radioisótopos, requieren al menos un paso para diferenciar
el anligeno que ha reaccionado para formar un inmunocomplejo (unido), del
que permanece sin reaccionar (libre). La inmovilización de antigenos o anti-
cuerpos en una fase sólida se realiza mediante uniones covalentes o median-
te adsorción tísica a través de interacciones no covalentes. Se han empleado
como lase sólida, partículas de gel hechas de agarosa. poliacrilamida. cuen-
tas de plástico o placas de poliestireno. y también partículas recubiertas de
oxido de hierro que pueden separarse en un campo magnético.
A menudo se utiliza la cara interna de un tubo o un pocilio de microtiter.
como fase sólida. Con estas fases sólidas relativamente grandes, puede ser
necesaria la agitación de la mezcla de reacción para acortar el tiempo nece-
sario para que tenga lugar la reacción inmune. El fenómeno prozonal o efec-
to de gancho, se debe a una elevada concentración de analito, y es probable
que se observe en un inmunoensayo de un solo paso cuando se emplean
cantidades limitadas de anticuerpo en fase sólida, o cuando se usan anti-
cuerpos conjugados con una sonda. Las placas de microtiter o de tiras pue-
den causar un "efecto de borde". Este efecto puede explicarse por las distin-
tas cinéticas de la reacción inmune o la actividad enzimática con las vanado
nes de la temperatura. Puede existir una diferencia en la temperatura entre
los pocilios que se encuentran en el borde de la placa y los que se encuen-
tran en el centro. Una diferencia de unos 2 C puede observarse con un ter-
mómetro infrarrojo entre los pocilios del borde y los centrales a temperatura
ambiente. La forma y tamaño de la fase sólida son factores críticos que afec-
tan a la cinética de la inmunorreacción y a la capacidad de unión del anti-
cuerpo o antígeno de la fase sólida. Partículas esféricas magnéticas o de
látex de 3.000 A de diámetro, poseen una superficie total mayor para la inmu-
noabsorción de lo que se obtiene normalmente con otras lases sólidas. La
mayor superficie total ayuda a reducir la duración de la reacción inmunológi-
ca (Nishizono. 1991).
Las partículas que se emplean en los ensayos de aglutinación de partícu-
las se enumeran en la Tabla 35-2 El fenómeno de la aglutinación de partícu-
las (aglutinación directa) causado por una reacción inmune, se observó por
primera vez en un ensayo para detectar la presencia de antigeno tras la incu-
bación con el suero de un paciente infectado. La aglutinación de eritrocitos
tras la incubación con el suero dio lugar al descubrimiento de los grupos san-
guíneos ABO. Los inmunoensayos de partícula se basan en el principio de
aglutinación y emplean como reactivo un anticuerpo o un antigeno unido a
una partícula inerte, en lugar de la precipitación directa de un complejo anti-
geno-anticuerpo. Como sonda, la partícula puede aumentar significativamen-
te la sensibilidad del inmunoensayo. independientemente de si la aglutinación
resultante se detecta a simple vista o mediante instrumentos espectrofotomé-
tricos para su cuantificación.
Los entreoíos, partículas de gelatina. Iiposomas. soles de metal, y varios tipos
de partículas de látex, incluyendo el látex modificado con óxido de nierro o tin-
tes, funcionan como fases sólidas útiles en estos ensayos. El diámetro de las
partículas empleadas en reacciones de aglutinación varía entre 7 pm y 0,01 pm.
No existe una única teoría que explique las reacciones de aglutinación
(Kasahara, 1992a) debido a la gran variedad de lamaño de las partículas emple-
adas. Para partículas mayores de 3 pm a 5 pm de diámetro, no se observa a
temperatura ambiente el movimiento browniano de partículas dispersas actuan-
do de acuerdo con el coeficiente de difusión. Sin embargo, la teoría de la ener-
gía potencial de la interacción entre partículas, o la teoria de la reacción de coa-
gulación de coloides, se pueden aplicar a partículas pequeñas como pueden ser
las micropartículas de látex. La IgM, por ser multjvalente, se estima que es unas
750 veces más eficiente en una reacción de aglutinación que una molécula biva-
lente de IgG. La distancia entre partículas en una floculación debe ser menor o
igual a 120 Adebido a la longitud de la molécula de anticuerpo. En resumen, los
factores importantes a tener en cuenta en una inmunorreacción de fase sólida
son las propiedades de la superficie de las partículas, como su carga e hidrofo-
bicídad, y la estabilidad de la dispersión.
INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMÉTRICOS
Origen y principios de la reacción de precipitina
El precipitado que se forma cuando grandes complejos de antigeno se
combinan con anticuerpos para formar un entramado insoluble se ha utiliza-
do ampliamente en la identificación y cuantificación de las reacciones de pre-
cipitina. La aplicación de las técnicas de precipitina posee las ventajas de la
sensibilidad, especificidad y sencillez. La limitación que supone la sensibilidao
de estos ensayos requiere de una importante consideración. Incluso en las
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA 825

Tabla 35-2 Partículas empleadas como sonda en el inmunoensayo de aglutinación de partículas

Método de ensayo Suministro
Eritrocitos humanos Hemaglutinación directa (Landsteiner) Grupo sanguíneo ABO
I lemaglutinación eritrocito-anticuerpo: Anticuerpo para el virus de la
humana (VIH)
placa de microtiter/portaobietos
Eritrocitos de ave Hemaglutinación directa Anticuerpo Irenle virus de la gripe humano
Hemaglutinación pasiva: placa de microtitor Anticuerpos de T allldum
Mezcla de eritrocitos animales Hemaglutinación pasiva indirecta: placa de microtiter Antigeno de superficit del virus de la Hepatitis I
(HBV)
Látex Aglutinación pasiva indirecta: portaobjetos Gonadotropma coriónica
Aglutinación pasiva indirecta: turbidimetría
Aglutinación pasiva indirecta Ferriti na
Látex (color) Inmunocromatografía Gonadotropma coriónica humana (hCG)
Microcápsulas Aglutinación pasiva: placa de microtiter Anticuerpo para T pallidum
Parliculas de gelatina Aglutinación pasiva: placa de microtiter Anticuerpos para HIV. T. pallidum
Aglutinación pasiva indirecta: cámara CCD Hemoglobina humana (hHb)
Parliculas pohpeptídicas Aglutinación pasiva e indirecta Anticuerpo para T pallidum, y para HBs
Partículas de silicato Aglutinación pasiva: placa de microtiter/cámara CCD Anticuerpo para T pallidum
Partículas de oro Fotometria mejorada con aglutinación indirecta Estrògeno total
Soles de metal Aglutinación indirecta hCG. hHb
De Kasahara Y Principles and applications ot particle immunoassay En Nakamura RM Kasahara Y. Rechnitz GA (ed ). Imnu id Biosensor
Technology lor the 1990s Washington DC American Society lor Microbiology. 1992b. pags. 127-147. con permiso

mejores condiciones de mejora de la sensibilidad que ofrecen nuevas técni-

cas de difusión de luz. el límite inferior de sensibilidad de ensayos de inmu-
noprecipitina se mantiene en el orden de 0.1 a 0.5 mg/dl. Este umbral de sen-
sibilidad es suficiente para la cuantificación de las principales proteínas séri-
cas. La reacción de precipitma forma la base de muchas técnicas inmunoqui-
micas cuantitativas y cualitativas que se emplean en los laboratorios clínicos
(Kabat. 1961).
Los factores que afectan a la reacción de precipitina fueron investigados
detalladamente por Heidelberg en 1935, quien encontró que las proporcio-
nes relativas entre reactivos, condiciones de temperatura, pH y fuerza iónica
del medio, y las características de avidez y afinidad del anticuerpo, son todas
de igual importancia para la formación del precipitado inmune. En cuanto al
patrón de formación de precipitma cabe notar que existe un punto en que la
precipitación es máxima u óptima, denominado punto de equivalencia. La
adición continuada de antígeno una vez que se ha alcanzado el punto de
equivalencia produce un efecto solubilizador del precipitado. El rango apro-
piado para la determinación de analitos debería de llegar hasta la zona de
equivalencia. La optimización de la concentración del anticuerpo que se va a
emplear como reactivo es necesaria, al igual que la optimización de las solu-
ciones tamponadas. Los métodos de precipitación más típicos son los
siguientes:
Métodos cualitativos del ensayo de precipitación
INMUNOENSAYOS DE PARTÍCULAS
Principio de aglutinación de partículas
La reacción de aglutinación se puede emplear para detectar anticuerpos
presentes en individuos que han sido sensibilizados con antigenos específi-
cos (aglutinación directa o pasiva) (Figura 35-3B). La aglutinación inversa
emplea un anticuerpo específico que se emplea para detectar antígenos
solubles en el individuo (Figura 35-3A). Un dominio de unión a haptenos
(para drogas, hormonas o partículas pequeñas) no forma una estructura
entrecruzada, y por tanto no se aglutina a no ser que se inmovilice en una
fase sólida. Como se muestra en los paneles A y 6 de la Figura 35-4. cuan-
do se emplea una partícula o un transportador inmovilizado con un hapteno
como reactivos, puede darse una inhibición de la reacción de aglutinación
que permite la detección del hapteno. Este ensayo se basa en el principio de
competitividad, en el que la aglutinación de partículas de hapteno con una
cantidad limitada de anticuerpo, libre o unido a partículas, se inhibe debido a
la presencia de hapteno libre presente en la muestra. Además, partículas
marcadas pueden reaccionar con reactivos fijados a una fase sólida de la
membrana. Este tipo de ensayo ha sido muy popular como un método sen-
cillo para la detección cualitativa de gonadotropma coriónica humana (hCG)
y otros analitos.

Inmunodifusión sencilla (Williams. 1970)

Inmunodifusión doble (Garvey, 1977)
Inmunodifusión doble en dos dimensiones (Williams, 1970)
Reacción de electroinmunodifusión (Ritzmann, 1975)
Inmunoelectroforesis (Rose. 1973)
Métodos semicuantitativos del ensayo de precipitación
Inmunodifusión radial sencilla (Manzini. 1965: Fahey, 1965)
Electroinmunodifusión en una sola dimensión (Axelsen. 1975) (electrofore-
sis 'cohete")
Inmunoensayos nefelométricos
Se han desarrollado vanas técnicas de análisis por inmunoprecipitina que
emplean sistemas de dispersión de la luz (Ritchie. 1978). La formación de los
complejos inmunológicos se ha asociado a la cantidad de dispersión de luz y
se ha empleado como la base para la cuantificaoón del antígeno Se han
diseñado instrumentos sofisticados que rápidamente miden la dispersión de
la luz. Las medidas de dispersión de la luz generalmente se denominan turbi-
dimetrias o nefelometrías.
Hemaglutinación
Las pruebas de hemaglutinación (Boyden, 1951) son sencillas en su reali-
zación y no requieren un equipamiento especial. Por este motivo, tanto los
países desarrollados como los que se encuentran en vías de desarrollo, han
adoptado una variedad de ensayos de hemaglutinación. Una de las pruebas
de hemaglutinación más extendidas es la que se emplea para la detección de
anticuerpos contra Treponema pallidum. comercializado como Serodia-TP por
Fujirebio, Inc (Tokio. Japón). En Estados Unidos, el ensayo de hemaglutina-
ción para Treponema pallidum se aprobó en 1981 por el Center for Disease
Control (CDC). También fue recomendado por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) gracias a su superioridad Irente a otros tipos de ensayo en cuan-
to a su especificidad y sensibilidad (Kasahara. 1992b).
En el ensayo de aglutinación de Treponema pallidum. el reactivo consiste
en eritrocitos sensibilizados y desensibihzados de oveja, y una solución dilu-
yeme del suero para la reconstitución de células sensibilizadas liofilizadas
como control positivo Se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos y semi-
cuantitativos mediante el uso del siguiente protocolo de dilución del suero,
empleando una placa de titer como recipiente de la reacción: empleando una
 826 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

A n t í g e n o o haptcno Anticuerpo en la muestra

В conjugado en una p a r t í c u l a

Figura 35-3. Principios del inmunoensayo de aglutinación pasiva de partículas para la detección de antígenos de múltiples epítopos [A) o de
anticuerpos (B). (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for 1990s.
Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.)

pipeta de 25 uj, poner cuatro gotas (100 ul) del diluyeme de suero en el poci-
lio 1 (Fig. 35-5) y una gota en los pocilios 2 y 4 del ensayo cualitativo (los poci-
lios del 2 al 8 se van a utilizar para el ensayo cuantitativo). Los patrones de
aglutinación resultantes se muestran en la Fig. 35-6. Los patrones negativos,
que indican que la reacción inmune no ha tenido lugar, muestran partículas en
floculación condensadas con una estructura entrecruzada en el fondo del
pocilio. Por el otro lado, los patrones positivos indican que la reacción inmu-
ne ha tenido lugar, y muestran un patrón de aglutinación de partículas exten-
dido. Las partículas aglutinadas no se pueden sedimentar más para obtener
una condensación como en los patrones negativos, porque se pierde su forma
global en la aglutinación. En las filas primera y segunda, se emplearon el
suero y las células no sensibilizadas (control negativo), respectivamente. Los
individuos 1 y 2 muestran resultados negativos. Los individuos 3 a 8 muestran
resultados negativos o positivos, dependiendo de la dilución de la muestra. Se
obtiene un resultado positivo para los individuos 7 y 8 hasta una dilución de
1:2.560 (filas 3 a 8).
Existen tote de hemaglutinación para la detección de anticuerpos frente al
virus de la hepatitis В (HBV), hepatitis tipo С (HCV), el virus de la inmunode-
ficiencia humana (VIH-1/2), la tiroglobulina, microsomas tiroideos y otras sus­
tancias. Ensayos de hemaglutinación inversa se emplean para la detección
del antígeno de superficie de HBV. la a-fetoproteína (AFP), hemoglobina
humana, etc. La sensibilidad de las pruebas de hemaglutinación es de apro-
ximadamente 50 ng/ml para la detección de antígeno (analito). Kemp (1988)
desarrolló un nuevo ensayo de hemaglutinación que emplea un anticuerpo
monoclonal específico para el antígeno de superficie de los eritrocitos huma-
nos. Este anticuerpo puede reconocer un epítopo común a diferentes tipos de
eritrocitos y a células anormales, como las que se encuentran en casos de
anemia falciforme. Tal y como se muestra en la Figura 35-7, los eritrocitos de
las muestras se emplean como partículas de fase sólida, y la aglutinación
resultante puede observarse a simple vista. Los anticuerpos bivalentes se
conjugan químicamente para que un anticuerpo reaccione específicamente
con los epítopos de superficie del eritrocito, y el otro es específico para el anti-
geno diana o analito. El ensayo se aplica para la detección de anticuerpos
frente a VIH, además de para la detección de varios antigenos. A diferencia
de otras formas de aglutinación convencionales, no requiere la separación de
plasma o suero. Este ensayo es simple y ahorra tiempo, y además, presenta
ventajas en cuanto a la seguridad, porque elimina la necesidad de la separa-
ción del suero en el caso de muestras peligrosas positivas para VIH o HBV.
Aglutinación de partículas de gelatina
El desarrollo de una partícula especial de gelatina con una superficie muy
hidrofílica que es capaz de evitar la unión inespecífica de materiales presen-
tes en la muestra ha supuesto una alternativa a los eritrocitos (Ikeda, 1984).
La partícula se prepara por separación de fases y entrecruzamiento tridimen-
f
sional a 40'C y pH óptimo. La partícula resultante se tija con formaldehído o
glutaraldehido, y su diámetro es de unas 3 um. Las propiedades físicas de las
partículas de gelatina en comparación con las de los eritrocitos se muestran
en la Figura 35-8. Una partícula de gelatina carece de antigenicidad y está,
por tanto, libre de los problemas asociados con el empleo de anticuerpos
heterofílicos cuando se emplean eritrocitos como partículas. Este tipo de par-
tícula artificial requiere una menor dilución del suero para evitar las uniones
inespecificas y garantiza una detección más sensible que en el caso de los
glóbulos rojos. Otras partículas sintéticas (Hirayama, 1991) compuestas de
ácido L-glutámico y sus derivados han sido desarrolladas por Mirayama
(1991) como alternativa a las partículas de gelatina. Estas partículas sintéti-
cas se pueden teñir de cualquier color porque las partículas son incoloras, al
igual que las de gelatina. El ensayo de aglutinación de partículas de gelatina
se empleó inicialmente para la detección de anticuerpos frente al virus linfo-
trópico humano de tipo I (HTLV-1), que se descubrió inicialmente como un
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA 827

Menos agregados
y de menor tamaño

Figura 35-4. Principios del inmunoensayo de inhibición de partículas para la detección de antígenos con un solo epitopo (haptenos), emple-
ando partículas de antigeno con anticuerpos libres (A) o fijados (8). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA |eds): Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
 828 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

Figura 35-5. Ensayo de hemaglutinacidn para la deleccidn del antigeno de T. palli-

dum (Serodia-TP, Fujireblo, Inc, Tokio, Japon) basado en prolocolos de ensayos se-
micuantitativos (De Nakamura RM. Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemi-
cal Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington. DC. American So-
ciety for Microbiology. ASM Press. 1992. con permiso)

retrovirus humano. Este ensayo de aglutinación (Ikeda, 1984) rápidamente se
hizo muy popular para la detección de VIH. HBV y HCV gracias a su alta sen-
sibilidad y especificidad, a su sencillez y a que no es necesario un control muy
estricto de la temperatura. La aglutinación de partículas de gelatina puede
sustituir cualquier ensayo basado en la hemaglulmación, con la excepción de
ensayos que emplean los eritrocitos de la muestra como partículas.
Aglutinación con látex
La aglutinación con látex (Galvin. 1984). utilizando partículas de látex,
se ha utilizado para la detección de vanos analitos. como la hCG para las
pruebas de embarazo, y la detección cuantitativa de otras proteínas plas-
máticas con o sin instrumentación. El procedimiento de este ensayo cuali-
tativo es sencillo. Por ejemplo, es posible que uno solo tenga que mezclar
unas gotas del látex sensibilizado con el reactivo y la muestra empleando
un palito, sobre un cubre negro. Dos o tres minutos más larde, se puede
detectar a simple vista la aglutinación de fase invertida, como resultado de
la inmunoreacción. La aglutinación con látex se adaptó para ensayos cuan-
titativos empleando métodos de detección lumínica basados en la turbidi-
metria (absorción de la luz) o nefelometría (dispersión de la luz). Con eslas
técnicas, la aglutinación de látex adquiere una mayor sensibilidad de sub-
nanogramos por mililitro, mientras que la sensibilidad del ensayo midiendo
la precipitación intacta del complejo antígeno-anticuerpo es menor de 0.5
ug'ml.
Ensayo de turbidimetha con látex
La absorción de luz (pérdida de luz mediante su dispersion en la superficie
de una partícula) es proporcional al diámetro de la partícula y depende de la
longitud de onda empleada. La mayoría de los reactivos de látex disponibles
de forma comercial con un diámetro inferior a 1 pm. se aplican a analizadores
químicos automáticos empleando principios de medida fotométncos. Para
mejorar todavía más la sensibilidad, se trató de mejorar los reactivos y la ins-
trumentación, así como optimizar el tamaño de la partícula, seleccionar la
longitud de onda apropiada, y mejorar el software del sistema informático que
integra los datos. Ahora existen sistemas automatizados que emplean partí-
culas de látex, y pueden procesar unas 200 muestras por hora con una sen-
sibilidad de subnanogramos por mililitro.
Inmunoensayo por contaje de partículas
El inmunoensayo por cómputo de partículas (PACÍA: paríde-counting
immunoassay) (Masson. 1986) emplea el contaje celular óptico para obtener
el descenso en partículas libres después de la inmunoreacción. En el forma-
to PACÍA, se puede medir tanto el ritmo del ensayo, es decir, el ritmo en el
que decrece el número de partículas libres, o el valor final cuando ha finali-
zado la reacción. La medida del ensayo al final de la reacción puede emple-
arse para obtener una sensibilidad del nivel de nanogramos por mililitro; sin
embargo, se requiere un mayor tiempo de incubación.
Inmunoensayos con otras partículas
Se han desarrollado inmunoensayos de dispersión cuasi-elástica emplean-
do la medida del cambio en la respuesta a la distribución del tamaño de la par-
tícula (Yarmush. 1987). Esla técnica utiliza un haz de láser para medir la reduc-
ción en la media del coeficiente de difusión de las partículas como resultado
de la reacción inmune. Otros métodos miden la variación de anisotropía angu-
lar de la luz dispersada con el incremento del tamaño medio de la partícula.
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A 829

Figura 35-6. Patrones de hemaglutinación para detectar anticuerpos anti-I pallidum (A) e interpretación como positivo o negativo a la dilu-
ción linal del suero (6). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s.
Washington, DC. American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.]

Glóbulos rojos Reactivos Unión pero

del dolíanle bivalentes un aglutinación

Figura 35-7. Representación esquemática de un ensayo basado en la aglutinación autóloga de eritrocitos, empleando eritrocitos presentes
en la muestra como partículas. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for
the 1990s. Washington, DC American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
 830 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Panículas ,ic yciiiiiiKi inirocitosdco\cia Figura 35-8. Microgratía electrónica (x25.000) y propiedades
tísicas de las partículas de gelatina en comparación con los
eritrocitos de oveja. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz
GA[eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology
lor the 1990s. Washington. DC. American Society (or Micro-
biology. ASM Press. 1992. pág. 139, con permiso. |

Las partículas con diámetros parecidos a la longitud de onda consiguen una se ha descrito en el apartado Cinética de la reacción de antigeno-anticuer-
variación angular de la dispersión de la luz dependiente del tamaño. po, de la siguiente ecuación.

Resumen B/F = K([Ab].-B)

a

La hemaglutinación indirecta y la aglutinación de partículas de gelatina son

el eje Y es la relación B.'F. que es proporcional a la cantidad de anticuerpo libre
ensayos que, realizados en placas de microtiter, han sido muy populares en
[Abj de [Ab],-B, igual al antígeno libre [Ag). Así. la K, representa la pendiente
procesos de determinación cuantitativa y cualitativa de diversos analitos. 9
de la representación. En esta figura, la constante de afinidad K, es 8.1 x 10
Estos ensayos no requieren instrumentos adicionales ni un control estricto de
L'M para el anticuerpo especifico para la ciclosponna. Las emisiones radiacti-
la temperatura. Lo más importante es que estos ensayos garantizan una sen- ;:
vas, como los rayos gamma del l, se pueden medir en términos de cuentas
sibilidad igual o mayor que la del inmunoensayo enzimático convencional en
por minuto (CPM) utilizando un contador de centelleo gamma. Los radioisóto-
lo que se reliere a la detección de anticuerpos frente a agentes infecciosos.
pos más frecuentes y sus propiedades se muestran en la Tabla 35-3. La elec-
El látex como fase sólida proporciona unas importantes ventajas cinéticas,
ción de la sonda afecta considerablemente al protocolo del ensayo. Por ejem-
como un menor tiempo de ¡nmunorreacción. Por este motivo, ha sido posible Ia
plo, una de las sondas más utilizadas, el l , necesita un tiempo relativamen-
adaptar el látex para su uso en instrumentos sofisticados, aplicando principios
te corto para el conteo. pero no puede almacenarse mucho tiempo debido a
diferentes y dando como resultado un ensayo con una sensibilidad de unos 3 1
que tiene una vida media corta. Sin embargo, el tritio ( H) requiere un tiempo
órdenes de magnitud mayor que en los ensayos de inmunoprecipitación con-
mayor para el conteo. y por tanto incrementa la duración del ensayo. La mayo-
vencionales. El látex es susceptible de presentar interferencias de factores
desconocidos en las muestras. Para eliminar este problema, se han utilizado
varios absorbentes tanto en el reactivo como en el medio de incubación. La
gran ventaja del inmunoensayo de partículas es su simplicidad, ya que no
requiere la separación de los reactivos libres de los unidos.

RADIOINMUNOENSAYO

Origen
Desde que apareció la técnica del RÍA. el uso de radioisótopos como
sonda, que se desarrolló en primer lugar por Yalow y Berson (1959]. se ha
mejorado de una forma espectacular en cuanto a sensibilidad y precisión. Se
han introducido diversas variaciones del método en el laboratorio clínico. Hay
dos tipos principales de RIAs, competitivos y no-competitivos, que requieren
pasos de lavado para separar la sonda unida de la que permanece libre (con-
jugados). El ensayo competitivo sigue la ley de acción de masas, que espe-
cifica la reacción entre analitos y proteínas de unión, receptores y anticuer-
po. El tactor clave en la optimización del ensayo es la afinidad de unión del
anticuerpo. La representación de Scatchard de la relación entre anticuerpo
unido y libre, frente a la concentración del analito, se emplea frecuentemen- Ciclosponna (pg/ml)
te para evaluar la función del anticuerpo. La Figura 35-9 muestra la repre- Figura 35-9. Representación de Scatchard de las características de unión de anti-
sentación de Scatchard para la determinación de la ciclosponna. Tal y como a 9
cuerpos a la ciclosporina (K = 8,1 x 10 L'M).
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Tabla 35-3 Propiedades de los radioisótopos empleados como
sonda en los radioinmunoensayos
Actividad especifica
l25
da de los RÍA actualmente emplean el l para realizar el proceso de conjuga-
ción y mantener la actividad biológica de los reactivos. Un método muy utiliza-
l?5
do de conjugación de proteínas con l es el método de la cloramma-T (Hunter.
1962). La lirosina. en particular, posee una mayor reactividad con el yodato
debido a la presencia de un grupo hidroxi en la posición para del anillo aro-
mático. La señal puede medirse en términos de CPM como emisiones de
radiación gamma. A diferencia de las enzimas, el empleo de isótopos como
sonda, con un radio de Stokes pequeño, no suele afectar a la actividad anti-
génica, debido a la falta de alteraciones alostéricas cuando se conjugan isóto-
pos con antígenos pequeños (haptenos).
Principios y métodos del ensayo
Se han desarrollado varios métodos (exceso de antigeno) basados en la
unión competitiva (Ekins, 1960) a anticuerpos, entre antígenos con y sin sonda
(analitos presentes en la muestra), para una amplia gama de analitos. Un
método competitivo convencional se muestra en la Figura 35-10. En un princi-
pio, una cantidad conocida de antigeno acoplado a una sonda y el antígeno de
la muestra se mezclan y reaccionan con una cantidad constante de anticuerpo
unido a una fase sólida, como puede ser partículas de sefarosa o la cara inter-
na de tubos de plástico. Después de que la reacción inmune alcance el equili-
brio, la mezcla se lava para eliminar los conjugados que no han reaccionado y
se separan los antígenos del complejo inmunológico que permanece atrapado
en la fase sólida. El paso de lavado aparece como separación B/F {bound:
unido/free: libre). Aplicando el principio de la competilividad, la representación
del porcentaje de antigeno unido frente a la concentración logarítmica del ana-
lito produce la curva estándar que muestra la Figura 35-10. La representación
de CPM sobre la curva estándar nos da la concentración del analito.
Otro método que emplea anticuerpos se muestra en la Figura 35-11. El pri-
mer anticuerpo es específico para un determinado antígeno (analito) y reaccio-
831
na competitivamente tanto con el conjugado como con el antigeno. Entonces,
el complejo inmunológico es capturado por un segundo anticuerpo específico
para el primer anticuerpo, asociado a una fase sólida. Cuando el segundo anti-
cuerpo se asocia a una fase sólida fina, el complejo inmunológico de la segun-
da reacción puede separarse como un precipitado, del resto de las moléculas
que no han reaccionado. Para la determinación de un anticuerpo, el anticuerpo
unido a una sonda y el anticuerpo de la muestra reaccionan competitivamente
con el antígeno (analito) fijado a la fase sólida. Cuanto mayor sea la pendiente
de la curva estándar, más precisos son los datos que aporta. Los métodos com-
petitivos requieren cantidades menores de anticuerpo o antígeno (analito) que
los ensayos de tipo sandwich descritos más adelante. Los ensayos no compe-
titivos, originalmente demostrados por Miles (1968), han cobrado mayor popu-
laridad en los últimos tiempos.
Los ensayos radioinmunométricos (IRMA) o ensayos de sandwich (Fig. 35-12),
tienen una relación alternativa entre el analito y el anticuerpo. El ensayo competi-
tivo clásico consigue una respuesta inmunológica con una mínima cantidad de
anticuerpo, y el ensayo de sandwich emplea una gran cantidad de anticuerpo en
la fase sólida. La tecnología de los anticuerpos monoclonales ha hecho posible la
elaboración de grandes cantidades de anticuerpos específicos a un coste
moderado, permitiendo la explotación del ensayo de sandwich. El ensayo de
sandwich emplea un exceso estequiométrico de anticuerpo y es más sensible
que un ensayo competitivo. Cuando se elimina por completo el fondo, la sen-
sibilidad teórica última del ensayo de sandwich es de una molécula de analito,
lo cual es posible cuando la cantidad de anticuerpo utilizada en el ensayo se
acerca al infinito. Como se muestra en la Figura 35-12, el anticuerpo en la fase
sólida primero se une al antígeno (analito) de la muestra. Después de la sepa-
ración B'F, el conjugado reacciona con el antígeno (analito) fijado a la fase sóli-
da, y la señal se puede medir después de la eliminación de los conjugados
libres mediante un paso de lavado. Este ensayo requiere antígenos con más
de dos determinantes antigénicos. Cuando se emplean dos anticuerpos dife-
rentes (es decir, un anticuerpo asociado a la fase sólida específico para un
determinante antigéníco, y un anticuerpo conjugado específico para otro deter-
minante antigénico), el protocolo de ensayo puede simplificarse haciendo el
sandwich en un solo paso. Así, la fase sólida puede mezclarse con el antíge-
no de la muestra y con el conjugado simultáneamente. No se produce interfe-
rencia porque ambos anticuerpos, tanto el de la fase sólida como el conjuga-
do, son capaces de reconocer distintos determinantes antigénicos. En este
ensayo la señal generada es proporcional a la concentración del analito pre-
sente en la muestra, al igual que en el ensayo de sandwich en dos pasos.
Este método de ensayo se puede aplicar a la detección de anticuerpos con
un formato de ensayo que emplea antígeno en la fase sólida y antígeno aco-
 832 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

->Conccnir;icit>ii de analto

Figura 35-11. Principio de un ensayo de RÍA competitivo empleando un segundo anticuerpo para la separación B'F (unido/libre).

piado a una sonda. Para un formato en dos pasos, se puede emplear el antí-
geno en la fase sólida y un anticuerpo específico para el anticuerpo diana
acoplado a una sonda. Empleando el formato de sandwich, la sensibilidad del
ensayo es elevada (Espinosa. 1987). Un ejemplo es utilizar IRMA para la
determinación de la hormona estimulante del tiroides (TSH): el nivel de sen-
sibilidad del ensayo es inferior a 0.07 pU/ml de TSH, en comparación con
unas 0,7 iiU/ml de un ensayo competitivo convencional de antígeno asocia-
do a una sonda.
Resumen
Comparado con otros inmunoensayos, los RIAs resultan ventajosos por
varios motivos: 1) precisión y elevada sensibilidad, 2) facilidad en la conjuga-
ción del isótopo, 3) detección de la señal sin optimización y 4) estabilidad fren-
te a la interferencia ambiental del ensayo, entre otros. Las desventajas del
RÍA son la corta vida en almacén de los reactivos y la necesidad de protec-
ción frente a la radiactividad nociva. Además, como se discute más adelante,

Figura 35-12. Principio de un ensayo de RÍA de tipo sandwich empleando la fase sólida, también conocido como ensayo inmunorradio-
métrico (IRMA).
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A 833

Tabla 35-4 Comparación del radioinmunoensayo. el ¡nmunoensayo enzimàtico heterogéneo y el inmunoensayo enzimàtico homogéneo
Ensayo Pasos de la reacción inmune Pasos de la reacción Pasos para la detección
enzimàtica de la señal
Radioinmunoensayo
Muestra*
Reacción inmune con pasos de No necesarios Emisión radiactiva (rayos y)
Analito o Ab lavado para la separación
marcado
Inmunoensayo enzimàtico
heterogéneo
Muestra+
Reacción inmune con pasos de Reacción enzimàtica con Densidad óptica
Analito o Ab -Enzima lavado para la separación reactivos adiciónalos Fluorescencia
marcado Luminiscencia
Inmunoensayo enzimatico
homogéneo
Muestra*
La reacción inmune y/o sistèmica La reacción inmune y/o Densidad óptica
Analito o Ab se desarrolla en una sola solución, sistémica se desarrolla en Fluorescencia
—Enzima o coladores
marcado que incluye el reactivo para el una única solución que Luminiscencia
revelado de la serial enzimàtica incluye el reactivo para el
revelado de la señal
enzimática

los RÍA no pueden aplicarse a inmunoensayos homogéneos, debido a que las
señales de los isótopos no pueden modular las reacciones antígeno-anticuer-
po.
INMUNOENSAYO ENZIMÀTICO
Origen y clasificación
Los inmunoensayos cuantitativos que emplean enzimas como sonda se
desarrollaron como una alternativa a los radioisótopos (Engvall. 1971: Van
Weeman. 1971; Avrameas. 1971). Los más utilizados son el ensayo inmuno-
absorbente enzimático (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), el
EIA y la técnica del inmunoensayo de multiplicación enzimática (EMIT: enzy-
me-multiplied immunoassay technique), que es una marca registrada de
SYVACo. (D. Behring Inc., Cupertino, CA 95041) (Rubenstein, 1972). Esen-
cialmente, los EIA heterogéneos son similares a los RÍA, excepto que emple-
an enzimas como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homo-
géneos, eliminando los pasos de lavado para la separación B/F que de otro
modo son necesarios. La Tabla 35-4 compara las características de los EIA
homo y heterogéneos con los RÍA. Mejoras en los EIA han aportado muchos
formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad, simplici-
dad y precisión. Las ventajas y desventajas de los EIA se listan en la Tabla
35-5 (Nakamura, 1992).
Inmunoensayos enzimáticos heterogéneos
El principio de los ensayos de EIA heterogéneos es similar al de los RÍA.
excepto que es la actividad enzimática, no la radiactividad, la que se mide.
Los EIA requieren un proceso secundario para obtener señales mediante la
reacción catalítica de las enzimas. Como fase sólida para separar los conju-
gados libres de los unidos, pueden utilizarse placas de microliter, partículas
de plástico, tubos de plástico, partículas magnéticas y látex con filtros, entre
otros. El uso de pequeñas partículas magnéticas y de látex permite acortar el
tiempo de mmunorreacción, reduciendo asi el tiempo total que requiere el
ensayo. El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuvo marca-
do por la introducción de sustratos colorimétricos y fluorométncos, y más
tarde de suslralos quimioluminiscentes. que incrementan la sensibilidad de la
señal. Algunas de las enzimas más utilizadas en vanos EIA heterogéneos son
la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, la (5-galactosidasa, la glucosa
oxidasa. la ureasa y la catalasa. Las enzimas más utilizadas junto con sus
características aparecen en la Tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando
se utilizan enzimas puede determinarse por la tasa de recambio de cada enzi-
ma y por la selección de la medida de la señal, entre los que la quimiolumi-
niscencia es el método más sensible.
El lormato del ensayo de los EIA heterogéneos, al igual que los RÍA. se
puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (véase Fig. 35-14).
Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antigeno-
enzima (Fig. 35-13A). mientras que los ensayos no competitivos (exceso de
reactivo) incluyen los ensayos inmunométricos de sandwich de dos dianas y
los ensayos indirectos para medir anticuerpos (Figs. 35-13Sy Q. Los ensayos
inmunométricos de sandwich han aumentado su popularidad para la determi-
nación de antigenos como hormonas, marcadores tumorales. proteínas plas-
máticas y agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para la medida de anti-
cuerpos (Fig. 35-13C) se han adoptado para la detección de anticuerpos fren-
te a agentes infecciosos (p. ej., VIH. HBV. HCV) y autoanticuerpos
Tabla 35-5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo
enzimático
A. Ventajas
t Se pueden desarrollar ensayos sensibles gracias al efecto de
amplificación de las enzimas.
2 Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una
larga vida de almacenaje
3. Se pueden desarrollar múltiples ensayos simultáneamente.
4 Se puede desarrollar una amplia variedad de configuraciones
del ensayo
5. El equipamiento no es necesariamente caro y está
ampliamente disponible.
6 No existen riesgos radiactivos durante el mareaje ni el
desecho de los residuos.
B. Desventajas
1. La medida de la actividad enzimática puede ser más compleja
que la medida de la actividad de algunos tipos de
radioisótopos
2. La actividad enzimática se puede ver afectada por algunos
componentes del plasma
3. Los ensayos homogéneos, actualmente, poseen una
J
sensibilidad de 10' M y no son tan sensibles como los
radiommunoensayos.
4. Los EIA homogéneos para moléculas proteicas grandes se
han desarrollado, pero requieren reaclivos inmunoquímicos
compiojos
EIA = inmunoensayo enzimático
De Nakamura RM Kasahara Y Heterogeneous enzyme immunoassays En
Nakamura RM. Kasahara Y Rechnitz GA (eds): Immunochemical Assays and
Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC. American Society lor
Microbiology. 199?. pags 149-167, con permiso
 834 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 35-6 Características de las enzimas típicas empleadas como sonda en los inmunoensayos enzimáticos
Enzima f5-galactosidasa Fosfatasa alcalina
Características Peroxidasa (EC 1.11.1.7) (EC 3.2.1.23) (EC 3.1.3.1)
Fuente Rábano E. coli Intestino bovino
Tamaño molecular (daltons) ca. 40.000 ca. 530.000 140 000
Actividad específica 250 U/mg 600 U/mg 1.000 U/mg
Tasa de renovación" 10 000 318000 250 000
Medida de la enzima Colorimetria, fluorimetria. Colorimetria, fluorimetria, Colorimetria, fluorimetria,
luminometria luminometría luminomelria
Medida de alta sensibilidad Luminometría Fluorimetria Luminometria
Método de mareaje de la enzima Oxidación del periodato Método de la dimaleimida, reactivo Método del glutaraldohído,
(método de Nakane) de entrecruzamiento' reactivo de enlrecruzamiento
' Número de moléculas del sustrato producidas por una molécula de enzima en una reacción de un minuto; número de moléculas/MUÍ
1
El reactivo contiene grupos químicamente reactivos como el maleimida y el succinimida.

¿ >

Un EIA heterogéneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos:
1. La fase sólida unida a los reactivos se mezcla con el analito. independiente-
mente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo.
2. Después de la adición del conjugado y la incubación, hay unos pasos de
lavado con una solución tamponada que contiene un detergente, uno o
dos pasos después de la inmunorreacción. La reacción inmunológica debe
alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable.
3. La fase sólida, con el complejo inmune que contiene el antígeno conjuga-
do a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con
la solución de sustrato enzimático.
4. La reacción enzimática se detiene (no es necesario en el ensayo de tasas)
y el producto de la reacción se mide con varios detectores dependiendo
del sustrato empleado.
Ensayo enzimático colorimétrico
En este ensayo, la reacción enzimática se realiza utilizando sustratos cro-
mogénicos para desarrollar un color mediante la reacción catalítica princi-
pal. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano, catalizando el ABTS [sal de dia-
monio de 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar
2 2

un color verde, y la fosfatasa alcalina, especifica para el p-nitrofenil fosfato

para dar un color amarillo. Ambas enzimas son los tipos más utilizados en
los inmunoensayos enzimáticos colorimétricos. Un espectrofotómetro se uti-
liza para medir la densidad óptima del cromógeno resultante. Existen diver-
sos instrumentos posibles que permiten medir la densidad óptica en tubos
o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automati-
zado que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresión de los
resultados, hasta instrumentos manuales más sencillos. Cuando la reacción
EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (método de transferen-
cia Western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes
insolubles. Un test de embarazo para la hCG en un formato de inmunoen-
sayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados de la benzidina
que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfato que reac-
cionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El
precipitado de color que se acumula en la fase sólida por la acción de la
enzima puede detectarse a simple vista. Teóricamente, la medida de la den-
sidad óptima está limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determina-
ción de la densidad óptica de analitos que requieren un amplio rango puede
resultar problemática, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado
y fase sólida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo
sandwich.

Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los
inmunoensayos no isotópicos, han sacado a la luz diversas desventajas de
los RIAs, como son los residuos radiactivos, radiólisis de los analitos marca-
l25
dos, y la corta vida media del l. Ishikawa (1989) desarrolló un EIA ultrasen-
sible que puede detectar 3 fmoles de una IgG específica. Para alcanzar este
nivel de sensibilidad, se requieren varios pasos tediosos, como la transferen-
cia del inmunocomplejo de una primera fase sólida a otra distinta para redu-
cir las señales de fondo.

Inmunoensayo enzimático fluorescente

L- ENSAYO de anticuerpo
Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimático (EIA) empleando la fase
sólida: (A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.
Los EIA fluorescentes son idénticos a otros EIA excepto en que utilizan sus-
tratos fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluoróforo se genera por la
reacción enzimática. Después de la excitación del fluoróforo a su longitud de
onda de excitación óptima, se emite luz a una longitud de onda característica.
Instrumentos como un fluorímetro requieren una fuente de suministro de la luz
de excitación y un fotomultiplicador como detector de la emisión de flúores-
 CAPÍTULO 35 INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A 835

AMI'I'I) AMIM) Interim diario ( I ESTADIO SI

Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimioluminiscente para la detección de la fosfatasa alcalina (ALP).
La eliminación hidrolítica del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrónico iniciada químicamente (CIEFL:
chemically initiated electron exchange lummiscence) con la descomposición del AMPPD mediante la liberación de dioxetano fenolato (AMP-
D) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxetano tiene lugar mediante la formación del intermediario de trans-
ferencia de carga (CT) y la consiguiente rotura del peróxido cíclico. Tiene lugar una liberación de energía con emisión de luz.

cencía. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en
la muestra. Estas sustancias aumentarían la señal de fondo, lo cual puede
interferir en la sensibilidad del ensayo. Así. se debe prestar atención a la elec-
ción de sustratos para los EIA para evitar estos factores. Comparado con los
EIA colorimétricos, los ensayos fluorescentes generan una intensidad de
señal que es al menos de un orden de magnitud mayor.
Inmunoensayo enzimático quimioluminiscente
Los inmunoensayos enzimáticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean
sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se
emplean como sonda La reacción enzimática quimioluminiscente genera luz.
similar a la bioluminiscencia. e implica el uso de sustratos naturales como la
luciferin-adenosina trifosfato (ATP). Durante los últimos 20 años, se ha pres-
tado mucha atención a la aplicación de la quimioluminiscencia en los inmu-
noensayos. y se ha desarrollado una variedad de sistemas que combinan
enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados del luminol
con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano para la fos-
fatasa alcalina, consiguen inmunoensayos muy sensibles. Estos ensayos son
efectivos como herramientas en el diagnóstico práctico. La reacción de oxi-
dación enzimática de análogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho
en los CL-EIA. El empleo de peroxidasa con H,0- es un método frecuente que
se puede cambiar por una enzima productora de H.O, como la glucosa oxi-
dasa o la uncasa. El descubrimiento de los potenciadores por parte de Thorpe
(1985) para la quimioluminiscencia basada en luminol mejora notablemente la
sensibilidad del ensayo. Los potenciadores incluyen derivados del fenol y
compuestos aromáticos. Por ejemplo, la luminol-peroxidasa con p-iodofenol
como potenciador consigue un incremento de la emisión de luz de unas 2.800
veces en una mezcla de reacción optimizada. Este ensayo puede detectar la
TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las reaccio-
nes oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por múlti-
ples factores que causan un aumento de las señales inespecíficas de fondo
(ruido).
Bronstein (1989a) desarrolló un sustrato quimioluminiscente para la fosfa-
tasa alcalina que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo
sustrato se conoce como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano-
3,2'-triciclo-[3.3.1.1]decano]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de
adamantilo. No requiere moléculas adicionales para la emisión de luz quimio-
luminiscente, a diferencia del luminol, que requiere compuestos oxidativos
externos a las moléculas de luminol. AMPPD es una molécula nueva que
constituye un sustrato completo porque está compuesta por un grupo ada-
mantilo como estabilizador de toda la molécula, la unión de dioxetano como
fuente de energía, el éster de fosfonlo como diana de escisión para la enzi-
ma, y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola
molécula. La estructura de la molécula y el proceso de reacción para la gene-
ración de luz se muestran en la Figura 35-14. La escisión del enlace fosfoes-
térico del AMPPD por la fosfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por
intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically ¡nitiated
electrón exchange luminiscence). mediante la liberación del grupo dioxetano
rico en electrones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda máxi-
ma de 477 nm se puede detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuan-
tas horas, dependiendo de la concentración de sustrato. El sistema de ensa-
yo de la fosfatasa alcalina con el AMPPD tiene una sensibilidad de menos de
2
10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka. 1991).
El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que se
usa como sonda enzimática. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instru-
mento totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarro-
llo de sistemas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sen-
sibles. Se usan partículas férricas de 0.3 pm de diámetro como tase sólida
para acortar el tiempo de mmunorreacción a unos 30 minutos y para propor-
cionar una mayor superficie de inmunoabsorcíon. La relación entre la señal
quimioluminiscente y la concentración de analitos es lineal hasta unos siete
órdenes de rango dinámico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishizono, 1991) era
10 veces mayor que la de un RÍA convencional cuando se ensayó la AFP; se
detectó un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos.
Así. los nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejo-
ra sobre los RÍA en términos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza
del proceso y están ganando en popularidad en el mercado.
Inmunoensayos enzimáticos homogéneos
Origen
Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es
diseñar instrumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogé-
neos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no
requieren pasos de lavado complicados, como los que requieren los EIA hete-
rogéneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los EIA
homogéneos porque la actividad enzimática se puede modular fácilmente
cambiando los factores presentes en el microambiente de la reacción Ag-Ab.
Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radioisótopo como
señal. Actualmente, los EIA homogéneos son menos sensibles que sus equi-
valentes heterogéneos. Los EIA heterogéneos convencionales tienen una
sensibilidad equivalente a la de los RÍA en muchas aplicaciones, mientras que
los EIA homogéneos (Nakamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o
dos órdenes de magnitud inferior. Los EIA homogéneos pueden necesitar
reactivos inmunoquímicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rápi-
dos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos convencionales. Hay
varios tipos de EIA homogéneos En cada uno de estos ensayos, la interac-
ción antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda aco-
plada a la enzima en presencia de sustrato. La modulación de la actividad
enzimática refleja el grado de reacción inmunoquímica. En la Tabla 35-7 apa-
rece una lista de las características de los EIA homogéneos típicos. Los EIA
homogéneos se pueden clasificar en ensayos de unión competitivos o no
 836 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

Tabla 35-7 Clasificación y características de un inmunoensayo enzimàtico homogéneo típico

Nombre y tipo de ensayo Conjugado Tipo de modulación
Competitivo'
EMIT Antigeno con hsozima. G6PD Inhibición alosténca
SLFIA Antigeno con sustrato Inhibición alosténca
ARIS Aniígeno con grupo prostético Inhibición alosténca
Inmunoensayo de canalización enzimàtica Antigeno con G6PD y hexocinasa Facilitación mediante proximidad
Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina Antigeno con avidina Inhibición alostérica
CEDÍA Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa Inhibición aloslérica
No competitivo'
Inmunoensayo de anticuerpo híbrido Anticuerpos híbridos específicos para el Inhibición alostérica
antígeno y el inhibidor
Inmunoensayo de unión proximal Anticuerpo con G6PD y hexocinasa Cascada de suslratos por proximidad
EIHIA Anticuerpo con amilasa Inhibición alostérica
Anticuerpo con |J-galactosidasa y anticuerpo Electo de cargas
Inmunoensayo enzimàtico mejorado frente al succinil
Anticuerpo con peroxidasa Estabilización
AEST
• La negrita indica que el nombre de la enzima está escrito y la enzima descrita en detalle en el texto
G6PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the
s 1990s Washington, DC, American Society lor Microbiology. 1992a. pags. 169-82. con permiso.

competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos sin embargo, la unión de anticuerpos específicos para haptenos a su ligando
acoplados a una enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibición de la actividad enzimática. Los haptenos libres presentes
matos de ensayo, el antígeno (analito) se puede conjugar al sustrato o a un en la muestra o en el estándar liberan esta inhibición compitiendo por la unión
grupo prostético de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unión no com- a los anticuerpos. Asi, la actividad enzimática es proporcional a la concentra-
petitivos emplean un conjugado compuesto por un anticuerpo acoplado a una ción de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima
enzima. De entre los distintos tipos de métodos mencionados, se presta espe- induciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la activi-
cial atención a cinco EIA homogéneos. dad enzimática (Rowley, 1975). La excepción al mecanismo de inhibición es
el ensayo EMIT para la tíroxina, que emplea la malato deshidrogenasa. En
Inmunoensayo de multiplicación enzimática este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenasa es inactivo enzi-
máticamente, pero pasa a una conformación activa cuando se une al anti-
EMIT, el primer EIA homogéneo, fue desarrollado por Rubenstein (1972). cuerpo anti-tiroxina (Ullman, 1979). Se cree que la tiroxina conjugada inhibe
El sistema de EMIT está esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 . En el EMIT, la la enzima mediante su unión al dominio catalítico, aumentando asi la K„ "apa-
conjugación de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimática; rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a la tiroxina del

Forma inactiva del

compi ej o enzimàtico

Enzima

Forma activa del con jugado

enzima-analito

Figura 35-15. Diagrama del sistema de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT) La actividad de una enzima que actúa como
sonda está inhibida por la unión del anticuerpo con el antigeno (analito) conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno.
Como enzimas se suelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensayo, la actividad enzimática es proporcio-
nal a la concentración de analito. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Technology for
the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA 837

Haz de
excitación
Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (SLFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El
sustrato, la |>galactosilumbeliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluorescente El sustrato puede ser escindi-
do por la enzima (1 gaiactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno reacciona con
un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisión del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la con-
centración del antigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de lluorescencia. (De Nakamura RM. Kasahara Y.
Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Society tor Microbiology
ASM Press, 1992. con permiso.)

dominio catalítico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa-
6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las más útiles porque tienen
menos probabilidad de verse afectadas por componentes del suero. Estos
ensayos generalmente miden drogas a concentraciones de miligramos por
litro. Sin embargo, el ensayo de la digoxina posee un limite de sensibilidad
muy inferior, en un rango de 0,8 a 2 ug'l.
Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado
El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substrate-
labeled tluorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un
sustrato fluorogénico característico, el umbeliferil (i-galactósido, unido a un
antigeno (analito). El producto fluorescente que se produce por la acción de
la |Vgalactosidasa es la umbelilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede
actuar sobre el complejo sustrato-antigeno cuando reacciona con un anti-
cuerpo especifico. El antigeno libre (analito) presente en la muestra compite
con el antigeno conjugado con el sustrato para formar el complejo inmunolo-
gía) (Fig. 35-16). La concentración del antigeno en la muestra es proporcio-
nal a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescente resultante. Se
puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y también para pro-
teínas como la IgG y la IgM. Una desventaja de este método es que no se uti-
lizan las propiedades de amplificación de la enzima, y por tanto, el sistema de
ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentración molar de
,c
analito de 10"' a 10 .
Inmunoensayo de reactivación de la apoenzima
El inmunoensayo de reactivación de la apoenzima (ARIS) es un ensayo
homogéneo desabollado por Morris (1981) empleando el grupo prostético, que
consiste en un dinucleótido de flavm adenína (FAD), conjugado al antigeno (ana-
lito) y la apoenzima glucosa oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17,
el antigeno (analito) y una cantidad constante del conjugado analito-FAD. com-
piten por una cantidad limitada del anticuerpo específico. En el equilibrio, el nivel
de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) presente
en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, pero
no con la que está unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucosa
oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. La
enzima activa se genera en este proceso, y además, se ha incluido un mecanis-
mo de amplificación dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para anali-
zar la presencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que
emplea el conjugado de FAD. se ha adaptado rápidamente a la medida de pro-
teínas de elevado peso molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985).
y para otros haptenos como la fenitoma o diversas hormonas.
Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática
El inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). desarrollado
por Ashihara (1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un
sustrato insoluole. Este ensayo es el más apropiado para la determinación de
antígenos (analitos) grandes. El EIHIA puede ser homogéneo porque el comple-
jo inmunológico del conjugado con un antígeno grande bloquea la reacción enzi-
mática con el sustrato sólido (Fig. 35-18). La u-amilasa se ha utilizado como
sonda enzimática para la detección de ferritína y AFP. La reacción inmune del
analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede alcanzar su máximo en
unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unión no competitiva
requiere un tiempo de incubación menor para alcanzar un nivel de detección
sensible. Empleando este método, el rango de medida de la femtina en suero es
de 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextra-
nasa como enzima alternativa (Nishizono, 1988). También se ha aplicado el
EIHIA en un formato sobre película seca (Ashihara. 1991). La película seca con-
siste en tres capas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para
la reacción inmunológica y enzimática. una zona de barrera, y una zona de reve-
lado de color. Se utiliza un inhibidor especifico de la amilasa humana presente
 838 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Forma activa

Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivación apoenzimática (ARIS). Se emplea el antigeno unido al dinucleótido de tlavin adenina (FAD). La
apoenzima es la apoglucosa oxidasa, que requiere FAD como cofactor para su actividad. En el ensayo, la concentración de antigeno (anali-
to) es proporcional a la actividad enzimática generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and
Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

en suero para prevenir el londo que puede dar el suero. El ensayo para la detec-
ción de la proteína C reactiva del suero (CRP) se completa en 6 minutos, sim-
plemente aplicando la muestra sobre la superficie empleando instrumental quí-
mico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sigue siendo inadecuada
para su aplicación en analitos como pueden ser los marcadores tumorales.
Inmunoensayo mediante clonación de donadores
de enzimas
El inmunoensayo mediante clonación de donadores de enzimas (CEDÍA:
cloned enzyme donor immunoassay) se consiguió por primera vez mediante la
aplicación de la tecnología de ADN recombinante a los inmunoensayos homo-
géneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de
sintetizar una proteína de p-galactosidasa dentro de un polipéptido de gran
tamaño (una enzima aceptora [EA]) y de un polipéptido pequeño (una enzima
donante [ED]). Las EA y las ED se reconstruyen para formar tetrámeros con
actividad enzimática. En el ensayo (Fig. 35-19), un hapteno antígeno (analito)
está unido a la ED. y el anticuerpo específico para ese analito se usa para inhi-
bir el ensamblaje espontáneo de la enzima activa. Los antígenos (analitos) pre-
sentes en el suero del paciente compiten con los analitos en el conjugado de
analito-ED por la unión al anticuerpo, modulando la cantidad de |í-galactosi-
dasa activa que se forma. La señal generada por los sustratos de la enzima es

Forma activa

Forma inactiva

Figura 35-18. Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de
Chaetomium gracile. conjugada con el anticuerpo específico para un antígeno de alto peso molecular. El antígeno de elevado peso molecu-
lar puede ser la ferritina o la a-fetoproteina. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reaccionado con el
antígeno especifico. La forma activa de la enzima puede reaccionar con un sustrato insoluble. La concentración de antigeno es directamen-
te proporcional a la actividad enzimática de la reacción del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press. 1992, con permiso.)
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A 839

Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimáticos clonados (CEDÍA). Los aceptores de enzimas se asocian con los donadores de enzi-
mas para formar un tetrámero de p-galactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociación del aceptor enzimático con el conjugado de anti-
geno-donador enzimático. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the
1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)

directamente proporcional a la concentración de analito presente en el suero
del paciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimétrico que no
requiere pretratamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es
apropiado para su uso en analizadores químicos automatizados.
Resumen
Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antígeno-anticuerpo,
incluyendo aquellos que implican a proteínas séricas, hormonas, drogas,
otros antígenos y anticuerpos dirigidos frente a patógenos. Los EIA hetero-
géneos que emplean sustratos cromogénicos pueden tener una sensibilidad
comparable a la de los RÍA, y han ganado en aceptación para su aplicación
en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogéneos emplean sustratos
sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeñas partículas
como fase sólida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos
de 1 pg'ml de analito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los
RÍA. Además, la manipulación del ensayo se encuentra muy simplificada en
los instrumentos totalmente automatizados. En comparación con los EIA
heterogéneos, los EIA homogéneos poseen ciertas limitaciones en cuanto a
sensibilidad, rango de aplicación y su aplicación en analitos de gran tama-
ño. Además, la elevada señal de fondo (ruido) y la relativamente baja señal
del ensayo son inevitables debido a la eliminación de los pasos de lavado
para separar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogéneos son
ventajosos porque están basados en un formato sencillo de ensayo y se
pueden adaptar a la instrumentación automática preexistente. En este
momento, los EIA heterogéneos con instrumentos totalmente automatiza-
dos, siguen siendo la mejor elección en cuanto a sensibilidad y simplicidad,
y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el uso de
radioisótopos.
tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se
encuentran ahora muy establecidos en los laboratorios de anatomía patoló-
gica. Durante los últimos años, se han desarrollados muchos procedimientos
de FIA para detectar concentraciones de drogas, hormonas y una amplia
variedad de proteínas y polipéptidos (Nakamura. 1992a). Al principio de su
desarrollo, los FIAs analíticos se vieron dificultados por el descenso de la
sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo presente en las muestras bio-
lógicas. Gradualmente, la sensibilidad de los métodos fluorimétricos fue
mejorando, y se hizo posible la detección de analitos a concentraciones de
15
10 M. También se consiguieron avances gracias a la mejora de la instru-
mentación y la introducción de sustratos únicos con unas reacciones inmu-
noquímicas y enzimáticas más óptimas.
La selección del fluorocromo que se va a emplear como sonda es impor-
tante. La sonda debería ser estable y debería poseer un coeficiente de extin-
ción molar y rendimiento cuántico elevados. También debería emitir en longi-
tudes de onda apropiadas sin interferir con las reacciones del ligando con su
anticuerpo. Cuando se irradian la mayoría de los fluoróforos o moléculas fluo-
rescentes con una longitud de onda apropiada, un electrón de la molécula
sulre una transición al estado excitado. A medida que el electrón vuelve a su
situación inicial, se libera energía física en forma de un fotón de menor ener-
gía (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de fluo-
rescencia muestra una longitud de onda de máxima emisión, característica de
un determinado compuesto fluorescente. Una de las sondas típicas, el isotio-
cianato de fluoresceína (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns
entre excitación y emisión, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio)
presentan una fluorescencia retardada con un intervalo de varios cientos de
nanosegundos. Los diversos FIA se pueden clasificar en: 1) heterogéneos y
homogéneos: 2) de ligando o anticuerpo marcado; 3) competitivos o no com-
petitivos, y 4) de fase sólida o no sólida. Se discutirán los métodos más
empleados.

INMUNOENSAYO FLUORESCENTE
Origen y clasificación
Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluores-
centes como sondas inmunoquímicas para detectar antigenos en secciones
Inmunoensayo fluorescente heterogéneo
Los protocolos de FIA heterogéneos incluyen un paso de lavado para sepa-
rar las sondas fluorescentes unidas de las libres. El procedimiento de este
ensayo es similar al de los inmunoensayos enzimáticos heterogéneos y los
 840 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
radioinmunoensayos. La mayoría de los ensayos comerciales disponibles
emplean un sistema con el antígeno unido a una lase sólida o un anticuerpo.
El ensayo puede o no ser competitivo, una propiedad que comparte con los
RIAylosEIA.
Método fluoroinmunométrico
El analito reacciona en solución con un exceso de anticuerpos marcados.
Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antígeno unido a
una tase sólida. La matriz de tase sólida se lava y la intensidad de fluores-
cencia se relaciona inversamente con la concentración de analito. Este méto-
do es adaptable para el ensayo de haptenos y proteínas complejas. El FIA en
fase sólida se desarrolló para el análisis serológico de anticuerpos trente a la
rubéola, toxoplasmosis, antígenos víricos y anticuerpos antinucleares. Los
métodos de FIA heterogéneos para la determinación de antigeno se desarro-
llaron para proteínas séricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Corti-
sol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogéneos es
la reducción significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes pre-
sentes de forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminación
física de los tactores de interferencia en el paso de separación.
Ensayo inmunofluorimétrico por partición radial
En los mmunoensayos por partición radial, se emplea una cromatografía
radial y el ensayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982).
El procedimiento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos
analitos presentes en el suero (Rogers, 1986).
Fluoroinmunoensayo en tiempo real
Esta metodología hace uso de una instrumentación especial y de sondas
fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el
uso de sondas fluorescentes que presentan una fluorescencia retardada con
un período de tiempo de unos 100 ns o más entre la excitación y la emisión.
Debido a que la mayoría de las sustancias responsables de la fluorescencia
de fondo poseen un periodo de decaimiento corto, la medida de la fluores-
cencia retardada reduce significativamente los efectos de la fluorescencia de
fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiempo real, un instrumento
especial que produce pulsos rápidos de luz que excitan al fluoróforo. La fluo-
rescencia se mide un poco después de la excitación. Así, el efecto del fondo
inespecífico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartar-
se (Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluoróforos que presentan fluorescencia
retardada y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los
siguientes:
1. Derivados pirénicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns.
2 Algunos metales raros quelados que poseen un periodo de decaimiento
3
muy largo de casi 50 ps a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario
1 3
(Sm ') y terbio (Tb ).
Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir
muchos analitos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.
Inmunoensayo fluorescente homogéneo
Por definición, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogéneas.
No requieren la separación de los conjugados unidos y libres y. normalmen-
te, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Los FIA
homogéneos también poseen la ventaja de ser rápidos Sin embargo, cuan-
do se comparan con los ensayos heterogéneos, presentan ciertas desventa-
jas. Los FIA homogéneos tienen una sensibilidad limitada de aproximada-
10
mente 10 molar con una instrumentación estándar. Pueden existir impure-
zas marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos
requieren un antigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros,
y una instrumentación especial para alcanzar una mayor sensibilidad.
Ensayo de polarización de la fluorescencia
Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un
solo plano. Cuando se observa desde un ángulo recto con respecto al haz
de excitación de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en
solución emiten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de pola-
rización de la fluorescencia fue aplicado por primera vez a los procedi-
mientos de inmunoensayo por Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada
que se transmite a través de la muestra puede excitar la sonda fluores-
cente independientemente de su unión al anticuerpo. Sin embargo, como
se muestra en la Figura 35-20. el movimiento térmico aleatorio da lugar a
que pequeñas moléculas que contienen un hapteno se muevan libremente
en la solución perdiendo su orientación polarizada. Cuando el antígeno
sondado se une a un anticuerpo con una masa molecular superior a los
160 kDa, el movimiento molecular se reduce lo suficiente como para
aumentar la señal polarizada.
Estudios que emplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuer-
pos no detectaron cambios en la polarización al mezclar antígeno y anti-
cuerpo marcado, aunque la reacción inmune hubiese tenido lugar. Este mé-
todo es el más útil para la medida de antigenos pequeños y haptenos (Jol-
ley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ensayo de
muchas drogas y fármacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL).
Desarrollaron un analizador de nueva generación, el IMx. para medir molé-
culas de gran tamaño molecular como los marcadores tumorales. hormo-
nas y antígenos relacionados con infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988).
Combinaron dos principios en el ensayo, la polarización de la fluorescencia
y el inmunoensayo enzimálico con microparticulas (MEIA). La demanda de
capacidades de acceso directo impulsó a Abbott a desarrollar un analizador
de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automatizado, denomi-
nado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios clíni-
cos (Smith, 1993).
Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia
de excitación
El método de transferencia de la fluorescencia de excitación (FETI)
(UHman, 1976) emplea dos sondas, la fluoresceína como donador de fluo-
rescencia y la rodamina como aceptor. El ¡sotiocianato de fluoresceína
(FITC) tiene un máximo de emisión de 525 nm y la tetraetilrodamma
posee un fuerte pico de absorción a 525 nm. Asi. cuando el antigeno mar-
cado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produ-
ce un apagamiento (quenching) de la lluorescencía del FITC. Este fenó-
meno implica una transferencia de energía de una sonda electrónica-
mente excitada a una sonda aceptora. La tasa de transferencia de la
energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia
entre las moléculas donadora y aceptora. Para que se produzca una
reducción apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia
entre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este método resul-
ta útil para el ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multi-
valentes. Porciones separadas de un anticuerpo especifico se marcan
con fluoresceína y rodamina. La mezcla de anticuerpos marcados con
fluoresceína y rodamina reduce la intensidad de señal de la fluoresceína
ajustando la proporción y la cantidad de donador y aceptor para que pue-
dan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energía.
Estos problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluo-
rescentes. Se han conseguido mejoras en el método FETI usando un
marcador fluorescente como el criptato trisbipiridínico de europio (III)
3
[Eu ] como donador y un fluoróforo como la aloficocianina como aceptor
(Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios poseen un
elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm
transfiere energía a través de una molécula aceptora a una excitación de
620 nm y finalmente emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en
tiempo real. Mathis (1993) ha desarrollado la transferencia de energía
mediante la resonancia de fluorescencia (FRET) empleando un metal
quelante de criptatos y lo ha aplicado a la detección de AFP y del antíge-
no carcinoembriónico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedox.
Francia) desarrolló un inmunoensayo homogéneo automatizado,
KRYPTOR. para la detección de marcadores tumorales como el CEA. CA
19-9. CA 125 y AFP empleando la emisión del criptato amplificada en
tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP era de 0.25 ng.'ml con
nueve minutos de incubación
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A 841

Baja p o l a r i z a c i ó n

Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluorescencia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlígeno, el conjugado marcado con una
molécula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamaño molecular de más de 160 kDa. la rotación molecular del F unido se
ve reducida y se mantiene la polarización 8. en la presencia de antígeno. hay menos conjugado unido ai anticuerpo, de modo que puede
rotar libremente en la solución, dando lugar a una disminución de la señal polarizada.

Inmunoensayo de fluorescencia protegida
En este ensayo (Nargessi. 1979). el antígeno proteico se marca con fluo-
resceína y a continuación se hace reaccionar con un anticuerpo específico
para el antígeno. El anticuerpo especifico inhibirá estéricamente la reacción
de un segundo anticuerpo específico para la fluoresceína. que funciona
absorbiendo la fluorescencia de la fluoresceína cuando se une al fluoróforo.
La habilidad del anticuerpo específico para la fluoresceína de interaccionar
con la fluoresceina cuando está unida a la superficie del antigeno se ve dis-
tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnóstico práctico, y sus
características se describen a continuación
Ensayo quimioluminiscente usando esteres de
acridinio como marcadores
En este método (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se con-
jugan directamente con moléculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden
reaccionar oxidativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para produ-
¿

minuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de concentración
de anticuerpos o de antígenos (analtos) en un sistema homogéneo.
INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE
Origen
Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda moléculas
que generan quimioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol.
esteres de acridinio, o derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio
;
[Ru(bpy).'i con tripropilamina (TPH) para la electroquimioluminiscencía.
Básicamente, el método del ensayo no difiere del de los inmunoensayos hete-
rogéneos. RÍA y FIA. La generación de luz por derivados del luminol requiere
OH iHfi. como iniciador químico, o H,0 con la peroxidasa como iniciadores
;
cir intermediarios muy energéticos que se descomponen en el fragmento exci-
tado, generando luz. La emisión de luz por parte de los esteres de acridinio
es muy rápida, en unos 5 a 10 segundos después del inicio de la reacción de
oxidación. La quimioluminiscencia de tipo flash, como se conoce este proce-
so, posee una relación entre el espectro de emisión y el tiempo de reacción
con una pendiente mucho más acusada que la quimioluminiscencia de tipo
resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es
mayor que la de un RÍA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres
de acridinio y la estabilidad de los conjugados con proteínas durante periodos
de almacenaje se han mejorado mediante la modificación de la molécula y la
química de la conjugación. Esta tecnología probablemente aporte mejoras
para los ensayos de algunos haptenos y de hormonas.

de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridinio estimulados Inmunoensayo electroquimioluminiscente

químicamente con OH H O muestran un rendimiento cuántico quimiolumi-
niscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras moléculas
quimioluminiscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998).
Las sondas de compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimica-
mente en la superficie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensa-
yo homogéneos. Tanto los CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec-
El ECLIA emplea compuestos electroquímicos como sondas que generan
luz electroquímicamente, asociada al ciclo reactivo de la reacción de oxida-
ción-reducción. Con la optimización de las soluciones de reacción, la selec-
ción del método de conjugación apropiado y el desarrollo de compuestos
2-
como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar la tecnología quimiolumi-
niscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991).
 842 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Proteína
Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un éster de acridinio basado en la descomposición oxidativa.
2
El Ru(bpy), * tiene un sitio de reacción para la conjugación de analitos
2
usando un reactivo de activación como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado
con los anticuerpos, se puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para
moléculas grandes. El conjugado genera luz en la superficie de electrodos
3
de oro. El Ru(bpy), - en una fase sólida y el TPA se oxidan en la superficie
1
de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA ', respectivamente. El TPA-'
3
pierde electrones de forma espontánea. El Ru(bpy) - puede generar una
3 temas de ensayo más sensibles capaces de detectar analitos presentes en
2
emisión de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado basal
a través de una reducción con TPA'. La eficacia de generación de la luz
(rendimiento cuántico) depende de la proximidad entre el electrodo y el
conjugado, y por tanto, de la difusión del conjugado. Los conjugados libres
pueden generar más luz que los conjugados fijados a una fase sólida como
resultado de una reacción inmune. Esto permite un acceso fácil al formato
de ensayo homogéneo, pero un ruido de fondo relativamente alto interfie-
re con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otros ensayos homogé-
neos. El protocolo de ensayo para la determinación de analitos es el
siguiente: microparticulas magnéticas cubiertas de anticuerpo como fase
sólida se mezclan con la muestra para permitir la reacción inmune.
Después de lavar para separar los conjugados libres de los unidos, una
solución con la fase sólida se introduce en un detector que posee un elec-
trodo para medir la quimioluminiscencia. El limite de detección de un
ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y de 0,4 ng/ml
para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra ven-
taja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la detección de la señal
que los FIA y otros CLIA.
AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN
DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO
Sistemas de ensayo homogéneos
A pesar de que muchos inmunoensayos homogéneos se han desarrollado
para protocolos manuales descritos en este capítulo, la mayoría de ellos no
han sido automatizados todavía. Para el método EMIT, se pueden adaptar
analizadores químicos genéricos automatizados (Boyd, 1985). Algunos ins-
trumentos están disponibles para los inmunoensayos fluorescentes homogé-
neos, pero estos sistemas no son intercambiables entre sí. El sistema CIS Bio
KRYPTOR se ha desarrollado con características especiales, incluyendo el
uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un método de dos
longitudes de onda para la corrección interna del estándar de intensidad de
fluorescencia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensi-
bilidad del límite de detección.
Sistemas de inmunoensayo heterogéneos
Hasta el principio de los años 80, la mayoría de los inmunoensayos hete-
rogéneos se hacian de forma manual. Entonces Boehñnger-Mannheim (que
se fusionó con Roche Diagnostics en 1998) desarrolló un analizador de acce-
so directo totalmente automatizado, el ES-600, basado en los inmunoensayos
enzimáticos colorimétricos que empleaban la peroxídasa de rábano como
enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compañías trataron de des-
arrollar sistemas de inmunoensayo enzimático totalmente automatizados, que
eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antígenos aso-
ciados con el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de cre-
cimiento como la calcitonina, existen en concentraciones muy bajas en el
suero, necesitando así un sistema de detección muy sensible para poder
medir estos analitos (Nishizono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los
muchos métodos, los ensayos quimioluminiscentes y sus enzimas son los sis-
concentraciones muy bajas.
Los instrumentos totalmente automatizados de los que se dispone ahora
son también capaces de utilizar inmunoensayos enzimáticos fluorescentes.
Estos sistemas de ensayo se clasifican en varios grupos basándose en la
generación y detección de las señales y el tipo de fase sólida. Con respec-
to a la detección de la señal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japón) y el
AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un método de fluorescencia del
inmunoensayo enzimático que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato
especifico, el 4-metilumbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponi-
bles para los inmunoensayos enzimáticos de quimioluminiscencia.
Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japón). Access (Sanofi Diagnostics Pasteur.
Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los Angeles, CA) han
utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfosforiladamantil-
dioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson, 1994:
Babson, 1991). El éster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha
aplicado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS
2010 (Roche Diagnostics. Indianapolís. IN), se usa el Rufbpy)/' como
sonda quimioluminiscente (Erler, 1998).
Secuencia práctica del inmunoensayo
en el sistema analítico
La demanda de mercado esperaba una instrumentación capaz de reali-
zar un gran número de ensayos con capacidad de acceso directo. Para
cumplir estas necesidades, es necesario mejorar los reactivos y evitar el
tedio que implican los inmunoensayos heterogéneos. Para simplificar el sis-
tema para su posterior aplicación en un sistema de ensayo totalmente auto-
matizado, se diseñaron cartuchos individuales de reactivos previamente
empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reacción. Un sis-
tema genérico para los inmunoensayos con sondas heterogéneas está
esquematizado en la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes
del ensayo mediante un programa de ordenador y carga los cartuchos de
reactivos o las botellas para cada ensayo. Para un analito concreto, los car-
tuchos y la cubeta de reacción se introducen de forma automática en el ins-
trumento. Las muestras se transportan a la posición apropiada para la dis-
pensación. El ensayo está diseñado para emplear bandejas de reacción o
rotores que automatizan los pasos de mezclado y separación, que depen-
den del funcionamiento de la primera y segunda inmunoreacción, y la reac-
ción de generación de la señal. Todos los pasos de la reacción tienen lugar
de forma secuencial en la línea de reacción y las señales generadas se
miden mediante un detector. Los resultados del ensayo se imprimen en los
siguientes 20 a 40 minutos y se envían automáticamente a través de la red
al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 200 ensayos por
hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este sistema de
acceso directo.
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo
heterogéneo
Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumen-
tos, pueden existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al
formato de la loma de muestras, control de la temperatura, la separación BF,
el arrastre, flujo de los desechos y demás. Asi. debemos prestar atención a lo
bien que funciona el instrumento después de su puesta en marcha.
Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de
inmunoensayo totalmente automatizado en un la-
boratorio clinico de automatización.
843
Cubeta de reacción
En un sistema de inmunoensayo. es muy importante diseñar las caracte-
rísticas de la cubeta con cuidado para obtener datos reproducíbles. Los fabri-
cantes emplean estas cubetas para posibilitar un maneto rápido de los reac-
tivos y del acceso directo. Se ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso
que contiene los reactivos y la unidad de reacción en el sistema Lumipulse.
El sistema Immulite emplea una unidad de reacción para la separación B.'F. El
 844 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 35-8 Nueva generación de sistemas de inmunoensayo heterogéneos

ACS:CENTAUR ADVIA IMS (BAYER
AIA-21 (TOSOH) ARCHITECT (ABBOTT)
(BAYER DIAGNOSTIC) DIAGNOSTICS)

Paquele de reactivos Liotilizado y empaquetado Paquete de reactivos Solución en una botella Particulas secas en la
en porciones (en solución) cubeta de reacción
Cubeta de reacción Recipiente de reacción Cubeta desechable Cubeta desechable Recipiente de reacción
Principio de la reacción Inmunoensayo enzimático Inmunoensayo Inmunoensayo Inmunoensayo
fluorescente quimioluminiscente quimoluminiscente quimioluminiscente
Sustancia marcada Fosfatasa alcalina Ester de acndinio Ester de acndinio Fosfatasa alcalina?
Sustrato enzimático 4-metilumbeliter¡l tosíalo Ninguno Ninguno Foslato de dioxelano?
Detector de la señal Fluorescencia Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia
Formato del ensayo S-1. S-2, competitivo S-1, S-2, competitivo S-1, S-2, competitivo S-1, S-2, competitivo
Pretratamiento Si Sí Sí ?
Flujo de la reacción Rotatoria Rotalona Rotalona Rotatoria
Duración del ciclo (seg) 30 15 18 36
Duración de la reacción (min) 10 o 40 min 7 5-36 29 20
Temperatura de la reacción 37°C 37"C 37"C 37"C
Numero máximo de analitos 20 30 25 36
Capacidad (ensayos/hora) 120 240 200 100
Fase sóhda Partícula magnética (bcad> Partícula magnética Partícula magnética Partícula magnética
Tiempo del primer resultado (min) 50 8-40 30? ?
Separación B/F Campo magnético Campo magnético Campo magnético Campo magnético
Método de muestreo Pipeteando la sonda Chip desechable Sonda fija Pipeteando la sonda
(técnica del aceite)
Aulodilución de la muestra Sí Si Si Si

AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reacción única que con-
siste en pocilios para el reactivo, la incubación y para la muestra dentro de
una misma cubeta. El programa combina el contenido de esta cubeta en una
unidad rnatricial. Esta última puede emplearse para captar la fase sólida de
látex, seguida de una separación B'F y de una segunda reacción inmune de
anticuerpo marcado con la fase sólida.
Tipo de toma de muestra y dispensación de fluido
En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos
tipos diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminación entre-
cruzada de muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el
chip desechable se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En
el caso del sistema con punta fija, aunque la muestra original se divida en
varias alícuotas pequeñas, la contaminación entrecruzada sigue ocurriendo.
Así, el sistema del chip desechable es la mejor forma de evitar la contamina-
ción y de minimizar los desechos biopeligrosos. Por otro lado, el coste de
emplear estos chips para el ensayo es superior al del sistema de punta fija.
También deben tomarse en consideración las consecuencias medioambien-
tales de los chips desechables.
Arrastre
El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentración
extremadamente alta, puede a veces dar lugar a diagnósticos clínicos erróne-
os. Un tubo de plástico desechable para la muestra es la forma más sencilla
de evitar este problema. Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias
ventajas económicas como se ha mencionado antes. Asi, la mayoría de las
técnicas que conciernen a la ingeniería de las muestras se han concentrado en
minimizar el arrastre de la muestra mediante pasos de lavado y mantenimien-
to de la punta. Ahora, hay varias puntas fijas que permiten limitar el arrastre a
menos de un orden de 10'. Incluso con un arrastre tan bajo, algunas muestras
todavía crean problemas (p, ej., una muestra fuertemente positiva para un
antígeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguida de una muestra
negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de software para com-
probar dicho resultado, mediante un reanálisis automático de los valores posi-
tivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.
Separación B/F y sistemas de lavado
En un inmunoensayo heterogéneo, el conjugado unido debe separarse
de la sonda libre. Esta separación B'F depende de las características de la
fase sólida. Los sistemas IMx y AxSYM emplean micropartículas de látex
como fase sólida y emplean una membrana porosa para atrapar el látex
para la separación de particulas de la fase sólida de la líquida. Diagnostics
Product Corp.. Los Angeles. CA ha desarrollado una unidad para los siste-
mas de separación B/F, en la que la solución de reacción sale de una uni-
dad interior a una exterior de desechos, mientras que la fase unida perma-
nece en un lecho de fase sólida (0,5 cm). Una ventaja de estos formatos,
es que evitan la contaminación entrecruzada y el arrastre de una mezcla
de reacción a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado.
Todos los demás sistemas emplean particulas magnéticas (magnette parti-
óles y magnelic beads) en las que se puede conseguir una separación rápi-
da y fácil, mediante la aplicación de un campo magnético.
Nuevos sistemas para la próxima generación
(sistemas modulares)
La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendi-
miento comercial que se han introducido en los últimos años. Muestra las
especificaciones instrumentales de cada analizador. Reduciendo los tiem-
pos de incubación y de reacción, se puede obtener un resultado rápido en
unos 10 a 25 minutos. Así, es posible una máquina de alto rendimiento
que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Además, varios fabricantes
han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos
sistemas analíticos que se necesitan en un laboratorio clínico. Muchos
laboratorios clínicos han introducido un sistema de transporte de muestras
que se conecta con distintos instrumentos analíticos controlados de forma
independiente. Sin embargo, algunos analizadores no son aplicables a
este sistema porque la velocidad del instrumento o la duración de su ciclo
no se puede armonizar fácilmente con el resto de software y hardware.
Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laboratories) es
un ejemplo de una máquina de nuevo concepto, en el que un sistema de
ordenadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo
conectados a un analizador químico. El ADVIA IMS. basado en un con-
cepto similar, ha sido introducido por Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY),
que puede realizar química clínica e inmunoensayos en una misma plata-
forma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto todavía en
desarrollo, que harán posible la simplificación del laboratorio clínico a un
coste final inferior.
 CAPÍTULO 35 • INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA SU
USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE
Origen
Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej.,
hCG para el diagnóstico del embarazo) ha simplificado el formato de los
inmunoensayos: el ensayo debe ser sencillo, rápido y reproducible. Teniendo
en cuenta estas metas, se han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto
ha dado como resultado una primera generación de formato de ensayo de
inmunoensayo enzimático de flujo.
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos
de ensayo por inmunofiltración)
La Figura 35-23 ilustra esquemáticamente un instrumento típico de inmu-
noensayo de flujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que
consiste en una membrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un
parche absorbente bajo la membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo
y el procedimiento se describen a continuación. Varias gotas de la muestra de
orina se aplican sobre la membrana. La orina es absorbida por el parche y
entonces se añade el tampón de lavado por goteo y a continuación una solu-
ción con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la loslatasa alcalina.
Tiras reactivas
También se ha desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el
coste de los materiales en comparación con el formato del ensayo de flujo En
este formato, la tira del ensayo contiene un área con un punteado de anti-
cuerpo en la punta de la tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente
manera: 1) se introduce la tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se
introduce la tira en un recipiente de lavado: 3) a continuación se introduce la
tira en una solución de marcado: y 4) finalmente se introduce la tira en un
revelador de color si es necesario.
Instrumentos inmunocromatográficos
Con el fin de eliminar pasos de adición de reactivos en estos dos forma-
tos, se han conseguido importantes mejoras empleando técnicas inmuno-
cromatográficas. que han dado lugar a un inmunoensayo simple y rápido.
Membrana de nylon
c En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipémico puede interferir en
Figura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Sección transversal de un Hybritech ICÓN
y vista superior del instrumento. Los anticuerpos de captación se encuentran inmo- de impregnación o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones
vilizados en el centro de una membrana de nylon que posee un parche absorben- de estos tres formatos. La mayoría de los instrumentos inmunocromatográficos
te para absorber el fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugados marcados directamente, coloides de metal o látex colorea-
cado y el tampón de lavado. El ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial.
parecido a un inmunoensayo enzimático en dos pasos.
845
La inmunocromatografía consiste en la separación B. F y generación de la
señal simultáneas, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso,
como una membrana de nitrocelulosa o una lámina de libra de vidrio. A tra-
vés de la acción capilar de la membrana, el analito de la muestra puede
migrar del extremo proximal al distal. donde existe un parche absorbente
para mantener una velocidad de flujo capilar constante. La zona de carga
de muestra, la de mareaje y la de detección se encuentran entre los dos
extremos. El método inmunocromatográfico se clasifica en varios formatos.
La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatográficos típicos El
extremo proximal se usa como puerto de carga de la muestra, y está
conectado a un parche que contiene el antigeno o anticuerpo marcado,
debajo del cual hay una membrana de nitrocelulosa en contacto con el par-
che que funciona como una zona de detección. El extremo distal de la
membrana se encuentra unido a un parche absorbente que funciona como
una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstituye
el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o látex colorea-
do, que forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este
complejo migra a la zona de detección. El anticuerpo o el antigeno inmovi-
lizado en la zona de detección puede captar el complejo y formar una linea
roja o azul positiva. El exceso de sustancia de mareaje migra hasta el par-
che absorbente. La fase móvil en una migración es la propia muestra.
Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentración de bihrrubi-
na o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de los resulta-
dos a simple vista. En este formato, la señal que debe detectarse se pro-
duce en la zona de detección con una zona donde se concentran partícu-
las coloreadas.
Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo forma-
to en plataforma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automá-
tica, incluyendo un paso de lavado. El instrumento aparece de forma
esquemática en la Figura 35-25. En este formato, la posición de cada una
de las zonas es completamente diferente a la del resto de las mmunocro-
malografías mencionadas anteriormente. El extremo proximal tiene una
solución de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso de
lavado espontáneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica
sobre un parche que está en el centro del instrumento y contiene un con-
jugado marcado seco. El extremo distal se conecta a un parche absorben-
te. Se añaden dos gotas de la muestra al parche para que reaccione con
el conjugado después de su reconstitución. La mezcla de reacción que
contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el anticuerpo marca-
do puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente que
contiene la solución de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye
y pasa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de detección. En
este momento, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes
del suero y el exceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarán
hacia el parche absorbente. Si la muestra contiene el analito, el anticuerpo
inmovilizado captura el complejo en la zona de detección para formar una
linea coloreada. Este método presenta algunas ventajas que difieren de
otros instrumentos inmunocromatográficos que se revelan con la muestra.
la evaluación del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado
color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reser-
vorio conectado puede no tener interferencias de estos componentes colo-
reados. Este instrumento ha sido útil en la detección de HBsAg. anticuer-
pos anti-HB (Yamauchi. 1997) y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasega-
wa, 1995). La mayoría de los componentes, como la membrana, el parche
absorbente y el compartimento para la muestra tienen su sitio dentro de un
molde de plástico.
Resumen
Los instrumentos de inmunoensayo rápidos y sencillos se resumen en la Tabla
35-9. Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo,
do. Estos tipos de formato resultan apropiados para la migración del inmuno-
complejo, junto con la migración de la solución de muestra. Sin embargo, mu-
 846 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatográfico típico mediante adición de la muestra. El desarrollo del ensayo se mues-
tra en la parte inferior de esta ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona como porción de carga de la muestra y consiste en un par-
che que contiene el anticuerpo o antígeno marcado con látex coloreado o coloides de oro. El analíto de la muestra forma un complejo con el
conjugado y migra a la zona de detección, inmovilizando asi el anticuerpo de captura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado
y la muestra sobrante migran al extremo distal de la tira.

chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil yos que emplean instrumentos de inmunocromatografía porque una persona con
a 200 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA práctica, como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede
permite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra, realizar el ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabrican-
25 ul. La corriente actual de ensayos rápidos para POCT se orienta hacia ensa- te, a diferencia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).

Figura 35-25. Instrumento inmunocromatográfico que emplea EIA. Se aplica un método de amplificación sensible a la inmunocromatografía
empleando una enzima. La muestra se añade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este método, se emplea una solu-
ción de revelado como fase móvil, que puede servir como tampón de lavado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plás-
tico y los resultados de un ensayo para anticuerpos TP.
Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rápidas para los instrumentos de inmunoensayo
Principio Nombre del kit _. Volumen de Tiempo de
... . Tipo de muestra Fase móvil Sensiblilidad Alojamiento Fabricante
del ensayo (analito) muestra (ul) reacción (min)

Formato inmunocromatográfico
Un paso Helisal One Step Sangre 5C Plasma 5 Igual que ELISA MP"' Cortecs Diagnostics
(todo en uno) (Helicobacter pylori) Ltd.
Biocard Troponin I test Suero 150-200 Suero 15 0.1 ng/ml MP ANI Biotech oy
Clearview hCG II Orina ? Orina 5 25 mlU/ml MP Unipath Limited
QuickVue One-Step Orina 3 gotas (75?) Orina 3 25 mlU/ml MP QU1DEL
hCG
CARD-I-KIT Suero 4 gotas (100?) Suero 5-10 0,1 ng/ml MP AboaTech Ltd.
Troponin I
TROPT Troponin T Sangre 150 Plasma 5-15 0.1 ng/ml MP Roche Diagnostics'
?
Determine HBsAg Sangre/suero 50 Plasma/suero 15 1 ng/ml? TS' Abbott
BioSign Tumor Sangre/suero 50 Revelador 5-10 '••IF Princeton BioMeditech
Corp.
HBs Insta test Sangre/suero 200 Plasma/suero 15-20 0.5 ng/ml MF Morningstar
Diagnostics
1
EASY-SURE HBsAg Suero 100-150 Suero 5-20 1 ng/ml TC' West Wind Plus, Inc.
Toot
PSA RapidScreen Test Sangre 1 gota colgante Revelador -15 >4 ng/ml MP Craig Medical
Distribution. Inc.
Triage Cardiac Sangre ? Plasma 15 ? MP Biosite Diagnosticst
(Myoglobin CK-MB
Troponin-I)
AMRAD ICT Sangre/suero ? Sangre/suero 5-15 2 ng/ml cc- j
Amrad Corporation
Hepatitis B Ltd.
Espline HBs-Ag Plasma/suero 25 Revelador 15 0.5 ng/ml MP Fujirebio Inc.
TestPack PLUS hcG Suero/orina 25 Suero/orina 5 50 mlU/ml MP Abbott
Dos pasos EASY-SURE HIV 1/2 Plasma/suero 40 Revelador 10 — CC West Wind Plus. Inc.

Método inmunocromatográfico de tiras reactivas

AimStick PBD Orina Volumen de Orina 3 20 mlU/ml Craig Medical
la inmersión
Distribution
Dainascreen HBsAg Plasma/suero 22 Plasma/suero + 15 3,1 ng/ml rs Dainabot
Formato de flujo solución del conjugado
ICON-II hCG Suero Hybritech, Inc.
NycoCard CRP Plasma de sangre 50 Tampón, etc. 2 10 ug/'ml TC Nyco Diagnostic
completa
Chagas dobule-spot Suero/plasma 1 gota Tampón, etc. 10 1 MP Morningstar
test Diagnostic
Combinación de inmunocromatografia y flujo
DoubleCheck HBsAg Suero/plasma ? Tampón. etc. 15 2 ng/ml MP Orgenics
MP = représense moldes de plástico (molóing plástic): TS = representa tiras reactivas {test strip): TC = representa una tapeta de reacción ((esí cara). CC = epresenta un tariete'o (cara case)
•Datos de Towt (1995)
t Datos de Bruni (1999)
j
 848 SECCIÔN V • INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA

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 C A P Í T U L O
Examen de laboratorio
del sistema inmune celular
• Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP)
• Susana Cunningham-Rundles, Ph.D.
• Maurice R.G. O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI)
CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN DE
LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA
LA INTERPRETACIÓN 851
Decisión de analizar
Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria
Significado clínico de las pruebas de inmunodeficiencia
Efecto de la edad en la respuesta inmune
Malnutrición y respuesta inmune
Cáncer
APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS DE
INMUNIDAD CELULAR 853
Fases de estudio: fase de exploración
Fases de estudio: fase de confirmación
Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad
PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO
IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD
CELULAR 855
Inmunología celular
Metodología: determinación de la activación y la
proliferación linfocítica en la evaluación de la
inmunodeficiencia celular
El conocimiento dei sistema inmune se ha mejorado enormemente gracias a
la detección de determinadas anomalías en pacientes con sospecha de déficit
inmunitario. Estos avances han surgido de estudios de la diferenciación y fun-
ción de las células inmunes normales, de la deleción experimental de genes, y
de análisis detallados de síndromes de inmunodeficiencia humanos. Los nue-
vos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las
bases funcionales de la desregulación inmune en pacientes con mutaciones
genéticas primarias (congénitas) del sistema inmune o de infecciones congéni-
tas secundarias (adquiridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no
se pueden distinguir por la presentación clínica de las infecciones: la informa-
ción genética está convirtiéndose en un importante componente para las prue-
bas e interpretación diagnóstica. La misión de la inmunología clínica de labora-
torio es transformar las nuevas líneas de investigación en pruebas altamente
estandarizadas y clínicamente relevantes para cada paciente en concreto.
Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado princi-
palmente en tres áreas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el
impacto de los defectos congénitos inmunes sobre la defensa del huésped; 2)
enfermedades autoinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad
inmune excesiva o inapropiada; y 3) deficiencias inmunológicas adquiridas,
en las cuales la infección daña directamente el sistema inmune, como en la
infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Además, los
defectos inmunes celulares de enfermedades con características de mala fun-
ción inmunológica, como las infecciones crónicas, el cáncer, la malnutrición o
las lesiones traumáticas, proporcionan información esencial en la defensa del
huésped mediada por la inmunidad.
36
FUNCIÓN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD
MEDIADA POR CÉLULAS 859
METODOLOGÍA: CITOMETRIA DE FLUJO
Y DE IMAGEN 859
Hardware y otras herramientas
RECEPCIÓN Y ANÁLISIS 865
Inmunofenotipificación: aplicación a las muestras
de rutina y leucémicas
Análisis del ADN
Citometría de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad
de fluorescencia
CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA DE CALIDAD
EN EL LABORATORIO CELULAR 874
BIBLIOGRAFÍA 874
El concepto general de inmunidad" a menudo se ha confundido con el de
inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpos potencialmente pro-
tectores frente a un agente infeccioso introducido por una infección natural o
por una inmunización. Debido a que la inmunología, como actualmente se uti-
liza en un laboratorio clínico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin.
1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real
de este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la
inmunidad humoral, la función inmune celular es fundamentalmente compleja
y difícil de medir. Las pruebas de inmunidad humoral básicas miden la pro-
ducción de anticuerpos específicos elaborados en cierto momento como res-
puesta a una infección por un virus o microbio específico; en contraste, los
análisis de la inmunidad celular miden las respuestas actuales.
En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteraciones inmunes
primarias, como las deficiencias de los complejos principales de histocompa-
tibilidad (MHC) clase I y II, o el síndrome del linfocito desnudo (BLS) (Tou-
rame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importan-
cia de la evaluación estandarizada en el laboratorio clínico de las deficiencias
inmunes. El descubrimiento y el estudio de niños con trastornos relativamente
raros pero muy importantes, como el déficit de adhesión leucocitario (LAD)
(Springer. 1984: Etizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos meto-
dológicos, a medida que se iba demostrando en estudios recientes cómo se
presentan estos defectos de adhesión (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nue-
vos estudios desde la identificación de la enfermedad granulomatosa crónica
(CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un grupo de enfermedades
heterogéneas con alteración en la actividad de la cadena respiratoria fagoci-
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han
sido útiles en la identificación del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997).
Actualmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congénitos pue-
den ser candidatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999)
o, en el futuro, a la terapia génica (Malech, 1999).
Como la mayoría de los linfocitos en sangre periférica son células en
reposo, la reacción inmune celular debe reproducirse o generarse en el sis-
tema de análisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta, man-
tener la reacción proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi
como de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunología clí-
nica cambió radicalmente durante los años 80, debido al impacto de los
importantes esfuerzos de investigación, incluyendo el uso de anticuerpos
monoclonales para identificar células inmunes, el descubrimiento de la regu-
lación de las citocinas de la respuesta inmune, y sobre todo por la tremenda
necesidad de comprender y controlar la aparición epidémica del VIH. La apa-
rición del VIH ocurrió casi de forma paralela a la posibilidad de identificar las
células T CD4+. Los primeros análisis de la inmunodeficiencía funcional celu-
lar en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basados
inicialmente en el análisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (Sie-
gal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes
funcionales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo
se presentan las pruebas inmunológicas celulares actuales a la luz de ten-
dencias futuras. La evaluación de la inmunidad celular está cambiando
desde los análisis simples y puntos finales fijos hacia un análisis integrado
de la función celular en varios niveles que reflejen las interacciones celula-
res como un proceso dinámico.
CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN
DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES
PARA LA INTERPRETACIÓN
Decisión de analizar
Aunque en teoría la interpretación de las pruebas inmunológicas comprende
desde el abordaje diferencial minucioso hasta el cribado, en términos prácti-
cos, la respuesta inmune del paciente se estudia en el contexto de la presen-
tación clínica. Sin embargo, como las pruebas inmunológicas pueden ser caras
y lentas, la elección de la prueba a menudo depende de la sospecha clínica.
Como hay pocas pruebas de la inmunidad celular, si es que existe alguna, que
sean total y específicamente diagnósticas, la interpretación debería realizarse
con precaución. La responsabilidad del laboratorio de inmunología clínica es
establecer un número suficiente de pruebas, realizarlas de forma sensata para
conocer la naturaleza y la extensión de la alteración inmune y considerar un
rango de posibles causas cuando se realice su interpretación.
Normalmente, la decisión de analizar la respuesta inmune en un paciente
surge por una de las razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la
inexplicable susceptibilidad a la infección, el aumento de la gravedad de
infecciones habituales, o la reacción inusual a la inmunización son motivos
para realizar una valoración inmune. Las infecciones inusuales, especial-
mente por agentes oportunistas o las infecciones graves que no responden
al tratamiento, y ciertos estados alérgicos o atópicos también pueden reque-
rir un análisis inmunológico. En estos últimos años, la posibilidad de la infec-
ción por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria
como principal diagnóstico de presunción. Sin embargo, como se tratará pos-
Tabla 36-1 Presentación de una posible inmunodeficiencia
Infecciones bacterianas frecuentes
Reacción sistèmica a virus inusualmente grave
Desarrollo de la infección debida a un organismo inusual como
hongos o protozoos
Reacción sistèmica después de la vacunación con virus vivos
Historia familiar de infecciones recurrentes
Exposición al virus de la inmunodeficiencia humana
851
teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnóstico de una enferme-
dad inmune primaria.
Los cambios inmunológicos pueden acompañar a muchas entidades clíni-
cas incluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neo-
plasias, de enfermedades hematológicas como la anemia de Fanconi, la
hemofilia, la trombocitopenia inmune, los trastornos linfoproliferativos como la
histiocitosis, y las hemoglobinopatías como la anemia de células falciformes.
la talasemia, además de un amplio grupo de anomalías cromosómicas como
el síndrome de DiGeorge. el síndrome de Down, el síndrome de Bloom, la dis-
queratosis congenita de William, la epidermólisis ampollosa, y el síndrome de
Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosoma X). Las enfermeda-
des autoinmunes como las enfermedades reumáticas, la enfermedad mixta
del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, la
esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple y la miastenia gravis pue-
den asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan más adelante en los
Capítulos 43 y 45.
Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria
Las características principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmuno-
deficiencia supuestamente adquirida por infección con VIH. debe distinguirse
de los cambios inmunes asociados a otras condiciones clínicas descritas.
Incluso a menudo las lesiones traumáticas como las quemaduras o los acci-
dentes que originan una gran pérdida de sangre o un daño visceral producen
un periodo de vulnerabilidad a las infecciones. Además, otras situaciones
como las enfermedades premalignas o las infecciones subyacentes no diag-
nosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden parecer fenotipi-
camente idénticos a la inmunodeficiencia primaria.
Mientras que la infección por el VIH puede diagnosticarse rápidamente
mediante una determinación directa, el laboratorio de inmunología clínica se
emplea frecuentemente como un campo de pruebas antes de obtener del
paciente o del tutor legal el consentimiento informado para el análisis del VIH.
Esto se basa en la observación de que entre los adultos VIH-positivos. casi
siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tanto, como resul-
tado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertido ha llegado
a considerarse como un marcador de la infección por el VIH.
Sin embargo, hay un cierto número de enfermedades que afectan al sis-
tema inmune que pueden producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un
número de células CD4 tan extremadamente bajo como el VIH. Éstas inclu-
yen, aunque no sólo están limitadas a estos, al síndrome de DiGeorge, el
timoma benigno, el comienzo de la infección por el virus de la hepatitis C
(VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutrición calórico-proteica y las
neoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversión del
cociente CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un número bajo de CD4.
El lactante del caso n." 3 presentaba múltiples abscesos sépticos del tracto
gastrointestinal (Gl) y se creía que tenía un trastorno de la inmunodeficiencia
primaria. Sin embargo, esta evaluación se hizo después de un episodio de
casi ahogamiento en una bañera en la que se encontraron indicios de un des-
tapacaños. Las lesiones del tracto Gl por cáusticos produjeron lesiones múl-
tiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos. El
desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos, pero no el daño del tracto
Gl. se resolvió rápidamente. Esle caso también muestra la necesidad de lle-
var a cabo una prueba de confirmación tan pronto como sea posible cuando
el paciente esté estable.
Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se presentan en el
contexto de una infección o de cambios hematológicos. Los trastornos por
inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Capítulo 42. La evaluación de
laboratorio a menudo requiere de una valoración por etapas, no solo para
minimizar la extracción de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las
pruebas disponibles con vistas a un diagnóstico diferencial. Puede parecer
que determinados diagnósticos de presunción se sospechan con demasiada
frecuencia, por ejemplo, el síndrome de Wiskott-Aldrich, aunque éste necesita
descartarse en casos de trombocitopenia inexplicada. Sin embargo, un sín-
drome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si sólo se valora la res-
puesta a mitógenos en lugar de la respuesta frente a antígenos. y con el
tiempo el defecto inmune puede llegar a ser más importante, de forma que
sean necesarias pruebas de seguimiento.
 852 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH

Conjunto de linfocitos
Caso estudio Edad %CD3 %CD4 %CD8 ABS # Diagnóstico
1. Inicial 3 años 56 26 29 209 Deficiencia idiopatica de CD4
2. Inicial 6 años 73 18 L'- 330 Disqueratosis
3. Inicial 3 meses 29 15 IO 762 Inmunodeficiencia congènita R/0
1 semana — 43 25 15 2.846 Lesión caustica gastrointestinal
4. Inicial 6 años 89 62 32 B74 Aplasia de glóbulos rojos
3 anos 93 36 57 272
5. Inicial 3 meses 83 51 31 2.734 Síndrome de Noonan
a los 5 meses 76 18 48 96
6. Inicial 4 meses 36 25 7 304 Sindrome de Williams
al año 51 42 12 2.794
7. Inicial 1 semana 0 0 24 0 Sindrome de DiGeorge
8. Inicial 12 años 64 20 33 No hay dalos Talasemia
9. Inicial 8 años 65 26 47 No hay datos Neutropenia inmune
10. Inicial 50 años 18 51 No hay datos Melanoma uveal
al día — 72 45 35 No hay datos Posthipertermia
ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.

Significado clínico de las pruebas Efecto de la edad en la respuesta inmune

de inmunodeficiencia
Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clínico es
cómo evaluar el significado clínico potencial de la respuesta inmune alterada
in vitro. Los estudios de trastornos relativamente bien definidos han demos-
trado que hay muchas diferencias significativas en el impacto clínico. Sin
embargo, el uso de nuevas estrategias de pruebas puede ayudar en la clasi-
ficación de los pacientes según el nivel y extensión del defecto.
Por ejemplo, los estudios del síndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1974), clási-
camente una tríada de aplasia tímica y paratiroidea y defectos conotruncales.
mostraban que existían diferencias importantes en la gravedad de las infeccio-
nes que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reducción del
número de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitógenos originada por
la hipoplasia tímica. Inicialmente. se observó un alto grado de muertes asocia-
das a este síndrome, pero con las nuevas técnicas quirúrgicas y métodos anes-
tésicos, se ha visto que un número significativo de niños parecen desarrollarse
normalmente sin infecciones graves (Bastían, 1989). Sin embargo, algunos niños
desarrollaron infecciones que no respondían al tratamiento y, finalmente, morta-
les y no hubo ningún modo de predecir la evolución. Recientemente, ha sido
posible utilizar análisis del fenotipo linfocítico más exacto y analizar los niveles de
los defectos inmunes en el síndrome de DiGeorge. Utilizando análisis longitudi-
nales durante muchos meses y una aproximación paramétrica múltiple, parece
que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consistente número de
células T CD4, por la inversión del cociente CD4/CD8, y por la producción dis-
minuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La
investigación del significado de las deleciones monosómicas del cromosoma
22q11.2, que son la principal causa del síndrome de DiGeorge, del síndrome
velocardiofacial y del síndrome de la anomalía conotruncal de la cara, ilustran la
importancia de la nueva información genética. Sólo el síndrome de DiGeorge fue
descrito originalmente como un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estu-
dios orientados a la frecuencia de la inmunodeficiencia en los otros síndromes
clínicos asociados con la microdeleción del cromosoma 22q 11.2 han mostrado
que en más del 75% de los pacientes existe evidencia de compromiso inmune
(Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficiencia no se correlaciona con
ninguna caracteristica fenotípica particular.
La función de las células T puede ser tan importante o más importante en
la infección por el VIH que la pérdida de las células CD4^ o la tasa de pér-
dida. En algunas enfermedades asociadas con virus, hay una considerable
incertidumbre sobre lo estrecha que es la asociación entre el délicit inmune
detectado ex vivo y la función inmune in vivo (Landay. 1991; Lloyd. 1992).
Mientras que los estudios recientes sugieren que la respuesta ortostática alte-
rada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del síndrome de fatiga cró-
nica o que un aumento de las concentraciones plasmáticas del factor de
necrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss.
1999), no existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.
Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia
durante proceso de envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan.
1994). Aunque hay una considerable variación en esto y muchas veces es
una consecuencia del estado nutricional alterado (Mazari. 1998), es esen-
cial que el laboratorio clínico proporcione resultados considerando distintos
grupos de edad.
El estudio de pacientes pediátricos presenta hallazgos particulares para el
diagnóstico de laboratorio en la inmunodeficiencia. El desarrollo del sistema
inmune en el niño no está completo al nacer y, además, los niños no han
estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambientales anormales
y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La exposición con-
génita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalías
inmunes. Diferencias claves en la respuesta inmune pediátrica incluyen una
marcada linfocitosis al nacimiento, una elevación de las células B, un
aumento del cociente CD4+/CD8+, y la existencia de pocas células asesinas
naturales (NK) (Fletcher, 1992: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993).
Estas diferencias se reflejan en las claras diferencias en el intervalo de nor-
malidad de las subpoblaciones linfocitarias y deben tenerse en cuenta a la
hora de evaluar los resultados (Denny, 1994). También, hay una importante
diferencia en la respuesta a varios activadores comparado con los adultos. La
respuesta neonatal de los niños prematuros a ciertos activadores microbianos
puede ser más potente que la de los adultos o que la de los niños nacidos a
término debido a los rápidos cambios en la regulación inmune (Veber, 1991:
Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la pro-
gramación perinatal (Prescott, 1998).
Malnutrición y respuesta inmune
Aunque generalmente se cree que la malnutrición es relativamente rara en
los países desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutri-
ción es relativamente frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad
(Pennington. 1996). La malnutrición se asocia con la inmunodeficiencia y ori-
gina una vulnerabilidad importante a las infecciones (Chandra. 1993; Cun-
ningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el déficit de zinc puede presentarse
como una inmunodeficiencia marcada que puede relacionarse con el déficit
primario de la captación de zinc en el tracto Gl, con una acrodermatitis ente-
ropática o con un déficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; Prasad. 1963).
Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorción asociada que
alecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta prolifera-
tiva in vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (Cun-
ningham-Rundles, 1981). Esto está asociado con el hecho de que el zinc es
necesario para la actividad biológica de la hormona tímica, necesaria en la
producción de las células T luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para
la activación de las células T (Cunningham-Rundles, 1996. 1998). Hay una
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la
respuesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos específi-
cos en la respuesta inmune. La malnutrición puede ser un factor que aumente
la complejidad de muchos casos clínicos. La interacción de las infecciones
con el metabolismo alterado secundariamente a la respuesta de fase aguda
puede provocar cambios transitorios en los oligoelementos que produzcan la
supresión transitoria de la respuesta inmune. El estrés físico puede tener
efectos similares y provocar un aumento de la vulnerabilidad a las infecciones
en el contexto de la inmunosupresión (Cunningham-Rundles, 1999). Ésle es
un proceso bidireccional. La alteración del crecimienlo puede ser el primer
signo de la infección por el VIH en un niño VIH+ (Peters, 1998). Por ello, como
por otras razones, la evaluación inmune debe ser un proceso continuo en el
contexto del tratamiento o de otros análisis.
Cáncer
La inmunodeficiencia primaria está asociada con el aumento de la inciden-
cia de cáncer (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez está más claro que
hay tumores que se desarrollan asociados a la infección por VIH (Davis. 1984;
Chintu, 1995; Krown. 1996).
En el paciente con cáncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reduc-
ción en la respuesta ante un estímulo antigéníco puede asociarse al desarro-
llo de una neoplasia primaria, ocurrir durante las metástasis o estar causada
por los efectos secundarios del tratamiento. La reducción en la respuesta
inmune frente a los activadores no específicos estudiados ex vivo en ensayos
de proliferación se correlaciona con el estado de la entermedad y tiene un sig-
nificado pronóstico en la supervivencia (Heimdal. 1999). A menudo se
observa en los pacientes con cáncer no tratado un cociente CD4/CD8 inver-
tido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987). Los
estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse
inmunológicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta
no protectora (Lee. 1997).
El desarrollo de nuevos métodos ¡nmunoterapeúticos está aumentando,
sugiriendo que la respuesta a antígenos específicos del tumor será más utili-
zada en el futuro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune
también pueden utilizarse en el seguimiento y evaluación de la respuesta a
los tratamientos como la IL-2 (Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cáncer
(Hsueh, 1998). En general, la quimioterapia producirá una supresión transito-
ria de la respuesta inmune que se resolverá en un corto periodo de tiempo,
mientras que la radiación puede tener efectos a largo plazo (Katz. 1993). La
evaluación de la respuesta inmune en el paciente con cáncer requiere de la
utilización de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de pruebas
y activadores, que refleje los procesos relevantes, así como especificidad en
la respuesta.
APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS
DE INMUNIDAD CELULAR
Los estudios en humanos se han basado en la observación de las células
inmunes de sangre periférica ya que el compartimento periférico es más
accesible y más fácil de medir, pero esta aproximación puede no reflejar los
sucesos regionales (Cunningham-Rundles, 1994a). Los conocimienlos sobre
las diferencias entre la respuesta inmune sistémica y mucosa pueden expli-
car finalmente muchas paradojas actuales que surgen cuando se compara la
respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del huésped in vivo
(Xu-Amano, 1993). La función de la inmunidad sistémica celular parece estar
regulada a través de los distintos patrones de funcionalidad de las citocinas
tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coad-
yuvantes tipo 1 (Th1), IL-2, e interferón-y (IFN-y). se favorece la defensa
inmune celular del huésped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvan-
tes tipo 2 (Th2), IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfoci-
tos B (Barnes, 1993; Yamamura, 1991).
En contraste con la inmunidad sistémica, la actividad primaria de la res-
puesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de
microorganismos, toxinas y antigenos a través de la secreción y el transporte
de la inmunoglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por
853
un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferación
reducida capaz de ayudar a la célula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto
los linfocitos T de la lámina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se des-
arrollan de forma relativamente independiente del timo y funconan de forma
diferente a las células T de sangre periférica en el uso de la vía de transduc-
ción del CD2 en lugar de la vía del receptor de células T/CD3.
Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no se realizan habitual-
mente en los laboratorios de inmunología clínica y. con raras excepciones, las
células inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre perifé-
rica. Por esta razón, el uso de pruebas cutáneas in vivo y el examen de la res-
puesta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es útil para el
inmunólogo celular, ya que proporcionan otra forma de evaluación. En cual-
quier caso, la utilización de aproximaciones sucesivas y la repetición de aná-
lisis son muy informativas.
Fases de estudio: fase de exploración
La evaluación de la función inmune en un paciente con una posible inmuno-
deficiencia habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una
exploración de las posibles áreas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3.
Estos estudios de exploración deben acompañarse de un análisis de citometria
de fluyo apropiada de las subpoblaciones de linfocitos y, en niños, debe incluir
del uso de marcadores de células B para evaluar posibles cambios en estas,
que pueden aparecer transitoriamente en los neonatos y reflejarse con una baja
población de células T. También se recomienda el empleo de un marcador de
células NK en niños de más de 3 meses de edad, ya que los niveles de esta
población pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (Zola. 1983).
Como existe frecuentemente una limitación en la sangre que va a ser
extraída para estos estudios es esencial que la primera evaluación incluya
paralelamente un recuento sanguíneo completo (CBC), en la muestra de san-
gre. Es esencial que se lleve a cabo el recuento diferencial.
La etapa de exploración incluirá un panel de pruebas para evaluar la res-
puesta mitogénica y frente a anligenos proliferativos. La respuesta prolifera-
tiva de linfocitos frente a un grupo de activadores continúa siendo una de las
herramientas más sensibles para evaluar la función normal, y cuando esta
incluye un activador apropiado de células T y B puede ser utilizado específi-
camente para definir las áreas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre,
se recomienda la utilización de distintas concenlraciones de cada activador.
Además, el tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El
uso de tubos que contienen heparina de litio o ácido etilenediamintetraacético
(EDTA) no se recomienda para ningún estudio de funcionalidad de linfocitos.
Deben utilizarse tubos con heparina sódica (sin conservante) o con citrato
dextrosa (ACD). La sangre extraída en tubos heparinizados también puede
emplearse para el análisis por citometria de flujo, aunque el tiempo para la
preparación de la muestra y su análisis es critico (Nicholson, 1993).
La pregunta sobre cuándo debe extraerse la sangre es importante. En gene-
ral, la mayoría de los datos se han obtenido con sangre extraída por la mañana
y hay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no
puede hacerse, es muy útil continuar manteniendo la uniformidad del tiempo
de extracción para cada paciente individual. Este hecho es más crítico cuando
se mide el número absoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzación de
la enfermedad por VIH o como parte de un ensayo clínico (Malone. 1990).
Los estudios funcionales necesitan llevarse a cabo en sangre fresca anti-
coagulada siempre que sea posible (o sangre almacenada a temperatura
ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) antes de que las células
Tabla 36-3 Exploración básica en los estudios inmunológicos
Recuento sanguíneo completo y análisis dilerencial
Análisis de las subpoblaciones linlocitanas (numero y porcentaje de
células B y T) por citometria de flujo
Activación de linfocitos in vitro frente a mitógenos y activadores mi-
crobianos
Inmunoglobulinas séricas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas
si hay evidencia de infecciones clínicas por bacterias encapsula-
das En algunos casos, los niveles de inmunoglobulinas son nor-
males pero se producen anticuerpos no fijadores heterogéneos,
por tanto, se necesitan estudios adicionales
 854 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se envía por avión u otro
transporte a un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir
un control paralelo de la muestra extraída de una persona sana que sirva
como un estándar interno en el proceso de evaluación.
Fases de estudio: fase de confirmación
Aspectos generales
Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se obser-
ven evidencias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repi-
tiendo pruebas sobre aspectos específicos de las primeras series. Como
poco, debe realizarse un prueba positiva o negativa (rango normal y rango
anormal). Pueden añadirse pruebas adicionales que proporcionen el punto de
partida de estudios analíticos.
Es importante organizar apropiadamente la extracción de sangre cuando el
paciente se encuentre en el estado más estable clínicamente. Se recomienda
realizar por duplicado los estudios básales antes de llevar a cabo una inter-
vención, o incluso en la fase de confirmación. En algunos casos de posible
inmunodeficiencia puede haber un secuestro de células inmunes, que se
refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el compartimento periférico,
como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confirmación tam-
bién debe incluir una cuidadosa reevaluación de la historia médica de los
pacientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta
etapa de confirmación se muestran en la tabla 36-4.
Persistencia timica
El roentgenograma de la silueta tírmca puede no ser suficiente, ya que el
timo tiende a la depleción por estrés (Haynes, 1998). Aunque es difícil
determinarlo con seguridad, se ha visto que el tamaño real del timo eva-
luado por resonancia magnética nuclear (MRI) se correlaciona con el
número de linfocitos CD4+ en la infección por VIH (Vigano' A, 1999). Estu-
dios recientes sugieren que el timo humano puede considerarse como un
órgano compuesto por tejido linfoide central y periférico. Haynes (1998) ha
postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las ato-
cinas o de otros tactores producidos por las células inmunes periféricas del
espacio tímico penvascular. Como se describe en la sección específica
sobre la evaluación por citometria de flujo de las subpoblaciones de linfoci-
tos T. la expresión de antígenos de maduración normales adquiridos
durante el desarrollo tímico será suficiente para identificar la presencia de
un timo funcionante.
Pruebas cutáneas
En este momento puede ser importante la utilización de un panel de
pruebas cutáneas. Este abordaje en la evaluación de la inmunidad celular
sirvió en un principio como punto de partida para el desarrollo de las prue-
bas funcionales de la inmunidad celular y mide la respuesta de hipersensi-
bilidad retardada directamente in vivo. La experiencia con las pruebas cutá-
Tabla 36-4 Estudios analíticos de confirmación y de primera etapa
Roentgenograma de la sombra timica
Prueba cutánea
Actividad de las células asesinas naturales (si el niño tiene 6 meses
0 más)
Producción de citocinas en respuesta a la activación con T-coadyu-
vante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interferón-y, IL-4 y otros)
Cultivo mixto de linfocitos con el paciente como estimulador y con el
paciente como respondedor
Respuesta a la inmunización
Prueba para la presencia de anticuerpos específicos según la
edad
Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas
(sustancias de grupo sanguíneo anti-A y anti-B) si el paciente es
del grupo sanguíneo A, B o O
Prueba para el déficit de actividad de las enzimas adenosín deami-
nasa y purma nucleótico fosforilasa
Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutánea
Falta de historia antigénica apropiada cuando el panel no incluye
activadores ubicuos
Inmunodeficiencia primaria
inlecciones víricas
Malnutrición
Enfermedades granulomatosas
Neoplasias
».
neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlación glo-
bal entre la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia
(Mass. 1998) pero no ha sido útil como herramienta analítica para determi-
nar la razón de la falta de respuesta. La prueba cutánea no es muy cuanti-
ficable. El empleo de la prueba cutánea con derivados proteicos purificados
(PPD) para evaluar la posible presencia de Mycobactenum tuberculosis es
una excepción, aunque los individuos anérgicos no responden y. además,
hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el bacilo
de Calmette-Guérin (BCG).
Las causas de falta de respuesta en la prueba cutánea se muestran en la
Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba cutánea con
inmunización de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se llegó a
utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigüe-
dad del mecanismo de respuesta subyacente. La introducción del prueba de
la ventana cutánea" proporciona una medida más cuantitativa e informativa
de la respuesta inmune in vivo debido a que la reacción puede emplearse
para determinar una respuesta tumoral autóloga (Black. 1998). Sin embargo,
aunque con algunas reservas, la importancia de las pruebas cutáneas como
demostración convincente de que los defectos inmunes que suceden in vitro
pueden tener un significado pronóstico in vivo, no debe ser infravalorada.
Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad
Los estudios analíticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6.
Aunque la descripción completa de estos abordajes no se encuentra entre los
objetivos de este análisis, en general estos estudios son válidos para definir
el mecanismo subyacente del defecto inmune y proceder en una serie de eta-
pas. Aunque hay diferentes modos posibles de hacerlo, un buen método es
evaluar el nivel general del defecto siguiendo el plan general de evaluar la
presencia de los tipos celulares y las proporciones relativas de cada uno a la
vista de las áreas de función general disminuida y entonces poner en marcha
los estudios de la función efectora.
Función inmune diferencial
Hay dos tipos principales de células implicados en la inmunidad (Haynes,
1990; Paul, 1993): 1) linfocitos T (células T) y 2) linfocitos B (células B). Los
linfocitos T se definen por la expresión del receptor del linfocito T el cual se
une al antigeno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el recep-
tor de células T que es esencial para su activación
Tabla 36-6 Estudios analíticos e inmunorreguladores
Desarrollo de los antígenos de la activación durante la respuesta a la
estimulación, como el antigeno Tac, el receptor de transterrina,
regulación del MHC de clase II sobre las células T, receptores
solubles y otros
Respuesta do activación precoz (p. ej, canales de calcio)
Inmunorregulación
Respuesta a IL-1, IL-2, interferones
Desarrollo de funciones efectoras
Síntesis de inmunoglobulinas in vitro
Actividad citotoxica de las células T
Análisis de células supresoras/factores de supresión
Activación de genes, análisis del ciclo celular
Respuesta a la inmunización: inmunización de novo
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Tabla 36-7 Fenotipificación inmunológica de las subpoblaciones
de linlocilos
Panel básico de sangre periférica (sangre, glóbulos rojos Usados*)
CD45/CD14
Inmunoglobulinas control de isofipo de ratón
CD3/CD19
CD3/CD4
CD3/CD8
CD3-/CD56 y 16
Células mononucleares aisladas, panel de activación'
CD45/CD14
Inmunoglobulinas control de isotipo de ratón
CD3/CD25 (IL-2R)
CD3/HLA-DR
' Si el CD3 está bajo, entonces repetir y añadir CD2. Posteriormente, pueden
añadirse monoclonales trente al receptor de las células T acoplado con CD3.
También pueden evaluarse los marcadores de monocitos. Esto también puede
realizarse utilizando reactivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como
iniciador
' Después de 2 días de cultivo, extraer las células y lavarlas antes de teñirlas
con los anticuerpos monoclonales escogidos: analizar las células control que
no contienen activador, después analizar las células activadas. Los activado-
res pueden incluir mitógenos. IL-2 y/o mleilerón-y.
Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un
amplio grupo de antígenos, requieren la maduración tímica para su función
normal y median la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las
inmunoglobulinas de superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclona-
les como el CD19 o el CD20) y tras una activación adecuada se diferencian en
células plasmáticas que secretan anticuerpos específicos, mediando, de este
modo, la inmunidad humoral. La falta de un timo normal comprometerá la fun-
ción de los linfocitos T y afectará a la activación de los linfocitos B dependien-
tes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la médula ósea puede afectar tanto a
la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de los linfocitos B. aunque
pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se describe con más
detalle posteriormente en la Proliferación linfocítica como método In Vitro de
evaluación de la inmunidad celular.
La distinción entre respuesta inmune específica y no especifica es una
necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya que el sistema debe ser
capaz de distinguir entre lo propio y lo extraño. En general, esto se logra
medíanle la incorporación del sistema de autoantigenos del complejo mole-
cular MHC en la fase de reconocimiento antigénico. El antigeno debe ser pro-
cesado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y con-
ducir al desarrollo de la memoria inmune. La función del procesamiento
antigénico se lleva a cabo por las células presentadoras de antígeno (APCs),
siendo el monocito la mejor estudiada. Esta respuesta dispara la activación y
la proliferación de los linfocitos. y puede incluir la producción de células elec-
toras y la activación de los linfocitos B para producir anticuerpos. Este tipo de
inmunidad, a menudo denominada inmunidad adaptativa. se mantiene como
"memoria" y se desencadena típicamente después de inmunizaciones o in-
fecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresión del antígeno MHC de
clase II puede detectarse en los linfocitos por citometría de flujo utilizando
anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor mar-
cador de déficit de MHC de clase II (Tabla 36-7).
Un segundo tipo fundamental de inmunidad puede describirse como la
inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aumenta con contactos repeti-
dos. Esta inmunidad está mediada por las células fagociticas. algunas de las
cuales, como el monocito. también pueden procesar y presentar antígenos, y
las células NK. A diferencia de las células fagociticas. las células NK no están
desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la ato-
cina clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduración de
este sistema, está también disminuida al nacer.
Esta tercera rama está representada por las células NK. que no son ni
célula B ni exactamente células T por no tener ni inmunoglobulinas de super-
ficie ni el receptor de células T. Estas células, antes llamadas células "K", célu-
las "nulas" o "tercera población", ha eludido la clasificación convencional por
análisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador
más definitivo de la célula NK (Trinchieri. 1998). Las células NK han sido más
855
conocidas como células que pueden matar inespecíficamente (naturalmente)
a las células infectadas por virus y bacterias y que evitan las metástasis de
las células tumorales. Sin embargo, las células NK también regulan funciones
de las células T y B y la hemalopoyesis. Estas funciones de las células NK
son, probablemente, dependientes de su capacidad para producir linfocinas,
particularmente IFN-y. Las células NK son importantes para la activación de
las células fagociticas independientes de antígeno durante las fases precoces
de la infección y para favorecer el desarrollo de las células Th1 específicas de
antígeno. El sistema NK está por naturaleza activado y no tiene que ser indu-
cido por antígenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan con anti-
cuerpos específicos, estas células pueden matar específicamente. La evalua-
ción funcional de esta población celular puede llevarse a cabo de forma
adecuada utilizando un análisis rápido de liberación de cromo ¡conocido como
un ensayo de citotoxicidad NK empleando K-562s como dianas) o mediante
citometría de flujo. Los estudios futuros estarán encaminados a detectar cómo
las células NK ligan la inmunidad innata y la adaptativa (Peritt, 1998).
Desarrollo de la respuesta inmune
Si se ha determinado que la población de células está esencialmente
intacta en ausencia de activación, la cuestión de un fallo intrínseco puede
estudiarse mediante muchos abordajes diferentes que incluyen el análisis
expandido de marcadores de superficie de linfocitos, entre ellos los determi-
nantes del receptor antigénico de las células T (TCR) y los antígenos de acti-
vación como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7). La ausencia de
regulación del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemplo. Aunque
las poblaciones celulares pueden expresar un antígeno de diferenciación nor-
mal de referencia, también pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo
cual puede ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las células
T CD8+ que coexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las células
CD8 que no expresan este marcador y se encuentran expandidas en la enfer-
medad por VIH (Giorgi, 1989). La ausencia de expresión de ciertas molécu-
las, como el CD28. también es un indicador importante. En algunos síndro-
mes de inmunodeficiencia primaria, la regulación del receptor de IL-2 en
respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden no estar trans-
locados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematura-
mente (Cunningham-Rundles. 1990).
El desarrollo de la respuesta puede ser anormal cinéticamente, debido al
retraso del reclutamiento secundario durante la fase de amplificación. Esto
debe ser comprobado mediante estudios periódicos. En algunos casos, no
pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas. Las
funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evalua-
ción puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la res-
puesta añadiendo citocinas pueden ser útiles, aunque pueden no mostrar la
lesión al compensar y no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias
de análisis pueden utilizar sangre en lugar de células mononucleares aisladas
(Bocchieri, 1995). Este sistema proporciona una excelente visualización, ex
vivo, de la respuesta inmune, ya que las relaciones reales entre las células no
se alteran. Además, este sistema puede utilizarse para medir la producción de
citocinas (Petrovsky, 1995; De Groóte, 1998; Suni, 1998).
Se aconseja al laboratorio de inmunología clínica elegir estudios analíticos
básicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base
para la comparación. El establecimiento de los valores de referencia y el man-
tenimiento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especial-
mente para ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sen-
sibilidad de estas pruebas.
PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO
IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR
Inmunología celular
Activación y proliferación linfocítica
Aunque el sistema inmune se divide clásicamente en componentes humo-
ral y celular, esta separación no es absoluta, ya que hay una considerable
interdependencia entre las células B y las células T.
 856 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA Í INMUNOPATOIOGÍA
El parámetro funcional de la inmunidad celular más frecuentemente medido
es la proliferación linfocitaria. La medida de la activación/proliferación de los
linfocitos ha evolucionado sustancialmente desde finales de los años 50 e ini-
cio de los 60. cuando la división celular se determinaba por el recuento del
número de linfocitos que se habían transformado en blastos. Estos métodos
fueron reemplazados por la cuantificación de la incorporación de precursores
marcados de los ácidos nucleicos (timidma tritiada) en el ácido desoxirribonu-
cleico (ADN) recién sintetizado. Aunque este "análisis en masa' permanece
como el procedimiento de laboratorio más frecuentemente utilizado para
medir la proliferación celular, recientemente han aparecido nuevos reactivos
y nuevos procedimientos para evaluar la activación y proliferación linfocitaria.
Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferación de
la superficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de células en fases
especificas del ciclo celular, la cuantificación de citocinas y de receptores de
citocínas asociados a células y la posibilidad de evaluar el número de divisio-
nes celulares en linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta
sección se revisan los acontecimientos moleculares implicados en la activa-
ción y en la proliferación de los linfocitos T y se revisan algunos de los nue-
vos métodos que se han desarrollado para evaluar las funciones del sistema
inmune celular.
Determinación de las vías bioquímicas
de la activación linfocitaria
Tras la interacción específica del mitógeno o el antigeno/MHC con los
receptores apropiados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celula-
res que incluyen cambios en el transporte de membrana, redistribución del
sistema del ciloesqueleto (polarizando el linfocito hacia la APC) y la activación
de múltiples vías de señalización. Estos cambios conducen finalmente a la
diferenciación de la célula T. a la secreción de citocinas. a la proliferación, a
la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones actuales están desvelando las
complejas rutas moleculares y bioquímicas que conducen a la célula T acti-
vada por estas rutas. Constantemente se están descubriendo alteraciones
especificas en estas vías y subyacen en muchas de las enfermedades de la
inmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los análi-
sis de proliferación en masa indican solo que no hay división celular o que
esta es limitada y no proporcionan información sobre las alteraciones subya-
centes de la activación del linfocito. Se requieren ensayos más sofisticados
para investigar las alteraciones subyacentes de las células T.
Activación de los linfocitos T inducida por antigenos
La activación de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una
serie de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre
la activación de una célula T nativa frente a la activación de una célula T de
memoria. El antigeno es procesado por las células B o por los monocilos pro-
vocando el ensamblaje de péptidos inmunogénicos en los productos de los
genes del MHC de clase I o II El complejo péptidoMHC es presentado a las
células T que portan el receptor apropiado de esa célula T. Además, la APC
expresa una serie de moléculas de adhesión y coestimulación que interactúan
con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de la célula
T. La unión aislada del receptor de la célula T no es suficiente para la activa-
ción de la célula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 señales" para la
activación de la célula T (Brestcher, 1992). La primera señal que ocurre por la
vía TCR/CD4/CD8 modula la transición de la célula T en las primeras etapas
de la activación (p ej.. de G a G.). La 2- señal se produce por la via de los
0
coestimuladores. más concretamente por el CD28 y en menor medida por
LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la inducción de la IL-2 y de otros genes de
citocinas requeridos para la proliferación y diferenciación de la célula T hacia
células efectoras.
Reconocimiento de las células T, activación
y transducción de la señal
El complejo TCR está compuesto por una estructura de reconocimiento
del antígeno heterodimérica (esto es. el TCR) y un complejo de transducción
no unido covalentemente que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la
superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de señali-
zación por si mismo. La estructura de reconocimiento antigénico está com-
puesta por cadenas estructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuente-
mente por las cadenas y y 6) y el complejo de transducción CD3 está
formado por cinco cadenas polipeplidicas invariantes, a. p\ e. y un dímero
de cadena zeta. Cada una de las proteínas del CD3 contienen un residuo lla-
mado residuo inmune de activación de la tirosina (ITAM). que se une al domi-
nio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f¡ (que existe como un
homodímero f¿ una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y)
contiene 3 ITAM y es el componente más significativo del complejo TCR.
estando implicado en la transducción de la señal desde el TCR (Weiss
1994). Inicialmente descritos por Reth (1989). estos residuos juegan un
papel esencial en los acontecimientos iniciales que siguen a la activación de
las células Tflrving. 1991). Las moléculas CD4y CD8 de la superficie de las
células T también están unidas de forma no covalente al complejo TCR Se
unen a las moléculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la APC y
también están implicadas en la transducción de las señales de activación
Una vez procesado el antigeno, este es presentado a las células T en el con-
texto de los antigenos del MHC. En general, las células T CD4+ responden
a antígenos exógenos procesados y presentados en el contexto de MHC de
Clase II y las células T CD8+ responden a antigenos endógenos procesados
y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los CD4 y los CD8 tam-
bién están asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontecimientos
precoces tras la activación de las células T. Además de estas interacciones
y las interacciones de las moléculas «estimuladoras, otro grupo de molécu-
las (moléculas de adhesión), presentes tanto en la APC como en las células
T respondedoras, se unen unas a otras y sirven para aumentar la avidez de
la unión.
Las moléculas coestimuladoras identificadas en las APC incluyen el B7
(CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (Azuma. 1993). el antigeno estable al calor
(HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 1998; Wingren. 1995) Sobre las células T.
la CD28 es la principal molécula «estimuladora y se une al B7: la CTLA-4.
por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y está implicada en la dismi-
nución de modulación de la activación de las células T (Linsley, 1991b). El
receptor en las células T para el HSA no ha sido identilicado. La presenta-
ción del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las moléculas
coestimuladoras lleva a una respuesta anérgica (tolerancia) en posteriores
exposiciones a ese antígeno especifico pero no afecta a las respuestas a
otros antígenos (Tan, 1993). La posibilidad de hacer no inmunogénicos a
tumores inmunogénicos transplantados transfiriéndoles el gen 87 (Townsend.
1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994) sugiere que las moléculas
coestimuladoras juegan un papel importante en la activación de las células T
in vivo.
Transducción de señales después de la estimulación
antigeno-específica
La presentación del antigeno a las células T conduce a la agregación del
complejo del TCR-CD3 y a la activación de la proteína tirosina cinasa (PTK),
El TCR por si mismo tiene un pequeño dominio ciloplasmático sin actividad
de transducción conocida. Es la cadena asociada ¡¡ del complejo CD3, que
contiene residuos ITAM y que se ha demostrado que coprecipita la actividad
de la proteína tirosina cinasa Dos clases bien conocidas de familias citoplas-
máticas de PTK están implicadas en las etapas mas precoces que siguen a
la agregación del receptor de células T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascadas de
señalización que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la vía de la
coestimulación por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activación de
1-
las tirosina cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la acti-
b
vación de tres vías. p2T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La
activación del p21"» activa las proleína cinasas activadas por mitógenos
(MAPK) que fosfonlan muchos factores de transcripción regulando de este
modo la expresión genética. La activación de la tirosina cinasa también activa
a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y origina la generación de
los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol trifosfato (IP3). El
DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rápido y sustancial
aumento del calcio ciloplasmático. El aumento del calcio libre activa la fosfa-
tasa calcineurina dependiente de calmodulma.
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
Estos procesos también conducen a la inducción de proteínas de unión al
ADN y a la transcripción de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor
de IL-2 requeridos para la proliferación de la célula T. Para más información
sobre las vías de transducción molecular tras la activación del TCP. y el CD28,
consultar a Wiss (1994). Zhao (1997), Foletta (1998) y Halloran (1999).
La comprensión de las vías que conducen a la activación de la célula T ha
llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de muchas enfermeda-
des de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a proporcionar
estrategias terapéuticas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se han
publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y están asociadas
con la forma autosómica del síndrome de la inmunodeficiencia combinada
severa (SCID) en humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena común
y de los receptores de interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan ano-
malías de la transducción y están asociadas con la forma ligada al cromosoma
X del SCID (Noguchi, 1993). Es interesante hacer notar que otras formas de
SCI adquiridas autosómicamente están asociadas con las mutaciones en la
proteína tirosina Jak3 de la familia de proteínas Jano. la única molécula de
señalización asociada con la cadena común y (Russell. 1995). A medida que
se van descubriendo más anomalías subyacentes que conducen a la inmuno-
deficiencia de células T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse
empleando un extenso sistema que identificará los trastornos de acuerdo con
las alteraciones en la diferenciación, la maduración y la función (Gelfand.
1993). Estas designaciones podrían comenzar a enfocarse en los defectos
fisiológicos o bioquímicos propiamente dichos y pueden finalmente proporcio-
nar nuevas opciones terapéuticas. Para una revisión de las alteraciones mole-
culares específicas que originan alteraciones en la activación y proliferación de
la célula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (1993) y IUIS (1999).
Respuestas de la célula T
Recientemente, se ha preterido la designación de la respuesta de la célula
T tipo I frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de
la célula T que originan unos patrones de secreción de citocinas que se sabe
que están implicados en la inmunidad celular frente a los patrones de secre-
ción de citocinas observados en la inmunidad humoral, respectivamente. Las
respuestas tipo I se caracterizan por la secreción de citocinas que se sabe
que aumentan la inflamación (promflamatorias) e inducen la activación y la
proliferación de las células T y los monocitos, a saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las
respuestas tipo II se caracterizan por la secreción de citocinas que suprimen
la inflamación (antiinflamatorias) y estimulan a las células B a dividirse y dife-
renciarse en células secretoras de inmunoglobulinas (esto es, IL-4, IL-5, IL-10
e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secreción de las citocinas del
tipo I regulan la secreción de las citocinas tipo II y viceversa (Paul. 1994). Por
ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Châtelain, 1992) como ih vitro
(Seder, 1992:1993). las células T no se diferencian en células secretoras de
IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta inmune
humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 pre-
sentes durante la estimulación de las células T nativas dirigirán la respuesta
hacia un lado o hacia otro (Paul, 1994).
Muchos factores están implicados en la regulación del tipo de respuesta de
la célula T que sigue a la estimulación antigénica. Además del ambiente de
citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antígeno influye en el
tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreñas, 1995). La respuesta predomi-
nante que se desarrolla Iras la activación de la célula T tiene implicaciones clí-
nicas significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de
tipo I a la infección por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora
(Clerici, 1994). Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la
mayoría de las personas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen
por intensa inmunodepresión. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que
la exposición repetida a una dosis baja de VIH-1 puede originar una inmuni-
dad protectora celular tipo I. Los resultados de estos grupos indican que entre
el 39% y el 75% de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC)
de los individuos de alto riesgo (varones homosexuales, adictos a droga vía
intravenosa y niños nacidos de madres VIH positivas) seronegativos para
VIH-1 y negativos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secre-
tan IL-2 en respuesta a la proteína env in vitro. Estos científicos proponen que
857
estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad
protectora mediada por células como resultado de una baja dosis de inmuni-
zación o de infección.
Metodología: determinación de la activación y
la proliferación linfocitica en la evaluación
de la inmunodeficiencia celular
Los defectos del desarrollo, las alteraciones genéticas congénitas y las
infecciones adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Ade-
más, las quemaduras graves, los traumatismos y las intervenciones terapéu-
ticas también originan mmunodeficiencias. Los análisis en masa pueden
emplearse para determinar si un individuo tiene o no una disminución de la
respuesta proliferativa de las células T y han estado disponible durante algún
tiempo pero están limitados por una baja reproducibilidad y por la limitada
información que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologías ha permitido
la producción de una variedad de reactivos que pueden emplearse para eva-
luar múltiples actividades a lo largo de la via de activación de la célula T. Estos
reactantes incluyen anticuerpos monoclonales específicos como marcadores
de la activación de la célula T. reactivos y sistemas para la detección de cito-
cinas intracelulares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioac-
tivos del ADN desarrollados para evaluar la proliferación linfocitica.
Procedimientos empleados para evaluar la activación
y la proliferación de la célula T
El procedimiento más frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmu-
nidad celular es una simple prueba cutánea. Una prueba cutánea positiva
para la delección de una respuesta de hípersensibilidad implica una inmuni-
dad celular y una quimiotaxis de monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las
pruebas cutáneas se llevan a cabo fácilmente, los resultados negativos son
difíciles de interpretar, especialmente en niños pequeños, y las pruebas cutá-
neas no son tan sensibles como los ensayos de estimulación de linfocitos in
vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad mediada por célu-
las son la sensibilidad por contacto, la formación de granulomas y el rechazo
alogénico.
Los linfocitos son los únicos en los que se expresan receptores de superfi-
cie capaces de identificar virtualmente cualquier molécula o sustancia extraña
(antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por el
reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la célula T. En gene-
ral, solo hay un número limitado de linfocitos circulantes capaces de recono-
cer un antigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extraño, las
células proliferan rápidamente de forma clonal para generar un gran número
de células tanto efectoras como de memoria.
Los primeros métodos empleados para evaluar la proliferación linfocitica
incluían el recuento manual del número de células antes y después de la esti-
mulación. Desgraciadamente, estas técnicas requieren mucho tiempo y pre-
sentan muchos problemas técnicos. En los últimos años se han desarrollado
nuevos métodos que miden los diferentes acontecimientos celulares que ocu-
rren en la ruta de la división celular. Hay que subrayar que los métodos que
miden los sucesos iniciales en la activación del linfocito T pueden o no corre-
lacionarse con la división celular.
Ensayo de incorporación de timidina tritiada H 3
(ensayo TdR)
Muchos laboratorios evalúan la capacidad proliferativa de los linfocitos cal-
culando el grado de incorporación de nucleósidos radiactivos del ADN (timi-
dina tritiada) durante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubación prolongada
de cultivos celulares de mononucleares de sangre periférica con mítógenos
(tres a cuatro días) o con antígenos (5 a 10 días). En general, solo un número
limitado de células T responden a un antigeno in vitro; por lo tanto, las célu-
las deben cultivarse durante 5 a 10 días para detectar la respuesta. Los mito-
genos, por otra pane, inducirán la rápida proliferación de hasta el 100% de las
células T. Por esta razón, la proliferación puede detectarse en tres o cualro
dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva. La trans-
formación linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtógeno fue descrita por pri-
 858 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

mera vez por Nowell (1960). Los mitógenos son, en general, los estimulado-
res más potentes, ya que activan una gran proporción de linfocitos en relación
con los aloantigenos y los antigenos.

Citometria de flujo en la evaluación de la activación

y la proliferación linfocitaria

Los análisis en masa, además de sus inherentes problemas técnicos, no

proporcionan información sobre las subpoblaciones celulares específicas
que están respondiendo. La citometria de flujo con su potencial multipara-
métrico inherente se ha convertido en el instrumento de elección para el
análisis de la inmunología celular. La figura 36-1 ilustra algunos de los acon-
tecimientos celulares que ocurren a lo largo de la ruta de activación/prolife-
ración de la célula T que pueden medirse por citometria de flujo. Para una
revisión extensa de la citometria de llujo y de los métodos empleados para
evaluar la activación y la proliferación linfocítica. véase Bauer (1993) y Sha-
piro (1995).
Otro método basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso
importante en los laboratorios clínicos es la medida de los linfocitos en varías
fases del ciclo celular. En general, los análisis del ciclo celular se llevan a
cabo midiendo el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de
ADN. El marcador empleado más frecuentemente es el yoduro de propidio.
que interacciona estequiométricamente con el ADN (esto es. la cantidad o
intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de la
célula). Utilizando complejos modelos matemáticos, es posible medir el por-
C
centaje de células con un contenido en ADN entre 2- y 4 , que se correlaciona
con el porcentaje de células en fase "S" del ciclo celular. En general, los lin-
focitos de sangre periférica se encuentran en la fase de reposo del ciclo celu-
lar, con menos del 5% de las células en la fase "S"
Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporación de
timidina tritíada por análisis de inducción de marcadores de superficie celular
combinados con una medida del porcentaje de células en vanas fases del
ciclo celular tras la activación (Cost. 1993).
Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de forma
estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso de
marcador, se estimula la división de los linfocitos. Con cada división sucesiva
la cantidad de marcador por célula se reduce a la mitad. La fluorescencia
emitida por las células tras el cultivo puede modelarse permitiendo la esti-
mación del número de divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodología se
ha estandarizado recientemente en un equipo analítico que incluye el soft-
Figura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activación de
los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de Sha-
piro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397
Copyright <g Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsi-
diaria de John Wiley 8 Sous, Inc.)
FLUORESCENCIA I.OÍÍ l»KH26
Figure 36-2. Empleo de marcadores de seguimiento PKH26 en linfocitos periféri-
cos estimulados y no estimulados por mitógenos tras cinco dias en cultivo. La pro-
liferación celular se indica por la dilución de la intensidad fluorescente en cada
generación sucesiva. (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Citometry. 3* ed.
Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pág. 3 1 3 . Copyright í Wiley-Liss. 1995. Reimpreso
con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)
ware necesario para el análisis junto con los marcadores de rastreo (Sigma
Immunochemicals. St. Louis. MO). Una evaluación de 14 de los marcadores
utilizados más frecuentemente informó que dos de los marcadores. PKH26 y
el ester succinimidilíco del diacetato de carboxifluoresceina (CSFE). eran los
más adecuados por su capacidad para cuantificar la proliferación de los lin-
focitos (Parish, 1999). Este ensayo puede proporcionar la evaluación más
fiable de la respuesta proliferativa celular en sistemas de cultivo in vitro con
ventajas importantes sobre los análisis en masa habituales, permitiendo la
medición de subpoblaciones específicas de linfocitos. Los indices de CSFE
parecen correlacionarse más estrechamente con los análisis con TdR que la
medida de las células CD69* (Ángulo. 1998). La medida de la proliferación
linfocitaria empleando las sondas marcadas PKH26 y el CSFE ha sido des-
arrollada, optimizada y analizada para su empleo en aplicaciones clínicas
(Allsopp, 1998; Ángulo. 1998).
La posibilidad recientemente desarrollada de medir la producción de ato-
cinas asociadas a las células a nivel de una sola célula tiene un importante
potencial como herramienta clínica en la evaluación de la respuesta celular
inmune. Básicamente, las células son estimuladas, ya sea como PBMC o
como sangre completa, durante cuatro a seis horas en presencia de reacti-
vos que bloquean el transporte de membrana (breleldina A o monensma)
para evitar la secreción de atocinas. Entonces, se marcan las células con
anticuerpos monoclonales específicos de cada subpoblación, se fijan, se
permeabilízan y se marcan con anticuerpos monoclonales fluorescentes
específicos para el estudio de la citocina de interés (Jung, 1993; Prussia
1995). El ensayo se ha desarrollado en presencia de anticuerpos «estimu-
ladores para la detección sensible de respuestas antigénicas en cultivos de
sangre tras periodos relativamente cortos de incubación (Suni, 1998). Se ha
prestado especial atención al desarrollo de anticuerpos que reconozcan las
formas de nacientes de las citocinas (dentro del aparato de Golgí) y la opti-
mización del tiempo de cultivo para detectar la máxima respuesta de las ato-
cinas (Mascher, 1999). Los estudios clínicos han comenzado a demostrar la
utilidad potencial de esta técnica. Por ejemplo, los pacientes que sufren que-
maduras muy graves y que muestran una deriva hacia la respuesta de cito-
cinas Th2 pueden tener un riesgo mayor de desarrollar fracaso multíorgánico
(Zedler. 1999). Esto puede ser muy ventajoso, ya que no hay pruebas actua-
les que indiquen qué pacientes sufrirán esta complicación potencialmente
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
mortal. Se están realizando actualmente muchos estudios que evalúan la
utilidad clínica de esta prometedora nueva tecnología. Se ha informado la
expansión de esta técnica para incorporar la capacidad de medir simultáne-
amente la proliferación y la síntesis específica de citocinas a nivel de una
sola célula pero todavía no ha sido evaluada en un marco clínico (Mehta,
1997).
Ciertamente, se están desarrollando nuevas técnicas que miden los dife-
rentes acontecimientos implicados en la activación de la célula T. Hay méto-
dos y reactivos disponibles para medir los acontecimientos precoces de fos-
forilación/desfosforilación hasta la transducción de señales, la transcripción
de los genes y la división celular. Según se adapten estos métodos a la acti-
vidad clínica diaria, podremos disponer de un arsenal de estos para evaluar
muchos de los procesos implicados en la activación y proliferación de los lin-
focitos. Aunque un elevado número de estas nuevas tecnologías todavía
están en manos de los laboratorios de investigación, los métodos se están
simplificando y adaptando constantemente para su uso y evaluación en los
laboratorios clínicos.
FUNCIÓN GRANULOCÍTICA EN LA INMUNIDAD
MEDIADA POR CÉLULAS
Tanto los monocitos como los granulocitos derivan de un precursor co-
mún. Los granulocitos son extremadamente importantes en la respuesta
inflamatoria precoz, y las alteraciones en sus funciones conducen a defi-
ciencias importantes en la inmunidad celular. Estas suceden en cualquier
punto de una serie de procesos necesarios para la función de los granuloci-
tos, incluyendo la dificultad en abandonar la vasculatura (diapédesis), el
movimiento hacia el agente agresor (quimiotaxis. quimioquinesia). la opsoni-
zación del agente agresor (fagocitosis) y la destrucción por la vía de la gene-
ración de radicales tóxicos del oxígeno.
METODOLOGÍA: CITOMETRÍA
DE FLUJO Y DE IMAGEN
El empleo de la citometria de flujo (análisis celular basado en el láser) se
ha convertido en el estándar de la práctica del laboratorio clínico en el estu-
dio de respuesta inmune celular, como se indicó previamente (Kamientsky.
1969; Hertzenber, 1976). Las determinaciones de la inmunocompetencia e
¡nmunomodulacíón de los marcadores y receptores de superficie específi-
cos, la caracterización de la línea por medio de la fenotipificación inmune
de los linfomas y de las leucemias, la definición de malignidad empleando
sondas específicas de cromosomas, así como el estudio de la heteroge-
neidad tumoral por las mediciones multiparamétricas del ADN son estudios
frecuentemente realizados en muchos laboratorios, como se estableció pre-
viamente, y se detallan en Keren (1989a. 1989b), así como en muchas
otras referencias mencionadas a lo largo de este texto. La clasificación de
los tipos celulares por estos medios significa la posibilidad de definir las
funciones biológicas y efectoras en las bases moleculares y permite esta-
blecer las relaciones de estas mediciones con procesos y definiciones de
enfermedades. Estas son unas pocas de las aplicaciones que son posibles
empleando las tecnologías basadas en el láser. Se utilizan dos tecnologías
principales. En la primera, conocida como citometria de flujo, se contabili-
zan las partículas y se determinan las características físicas y químicas de
las partículas que pasan a través de un flujo de líquido en una suspensión
de células aisladas. En la segunda, conocida como análisis estático, las
partículas son estacionarias y la plataforma o el láser se mueven como en
un análisis de imagen (Martin-Reay. 1994). La tecnología del análisis de
imagen se está haciendo un hueco poco a poco en el laboratorio para la
evaluación de citospines preparaciones de contacto {louch preparations).
en preparaciones cromosómicas. y en secciones titulares para ciertas apli-
caciones, como la hibridación ¡n situ fluorescente (FISH) y de DNA. Los
avances en la disponibilidad de las sondas fluorescentes para la FISH y la
representación cromosómica en los años recientes hará que estos análisis
859
sean más relevantes y útiles en el laboratorio clínico (Weinberg. 1993). Re-
cientemente, la FDA aprobó el anticuerpo monoclonal obtenido por inge-
niería genética trastuzumab (Herceptin) para el tratamiento de pacientes
con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan el gen
HER2meu y al mismo tiempo aprobó una prueba diagnóstica en la que se
usan métodos de inmunohístoquímica (IHC) para la detección de la protei-
na HER2/'neu, que es la diana del anticuerpo. Otra prueba que utiliza la
FISH para detectar la amplificación de la expresión génica de la proteina
HER2/neu se está utilizando en laboratorios especialmente entrenados.
Cada prueba complementa a la otra, poseyendo cada una distintas dificul-
tades técnicas y sensibilidad. El IHC suele producir falsos negativos debido
a la existencia de artefactos y necesita ser revisado por otro método. Con
el FISH existe la posibilidad de falsos positivos (la expresión génica no
tiene por qué equipararse necesariamente con la amplificación génica).
Como sucede en muchas técnicas, incluyendo el análisis del ciclo celular
en el ADN. cada uno de los nuevos marcadores y de las nuevas técnicas
deben ser definidos, evaluados y correlacionados con los resultados del
paciente antes de otorgarle o no una utilidad clínica absoluta. Se ha intro-
ducido el desarrollo de instrumentación que combina la fuerza de la cito-
metria de flujo y las ventajas estáticas del análisis de imagen. Esos instru-
mentos, conocidos como citómetros de exploración por láser, realizan las
mediciones tradicionales de citometria de flujo de dispersiones hacia ade-
lante, dispersiones laterales y fluorescencia en las células en suspensión o
fijadas en el portaobjetos. La experiencia con estos sistemas determinará
si este abordaje ofrece ventajas de las que no se dispone con la citometria
de flujo actual y con las configuraciones de sistemas de imagen (Martin-
Reay, 1994) (Fig. 36-3). Los citómetros de exploración por láser y los aná-
lisis de imagen no se desarrollan en este capítulo.
Los avances combinados en el procesamiento por pulsos electrónicos, óp-
ticos y en el almacenamiento de datos junto con los avances en la tecnología
de los ordenadores y del software han permitido que la tecnología de la cito-
metria de flujo llegue a ser una rutina en el laboratorio. Además, la amplia
posibilidad de anticuerpos monoclonales agrupados, que incluyen más de 150
(Kishimoto, 1998), marcados con muchos colores, directamente conjugados y
en formato preformado ha permitido la detección simultánea de múltiples anti-
genos de superficie así como de constituyentes citopiasmáticos y nucleares.
La posibilidad de desarrollar análisis multiparamétricos es la mayor fuerza de
la citometria de tiujo. Actualmente, la determinación tanto de los marcadores
fenotípicos como de los intracelulares es una rutina en muchos laboratorios.
Los principales fabricantes han desarrollado el arte de la citometria de flujo
convirtiéndolo en una ciencia de rutina en los laboratorios (ciencia de "caja
negra") para desgracia de muchos. Como se ha descrito, este fenómeno es
el resultado del uso de la citometria de flujo en la fenotipificación de las pobla-
ciones de las células T para la monitorización de los pacientes con VIH (Sha-
piro, 1993: Centers for Disease Control [CDC], 1992; Calvelli, 1993). Antes de
la aparición de la epidemia del VIH, la utilidad de la citometria de flujo en el
laboratorio lúe principalmente para la caracterización de las leucemias y de
otras enfermedades hematológicas malignas y para el análisis del ADN de
tumores en la fase de síntesis (fase S) y el índice de ADN (DI). Aunque la tec-
nología de la citometria de flujo puede ser más "caja negra", la epidemia de
VIH ha aportado la citometria de flujo a un número mucho mayor de institu-
ciones y laboratorios [College of American Pathology [CAP]. 1990-2000). Esto
ha permitido a esta tecnología ser una parte integral de muchos diagnósticos
y un importante complemento en el tratamiento de los pacientes. A pesar de
su simplificación, persisten muchas cuestiones relacionadas con la regulación
de la FDA, la competencia de los análisis y la gestión y reproducibilidad de los
datos. Eslo es particularmente cierto en lo referente al análisis del ADN (CAP,
1990-2000). No es el propósito de este capítulo describir todos los matices de
la citometria de flujo o de la citometria de imagen. Todas las citometrías de
flujo actuales pueden utilizarse adecuadamente como rutina en la fenotipifi-
cación y análisis del ADN. La mayoría de los problemas de los laboratorios
son la imposibilidad de estandarizar los reactivos de control de calidad y los
calibradores y la pérdida de métodos rápidos y fiables para la transferencia y
almacenaje de datos, compatibles con los sistemas de información del labo-
ratorio. Se insta a los lectores a que consulten las numerosas referencias para
una selección apropiada del citómetro de flujo o de imagen referente en
cuanto a sus muchas configuraciones y capacidades (Shapiro, 1993, 1995).
860 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 36-3. El empleo de citómetro de exploración por láser (LSC) produce dalos que son comparables a los datos de la citomelría de flujo:
sin embargo, debido a que la máquina se basa en cortes, hay algunas diferencias clave. A diferencia de la citomelría de flujo, en la que toda
la información de cada célula se encuentra en un solo pulso electrónico para cada parámetro, la LSC emplea cientos de mediciones para cal-
cular y extraer los parámetros para cada célula. También es posible obtener parámetros derivados. El valor celular es la cantidad total de fluo-
rescencia por célula, pero los parámetros derivados, como el área celular y el valor pico, son también importantes. La figura muestra los datos
de una preparación con cytospin de células HL-60 que fueron marcadas con yoduro de propidio (Pl). Se muestra el histograma de un solo
parámetro del valor rojo, así como las tres posibles combinaciones de los parámetros rojos derivados. De particular interés es la agrupación
de células localizada debajo de la letra c. La muestra tue teñida con hematoxilina y eosina. y las células de las áreas marcadas (videsupca)
fueron trasladadas. Se muestran las lotos digitales de las primeras 20 células trasladadas a cada región. Las células en la región c están en
mitosis. mientras que las células en la región d, b. y a se corresponden a células a través de las etapas G.a, G,b. y G;m del ciclo celular.
(Cortesía de CompuCyte. Cambridge, MA.)

Más importante para los médicos es la comprensión de la tecnología, las for-
talezas y las debilidades en el control y garantía de la calidad, en la prepara-
ción de la muestra y en la interpretación de los datos.
Hardware y otras herramientas
Fuente luminosa y procesamiento de la señal
La citomelría de flujo actual rara vez se utiliza para realizar una clasifica-
ción, y esta propiedad persiste con los elementos de investigación en los
laboratorios altamente especializados. La citometría de flujo clínica emplea
ahora helio-neón o diodos láser y láser de ion de argón refrigerados por aire
o un único ion de argón refrigerado por aire con emisión a 488 nm (Bogh.
1993). El láser actual tiene una salida de pocos milivatios, entre 10 y 20 mW,
y dura más de 6.000 horas. Esos láseres, comparados con los previos refri-
gerados por agua, son fáciles de mantener, no requieren precauciones espe-
ciales de seguridad y son más baratos de sustituir. Si un laboratorio está inte-
resado en desarrollar cinco o más colores de análisis empleando sondas de
Hoescht estimuladas con radiación ultravioleta, entonces es necesario
emplear grandes láseres refrigerados por agua de 5 W combinados con los
láseres refrigerados por aire, aunque los nuevos instrumentos con nuevos
láser están eliminando la necesidad de los láseres relrigerados por agua. La
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
mayoría de los citómetros de ílujo multifacéticos clínicos utilizan un láser sim-
ple de ion argón refrigerado por aire con un minimo de cuatro tubos lotomul-
típlicadores. Las configuraciones instrumentales más Irecuentes incluyen el
Becton-Dickmson FACScan que está siendo reemplazado por el FACS-Cali-
bur (tiene un módulo de clasificación con capacidades limitadas) y el FACS
Vantage para ocho o más parámetros y categonzación de alta velocidad. El
Coulter Protile II y el Odho Cytoron, instrumentos de laboratorio habituales,
ya no se fabrican y han sido sustituidos sobre todo por el Coulter XLs o el
FACSCalibur. Beckman Coulter continúa con el Coulter XL y software mejo-
rado para el tratamiento de datos. Además, el ASTRA de Beckman Coulter
añade a la categonzación de alta velocidad, ocho parámetros adicionales
para el laboratorio de investigación. La introducción del XL como última tec-
nología en citometría de flujo con el empleo de señales de procesamiento de
pulso digital (Coulter, 1994; Shapiro, 1995). con convertidores de analogía
digital de alta resolución (ADCs). invalida el uso de los amplificadores loga-
rítmicos (log amps). Este es un importante avance ya que elimina cuestiones
de alineación y baja sensibilidad en los límites bajos (umbral) en la medición
de la intensidad de fluorescencia. En la citometria de flujo tradicional, las
mediciones de la fluorescencia se realizan en una escala lineal pero tienen
que ser convertidas a logaritmos para que la escala sea razonable (para
colocar todos los puntos de interés). Este proceso en los instrumentos no
digitales se lleva a cabo con el empleo de ACD con amplificadores logarít-
micos. Desgraciadamente, esta conversión de la señal lineal por medio del
ADC a los amplificadores logarítmicos ocasiona un ruido que origina un
aumento de los coeficientes de variación de procesamiento de la señal (CV)
al aumentar la señal fluorescente Esto hace que cada medición tenga dife-
rente sensibilidad ya que el CV de la señal de conversión aumenta con un
mayor número de canales (Shapiro. 1995a). Aunque muchos técnicos que
utilizan una citometria de flujo clínica realmente no entienden la causa de la
sensibilidad variable de los amplificadores logarítmicos en sus instrumentos,
se enfrentan a los resultados o a la falta de respuesta en ciertas regiones de
su escala logarítmica. La linealidad es particularmente importante en la
medición del contenido del ADN (como las mediciones del ADN se hacen en
una escala lineal, los problemas de la amplificación logarítmica se eliminan
pero entran en juego otros factores electrónicos similares) ya que el valor DI
depende de su exactitud. Ademas, la alineación se está haciendo cada vez
más importante en la medida cuantitativa de la fluorescencia de la prolifera-
ción y la activación (Auer. 1994; Shapiro, 1995) así como está afectando al
valor pronóstico de los valores de la fase S en ciertos cánceres. El laborato-
rio debe realizar medidas de linearidad. sensibilidad y resolución, y controles
de calidad antes de desarrollar trabajos clínicos. Los controles de calidad
diarios se definen posteriormente en este capítulo. Se remite de nuevo a los
lectores a revisar referencias apropiadas para ampliar con detalle (Bauer.
1993: Shapiro, 1995).
Flujo celular
En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, pero como la
mayoría de los instrumentos clínicos se utilizan en la medición de las células
CD4 en la monitonzación de la enfermedad por VIH, la mayoría de los siste-
mas clínicos utilizan un sistema cerrado como precaución de riesgo bioló-
gico. El primero, conocido como un flujo celular de corriente en aire o de flujo
en aire, permite que el punto de medida óptico se encuentre directamente
sobre la corriente de muestra. Este tipo de flujo celular minimiza la distancia
entre la cámara de flujo y la punta del inyector de la muestra y por lo tanto
minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de lavado de muestra nece-
sario entre las mismas. Esta cámara permite una mayor variabilidad del
grado de flujo de la muestra que en un sistema cerrado (Shapiro. 1993:
Bogh. 1993). Otras ventajas de las puntas en la corriente en aire son impor-
tantes en la clasificación celular y no se consideran aquí. En el sistema
cerrado, a menudo referido como punta de cuarzo o célula de flujo, el punto
focal está dentro de la cámara. Las desventajas de estos sistemas de cuarzo
son la fineza del cuarzo y por ello la difracción del haz del láser o la disper-
sión de la señal. Adicionalmente. la sección cuadrada tan relativamente
amplia (200/ pm) hace que sea más difícil controlar el flujo. El éxito de estas
células de flujo de cuarzo en el sistema clínico depende de la iluminación y
de las ópticas de recogida. Los fabricantes conocidos han avanzado mucho
861
en estos sistemas para proporcionar seguridad y una máxima sensibilidad
con el uso de sistemas basados en láser de baja potencia iBogh. "993).
Todos los términos empleados en la definición de estos sistemas son confu-
sos, incluyendo la tasa del flujo, la cubierta de presión, el tamaño de la parte
central, la velocidad resultante de la partícula, el CV resultante, etc El factor
más importante que ha de comprender un trabajador de laboratorio es que
en el análisis del ADN, las células son analizadas con un flujo bajo para
aumentar el tiempo que permanece la partícula en el haz, lo que permite una
mayor sensibilidad y un mejor CV. En la inmunotipificación. la sensibilidad no
es un problema especial, y el flujo de la partícula puede aumentarse. Muchos
sistemas clínicos están comprometidos en acomodar las dos aplicaciones
más frecuentes: la inmunotipificación y el análisis del ADN (Shapiro, 1993,
1995a: Goetzman. 1993). Los citómetros de flujo de investigación tienen mu-
cha mayor flexibilidad y el operador puede controlar el flujo de la muestra, la
presión diferencial y el tiempo
Colores y más colores:
aplicaciones de los fluorocromos
Muchos laboratorios todavía emplean los fluorocromos más frecuentes, el
isotiocianato de fluoresceína (FITC: 530 nm de emisión) y el ficoeritrin (PE;
575 nm de emisión) en la medida del ADN (Shapiro. 1995b). El FITC y el PC
se conjugan directamente por el anticuerpo de interés y simultáneamente se
añaden a la muestra del paciente. Ya no se requiere del uso de un anticuerpo
secundario como una IgG de carnero antirratón (GAM) marcada con fluores-
ceína para tener una mayor sensibilidad, y por lo tanto se minimiza la fluo-
rescencia de fondo. Muchos de los anticuerpos utilizados en la clínica en el
estudio del VIH son premezclados y prediluidos para su empleo con sangre
completa. El Pl puede utilizarse simultáneamente con el análisis de superficie
realizado en el análisis multiparamétrico del ADN, aunque esto requiere la
conservación de la membrana celular (Clevenger, 1993).
Existen más tinciones disponibles en el laboratorio clínico que permiten
mediciones simultáneas de cuatro colores con anticuerpos monoclonales
marcados directamente y excitados en un láser a 488 nm. Esta disponibili-
dad está revolucionando el desarrollo actual de la citometria de flujo en la
práctica de laboratorio Estas tinciones con una emisión roja o roja lejana
incluyen el tándem PE Texas Red (625 nm de emisión), el tándem PE-Cy-5
(675 nm de emisión) y la alolicocianina (675 nm de emisión), por nombrar
unos pocos (Fig. 36-4). Los primeros tándem eran problemáticos ya que el
exceso de PE libre en la solución conducía a un exceso de fluorescencia de
fondo. Están surgiendo nuevas tecnologías para la síntesis de estas tincio-
nes, resolviendo muchos de los problemas técnicos, y constantemente se
están añadiendo nuevas tinciones para el empleo en el laboratorio clínico
(Clevenger. 1993). Con la disponibilidad de las tinciones rojas y rojas lejanas,
se puede desarrollar un análisis de la población de VIH en un único tubo con
gran seguridad. Un tubo con 100 pL de sangre completa se liñe simultánea-
mente con CD45, PE-Cy-5. CD3 PE-Texas Red. CD8 FITC y CD4 PE. Con
el nuevo procesamiento de señal digitalizado. la compensación (wde inlral
se lleva a cabo fácilmente, y se realiza el análisis empleando el CD45 como
un agente iniciador mediante dispersión lateral (SSC) y el análisis simultáneo
de CD3. CD4 y el CD8 (Fig. 36-5). Otro fenómeno interesante es que estas
nuevas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia como un ini-
ciador en lugar de los parámetros habituales de dispersión de luz. Esto es
posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes
de la mayoría de las células o no tienen competición autofluoresceme en
estado natural como se encuentra con el FITC. Además, pueden excitarse a
una longitud de onda que minimiza la autofluorescencia de los constituyen-
tes celulares como la riboflavina. Por tanto, cuando ocurre un suceso raro
(presencia celular <0.1% de la población total) empleando un iniciador fluo-
rescente, se pueden analizar muchas células rápidamente Este método
también se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utilizando
fluoresceina como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el núcleo o el
citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. Los métodos de eva-
luación de sucesos raros son cada vez más frecuentes y más fiables para el
laboratorio clínico. Se han realizado y evaluado algunas investigaciones. En
la evaluación de la enfermedad residual mínima (MRD) incluyen la PCR. la
citometria de flujo combinada con sondas nucleares, la citometria de flujo
 862 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA

Figura 36-4. Sondas fluorescentes frecuentes empleadas en la citometría de flujo multicolor multiparamétrica (De Shapiro HM: Practical Flow
Cytometry. 3- ed. Nueva Cork, Wiley-Liss, 1995. pág. 245. Copyright © Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsi-
diaria de John Wiley & Sons. Inc.)

con la utilización de múltiples marcadores que delinen el fenotipo leucémico
y varias aplicaciones del FISH. Los datos sugieren que la remisión real de la
médula ósea en la leucemia mieloide nunca ocurre realmente como se ha
demostrado en el análisis de citometría de flujo; simplemente es un tema de
nivel de sensibilidad y de detección del suceso (Campana. 1995.1999). Esto
obviamente tiene grandes implicaciones cuando se correlacionan los resul-
tados de la citometría de flujo frente a los criterios morfológicos de remisión
y predicción de recidivas. Sigue evaluándose cómo afectará esto a las estra-
tegias de tratamiento en varias enfermedades hematológicas malignas. Ade-
más, el empleo de la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es más habi-
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
tual. La detección de las señales de RT-PCR en pacientes que se encuen-
tran en remisión clínica todavía no está clara, mientras que la detección del
MRD por amplificación de la PCR de los genes del receptor antigénico se ha
correlacionado consistentemente con los resultados del tratamiento (Cam-
pana, 1999).
El empleo de fluorescencia multicolor ha permitido que el concepto del
análisis mulliparamétrico llegue a ser una realidad en muchos laboratorios.
Los parámetros pueden evaluar 1) diferentes poblaciones funcionales de una
población celular particular empleando unas sondas fluorescentes mtracelu-
lares; 2) el empleo de muchos colores para identificar pequeños grupos de
863
otros sucesos no identificables de otra forma (como en el MRD): (3) el esta-
tus de activación celular en una etapa particular de la enfermedad (p. ej., el
empleo del HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estadificación del
VIH empleando un abordaje en ancla): (4) asi como observar la expresión
de la superficie celular y el DI o fase S de una población particular de célu-
las al igual que definir la fase S CD19 en la leucemia aguda. Obviamente,
las posibles combinaciones son casi infinitas y su sofisticación está aumen-
tada por la disponibilidad de marcadores específicos y sondas de ADNARN
(Fig. 36-6). A continuación se expone un análisis sobre algunas de esas
investigaciones y técnicas.

4 C O L O R (1)45/4/3/8

Figura 36-5. A. Empleo de la atometría de flujo de cuatro colores en el desarrollo del panel de moni
tonzación del VIH. El método demuestra el empleo del CD45 como estrategia de comienzo y el
empleo del CD45 y la dispersión de luz en el desarrollo de una diferenciación en tres partes (H-6). El
empleo de la citometria de flujo de cuatro colores permite que las poblaciones de células T sean medi-
das en el mismo tubo y que todas las células sean contadas. El histograma 7 se incorpora en la región
F contenida en el histograma 1 (FALX frente a SSC). En el histograma 1. el empleo de la región Q
define los desechos. Si estos son mayores del 15% del total de sucesos, normalmente se toma como
una muestra inaceptable. Esta investigación permite analizar todos los parámetros y compararlos
entre si. (Los anticuerpos monoclonales directamente conjugados fueron de clones Coulter o (Sector-
Dickinson para el FTIC PE. Coulter para el ECD y de Callag Corporation para el Cy-5-CD45.)
La ilustración continúa en página siguiente
864 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 36-5. Continuación. B. panel de monilorización del VIH como en A, excepto que en este caso los paneles incorporan el empleo de un
parámetro de recuperación lintocítico calculado con FALS trente a SSC y CD45 y Irente a SSC. Adicionalmente, en H:2 se demuestra el
empleo de una entrada-T. Estas estrategias de recepción permiten calcular y comparar múltiples valores del CD3 trente a otros.

Figura 36-6. El empleo de la citometría de

flujo multiparamétrica permite la detección
simultánea de una superficie fluorescente
(CD20 positiva) y por lo tanto la definición de
la linea celular y después la posibilidad
simultánea de medir la intensidad de yoduro
de propidio y así la medición del contenido
total de ADN. para identificar las células leu-
cémicas específicas marcadas como CD20.
Esta técnica evita la necesidad de aislar la
población de interés antes de la tinción del
ADN y puede hacerse simultáneamente con
la tinción de la médula ósea para la evalua-
ción leucémica. Otras poblaciones, como las
citoqueratinas y otros marcadores de estirpe
celular, pueden ser identificadas en tubos
adicionales. La muestra de médula ósea fue
teñida con CD20 FITC (Coulter, Miami, FL) y
ID Pcnt después fijada empleando metanol, permea-
11 1.7 bilizada usando Tritón X al 0.1%, y teñida
con solución de yoduro de propidio (Pl) y
12 71.2 ARNasa estándar. Los linfocitos de sangre
13 1.4 periférica fueron utilizados como control nor-
14 25.6 mal no ciclico (no se muestran los dalos).
 CAPITULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
RECEPCIÓN Y ANÁLISIS
Inmunofenotipificacion: aplicación
a las muestras habituales y leucémicas
El análisis de las poblaciones celulares con la citometría de flujo emplea
una combinación de parámetros que. cuando se aplican, definen una pobla-
ción especifica de células. La citometria de flujo emplea parámetros similares
a aquellos que se han empleado durante muchos años en hematología, inclu-
yendo el tamaño (por dispersión de luz hacia delante), la granulación cito-
plasmática (dispersión lateral), las afinidades por marcadores específicos y
otros, y las combina con las herramientas inmunológicas ya mencionadas.
Estas incluyen múltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o
sondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien Pl o 4'6-diamidin-2-
fenolindol (DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la detección
simultánea de estos parámetros por los sistemas analíticos actuales. Durante
muchos años, la citometria de flujo del laboratorio clínico sólo podía emplear
tres mediciones simultáneas incluyendo la dispersión de luz hacia adelante
(FALS) frente al SSC, frente al FTIC o al PE. La tinción de las poblaciones
celulares estaba limitada por la no disponibilidad de anticuerpos monoclona-
les conjugados directamente, necesitándose la utilización de un reactante
GAM secundario o el empleo de anticuerpos marcados con bíotina. La defini-
ción de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran tondo hizo
necesario el uso de un algoritmo de resta canal por canal para diferenciar lo
positivo de lo negativo (Bagwell. 1993). En los casos en los que la población
celular tiene un límite definido entre negativo y positivo, se colocaba un cur-
sor de modo que no más del 2% de los acontecimientos considerados como
negativos cayeran a la derecha del cursor, diferenciando los acontecimientos
positivos empleando un control isotípico emparejado. Aunque esta investiga-
ción parecía razonable en aquel momento (Lewis, 1993) y funcionó bien con
grupos celulares brillantes, se ha hecho bastante incómoda a la hora de iden-
tificar células leucémicas o de desarrollar análisis de marcadores de activa-
ción celular. Las células leucémicas eran particularmente problemáticas, por-
que cada leucemia tiene su propia intensidad fluorescente "relativa" y los
controles isotópicos pueden tener poca relevancia. La aplicación de reglas
estrictas y rápidas a los cursores de posición conducía a una infraestimación
de los grupos positivos. El fallo de esta lorma de actuación se hace especial-
mente dramático en el análisis de la monoclonalidad de la expresión de cade-
nas ligeras K y A. A menudo se perdían diferencias pequeñas pero significa-
tivas. Se ha cuestionado en muchos casos el empleo de isotipos de control en
ciertas situaciones, tanto por las aberraciones técnicas asociadas con su uti-
lización como por los costes añadidos al laboratorio. Los nuevos algoritmos
de software tienen la capacidad de realizar mediciones de intensidad y de
definición de grupos basándose en los significados de las intensidades de las
poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas asi como la
cuantilicación del MESF real [vide intra). Claramente, ha de considerarse la
necesidad de recordar lo que estamos midiendo y comprender la biología de
la población de interés cuando se diseña un protocolo de análisis. Afortu-
nadamente, algunos software sofisticados y los mejores reactantes nos han
permitido utilizar entradas multiparamétncas para identificar las poblacio-
nes, antes que intentar hacer estimaciones de la expresión fluorescente
empleando valores cursor. Muchos investigadores han empleado la investi-
gación mulliparamétrica para definir grupos u otras poblaciones de interés
(Shapiro, 1995c; Loken, 1987; Terstapen, 1988,1990; Verwer, 1993; Porter,
1999). Estas investigaciones tienen muchas formas, y algunas de ellas se
revisan aquí.
Con la llegada de la florescencia multicolor surgió la necesidad de anali-
zar el número de células que expresaban uno o más colores al mismo tiempo
en una población celular particular identificada por las regiones FALS y SSC.
Cuando se desarrolló este método por primera vez. los científicos estaban
pensando básicamente en cálculos matemáticos y recuento de todas las
células y en el número de estas células que expresaban uno o más colores.
Se desarrolló una investigación binaria para este análisis, conocida como
prisma (Coulter. Hialeah, FL). Las regiones de análisis tenían una entrada
difícil y fueron introducidas en el instrumento por el operador. Estas regiones
no se podían redefínir posteriormente utilizando listas de análisis de modos,
865
provocando una frustración importante. La técnica fue modificada con poste-
rioridad para permitir más recepciones, y otros fabricantes con el software
realizaron esta aproximación binaria con base postanalílica Loken entonces
identificó las poblaciones de la médula ósea empleando el CD45 frente al
SSC. una investigación única para identificar las poblaciones heterogéneas
presentes en la médula ósea (Fig. 36-7). Estos y otros iBorowitz. 1992) des-
arrollaron el concepto de patrones que identifican estados leucémicos espe-
cíficos. Shapiro empleó una vía de estimulación para definir la evolución de
este concepto (Shapiro, 1995c). Después Loken promocionó el empleo del
análisis de entrada dual-paramétrico con CD45 y CD14 en la región linloci
tica del FALS frente al SSC en sangre periférica (Loken, 1990). Muchas
agencias aceptaron y promovieron esta investigación en la mayoria de los
paneles de citometria de flujo para el VIH para minimizar el efecto de los
monocitos contaminantes en la población Imfocítica ya que podrían interferir
con el recuento real de linfocitos CD4. porque los monocitos tienen recepto-
res CD4 en su superficie (Passlick. 1989). Las agencias que iniciaron este
tipo de análisis incluían los Centros para el Control y Prevención de Enfer-
medades (CDC. 1992), el Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e
Infecciosas, la División de SIDA (NIH, DAIDS) (Calvelli, 1993). el Estado de
Nueva Cork, el Comité Nacional para la Estandarización del Laboratorio Clí-
nico (NCCLS. 1992) y el CAP (1990-2000). Desgraciadamente, aunque esta
investigación solucionó muchos problemas, no asegura que cada tubo en el
panel tenga los mismos contenidos que el tubo que contiene el CD45 y el
CD14, y la corrección purificada corregida puede ser sobreestimada, condu-
ciendo a valores incorrectos del CD4 Estos temas fueron revisados durante
una conferencia convocada por el CDC. un año después de que se publica-
ran las líneas para el desarrollo del recuento del CD4 en el VIH (Steizer.
1993; CDC. 1993). Otros análisis de esta investigación se han desarrollado
por el ACTG Flow Advisory Comittee en el programa DAIDS Proficiency
CD4.CD8 iCDC. 1 9 9 3 ; Kagan, 1993) y por el CAP en su programa de aná-
lisis de competencia (Homberger, 1993). Una nueva investigación de recep-
ción fue evaluada en los paneles del VIH que siguieron a la investigación
original de Loken para identificar los grupos de la médula ósea (Loken.
1990). El empleo del CD45 como parámetro de entrada ha simplificado el
análisis de la médula ósea, las leucemias y los paneles de VIH. En las revi-
siones de médula ósea y leucemia, el CD45 normalmente se establece
como un tercer o cuarto color y se empareja con la dispersión luminosa
anterior o la dispersión lateral; esto permite la identificación de una pobla
ción potencial de blastos (malignos) La población de blastos entonces se
identifica empleando un panel de monoclonales utilizando los tres paráme-
tros de color disponibles (Fig. 36-7). En el VIH. el método de CD45 en tubo,
con cuatro colores, permite la identificación de una región grande de linfo-
citos iniciados, que son introducidos secundariamente para el CD45. Esto
también puede hacerse sin la utilización de los parámetros de dispersión
luminosa, como se describió previamente (también puede hacerse em-
pleando un panel de dos tubos, tres colores). Recientemente, nuevos pro-
ductos (Becton-Dickinson y Beckman Coulter) añaden gotas precontadas ai
tubo de contenido monoclonal y esto permite el recuento absoluto de irfo
citos (conocido como flujo diferencial) para realizarse al mismo tiempo que
la fenotipificación. Esto elimina la necesidad de realizar un recuento hema-
tología) cuando se desarrollan las enumeraciones de célula T y elimina los
problemas del deterioro de los glóbulos blancos al empaquetarse y permite
un diferencial exacto para obtener el número de células T exacto. Estos
métodos están siendo incorporados en los ensayos ACTG VIH y en oros
laboratorios.
Otra estrategia de recepción es el empleo de dos o tres identilicadores de
una población particular de interés. Esta investigación, frecuentemente cono-
cida como puerta de entrada (anchor gating), utiliza las propiedades particu-
lares de algunas células para investigar otro tipo de parámetros. Cuando se
aplican específicamente a linfocitos T, se considera como una puerta-T
(Mandy. 1992). El empleo de una puerta de entrada (Paxton, 1995) es de
especial utilidad cuando se buscan los marcadores de actividad, como en las
poblaciones de VIH CD3 CD8 que expresan CD38 y HLA-DR o para buscar
la expresión de CD45Ra y CD45Ro frente a CD3CD4 o CD3CD8. La ventaja
de este método es que es intuitivo y que cada color actúa como un control de
calidad para la otra población (Fig. 36-8). Además, tenemos la posibilidad de
identificar la expresión de marcadores biológicamente relevantes en relación
 S66 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

3: P 4: k
ENTRADA Bl ÁSTIC A

ENTRADA DF. MEDULA OSEA 45

(1)34 C"D33 (1)45

Figura 36-7. Médula ósea utilizando entrada de CD45 frente a la tradicional entrada de imagen luminosa: (paneles
H1-H3): H1: FALS frente a SSC. H2: entrada linfática. FTIC frente a PE, identificando la población de blastos
CD34/CD33 doble positiva (61,1% de todos los linfocitos se identifican como blastos). H3: Entrada total. CD34/CD33
doble positivo (43,6% del total de acontecimientos identificados como blastos). H4: Blastos identificados por el CD45
frente al FALS son iguales a 46,5% (letra región k). con un 74,8% CD34/CD33 doble positivo. Paneles H5, H6, H7:
Dispersión lateral identificada por marcador fluorescente de interés (PE-CD33, FITC-CD34. Cy-5 [tricolor] CD45).
(Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente fueron obtenidos tanto de Coulter como de Becton-Dickm-
son para los clones FITC- y PE marcados. Coulter para los clones ECD marcados y Caltag Crp. [S. San Francisco,
CA] para los clones Cy-5 marcados.)

con las poblaciones funcional o biológicamente relevantes. Esta evaluación
es buena por si misma para cuantificar la fluorescencia (véanse histogramas
2 y 3. respectivamente). Aunque el concepto de fluorescencia cuantitativa no
es nuevo, sí lo son las técnicas para medir los equivalentes de fluorescencia
o los umbrales de fluorescencia u otros similares. Las mediciones cuantitati-
vas de la fluorescencia se describirán tras el análisis y entrada del ADN. Otra
investigación para la puerta de entrada se encuentra en la recogida de CD34,
que emplea el CD34 y el CD45 teñidos con o sin ADD como una evaluación
de viabilidad en la identificación y enumeración de los progenitores celulares
CD34. Estos métodos también utilizan gotas para enumerar el número de
células recubiertas. Estos métodos tienen gran utilidad en los protocolos de
trasplante de médula ósea en los que los progenitores celulares se extraen de
la sangre del cordón, de la médula ósea o de sangre periférica y, posterior-
mente, se reinfunden (p. ej., The Internacional Society for Hematolherapy and
Graft Engineering [ISHAGE] (Fig. 36-9). Esta investigación se ha convertido en
el patrón para muchos laboratorios que realizan trasplantes. La Figura 36-9
delinea dos métodos estándar, el ISHAGE y el protocolo Milán para desarro-
llar la enumeración de CD34. Un sistema comercial llamado ProCount (Bec-
ton-Dickinson) utiliza una investigación similar y reactivos para automatizar el
proceso. Adicionalmente. se ha diseñado un método capilar llamado ensayo
Steller, un procedimiento sin lisado ni lavado para el IMAGN 2000 (Becton-
Dickinson).
Análisis del ADN
Generalidades
Conceptualmente, la realización del análisis del ADN debería ser más
simple que el análisis de inmunotipificación, pero la revisión de los datos
publicados y sus capacidades pronosticas asi como los progresos por los
laboratorios sobre las pruebas de competencia indican otra cosa (Nicholson,
1993; Coon, 1994; Trinidelli Danesi, 1997). Se convocó una conferencia de
consenso de ADN y los resultados se publicaron en Cytometry (Shankey.
1993). Esta publicación fue una revisión histórica de los principales tipos de
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
tumores (en muestras en fresco, congeladas y en parafina) y del valor clínico
de la medida de la ploidia por DI y el valor de la fase S. Estos parámetros
fueron analizados en términos de efectividad como marcadores pronósticos.
La conferencia CAP #26 de 1994 se basó en los marcadores previos y en
marcadores indirectos de algunos tumores potenciales adicionales. En cada
caso, el DI y la fase E fueron menos predecibles como marcadores pronós-
ticos de lo que se esperaba. Esto fue atribuido a la variabilidad en la realiza-
ción técnica y al análisis de estos ensayos (tanto en la preparación de ins-
trumentos como de muestras) y en el riesgo inherente de la heterogeneidad
tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor. Se realizaron reco-
mendaciones específicas en cada tipo de tumor para las medidas apropia-
das de control de calidad que deben realizarse y de la ausencia de «involu-
ción apropiada de los histogramas.
Preparación de la muestra
Los métodos de preparación del ADN son razonablemente simples y bara-
tos de realizar. Existen muchas referencias para los métodos originales, asi
867
como muchas modificaciones. Los métodos más frecuentes, desarrollados
por Krishan. Vmdelov, Crissman. Steinkamp y otros (Rabinovitch, 1993; Vin-
delov, 1994), son aquellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aque-
llos que utilizan bloques de parafina con preparaciones de Hedley (1983). En
cada caso, ya estén las células enucleadas o conservada la membrana celu-
lar, el marcador Pl de ADN es el que más frecuentemente se utiliza en la
mayoría de los laboratorios clínicos y ya se ha descrito. La tinción Pl es
directa a condición de que se sigan el tiempo, la saturación y los parámetros
de extracción del ARN Las medidas de las alteraciones macroscópicas del
cariolipo se realizan comparando el pico (intensidad fluorescente, captación
de Pl) del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta
medición incluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor,
el índice GyG, o la linealidad del instrumento, linealidad medida por el
paquete de software de deconvolucion (Bagwell. 2000) y el porcentaje del
tumor presente (muestreado) en la muestra. Es frecuente ver que los labo-
ratorios publican el resultado de un tumor diploide en una muestra que "no"
contiene tumor. Los tumores con valores casi diploides necesitan reglas de
interpretación estrictas, como la definición de tetraploidia. Surgen más pro-

Figura 36-8, La citometría de flujo con cuatro colores para realizar estudios funcionales permite el estudio
recíproco de poblaciones celulares, como sucede con el estudio CD45Ro (definido como memoria) y el
CD45Ra (definido funcionalmente como nave) en un determinado subgrupo de células T. Esta figura
demuestra la definición de un ancla (Patxon. 1994) de CD3CD4 (región E) evaluada en los histogramas 5.
6 y 7 para la expresión de RARO. Los histogramas 2. 3 y 8 determinan RARO y las células no CD4. Esto
se puede utilizar como una determinación comparativa de los CD3 CD4 sin necesidad de un segundo tubo.
La fluorescencia en cinco colores debería permitir el uso simultáneo de CD8. que debería medirse y com-
pararse con los CD4. Obsérvese la ausencia clara de tinción no específica actualmente disponible utili-
zando directamente clones conjugados. El procesamiento digital pulsado permite la cuantificación directa
de estos marcadores en equivalentes de fluoresceina y la comparación de un punto y otro en el tiempo en
un estudio longitudinal mediante histogramas simples con parámetros, como es el caso de los histogramas
2, 3, 6 y 7. (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a través de CD45Ra y CD45Ro se
obtuvieron de Coulter y Becton-Dickinson. Todos los ensayos se realizaron utilizando los métodos de lisado
de sangre completa estándares).
 868 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

C8228950.02 C8228950.02 C8228950.02

Figura 36-9. Protocolos ISHAGE/Milán para la enumeración del CD34. Arriba, la enumeración de las células CD34+ en sangre del cordón
por análisis de citometria de flujo utilizando el protocolo ISHACGE (filas de arriba y del medio) o el protocolo Milán (fila de abajo). Se define
la estrategia de entrada para el ISHAGE. La estrategia utiliza la entrada secuencial para excluir los acontecimientos no CD34+ en la región
celular dim CD45 y para excluir las células muertas empleando 7AAD (no mostrado) (fila superior). La fila del medio muestra el protocolo
ISHAGE con un isotipo control. • El protocolo Milán utiliza un isotipo conlrol (diagrama de puntos del centro, abajo) para establecer los cua-
drantes, el inferior derecho se usa para excluir los sucesos putativos C034+. (De Sutherland DR Anderson L, Keeney M, y cois: The ISHAGE
guidelmes lor CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother 1996; 3:213, con permiso.)

blemas en la definición de los agregados, dobletes, detritus, tratamiento de
cortes y restos de núcleo y la población en fase S. La sigla, descriptiva y semi-
cuantitativa, de BAD se utiliza en el paquete de software de análisis para mol-
dear los efectos de fondo, agregados y dobletes (Ravinovitch, 1993, 1994)
(Figs. 36-10 y 36-11). El impacto de este parámetro en el análisis es contro-
vertido.
Las mediciones resultantes de la fase S y del DI utilizando un modo de
análisis paramétrico simple (sólo Pl) están sujetas a estos algoritmos de
deconvolución. llevando a una gran variabilidad entre los laboratorios
(Coon, 1994). Los algoritmos de deconvolución para el ADN se han estu
diado de forma extensa (Coon. 1994: Rabinovilch. 1993. 1994. 1999:
Wheeless, 1991: Shankey, 1993; Bagwell, 2000), pero muchos modelos
 CAPITULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
empleados para el análisis necesitan un mayor estudio. El documento de
consenso del ADN hizo recomendaciones especificas aplicables a ciertos
tipos de tumores y sugiere que los laboratorios desarrollen análisis en
concordancia, pero incluso con estas pautas existe un nivel de ambigüe-
dad en la interpretación y rendimiento en el laboratorio clinico. Estas
ambigüedades contribuyen a la discordancia de los resultados en estu-
dios comparativos asi como en las pruebas de competencia (Coon. 1988,
1994; Wheeless. 1991). La dilicultad de llegar a un consenso hace que la
interpretación de los resultados sea más difícil para los laboratorios nue-
vos y para ios el nicos que están intentando comparar los resultados de
su laboratorio con la bibliografía reciente en el tratamiento de sus pacien-
tes Esto es especialmente cierto en la clasificación de los valores de la
fase S. Las medidas de la (ase S están sujetas a los efectos de los res-
tos y modelación de los agregados como describieron Rabinovitch (1993.
1994. 1999), Bagwell ( 1 9 9 3 . 2000), Shankey (1993). Coon (1988), Whe-
eless, (1991) y otros. El área entre 2C y 4C está sujeta a interferencias
por artefactos. Además, es de importancia clave que la decisión con res-
869
pecto al modelo matemático usado para un tumor determinado se man-
tenga constante y que los datos del modo de lista se conserven sin cam-
bios por si se necesitan más análisis.
Debido a la dificultad en el análisis del histograma del ADN. algunos han
propuesto que las mediciones del ADN las realicen solo laboratorios exper-
tos. La actualización de la FDA no ha aclarado ningún método y todavía se
considera como una prueba en investigación. Desgraciadamente, durante
muchos años la práctica clínica sugería otra cosa. Múltiples artículos pro-
ponen realizar las mediciones de ADN conjuntamente debido al alto grado
de variabilidad y de pérdida de significado pronóstico (ASCO. 1996). Poste
riormente. varios grupos han conseguido avances significativos para resol-
ver algunos de los temas en el análisis (Rabinovitch. 1996) (Figs. 36-12 y
36-13). Está en desarrollo un patrón o guía de la NCCLS para su emplee
por los laboratorios. En cualquier caso, deben hacerse estrictos controles
de calidad para permitir mediciones significativas del ADN que puedan ser-
vir como marcadores pronósticos y como medidas de la actuación y prác-
tica médica.

Figura 36-10. Empleo de diferentes técnicas de entrada para el análisis del ADN A.
Pico tradicional frente a su integración con la correspondiente excusión de dobletes.
El histograma de un parámetro (inserto) demuestra la intensidad lineal del yoduro de
propidio (Pl) demostrando un pico diploide (2N) y un pico aneuploide G -G con el
correspondiente G..M. B. Nuevo método de entrada (K.D. Bauer. comunicaciones
personales [1994]) utilizando el cociente del pico trente a la medición integral y al
FL3 (área) Este método está siendo evaluado para mayor consistencia en la eva
luación de los valores de la fase S C. Pico frente a integral demostrando que el
66.8% de los acontecimientos se encuentran en la puerta de la población (pico
frente a integral, puerta b).
 870 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

80818589.H83 FL3 HP's "A" DIPLOID CVCLE

4(H)

Figura 36-11. A y 8, El empleo de técnicas con modelado informático en dos tipos diferentes de muestras. En A. se demuestra una linea
celular fijada. Esta preparación muestra pequeños restos y una buena recuperación de la población aneuploide. Ambas poblaciones demues-
tran un buen CV. El valor de la fase S es constante para una linea celular de la muestra. En B. se demuestra una sección de una muestra
en parafina con la presencia de restos y un pico casi diploide aneuploide. El CV es bueno, y los restos son minimos. La muestra demuestra
una fase S del 9%. (Cortesía de Multicycle Software, Phoenix Flow System. San Diego. CA.)

Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los deri- un modelo estático o un dibujo en el tiempo de todas las células analizadas.
vados de la timidina, la bromodesoxiuridina (BrdU). diversos abreviados, y La integración del área para el número de células entre 2C y 4C en el histo-
otros (Fig. 36-14) y naranja de acridina (ARN) para mejorar la calidad de los grama del ADN no es capaz de dar ninguna información respecto a las célu-
modelos en la estimación de las propiedades proliferativas y cinéticas de un las "detenidas" en S (las células en realidad detienen la síntesis de ADN) o
c

determinado tumor. Es importante recordar que las medidas de la prolifera- de medir el número de células normales infiltrantes que pueden estar también
ción no son iguales que las medidas de la cuantificación de la fase S, que son proliferando. El valor de la fase S a menudo puede ser mayor que la capaci-
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Contenido de A D N / D A P 1
Figura 36-12. Representación mulliparamétrica del contenido de ADN (escala ver-
tical) Irente a la fluorescencia de la citoqueratina (escala horizontal) que muestra
una población celular citoqueratina-positiva con menos de 2N de contenido de
ADN El estroma celular citoqueratina negativo se emplea para establecer la refe-
rencia 2N. permitiendo esto la identificación de las células hipodiploides. El histo-
grama sin entrada convencional en el panel inferior demuestra la imposibilidad de
asignar un contenido de ADN a la población celular mixta del tumor y de células
estromales (Glogovac, 1999).
dad proliferativa real debido a artefactos de la heterogeneidad tumoral. El his-
tograma de un parámetro proyecta resultados razonables cuando se trata de
una población celular asincrónica, relativamente homogénea. El mareaje por
pulsos se utiliza más frecuentemente en grandes entornos académicos y más
a menudo para medir la efectividad de la irradiación y quimioterapia obte-
niendo medidas reales de las células G,. G.. así como de los compartimentos
G + M. lo que no es posible empleando medidas paramétricas simples de la
fase S.
Pueden utilizarse otras técnicas con sondas nucleares y citoplasmáticas
asi como marcadores de superficie para separar la población de interés de la
mezcla de tipos celulares. Este tipo de análisis multiparamétrico es muy útil
para medir la lase S en las neoplasias hematológicas malignas (Fig. 36-6).
Puede identificarse la población especifica de blastos por el FITC fluores-
cente y por el FALS. y estos hechos pueden analizarse por el contenido de
ADN y de la lase S empleando el Pl. Los métodos de tinción están altera-
dos para conservar las propiedades de la superficie nuclear o las propieda-
des nucleares (Clevenger. 1993: Ramaekers, 1993: Carothers, 1994; Bauer,
1994: Rabinovitch. 1996: Poder. 1999). Estos métodos normalmente inclu-
yen la tinción del marcador de superficie de interés (p. ej.. KI-67. ciclina B1.
citoqueratina. CD10) con el anticuerpo monoclonal. fijación en alcohol (o
fijación comercial y permeabilización reaclante) y tratamiento con un deter-
gente para permitir la entrada de Pl u otro marcador nuclear. Los métodos
de tinción se modifican selectivamente para conservar las propiedades de
membrana y núcleo especificas de la sonda de interés (Bauer, 1994).
Esludios de interés del ADN
Se ha publicado mucho en la bibliografía sobre la apoptosis (a menudo
definida como muerte celular programada) y su relevancia en los parámetros
tradicionales del ADN y en otras consideraciones fenotipicas. No es el propó-
871
sito de este capítulo desarrollar este tema. Aunque se están realizando mu-
chos estudios, las mediciones de la apoptosis todavía no son parte de la ruti-
na del laboratorio clínico.
Como se mencionó anteriormente, el análisis de laboratorio del ADN se ha
controlado mucho, y en algunas regiones, estos esludios ya no se reembol-
san. Muchos investigadores de este campo han votado por la exclusión sis-
temática de esta prueba del laboratorio, aunque tiene cierta utilidad en ciertos
tumores. Bagwell y otros, están estudiando retrospectivamente la reevalua-
ción de un grupo de casos de cáncer de mama para tratar de desarrollar un
modelo pronóstico unificado para los pacientes con cáncer de mama con gan-
glios negativos En el análisis se incluyen un total de 350 histogramas de ADN
unívariantes de tres centros de cáncer de Suecia (Bagwell, 2000). El estudio
está tratando de identificar y corregir los factores que pueden haber dismi-
nuido la utilidad de la fracción de la fase S como describieron las recomen-
daciones de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO), para des-
arrollar un modelo pronóstico para el cáncer de mama ganglio-negativo, para
identificar posibles avances en los métodos de la citometría de ¡lujo y para
demostrar la utilidad de estas técnicas. Otro estudio de Rabinovitch (comuni-
cación personal. 2000) y col. se ha publicado recientemente sobre 630 mues-
tras de tumores de mama fijadas con formol de mujeres menores de 45 años
empleando un análisis bivariante de citoqueratina'ADN (Figs. 36-12 y 36-13).
Este análisis se desarrolló para aumentar la capacidad de detectar poolacio-
nes tumorales mezcladas donde los índices de supervivencia pueden dismi-
nuir y sus tumores hipodiploides o tetraploides pueden haberse perdido en el
análisis convencional del ADN. Se espera que estos estudios y otros hagan
resurgir lo que puede ser una herramienta pronostica y diagnóstica útil que
previamente quizá fue infravalorada por su complejidad.
Citometría de flujo cuantitativa:
mediciones de intensidad de fluorescencia
La definición de los tipos celulares en términos mmunológicos como las
células efectoras implica la propiedad de estas células de regular, ya sea
aumentado o disminuyendo, las funciones moleculares especificas a través de
receptores de superficie. Conocidas como fenotipos inmunológicos (Poncelet,
1993). estas células necesitan otras propiedades medióles para definir sus
papeles biológicos en la maduración y en los procesos de enfermedad. Uno de
los fenómenos observados es la diferente expresión de antígenos de superfi-
cie celular (CD) en términos cuantitativos relativos y absolutos. Antes de la dis-
ponibilidad de las medidas absolutas, los términos descriptivos como brillante
u oscuro, bimodal. y demás, eran utilizados en la bibliografía para describir un
fenómeno visual de diferentes densidades antigénicas. Aunque descriptivos,
estos términos son dificiles de definir y de estandarizar entre los laboratorios y
entre los pacientes. También pueden perder precisión a la hora de definir un
hecho y no pueden emplearse objetivamente para monitorizar el tratamiento
de los pacientes o la definición (tipo celular) mediante la medida de la expre-
sión de CD y el solapamiento de la expresión. La evidencia sugiere que las
diferencias cuantitativas en la expresión antigénica en la leucemia linfocítica
crónica y en otras leucemias puede ser importante para determinar el pronós-
tico (Poncelet. 1985). Estas medidas también se emplean en la definición del
MRD y en la investigación del efecto o activación viral en la enfermedad por
VIH (Poncelet, 1991). El porcentaje de células específicas presentes a menudo
no aporta una imagen clínica real. Esto es particularmente cierto en los casos
de leucopenia y cuando la población de blastos es un porcentaje relativamente
pequeño del total de células presentes.
La citometría de flujo cuantitativa (QFCM) se define como la cuantificación
de la intensidad fluorescente (Fl) determinada por la capacidad de unión del
anticuerpo de un anticuerpo conjugado con un fluorocromo. y es una medida
indirecta de la cantidad de antígeno celular de superficie por cada célula indi-
vidual (Stelzer. 1997). Los investigadores (Poncelet. 1985, 1986; Schwartz,
1994; Vogt. 1991. 1994) han descrito el empleo de granos de polieslireno o
líneas celulares mezcladas con cantidades saturantes de anticuerpo para
determinar el número de absoluto de receptores o de determinantes amígam-
eos por célula, también denominados densidad antigénica (Poncelet. 1993).
Las unidades ABC se definen como la medida de la capacidad retal/va de
unión del anticuerpo.
Figura 36-13. A Diagramas de contorno bivariantes de células de tumores tija-
dos en parafina analizadas con ADN (Pl) frente a tinción de citoqueratina (FITC).
Al Una población aneuploide de CK+ de cáncer de mama: A2, Un cáncer de
mama mulliploide con una población hipodiploide y casi Iriploide aneuploide.
Véase que el contenido diploide de ADN se identifica por la localización de la
población celular CK. A3. Un ganglio lintático axilar con metástasis de adeno-
carcinoma de mama. La presencia de la población celular muy pequeña ce célu-
las aneuploides (2%) es ambigua en los datos no metidos (véase Fig. 36-128):
sin embargo, en la presentación bivariabte. las células CK+ aneuploides son cla-
ramente evidentes. A4, Tinción con citoqueratina de células de tumor prostátíco
extraídas de biopsias fijadas en parafina. La exclusión de las células CK del
estroma en el análisis del ciclo celular del ADN incluye la medición del 2,6% a
3.9% de la fase S. 8, Histograma de ADN de un ganglio axilar con metástasis de
adenocarcinoma de mama mostrando un dato sin entrada (línea gruesa y línea
de puntos mostrando 10x en la escala vertical) y el dato de la citoqueratina del
ADN introducido (línea de guiones) La presencia de células aneuploides es
ambigua en los datos no metidos: si se reconocen como una población aneu-
ploide, representan solo el 2% de las células, concordando con la abundancia
histológica de linfocitos. (De Glogovac JK, Pierce R. Palanca BJA. Rabinovitch
PS: Cytokeratin Immunofluorescence in DNA analysis of paraffin extracted cells.
Clin Immunol. Newslett, 1996; 16:157-161. con permiso.)
 CAPÍTULO 36 • EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Este método no necesita igualar los Índices de fluoresceinaproteína (F P).
ya que las células y el modelo se han teñido con el mismo anticuerpo. El
empleo de mediciones de intensidad fluorescente debería proporcionar al
usuario un medio para evitar esta situación.
El empleo de lineas celulares o microgránulos para construir una curva de
calibración estándar sigue ciertos supuestos (modilicado de Poncelet. 1986):
1. Los anticuerpos en condiciones de saturación deben unirse a la super
ticie celular a través de una interacción monovalente.
2 El número de lugares antigénicos por célula puede inferirse de la canti-
dad de anticuerpo unido.
3. La intensidad fluorescente puede determinarse utilizando una curva
de calibración con células de diferente expresión antígénica o con gra-
873
nulos recubiertos de diferentes cantidades de mmunoglobulinas de
ratón a las concentraciones de saturación del anticuerpo. Estas medi-
das están sujetas a la variación de la capacidad de unión de los anti-
cuerpos monoclonales específicos con la inmunoglobulina de ratón,
asi como a las interacciones del poliestireno con los clones específi-
cos. Puede que estas medidas no se puedan transferir de un labora-
torio a otro y pueden no ser las mismas para los diferentes monoclo-
nales fabricados de la misma especificidad (Schwartz. 1994: Paxlon.
1995).
4. Se puede utilizar la intensidad de fluorescencia media del canal de
estas partículas, determinada por citometría de flujo, para estimar la
molécula del fluorocromo soluble equivalente (MESF) de una determi-
nada célula.

Figura 36-14. Este histograma demuestra el empleo del análisis multiparamétrico del ADN empleando BrdU como sonda nuclear. Fue reali-
zado empleando una línea celular CEM de crecimiento exponencial que fue marcada con BrdU y después con un anticuerpo FITC anti-BrdU
y teñida para el contenido de ADN con yoouro de propidio (Pl). La figura de abajo demuestra un control negativo (linea celular no ciclada o
linlocitos de sangre periférica |PBL|) utilizados para validar la unción con BrdU. Los controles negativos son obligados para el éxito de la inter-
pretación de estos análisis Estos estudios proporcionan una mejor comprensión de las células que están en el ciclo y en qué fase del ciclo
celular están.
 874 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
5. Estas medidas, si se llevan a cabo de torma indirecta utilizando una
fuente constante de inmunoglobulinas antirratones de cabra (GAM).
son independientes de las subclases de anticuerpo empleado para
detmir el antigeno.
6. Estas determinaciones pueden realizarse empleando monoclonales
conjugados directamente a saturación utilizando patrones de granulos
apropiados. Debe tenerse más cuidado para evitar problemas espacia-
les relativos al tamaño de la molécula de tluorocromo y los Índices de
fluoresceína'proteína.
Se puede obtener más información recurriendo al documento consensuado
de 1997 de U.S.-Canadá que revisa los parámetros necesarios para la estan-
darización (Stelzer. 1997).
Aunque precoces en su desarrollo, los fenotipos cuantitativos nos ayuda-
rán a definir programas de software de análisis de grupos para la cuantifica-
ción e identificación celular estableciendo la intensidad fluorescente media de
los canales como medida de separación de células con diferentes fenotipos
tuncionales.
CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA
DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR
En este capítulo, se han tratado de resaltar las áreas donde los médicos
asi como los laboratorios deben prestar particular atención a los métodos uti-
lizados y a las interpretaciones realizadas en la evaluación de la respuesta
celular. La garantía de la calidad y el control de calidad de los parámetros no
están bien definidos en esta área del laboratorio, y existen pocos estándares
absolutos cuando se compara con los análisis químicos o las determinacio-
nes de anticuerpos humorales. El éxito del laboratorio celular reside en su
aproximación al problema y en la evaluación longitudinal de la condición que
va a ser diagnosticada. Se señaló claramente que los estudios de base nece-
sitan repetirse si la evaluación original se lleva a cabo en un momento de
estrés inmunológico.
Los parámetros básicos de las variaciones diurnas en las poblaciones de
linfocitos son obvios pero a menudo se olvidan o se pasan por alto. Malone
(1990) concluyó que la variabilidad en las medidas del CD4 de los recuen-
tos absolutos se debe en un 50% a la biología y en otro 50% se debe a
otros problemas técnicos. Los factores que afectan la evaluación longitudi-
nal de las cantidades absolutas de CD4 en un ensayo clínico han sido revi-
sadas por Fei (1993). Además. Fahey (1990) revisó el valor pronóstico tanto
humoral como celular de los análisis en VIH. En otros ensayos clínicos
celulares, la variabilidad es inherente al ensayo debido a la falta de forma-
tos y métodos estandarizados asi como a los reactivos. Además, la cali-
bración de los instrumentos y la sensibilidad no están bien monitorizados.
Los ensayos con linfocitos T citotóxicos son particularmente difíciles de
estandarizar. Los ensayos históricos como la proliferación mitogénica son
también difíciles, con variabilidad entre los laboratorios. Por lo tanto, los
laboratorios que ofrecen estas pruebas inmunologías deben tener una
amplia base de dalos mediante la cual se pueda interpretar el resultado
individual del paciente. Los laboratorios celulares deben establecer rangos
normales para sus ensayos y tener cuidado en que los rangos normales de
adultos no se apliquen en los ensayos pediátricos. Esto es particularmente
problemático porque los rangos normales pediátricos son difíciles de deter-
minar debido a la falta de niños disponibles en el primer año de vida, y la
correcta interpretación de los resultados del laboratorio depende de ellos.
Deben hacerse cuidadosamente las comparaciones de los datos entre los
laboratorios.
Siempre que esté disponible, un laboratorio de inmunología celular debe
utilizar los estándares adecuados en el desarrollo de la citometría de flujo y
en el análisis del ADN y tener presentes las regulaciones federales y estata-
les con respecto al laboratorio, incluyendo la Ley de 1988 (Human Health and
Services Clinical Laboratory Improvement Acf). Además, deben participar en
pruebas de capacidad, cuando estén disponibles, y estar incluidos en progra-
mas de formación incluyendo evaluaciones de competencia para todo el per-
sonal implicado en la prueba. Todos los ensayos desarrollados en el labora-
torio deben incluir un control normal y. cuando sea posible, controles durante
el proceso para establecer la validez del ensayo. Las muestras enviadas
deben ser cuidadosamente controladas en cuanto a la exposición al calor y al
frío y el tiempo desde que se extraen al paciente Debe acompañar a las
muestras una historia clínica para que se puedan realizar estudios particula-
res de modo que el director del laboratorio pueda realizar la correcta aproxi-
mación a la prueba.
Se ha publicado un documento de consenso con recomendaciones sobre
el análisis inmunofenotipico de las neoplasias hematológicas por citometría
de flujo (Braylan, 1997). Este documento fue minuciosamente desarrollado
por los proveedores de la comunidad médica interesados en cubrir los proce-
dimientos de laboratorio, la selección de anticuerpos para la identificación de
neoplasias, el análisis de datos y la interpretación, informes médicos e indi-
caciones, en ausencia de equipos estandarizados y otros artefactos. La FDA
ha puesto en marcha la Analyte Specific Regulation |ASF¡. 1998). que elimina
reactivos como los monoclonales para su empleo en la investigación. Esta
regla no permite a los fabricantes decir a los empleados del laboratorio cómo
emplear sus reactivos. No pueden especificar las instrucciones de uso. La
regla ASR proporciona unos reactivos estables, bien definidos, fabricados en
buenas condiciones. Todos los laboratorios que utilizan estos reactivos como
una prueba de fabricación casera" deben desarrollar sus propios ensayos clí-
nicos y estudios de validación y deben emplear una declaración de descargo
de responsabilidad en su informe final. El documento de consenso permite al
laboratorio desarrollar sus análisis de un modo consistente y la definición del
significado clínico a un gran número de laboratorios e instituciones. El docu-
mento no es un patrón pero concuerda con otro estándar NCCLS que está
actualmente en uso. El laboratorio celular se enfrenta con una mayor dificul-
tad de trabajo de interpretación ya que los datos no son fácilmente estandari-
zabas. Además, la garantía de la calidad de la muestra y la evaluación reali-
zada dependen de la cuidadosa documentación de los parámetros biológicos
y logisticos que pueden influir en el resultado. El futuro de las pruebas utili-
zadas en la evaluación de los componentes celulares de la respuesta inmune
residen en el desarrollo de nuevos métodos que conduzcan a una mejor es-
tandarización.
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 C A P Í T U L O
S Evaluación del funcionamiento de las
#
> inmunoglobulinas y la inmunidad humoral
• Richard A. McPherson, M.D.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE
LOS ANTICUERPOS 878
Moléculas de anticuerpo
Interacción antígeno-anticuerpo
BASE GENÉTICA DE LA DIVERSIDAD
DE ANTICUERPOS 880
PROPIEDADES GENERALES DE
LAS INMUNOGLOBULINAS 881
Inmunoglobulina M
Inmunoglobulina G
Inmunoglobulina A
Los anticuerpos son las moléculas electoras de la inmunidad humoral
(mediada por células B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen
específicamente a los antigenos que estimularon su producción. Las inmuno-
globulinas constituyen un 20% de las proteínas plasmáticas de un individuo
sano. La actividad de los anticuerpos se asocia a las proteínas con menor
velocidad de migración en una electroforesis. las y-globulmas. Este capitulo
se centra en la discusión de las propiedades estructurales y funcionales de las
inmunoglobulinas, su evaluación en el laboratorio y su importancia clínica.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE
LOS ANTICUERPOS
Moléculas de anticuerpo
Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propieda-
des estructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford,
1991). Una molécula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de
"Y". Presenta dos dominios de unión al antigeno en las puntas de la "Y" (región
Fab) y zonas de unión para componentes del sistema del complemento y/o
varios receptores de la superficie celular en la cola de la "Y" (región Fe). Cada
molécula de inmunoglobulina está compuesta por 2 cadenas pesadas (H:
heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idénticas entre si. Estas cadenas poli-
peptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se
encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios de interacción
con el antigeno están compuestos por partes de ambas cadenas. Cada una de
las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una región varia-
ble de unos 110 residuos de aminoácidos en el extremo amino-terminal (las
puntas de la "Y"), que forma el dominio de interacción con el anligeno, unido a
una región constante. La región conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces
más grande que en la cadena L. Cada cadena está compuesta por repeticio-
nes de dominios plegados de forma semejante: una cadena L tiene un domi-
nio de región variable (V ) y un dominio de región constante (CJ. mientras que
la cadena H tiene un dominio de región variable (V,.) y 3 ó 4 dominios de región
constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la secuencia de aminoácidos en
H
37
Inmunoglobulina D
Inmunoglobulina E
Resumen
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS 886
Patogénesis
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES 888
Inmunoelectroforesis
Inmunofijación
Prevención de las enfermedades y terapia
BIBLIOGRAFÍA 891
las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3
pequeñas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo amino-
terminal de la molécula para formar el sitio de unión al antigeno. Cada domi-
nio de unión al antígeno tiene sólo el tamaño suficiente para unir un determi-
nante antigénico del tamaño de cinco o seis residuos de azúcar.
Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos distintos (y, a, p. 8, e)
y las cadenas ligeras de dos (•,- y X), donde algunos de los isotipos presentan
subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos y„ y , y y y.. Los
2 3
isotipos se torman como resultado de variaciones en las regiones constantes
de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas forman la
base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pesada
por sí sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se deno-
minan haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una
letra de nuestro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE).
Los anticuerpos tienen dos dominios idénticos de interacción con el anti-
geno. El dominio de interacción con el antigeno está compuesto por los ami-
noácidos de un tipo de cadena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molécula
monomérica compuesta por 4 cadenas (véase Fig. 37-1) posee dos sitios
idénticos de asociación con el antígeno, y se dice que son moléculas biva-
lentes. Estas moléculas son capaces de entrecruzar moléculas de antigeno,
si cada una de ellas presenta 3 o más determinantes antigénicos, formando
un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un deter-
minado tamaño, precipitará (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es impor-
tante fisiológicamente porque facilita ia internalización del antígeno. como
puede ser el expresado por bacterias o por leucocitos lagociticos. También
interviene en la activación del sistema del complemento. Además, este entre-
cruzamiento puede ser necesario para desencadenar la producción de anti-
cuerpos (por la acción de linfocitos B) por parte del antígeno. La eficiencia con
la que el anticuerpo se une al antígeno y produce entrecruzamiento se ve
aumentada gracias a una región muy flexible (región de bisagra) que se
encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que varíe
la distancia que separa los dos dominios de unión al antígeno.
La multivalencia afecta a la avidez con que un anticuerpo puede unir deter-
minados tipos de antígeno. Un antigeno particulado (como una bacteria o un
virus) presenta repeticiones de determinantes antigénicos en su superficie.
 CAPÍTULO 37 • EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
IKKK' OKIH
Figura 37-1. Representación esquemática de la molécula de inmunoglobulina G.
Se muestran las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e
intracalenarios que determinan los lazos Cada uno de los lazos determina un
dominio de cadena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indi-
can las regiones de corte enzimàtico más probables en la región "bisagra" por par-
te de la pepsina y papaina. Los fragmentos resultantes de la acción de la papaina
se laman Fab y Fe. Los fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2
fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro). La digestión de Fab con pepsina
en las condiciones adecuadas libera el fragmento F (V y V asociados de forma
v H L po. Esta unión reversible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes rela-
no covalente). La porción de la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab
se denomina Fd.
Una molécula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partícula de tal
forma que ambos dominios de interacción antigénica se encuentren unidos a
determinantes antigénicos de esa misma partícula, en lugar de encontrarse
en dos partículas adyacentes. Cuando se produce este tipo de unión, la ener-
gía efectiva de la interacción o avidez, es mucho mayor que la que presenta
una unión monovalente a dos partículas. Se ha demostrado que este meca-
nismo es muy importante desde un punto de vista fisiológico, en la neutrali-
zación de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la unión.
El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su
habilidad para unir antígenos. Intervienen en una gran variedad de activida-
des biológicas mediadas por la cola de la "Y", la región Fe de la molécula.
Esta parte de la molécula de anticuerpo determina lo que ocurrirá con el antí-
geno una vez que se haya unido. Inmunoglobulinas con la misma capacidad
de interacción con el anlígeno pueden presentar una variedad de regiones Fe
distintas, por tanto, diferentes propiedades funcionales, como puede ser acti-
var el sistema de complemento y unirse a receptores de Fe presentes en la
superficie de macrófagos, facilitando asi la fagocitosis de antígenos.
Debido a que posee una localización expuesta y una estructura flexible, la
región bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nom-
bre indica, esta región confiere una cierta flexibilidad a la molécula, permi-
tiendo que adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anti-
cuerpo se una a una sola partícula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos
regiones de unión al antígeno o. alternativamente, puede estirarse al máximo
para unir dos partículas. Las propiedades que aporta la región bisagra a las
moléculas de inmunoglobulina están relacionadas con su alto contenido en
prolina y residuos de aminoácidos hidrofílicos. Los puentes disulfuro que se
establecen entre las cadenas H en moléculas de IgG. IgA y en IgD se encuen-
tran en la región bisagra (Fig. 37-1).
Las enzimas proteoliticas papaina y pepsina escinden las moléculas de anti-
cuerpo en diferentes fragmentos característicos que permiten un entendimiento
de la relación estructura-función de la proteina. El corte con papaina produce dos
fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fragmento de unión al antígeno) idén-
ticos, cada uno de ellos con un dominio de unión al antigeno, y un fragmento Fe
879
(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por
otro lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque
consta de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco más grande que un
fragmento Fab, unidos covalentemente; el resto de la molécula está cortada en
fragmentos más pequeños de varios tamaños (Fig. 37-1). Como los fragmentos
F(ab'),son bivalentes, todavía pueden entrecruzar antigenos y formar precipita-
dos. Esto no ocurre con los fragmentos Fab puesto que son univalentes. Ningu-
no de estos fragmentos (subunídades de anticuerpos) tiene las demás propie-
dades biológicas de las moléculas intactas de anticuerpos puesto que carecen
de la cola (la región Fe) que media estas propiedades. Sin embargo, los frag-
mentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclonal que se emplea
terapéuticamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi niveles tóxicos
y facilitando la eliminación de la sustancia del cuerpo.
Cada clon de células B produce moléculas de anticuerpo con un único domi-
nio de unión al antígeno. Inicialmente, las moléculas se insertan en la membra-
na plasmática, donde funcionan como receptores de superficie para el antígeno.
Cuando un antigeno se une a los anticuerpos en la superficie celular, activan a
las células B, las cuales se multiplican, diferencian en una célula plasmática, y
sintetizan una gran cantidad de anticuerpo soluble con el mismo dominio de
interacción con el antígeno, que se secreta a la sangre. Los anticuerpos humo-
rales protegen a los humanos y animales de infecciones, inactivando virus y toxi-
nas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutando el complemento y
t
diversas células para matar e ingerir los microorganismos invasores mediante
sus dominios C en la región Fe de la molécula. Las propiedades biológicas de
L
los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1.
Interacción antígeno-anticuerpo
La unión de un antígeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el núme-
ro de sitios de unión contribuyen a la fuerza de la interacción antígeno-anticuer-
tivamente débiles, incluyendo uniones hidrofóbicas y de hidrógeno, fuerzas de
van der Waals e interacciones iónicas. Estas fuerzas débiles son efectivas sólo
cuando la molécula del antigeno está lo suficientemente cerca para permitir que
algunos de sus átomos puedan insertarse en las regiones complementarias de
la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de un anticuerpo de
cuatro cadenas son sus dos dominios de interacción con el antígeno idénticos
entre sí, mientras que la región correspondiente del antígeno es lo que se deno-
mina el determinante antigénico (epitopo). La mayoría de las macromoleculas
antígénicas presentan vanos determinantes antigénicos distintos; si dos 3 más
de ellos son idénticos, se dice que el antigeno es multivalente.
La afinidad de una molécula de anticuerpo refleja la fuerza con que el deter-
minante antigénico se inserta en un solo sitio de unión al antigeno, y es inde-
pendiente del número de determinantes antigénicos. Sin embargo, la avidez
total de un anticuerpo por un antígeno multivalente. como un polímero con
Tabla 37-1 Propiedades biológicas de los dominios de
inmunoglobulina (IgG)
Dominio Función conocida o probable
C„3 1. Reacciones citotrópicas que implican
(a) Macrófagos y monocitos
(b) Mastocitos heterólogos
(c) Células citotóxicas (K)
(d) Células B
2. Ensamblaje no covalente de las cadenas pesadas y ligeras
C,,2 1. Unión al complemento (C1q)
2. Control del ritmo catabòlico
C..1/C 1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas
2. Ensamblaje covalente de cadenas ligeras y pesadas.
3. Espaciadores entre interacciones entre dominios que
conllevan unión del antígeno y funciones electoras
VHTV, 1. Unión al antígeno
2. Formación de enlaces no covalentes entre cadenas
pesadas y ligeras
De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of
immunoglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciu-
dad de Canberra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso
880 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unión de todos los
sitios de unión juntos. Una molécula de IgG típica se une con al menos 10.000
veces mayor fuerza a un antígeno multivalente si ambos dominios de interac-
ción con el antigeno están implicados, que si sólo interviene uno de ellos.
Por el mismo motivo, si la afinidad de los dominios de interacción con el antí-
geno entre moléculas de IgG e IgM es la misma, la molécula de IgM (debido a
que es un pentámero y por tanto posee 10 dominios de interacción con el antí-
geno) poseerá una avidez mucho mayor por un antígeno mullivalente que una
molécula de IgG (que posee dos dominios de interacción con el antígeno). Esta
diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerpos pro-
ducidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidades
mucho menores que los que se producirán más adelante. El aumento en la afi-
nidad media de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la
inmunización se denomina maduración de la afinidad. Esto ocurre porque la res-
puesta humoral frente a un antígeno es heterogénea, esto es, se producen anti-
cuerpos con distintos dominios de unión al antígeno por parte de los clones de
linfocitos B de respuesta. Debido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo
de Ig producida al principio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso
cuando cada uno de sus dominios de interacción sólo tiene una baja afinidad.
El tamaño del complejo antígeno-anticuerpo se determina por la valencia
del antígeno y las concentraciones relativas del antígeno y el anticuerpo. La
reacción de precipitación de antigeno-anticuerpo se basa en el entrecruza-
miento de antígenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si sólo está
presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), moléculas con un
solo determinante antigénico no pueden entrecruzarse. Si un antígeno es
bivalente, puede formar pequeños complejos cíclicos o cadenas lineales con
el anticuerpo, mientras que un antígeno con tres o más determinantes anti-
génicos puede formar complejos tridimensionales que precipitan con facilidad.
Sin embargo, la mayoría de los antisueros producidos frente a un antígeno
contienen una variedad de anticuerpos diferentes (una respuesta policlonal)
que reaccionan con diferentes determinantes del antígeno y pueden cooperar
en el entrecruzamiento del antígeno. Por el contrario, anticuerpos homogé-
neos (monoclonales) sólo pueden precipitar moléculas que presentan repeti-
ciones idénticas de determinantes antigénicos.
Dadas las condiciones de valencia que permiten la formación de grandes
agregados, el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman
depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos
reactivos. Si hay un exceso de antígeno o de anticuerpo es poco probable que
se formen grandes complejos (Fig. 37-2).
El tamaño y composición de los complejos antígeno-anticuerpo no sólo son
importantes para las reacciones de precipitación in vilro. también son crucia-
les para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los comple-
jos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan múltiples
regiones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los
receptores Fe de los macrófagos, los cuales los ingieren y degradan. Los
complejos pequeños, formados en exceso de antígeno, sólo presentan una
región Fe por complejo. Así, se unen pobremente a los receptores Fe de los
macrófagos y se destruyen con menos eficiencia. En lugar de ser destruidos
se pueden depositar en pequeños vasos sanguíneos de la piel, ríñones, arti-
culaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del complemento, cau-
sando inflamación y destrucción del tejido.
Aunque parece que los complejos antígeno-anticuerpo tienen una apariencia
muy rígida, los anticuerpos son entidades dinámicas que sufren fluctuaciones
estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 1991). Cambios conformacionales pue-
den ser necesarios para la unión. Estos ajustes incluyen desplazamientos
laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de anillos aromáticos,
cambios conformacionales e incluso pequeñas rotaciones entre dominios V H
y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrón, 1991).
L
BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD
DE ANTICUERPOS
6 9
Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 molé-
culas de anticuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genéticos
especiales para producir una gran cantidad de moléculas de inmunoglobulina,
que se desarrollan durante la respuesta a un antígeno sin la necesidad de
involucrar un número excesivo de genes (Edward, 1993).
Figura 37-2. Las concentraciones del antígeno y del anticuerpo
influencian el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se
forman. Los complejos de mayor tamaño se forman cuando ambas
moléculas están presentes en aproximadamente la misma concen-
tración molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos más
pequeños se forman cuando existe un gran exceso de antigeno.
Nótese que los pequeños complejos formados en exceso de antige-
no presentan pocas moléculas de anticuerpo por complejo: por este
motivo, no son eliminados eficientemente por los macrófagos de los
fluidos extracelulares.
 CAPÍTULO 37 • EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL 881

Figura 37-3. Organización y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas (exones) en el cromosoma 12 de ratón.
Cada gen V„ tiene también una secuencia líder que no aparece en la representación Los genes de la región constante se identifican mediante
el isolipo de la cadena pesada, y existe más de un gen para los isotipos C, y C„ A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C están com-
M

puestos por múltiples exones, tal y como se ilustra para el gen C„ (dominios C„,-C,„...). Los sitios de recombmación se encuentran en el extremo
5' de cada uno de los genes C„ y tampoco se muestran. La linea continua representa las secuencias intermedias (intrones) entre genes o seg-
mentos génicos. Cada cadena pesada está codificada por cuatro segmentos génicos diferentes. V, D. J. y C. (Reproducido de Marcu KB: Immu-
noglobulin heavy-chain constant region genes. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright © de Cell Press).

Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codi-
fican para las cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que
codifican para las cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas
diferentes. En cada grupo, distintos segmentos génicos que codifican para
diferentes partes de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se
pueden poner en contacto mediante procesos de recombinación específicos
que tienen lugar durante la diferenciación de células B. Los grupos de genes
de cadenas ligeras contienen uno o más genes constantes (C) y juegos de
segmentos variables (V) y de genes de unión (J). El grupo de genes de la
cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diver-
sidad (D) y segmentos J. Para generar una molécula de anticuerpo, un seg-
mento génico V se recombina con otro segmento génico J , dando lugar a un
gen V para la cadena ligera; y un segmento V„ se recombina con un seg-
mento D y otro J para generar un gen V para la cadena pesada (Fig. 37-3).
H sidad de los anticuerpos depende de la presencia de múltiples segmentos
Cada uno de los segmentos génicos generados se cotranscribirá con el seg-
mento de la región constante correspondiente para producir un ARN mensa-
jero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediante la combi-
nación de los diferentes segmentos génicos que codifican para las regiones
V, y V.„ los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y
miles de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millo-
nes de moléculas de anticuerpo diferentes.
Este repertorio inicial de moléculas de anticuerpo se puede expandir inclu-
so más mediante la hipermutación somática, la cual se activa mediante la
exposición al antígeno. Así, el papel que juega el antígeno en presencia de la
mutación somática parece derivar en un refinamiento de la respuesta inmune
y a una diversidad prácticamente ilimitada de moléculas de anticuerpo. Muta-
ciones somáticas puntuales tienen lugar en células B (no en células germina-
les) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegawa, 1983). Las
hipermutaciones somáticas se encuentran, en su mayoría, confinadas a los
genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones conti-
guos. Se estima que tendrá lugar, aproximadamente, una mutación en la
región V de la cadena H o L. en cada célula individual con cada división celu-
lar. Esto no sólo aumenta la diversidad de anticuerpos, sino que también pue-
de causar un cambio en la afinidad con la que el anticuerpo se une a su ligan-
do. Aquellas células B resultantes que puedan unir al antígeno con mayor
avidez presentan una ventaja sobre otras células B que no son capaces de
unir al antígeno con tanta avidez. A medida que decae la concentración de
antígeno, aquellas células B que presentan receptores con mayor avidez
dominan la población de células involucradas en la respuesta. Esto origina
una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo con-
tacto con el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hiper-
mutación somática puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados
de anticuerpos de alta afinidad que resultan mucho más efectivos.
Todas las células B producen inicialmente anticuerpos IgM. Más adelante
algunas pasan a producir otros tipos de anticuerpos (isotipos) que poseen el
mismo dominio de unión al antígeno (idiotipo) que la IgM original (exclusión
alélica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combinación con la
exclusión alélica permite que los mismos dominios de unión al antígeno (la
misma cadena V„ y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propie-
dades biológicas (funciones efectoras secundarias).
Así. este mecanismo de organización gémea permite la construcción de
moléculas de inmunoglobulina con una variedad de especificidades. La diver-
génicos, su reagrupación en diferentes secuencias, la combinación de distin-
tas cadenas pesadas y ligeras en la construcción de moléculas de inmuno-
globulina, y de mutaciones somáticas.
PROPIEDADES GENERALES DE
LAS INMUNOGLOBULINAS
(Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993)
Los diversos tipos de inmunoglobulinas humanas y sus propiedades están
resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina M
Esta glucoproteína es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre
en las primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la
IgM se secreta en forma de pentámero compuesto por cinco unidades de cua-
tro cadenas cada una. una macroglobulina con una velocidad de sedimenta-
ción de 19S y una masa molecular de 900 kDa. Sin embargo, en trastornos
autoinmunes humanos, como puede ser el lupus entrematoso sistémico
(SLE), la forma monomérica de 7S se puede detectar en cantidades aprecia-
bles en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno poco fre-
cuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de
inmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.
 882 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\
(denominados Lv1. Lv2. Lv3) y del dominio V„ (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminoácidos se enumeran empezando por el
extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se ha observado una región hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama tam-
bién se ilustra la región donde pueden encontrarse la mayoría de las vanantes de inmunoglobulina. Los determinantes idiotipicos se encuen-
tran exclusivamente en los dominios V, y V„. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. Los marcadores alotipi-
cos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.

Debido a que la forma pentamérica de la IgM tiene un total de 10 domi-
nios de unión al antigeno, resulla más eficiente que su forma monomérica
7S o la IgG en el entrecruzamiento del antígeno y en la activación del sis-
tema del complemento una vez unido al antigeno. Asi, esta elevada efi-
ciencia en la unión y activación del complemento, unido a su temprana
aparición durante el transcurso de una infección, hace de la IgM un agen-
te especialmente potente para combatir las invasiones microbianas.
Cada pentámero de IgM contiene una copia de otra cadena polipeptídica.
denominada cadena J (del inglés joming). con un tamaño molecular de 15 kDa.
Este polipéptido accesorio se produce por parte de las células secretoras de
 CAPÍTULO 37 • EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL 883

Tabla 37-4 P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s

IgM IgG IgA IgD

A Fisiológicas
Concentración mg/ml en suero de un adulto normal 1.2-4.0 8.0-16.0 0.4-2.2 0.03 17-450 ng/ml
Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <100
Porcentaie de la inmunoglobulina total 13 80 6 • 0.002
Porcentaje de distribución intravascular 41 48 76 75 51
Ritmo de sintesis mg/kg/dia 2,2 35 24 0.4 0,003
Ritmo de catálisis en suero, %/día 10,6 6 24 37 90
(o vida media/dia) (5-6) (18-23) (5-6.5) (2.8) (2,3)
Biológicas
Capacidad de aglutinación +4 • +2
+
Capacidad de fijación del complemento por la vía clásica •4 —
Hipersensibilidad anafiláctica homologa +4
Anafilaxis heleróloga en conejillo de Indias — + —
Fijación a basólilos y mastocitos homólogos — ± +4
Unión citolilica a macrófagos + 1
Transporte Iransplacentario + — —
Unión al tactor reumatoide + —
Presencia en secreciones externas ± + +4 +2
Otras propiedades características:
IgM - Se produce en el inicio de la respuesta inmune, es la primera defensa electiva frente a la bacteremia.
IgG Combate los microorganismos y sus toxinas en los fluidos extravasculares
IgA -Defiende las superficies externas del cuerpo.
IgD -Presente en la superficie de hnfocitos inmunocompetentes importante para la activación de células B y/o la inmunorregulación

IgM Se trata de una glucoproteina acidica con un elevado contenido en resi-
duos de cisteina y. por tanto, se asocia mediante puentes disulfuro al extremo
carboxilo-terminal de dos regiones Fe de moléculas monoméricas de IgM
adyacentes. Se cree que la oligomerización se inicia en este punto.
La IgM es además, el primer tipo de anticuerpo secretado por las células B
durante su desarrollo. Los precursores inmediatos de las células B. llamadas
células pre-B. sintetizan cadenas u., pero no cadenas ligeras, que acumulan
en el interior de las células. A continuación las células pre-B empiezan a sin-
tetizar cadenas ligeras que se combinan con las cadenas u para formar molé-
culas de IgM monoméricas. El conjunto formado por las dos cadenas pesa-
das y las dos cadenas ligeras se inserta en la membrana plasmática, donde
funciona como receptor para el antigeno. En este momento, las células se
han convertido en linfocitos B y pueden responder al antígeno.
Quizás debido a su gran tamaño, el pentámero de IgM secretado no se
encuentra de modo significativo en los espacios intersticiales; se encuentra
confinado a la sangre y no atraviesa la placenta. La IgM es un componente
minoritario de las inmunogiobulinas secretadas en superficies mucosas y en
la leche materna.
Filogenéticamente, la IgM es la inmunoglobulina más primitiva, y la mayo-
ría de las variantes de los genes de la cadena LI parecen haber evolucionado
para dar genes de cadenas pesadas de otros tipos de inmunogiobulinas.
Otras propiedades físicas y biológicas de la IgM y de otros tipos de inmuno-
globulinas se citan en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina G
La IgG es el isotipo mejor estudiado tanto a nivel estructural como funcional
(Burton. 1985). Los anticuerpos de este tipo constituyen la principal inmunoglo-
bulina en sangre. Se producen copiosamente durante la respuesta inmune
secundaria. La región Fe de las moléculas de IgG se une a receptores específi-
cos de células lagocíficas, como macrófagos y leucocitos polimorfonucleares.
incrementando asi la eficiencia con que las células fagociticas pueden ingerir y
destruir microorganismos infecciosos que se han recubierto con anticuerpos de
IgG en respuesta a la infección. Estos anticuerpos unidos a células diana tam-
bién pueden guiar a linfocitos NK (Natural Killer) a destruirlos mediante un pro-
ceso de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC del inglés anti-
body-dependenl cell-mediated cytotoxic¡ty¡. La función mejor conocida de la IgG
es la activación del complemento por la vía clásica. La región Fe de la IgG pue-
de unirse, y por tanto activar al primer componente del sistema del complemen-
to, que desencadena un ataque bioquímico que mata a los micoorganismos Se
necesitan al menos dos moléculas de IgG para la activación del complemento,
en comparación con una sola molécula de IgM, que contiene cinco regiones Fe
Las moléculas de IgG son los únicos anticuerpos que pueden pasar de la
madre al feto. Células placentarias que se encuentran en contacto con la san-
gre materna poseen receptores que se unen a la región Fe de la IgG y median
su paso hasta el feto. Los anticuerpos primero penetran por un proceso de
endocitosis mediada por receptores y después se transportan a través de la
célula para liberarse posteriormente por exocitosis a la sangre fetal. Otros
tipos de anticuerpos no pueden unirse a estos receptores y. por tanto, no pue-
den atravesar la placenta. La habilidad de la IgG para cruzar la placenta con-
fiere una linea de defensa fundamental frente a la infección durante las pri-
meras semanas de vida del niño. Normalmente, el embrión humano empieza
a recibir cantidades significativas de IgG materna por vía transplacentaria a
las 12 semanas de gestación. La cantidad aumenta de forma constante has-
ta que, al nacer, el suero del cordón contiene una concentración de IgG com-
parable a la del suero materno. Salvo que existan trastornos inmunológicos.
los niveles de IgG de un adulto se alcanzan en el séptimo año de vida y a par-
tir de este momento permanecen constantes.
Los anticuerpos IgG tienen un elevado coeficiente de difusión que les permi-
te difundir a espacios extravasculares del cuerpo con mayor facilidad que otros
tipos de Ig. Como la IgG es la principal representante de las Ig en estos espa-
cios, es la principal encargada de neutralizar toxinas bactenanas y de unirse a
microorganismos para facilitar su fagocitosis. Ademas, solo los anticuerpos IgG
que se encuentran recubriendo células diana, como pueden ser células tumo-
rales, pueden desencadenar su muerte extracelular mediante ADCC; las célu-
las NK responsables de la ADCC presentan receptores para Fe de IgG.
Existen cuatro subtipos de IgG humana, de 1 a 4. Las cuatro subclases refle-
jan la existencia de cuatro cadenas H distintas no genéticamente (y1 a y4). que
son similares pero no idénticas en cuanto a su secuencia de aminoácidos y pro-
piedades generales. Por ejemplo. lgG1 es el subtipo dominante en adultos
humanos. La lgG3 es la más efectiva en su unión al complemento, seguida de
lgG1 e lgG2. La lgG4 en la mayoria de los casos es incapaz de unirse al com-
plemento por la vía clásica. Todos los subtipos excepto la lgG2 pueden atrave-
sar la placenta. Un resumen de las propiedades físicas y biológicas de la IgG
se encuentra en las Tablas 37-3 y 37-4. y de los subtipos en la Tabla 37-5.
Inmunoglobulina A
Los anticuerpos de esta clase constituyen el principal tipo de anticuerpo
presente en las secreciones (leche, saliva, lágrimas y secreciones respiratorias
 884 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 37-5 Propiedades de las subclases de inmunoglobulinas G

IgGI igG2 igG3 lgG4

A. Fisiológicas
Porcentaje de IgG total en suero 66*8 23 ± 8 7,3 ± 3.8 4.2 ± 2.6
Ritmo de síntesis, mg/kg/dia en suero 25 ? 3,4 ?
Ritmo de catálisis en suero, %/día 8 6,9 16.8 6.9
(vida media, día) (23) (23) (7) (23)
Relación K/X 1,4-2,4 1,0-1,1 1.1-1,3 5,0-7,0
Marcadores alotípicos (tipo de Gm) a, z, f, x n bo, bi, bz.
g. st. etc
B. Biológicas
Capacidad de fijación del complemento por la via clásica +2 ± +3
Capacidad de adhesión a piel heteróloga + + +
Transporte transplacentario + ± + +
Receptor en macrófagos + +
Capacidad de reacción con proteína A + + -

Actividades dominantes:
Toxoide antitetáníco +2 + + ±
Toxoíde antidiftérico +2 + + ±
Antitiroglobulma +2 + + ±
Anti-ADN +2 +2 ± ±
Anti-Fth +2 ±
Anli-lactor VIII +
Anlidextrano — •
Anlilevano — - —
—
— + —
Anti-ácido teicoico
Número de puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la región de bisagra 2 4 5
—
2
Posición de los puentes disulluro de las cadenas ligeras sobre las cadenas pesadas N214 N131 N131 N131

e intestinales). Existe en forma de un monómero de cuatro cadenas (como la epitelial. La porción extramembranal del receptor se escinde por acción enzi-
IgG) o formando un dímero de dos unidades monoméricas. Las moléculas de mática y se secreta como parte de la molécula de IgA secretora ([(/. ,L,,)/J(/.)
?

IgA presentes en las secreciones son dímeros que llevan una sola cadena J.
similar a la asociada con la IgM pentaméríca, con una cadena adicional glico-
polipeptídica llamada el componente secretor (SC) de 70 kDa. Los dímeros de
IgA recogen el SC de la superficie de células epiteliales que recubren el intes-
tino, tos bronquios o los conductos galactóforos, salivares o lacrimales. El com-
ponente secretor se sintetiza en las células epiteliales e inicialmenle se expo-
ne en la superficie extema de estas células, donde actúa con un receptor que
une los dímeros de IgA. El complejo resultante de la unión del dímero a su
receptor se internaliza por endocifosis mediada por receptor, y se transfiere a
través del citoplasma de la célula epitelial en forma de vesícula membranosa,
la cual se fusiona con la membrana plasmática en el lado luminal de la célula
al lumen. El extremo amino-terminal del receptor del dímero de IgA que per-
manece unido a este dímero es el SC (Fig. 37-5). Así, la molécula secretora
completa de IgA es un producto sintético de dos tipos celulares, células plas-
máticas y células epiteliales. Además de su papel en el transporte, el SC tam-
bién puede proteger las moléculas diméricas de IgA de la digestión por parte
de enzimas proteolíticas presentes en las secreciones.
En los humanos se han clasificado los anticuerpos de IgA en dos subtipos,
lgA1 e lgA2, en función de la estructura antigénica y la variación en la dispo-
sición de los puentes disulfuro intercatenarios. Así como la lgA2 es un com-
ponente menor del suero, este subtipo es la forma dominante en las secre-
ciones. Además, la IgA secretada alcanza los niveles de un adulto antes que

Figura 37-5. Mecanismo por el cual el compo-

nente secretor media el transporte de la molécula
dimérica de IgA a través de una célula epitelial.
Todo el complejo se transporta desde el fluido
extracelular al interior del lumen del tubo epitelial.
El componente secretor se sintetiza en la célula
epitelial como una glucoproteína transmembranal
y funciona como un receptor en su superficie
basolaleral para unir el dímero de IgA. El comple-
jo IgA-receptor penetra en la célula en una vesí-
cula endocíticá que cruza la célula y es exocitada
en la superficie apical La escisión del receptor
libera el dímero de IgA para su secreción a la
superficie exterior (luminal). La porción del recep-
tor que permanece unida al dímero de IgA se
denomina el componente secretor. Este mecanis-
mo de transporte es responsable de la deposición
de IgA en diversas secreciones exocrinas (p. ej.,
saliva, leche, bilis, lágrimas y sudor) y en capas
mucosas que protegen el revestimiento de los
conductos nasofaríngeos, intestinales y del tracto
genitourinario.
 CAPÍTULO 37 • EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL 885
la IgA en suero. El sistema de IgA en el tracto intestinal humano, por ejemplo, Inmunoglobulina E
puede estar plenamente desarrollado a los dos años de edad, mientras que
De los diversos tipos de inmunoglobulinas. la IgE está presente en la menor
los niveles de IgA en suero no alcanzan las concentraciones de un adulto has-
concentración en suero (Tabla 37-4). Posee la habilidad de unirse a la piel
ta los 12 años de edad.
humana (anticuerpo homoertotropico) y de iniciar aspectos de la reacción alér-
Debido a su presencia cerca de las membranas extemas, la IgA secretada
gica (anticuerpo reagénico) La actividad biológica de la IgE se basa en su pro-
constituye una primera linea de defensa frente a microorganismos del ambiente
piedad de unirse mediante su región Fe a basófilos y a su equivalente en los
exterior Se ha postulado que la IgA inhibe la adhesión de microorganismos a la
tejidos, los mastocitos La IgE puede ser importante también en la respuesta
superficie de las células mucosas, previniendo asi. su entrada en los tejidos. Una
inmune humoral durante enfermedades parasitarias, ya que a menudo se
propiedad de la IgA secretada que es importante en este aspecto es su multiva-
encuentran elevados los niveles de esta inmunoglobulina en suero de pacien-
lencia. que se asocia a una gran avidez por la unión de antígenos; esto puede
tes que presentan una infección por helmintos. La IgE puede jugar un papel en
resultar especialmente relevante en la neutralización de virus. La actividad anti-
el paso de leucocitos, anticuerpos y componentes del complemento a los locos
viral de anticuerpos de IgA se ha demostrado en individuos a los que se le ha
de inflamación desencadenando una reacción de hipersensibilidad inmediala.
suministrado cualquiera de las vacunas para la polio. La IgA secretada también
Los anticuerpos de IgE representan un claro ejemplo de la naturaleza biluncio-
puede combinarse con determinados antígenos de la comida, impidiendo su
nal de las moléculas de anticuerpo Su porción Fe se une a las células diana
absorción al torrente sanguíneo y reduciendo asi la incidencia de reacciones
mientras que su porción Fab se une al alérgeno (véase Capitulo 46 para el
alérgicas. Por eiemplo. las inmunodeficiencias de IgA pueden desencadenar
papel de la IgE en enfermedades alérgicas y ensayos relacionados) Los nive-
incrementos en tos niveles e incidencias de anticuerpos humorales dirigidos con-
les de IgE en suero en determinadas condiciones se muestran en la tabla 37-6.
tra antígenos derivados de la comida y microorganismos intestinales.
La IgA posee las siguientes propiedades efectivas: fija el complemento Al igual que la IgA, la IgE se produce principalmente en el revestimiento de
mediante la vía alternativa; a través de un receptor específico de Fe presen- los tractos respiratorios e intestinales y forma parte del sistema secretor exter-
te en macrófagos puede funcionar como una opsonina para la fagocitosis; y no de anticuerpos. Una deficiencia de IgE se ha asociado de forma poco con-
puede inducir la degranulación de eosinófilos mediante un receptor especifi- sistente con la deficiencia de IgA en individuos inmunodeficienles que pre-
co, que ha implicado a la IgA en respuestas antiparasitarias. Las propiedades sentan una excesiva susceptibilidad frente a infecciones. La IgE no atraviesa
físicas y biológicas de la IgA están enumeradas en las Tablas 37-3 y 37-4. la placenta y los complejos de IgE-antigeno no se unen al complemento por
la vía clásica (Tabla 37-4).

Inmunoglobulina D
Tabla 37-6 Niveles de IgE en suero en determinadas
A pesar de ser un componente minoritario del suero, la IgD es una de las
afecciones
principales inmunoglobulinas de membrana presentes en la superficie de una
proporción elevada de linfocitos B, especialmente en recién nacidos. Durante Elevado
el transcurso de la diferenciación de las células B. estas células sintetizan y Dermatitis atópica
presentan en superficie tanto moléculas de IgD como de IgM. Aunque esto Mieloma de IgE
Hiper-lgE e inlecciones recurrentes
aparentemente contradice la regla de "una célula, una inmunoglobulina", los
Síndrome de Wiskott-Aldrich
dominios de unión al antígeno (idiotipos) de ambas moléculas y de sus cade- Enfermedad de Hodgkin (especialmente en lases tardías)
nas ligeras son idénticos. Sólo difieren en sus regiones C„. La IgD asociada Aspergilosis broncopulmonar
a la membrana puede funcionar como uno de los receptores con que las célu- Pénfigo
las B unen el antigeno y se estimulan para sufrir la proliferación clonal. Exis- Parásitos (como la ascariasis)
ten evidencias que sugieren que las células B que presentan IgM pueden res- Lepra
ponder a ciertos antígenos T-independientes y que la adquisición de IgD se Sida
requiere por parte de las células B para poder responder a la ayuda de célu- De normal a elevado
Rinitis alérgica
las T necesaria para las respuestas a antigenos T-dependientes.
Asma alérgica
Además, si las moléculas de IgD se eliminan selectivamente de células B Alveolitis extrínseca alérgica
que presentan tanto IgD como IgM. aprovechando que la cadena 8 es mucho Fibrosis quistica
más sensible a la acción de la papaina, estas células pasan a ser suscepti- Aspergiloma
bles de convertirse en tolerantes. El papel exacto de la IgD en una respuesta Alergias a medicamentos
inmune sigue sin conocerse, pero la opinión general es que enciende, apaga Enfermedad hepática grave
Urticaria alérgica
o modula la división o la diferenciación de células B.
Enfermedad de Kawasaki
La IgD generalmente se detecta en suero a los seis meses de edad, y su Periarteritis nodulosa
concentración a lo largo de toda la vida es muy baja. Sin embargo, en esta- Normal
dos de enfermedad la concentración de IgD puede variar enormemente. En Linfangiectasia intestinal
infecciones crónicas, los niveles en suero de IgD se elevan, al igual que los Bronquiolitis
del resto de las inmunoglobulinas. Hasta la fecha, no se ha asociado un incre- Pénligo
Tiroiditis
mento específico de IgD con una enfermedad en concreto. Pacientes con
alergias y enfermedades autoinmunes no presentan variaciones de las con- Fallo renal crónico
De normal a disminuido
centraciones normales de IgD. Generalmente, la IgD está ausente en indivi-
Leucemias
duos con hipogammaglobulinemia.
Mieloma múltiple
Hasta la lecha, la IgD no tiene asignado un papel biológico específico como Deficiencia de IgA
anticuerpo humoral. Se ha descrito la actividad de la IgD frente a un cierto Disminuido
número de antigenos. La IgD de superficie, que tiene proteínas semejantes a Ataxia-telangiectasia
las de la IgM de superficie, es un marcador de células B maduras, y su papel Hipogammaglobulinemia ligada al sexo
como receptor está aceptado a pesar de que la naturaleza y finalidad de la Hipogammaglobulinemia congenita
Hipogammaglobulinemia adquirida
señal que Iransmile siguen siendo controvertidas (Carsetti. 1993; Roes.
Deficiencia de IgE
1993). La IgD no une al complemento, no atraviesa la placenta y no se une a
células a través de su región Fe. La forma secretada de IgD. al igual que la Modificado a partir de Waldmanri TA Strober W, Polmar SH. Terry WD en Ishi-
zaka K Daylon DH Jr (eds) Tue Biological Role ol the Immunoglobulin E
del resto de las inmunoglobulinas. carece del péptido transmembranal en la System. Washington DC. US. Governrnenl Printing Oltice 1975 y Arbesman
región carboxi-terminal que ancla la molécula en la superficie de las células CA tvi Ishi/aka K. Daylon DH. Jr (eds): The Biological Role ol the Immunoglo-
bulin E System, Washington. DC. U S. Government Printing Ottice, 1975
B. Las Tablas 37-3 y 37-4 enumeran otras propiedades de la IgD.
 886 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAKXOGI'A

Tabla 37-7 Concentraciones d e inmunoglobulina e n suero Hiperinmunoglobulinemia

Edad Media de IgG (mg/ml) Media de IgA (mg/ml) NIVELES DE INMUNOGLOBULINAS EN SUERO
(Años) Varón blanco Mujer blanca Varón blanco Mujer blanca Una interpretación válida de los niveles de inmunoglobulinas en suero requie-
re un reconocimiento de las variaciones biológicas que existen a lo largo de la
5-9 10,28 11.05 1.09 1,10
10-14 10.41 11.13 1,16 1.15 vida de los individuos. Las vanables más importantes son la edad, sexo y raza.
15-19 10,55 11 20 1,23 1.21 Estudios en un grupo de individuos sanos de raza blanca (3.212) de una
20-24 10,69 11 28 1,32 I.28 sola comunidad (Tecumseh, MI) mostraron que la concentración media de IgG
25-29 10.83 11.35 1.40 1.35 e IgA aumenta con la edad, con diferencias pequeñas pero significativas entre
30-34 10.98 11.43 1,50 1.42 sexos. Las mujeres presentaban niveles mayores en suero de IgG y menores
35-39 11.12 11.50 1.59 1,49
40-44 11.27 11.58 1.70 1.57 de IgA (Tablas 37-7 y 37-8) A pesar de que estas diferencias entre sexos para
45-49 11,42 11,66 1.81 1,65 la IgG y la IgA son estadísticamente significativas, su significado biológico no
50-54 11,57 11,74 1.93 1,74 resulta evidente. Los niveles de IgM en estos sujetos permanecieron relativa-
55-59 11,72 11,81 2.06 1,83 mente constantes con la edad. Sin embargo, las mujeres lenían niveles medios
60-64 11.88 11.89 220 1.93 de IgM (1,06 mg/ml) superiores a los hombres (0,77 mg/ml).
65-69 12,04 11,97 2.34 2.03
70-74 12.20 12.05 2.49 2.14 Vanos estudios han descrito que los niveles de inmunoglobulinas son mas
75+ 12.36 12.13 2.66 2.26 elevados en personas con pieles pigmentadas. En la Tabla 37-8 se muestran
Los dalos se obtuvieron de 3 213 muestras de suero recogidas de un grupo de los resultados obtenidos en una población birracial de individuos sanos del
sujetos no praseleccionados de una sola comunidad sana (Tecumserv MI) condado de Evans. Georgia. Los individuos de color tenían niveles mayores de
(Cassidy. 1974).
las tres inmunoglobulinas principales (IgM. IgG e IgA) que los blancos. La
mayor diferencia se encontró en la IgG. No se detectaron diferencias entre indi-
viduos urbanos y rurales en este estudio. Individuos blancos de Rochester,
Nueva York, tenían niveles en suero de IgG e IgM similares a los de individuos
Resumen
blancos de la Georgia rural. Un estudio trirracial en Durban, Natal, Sudáfrica,
En humanos existen cinco tipos diferentes de anticuerpos (IgM. IgG, IgA, demostró que varones adultos bantúes tenían niveles significativamente mayo-
IgD e IgE). cuatro subtipos de anticuerpos IgG (lgG1, lgG2. lgG3 e lgG4) y res de IgM (32% más), IgG (40% más) e IgA (32% más) en suero que indivi-
dos subtipos de IgA (lgA1 e lgA2). Cada uno de estos isotipos de anticuerpo duos blancos de esta comunidad que nacieron en el mismo año y pertenecían
posee una determinada cadena H (n, y, a. 8, e, y„ y¡, y . y¿ y n, a¿. res-
3 al mismo grupo sanguíneo ABO. Varones asiáticos sanos mostraban aproxi-
pectivamente). Las cadenas H contienen la región Fe del anticuerpo, que madamente un 20% más de IgG. un 23% más de IgA. y un 7% más de IgM
determina qué otras proteínas se unirán al anticuerpo y por tanto, las propie- que individuos comparables de raza blanca. Un estudio de individuos del área
dades biológicas del tipo y subtipo. Cualquiera de las cadenas L (K- O X) pue- metropolitana de Washington, D.C. demostró que individuos de color tenían
den asociarse con cualquiera de las cadenas H. niveles significativamente mayores de IgG que individuos blancos pero niveles
Las diferencias estructurales entre los cinco tipos de inmunoglobulinas similares de IgA e IgM (Tollerud. 1995). Los grupos control empleados en estos
corresponden a las diferencias funcionales en sus lugares de producción y estudios se hicieron atendiendo a la edad. sexo, raza y también a diversos fac-
acción, sus niveles relativos de síntesis en respuestas inmunes primarias y tores ambientales (Cassidy, 1974; Lichtman, 1967). Los incrementos de '/-glo-
secundarias, y sus papeles como efectores fisiológicos. Por ejemplo, la IgG pre- bulinas a menudo se detectan primero tras una electreforesis de proteínas del
domina tanto en sangre como en los fluidos intersticiales, mientras que la IgM suero, una medida de las proteínas totales o de albúmina y fracciones de
está principalmente confinada a la sangre, y la IgA secretada se encuentra fun- y-globulinas. Los valores de referencia para las diversas inmunoglobulinas
damentalmente en superficies epiteliales. La IgD e IgE se encuentran principal- varían con la edad, sexo y raza (Tablas 37-7 y 37-8).
mente unidas a células, la IgD en células B. y la IgE en basófilos y mastocitos.
Los incrementos de inmunoglobulinas pueden ser monoclonales o policlona-
les. Las inmunoglobulinas monoclonales de un único individuo son idénticas
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS estructuralmente, y se cree que son el resultado de la expansión clonal de una
sola célula linfoide productora de inmunoglobulinas, y por tanto, son específicas
Las inmunoglobulinas juegan papeles muy importantes en la patogénesis, para un solo antigeno. Las inmunoglobulinas policlonales de un mismo individuo
diagnosis, prevención y terapia de las enfermedades. son estructuralmente diferentes entre ellas en una o más características impor-
tantes: por tipo, IgG, IgA o IgM policlonales: por su cadena ligera; o por su espe-
Patogénesis cificidad antigénica. Las inmunoglobulinas policlonales provienen de la expan-
sión clonal de varias células linfoides productoras de distintas inmunoglobulinas.
La hiperinmunoglobulinemia es una destacada característica del mieloma
múltiple y de la macroglobulinemia de Waldenstrom. Anticuerpos contra antí-
genos nativos pueden aparecer en enfermedades autoinmunes. tal y como se INMUNOGLOBULINAS POLICLONALES
describe en los Capítulos 43 y 45. La hipo- y agammaglobulinemia es a menu- Los aumentos policlonales de inmunoglobulinas se han asociado con
do una de las características más destacadas de algunas inmunodeficiencias diversos estados patológicos (Tabla 37-9) (Buckley, 1977; Cushman. 1973).
(véase Capítulo 42). La electroforesis de proteínas séricas es a menudo suficiente para estable-

Tabla 37-8 Concentración de le G en suero en una población birracial

Media de la raza blanca Media de la raza negra
Sexo Edad (Años) N. de muestras (± SE) (mg/ml) N. de muestras (± SE) (mg/ml)
Hombres 15-34 17 11.2(7.3) 21 13.4 (6.5)
35-54 17 10.8 (5.9) •"• 13,5 (9,0)
55-74 20 10,9(7.4) 20 13,3 (5.8)
Mujeres 15-34 19 10,6 (6,3) I8 15,6 (8.0)
35-54 19 12,3(3.4) 15 15,4 (6,4)
55-74 20 10,9 (6.1) 16 14.2 (9,6)
Estos datos son representativos de habitantes de Evans County, Georgia (Lichtman. 1967)
 CAPÍTULO 37 • EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL 887
Tabla 37-9 Hiperinmunoglobulinemias policlonales: algunas La incidencia de las inmunoglobulinas monoclonales (componentes M) en
enfermedades asociadas estudios de una población no seleccionada se estima en 0,9% (Bachman.
1965: Axelsson. 1968; Cohén 1985). En labóratenos clínicos se encuentra
Tipo de
una incidencia mucho mayor de resultados positivos, puesto que los sueros
Afección inmunoglobulina
son preseleccionados. El mieloma múltiple, la macroglobulmemia de Wal-
Inmunodeliaenaas denstróm y neoplasias de células B son algunas de las enfermedades aso-
Hiperinmunoglobulina E e infecciones ciadas con un aumento en el nivel de inmunoglobulinas monoclonales. Antes
recurrentes igE se creía que las gammapatias monoclonales eran poco frecuentes en casos
Síndrome de Wiskott-Aldrich igA, igE de leucemia linfocítica crónica o de linterna Imfocitico bien diferenciado.
Disgammaglobulinemia tipo 1 IgM Actualmente se ha demostrado que cuando se combinan la inmunofijación y
Hiperinmunoglobulina A e infecciones la electroforesis de alta resolución para estudiar muestras de estos pacientes,
recurrentes igA la mayoria de ellos presentan una gammapatía monoclonal (Keren. 1988).
Sida Todos los tipos También se ha demostrado la existencia de gammapatias en pacientes con
Infecciones linterna de Burkitt y leucemia linfocítica aguda de células B.
Infecciones congénitas (sífilis. IgM Aunque generalmente se desconocen las especificidades antigénicas de
toxoplasmosis, rubéola, citomegalovirus) las gammapatias monoclonales, algunas causan neuropatías paraproteinémi-
Mononucleosis infecciosa IgM o todas cas. Este síndrome clínico generalmente se debe a la interacción de una
Tripanosomiasis IgM o todas paraproteina de IgM con una glucoproleina asociada a la mielina (MAG), gan-
Parasitismo intestinal Todos los tipos gliósidos (por ej. GM. en la neuropatía motora y GD„, en la neuropatía sen-
Varias infecciones helmínticas igE
sorial) u otros glicoesfingolipidos (Ropper, 1998).
Larva migrans visceral Todos los tipos
Granulomatosis crónica infantil Todos los tipos El término de gammapatía monoclonal de significado indeterminado
Lepra Todos los tipos (MGUS: monoclonal gammopathy of undetermmed signiticance) fue acuñado
Infecciones crónicas en general Todos los tipos, con por Kyle para categorizar individuos en los que se ha demostrado un compo-
preferencia de IgG nente monoclonal en el suero pero que carecen de otras características que
permitan el diagnóstico de un cáncer (Kyle. 1982). Individuos con MGUS pue-
Enfermedades hepáticas
den tener hasta un 10% de sus células plasmáticas en la médula ósea. Esto
Hepatitis crónica activa Predomina IgG
es considerablemente menos que la plasmacitosis de médula ósea que se
Hepatitis aguda Predomina IgG
asocia con el mieloma múltiple. Aproximadamente un 20% de individuos con
Cirrosis biliar Predomina IgM
Hepatitis lupoide Todos los tipos MGUS desarrollarán un trastorno linfoproliferativo de células B, siendo el más
Trastornos pulmonares común de ellos el mieloma múltiple, en un periodo de 10 años. Algunos de los
Síndrome de hipersensibilidad pulmonar Todos los tipos otros casos pueden desarrollar leucemia linfocítica crónica, amiloidosis. linte-
Sarcoidosis Todos los tipos rna linfocítico diferenciado y otras patologías que afectan a la proliferación de
Beryliosis Todos los tipos células B. La mayoria de los casos de MGUS no progresan hacia ninguna otra
Trastornos autommunes patología clínica. Pacientes con MGUS poseen cantidades del componente M
Lupus eritematoso sistémico Todos los tipos de entre 300 y 3.000 mg'dl y normalmente no presentan la protema de Ben-
Artritis reumatoide igA o todos ce Jones en la orina. Se recomienda que estos pacientes tengan un segui-
Muchos estados autoinmunes como Todos los tipos miento mediante electroforesis de proteínas séricas cada 6 a 12 meses para
la tiroiditis determinar si el proceso progresa o retrocede.
Escleroderma Todos los tipos
Enfermedad de la aglutinina fría IgM Una consideración especial es el MGUS que se observa en pacientes Iras-
Púrpura anafiláctica IgA plantados que han recibido inmunosupresores que afectan a las funciones de
células T incluyendo la modulación de la respuesta B. Estas gammapatias
Otras monoclonales pueden ser transitorias hasta en un 75% de los casos (Radl,
Síndrome do Down Todos los tipos 1985). Pueden ocurrir tanto en forma monoclonal como oligoclonal (Stanko,
Amiloidosis Todos los tipos 1989). y pueden coincidir con infecciones por citomegalovirus o por el virus de
Adicción a narcóticos IgM Epstein-Barr (Drouet, 1999). Su progresión probablemente se estimula por los
Enfermedad de los lúbulos renales Todos los tipos
elevados niveles de interleucina-6 circulantes (Nickerson, 1994).

cer esta condición. La inmunoelectroforesis, inmunofijación y determinación Tabla 37-10 Alteraciones asociadas a inmunoglobulinas
de las inmunoglobulinas individuales o cadenas ligeras de inmunoglobulina monoclonadas
pueden ayudar a confirmar una distribución policlonal o un aumento de uno
o más tipos de inmunoglobulina. El aumento de las inmunoglobulms séricas Mieloma múltiple
puede deberse a un descenso del catabolismo y un aumento de la síntesis. Macroglobulinemia de Waldenstrom
Leucemia linfocítica crónica
Los mecanismos de control de estos sucesos no se conocen bien. Las con-
Otras leucemias
secuencias de una elevación de inmunoglobulinas son desconocidas. La
: Linfomas
mayor parte de las inmunoglobulinas no parecen estar dirigidas frente a un
I Gammapatía monoclonal "benigna"
solo determinante antigénico o grupo de ellos. Además, la mayoría de los
j Síndrome de escape capilar sistémico
autoanticuerpos no son monoclonales sino policlonales, En general, los
Amiloidosis
incrementos persistentes de carácter policlonal en y-globulinas, se relacio-
i Enfermedad hepática crónica como la hepatitis activa, o la
nan con una estimulación antigénica de naturaleza crónica, o con una pér-
cirrosis biliar primaria
dida de la regulación de las inmunoglobulinas.
Trastornos autoinmunes, incluidas la artritis reumatoide. el lupus
eritematoso sistémico. la tiroiditis. la anemia perniciosa,
Inmunoglobulinas monoclonales la poliarteritis nodulosa o el síndrome de Sjogren
Enfermedad de Gaucher
Las inmunoglobulinas monoclonales o los fragmentos de inmunoglobulinas se
| Varios tipos de cáncer
han asociado con diversos estados patológicos (Tabla 37-10) (Atkinson, 1977; ¡ Esferocitosis hereditaria
Benbassat, 1976: Schaefer, 1978; Wells, 1974; Kelly, 1985). Estas inmunoglobu- I Infección por VIH, incluido el sida
linas también se han llamado inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida.
 888 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
La evaluación en el laboratorio de los niveles y funciones de inmunoglobu-
linas puede ayudar en el diagnóstico y tratamiento de las patologías. El
empleo de pruebas de fijación del complemento, de hemaglutinación y otros
inmunoensayos pueden detectar un aumento o cambio en la titración de anti-
cuerpos frente a determinados antigenos, como los que están presentes en
microorganismos.
Las peticiones de examinar un suero para la presencia de proteína mono-
clonal generalmente vienen de un médico que reconoce en un paciente los
síntomas clínicos y signos de este tipo de trastorno, o del examen clínico de
una electroforesis de proteina sérica que sugiere la presencia de una proteí-
na monoclonal. A menudo la sospecha del médico de la existencia de una dis-
crasia de células plasmáticas viene con la detección de anemia (con una o
más citopenias), niveles elevados de proteina total en el suero con un aumen-
to de las globulinas, y proteinuria: otras detecciones pueden incluir hiperuri-
cemía, hipercalcemia, un incremento de fosfatasa alcalina, dolor óseo o lesio-
nes líticas del tejido óseo en radiografías. Si efectivamente existe un
componente M en la electroforesis de proteínas séricas, una medida cuanti-
tativa de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial, nefelometría u otra téc-
nica apropiada puede identificar la inmunoglobulina especifica si sólo se
encuentra elevado uno de los tres tipos principales de inmunoglobulina.
Obviamente, esto no determina la cadena ligera de una inmunoglobulina
monoclonal ni detecta los mielomas de cadena ligera. Las gammapatías biclo-
nales pueden ser confusas.
El empleo de inmunoglobulinas cuantitativas resulta útil en la monitoriza-
ción del transcurso de la enfermedad y su tratamiento y puede ayudar a
distinguir la condición benigna de la maligna. Niveles de IgG monoclonal de
2 g/100 mi o de IgA de 1 g/100 mi (Isobe, 1971) o superiores sugieren una
condición maligna. En muchas inmunocítopatías malignas, la concentración
de inmunoglobulinas no monoclonales se encuentra reducida. Asi, una defi-
ciencia de inmunoglobulinas policlonales sugiere la malignidad. Paradójica-
mente el paciente que posee una inmunocitopatía maligna es inmunodefi-
ciente a pesar de que posee grandes cantidades de inmunoglobulinas "sin
sentido" producidas por un clon de células linfoides mal controlado.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis (IEP) y la electroforesis con inmunofijación (IFE)
son muy útiles en la detección de proteínas monoclonales. Asi, en pacientes
que presentan signos sospechosos, síntomas o especialmente cuando se
detectan signos hematopatológicos en sangre periférica, médula ósea o gan-
glios linfáticos, un IEP puede dar un diagnóstico. El que una electroforesis de
proteina sérica deba preceder a una IEP o IFE depende de la disponibilidad
relativa de estas técnicas y de la sofisticación de cada laboratorio. Por ejem-
plo, una electroforesis en agarosa de proteínas séricas detecta la mayoría de
los componentes M. Sin embargo, la electroforesis en papel o acetato de
celulosa no es tan sensible. Otro modo de seleccionar sueros para IEP o IFE
es revisando las determinaciones electroforéticas de las proteínas séricas.
Otra manera de abordar el análisis sugerida por Keren y sus colaborado-
res (Keren, 1988) consiste en determinar los valores del suero y la relación
K/X conjuntamente con una electroforesis de alta resolución. La inmunofija-
ción del suero se realiza si no se detectan anomalías en la electroforesis, ni
hipergammaglobulinemia, ni hipogammaglobulinemia. y si la relación K/X no
se encuentra dentro de los valores de referencia. También se recomienda la
inmunofijación del suero cuando la relación K/X es normal pero aparece una
banda no identificada en la electroforesis.
La IEP es una técnica sensible y relativamente sencilla empleada para
detectar componentes M y sus cadenas pesadas y ligeras. Permite una semi-
cuantificación de la concentración de las inmunoglobulinas. El suero de
pacientes se debe comparar con sueros "normales" o un grupo •normal". Por
ejemplo, de muestras de 100 a 200 mi de individuos sanos, se hacen porcio-
nes de 1 mi que se congelan rápidamente en hielo seco y acetona y se con-
servan a -70 °C. El suero control que no se ha utilizado no se vuelve a con-
gelar sino que se tira tras mantenerlo durante 3 dias a 4 °C.
Se recomiendan los siguientes tipos de antisuero: antisuero completo
humano; anti-lgG (cadenas y). anti-lgM (u), anti-lgA (a), anti-K y anti-A
(Fig. 37-6). Es importante darse cuenta de que no todos los antisueros son
semejantes en cuanto a fuerza y especificidad y es posible que un compo-
nente M no se detecte con un antisuero y, sin embargo, pueda encontrar-
se con un segundo antisuero. Asi, cada lote de antisuero debe comparar-
se con un suero control para su actividad mediante una difusión en gel, y
para su especificidad con suero humano completo mediante IEP. La inter-
pretación de una IEP puede requerir una considerable experiencia, pero
generalmente uno busca una variación de una linea normalmente unifor-
me, como puede ser porque se curva, presenta engrasamiento o tiene dife-
rente movilidad. Ejemplos de IEP se muestran en la Figura 37-6. La IEP es
una técnica útil pero tiene sus limitaciones. Puede identificar la presencia
de cadenas pesadas y ligeras pero no asegura que lo que hay es efectiva-
mente una molécula de inmunoglobulina compuesta por dos cadenas
pesadas y dos ligeras.
También es posible, aunque poco frecuente, que existan anticuerpos
monoclonales por debajo del límite de detección del sistema empleado. El
umbral de detección puede determinarse diluyendo un anticuerpo monoclonal
conocido y probándolo en IEP. Debido a que proteínas monoclonales perte-
necientes a las IgM, IgA. IgD e IgE pueden estar presentes en cantidades
relativamente pequeñas en comparación con la IgG, la cadena ligera de la
inmunoglobulina no-lgG puede no ser detectada mediante IEP. La incapaci-
dad para detectar las cadenas ligeras de inmunoglobulinas presentes en
menor concentración en presencia de una mayor concentración de IgG, se
denomina efecto sombra (umbrella eflecl). Por tanto, pueden ser necesarios
otros procedimientos para descartar la enfermedad de Franklin o de cadena
pesada. Es posible que el suero que se está testando y el anticuerpo que se
está utilizando no estén a la concentración adecuada y que no se detecte el
componente M. Finalmente, puede ser que el antisuero que se está usando
no detecte los determinantes disponibles de un componente M concreto. Si
uno tiene una importante sospecha, puede ser útil utilizar un segundo anti-
suero de distinto origen.
Inmunofijación
La IFE prácticamente ha sustituido a la IEP en el laboratorio clínico debi-
do a su rapidez, sensibilidad y facilidad en la interpretación; ambos proce-
dimientos son comparables en cuanto a sensibilidad. La IFE además posee
la ventaja de dar un resultado más rápido ya que no requiere la difusión a
través de gel. Muestras de suero del paciente se someten por duplicado a
una electroforesis en gel de alta resolución antes de añadir un antisuero
monoespecífico directamente sobre las proteínas separadas. Se lava el
gel, y los complejos antigeno-anticuerpo se tiñen y miden directamente
(Fig. 37-7).
De vez en cuando, la concentración de una proteína monoclonal en el sue-
ro de un paciente es tan alta que excede la capacidad de los anticuerpos para
lormar complejos que precipiten por IFE. Este fenómeno se corresponde con
la zona de exceso de antigeno indicada en la Figura 37-2. El resultado es un
halo de complejos precipitados (donde las concentraciones se aproximan a la
equivalencia) con una zona central clara donde existe el exceso de antígeno.
Aunque este resultado parece atípico, se puede interpretar y comprobar de
forma directa repitiendo el IFE con una mayor dilución del suero del páctenle
(Keren, 1999).
Cualquiera de las dos técnicas puede aplicarse a otros fluidos corporales,
siendo la orina el más común. Se pueden detectar cadenas ligeras monoclo-
nales en la orina (proteína de Bence Jones) de más de la mitad de los pacien-
tes con mieloma múltiple (Isobe. 1971; Wells. 1974). Cadenas ligeras policlo-
nales pueden detectarse en pacientes con otros trastornos, normalmente
formando parte de moléculas de inmunoglobulina completas. La detección de
la proteína de Bence Jones por calor se describe en el Capitulo 18. La
IEP/IEF de orina es más específica y más sensible que otros ensayos de Ben-
ce Jones más antiguos. Se pueden realizar IEP/IEF en muestras de orina con
suficiente proteina o tras concentración por liofilización o mediante membra-
nas selectivas (Minicon, Amicon). La medida de la viscosidad del suero se
estudia en el Capítulo 27.
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

•I v
 Figura 37-7. Presencia de inmunoglobulinas demostrada mediante inmunofijación del suero Se sometieron por duplicado muestras de sue-
ro de un paciente a una electroloresis en geles de agarosa a pH 8.6. Las proteínas separadas reaccionan con un antisuero monoespecilico,
los geles se lavaron, fijaron y tiñeron. SP o SPE = muestra que no ha sido lavada o que no se ha sometido a reacción con el antisuero: G o
IgG = muestra que ha reaccionado con anti-lgG: A o anti-lgA = muestra que ha reaccionado con IgA: M o anti-lgM = muestra que ha reac-
cionado con anli-IgM. K o anti- = muestra que ha reaccionado con anti- ;Loanti- - muestra que ha reaccionado con anti- . A. "normar.
B Componentes M de IgG-K (2). C. Componente M de IgA- . D. componente M de IgM- . E. componente M de cadena F. componente
M de cadena .

Prevención de las enfermedades y terapia
La inmunización pasiva es la administración de anticuerpos preformados
obtenidos de otro individuo de la misma especie ( -globulinas homologas) o
de una especie diferente ( -globulinas heterólogas); proporciona una protec-
ción inmediata frente a la infección. La inmunidad dura poco y decae a medi-
da que los anticuerpos se utilizan y catabolizan. La protección pasiva duran-
te el periodo neonatal se basa en la transferencia de anticuerpos maternos a
través de la placenta o el calostro (Pennington. 1991).
Grupos de -globulinas humanas son útiles para la protección temporal fren-
te a varias infecciones víricas o bacterianas (Berkman, 1990; Hammarstróm,
1990; Desai, 1991). Dependiendo de la dosis empleada y el momento de admi-
nistración, la enfermedad puede modificarse a una forma más suave o puede
prevenirse por completo. El efecto es más completo y predecible si se usan
preparaciones hiperinmunes preparadas a partir del plasma de individuos que
están convaleciendo de la enfermedad en cuestión o que se han inmunizado
frente a ella recientemente. Estas preparaciones contienen una concentración
más elevada de anticuerpos específicos. También se pueden producir anti-
cuerpos en animales, como pueden ser los caballos, y en el pasado han teni-
do una importante aplicación. Sin embargo, la sensibilización a proteínas
externas puede desencadenar reacciones clínicas como la anafilaxis, enfer-
medad del suero, pirexia y reacciones de Arthus locales.
Los anticuerpos monoclonales han revolucionado muchas áreas de la
medicina, incluyendo la investigación, diagnóstico y terapia. Se han desarro-
llado anticuerpos murinos, humanos y humanizados (Lefrano, 1990: Moun-
tain, 1992: Morrison, 1992; Ward. 1992; Shin, 1993). Muchos anticuerpos
monoclonales. que a menudo reemplazan a los antisueros policlonales. se
usan con fines diagnósticos (Véase Cap. 35). Quizás las aplicaciones tera-
péuticas más importantes se ven en el campo del trasplante y la oncología
(Neame. 1994; Stevenson. 1990: Vitetta, 1993). OKT3. un anticuerpo mono-
clonal munno frente al receptor CD3 de linfocitos, a menudo se emplea como
terapia antirrechazo para bloquear la actividad de linfocitos T citotóxicos en
 CAPÍTULO 37 • EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
pacientes de transplante renal (Ortho Multicenter Transplant Study Group.
1985). Se están evaluando muchas aplicaciones clínicas importantes de anti-
cuerpos monoclonales. Un ejemplo reciente es el uso de un anticuerpo mono-
clonal frente al factor de necrosis tumoral u para prevenir las reacciones de
Jarisch-Herxheimer resultantes del tratamiento con antibióticos en el caso de
infecciones por Borrelia en ovejas (Fekade. 1996). Anticuerpos monoclonales
anticitocinas y antimoléculas de adhesión de neutrófilos pueden resultar efec-
tivos en condiciones asociadas con inflamación aguda y liberación de ciloci-
nas, por ejemplo, inhalación de ácido, isquemia o heridas de reperfusión
(infarto de miocardio, choque hemorrágico, reparación de un aneurisma aór-
tico); y anticuerpos que inhiben la adhesión de neutrófilos pueden resultar
efectivos en el tratamiento de asma, fibrosis pulmonar, meningitis y malaria
cerebral. Parece razonable esperar que una multitud de aplicaciones tera-
péuticas aparezcan en el luluro, en que se diseñarán anticuerpos monoclo-
nales que modulen las acciones de uno o más mediadores naturales de infla-
mación, infección o proliferaciones malignas.
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 C A P Í T U L O 38

Complemento y cininas:
1
mediadores de la inflamación
Eric Wagner, PhD.
Haixiang Jiang, M.D., PhD
Michael M. Frank, M.D.

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL SISTEMA Enfermedades dermatológicas

DEL COMPLEMENTO 892 Enfermedades hematológicas
Nomenclatura Enfermedades neurológicas
C3: molécula central de las vías de activación Enfermedades cardiovasculares
del complemento Biocompatibilidad
Vía clásica Trasplante de órganos
Vía alternativa UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES
Vía de la lectma fijada a mañosa
DEL COMPLEMENTO 906
Componentes finales del complemento
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO 906
Anafilotoxinas
Principios generales
Regulación de la activación del complemento
Evaluación funcional de la vía clásica
Receptores del complemento
Manejo de las muestras
Biosíntesis del complemento
Preparación de eritrocitos
Genética del complemento
Preparación de eritrocitos de oveja sensibilizados
Complemento e inmunidad adquirida con anticuerpos
DEFICIENCIAS GENÉTICAS DEL COMPLEMENTO 902 Ensayo del complemento hemolítico total
Ensayo de la vía alterna
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL
Niveles del complemento mediante
COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD 903
ensayos antigénicos
COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD 903 Prueba de fijación del complemento
Enfermedades reumatológicas
CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN DE CININAS 910
Enfermedades infecciosas
BIBLIOGRAFÍA 910
Enfermedades renales

mación con la atracción de células fagocitos. También ha quedado claro que el

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL SISTEMA
DEL COMPLEMENTO
El término "complemento" se refiere a un grupo de glicoproteínas circulantes
que funcionan facilitando la inflamación y realizan un importante papel en la
defensa del huésped. El daño tisular incontrolado es una posible complicación
de la activación del complemento, y existen una gran variedad de glicoprotei-
nas circulantes así como proteínas tisulares de unión a membrana que funcio-
nan regulando la actividad del complemento y disminuyen la agresión del com-
plemento. La existencia de este sistema de proteínas fue inferido en los últimos
años del siglo xix cuando quedó claro que el suero fresco tenía la posibilidad de
lisar bacterias Gram negativas y vibriones cólera en presencia de anticuerpos
específicos. A medida que las técnicas para la purificación y la identificación de
proteínas se hicieron más sofisticadas con los años, quedó claro que había un
sistema muy complejo con muchas proteínas interaccionando.
En general, el sistema funciona identificando células y microorganismos extra-
ños y destruyéndolos Esto ocurre por lisis directa, por opsonización (el proceso
de cubrirlos con péptidos específicos del complemento reconocidos por recepto-
res específicos de los fagocitos para producir su ingestión) o provocando infla-
complemento juega un papel para facilitar la respuesta inmune.
El sistema de proteínas del complemento es más antiguo filogenèticamen-
te que la inmunidad adquirida (anticuerpo) y está presente en muchos orga-
nismos primitivos. Presumiblemente, proporciona un nivel de inmunidad natu-
ral y defensa del huésped incluso en ausencia de anticuerpos. Esto lo hace a
través de la vía de la de lecitina unida a manosa (MBL) y la vía alternativa del
complemento, que se tratan mas adelante. Los anticuerpos proporcionan un
nivel de especificidad aumentado y aumentan la eficacia mediando la defen-
sa del huésped. En otras obras se puede encontrar una detallada historia del
descubrimiento del complemento y de las diferentes vias del complemento
(Frank. 1998).
Nomenclatura
Hay tres vias pnncipales de activación del complemento en el suero humano:
la vía clásica, la vía alternativa y la via de la MBL (o vía de la MBLectina). La
Figura 38-1 muestra la secuencia de reacción de cada vía. La Tabla 38-1 pro-
porciona información especifica sobre cada proteina del complemento plasmá-
tica La nomenclatura para las proteínas del sistema del complemento
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN 893

C5b678(9)n Complejo de alague de membrana

Figura 38-1. Los componentes de las vías clásica, MBIecitina y alternativa convergen para formar una convertasa que degrada al C3. En la
via clásica, el complejo antigeno-anticuerpo se une y activa secuencialmente al C1,C4y C2. En la vía de la MBIectina, la interacción de la
MBL con un carbohidrato en la superficie de un microorganismo origina la formación de un complejo enzimático (MBL-MASP-l-MASP-2, lla-
mado M en la figura) que se une y activa al C4 y al C2. En la via alternativa, el C3 sufre la hidrólisis de su enlace tiol-ésler. lo que induce un
cambio en su conformación. Entonces se une al factor B (B), que es degradado por el factor D (D) para formar una convertasa que es esta-
bilizada por la properdina (P). El C3b, el producto de degradación del C3, también tiene un residuo tiol-ester degradado y es capaz de acti-
var la via alternativa. La convertasa con C3b de todas las vías continúa secuencialmente mediante la unión con los componentes de apari-
ción final hasta que la secuencia de activación se completa.

generalmente sigue dos convenciones (WHO. 1968: IUIS-WHO. 1981). Por
razones históricas, las nueve proteínas de la vía clásica se nombran por la
letra C seguida del número que cuenta su orden de aparición en la secuencia
de reacción. Una excepción importante es C4, que aparece antes que C2. Las
moléculas que son parte del complejo C1 se denominan Clq, Clr y Cls. Las
proteínas que reaccionan únicamente en la vía alternativa son llamadas fac-
tores y se denominan con una letra mayúscula (p. ej., factor B. factor D).
Además, los fragmentos de las proteínas del complemento resultantes de la
ruptura proteolítica se denominan con una letra en minúscula (p. ej.. C4a,
C4b) donde a representa el fragmento pequeño y b representa el fragmento
grande. La excepción a esta regla es C2, donde C2a es el fragmento grande
y C2b es el fragmento pequeño. Los posteriores fragmentos degradantes de
los fragmentos grandes del complemento en un componente son denomina-
dos con una letra en minúscula (p. ej., C3c, C3d). Los componentes que han
perdido su actividad normalmente se denominan con un prefijo con i minús-
cula (p. ej.. iC3b, iC4b). Las cadenas polipeptídicas de la proteína nativa del
complemento se denominan con letras griegas (r/.. |5. y) excepto para el Clq,
cuyas cadenas son denominadas A, B y C. Los componentes simples o com-
plejos multicomponentes que tienen actividad enzimática se denominan con
una barra sobre el componente o los componentes. Las proteínas de la
recientemente descrita vía MBLectina son denominados con las abreviaturas
de los nombres de las proteínas (p. ej., MBL para lectina lijada a mañosa,
MASP para la proteinasa sérica asociada a la MBL). Las proteínas regulado-
ras son denominadas con un lítulo o una letra descriptiva (p. ej.. proteína uni-
da a C4, factor H). Las proteínas reguladoras de unión a la membrana han
sido denominadas con números CD y títulos descriptivos (p. ej., proteína
 894 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA

Tabla 37-8 Proteínas del c o m p l e m e n t o en el plasma h u m a n o

Proteina P e s o molecular (kDa) Localización c r o m o s o m i c a Concentración (mg'ml)

Común a todas las vias

C3 185 19p13.3-p132 1 200-1.300
Via clásica
C1q 460 1p34.1-36.3 150
Cir 85 12p13 50
C1S 85 12p13 50
C4 205 6p21.3 300-600
C2 102 6p21 3 20
Via alternativa
Factor B 93 6p2t 3 200
Factor D 24 Desconocido 2
Properdina 55 (monomoro) Xpl 1 4-p 11 2 25
Vía MBLecitina
MBL 200-400 10p11 2-q21 0.002-10
MASP-1 93 3q27-28 1,5-13
MASP-2 7C 1p36 3-36.2 Desconocida
Complejo de ataque a la membrana
C5 190 9q33 80
C6 110 5p13 45
C7 too 5p13 90
C8 150 1p32 (cadenas u y ß) 9q22 3-q32 (cadena y) 55
C9 70 5p13 60
Proteínas de control
C1inh 105 11q11-q13.1 240
C4bp 550 1q32 250
Factor I 88 4q25 35
Factor H 150 1q32 300-450
Proteina S 84 17q11 500
Clusterin 70 Desconocido 50
Factor J 20 Desconocido -5,4

cofactor de membrana. CD46) y los receptores del complemento son deno- En presencia de un aceptor adecuado, el tiol-éster interno puede no sufrir
minadas con números que siguen al pretijo CR (para los receptores del com- la hidrólisis y degradarse, pero puede reaccionar con un nucleófilo en una
plemento 1 a 4). Los otros receptores del complemento se denominan con célula diana para formar una unión amida o éster con el sustrato diana del
símbolos del complemento seguidos por la letra mayúscula R. complemento de ataque. De este modo, la activación del C3 con la consi-
guiente degradación del tiol-éster puede originar una unión covalente de la
C3: molécula central de las vías de activación molécula de C3 a ia superficie de la célula diana.
del complemento Así queda cubierta una diana con C3b. pudiendo interaccionar con las célu-
las que expresan receptores de C3b. Estas incluyen todos los fagocitos, los
La proteína lamada C3 es fundamental para la función de las tres vias de linfocitos B y una población de linfocilos T,
activación del complemento (la via de la MBLectina, la via alternativa y la vía El C3, con su cadena a' unida covalentemente a la diana y la cadena \i
clásica) y la comprensión del C3, su mecanismo de acción y sus funciones es unida debido a la unión disulfuro intracatenaria. se denomina C3b (Fig. 38-2).
esencial para comprender la activación y la función de todas las vias del com- Es la forma en la que el C3 continúa la cascada del complemento conducien-
plemento. do a la lisis. Además, de esta forma, la molécula puede interaccionar con las
El C3 es una molécula de dos cadenas sintetizada en muchas células, par- dos glicoproteinas circulantes, los factores H e I. siendo la segunda una enzi-
ticularmente en los hepatocitos. formada a partir de una molécula de cadena ma proteolítica que degrada el C3 de la sangre. En la interacción con los fac-
única, el pro-C3, y liberado a la circulación. Las dos cadenas (a y p) están tores H e I. un pequeño fragmento, el C3f, de 3 kDa. es liberado, siguiendo
estabilizadas por puentes disulfuro mtracatenario, y hay un puente disulfuro dos degradaciones adicionales de la cadena a en una curva disulfuro dentro
intercatenario estabilizando la interacción de la cadena a y la p (Fig. 38-2). de la cadena que conecta las porciones amino y carboxi-terminal de la cade-
Las interacciones hidrofóbicas son también importantes, y la reducción de los na a' (Fig. 38-2). Debido a las diferentes uniones disulfuro, la mayoría del
puentes disulfuro intracatenano no origina la separación de las cadenas en C3b permanece unido a la diana del complemento.
ausencia de agentes que rompan la interacción hidrofóbica. Una vez realizada la degradación del C3b por los factores H e I. todavía
En la cadena a del C3. hay un tiol-éster uniendo el sulfhídrilo de la cisterna ocurre otro cambio conformacional. Esta molécula, ahora lamada iC3b. inter-
en la posición 988 con un residuo de glutamina de 3 aminoácidos. Este tiol-éster acciona pobremente con el CR1. el receptor C3bC4b. pero interacciona con
interno confiere una estructura inestable a la molécula de C3 El tiol-éster inter- la integrina p\, CR3 (CDl1b CD18). El iC3b ya no puede interaccionar con las
no está oculto en el centro hidrofóbico de la molécula. Puede ser degradado por proteínas de la parte final del complemento para inducir la lisis.
la hidrólisis gradual a medida que el agua penetra en la molécula. Es degrada- Igual que con el C3b. el iC3b facilita la fagocitosis uniendo la diana del com-
do mucho más rápidamente una vez degradada la cadena alfa del C3 con libe- plemento a los fagocitos mediante los receptores de iC3b. Estos incluyen
ración del C3a (fragmento de 9 kDa) en el extremo amino-terminal de la cade- todos los lagocilos y los macrófagos, pero no incluyen los linfocilos B o las
na a. La cadena restante se lama a'. El C3 nativo, presente en 1,2 mg'ml en células T. En presencia de CR1, el C3b y el iC3b pueden sufrir posteriores
el plasma normal, no interacciona con las células que expresan receptores de degradaciones por el factor I. En ese caso, una degradación adicional se pro-
C3. Sufre una gran alteración conformacional con la degradación del tiol-éster duce en la porción amino-terminal de la cadena (/.. Una porción de 41-kDa de
interno. El C3 con el tiol-éster hidrolizado interactúa con las células que expre- la cadena a unida por enlaces amino o éster a la diana permanece detrás, y
san receptores de C3b. especialmente CR1 (receptor C3b C4b, CD35). es liberado el C3c. que contiene las porciones amino-terminal y carboxi-ter
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN 895

mínal del C3b. unidas por un disulfuro entre ellas, y unida por un disulfuro a convertasa de la vía alternativa descrita antes, degrada las moléculas adicio-
la cadena |5 (Fíg. 38-2). La porción restante unida covalentemente a la diana nales del C3 continuando la cascada del complemento {vide mira).
se denomina C3dg y puede sufrir una posterior degradación a C3d. De nue- Datos recientes sugieren que existe una vía MBLecitina que actúa via MBL
vo, existe un receptor específico para el C3d y para el C3dg (CR2, CD21). y serin proteasas lamadas MASP-1 y MASP-2 ya sea para la degradación
Este receptor está presente en todos los Imfocitos B, en algunos linfocitos T directa del C3 por una de las enzimas MASP o para la activación de la vía clá-
y en algunas células epiteliales, pero no está presente en los fagocitos. Se sica para formar la C3 convertasa de la vía clásica. En cualquier caso, el C3a
analiza con más detalle posteriormente. se degrada de C3. El tioléster es degradado y la molécula entonces es capaz
El C3 en su configuración nativa no activa la via alternativa. Sin embargo, de unirse a las dianas. Debe quedar claro que el C3 sufre una hidrólisis o la
el C3 (H 0) (también lamado iC3) y el C3b interaccionan con los factores
2
escisión a C3b, una posterior degradación a iC3b, y después la posterior
proteicos D, B y properdina de la via alternativa para formar una nueva enzi- degradación a 3dg y a C3d. Los diferentes receptores celulares interaccionan
ma, el C3bBb. la convertasa da la vía alternativa. Esta enzima es capaz de con el C3 en etapas específicas en la vía de degradación.
degradar posteriormente el C3 separando la cadena a de las moléculas adi- De este modo, el C3 representa la proteina central de las tres vias del com-
cionales del C3 nativo. La hidrólisis interna gradual del C3 a C3(H-,0). por lo plemento. La proteina no interaccíona con ningún receptor en su lorma nati-
tanto, puede mediar la activación de la vía alternativa activando el C3 a una va. Debe ser hidrolizada para activar la vía alternativa e mteraccionar con los
configuración hidrolizada de C3. uniendo los factores B. D y properdina y receptores de C3b. La separación del C3a de su cadena a produce el mismo
degradando moléculas adicionales de C3. Esto se denomina "señal" interna efecto. Esto puede ocurrir a través de la activación de cualquiera de las tres
y se cree que es bastante importante en la activación inicial del C3 por la vía vías del complemento. La posterior degradación, como se describió, conlleva
alternativa. a una progresiva interacción con los receptores en diferentes etapas de las
El anticuerpo y los componentes de la vía clásica originan la producción de células presumiblemente mediando la fagocitosis por un lado y la regulación
una vía clásica C3 convertasa en la superlicie de las dianas, que, como la C3 de la respuesta inmune por el otro.

Figura 38-2. Secuencia de degradación del C3 e inacti-

vación del C3b. El peso molecular aproximado de cada
cadena o fragmento se da en kilodaltons. Las enzimas y
cofactores responsables de cada degradación (designa-
dos en letras mayúsculas) son: A. C3 convertasa: B, fac-
tor H o CR1 + factor I; C. CR1 + factor I; D, tripsina, elas-
tasa o plasmma.
 896 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Vía clásica al anticuerpo Ig G cuando esta inmunoglobulina es la iniciadora de la activación

de la vía clásica del complemento (Brown. 1983). El nuevo complejo generado
La activación de la via clásica del complemento, descrita alrededor del año (C4b2a3b) representa la C5 convertasa de la vía clásica y dispara la sedimen-
1900. fue la primera en ser estudiada. Esta via es responsable de la activa- tación de los componentes finales del complemento en la superficie diana.
ción del complemento en la mayoría de las células sensibilizadas con anti- La IgM y la IgG difieren en su capacidad para activar la vía clásica del com-
cuerpos. Los detalles de esta vía están publicados en otras obras (Volanakis. plemento. Parece que una molécula simple sobre todo de anticuerpos Ig M uni-
1998: Fries, 1987). Nueve proteínas numeradas componen la vía clásica. La da por múltiples lugares del anticuerpo a un antígeno puede unir una molécu-
activación de la via clásica normalmente requiere la interacción entre un antí- la de C1 y disparar una secuencia completa de activación del complemento.
geno y un anticuerpo fijador de C1. En humanos, solo la inmunoglobulina M La Ig M. con sus cinco sitios de unión antigénicos, adopta una conformación
(Ig M) y la Ig G son efectivas en activar la via clásica. La eficacia de la acti-"básica" en la superficie antigénica para permitir múltiples interacciones con los
vación de la vía clásica por las subclases de Ig G es la siguiente: Ig G3>lg antígenos. En contraste, la unión del C1 a la Ig G requiere dos moléculas de
G1>lg G2; la Ig G4 no es capaz de activar el complemento. Interesantemen- Ig G una al lado de la otra en la mayoría de los estudios experimentales (Bor-
te, un número de moléculas, diferentes de las inmunoglobulinas. tiene la sos, 1965). Ya que los anticuerpos Ig G se unen a una superficie diana de for-
capacidad de activar la via clásica a través de la interacción directa con el ma aleatoria y ya que los antígenos pueden no ser distribuidos de forma uni-
C1q. Estas incluyen la proleína C reactiva, el componente sérico del amiloide forme en un organismo diana, puede ser necesaria la unión de cientos o miles
P, el fi-amiloide. algunas bacterias gram negativas, ciertos virus, el micoplas- de Ig Gs para generar un lugar de unión para el C1. La activación de la vía clá-
ma, protozoos y componentes intracelulares como el ADN, las membranas sica por el complejo Ig G-antígeno también parece facilitar la vía alternativa
mitocondriales y los filamentos del ciloesqueleto (Gewurtz. 1993). Interesan- (véase siguiente sección) sobre la superficie del activador (Moore, 1981).
temente, las células apoptóticas se unen al C1q (Korb, 1997) y tienen la capa- La capacidad de las inmunoglobulinas agregadas para unir el Ciq ha pro-
cidad de activar la vía clásica. Esto puede ser de importancia crítica en la eli- porcionado las bases para un número de pruebas diseñadas para detectar la
minación de las células apoptóticas de la circulación. presencia de complejos inmunes solubles en las muestras de sangre de los
Nos centraremos en la activación del complemento como sucede en las dia- pacientes. El C1q radiomarcado se añade a la muestra de suero o de plasma,
nas sensibilizadas a anticuerpos. Una vez unida la inmunoglobulina al objetivo, y se usa una de las técnicas existentes para separar el Ciq libre del unido a los
el C1 se une a la inmunoglobulina y se activa. La naturaleza precisa de la inter- componentes proteicos del suero. El Ciq unido sugiere la presencia de com-
acción antígeno-anticuerpo-C1 no está clara. El C1 es una macromolécula de plejos de inmunoglobulinas en la muestra de suero o de plasma (Zubler. 1976).
740 kDa que consta de una molécula simple de C1q compleja con dos cadenas
C1r y dos cadenas C1S unidas todas en presencia de iones calcio. El C1q está
formado por seis subunidades, cada una conteniendo tres cadenas polipeptídi- Vía alternativa
cas (designadas A. B y C). Las tres cadenas forman una triple hélice parecida al La presencia de una segunda vía de activación del complemento fue
colágeno con regiones globulares que constituyen la porción carboxi-terminal de propuesta por primera vez por Piilemer (1954) pero fue aceptada por la
la molécula. El C1q se une a las inmunoglobulinas a través de sus cabezas glo- comunidad científica dos décadas después. Esta vía de activación del com-
bulares, mientras que se une a otros activadores de la vía clásica como la pro- plemento parece ser importante en la defensa precoz contra los microor-
teina C reactiva y el ADN a través de su región parecida al colágeno. Las cade- ganismos patógenos (Pangburn. 1984). Los anticuerpos pueden activar la
nas C1r y C1S se unen a la región similar al colágeno del C1q. Se sabe que el via pero normalmente no son necesarios. El comienzo de la via alternativa
primer componente de la via clásica, el Ciq. se une al dominio Cy2 de la Ig G o en la superficie de un aceptor depende de la capacidad del grupo carbonil
al dominio Cu3 de la Ig M. Una vez unido a la inmunoglobulina, el C1q adopta del grupo tioléster expuesto del C3b de interaccionar ya sea con un grupo
un cambio conformacional que conlleva la autoactivación de las dos cadenas amida o con uno hidroxilo de la proteína o del carbohidrato presente en la
C1r. Se cree que esto origina la degradación de las dos cadenas C1r para crear superficie del objetivo (Law, 1979). La generación del C3b se consigue por
un sitio activo enzimáticamente en cada cadena. El C1r activado se escinde
2 la denominada C3 convertasa de iniciación. En el suero, el C3 es hidroli-
entonces en dos cadenas C1s. Este C1 "activado" es una proteasa y tiene ade-zado a un índice de 0,2% a 0,4% del depósito plasmático por hora (Pang-
más, en algunos sistemas modelo, actividad estearasa. El C1s aclivado degra- burn, 1981). El C3 con un tioléster hidrolizado sufre un cambio conforma-
2

da el siguiente componente de la cascada, el C4. El fragmento mayor, C4b, se cional que le permite interaccionar con las proteínas que no interaccionan
une a la superficie del activador, mientras que el fragmento pequeño, el C4a, es con el C3 nativo y se denomina C3(H,0) (también lamado iC3). El 03(^0)
liberado en la fase de fluido. El C4a es una anafilotoxina y se describe en otra entonces tiene la capacidad de interaccionar con el factor B en presencia
sección de este capítulo. El C4b es altamentente reactivo químicamente duran- de iones magnesio. El factor B. una vez unido al C3(H,0), puede interac-
te unos momentos después de la degradación del C4 y puede unirse a la super- cionar con el factor D y es degradado para generar la convertasa de ini-
ficie del activador. La unión a la superficie del activador es relativamente ineficaz. ciación C3(H;0)Bb y liberar un pequeño fragmento, el Ba. Esta degrada-
Por lo tanto, la mayoría del C4b generado es hidrolizado y permanece en la fase ción es mediada por el factor D, una proteasa sérica que adopta una
de fluido. De cualquier manera, algunas de las moléculas de C4b generadas se configuración activa una vez reconocido su sustrato y vuelve a una confor-
unen a la superficie del activador como un grupo alrededor del lugar antígeno- mación inactiva una vez que se produce la degradación proteolítica (Vola-
anticuerpo-Cl. Un lugar simple antígeno-anticuerpo-C1 puede entonces condu- nakis, 1996). La convertasa de iniciación C3 degrada el C3 para generar
cir a la sedimentación de muchas moléculas de C4b. un C3b metaestable a un índice constantemente bajo en la circulación. El
C3b metaestable puede unirse covalentemente a la superficie del activador
En presencia de iones magnesio, el C4b actúa como un lugar para la unión
y entonces, como el C3(H 0). unirse al factor B. Se ha propuesto que la
2
y posterior degradación del C2. El C1s, en asociación con el C4b. degrada el
2
presencia de ácido siálico en las glicoproteínas y glicolípidos asociados a
C2 en dos fragmentos. El fragmento mayor. C2a, permanece unido al C4b,
la membrana previene la formación de una C3 convertasa de la vía alter-
mientras que el pequeño, el C2b. se libera en la fase liquida. Esle complejo
nativa aumentando la afinidad del factor H (véase después en Regulación
molecular (C4b2a) es inestable y tiene una vida media relativamente corta debi-
de la activación del complemento) para el C3b (Kazatchkine, 1979). Como
do a la desintegración que resulta de la disociación de C2a en una forma inac-
en la C3 convertasa de iniciación, el factor D degrada al factor B para
tiva. Este complejo (C4b2a) representa la convertasa C3 de la vía clásica reque-
generar la C3 convertasa de unión celular C3bBb. Este complejo se desin-
rida para la unión y degradación del C3. El C2a en el complejo C4b2a es la
tegra rápidamente pero es estable una vez unido a la properdina. que pro-
enzima que degrada el C3 en la siguiente etapa de la cascada de activación y
longa la vida media de la C3 convertasa de uno a dos minutos a 18 minu-
del C5 en una etapa posterior. El C2a degrada el C3 en un fragmento grande,
tos (Fearon, 1975). Esta C3 convertasa estabilizada rápidamente degrada
el C3b, que se une a la superficie del activador, y un fragmento pequeño, el
más C3, que puede unirse a la superficie del activador y entonces se con-
C3a. que es liberado en la fase de fluido y sirve como una anafilotoxina. Como
sidera como la amplificación de la C3 convertasa de la vía alternativa. Esta
en el caso del C4. no todo el C3b se une a la superficie del antigeno objetivo.
amplificación del C3b depositado en la superficie del activador permite la
En algunos sistemas modelo, alrededor del 5% del C3 activado se une al obje-
formación de una C5 convertasa (C3b-BbP) (Kinoshita, 1988) que tiene la
tivo. Además, en algunos modelos, un alto porcentaje del C3 del objetivo se une
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN 897
capacidad de disparar la activación de los componentes terminales del sis- embrago, es necesaria la inserción de múltiples copias de C9 a través de la
tema del complemento. bicapa lipídica a través de la interacción inicial con la cadena a del C8 para
producir la completa actividad citolítica del MAC (Plumb. 1998). Se cree que
el complejo C5b-8 sirve como un iniciador para la polimerización del C9 en
Vía de la lectina fijada a mañosa la membrana celular. El MAC, por microscopía electrónica, muestra una
estructura parecida a un cilindro hueco formada por el ensamblaje de sus
Recientemente se ha descrito una tercera via de activación del comple- componentes en presencia de un exceso de C9 (Podack. 1984). El meca-
mento que utiliza una proteina sérica, presente en alrededor de 1.5 ug mi. nismo por el que el MAC rompe la membrana celular todavía es controver-
la MBL (también lamada lectina unida a mañosa o proteína fijadora de tido y puede incluir la distorsión de la bicapa lipídica para formar parches
mañosa). La MBL está presente en todos los mamíferos y pájaros, y per- agujereados" (Esser, 1991) o, más probablemente, la lormaaón de un poro
tenece a la familia de moléculas lamadas colectmas (Turner, 1996: Eps- transmembrana con un centro hidrofílico a través del que los iones pueden
tein, 1996). La familia de las colectinas incluye, además de la MBL, las pro- pasar libremente (Bhakdi. 1991). La formación del MAC induce la lisis de
teínas del surfactante pulmonar A y D (SP-A, SP-D), la conglutinina bovina ciertas bacterias y virus, y de eritrocitos heterólogos. La mayoría de las
y la CL-43 bovina (Epstein. 1996). La MBL está estructuralmente relacio- células nucleadas resisten la citotoxicidad inducida por el MAC. Esta pro-
nada con el C1q. Su estructura primaria es una cadena polipeptidica for- tección, especialmente del ataque del complemento por las proteínas del
mada por un núcleo colágeno y un dominio globular carboxi-termmal (Han- complemento propias, es mediada por las moléculas reguladores asociadas
sen, 1998). Tres de las cadenas se asocian para formar la subunidad de la a la membrana que previenen la formación del MAC (véase después Regu-
molécula. En el suero, la MBL se encuentra como una mezcla de dímeros lación de la activación del complemento) asi como por la liberación de pro-
y hexámeros de su subunidad primaria. La MBL reconoce ciertos carbohi- teínas del complemento activadas por la sangre de la superficie celular. La
dratos expresados en la superficie de los microorganismos (es decir, no lisis de las células nucleadas mediada por el MAC puede ocurrir pero
reconoce carbohidratos como la galactosa y el ácido siálico que son los requiere múltiples lesiones por el MAC para producirse (Koski, 1983). Se na
azúcares terminales expresados en las glicoproteinas de los mamíferos) propuesto que la pérdida de cantidades subliticas de MAC puede proteger
(Epstein. 1996). En orden de importancia, los ligandos de la MBL son: a la célula del consiguiente ataque del complemento (Reiter, 1992). Las
mañosa, W-acetil-glucosalina, -fucosa, rv-acetil-manosamina y glucosa
L
células nucleadas están protegidas en parte de los efectos del MAC debido
(Hansen, 1998). Esto permite a la MBL discriminar entre lo propio y lo a la eliminación activa de la superficie celular a través de la reparación de
extraño. Se informó que la MBL reaccionaba con un amplio numero de bac- la membrana unida al recambio lipidico (Mold, 1998). La formación del MAC
terias no capsuladas Gram positivas y Gram negativas, con virus, levadu- tiene un efecto estimulante sobre muchos tipos de células nucleadas. Entre
ras, micobactenas. parásitos y protozoos (Epstein, 1996). Una vez recono- otros, estos efectos incluyen la producción de radicales reactivos del oxíge-
cido su carbohidrato ligando, la MBL adopta un cambio conformacional que no por los neutrófilos y los macrófagos, la liberación de eícosanoides por las
conleva la activación de dos proteasas séricas asociadas a la MBL, la células tagociticas. la inducción de actividad procoagulante por las plaque-
MASP-1 y la MASP-2 (Thiel, 1997). Tanto la MASP-1 como la MASP-2 tas y las células endoteliales. la actividad proinflamatoria en las células
muestran homología estructural con el C1 r y el Cis, sugiriendo similitudes endoteliales y las células del músculo liso, la proliferación de células del
con el complejo C1 (C1qrs). Una vez activada, la MASP-2 degrada el C4 músculo liso y de células endoteliales. y la iniciación de las vias de trans-
2 ?

para generar la C3 convertasa C4b2a (Vorup-Jensen. 1998). La MASP-1
tiene la capacidad de degradar el C3 (Matsushita. 1998). sugiriendo que
esto puede desencadenar directamente la activación de la vía alternativa
(Schweinle, 1989). Después de la generación de la C3 convertasa de la vía
clásica, la C4b2a, por el complejo MBL-MARSP-1-MASP-2, la activación
del complemento se produce como en la vía clásica con el posible recluta-
miento de la vía alternativa también (Suankratay. 1998). La via de la MBLe-
citina también puede dispararse por un complejo antígeno-anticuerpo Se
demostró que una fracción de las moléculas de Ig G que carecen de resi-
duos galactosa terminal (llamados Ig G-GO), tal y como se encuentran en
el plasma de pacientes con condiciones patológicas como la artritis reu-
matoide. tienen la capacidad de interaccionar con la MBL y activar la vía
clásica (Malhotra, 1995). La MBL puede jugar un papel en la eliminación de
organismos diana por los fagocitos a través de la interacción con un recep-
tor específico presente en estas células (Hansen. 1998: Tenner. 1995). La
regulación de la vía de la MBLecitina parece ser mediada por el Cl inhibi-
dor (Matsushita. 1996) y por la cx-macroglobulina (Terai. 1995).
Componentes finales del complemento
degradado por el Cls . El C3a es un fragmento peplidico de 9 kDa liberado
ducción de señales (Mold. 1998; Sims. 1995: Tudesco. 1997: Benzaquen.
1994; Kilgore, 1996; Niculescu. 1999, 1993).
Anafilotoxinas
La activación de la vía clásica, alternativa o de la MBLectina del comple-
mento origina la generación de los fragmentos proteicos de! complemento
que tienen importantes papeles en diferentes funciones biológicas como la
opsonización. la fagocitosis, la inmunomodulación y la generación de reac-
ciones inflamatorias. La opsonización, la fagocitosis y la inmunomodulación
dependen en su mayor pane de los receptores del complemento expresados
en las diferentes células del cuerpo, y se discuten en una sección posterior.
Como se discutió previamente, la activación del complemento origina una
degradación proteolitica de muchas proteínas del complemento con la consi-
guiente liberación en la fase de fluido de pequeños fragmentos que tienen
efectos biológicos. Tres de estos fragmentos liberados se laman anafilotoxi-
nas. Son el C4a. el C3a y el C5a. Las caraclerislicas estructurales y funcio-
nales de estas moléculas se describen en un mlorme excelente sobre el tema
(Ember. 1998). El C4a es un péptido de 8.7 kDa liberado del C4 una vez
:

Las tres vías principales de activación del complemento convergen en la durante la degradación proteolitica selectiva de la cadena C3r/ por el C2a en
activación del C3 y en el ensamblaje del complejo de ataque a la membra- la vía de activación de la C3 convertasa clásica y MBLectina. También es libe-
na (MAC), que está formado por los componentes C5 a C9, Una vez forma- rado por la degradación proteolitica del C3 por el péptido enzimáticamente
das las convertasas de la via clásica, de la MBLecitina (C4b2a3b) y de la activo, Bb, en la via de la C3 convertasa alternativa. El C5a es un péptido de
alternativa (C3b2Bb). el C5 es degradado. El fragmento grande (C5b) pue- 11 kDa liberado de la cadena a del C5 por la degradación inducida por el C2a
de asociarse con la membrana celular e interaccionar con el C6. La siguien- en la vía de la C5 convertasa clásica o MBLectina o por el Bb (y quizás en la
te etapa incluye la interacción del complejo C5b-6 con un fluido fase C7 for- MBLectina) en la vía de la C5 convertasa alternativa. En general, las anafilo-
mando un complejo triménco con propiedades anfifílicas (alta afinidad por loxinas se definen por sus efectos biológicos sobre las células del músculo
los constituyentes lipidíeos de la membrana celular) (Podack, 1979). El C5b- liso, los maslocitos, los pequeños vasos sanguíneos y los leucocitos de san-
7 se inserta en la bicapa lipídica de la membrana celular pero no es sufi- gre periférica. Los efectos específicos mediados por estos péptidos incluyen
ciente para que ocurra la lisis celular. El C8 se asocia con este complejo tri- la degranulación de los mastocitos y los basófilos con la consiguiente libera-
molecular a través de la interacción con el C5b expuesto. El complejo C5b-8 ción de diferentes mediadores como la histamina o la serotomna. Además,
penetra a través de la bicapa lipídica para formar un pequeño poro trans- inducen la agregación neulrofílica humana, la contracción del músculo liso, el
membrana y puede originar la lenta lisis de los eritrocitos (Ramm, 1982). Sin aumento de la permeabilidad vascular, la inducción de la liberación de trom-
 898 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

boxano de los macrólagos del conejilo de Indias, y la estimulación de la Reguladores del fluido sanguíneo
secrección de moco por las células caliciformes (Marón, 1985). Un efecto
importante de las anafilotoxinas sobre los basófilos es originar vasodilatación El control del primer componente de la via clásica, el C1. está mediado
a través de la liberación de histamina, conduciendo a un aumento del flujo san- por el C1 inhibidor (C1inh). El Clinh es una proteína altamente glicosilada
guíneo en el lugar de la inflamación. La función del C4a generalmente es simi- de 105 kDa que tiene la capacidad de disociar el C1 activado (Davis. 1989).
lar a la del C3a. Sin embargo, el C4a es mucho menos efectivo en sus efectosEl Clinh inhibe la autoactivación del C1. la activación del C1 en el fluido san-
biológicos sobre una base molecular. El C5a es sin duda la más potente de las guíneo, y la activación del C1 en la superficie de los activadores de la vía clá-
anafilotoxinas humanas. Por ejemplo, el efecto del C5a es 200 veces mayor sica pero no en la mayoria de los complejos inmunes (Doekes. 1983). El Clinh
que el del C3a y 3.000 veces mayor que el del C4a originando la contracción es un inhibidor serín proteasa (serpin) que disocia el complejo C1 activado
del músculo liso del Íleon del conejilo de Indias Debe observarse, sin embar- uniéndose a las subunidades de C1r y C1s del complejo. Mientras el C1q per
go, que la relativa efectividad de estos péptidos es tanto específica de tejido manece en la superficie del activador, el C1r y el C1s son liberados al fluido
como de especie. Se ha sugerido que el C3a es efectivo selectivamente sobre sanguineo en forma de dos complejos de Ciinh-Clr-Cls-Clmh (Ziccardi.
los eosinófilos localizados en los lugares alérgicos, mientras que el C5a tiene 1979). Recientemente, se propuso que el Clinh tiene la capacidad de separar
efecto en muchos otros tipos celulares (DiScipio. 1999). el complejo Clqr s entero de las inmunoglobulinas que tienen una baja afini-
Además de este papel como anafilotoxina. el C5a tiene otras muchas pro- dad por el Clq (Chen, 1998b) o de objetivos sensibilizados con dosis bajas de
piedades biológicas importantes. La unión del C5a a los neutrólilos origina un Ig G humana (Chen. 1998b). In vitro, el Clinh inactiva la manosa fijadora de
aumento de la adhesión, la agregación y la inducción de una respuesta oxi- lectina asociada a serín proteasas (MASP) (Matsushita. 1996). El Clinh tam-
dativa, y la liberación de enzimas lisosómicas. Además, el C5a es fuertemen- bién inhibe al factor Xlla y a la calicreína del sistema de contacto. Este tema
te quimiotáctico para los monocitos y los neutrófilos. induciendo la migración será tratado en la sección Cinmas y el sistema de generación de Cinmas. Inte-
de las células hacia la fuente de activación del complemento. De este modo, resantemente, el Clinh demostró interferir con la proliferación in vitro de los lin-
una reacción inflamatoria de activación del complemento local puede por tan- focitos T y con el desarrollo de linfocitos T citotóxicos bloqueando la degrada-
to inducir un aumento del flujo sanguíneo al tejido, la adherencia de los neu- ción de la (5-microlobulina a desLys" p\-microlobulina por los linfocitos T
?

trófilos al endotelio local, y la migración directa de los fagocitos a los lugares activados y por el C1r (Nissen. 1998). Sin embargo, la relevancia in vivo de
inflamatorios. Los neutrófilos agregados por el C5a pueden embolizar al pul- estos hallazgos no está aún clara. Se ha informado una proteina de 20 kDa
món, originando cambios en el intercambio gaseoso pulmonar e incluso la con actividad inhibitoria sobre la función C1. lamada factor J (Lopez-Trascasa.
muerte. Se cree que mucha de la inflamación de los pulmones causada por 1989). Se informó que inhibía la formación del complejo C1 (Lopez-Trascasa.
la formación del complejo inmune está mediada por el C5a (Ward, 1997). En 1989) y después actuaba sobre la vía alternativa inhibiendo la degradación del
un modelo experimental de sepsis en ratas, se ha demostrado recientemente C3 por el factor B (González- Rubio. 1994) La defensina, péptido-1 neulrofíli-
que el C5a puede bloquear las funciones bactericidas de los neulrófilos si se co humano (HNP-1 ). también puede inhibir al C1 en los lugares de inflamación.
produce en cantidades suficientes, sugiriendo un papel para la activación del Se demostró que se unía al C1q en el fluido sanguíneo y bloqueaba la activa-
complemento en los altos índices de mortalidad observados en la sepsis ción del complemento mediada por la via clásica (van den Berg. 1998).
(Czermak. 1999).
La actividad del C4b es regulada por el factor I (antes denominado inactiva-
Los efectos biológicos de las anafilotoxinas están mediados por los recep- dor del C3b'4b) (Fries. 1987). El factor I degrada la cadena a del C4b para
tores específicos expresados por los dilerentes tipos celulares. Estos recep- generar dos Iragmentos. el C4c y el C4d; el último fragmento permanece unido
tores se describen en la sección de los receptores del complemento. a la célula. Para la proteóhsis se necesita un cofactor. la proteína fijadora de C4
(C4BP). El C4BP es una proteina de 570 kDa que también puede unirse al C4b
unido a partículas y sanguíneo, y desplazar al C2a de la via clásica de la C3
Regulación de la activación del complemento
convertasa C4bza (Gilgli, 1979). Además, el C4BP circula en asociación con
Los graves efectos de la activación del complemento para inducir el daño aproximadamente el 60% de la proteina S, un cofactor dependiente de la vita-
tisular requieren mecanismos de control internos para: (1) limitar la inflama- mina K para la proteina C mediando la degradación de los factores de la coa-
ción diseminada cercana, (2) evitar una excesiva activación, y (3) proteger las gulación Va y Villa. Esta asociación inhibe la actividad del cofactor de la protei-
células huésped de la lesión inadvertida. Se ha implicado un potente sistema na S (Dahlbáck, 1986) y parece inhibir la activación del factor X a través de las
de regulación para controlar la activación del complemento en cualquier eta- interacciones del C4BP tanto con la proteína S como con el factor VIII (Koppel-
pa de la cascada de la activación. Asi existen proteínas sanguíneas o aso- man. 1995). Una proteína de 120 kDa con similitudes estructurales con el C2
ciadas a membrana que desarrollan una acción reguladora en la activación pero funcionalmente distinta del C2 fue aislada, y puede tener actividad regula-
del complemento (Tabla 38-2). dora sobre el sistema del complemento uniéndose al C4b (Hammer, 1989).

Tabla 38-2 Proteínas reguladoras del complemento

Proteínas Peso molecular (kDa) Objetivo Mecanismo de acción
Fases del fluido
Cl inhibidor 105 C1 Disocia el complejo C1 uniéndose al C1r y C1s
Factor H 150 C3b Colador para la inactivación del C3b por el (actor I
Proteína fijada a C4 550 C4 Cofactor para la inactivación del C4b por el factor I
Proteína S (vilronectina) 84 C5b-7 Inhibe la inserción del MAC en las membranas celulares
Clusterin 70 C5b-7 Inhibe la inserción del MAC en las membranas celulares
Factor J 20
Célula asociada C1. C3. B Inhibe la formación del complejo C1 inhibe la degradación
de C3 por el Bb
CR1 190" C3b. C4b Disociación de las C3/C5 convertasas cofactor par la
inactivación del C3b y el C4b por el factor I
DAF (CD55) 70 C3bBb. C4b?a Disociación de las convertasas C3/C5
MCP (CD46) 45-70 C3b (C4b) Cofactor para la inactivación del C3b por el factor I
CD59 (protectina) 18-20 C8, C9 Inhibición de la formación del MAC
HRF 65 C8, C9 Inhibición de la formación del MAC
•Isoterma más frecuente del CRI
CRU receplor del complemento tipo 1. DAF= factor acelerador de la degradación, MCP= proteina cofactor de membrana. HRF= tactor de restricción homologo
 CAPITULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Debido a su papel crucial en las tres vías de activación del complemento,
el C3 está bajo un control rígido. El C3b sanguíneo y el C3(H 0) son rápida-
? da por el factor I de iC3b en fragmentos pequeños (Mitomo. 1987).
mente inactivados por el factor I que degrada los tres péptidos unidos de la
cadena a' del C3b (Davis. 1982]. generando entonces una lorma inactiva de
la molécula, la iC3b. que es incapaz de atraer al C5 o al factor B. Esta degra-
dación mediada por el factor I requiere al tactor H como cofactor. El factor H
es una proteína de 150 kDa que se une al C3b y tienen actividad acelerado-
ra de la desintegración a través de la vía alternativa de la C3 convertasa ade-
más de su actividad de cofactor para la degradación del C3b mediada por el
factor I. Además de regular al C3b en el fluido sanguineo, el factor H se une
al C3b unido a la célula y dispara la degradación por el factor I. limitando asi
la activación por la vía clásica (Ollert. 1995). Una vez que el C3b es degra-
dado en iC3b. que permanece unido a la superficie del objetivo, puede ínter-
accionar con el receptor del complemento tipo 3 (CR3) presente en las célu-
las fagocíticas y promover la fagocitosis (véase después en Receptores del
complemento).
Hay un número de inhibidores sanguíneos de los componentes terminales
del complemento que previenen la inserción del complejo de ataque a la
membrana en las membranas celulares. La proteína S [S-protein). también
llamada vitronectina, se une al complejo C5b-7. previniendo así su inserción
en la membrana celular (Podack. 1977) e inhibiendo la polimerización del C9
(Johnson, 1994). Recientemente, se ha publicado que la proteína S se une
al C5b y al C8 en el complejo C5b-9 (Su, 1996) y se une al receptor de la
cabeza globular del Clq (Ljm, 1996). Aunque el papel exacto de la proteina
S en la regulación de la activación del complemento in vivo es incierta. Pea-
ke y col. mostraron que la proteina S forma un complejo con el sC5b-9 cuan-
do el complemento es activado en conejos y que este complejo todavía tie-
ne la capacidad de bloquear la lisis mediada por el C9 de los eritrocitos de
oveja sensibilizados llevando los componentes 1 al 7 del complemento (Pea-
ke. 1996). Clusterin (también llamado Sp-40.40 o apolipoproteína J) es otro
inhibidor sanguineo de los componentes finales del complemento. Como la
vitronectina. clusterin previene la inserción del complejo C5b-7 en la mem-
brana celular (Choi, 1989) y regula el complejo de ataque a la membrana en
los niveles C5b-7 y C9 (Berge. 1997). Todavía se desconoce el papel in vivo
del clusterin. aunque recientemente se publicó que el clusterin se deposita
en las lesiones cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alzheimer
iVerbeek. 1998). También, se ha publicado recientemente una asociación
significativa entre los niveles bajos de clusterin y algunos signos clínicos del
lupus eritematoso sistémico (LES), sugiriendo un control insuficiente de la
inflamación mediada por anticuerpos (Newkirk, 1999).
Proteínas reguladoras asociadas a las células
Además de estar regulado en la lase liquida, la activación del complemento
también está regulada en la superficie de muchos tipos celulares para limitar la
lesión inadvetida a las células huésped. Algunas de estas proteínas no solo se
unen a las proteínas del complemento sino que actúan como receptores. Una
de estas proteínas es el receptor del complemento tipo 1 (CR1). La estructura
del CR1 se describe con más detalle en la sección Receptores del comple-
mento. La función del CR1 es unirse al C4b y C3b activado y servir como cofac-
tor para la degradación mediada por el (actor I de estos componentes en sus
productos de degradación inactivos. Además de servir como colador para la
degradación mediada por el factor I del C3b en iC3b. el CR1 también promue-
ve la degradación posterior del iC3b por el factor I en C3dg. El C3dg puede ser
degradado posteriormente en C3d por varias enzimas como la elastasa, la trip-
sina y la plasmina (Davis, 1984; Ross, 1982). El CR1 también tiene una activi-
dad aceleradora de la desintegración hacia las convertasas C3 y C5 de la vía
alternativa y la clásica de la activación del complemento. Al unirse a C4b o C3b.
el CR1 también desplaza al C2a (vía clásica) o al Bb (vía alternativa), acele-
rando entonces la eliminación de las C3 convertasas. Interesantemente, el CR1
promueve la eliminación acelerada de la C3 convertasa unida a la superficie de
la vía alternativa mucho más eficientemente que de la vía clásica (Ross. 1982;
Nicholson-Weller, 1982). Debido a que se expresa en los eritrocitos, más que
sobre otros tipos celulares, el CR1 ayuda al trasporte de los complejos inmunes
que llevan el C3b a los lugares de degradación de las células de Kupffer del
hígado (Cornacoff, 1988). Parece que otro receptor del complemento, el CR2,
899
también tiene la capacidad de servir como colador para la degradación media-
El control del C4b y C3b depositado en la membrana celular se lleva aca-
bo posteriormente por la proteina cofadora de membrana íMCP, CD46). Esta
proteína es expresada en casi todas las células, con la importante excepción
de los eritrocitos. Sirve como cofactor para la degradación del C4b y el C3b
en C4c y C4d. e iC3b. respedivamente. mediada por el factor I (Seya. 1986.
1989) pero es incapaz de promover la posterior degradación del iC3b Se
informó que el MCP protege a la célula de la activación de la vía alternativa
más eficazmente que de la activación de la vía clásica (Kojima, 1993). Se ha
sugerido que esta proteína de 50 a 58 kDa juega un papel significativo en pre-
venir el daño celular mediado por el complemento en aquellas células en las
que se expresa (Liszweski, 1992). A diferencia del DAF. no protege a las célu-
las vecinas (viúeintra).
Otra proteina asociada a la membrana celular que controla la activación del
complemento a nivel de las C3 y C5 convertasas es el tactor acelerador de la
eliminación (DAF. CD55). El DAF es expresado por todas las células de la cir-
culación, las células endoteliales y un número de células epiteliales iMorgan.
1994b). Esta proteína de 70 kDa lunciona. como su nombre implica, acele-
rando la eliminación de las C3 y C5 convertasas tanto de la via clásica como
de la alternativa. Interesantemente, tiene una mejor capacidad de afectar a la
C3 convertasa de la vía clásica que a su contrapartida de la vía alternativa
(Nicholson-Weller. 1982). El DAF media la disociación del C2a y el Bb de las
C3 convertasas (Fujita. 1987). a diferencia del factor H y CR1. que tienen la
capacidad de bloquear la unión de C2 a C4b o del factor B a C3b. El DAF está
unido a la membrana celular por un enlace glicosil fosfatidilinositol más que
por un dominio hidrofóbico transmembrana, que ofrece a la molécula una gran
mobilidad y presumiblemente una mejor eficacia como inhibidor del comple-
mento (Davitz. 1987). Notablemente, el DAF no tiene actividad cofadora para
la degradación del C3b y C4b mediada por el fador I.
El control de los componentes finales del complemento en la superficie
celular se lleva a cabo por dos proteínas unidas al glicosil fosfatidilinositol. lla-
madas factores de restricción homólogos (HRF) o proteina fijadora de C8 y
CD59 (también llamado proleclina. HRF-20. inhibidor de membrana de la lisis
reactiva y P-18). El HRF es una proteina de 65 kDa expresada en los eritro
citos. las plaquetas, los linfocitos T, los linfocitos B. los neulrófilos y los mono-
citos (Morgan. 1994b). El HRF funciona uniéndose al C8. inhibiendo la poli-
merización del C9 (Morgan, 1994b). Otra proteína que inhibe el complejo de
ataque a la membrana es el CD59, El CD59 es una proteína de 20 kDa que
se encuentra en una amplia variedad de células incluyendo todas las células
circulantes, las células endoteliales, las células epiteliales, los espermatozoi-
des, los podocitos glomerulares. numerosas líneas celulares (Morgan. 1994b)
e incluso las células del cerebro (Morgan. 1996). Se demostró que se unía
tanto a la cadena |i del C8 como al domino b de la del C9 (Chang. 1994). Inhi-
be la formación del MAC sobre las células huésped y actúa de un modo intrín-
seco, esto es, proteger a la célula sobre la que se expresa. El DAF, HRF y
CD59 están ausentes en las células de los pacientes con hemoglobinuria
paroxística nocturna (HPN). debido a la unión de su glicosil fosfatidilinositol a
la membrana celular (Volanakis. 1998).
Receptores del complemento
Los receptores que se unen a los componentes adivados del complemento
han sido descritos en vanos tipos celulares Estos receptores controlan los efec-
tos biológicos de los péptidos de activación del complemento y están unidos a
muchas otras funciones celulares (Tabla 38-3). Esto será descrito para cada
receptor del complemento. Los receptores del complemento que han sido mejor
estudiados son aquellos que se unen a los fragmentos de degradación del C3.
El receptor del complemento tipo 1 (CR1. CD35, receptor de C3b'C4b) es
una glicoproteína de cadena simple de 190 kDa (isoforma más frecuente). En
humanos, se expresa en eritrocitos, fagocitos mononucleares. eosinófilos. lin-
focitos B, un subgrupo de linfocitos T, podocitos glomerulares, células dendrí-
ticas foliculares (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996). Este receptor del
complemento se une tanto al C3b como al C4b. y. en menor medida, al iC3b.
Se informó recientemente que el CR1 se unía también al Clq (Klickstein.
1997). Existen cuatro formas alélicas diferentes del CRl que difieren en tama-
 900 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 38-3 Receptores celulares para los f r a g m e n t o s proteicos d e l c o m p l e m e n t o
Receptor Peso molecular (kDa) Ligando
CR1 190 (isoforma más frecuente) C3b, C4b. iC3b
CR2 140 C3d. C3dg, iC3b
CR3 165 (cadena u) iC3b C3d. C3b
95 (cadena (5)
CR4 150 (cadena a) iC3b. C3b
95 (cadena |5)
C1qRp' 126 C1q. MBL. SP-A
C3aR 48 C3a
C5aR 43 C5a C5a desArg
' También han sido descritos otros receptores del Ctq.
CR1 = receptor del complemento tipo 1; CR2 = receptor del complemento tipo 2, CR3 = receptor del complemento tipo3 CR4 = receptor del complemento Upo 4;
C1qRp = receptor para la región del colágeno del Ctq; C3aR = receptor de C3a; C5aR = receptor de C5a; MBL = mañosa fijadora de lectma: SP-A = proteina sur-
factante A; C5a desArg = pérdida del residuo argiruna terminal del C5a tras la inactivación por la carboxipeptidasa-N.
ño y número de lugares de unión. La forma alélica más frecuente (llamada
alotipo A o F) está formada por 30 unidades repetidas de 60 a 70 aminoáci-
dos, la mayoría de las cuales están altamente conservadas. Estas unidades
repetidas son llamadas repeticiones consensuadas cortas (SCR). De estos 30
SCR, 28 están agrupados en cuatro parejas de repetición de siete SCR cada
uno. Esas parejas repetidas se denominan repeticiones homologas largas
(LHR). Como se señaló en la sección Regulación de la activación del com-
plemento, el CR1 sirve como cofactor para la degradación del C3b mediada
por el factor I, el iC3b y el C4b y tiene actividad aceleradora de la eliminación
tanto sobre la via de la C3 y C5 convertasa clásica y alternativa. Un papel
fisiológico más importante del CR1 está relacionado con la fagocitosis de las
partículas envueltas por el complemento (partículas opsonizadas). El CR1
puede aumentar la unión de las partículas envueltas con Ig G y C3b o iC3b a
los monocitos o los neutrófilos, aumentando entonces la eficacia de la fagoci-
tosis mediada por el receptor Ig G-Fc (Wright. 1985; Sengelov. 1995). El CR1
también puede disparar la fagocitosis de los objetivos envueltos por el C3b en
ausencia de IgG en los macrólagos activados por varios estimuladores como
la libronectma. el acetato forfol mirislato. el interferón-y y la anafilotoxina C5a.
El CR1 sobre los eritrocitos regula la función C3b sirviendo como cofactor
para la degradación del C3b mediada por el factor I y aumentando la elimina-
ción de C3 convertasas. Se cree que el CR1 eritrocitario tiene un papel impor-
tante en secuestrar el C3b y el complejo inmune relacionado con iC3b. sacán-
dolos del plasma y facilitando su transferencia a los lugares de degradación
en el higado y en el bazo (Birmingham. 1995). Recientemente se propuso que
la captación dependiente del CR1 de los complejos inmunes por los eritroci-
tos de la circulación puede servir como mecanismo de inhibición de la activa-
ción excesiva de las células fagocíticas o las células B (Nielsen, 1997). El
CR1 también es expresado en las células B humanas y en las células den-
dríticas foliculares del bazo y puede tener un efecto inmunorregulador en
estas células. Este tema se analiza con más detalle después, en la sección
Complemento e inmunidad adquirida.
Un receptor para el fragmento C3d del C3 se encuentra en las células
humanas |i las lineas celulares B, las células dendriticas foliculares, algunas
células T periféricas, algunas lineas celulares T, timocitos (Ahearn. 1998) y
astrocitos (Morgan, 1996), y es denominado CR2 (CD21). El CR2 es una gli-
coproteina transmembrana tipo I, de 140 kDa, que sirve como receptor para
el C3d. el C3dg, y se une débilmente al iC3b. El CR2 tiene la capacidad de
servir como cofactor para la degradación de iC3b unido a los objetivos media-
da por el factor I (Mitomo. 1987). El CR2 también es el receptor o sitio de
unión a través del cual el virus de Epstein-Barr entra en las células B, en la
sangre, modalidad independiente del complemento, para causar la mononu-
cleosis infecciosa (Fingeroth. 1984). Se cree que la principal función del CR2
es la regulación de la respuesta inmune de las células B ante el antigeno
(Carroll, 1998b). Este tema se discute con más detalle después, en la sección
Complemento e inmunidad adquirida.
Un tercer receptor del complemento, el CR3 (también denominado Mac-1,
Cd11b'CDi8) es un miembro de la familia de moléculas de sdhesión de la |3 2
Papel fisiológico
Fagocitosis, aclaramiento del complejo inmune
Activación de las células B
Fagocitosis, adhesión celular
Adhesión celular
Fagocitosis
Quimiotaxis, degranulación de los mastocitos del suero,
aumento de la permeabilidad vascular
Quimiotaxis. degranulación de los mastocitos del suero.
aumento de la permeabilidad vascular
integnna leucocítica. Está formada por dos cadenas polipeptidicas con pesos
moleculares de 165 kDa (cadena a) y de 95 kDa (cadena |i) (Ahearn, 1998).
Otros dos miembros de la familia de moléculas de adhesión de la |i, integri-
na (LFA-1 y CR4) comparten la misma cadena p* con el CR3. El CR3 se
expresa en los fagocitos mononucleares, granulocitos y células asesinas
naturales (NK) (Ahearn. 1998), y en las células microgliales (Morgan. 1996).
El CR3 se une al iC3b, y al C3b y el C3d pero con menor afinidad (Brown.
1991). En las células fagocíticas, el CR3 dispara el proceso fagocitico de un
modo paralelo al CR1. El CR3 aumenta la ingesta de partículas recubiertas
con Ig G y C3 (Sengelov, 1995; Gaither, 1987). Otro papel importante del CR3
es la adhesión de los monocitos y los neutrófilos a las células endoteliales a
través de la interacción con su contraligando, molécula de adhesión intrace-
lular tipo 1 (ICAM-1). Esto permite la acumulación de los fagocitos en los luga-
res de daño tisular donde las células endoteliales son activadas.
El receptor del complemento tipo 4 (CR4. CD11c/CD18) es una glicoproteí-
na que comparte características con el CR3. También es un miembro de la
familia de moléculas de adhesión de las miegrinas con una única cadena a de
150 kDa. Se expresa en las células mieloides. células dendriticas. células NK.
células B activadas, algunas células T activadas, plaquetas (Ahearn. 1998). y
células microgliales (Morgan, 1996). El CR4 se une al iC3b. y al C3b en menor
medida (Brown, 1991). Sin embargo, el papel exacto del CR4 en términos de
activación del complemento es desconocido y, como esta glicoproteína es una
molécula de adhesión, puede servir para ayudar" a la adhesión de los neutró-
filos al endotelio durante el proceso inflamatorio (Sengelov, 1995).
Se han descrito varias moléculas de superficie celular con actividad recep-
tora para el Clq. Son receptores (ClqR.. C1qRJ, modificadores de la res-
puesta (gC1qR. proteoglicano condroitin sulfato derivado de las células B). y
proteínas de unión (CR1, cClqR) (Tenner, 1998). El CiqR es una glicopro-
3
teína de 126 kDa expresada en las células de origen mieloide. en las células
endoteliales, en las plaquetas y en las células microgliales (Nepomucenc,
1998). Se ha mostrado que se une a la región tipo colágeno del C1q (ten-
ner,1998) y a las colectinas MBL y SP-A (Hansen. 1998). Se demostró que
este receptor aumenta la fagocitosis de partículas subóptimamente recubier-
tas con complemento o Ig G mediada por el CR1 y por el receptor Fe. Un
segundo receptor, todavía pobremente caracterizado, es denominado
C1qR , se une al C1q e inicia la generación de radicales tóxicos del oxígeno
o2
por los neutrófilos, los eosinófilos y las células del músculo liso vascular
(Tenner. 1998). El receptor para las cabezas globulares del Clq (gCiqR) es
una proteina de 33 kDa expresada en las células B, en los fagocitos mono-
nucleares, en los neutrófilos, en las plaquetas y en las células endoteliales.
Se ha informado que induce la quimiotaxis de neutrófilos humanos (Nepomu-
ceno, 1998). También se ha informado que otra molécula de superficie celu-
lar se une a la región tipo colágeno del C1q (cClqR). Esta proteína de 56 kDa
se expresa en una variedad de células, se une la Clq, a la MBL y a la SP-A
(Hansen, 1998) y tiene homología con la calreticulma. Puede inducir la fago-
citosis de los objetivos recubiertos con Clq asi como mediar la citotoxicidad,
la producción de anticuerpos y la secreción de citocinas. El papel del CR1 una
 CAPITUIO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN 901
vez unido al C1q es totalmente desconocido. Es importante realzar que el zados por los hepatocitos o por las células extrahepálicas a menudo requiere
papel exacto que juegan in vivo estas proteínas unidas al C1 q asociadas a las un estímulo generado en las respuestas inflamatorias como la interleucina-lu,
células sigue estando poco claro. la interleucma-6 o el interferón-y. En oirás obras se puede ver una mejor des-
Como se trató anteriormente en la sección Anafilotoxinas, los fragmentos pep- cripción de la regulación de la síntesis de las proteínas del complemento por las
tídícos pequeños liberados tras la degradación proteolitica del C4. C3 y C5 tie- diferentes células (Collen. 1998) Interesantemente los datos del higado y la
nen profundos efectos en la respuesta inflamatoria. Esto incluye el aumento de médula ósea humana (Naughton. 1996) y el trasplante renal (Tang, 1999)
la permeabilidad vascular, la degranulación de los mastocitos y la inducción de demostraron que. aunque el higado es el lugar más importante de la síntesis del
la quimiotaxis. El receptor del C3a humano (C3aR) ha sido clonado reciente- complemento, los lugares extrahepáticos pueden contribuir a ios niveles de los
mente. Es una proteina transmembrana unida a la proteína G. de cadena única componentes del complemento en el plasma.
de 48 kDa (Ember, 1998). El C3aR se expresa en las plaquetas del conejilo de
Indias, en los mastocitos de rata, en los macrófagos alveolares humanos, en los
neutrófilos. en los basófilos y en los eosinófilos (Ember, 1998). Recientemente, Genética del complemento
se ha demostrado que se expresan en las células B de las amígdalas humanas
(Fisher, 1997) y en varias células del cerebro humano inflamado (Gasque. 1998). Muchos de los genes que codifican las proteínas, los receptores y las molé-
Se ha informado que el C3a unido a su receptor origina quimiotaxis eosinofilica: c u las reguladoras del complemento han sido clonados y se les ha asignado
la degranulación de los eosinófilos. los mastocitos y las plaquetas: la adheson una localización cromosómica (Tabla 38-1). Interesantemente, existe una
de los eosinófilos y las plaquetas; y la supresión de las funciones de las célu- unión para un número de genes que codifican las moléculas relacionadas con
las B amigdalares incluyendo la producción de inmunoglobulinas. Debido a las el complemento. Estos grupos de unión incluyen los genes del MHC clase III
similitudes estructurales entre el C3 y el C4, se pensó que el C4a era capaz de (C2. factor B y C4), los genes de los reguladores de la activación del comple-
interaccionar con el C3aR. Sin embargo, parece que no es así y el C4a humanomento (proteína fijadora de C4. CR1. CR2, DAF, MCP y factor H). y los genes
no puede interaccionar con el C3aR humano (Ames. 1997). aunque parece que de las proteínas del complejo de ataque a la membrana (C6. C7 y C9) (Schnei-
interacciona con el C3aR del conejilo de Indias (Lienenklaus. 1998). der, 1999). Las moléculas de cada uno de estos tres grupos muestran homo
logia estructural, lo que sugiriere que las proteínas del complemento pueden
Un receptor para la analilotoxma C5a (C5aR) se expresa en los neutrófilos. derivar de una duplicación genética de un número limitado de genes ancestra-
los monocitos, los basófilos, los eosinófilos, las plaquetas, los mastocitos, las les. Es de interés que existen dos genes para el C4. Originan dos isolipos de
células del parénquima hepático, las células del músculo liso vascular del pul- C4 lamados C4A y C4B, los cuales son producidos con frecuencia (O'Neill.
món, las células endoteliales vasculares del pulmón y umbilicales, las células 1978a: Awdeh, 1980). Estos dos productos génicos difieren funcionaimente y
epiteliales bronquiales y alveolares, los astrocitos, las células microgliales tienen diferente eficacia hemolitica. Una vez expuestos al grupo tíoléster de la
(Ember. 1998) y las células T humanas (Nataf. 1999). El C5aR es una proteí- molécula. C4A forma un enlace amida con un aceptor de la molécula en su
na transmembrana asociada la proteina G de 43 kDa El C5a unido al C5aR microambiente. mientras que la forma C4B forma un enlace áster. Además, se
induce una amplia variedad de efectos dependiendo del tipo de célula diana. descubrió que el C4A se une al CR1 con mayor afinidad que el C4B (Reily.
Estos incluyen las quimiotaxis de neutrófilos. eosinófilos. basófilos y fagocitos 1997). También todas las proteínas relacionadas con el complemento mues-
mononucleares; la degranulación de los mastocitos de las serosas; la pro- tran polimorfismo (es decir, existen múltiples alelos con variables frecuencias
ducción de radicales del oxigeno: facilitar la adhesión celular; y la producción en humanos). El componente más polimórfico del complemento es el C4, con
de leucotrienos y prostaglandinas en los neutrófilos y los eosinófilos. En más de 35 alelos identificados (Schneider. 1997). La degradación de los Itag-
varios estudios el C5a también demostró inducir la producción de proteínas mentos del C4A y C4B y su unión a los eritrocitos origina a los antigenos de
de fase aguda, citocinas y anticuerpos (Ember, 1998). grupo sanguíneo Rodgerds y Chido. respectivamente (O'Neill. 1978b). Las
Los receptores de los factores H y B se han descrito en muchos tipos de variaciones alélicas del factor acelerador de la degradación (DAF) originan el
leucocitos y están descritos en otras obras (Fríes. 1987). Sin embargo, el sig- sistema de grupo sanguíneo Cromer con el fenotipo Inab que carece de DAF.
nificado fisiológico de estos receptores todavía no está claro. Las mutaciones puntuales, las inserciones o las deleciones de los ácidos
nucleicos normalmente van unidas con defectos de las proteínas del comple-
mento (Schneider, 1997). Como se discute después en la sección Defectos
Biosintesis del complemento genéticos del complemento, estas son normalmente poco frecuentes entre la
Se calcula que el 90% de los componentes del complemento del plasma sonpoblación. El polimorfismo de las proteínas del complemento se evalúa tanto
sintetizados en el hígado y son proteínas de fase aguda (es decir, su síntesis por los análisis fenotipicos como por los genotipicos. Los detales de estos
por el higado aumenta en la respuesta inflamatoria para aumentar los niveles métodos no serán discutidos en este capítulo y el lector es remitido al Capitu-
del plasma). El hepatocito produce la gran mayoría de los componentes del lo 41 y otros capítulos sobre el tema (Schneider. 1997; Mauff. 1997).
complemento, con la excepción del C1q. el factor D, la properdina y el C7 (Mor-
gan, 1997a). El C1q parece que es sintetizado por las células epiteliales, los
monocitos 'macrófagos y los fibroblastos. El principal productor de factor D es Complemento e inmunidad adquirida
el adiposito. La properdina es sintetizada mayontariamente por los monocitos y
los macrófagos ocurriendo algo de la síntesis en los linfocitos y en los granulo- Está quedando claro que el sistema del complemento juega un papel
otos. La mayoría del C7 del plasma también parece originarse por los monoci- importante en el establecimiento de las respuestas inmunes adquiridas. La
tos y los macrófagos. aunque los leucocitos polimorfonucleares parece que depresión de las respuestas de anticuerpos a la estimulación anligénica se
almacenan C7. Es de interés que muchos otros tipos celulares han sido descri- demostró en animales deplecionados transitoriamente de C3 (Pepys, 1974),
tos como sintetizadores de los componentes del complemento in vitro. Se ha en animales con defectos genéticos en el C2. C4 o C3 (Bötger, 1985; Ochs,
publicado una exhaustiva lista de células que producen componentes del com- 1983; O'Neil, 1988), y en pacientes con defectos genéticos en C2, C4, C3 o
plemento (Morgan, 1997a). Brevemente, se ha informado que los linfocitos B y CR3 (Ochs. 1986). El desarrollo reciente de ratones knockout sin C4, C3. o
T, los monocitos, las plaquetas, los neutrófilos. los macrófagos. los fibroblastos, receptores del complemento tipos 1 y 2 (CR1 y CR2 son productos de la divi-
las células endoteliales. las células epiteliales, los queratinootos. los mioblas- sión de un mismo gen en el ratón en oposición a los humanos) ha permitido
tos. las células del músculo liso, los adipocitos y las células de la sinovial. cere- un mejor conocimiento del papel del complemento en las respuestas de anti-
bro y tracto genital sintetizan uno o más componentes del complemento. Inte- cuerpos al antigeno. Este efecto ha sido revisado recientemente (Carroll.
resantemente, los monocitos. los macrófagos. las células del tejido sinovial y los 1998a: 1998b: Fearon, 1998). El complemento puede influir en la respuesta
astrocitos del cerebro tienen la capacidad de sintetizar todos los componentes de anticuerpos al antígeno de muchas maneras. Primero, el CR 1 y el CR2 son
de las vías clásica y alternativa. Esto puede tener importantes implicaciones en expresados en las células B y en las células dendriticas foliculares (que están
la inflamación especifica de tejido, donde debe estar presente un mecanismo presentes en el bazo). EL CR2 está presente en la superticie de las células B
localizado de defensa del huésped para eliminar las partículas extrañas eficaz- en asociación con el CD19 y el TAPA-1. Una vez que se ha ligado el receptor
mente. La producción de componentes del complemento normalmente sinteti- de la célula B para el antigeno y para el CR2 (como ocurrirá cuando el antí-
 902 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

geno eslé unido al C3d), disminuye drásticamente el umbral para la activación

de la célula B. También, el complemento ayuda en el atrapamiento de los
complejos inmunes por las células dendriticas foliculares en el bazo. Esto
facilita la formación de centros germinales donde las células B adquieren el
fenotipo memoria. Por lo tanto, la pérdida de uno de los componentes inicia-
les de la via clásica de la activación del complemento o la pérdida del CR1 y/o
el CR2 conduce a una respuesta inmune inapropiada al antígeno y, en algu-
nos casos, puede conducir a la incapacidad para producir una respuesta de
anticuerpos secundaria. El complemento puede jugar un papel en la genera-
ción de células B CD5 positivas, las cuales producen anticuerpos "naturales"
(Carroll. 1998a). La activación adecuada de las células B en respuesta a anti-
genos parece depender, en algunos casos, de la activación de los anticuer-
pos "naturales" y el complemento (Boes, 1998: Lutz, 1999). Interesantemen-
te, el complemento parece importante en el mantenimiento de la tolerancia de
las células B a los antígenos propios. Esto parece depender del componente
del complemento C4, y del CR1 y del CR2 (Prodeus, 1998). Finalmente, el
complemento (especialmente el C3) ayuda a la generación de una respuesta
inmune adquirida al antígeno a través de las células presentadoras de antí-
geno (APCs). La presencia de productos de degradación de C3 sobre los antí-
genos aumenta la captación del anligeno por las APCs (células B y otras
APCs profesionales que expresan CR1 y/o CR2), aumentando por lo tanto la
eficacia de la presenlación antígénica a las células T con la consiguiente res-
puesta mediada por las células T (Boackle. 1998: Kerekes. 1998).
DEFICIENCIAS GENÉTICAS DEL COMPLEMENTO
Los pacientes con deficiencias del complemento genéticamente controlados
son muy raros pero son interesantes porque nos permiten determinar el papel
de los componentes del complemento en distintos fenómenos biológicos y en
diferentes estados de enfermedad. En general, la ausencia de un componen-
te sigue los principios de la genética mendeliana simple y es heredada como
un rasgo autosómico recesivo. Por ello, los pacientes heterocígóticos tienden
a tener la mitad de los niveles normales o menos, y los pacientes con defec-
tos homocigóticos tienen poca o indelectable actividad del complemento. El
gen de la properdina está en el cromosoma X. Se conocen deficiencias para
todas las proteínas ligadas a la activación del complemento (Tabla 38-4). Con
el descubrimiento reciente de la vía de la MBL de la activación del comple-
mento llegó el sorprendente hallazgo de que el déficit en suero de MBL es bas-
tante frecuente. Se calcula que aproximadamente el 5% de la población tiene
una de las tres mutaciones genéticas reconocidas que conducen a la deficien-
cia de MBL (Sumiya. 1997). Se ha descrito una correlación entre la deficiencia
de MBL y las infecciones del tracto respiratorio superior, especialmente entre
los 6 y 18 meses de edad, demostrando la importancia de la vía de la MBLe-
citina en la primera infancia (Turner. 1996). Un estudio reciente sugiere que la
variación de genes de la MBL puede estar asociada con al menos un tercio de
las inlecciones meningocócicas en la infancia (Hibberd. 1999). Se ha informa-

-• ?
Tabla 38-4 Deficiencias h e r e d a d a s d e l c o m p l e m e n t o y d e las proteínas relacionadas c o n el c o m p l e m e n t o
Proteina Patrón de herencia Principal correlación clinica'

Común a todas las vías

C3 Autosómica recesiva Infecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis
Vía clásica
C1q Autosómica recesiva Glomerulonefritis. LES
C1r Autosómica recesiva Glomerulonefritis. LES
C1S Autosómica recesiva Glomerulonefritis. LES
C4> Autosómica recesiva LES
C2t Autosómica recesiva LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis
Vía alternativa
Factor B Autosómica recesiva Infecciones por Neisseria meningitidis
Factor D Autosómica recesiva Infecciones piógenas recurrentes
Properdina Ligada al X Infecciones piógenas recurrentes, meningococcemia fulminante
Via de la MBLectina
MBL Autosómica dominante Infecciones recurrentes
Complejo de ataque a la membrana
C5 Autosómica recesiva Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria. LES
C6 Autosómica recesiva Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria
C7 Autosómica recesiva Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad
de Raynaud
C8 (cadenas ß y a-y) Autosómica recesiva Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria
C9 Autosómica recesiva Nada
Proleinas de control del fluido sanguineo
C1inh Autosómica dominante o adquirida Angioedema hereditario, enfermedades autoinmunes'
C4bp Autosómica recesiva Angioedema, síndrome semejante al Behcet
Factor I Autosómica recesiva Inlecciones piógenas recurrentes
Factor H Autosómica recesiva Inlecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis
Proteínas unidas a células
1
CR1 Autosómica recesiva ' Asociación entre la expresión baja en eritrocitos y el LES
CR3 Autosómica recesiva" Infecciones piógenas recurrentes, leucocitosis
DAF/CD59/HRF Adquirida Hemoglobinuria paroxística nocturna
* Véase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y componentes del complejo de ataque a la membrana, están clínicamente bien.
Un número sustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad autoinmune. Las deficiencias del Ct al C9 están asociadas con un CH50
de O. Las deficiencias de Ct. C4 y C2 están asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen prep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 eslán asociadas
con una ausencia o una baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 está asociada con la ausencia o disminución de la actividad quimiotáctica en
suero y puede estar asociada con la ausencia de respuesta leucocítica a la infección.
i La deficiencia en cualquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal deficiencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales
deficiencias tienen una incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos heterozigóticos para la deficiencia de C2 también tienen un
aumento de la incidencia de enleimedades autoinmunes.
1
Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas silentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida disluncional de la proteina Ct inhibi-
dor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1 esta normal o disminuido, el nivel de C3 está siempre normal, y el nivel de C4 eslá disminuido. En la enfermedad adqui-
rida, los niveles de Cl y C4 están disminuidos, el nivel del antigénico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funcional del Cl inhibidor esta muy disminuido.
La homocigosis para la expresión numérica ba|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar asociada con el LES También puedo
detectarse un defecto adquirido en el número de CRI
Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padres de la mayoría de los niños con delicit de CR3.
LES = lupus eritemaloso sislémico. LED = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de mañosa
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN 903
do que las infusiones de MBL purificada corrigen el defecto y la susceptibilidad Es importante reconocer que la medición de los niveles del complemento
a las infecciones en los niños con deficiencias del MBL (Valdimarsson, 1998). sérico representa los niveles estáticos de proteínas que se recambian rápi-
Además, se ha sugerido que la deficiencia de MBL conduce a enfermedades damente. Incluso en los individuos normales, el Índice fraccional catabólico
autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (Turner. 1996) y que es un de la mayoría de los componentes que han sido medidos está alrededor del
factor de riesgo para el aborto recurrente (Christiansen. 1999). 2% por hora. Muchas de estas proteínas se comportan como reactantes de
La deficiencia en cualquiera de los componentes de la cascada del com- fase aguda, y sus niveles en suero pueden aumentar drásticamente en los
plemento tiene alguna asociación con la susceptibilidad a infecciones (Figue- estados inflamatorios. Sus índices de catabolismo pueden aumentar en
roa. 1991; Densen. 1998). Debido al papel central que el C3 tiene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminución del nivel
nización, la deficiencia de C3. de otros componentes de la vía alternativa, o del complemento puede avalar la sospecha de que el sistema del comple-
de las moléculas reguladoras como los factores H e I está asociada con un mento participa en el daño tisular, pero no lo prueba. El hallazgo de un nivel
aumento de la incidencia de infecciones. Interesantemente, las deficiencias normal de complemento en el suero no excluye la participación del comple-
de los componentes del complejo de ataque a la membrana (C5-C9) están mento en el daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con cirrosis biliar tienen
altamente asociadas con un aumento de la incidencia de infecciones por un aumento del Índice catabólico de C3, y se ha sugerido que el C3 puede
Neisseria meningitidis, sugiriendo la importancia de la lisis mediada por el jugar un papel en el desarrollo de esta enfermedad. No obstante, el nivel de
complemento en el control del meningococo La vacunación empleando un C3 en el suero de los pacientes con cirrosis biliar está casi siempre elevado.
polisacárido capsular multivalente para Neisseria meningitidis demostró ofre- En este caso, el aumento de la síntesis encubre el catabolismo aumentado.
cer alguna protección frente a la infección menmgocócica en los pacientes También debe reconocerse que la función del complemento en los diversos
con deficiencia del complemento (Fijen. 1998). compartimentos del cuerpo puede ser diferente. La actividad del comple-
Otra característica de la deficiencia del complemento, especialmente en los mento en la sangre de pacientes con artritis reumatoide seroposítiva puede
componentes iniciales de la via clásica (C1. C4, C2). es la asociación con ser normal o elevada; sin embargo, la actividad del complemento del liquido
enfermedades autoinmunes como el LES. Ya que el complemento es impor- sinovial puede eslar severamente disminuida.
tante en el aclaramiento de los complejos inmunes de la circulación, puede ser Muchos investigadores han intentado identificar qué vía de activación del
que la deficiencia de los componentes iniciales del complemento conduzca a complemento predomina en la mediación del daño tisular o en los niveles dis-
una degradación inadecuada de los complejos inmunes con su acumulación minuidos del complemento en una y otra enfermedad estableciendo el" perfil
en los tejidos como el riñon. Recientes datos experimentales que emplean del complemento". La aproximación más simple a este problema examina los
ratones transgénicos sugieren que la autommumdad asociada con la deficien- niveles de varios componentes y da por hecho que los niveles disminuidos de
cia de Clq origina un aclaramiento inadecuado de las células apopléticas que. un complemento dado de una de las vias de activación del componente es
a su vez. conduce al desarrollo de anticuerpos autorreactivos (Bofto. 1998). más frecuente que ocurra cuando la vía está activada. Por lo tanto, si un
Como se discutió previamente en la sección Complemento e inmunidad adqui- paciente tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles normales de factor B,
rida, la deficiencia del complemento (especialmente de C4 o CR1 CR2) tam- seguramente estará implicada la vía clásica. Si un paciente tiene niveles dis-
bién puede alterar el mecanismo por el que las células B se hacen tolerantes minuidos de C3, factor B y properdina, y niveles normales de C4, probable-
a los antígenos propios, conduciendo por ello a una autoinmunidad (Prodeus, mente estara activada la vía alternativa. De esta manera, la determinación de
1998). Existen deficiencias en las moléculas reguladoras del complemento los niveles de un número limitado de componentes puede proporcionar
unidas a la membrana. La deficiencia de CR3 origina severas infecciones pió- mucha información. Exceptuando el caso de alteraciones conlroladas genéti-
genas y defectos en la adhesión leucocitana (Fríes. 1986; Morgan. 1991). La camente del complemento, uno nunca necesita conocer los niveles de todos
deficiencia en la capacidad para generar el enlace glicosil fosfatidilinositol que los componentes excepto para objetivos de investigación.
une algunas proteínas de control del complemento a la membrana celular ori- Un importante avance en este área es el empleo de ensayos de enzimas
gina HPN. Los pacientes con tal enfermedad no tienen DAF. CD59 y HRF en fijadoras inmunoabsorbentes (ELISAj para detectar los complejos estables
la superficie de sus células y sufren una hemolisis intravascular crónica, trom- formados en el suero durante la activación del complemento. Estos ensayos
bocilopenia y disminución de la hematopoyesis (Jarva, 1999). La deficiencia son muy sensibles y pueden demostrar rápidamente que vía del complemen-
del C1 inhibidor origina el angioedema hereditario, una enfermedad caracteri- to está activada en varios estados de enfermedad (Morgan. 1994a).
zada por episodios recurrentes de edema subcutáneo y submucoso. Esta defi-
En la activación, muchas proteínas del complemento expresan nuevos
ciencia puede heredarse o adquirirse tras el desarrollo de autoanticuerpos con-
antigenos (neoantígenos) que no son expuestos en la proteína nativa plas-
tra el C1 inhibidor. Los pacientes con deficiencia del C1 inhibidor a menudo
mática. El neoantígeno presente en el MAC pero no presente en los compo-
muestran niveles bajos de C4 y C2. demostrando una activación incontrolada
nentes nativos termínales es quizás el más interesante. El anticuerpo para
del C1. Se cree que el angioedema hereditario es causado principalmente por
este neoantígeno existe y se ha utilizado para estudiar el nivel de neoantí-
la pérdida de la regulación del sistema generador de cininas por el C1 inhibi-
geno por inmunofluorescencia así como por ELISA (Falk. 1983; Sanders.
dor (Cugno. 1998; Davis. 1998).
1985). El nivel de neoantígeno está elevado en sangre y en líquido cefalo-
Los pacientes con hypogammaglobulinemia o inmunodeficiencia combinada rraquídeo en muchos pacientes con activación consiguiente del complemen-
severa a menudo tienen disminuidos los niveles de Clq. En parte, estos nive- to (Sanders. 1986). Además, está presente en los tejidos en los lugares de
les disminuidos de C1q se relacionan con los niveles bajos de IgG en la circu- depósito del complejo terminal. Por ejemplo, está presente en el tejido lesio-
lación. Parece que el Clq interacciona con la IgG en la circulación y que esta nado en los glomérulos de los pacientes con glomerulonefritis (Falk. 1983) y
interacción conduce, a su vez. a una disminución del catabolismo del Clq. en la piel lesionada en los lugares de LES activo (Biesecker. 1982). A que-
rencia del C3 depositado en la piel normal de pacientes con LES y con test
de banda para el lupus positivo, el neoantígeno MAC solo se encuentra en
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL las lesiones.
COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD
COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD
En muchos contextos de enfermedad, las funciones del complemento son
normalmente producir inflamación o daño tisular. Cuando el complemento jue-
ga un papel en el desanollo de la enfermedad, a menudo es activado por un Enfermedades reumatológicas
anticuerpo anormal, un complejo inmune o por material extraño. Frecuente- La enfermedad reumatológica que ha sido evaluada más extensamente
mente es importante evaluar el nivel de uno y otro componente del comple- en cuanto a la contribución del complemento a la actividad de la enlermedad
mento como medida de la actividad de un proceso de enfermedad. Por ello, loses el LES (Agnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta enfermedad se forman
pacientes con LES activo pueden tener disminuidos los niveles de C3 y C4, y grandes cantidades de complejos inmunes. Se encuentran inmunocomplejos
estos niveles disminuidos del complemento pueden seguirse como un marca- circulantes y unidos a tejidos. Estos inmunocomplejos activan el comple-
dor aproximado de la actividad de la enfermedad. mento, y los productos de activación del complemento contribuyen a que
 904 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

continúe la inflamación. A menudo están disminuidos los niveles de C3 y C4 matismo severo o sepsis incontenible. Hay evidencia de activación masiva
en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los pacientes condel complemento en estos pacientes, lo que sugiere que las bacterias y los
enfermedad activa. Algunos sugieren que un nivel bajo de C4 es el mejor productos bacterianos activan el complemento (Hammerschmidt, 1980).
indicador de que la enfermedad continúa activa. Sin embargo, hay pacientes Parece que se activan la vía clásica y la vía alternativa (Langlois. 1988). Se
con enfermedad activa que muestran niveles normales de C4. De acuerdo forman factores inflamatorios como el factor activador de neutrófilos y el C5a.
con otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantígeno del MAC puede ser Hay evidencia de que los neutrófilos infiltran el pulmón, y se cree que los pro-
un indicador mejor de enfermedad activa (Gawryl, 1987). Como se trató pre- ductos oxidativos neutrofílicos y las proteasas son responsables de mucho
viamente, el complemento parece jugar un papel esencial en el aclaramien- del daño pulmonar que ocurre.
to de los inmunocomplejos circulantes, particularmente de aquellos que con-
tienen isotipos activantes del complemento IgM o IgG. El depósito de C3b
sobre el inmunocomplejo procede de la activación del complemento, que Enfermedades renales
permite la interacción con células que poseen el receptor de C3b (CR1). Con
la unión a los eritrocitos a través del CR1. se impide que los complejos inmu- El complemento parece ser una clave importante en el daño glomerular en
nes se difundan del plasma a los tejidos donde pueden originar daño. Los eri- muchas de las glomerulonefritis (West, 1998). Esto se demuestra a menudo
trocitos que unen a inmunocomplejos circulan hacia el hígado, donde los por el depósito de C3 y otros componentes, en o cerca de la membrana basal
inmunocomplejos son eliminados por un proceso que no disminuye la vida glomerular. Además, el MAC ha sido reconocido en el daño glomerular en
media de los hematíes (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). En las enfer- pacientes con glomerulonelritis y LES. Se ha demostrado que los pacientes
medades en las que el complemento es activado y estos productos inmuno- con enfermedad del suero debida a inmunocomplejos circulantes tienen
lógicamente activados se forman en la circulación, el número de CR1 por eri- lesión glomerular. En el análisis del suero, estos pacientes mueslran la acti-
trocito está disminuido. Esto puede resultar de la eliminación de algunos de vación de las vías clásica y alternativa, o de ambas. Tradicionalmente, se ha
los CR1 cuando el complejo inmune es retirado del eritrocito en el hígado creído que los complejos son depositados en los glomerulus a medida que
(Ross, 1985). Además del LES, se ha publicado que los eritrocitos de pacien- se filtra el plasma que contiene los inmunocomplejos. Una vez depositados,
tes con enfermedad crónica por aglutininas frías. HPN, anemia hemolíhca estos complejos activan el complemento. Un punto de vista alternativo es
autoinmune. síndrome de Sjogren y neumonía por Mycoplasma pneumoniae que los anticuerpos contra las estructuras glomerulares forman inmunocom-
tienen reducido el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depósitos inmunes plejos en el riñon que luego activan el complemento para causar daño local
han sido eliminados de los eritrocitos en estas enfermedades (Atkinson, (Daha, 1979). Aunque los anticuerpos frente a las estructuras de la mem-
1986: Ross, 1985). brana basal glomerular son claramente importantes en el síndrome de Good-
Las proteínas del complemento actúan como reactantes de fase aguda y pasture, su papel global en las glomerulonefritis es más cuestionable. El
los niveles pueden no estar disminuidos incluso en situaciones en las que papel del complemento en la enfermedad intersticial y tubular está menos
ocurre la activación del complemento. Se encuentran niveles séricos del com- claro; sin embargo, hay quienes creen que el complemento también funcio-
plemento normales o aumentados en la artritis reumatoide juvenil, en el reu- na en estos trastornos. Interesantemente, en algunos pacientes con glome-
matismo palindrómico. en la seudogota. en la gota, en el síndrome de Reiter rulonefritis con niveles muy bajos de C3. una proteina lamada factor nefríti-
y en la artritis gonocócica. AI mismo tiempo, parecen existir niveles disminui- co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la vía de la C3 convertasa alternativa. Este
a

dos del complemento en el líquido sinovial en un número de otras enferme- factor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb que aumenta la vida media
dades reumatológicas. incluyendo la artritis reumatoide. Se cree que la dis- de la C3 convertasa de la via alternativa en más de 10 veces (Daha. 1979.
minución de la actividad hemolitica total del complemento (CH50; véase 1976). El C3NeF parece proteger a la C3 convertasa de la vía alternativa de
después en Ensayos del complemento) y la presencia de productos de degra- la eliminación por la disociación por el factor H (Fearon, 1980). Se cree que
dación del C3 y del factor B representan la activación intraarticular en el líqui- el C3NeF es responsable de los niveles tan bajos de C3 presentes en estos
do sinovial de muchos pacientes con artritis reumatoide seronegativa. LES, pacientes pero no se cree que juegue un papel central en el desarrollo de la
seudogota, gota, síndrome de Reiter y artritis gonocócica. Esto no es cierto nefritis.
en fluidos obtenidos de pacientes con artritis degenerativa.

Enfermedades dermatológicas
Enfermedades infecciosas
Como en los otros grupos de enfermedades señalados, se cree que el
Como se mencionó anteriormente y como se evidenció en hallazgos clíni- complemento toma parte en el daño tisular en una variedad de enfermeda-
cos en pacientes con deliciencias genéticamente controladas del comple- des dermatológicas. Estas incluyen el penfigoide ampollóse el penfigoide
mento, el sistema del complemento juega un papel crucial en la defensa con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermólisis ampolosa adquirida, la
tra los microorganismos. Los pacientes con septicemia por Gram negativos dermatitis herpetiforme y el pénfigo vulgar (Yancey, 1998). Es importante
a menudo tienen niveles disminuidos de C3 y de componentes de la vía alter-saber que los niveles séricos del complemento suelen estar normales o ele-
nativa, al igual que pacientes con ciertas enfermedades fúngicas como la vados en estos estados inflamatorios, y de que la importancia del comple-
septicemia criptocócica. El complemento puede estar implicado en el daño mento es estimada por análisis de inmunofluorescencia de las biopsias lisu-
tisular asociado con la infección crónica. Se sabe que los pacientes con lares y por estudios del liquido de la ampolla. Además. Gammon y cois.
hepatitis infecciosa HbsAg positiva tienen una caída precoz en el C3 sérico, (1984) han desarrollado un modelo in vilro útil para el estudio de enferme-
que posteriormente vuelve a la normalidad. Esto puede estar asociado con dades cutáneas mediadas por anticuerpos anli-membrana basal. Estos
signos de enfermedad por inmunocomplejos (esto es, la artralgia). De una autores han mostrado concluyentemente que el C5a es un elemento clave
forma similar, el complemento parece jugar un papel importante en muchas en la patogénesis del penfigoide ampolloso y de la epidermólisis ampollosa
infecciones parasitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la adquirida. El C5a actúa como un quimioatrayente necesario para el aflujo de
giardiasis y la malaria. La discusión detallada de las interacciones entre el leucocitos polimorfonucleares a los lugares de daño tisular en estas enfer-
sistema del complemento y los parásitos, las bacterias y los virus no se medades.
encuentra dentro de los objetivos de este capitulo y el lector debe remitirse
a revisiones sobre el tema (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moffitt,
1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante reconocer que los nive- Enfermedades hematológicas
les del complemento sérico en general no son un índice fiable de actividad
de enfermedad en estas condiciones. En muchos tipos de anemia hemolitica autoinmune, el complemento juega
Se ha estudiado el papel del complemento en el síndrome de dificultad un papel importante en la opsonización de los eritrocitos, conduciendo a su
respiratoria del adulto (SDRA), un proceso frecuente en pacientes con trau- aclaramiento por las células del sistema reticuloendotelial.
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento está
claramente implicado, los niveles séricos del complemento suelen ser nor-
males. El complemento es particularmente importante en el aclaramiento de
células recubiertas con crioaglutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos
autoanticuerpos (aglutininas frias) están asociados con trastornos linfoprolí-
ferativos que siguen a infecciones, o pueden ser hallazgos aislados, espe-
cialmente en los ancianos. Las aglutininas frías generalmente se unen ópti-
mamente a temperaturas subfisiológicas, que se encuentran en algunas
áreas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos, y las
orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes vuel-
ven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas frías son anti-
cuerpos IgM. El síndrome de la hemoglobinuria paroxistica fría (HPF), por
ejemplo, resulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen
a las células a temperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez
calientes. Aunque el anticuerpo es diferente, los efectos fisiopatológicos son
similares.
Otros autoanticuerpos que activan el complemento se unen más eficaz-
mente a temperaturas calientes. En general, estas aglutininas calientes son
del isotipo IgG. En algunos casos, estos anticuerpos pueden estar asocia-
dos con enfermedades malignas linfoprolíferativas y con infecciones vira-
les. La mayoría de los anticuerpos IgG reactivos al calor encontrados en la
anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son pobres acti-
vadores del complemento en contraposición con las aglutininas frías y con
los anticuerpos frente a los grupos sanguíneos anti-A y anti-B. Sin embar-
go, algunos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la
lisis.
En una anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria
paroxistica nocturna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de
lisis mtravascular. Se cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se
lleva a cabo por la vía alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los
niveles séricos del complemento siempre son normales y el test directo anti-
globulina es siempre negativo. El defecto en la HPN es una pérdida de pro-
teínas de enlace glicosil fosfatidilinositol en la superficie de las células de los
pacientes originado por mutaciones en el gen fosfalidil glicano A (p/g-A).
Entre otras proteínas de unión a través de este enlace de membrana están
el DAF y el CD59. dos moléculas que controlan la activación del comple-
mento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (véase
anteriormente en Regulación de la activación del complemento). Se cree que
la lisis de los eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activación incon-
trolada del complemento en la superficie de estas células. Recientemente, se
informó de que, aunque la pérdida de DAF y CD59 de la superficie de los eri-
trocitos en pacientes con HPN es responsable del aumento de la sensibilidad
a la lisis mediada por el complemento, la deficiencia de CD59 origina una
mayor sensibilidad a la lisis celular que la deficiencia de DAF (Shichishima,
1999).
Enfermedades neurológicas
El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema
nervioso se ha hecho evidente en los años recientes. Esto es algo sorpren-
dente, ya que la barrera hemaloencefálica bloquea eficazmente la penetra-
ción del complemento en el liquido cefalorraquídeo. La activación del com-
plemento fue demostrada en enfermedades como la miastenia gravis. la
esclerosis múltiple, el lupus cerebral, el síndrome de Guillain-Barré y la
enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El depósito
de proteínas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y
se demostró la activación del complemento en el líquido cefalorraquídeo
(LCR) de pacientes con muchas de estas enfermedades. Presumiblemente,
la inflamación origina una ruptura de la barrera hematoencefálica con la
penetración local de proteínas del complemento. Además, algunas células
sintetizan proteínas del complemento. Hay evidencia de que la activación del
complemento puede estar implicada en el daño a la mielina, originando de
este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del periféri-
co. También se demostró que el complemento estaba implicado en la enfer-
medad de Alzheimer y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alz-
heimer, un péptido derivado del amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y
activa el complemento en las placas seniles del cerebro enfermo. Interesan-
905
temente, el tipo de célula glial más abundante, el astrocito, demostró sinteti-
zar in vitro todas las proteínas del complemento en condiciones inflamatorias
(Morgan. 1996). Además, los astrocitos y las células microgliales expresan
receptores del complemento ¡n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar
de la barrera hematoencefálica. el cerebro tiene la capacidad de preparar
una reacción inflamatoria dependiente del complemento como mecanismo
de defensa.
Enfermedades cardiovasculares
Se admite la implicación del sistema del complemento en la lesión por
isquemia'reperfusión miocárdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi.
1997a). El mecanismo por el que el complemento contribuye al infarto agudo
de miocardio en los pacientes todavía no está claro. Sin embargo, se han
demostrado los depósitos de los componentes de las vías clásica y alternati-
va en el miocardio afectado junto con C5b-9 La producción de analilotoxmas
que acompañan a la activación del complemento parece ser responsable de
la reacción inflamatoria local. La demostración más clara del efecto del com-
plemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del
modelo animal de oclusión de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los cone-
jos con deficiencia genéticamente controlada de C6 muestran una significati-
va reducción del tamaño del infarto en comparación con los conejos norma-
les. Además, la infiltración neutrofilica se redujo significativamente en los
conejos con deficiencia de C6. sugiriendo un papel crucial de los componen-
tes finales del complemento en la generación de inflamación local.
El complemento también parece jugar un papel en el desarrollo de lesiones
de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el
que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arterioscleróticas
no está claro. Sin embargo, el depósito de los componentes finales del com-
plemento (C5b-9) ha sido demostrado en las íntimas adelgazadas y en las
placas fibrosas. La activación del sistema del complemento está asociada con
etapas prelesionales y con la progresión de lesiones arterioscleróticas (Nicu-
lescu, 1987; Seifert, 1989). Los conejos con déficit de C6 demostraron ser
menos susceptibles que los conejos normales a las lesiones arterioscleróticas
inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).
Biocompatibilidad
Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el comple-
mento, particularmente la vía alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En
contacto con la sangre o con los líquidos tisulares. estos materiales pueden
activar el complemento y producir inflamación local o daño tisular. Los mate-
riales deben ser testados sobre su capacidad de activar el complemento an-
tes de ser utilizados ampliamente.
Trasplante de órganos
El éxito del trasplante de órganos ha creado un gran problema, la esca-
sez de órganos humanos para satisfacer las demandas para un número de
pacientes que no deja de crecer que lo están esperando como técnica qui-
rúrgica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes anima-
les como el cerdo en este campo como una lógica alternativa a los órganos
humanos. Sin embargo, los órganos porcinos vascularizados son suscepti-
bles de una intensa reacción de rechazo, denominada rechazo hiperagudo.
cuando son implantados en primales o en humanos (Platt. 1998; Dalmasso,
1992). Esta reacción es mediada por anticuerpos que se unen a las células
endoteliales y la activación del complemento. Se demostró que la activación
del complemento era crucial en el daño tisular en la reacción hiperaguda
de los xenotransplantes. La activación del complemento en las células
endoteliales xenogénicas origina su activación (es decir, las células endo-
teliales adoptan un fenotipo procoagulante), que conduce a trombosis
intravascular e intersticial y a hemorragia. Tal intensa reacción se debe a la
incapacidad de las moléculas reguladoras del complemento asociadas a
las células porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar la activación
del complemento humano. Por lo tanto, el éxito de esta prometedora inter-
vención terapéutica recae en la capacidad de controlar la activación del
complemento. El papel del complemento en el rechazo de órganos huma-
 906 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activación del
complemento contribuye de algún modo a los episodios de rechazo agudo
y crónico (Baldwin, 1995).
UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES
DEL COMPLEMENTO
La activación del complemento contribuye indudablemente al daño lisu-
lar observado en una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el
empleo de agentes que bloquean la activación del complemento debe mos-
trar su utilidad para limitar el daño tisular. Desgraciadamente, no hay agen-
tes disponibles para el uso en la práctica clínica. Se están realizando inves-
tigaciones para desarrollar inhibidores del complemento que demuestren
eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en el control
de la infección, un inhibidor del complemento adecuado no debería interfe-
rir con esta función del complemento. También se sabe que el C3a y el C5a
son potentes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el
inhibidor deseable deberá actuar a nivel de la C3 convertasa clásica y
alternativa para evitar la producción de estas anafilotoxinas. Se han pro-
ducido muchos inhibidores recientemente y están siendo desarrollados
actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhibidores que se mues-
tran como promesas en el área clínica. Para una descripción más comple-
ta de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento,
se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998;
Wagner, 1998).
Como se discutió previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la
via clásica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegración
de las C3 y C5 convertasas de ambas vías y sirve como cofactor para la
degradación del C4b, C3b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta
molécula representa un excelente candidato para la inhibición terapéutica del
sistema del complemento en los estados de enfermedad. Una forma recom-
bmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue producida y demostró man-
tener todas las propiedades de la proteína nativa unida a la membrana. En
una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe
que la activación del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejo-
ra significativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros:
xenotransplante cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alve-
olítis en un modelo de reacción pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesión
tisular de isquemia/reperfusión miocárdica (Weisman, 1990), desmielinización
en un modelo experimental de encefalomielitis alérgica en ratas (Piddlesden,
1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995). El sCR1 ha entrado ahora en la fase
I de los ensayos clínicos en pacientes con infarto de miocardio y en pacien-
tes con SDRA inducido por quemaduras.
Otro inhibidor del complemento que ha entrado también en la fase I de los
ensayos clínicos es un anticuerpo humanizado de cadena simple contra el
C5 humano. La ventaja de tal anticuerpo es que permite el bloqueo de la acti-
vación del complemento sin liberar C5a y depositar C5b-9, lo que se sabe
que promueve el potente daño tisular debido a la inflamación y a la activa-
ción celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demostró en modelos ani-
males interferir en el rechazo hiperagudo de los órganos porcinos en siste-
mas de perfusión in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de
artritis en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Wang. 1995),
para disminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratón de LES (Wang,
1996) y para disminuir el tamaño del infarto en un modelo de rata con un
modelo de lesión de isquemia/reperfusión miocárdica (Vakeva. 1999). EL
anticuerpo anti-C5 humanizado demostró ser un potente inhibidor del siste-
ma del complemento in vitro (Evans, 1995). Los resultados de los ensayos
clínicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir significativamente el
daño al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirúrgico cardio-
pulmonar ¡Rollins, 1998).
Las preparaciones de IgG humana purificada para el empleo intravenoso
(IVIG) se han empleado en un número de enfermedades autoinmunes e
inflamatorias como la púrpura trombocitopénica idiopática, la enfermedad de
Kawasaki, el síndrome de Guillain-Barré y la miastenia gravís (Dwyer. 1992).
Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su acción bene-
ficiosa no está claro y puede incluir el bloqueo de anticuerpos a través de las
interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los receptores Fe para IgG en
las células lagocíticas, la modulación de las funciones de las células T y B y
la selección de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente tiene un
efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demos-
trado interferir en la reacción de shock dependiente de la via clásica de Fross-
man en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del
xenomjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Además, el trata-
miento con alias dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibió el
depósito de C3b y C5b-9 que normalmente se ve en los capilares del endo-
misio de estos pacientes (Basta, 1994). La IVIG inhibe la activación del com-
plemento a través de su porción Fe. El mecanismo exacto por el que la IVIG
bloquea la activación del complemento en la superficie del objetivo todavía no
se comprende completamente. Informes han demostrado que la IVIG puede
prevenir el daño tisular mediado por el complemento interactuando directa-
mente con el C 1 o previniendo la unión del C4 con la célula diana (Mollnes,
1995; Miletic, 1996).
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
Principios generales
Están disponibles los métodos que permiten asegurar la determinación de
los niveles de cualquiera de los componentes de las vías clásica, alternativa
y de la MBLectma, así como muchas enzimas y reguladores del sistema del
complemento. Sin embargo, muchos de estos ensayos no están disponibles
en los laboratorios clínicos de rutina y están restringidos los laboratorios de
investigación. Centraremos nuestra atención sobre las técnicas que no
requieren para su realización un laboratorio especializado en la investigación
del complemento. Para más detalles relativos a métodos que requieren téc-
nicas más especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley,
1985: Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Würzner, 1997). Los ensa-
yos sobre el complemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que
miden las proteínas del complemento como antigenos en los líquidos bioló-
gicos y aquellos que miden la actividad funcional de un componente dado.
Ambos tipos de técnicas tienen ventajas e inconvenientes. Los métodos de
análisis antigénico (inmunoquimicos) generalmente son fáciles de realizar.
Estos ensayos antigénicos con altamente específicos, requieren menos
reactantes especializados, son más baratos y se realizan en una cantidad de
tiempo considerablemente menor. Los anticuerpos para las proteínas del
complemento humano y para las proteínas purificadas del complemento
humano están comercialmente disponibles. El Linscott's Directory ol Immu-
nological and Biological Reagents (1998) es una guía útil para conocer los
reactantes del complemento disponibles. Son sulicientes en estos ensayos,
en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los métodos comunes
de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razón, los ensayos antigé-
nicos son fácilmente adaptables al laboratorio clínico. Por otra parte, los
ensayos antigénicos no proporcionan información sobre la actividad de un
componente ya que pueden detectar los productos de degradación asi como
los componentes funcionalmente activos. La presencia en suero de peque-
ños fragmentos de una proteina con actividad antigénica puede confundir los
resultados. Algunos ensayos antigénicos emplean inmunodifusión radial. En
estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir más rápidamente que
la molécula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevados.
Como ejemplo, el ensayo antigénico más frecuentemente empleado para el
C3 mide su principal producto de degradación, el C3c. por inmunodifusión
radial. Para mediciones seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C
durante un número de días para permitir la completa conversión de C3 en
C3c. En realidad, esto no se hace normalmente y por ello representa un moti-
vo de error, aunque el error es pequeño y normalmente no tiene consecuen-
cias clínicas. En general, los ensayos antigénicos no son tan sensibles como
los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos de un compo-
nente presente en ciertos líquidos corporales. La sensibilidad de los ensayos
antigénicos en cierto grado de la concentración del anticuerpo empleado, y
con los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antigé-
nica tan pequeña como 10 pg/ml.
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Hay kits disponibles que emplean la inhibición de la unión de un sustra-
to radiomarcado para detectar varios péptidos del complemento. Estos
equipos están disponibles para la medición del C3a. C4a y C5a. La utilidad
de estas mediciones todavía está debatiéndose. Está disponible un infor-
me detallado sobre los procedimientos de medida de la actividad lítica fun-
cional y sobre los niveles antigénicos de los componentes de la vía alter-
nativa (Minta, 1985). También se han descrito ensayos diseñados para
medir la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el
suero humano pero requieren reactantes especializados que pueden no
estar disponibles comercialmente (Gaither. 1979). Han sido desarrollados
ensayos con ELISA para la medición de productos de degradación de las
proteínas del complemento o para los complejos formados tras la activa-
ción del complemento. Hay equipos comercialmente disponibles (Quidel.
San Diego. CA). Estos miden los productos de degradación de las proteí-
nas del complemento a medida que se generan tras la activación del com-
plemento empleando anticuerpos monoclonales específicos. La activación
del complemento por la vía clásica puede medirse siguiendo los niveles de
C4d en suero frente a los de C4. También, la medición por ELISA de los
complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona una medida de la activación del
complemento a través de la via clásica. La activación de la vía alternativa
puede medirse por ELISA evaluando los niveles de los complejos Bb, o
C3BbBP o C3bP en la circulación (Mayes, 1984). Se informó de que las
mediciones de dichos complejos cuantifican tan poco como 10 a 20 ng/ml
de C3bP en suero. Este ensayo puede también emplearse para medir los
complejos de activación unidos a la superficie. La activación a través de
cualquier via puede monitonzarse midiendo los niveles de iC3b o de la lor-
ma soluble del complejo de ataque a la membrana. sC5b-9. Además, los
kits de ELISA están disponibles para medir la generación de anafilotoxmas
en sueroplasma. Ya que el C3a y el C5a son rápidamente convertidos en
sus fragmentos desArg inactivos por carboxipeptidasa-N en el suero, estos
ensayos emplean anticuerpos monoclonales específicos para el C3a-des-
Arg y el C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI-
SA proporcionan una herramienta excelente para evaluar la activación del
complemento en los líquidos biológicos a través lanto de la via clásica
como de la vía alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmente son
caros y requieren que el usuario establezca una curva de dilución están-
dar. Por lo tanto, en un solo kit se puede incluir una cantidad limitada de
muestras.
Evaluación funcional de la vía clásica
Los ensayos funcionales del complemento son herramientas sensibles y
precisas para proporcionar información sobre la actividad de un componente.
Algunos de estos métodos pueden utilizarse para cuantificar la actividad del
nivel molecular, y otros para expresar la función del complemento en unida-
des arbitrarias. Los reactantes comerciales están disponibles para valorar
cada componente de las vias clásica y alternativa. Sin embargo, para la
mayor parte, estos ensayos son desarrollados en un limitado número de cen-
tros de investigación. Muchos ensayos funcionales requieren procedimientos
que requieren tiempo y componentes del complemento relativamente muy
purificados, que son más caros que aquellos requeridos por los ensayos anti-
génicos. Por lo tanto, se limitará la descripción de los ensayos del comple-
mento a los métodos de referencia para la evaluación de la activación tanto
de la via clásica como de la alternativa. Los amortiguadores que se emplean
frecuentemente en la mayoría de los laboratorios donde se desarrollan los
ensayos del complemento se describen en la Tabla 38-5. Uno debe darse
cuenta de que la preparación precisa de estos amortiguadores es crítica ya
que cambios en la molaridad y en la concentración del ion metal pueden afee-
lar a los títulos obtenidos.
Los ensayos que miden la actividad hemolitica total en una muestra (CH50) periodo de lempo indefinido
o la actividad funcional de los componentes del complemento aislados en
general emplean eritrocitos de oveja como objetivos de la lisis mediada por el
complemento. Los eritrocitos de oveja son más sensibles a la lisis por anti-
cuerpos y mediada por el complemento que los eritrocitos de otras especies. adecuados están comercialmente disponibles. La activación de la via alterna-
Además, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolípido (antígeno de Forss-
man) que provoca una respuesta potente de los anticuerpos en conejos una Estas células son particularmente sensibles a la lisis independiente de anti-
vez inmunizados estos animales con eritrocitos de oveja. Los anticuerpos
907
Tabla 38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los
e n s a y o s del complemento
Soluciones stock*
1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS)
Disolver 85 g de NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1.5 I de
agua destilada. Ajustar el pH a 7.35±0.05 con CIH IN y llevar hasta 2
l de volumen con aguda destilada Esta solución es cinco veces la
concentración de una solución isotómca y puede almacenarse a 4"C
durante al menos un mes.
2. Ácido disodio etilendiaminetertetr acético 0.01 M (stock EDTA)
Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila
da. Ajustar el pH a 7.65±0.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de volu-
men con agua destilada El stock EDTA puede utilizarse durante al
menos tres semanas con almacenaje a 4"C.
3. Dextrosa con Ca- Mg •' y gelatina (D5wg++)
Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un tubo sepa-
rado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentán-
dolo hasta que los granulos de gelatina estén disueltos Añadir la
solución de gelatina a la solución de dextrosa Añadir 2 mi de la solu-
ción stock 4 y 2 mi de la solución stock 5 a la mezcla Ajustar el pH a
7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solución
puede emplearse durante una semana cuando se almacena a 4 C
4. MgCI. 1 M
Preparar 100 mi de solución que contenga MgCI, 2 M aproximada-
mente. Medir la gravedad especilica de la solución y determinar la
concentración de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics'
(tablas de conversión para valores concentrados de soluciones acuo-
sas) A|ustar la concentración a 1 M añadiendo agua destilada Alma-
cenar a 4°C.
5. CaCl 0.15 M
Se preparan 100 mi de una solución de CaCK.3 M aproximadamente
Medir la gravedad especilica de esta solución y determinar el CaCl,
como se describe arriba Ajustar a 0 15 M añadiendo agua destilada
Almacenar a 4"C.
Soluciones de trabajo
¡ 1. VBS isolónico con gelatina y metales (GVBS++)
Añadir 200 mi de la solución stock 1 (arriba) a 700 mi de agua destila-
da en un malraz alorado de 1 I de volumen Añadir 1 mi de la solución
stock 4 y 1ml de la solución stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi
de agua destilada calentando como se describió en la solución stock
3. Añadir la solución de gelatina y ajustar el pH a 7.35±0.05 Llevar
hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS++ debe preparar-
se en Iresco una vez cada semana
2. Dextrosa-VBS Daß en iones con metales y gelatina (DGVBStt)
Los amortiguadores de diferentes potencias iónicas son preparados
mezclando la solución stock 3 con la solución de trabaio 1. El
DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando tres partes de la solución
citada primero con dos partes de la segunda solución. El DGVBS+t
debe prepararse en Iresco.
3. EDTA-VBS isotómco (EDTA-GVBS—)
Preparar el GVBS como en la solución de trabajo 1 con la excepción
de utilizar 600 mi de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las
soluciones 4 y 5 no se añaden a esta solución. Añadir 100 mi de la
solución stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Llevar a un volumen de
1 i con agua destilada Esta solución es estable durante al menos una
semana a 4°C
4. VBS isotónico con glicol etilen bis (b-aminoetil éter) N. N N. N • acido
tetraacetico e iones Mg- (EGTAGVBS+)
Añadir 50 mi de la solución stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un
matraz aforado de 250 mi de volumen Añadir 1.25 mi de la solución
stock 4 Disolver 0 25 g de gelatina en 25 mi de agua destilada calen-
tando como se describió en la solución de Irabaio 1 y añadir a la solu-
ción. Preparar una solución stock EGTA añadiendo 0.761 g de EGTA a
5 mi de agua destilada Disolver EGTA con NaOH 5 NI A|ustar el pH a
7,35±0.05 con acido acético al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con
agua destilada Añadir esa solución stock de EGTA a la solución de
trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y llevar a un volumen de 250 mi con
agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Iresco.
I " Las soluciones stock 1. ? y 3 deben almacenarse de 20"C a -50"C durante un
* De West RC (ed) CRC Handbook Ol Chemistry and F-hysics Boca Ratón FL. CRC
Press 1985-t986. con permiso
tiva del complemento se mide fácilmente empleando eritrocitos de conejo.
cuerpos mediada por el suero humano.
 908 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Manejo de las muestras
El correcto manejo de las muestras es crítico para el correcto análisis fun-
cional del sistema del complemento. Par la mayoría de los ensayos funciona-
les, se prefiere el suero al plasma para el análisis ya que los quelantes del cal-
cio como el EDTA o la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las
muestras son diluidas más de 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del
plasma puede emplearse ya que la dilución sobrepasa el electo quelante. Para
obtener el suero para los ensayos funcionales, la sangre debe dejarse coagu-
lar durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente y después en hielo
durante al menos una hora. Si se necesitan estudios del fijador de C1q. se de|a
la muestra coagular durante dos horas a temperatura ambiente. En este caso,
la polimerización completa del coágulo parece facilitar la precisión del ensayo.
Para separar el suero, se recoge el coágulo y se centrifuga de 0 a 4 C duran-
te 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnoprecipitantes. la
centrifugación y formación del coágulo de la muestra debe hacerse a 37 C ya
que puede ocurrir la fijación del complemento si la muestra se enfría. En cier-
tos casos, la congelación disminuirá los títulos de complemento considerable-
mente. Aunque las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en men-
te que un título considerablemente disminuido de complemento sólo puede
reflejar un artefacto de una preparación sérica inadecuada. Si se sospecha
esto, el suero debe prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activación
del complemento. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en varios
volúmenes pequeños y almacenarse inmediatamente a una temperatura de
-40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos perio-
dos de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin pérdida de la
actividad. Cuando los sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes
de empaquetarse en un contenedor con grandes cantidades de hielo seco.
Preparación de eritrocitos
La sangre de oveja estéril se obtiene de una solución estéril de Alserver. La
sangre anticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utili-
zarse y puede emplearse durante un máximo de seis semanas si se mantiene
estéril. La edad de las células afecta mucho a los títulos de la mayoría de los
componentes del complemento, y los títulos pueden ser falsamente bajos si
se utilizan células frescas. En condiciones estériles, se extrae asépticamente
y se centrifuga a 4 C un volumen de células. Se extraen el sobrenadante y la
capa leucocitaria. y se remtroducen las células en una solución tampón ade-
cuada. Los detalles del lavado y sensibilización de las células con anticuerpos
se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alternativa,
se extrae asépticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa
como la sangre de oveja.
Preparación de eritrocitos de oveja
sensibilizados con anticuerpos
Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componen-
tes individuales o el título de complemento hemolítico total emplean eritroci-
tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) anti-Forssman de conejo.
Como se describió anteriormente, este antígeno es altamente inmunógenc e
induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos inmu-
nizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con deta-
lle por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del anti-
suero es destruida por la inactivación con calor a 56 C durante 30 minutos.
Los métodos para la titulación del anticuerpo y para la preparación de las
células óptimamente sensibilizadas se explican en otras obras (Gaither,
1984). Es esencial que se utilice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los
eritrocitos de oveja de modo que pequeñas diferencias en la cantidad de anti-
cuerpo sensibilizado no afecten al titulo. Los eritrocitos de oveja sensibiliza-
dos con cantidades óptimas de anticuerpo se denominan EA Los componen-
tes intermediarios de la célula con componentes del complemento unidos a la
membrana, que se utilizan en la titulación funcional individualizada de los
componentes, pueden prepararse utilizando componentes de complemento
purificados Los métodos para la preparación de estos intermediarios celula-
res ya se han descrito (Gaither, 1984).
Ensayo del complemento hemolítico total
El ensayo más simple sobre la vía clásica mide el complemento hemolítico
total. La ausencia de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en
los pacientes con déficit genético homocigotos. generalmente origina un títu-
lo de complemento hemolítico total (CH50) de cero. Sin embargo, un valor
normal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales.
Cuando la historia y los síntomas de un paciente sugieren una posible defi-
ciencia, deben pedirse los títulos hemolitico y anligénico de los componentes
individuales. A menudo, el título de CH50 será una medida funcional adecua-
da de la actividad del complemento.
El titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la
dilución de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan
diluciones seriadas de la muestra y se añaden al EA (Tabla 38-6). En este
caso, el punto linal del 50% se determina por la transformación de los datos de
Von Krogh. Esta fórmula derivada empíricamente convierte la curva dosis-res-
puesta en forma de S en una función lineal. Se calculan los valores de / / 1 - /
donde Yes la fracción de glóbulos rojos usados en el test de dilución. Se cons-
truye una gráfica en donde se representa el logaritmo del volumen relativo del
complemento frente a los valores del logaritmo de V'1-V. Normalmente, se
obtiene una línea recta, y el titulo se calcula determinando el volumen relativo
de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) Esle valor se divide por
el reciproco de la dilución sérica original (1:60 para el suero humanoi para cal-
cular la concentración de complemento sérico que lisa el 50% de las células
El título de complemento representa el número de unidades hemoliticas 50%
que están presentes en 1.0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970).
El suero de los conejillos de Indias con déficit de C4 está disponible comer-
cialmente y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una
muestra. El método se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un núme-
ro limitado de laboratorios está disponible el suero de humanos y conejillos de
 CAPÍTULO 38 • COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN 909

Tabla 38-7 Titulación funcional de la vía alterna (ensayo AH50)

'Si una muestra se suero muestra algún grado de hemolisis (color rojizo), se prepara un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero
no E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos se sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que están mez-
clados con E
EGTA GVBS+ = salmo isotónico tamponado con Veronal con gelatina, EGTA y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS— = salino isotónico tamponado con Veronal con
:

EDTA; CB = E solo con lampón; CL = E con agua destilada (lisis completa).

Indias con délicil de C2 y el de conejos con déficit de C6. Estos sueros son inmunodifusión. Existen disponibles equipos de inmunodifusión radial para
una aceptable alternativa al empleo de intermediarios celulares para titular los todos los componentes de la vía clásica y alternativa. Estos equipos consis-
componentes individuales, ya que solo tienen la pérdida de una proteína del ten en cristales cubiertos de una tina capa de agarosa al 2% que contienen
complemento, anticuerpos monoespecíficos. El suero proteico estándar (un pool estabiliza-
do de suero humano normal) se suministra, normalmente, en soluciones pre-
Ensayo de la vía alterna diluidas. Cada solución estándar contiene una cantidad específica de la pro-
teína que se está midiendo para su uso en la construcción de la curva de
En este ensayo, el suero humano (normalmente diluido primero a 1:5) se referencia.
diluye seriadamente y se añade a eritrocitos de conejo que no están sensibi-
lizados con un anticuerpo específico en un tampón que contiene iones mag-
Prueba de fijación del complemento
nesio y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) para quelar los iones calcio (los
iones calcio son necesarios para la activación de la via clásica, no para la acti- Se dispone de una descripción detallada de este ensayo (Mayer. 1961), y
vación de la via alternativa) (Pangburn, 1988) (Tabla 38-7). El título de la vía aquí no se detallará. Sin embargo, ya que las reacciones de fijación del com-
alternativa se denomina AH50 y representa la dilución final del suero humano plemento son de gran importancia en el diagnóstico clínico, se tratarán bre-
en el ensayo que lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una gráfica vemente. La técnica de la prueba depende de la capacidad del complemento
similar a la descrita para la litulación del complemento hemolítico total para del suero fresco de interaccionar con complejos antígeno-anticuerpo. En la
determinar el AH50. El suero humano puede poseer a veces anticuerpos primera etapa de la reacción, el complemento es incubado con los materiales
"naturales" para un carbohidrato expresado ampliamente en las células de que pueden contener el antigeno y el anticuerpo. Si se forman complejos antí-
otras especies diferentes de los humanos y de los primates. Si se mezcla una geno-anticuerpo, interaccionan con el complemento del mismo modo que los
alta concentración de suero con los eritrocitos de conejo se puede inducir la complejos de anticuerpo sobre el antigeno de superficie celular interaccionan
aglutinación, que puede alterar la interpretación del titulo de AH50 (Tomlinson, con el complemento. El complemento es activado, los componentes son frag-
1997). Por lo tanto, puede ser útil absorber el suero con concentrado de eri- mentados, y el complemento es "utilizado" o "fijado". En la segunda etapa, se
trocitos de conejo lavados en hielo durante 15 a 30 minutos para extraer una añaden las células de oveja sensibilizadas (EA). y la mezcla se incuba a 37 C
cierta proporción de anticuerpos naturales, disminuyendo asi la aglutinación durante una hora. Si el suero de la prueba contiene el anticuerpo contra el
celular en el ensayo. antígeno utilizado, el complemento se lija y por lo tanto no está disponible pa-
ra lisar el EA. Por ello, la ausencia de lisis indica una reacción positiva, y la
lisis completa indica un resultado negativo.
Niveles del complemento mediante
Hay dos aproximaciones generales de las pruebas de fijación del comple-
ensayos antigénicos mento. En la primera, el suero concentrado es el que proporciona el comple-
Para utilizarla en ensayos antigénico, la muestra (ya sea suero o plasma) mento, y la cantidad de complemento fijado se determina por la titulación del
se almacena congelada (20°C o menos). La contaminación bacteriana pue- suero antes y después de la fijación. En la segunda, se emplea una dilución
de originar la desnaturalización o la fragmentación de las proteínas, mientras de suero que proporciona suficiente complemento para la lisis de EA o poco
que el hielo y el deshielo no tienen un electo adverso importante sobre los más del suficiente (tres a cinco unidades CH50) En este caso, se añaden las
niveles antigénicos. En ciertos ensayos del complemento, la muestra se dilu- células sensibilizadas sin dilución posterior de la cantidad de complemento.
ye en salino para obtener el índice corréelo de concenlración para la adecua- La incubación del material del test con el complemento puede hacerse a 37 C
da cuantificación. durante una hora o toda la noche en frió. En general, la incubación en frió ori-
Los análisis antigénicos de las proteinas del complemento hacen uso de gina títulos mayores. El complemento puede activarse por un número de
una de las muchas técnicas de precipitación inmune. La inmunodifusión radial agentes diferentes de los complejos antígeno-anticuerpo como las bacterias,
simple (RID) utilizando el método ya sea de Fahey o de Mancini es el méto- endotoxinas y y-globulinas agregadas. Por lo tanto, son necesarios los con-
do empleado más frecuentemente para calcular una cuantificación específica troles pata demostrar que ni el suero ni el antígeno aislados fijarán el com-
de una proteína. En ambos métodos, el antígeno se añade a los pocilios en plemento. El test de fijación del complemento es de particular valor en tanto
un gel que contiene anticuerpo, y se forman anilos de precipitación. El méto- que no necesita que los antigenos o los anticuerpos estén presentes en su
do de Fahey emplea un anticuerpo que no está en exceso. El tiempo de difu- forma altamente purificada. Pueden utilizarse tanto antígenos solubles como
sión al que los resultados son leídos es por ello crítico. Los puntos de difusión particulados, y se pueden medir tanto los antígenos como los anticuerpos.
finales no se alcanzan y pueden levar a mediciones inadecuadas de los nive-Una aproximación alternativa al test de fijación del complemento es el empleo
les del complemento antigénico. El método de Mancini utiliza un exceso de de ensayos con ELISA que miden los productos de fragmentación de las pro-
anticuerpo en un gel y es más sensible y exacto. El método de Mancini se uti- teínas del complemento o de los complejos formados tras la activación del
liza por muchas firmas comerciales para la preparación de los cristales de complemento, como se discutió previamente. De cualquier modo, estos ensa-
 910 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados
con la prueba de fijación estándar.
CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN
DE CININAS
El sistema de generación de cininas es una vía mediadora secundaria pre-
sente en el plasma y activa en las superficies celulares que controla la gene-
ración de péptidos que son importantes en la respuesta inflamatoria. Aquí
será descrito brevemente. Para más detalles, se remite al lector a recientes
revisiones sobre el tema (Kozin. 1992: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius.
1995). El péptido biológicamente activo más importante generado por este
sistema parece ser la bradicinina, un nonapéptido con potente actividad en
muchos sistemas biológicos. Es activa en aumentar la permeabilidad vascu-
lar, vasodilatación, hipotensión, inducción del dolor, contracción de muchos
tipos de células musculares lisas, y activación del sistema de la fosfolipasa A,
con su función de activación del metabolismo del ácido araquidónico celular.
Aunque en muchas cosas se parece al sistema del complemento, el sistema
de generación de cininas del plasma es más simple debido a que está com-
puesto solo por cuatro proteínas plasmáticas. Los elementos tisulares tam-
bién generan cininas.
Las principales proteínas del sistema de generación de cininas comprendi-
das actualmente son el factor de Hageman. el factor de coagulación XI, la pre-
calicreína y el quininógeno de alio peso molecular. El factor XI circula en el
plasma como un complejo con el quininógeno de alto peso molecular con una
relación molar de 2:1. La precalicreína también circula en un complejo con el
quininógeno de alto peso molecular con una relación molar de 1:1. En con-
traste, el factor de Hageman circula como una proteína plasmática de cade-
na simple, no formando complejos.
Al igual que en la secuencia de activación del complemento, la secuencia
de generación de cininas sigue una vía específica. Interaccionando con su-
perficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente
con cristal o naturalmente con muchos materiales activos biológicamente co-
mo el lipido A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de
Hageman es degradado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa)
tiene actividad proteolítica y después activa y degrada las moléculas del tac-
tor de Hageman adicionales para generar más aHFa. La degradación de la
cadena simple del factor de Hageman (peso molecular de 80 kDa) libera las
cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y 28 kDa. respectivamen-
te) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar enzimático activo
del factor de Hageman reside en la cadena ligera.
Muchas enzimas proteolíticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y
activar al factor de Hageman. El «HFa mteracciona con el complejo del fac-
tor XI y el quininógeno de alto peso molecular para activar el factor XI a fac-
tor Xla, originando la activación de la cascada intrínseca de la coagulación. El
«HFa también interacciona con el complejo quininógeno de alto peso mole-
cular-precalicreina para degradar la cadena simple de la precalicreína en una
molécula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas por puentes
disulfuro. La precalicreína degradada tiene actividad enzimática proteolítica
localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones
ocurren mucho más eficazmente cuando las proteínas se unen a superficies
cargadas negativamente, las cuales son críticas para la activación de la cas-
cada. La calicreina activada degrada al qummogeno de alto peso molecular
en muchos lugares, liberando bradicinina.
La calicreina activa, generada por la degradación de la precalicreína, tam-
bién es capaz de degradar posteriormente el «HFa a un producto de menor
peso molecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede
degradar y activar al complejo quininógeno de alio peso molecular- precali-
creína pero no permanece en la superficie de unión y no interacciona eficaz-
mente con el complejo quininógeno de alto peso molecular-factor XI.
La bradicinina tiene una vida media corta ya que se inactiva rápidamente
por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina carboxi-terminal para for-
mar des Arg bradicinina. Esta molécula ya no tiene la actividad de la bradici-
nina de contraer el músculo liso y no puede inducir la salida de líquido vas-
cular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos de sus
efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es degradada por la en-
zima convertidora de angiolensma para formar péptidos de bajo peso mole-
cular que pierden su actividad biológica.
Los inhibidores del sistema de generación de cininas incluyen el C1 inhi-
bidor, la «,-macroglobulina, y el «.-proteasa inhibidor El Cl inhibidor y la
«¿-macroglobulina son los principales inhibidores de la calicreina activa,
ejerciendo el C1 inhibidor la influencia más potente. El C1 inhibidor y la
«,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hageman activo.
El angioedema hereditario resulta de la deficiencia genética o adquirida del
C1 inhibidor. Se cree que las características clínicas asociadas con esta en-
fermedad surgen de la pérdida del control adecuado del sistema de genera-
ción de cininas por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998)
También existen en el plasma los quminógenos de bajo peso molecular y
pueden actuar como sustrato de la bradicinina. Los quminógenos no son fáci-
les de degradar por la calicreina del plasma, pero las calicreinas tisulares pre-
sentes en las células pueden degradar el quininógeno de ba|0 peso molecular
a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente, la lisil-bradiciní-
na sufre la misma vía de degradación que la bradicinina,
Se ha postulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de en-
fermedades. La bradicinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el
fluido nasal en la rinitis. También se ha sugerido un papel patogénico para la
bradicinina en enfermedades que van desde el asma al angiodema heredita-
rio, asi como otras clases de enfermedades edematosas incluyendo la infla-
mación. Está claro que no se conoce totalmente el papel exacto del sistema
generador de cininas en las enfermedades. Sin embargo, la brad cinina y sus
derivados indudablemente son importantes en el edema y el dolor asociados
con la inflamación.
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 C A P Í T U L O
Gtocinas y moléculas
de adhesión
• H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S.
• Richard A. McPherson, M.D.
CITOCINAS 914
lnterleucina-1
lnterleucina-2
lnterleucina-3
lnterleucina-4
lnterleucina-5
lnterleucina-6
lnterleucina-7
lnterleucina-8 y las quimiocínas
lnterleucina-9
lnterleucina-10
lnterleucina-11
lnterleucina-12
lnterleucina-13
CITOCINAS
La secreción y la unión de las citocinas es el equivalente celular a estar
"en línea". El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un
Internet" de comunicación entre las células. Las señales de las citocinas
son recibidas sobre la superficie celular y no sólo como simples mensajes,
sino también como combinaciones complejas e imperceptibles sinérgicas y
antagónicas que regulan procesos como la respuesta inmune, la migración
celular y la cicatrización de las heridas. Para responder a los mensajes
específicos de las citocinas, las células despliegan miles de receptores de
superficie de citocinas, presentados como múltiples antenas. Utilizando
estos receptores, las células seleccionan, procesan y responden a combi-
naciones de citocinas solubles y de unión a sustratos de manera depen-
diente de la densidad y el estado de activación de los receptores de super-
ficie. El término "citocina" se refiere a los productos solubles de las "células"
en senlido genérico. Muchos tipos celulares son capaces de producirlas,
pero para la mayor parte son la célula T y el macrófago las factorías virtua-
les de citocinas. y por esta razón muchas familias de citocinas se conocen
como interleucinas (IL).
Aunque los bioanálisis son a veces el método de referencia para la detec-
ción de la actividad de las citocinas, normalmente llevan mucho tiempo y son
difíciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equipos de ensayo con
enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) están ampliamente disponibles
para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las técnicas moleculares
(reacción en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridación ¡n situ) se emplean
en laboratorios más modernos para identificar la presencia de citocinas con
alta sensibilidad y para localizar más precisamente una citocina de un tipo
celular particular.
En los años recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero sólo se pre-
sentan aquellas para las que se conoce suficiente información.
39
lnterleucina-14
lnterleucina-15
lnterleucina-16
lnterleucina-17
lnterleucina-18
Factor transformante del crecimiento |i
Factor de necrosis tumoral
Interferón-y
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR 922
Integrinas
Selectinas
PERSPECTIVAS 924
BIBLIOGRAFÍA 924
lnterleucina-1
La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres proteínas: la IL-1r/. y la IL-1|3
(los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA),
un antagonista específico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello,
1998). Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflama-
torias han sido mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la
IL-115 son sintetizadas como proteínas precursoras intracitoplasmáticas de
31 kDa que son degradadas para generar las formas biológicamente acti-
vas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convertida en su forma activa a través de
la acción de proteasa extracelulares, aunque la proforma no degradada
puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberada por los
queratinocitos, por las células T colaboradoras tipo II (Th2) o por los timo-
citos. La pro-IL-l f5 se convierte intracelularmente en su forma biológica-
mente activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima aso-
ciada a la apoptosis.
Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 kDa
ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la señal cuando se une tan-
to a IL-1 a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa más restringido (para
neutrófilos, monocitos y células B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la señal
intracelular, incluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo
tanto se ha descrito como un receptor "señuelo" que actúa como un "escon-
dite" para las moléculas de IL-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se
asocia con una proteina accesoria (IL-1 RAcP). Juntos señalizan el núcleo a
través de muchas vías de cinasas de proteínas asociadas a macrotúbulos
(MAP) que activan los factores de transcripción nuclear incluyendo el factor
nuclear (NF) K(Í. entre otros (O'Neill, 1996). La molécula antagonista IL-IRA
es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la señal de transducción
intracelular.
Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatorias, la
IL-1 exhibe miles de efectos biológicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el
 CAPÍTULO 39 • CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
complejo mayor de histocompatibilidad antígeno.'receptor de células T
(MHC/TCR) mediando la activación de las células T como un componente
importante de señal no conocida, y aumenta la actividad de las citocinas deri-
vadas de la célula T como la IL-2 a través de la regulación a la alta del recep-
tor de IL-2. La IL-I estimula la proliferación de la célula progenitora hema-
topoyética (CPH) en sinergia con los factores estimulantes de colonias
hematopoyéticos, y cuando se administra aislada moviliza neutrofilia deriva-
das de la médula ósea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en pro-
mover el crecimiento y proliferación de algunas lineas celulares leucémicas,
pero es citotóxica directamente para algunas células mlecladas por virus y
para algunas células tumorales.
La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del ácido araquidó-
nico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos
como intermediarios, y su capacidad para inducir la producción y liberación
de cantidades de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinfla-
matoria. En los lugares de inflamación, la IL-1 origina una regulación a la
alta de los receptores de moléculas de adhesión sobre el endotelio vascu-
lar y estimula la producción de quimiocinas conduciendo a la acumulación
local de leucocitos. En situaciones de alergia como la hipersensibilidad Tipo 1,
la IL-1 puede aumentar la liberación de histamina de los basófilos y eosinó-
filos, contribuyendo esto a la broncoconstricción al estimular al músculo liso
vascular.
La IL-1 es responsable de la producción de reactantes de fase agua por
el hígado (p. ej.. complemento, péplido C reactivo) a expensas de proteínas
transportadoras como la albúmina. Para pagar el coste de los aminoácidos
de la síntesis masiva de péptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular,
acontecimiento que explica la mialgia que acompaña a algunas enfermeda-
des. La IL-1 contribuye a la dilatación vascular y a la hipotensión en el cho-
que séptico a través de la inducción de óxido nítrico (NO) en las células
endoteliales. y también puede ser un significativo mediador del choque car-
diogénico.
En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promueve la fiebre, la añore-
xia, el sueño de ondas lentas y la letargia, así como la liberación de corticoï-
des del hipolálamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la prolifera-
ción de células sinoviales. el depósito de colágeno, la resorción del cartílago
y el hueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias
como la artritis reumatoide (AR).
Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1 origina profun-
das reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas por las dosis
bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompañante de la hematopoye-
sis, que puede disminuir el punto más bajo y acortar el periodo de supresión
medular en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991).
Sin embargo, el efecto beneticioso de la administración de IL-1 está limitado
por su profunda toxicidad.
Un nivel elevado de IL-IRA puede ser más sensible como marcador de
actividad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1.
El aumento de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio,
los procedimientos de cirugía general, y en personas asintomáticas que tie-
nen el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Además, la
severidad de la enlermedad a menudo es mejor indicada por los niveles de
IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Esto puede ser cierto en enfermedades
del hígado, en estados autoinmunes y en enfermedades infecciosas (Dina-
relio, 1996,1998).
La elevación del IL-1 RA puede representar un importante esfuerzo para
minimizar los intensos efectos tóxicos de los niveles sistémicos aumentados
de IL-1: la inyección de IL-1 RA en ratones justo antes de darles endotoxina
intravenosa aumentó la supervivencia. La IL-1 RA administrada a pacientes
con choque séptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependiente
medida al día 28, pero este efecto no se observó uniformemente en ensa-
yos posteriores más grandes (Fisher, 1994). El mejor éxito con la terapia
con IL-1 RA se obtuvo en un gran estudio doble ciego completado en pacien-
tes con artritis reumatoide. Los resultados indicaron una reducción depen-
diente de la dosis de IL-1 RA en el edema articular, y una reducción significa-
tiva en las nuevas erosiones óseas (Bresnihan, 1998). Otros ensayos clínicos
que evaluaban la eficacia de la administración de IL-1 RA en la enfermedad
injerto contra huésped (EICH) cortico-resistente mostraron una mejora en la
mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).
915
lnterleucina-2
La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminoácidos, miembro
de la familia de las citocinas de cuatro hélices-!/ (Bazam, 1990), con dos
puentes disulfuro en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido
secuenciado en el cromosoma 4. La activación de las células T y la liberación
de la IL-2 resulta de la interacción entre el TCR y el anligeno presentado en
asociación con las moléculas de MHC sobre las células presentadoras de
antigeno (APCs) (Fraser, 1991).
El receptor para la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito com-
puesto por una cadena o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 kDa y una
cadena y de 64 kDa (Waldmann. 1998). El IL-2R existe en tres formas mole-
culares: un complejo de alta afinidad para las subunidades a. [J. y y. un com-
plejo de afinidad intermedia de las subunidades |i y y, y un receptor de baja
afinidad hecho solo de IL-2Ru.
Solo el IL-2R</|ly y el IL-2R|iy son capaces de Iransducir la señal tras la
unión con el ligando. En las células T y en las células asesinas naturales (NK).
la IL-2 activa vías mtracelulares incluyendo la JAK-1 y la JAK-3 de la familia
de las cinasas Jane, que actúan a su vez en sus sustratos. STAT-3 y STAT-5.
de transductores de la señal y activadores de la familia de Iranscnpcion de los
factores de transcripción. Los genes diana de las vías de señalización activa-
das por IL-2 incluyen el bcl-2. c-myc. c-jun. y c-los (Gómez, 1998).
Ya que comparten las cadenas ot y y de las subunidades del receptor, la IL-2
y la IL-15 tienen actividades biológicas solapadas. Junto con la IL-15. la IL-2
estimula la proliferación in vitro de las células T CD4/CD8+ activadas, las sub-
poblaciones de células T y/5, y las células NK (Burlón, 1994), mientras que
promueve la función citolítica de los linfocitos T citóxicos (LTCs) y de las célu-
las asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Burton, 1994; Grabstein. 1994).
Además, ambas citocinas pueden inducir la proliferación de las células B esti-
muladas, y la síntesis de IgM. La IL-2 es también quimiotáctica para las célu-
las T (Wilkinson. 1995: Armitage. 1995).
In vivo, la IL-2 puede jugar un papel indispensable en el mantenimiento de
tolerancia a lo propio, ya que los animales con déficit de IL-2 desarrollan
enfermedades de inmunodeficiencia y autoinmunes como la anemia hemoliti-
ca y la enfermedad inflamatoria intestinal (vVillerford, 1995). Los ratones sin
IL-2R-|5 desarrollan espontáneamente activación de células T y diferenciación
celular plasmática de células B. con aumento de los niveles séricos de IgG e
IgE (Suzuki, 1995: Wang. 1996). Esto sugiere que la IL-2 puede provocar la
inducción a la anergia o a la apoptosis en la muerte celular de células T por
activación (AICD).
La readministración de linfocitos infiltrantes de tumor aislados (TIL) que han
sido expandidos y activados in vitro con IL-2 y OKT3. con infusiones farma-
cológicas de dosis de IL-2. son terapias prometedoras para los tumores malig-
nos inmunogenicos como el melanoma maligno (Goedegebuure. 1995). La
actual terapia inmunosupresora para los receptores de alotransplantes inclu-
ye los inmunosupresores ciclosporina A, FK-506, y Rapamicina. Estos agen-
tes se unen a las dianas inmunofilinas inlracelulares, creando un complejo fár-
maco-inmunofilina que bloquea la capacidad del factor nuclear de las células
T activadas (NF-AT) de activar los genes de la IL-2 necesarios para la proli-
feración de las células T, y otros genes necesarios para la activación de las
células B (Ho. 1996), produciendo asi inmunosupresión.
lnterleuc¡na-3
La actividad de la IL-3 fue detectada por primera vez en cultivos de linfo-
citos espíemeos de ratón, donde inducía a la enzima 20-i/-hidroxiesteroide
deshidrogenasa (Ihle, 1981). Es una proteína de 26 kDa sometida a un
estricto control regulador y expresada en una población de células restrin-
gida que incluye las células T activadas, las células NK. los mastocitos y
algunos megacariocitos (Blalock, 1999). La síntesis adecuada de IL-3
requiere la activación de las células T a través del complejo TCR'CD3 Esto
inicia las vías mtracelulares conduciendo a la activación del NF-KB, que se
introduce en el núcleo para transactivar la expresión del gen IL-3 (Park,
1993: Link, 1992).
El receptor de IL-3 (IL-3R) es un miembro de la familia génica de los recep-
tores de citocinas y tiene una cadena |5 específica de ligando asociada no
covalentemente con una cadena de transducción de señal |i. El gen que la
codifica ha sido secuenciado en el cromosoma 5 (Blalock. 1999)
 916 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Las células diana de la IL-3 incluyen los precursores in vilro de las células T
y células B. La administración in vivo de IL-3 a dosis farmacológica origina un
aumento de la producción de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en ratones,
mientras que la sobreexpresión de IL-3 mediada por retrovirus en las células
medulares conlleva el desarrollo de un síndrome míeloproliferativo no neo-
plásico (Metcalf. 1986; Chang, 1989). Se ha sugerido un papel para la IL-3 en
el desarrollo de la hipersensibilidad por contacto, ya que los ratones con défi-
cit de IL-3 muestran un desarrollo escaso de la hipersensibilidad retardada del
tipo hapteno específico (Mach. 1998). Además, evidencias muestran un papel
para la IL-3 en el desarrollo normal del SNC (Chiang. 1996).
lnterleucina-4
La IL-4 (Paul, 1991) desarrolla importantes funciones en la regulación de la
producción de anticuerpos, en la hematopoyesis, en la inflamación y en el
desarrollo de las respuestas T celulares efectoras. Es una proteína compleja
con muchos puentes disulfuro intramoleculares y muchos lugares de glicosi-
lación cuyo gen ha sido secuenciado en el cromosoma 5. La producción de
IL-4 está altamente regulada y se restringe a las poblaciones de células T acti-
vadas, mastocitos, basótilos y eosinófilos.
Los efectos biológicos de la IL-4 están mediados a través de receptores de
IL-4 de alta afinidad (IL-4R) compuestos por una cadena a. específica de
ligando, y una cadena y de señal de transducción compartida por muchas
otras citocinas incluyendo la IL-7 y la IL-2. El dominio extracelular del IL-4R
tiene homología con el IL-5Ra y con el IL-6R.
La IL-4 activa las células B y promueve su diferenciación, reflejando el
hecho de que la IL-4 fue descrita por primera vez en los sobrenadantes de
cultivos de células T activadas y factor de crecimiento de célula B duplicado.
Además de inducir la expresión de CD23 y moléculas de MHC en las células
B, regula la apoptosis de las células B y el cambio de isotipo. particularmen-
te de lgG1 a IgE (Brown. 1997). En el conjunto de la hematopoyesis, la IL-4
estimula la formación de colonias por los precursores eritroides, megaca-
riocíticos. mastociticos y granulocito/monocíticos, mientras promueve el
desarrollo de poblaciones Th CD8+ y CD4+ (Sillaber, 1991; Erard, 1993).
En la respuesta inflamatoria, la IL-4 induce la proliferación de células endo-
teliales, y origina una regulación a la alta de las moléculas de adhesión celu-
lar del endotelio. Activando el endotelio de esta forma, la IL-4 permite el
aumento de la adhesión leucocítica a la superficie de los vasos de modo que
las células inflamatorias migran a los lugares de inflamación local. Además, la
IL-4 es quimiotáctica para los eosinófilos y facilita la citotoxicidad de los mono-
citos y de las células T (Tepper, 1989; Crawford. 1993).
Se encuentra un aumento de los niveles de IL-4 en enfermedades alérgi-
cas como la dermatitis atópica y en la fiebre del heno, y los ratones transgé-
nicos para la IL-4 desarrollan un trastorno alérgico en el párpado (Tepper,
1989). La IL-4 también puede conferir un grado de protección ante algunos
parásitos extracelulares, y disminuir el daño de las respuestas autoinmunes
inhibiendo las respuestas prolongadas de células T (Finkelman, 1986; Rapo-
port, 1993).
La IL-4 participa en la inmunidad tumoral ya sea promoviendo a las células
NK efectoras o la actividad tumorícida de los macrófagos (Bosco, 1990). Al
mismo tiempo, la IL-4 está implicada en el crecimiento de las leucemias de
células T humanas in vilro. Como está asociada con un cambio de las células
efectoras CD8+ a células no citotóxicas, la IL-4 puede jugar un papel en la pro-
gresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Erard, 1993).
Los niveles elevados de IL-4 en las lágrimas y en la sangre de pacientes
atópicos determinados por ELISA sugieren un papel para la IL-4 en la enfer-
medad alérgica y puede servir como marcador de severidad de la enferme-
dad (Páranos, 1998: Fujishima, 1995).
lnterleucina-5
La IL-5 es un homodímero unido por disulfuros de 45 kDa. 134 aminoá-
cidos, que juega un papel central en la maduración, activación y supervi-
vencia de los eosinófilos, y en el desarrollo de enfermedad atópica y eosi-
nofilia. El gen IL-5 reside en el cromosoma 5 en un grupo de genes que
codifican la IL-3, la IL-4 y el factor estimulante de colonias de granulocitos-
macrófagos (GM-CSF). Estructuralmente, está relacionado con el grupo de
citocinas a-helicoidal (Milburn, 1993). El receptor para la IL-5 (IL-5R) consis-
te en una cadena u específica de ligando y una cadena |5 de transducción de
señal común a los receptores para la IL-3 y GM-CSF (Tavernier. 1991). Los
dominios intracitoplasmáticos de las subunidades </. y \i contiene regiones
implicadas en la unión del JAK-2 y el JAK-1. respectivamente, que son nece-
sarios para la transducción de señales. No se ha descrito completamente la
total distribución tisular del IL-5R. pero parece estar restringida a los basólilos
y eosinófilos.
La IL-5 es producida por las células Th2 que liberan la cilocma cuando son
estimuladas apropiadamente. Los mastocitos. las células NK. las células B,
los eosinófilos, las células malignas y algunas células transformadas por virus
son capaces también de secretar IL-5. La IL-5 promueve la diferenciación, la
migración, la activación, la degranulación y la supervivencia de los eosinófi-
los. Estudios en ratones implican a la IL-5 aislada en la estimulación de la pro-
ducción de eosinófilos in vivo (Tominaga. 1991; Dent, 1990). La IL-5 es res-
ponsable de la inducción de la acumulación, activación y degranulación de los
eosinófilos tras el contacto antigénico, posiblemente a través de su gran acti-
vidad quimiotáctica, de su capacidad de producir una regulación a la alta de
ciertas moléculas de adhesión presentes en los eosinófilos como CD11b. y
promoviendo la liberación de granulos de IgG inducida (Wang, 1989: Walsh,
1991; Fujisawa. 1990).
El papel de la IL-5 en la enfermedad humana puede incluir la producción
de daño en la membrana basal observado en el penfigoide ampollóse pro-
mover la infiltración eosinófila en los lugares de infestación parasitaria, y pro-
mover la producción de anticuerpos del receptor de la antitirotropma en la
enfermedad de Graves. Además, la eosinofilia local de la enfermedad de
Hodgkin puede estar asociada con la capacidad de las células de Reed-Stern-
berg de liberar IL-5. En las respuestas alérgicas, la IL-5 liberada por los mas-
tocitos lisulares puede servir para promover la acumulación de eosinófilos en
los tejidos (revisado en Lalani. 1999).
Actualmente, se emplea el ELISA para la medición in vilro de la IL-5, y las
técnicas de inmunofluorescencia permiten la localización de IL-5 en células
especificas, mientras que la hibridación in silu permite la precisa localización
de la IL-5 en las células individuales.
lnterleucina-6
La IL-6 fue identificada inicialmente en los sobrenadantes de cultivos de
células T cooperadoras como un agente capaz de inducir la proliferación de
una inmunoglobulína secretada por las poblaciones de células B. Sin embar-
go, sus acciones se extienden a muchas células diana y ahora se reconoce
como una citocina importante inmune, hematopoyética y proinflamatoria (Hi-
rano. 1998). La IL-6 es secretada como un péptido de 184 aminoácidos de
alrededor de 21 kDa, dependiendo de su grado de glicosilación. El gen que
codifica la IL-6 ha sido secuenciado en el cromosoma 7 (Hirano, 1986). La
molécula de la IL-6 se caracteriza por cuatro asas a-helicoidales conectadas
por asas de péptidos interpuestas (Bazan, 1990).
El complejo del receptor de la IL-6 (IL-6R) (revisado en Hirano, 1998) es un
miembro de la supertamilia de receptores de citocinas y está compuesto de
una cadena de unión a específica de ligando de 80 kDa (IL-6R«) y una cade-
na de señalización |i no asociada covalentemente. la gp130. La subunidad (i
es compartida por otros receptores incluyendo los de la IL-11 y del GM-CSF,
y se marca por cuatro residuos conservados de cisteina y un dominio triptó-
fano-serina-X-triptófano-serina en su región amino-terminal. Esto puede
explicar en la redundancia funcional observada en las actividades de estas
citocinas. El complejo IL-6R combinado forma un receptor de alta afinidad
para la IL-6. permitiendo la señal de transducción a través de las vías de la
JAK/STAT.
Una variedad de células producen IL-6, incluyendo las células T y las célu-
las B, los monocitos y macrólagos, los fibroblastos, los queratinocitos, los
sinoviocitos, los condrocitos y las células endoteliales. La IL-6 actúa sobre las
células T, los hepatocitos, los progenitores hematopoyéticos y las neuronas.
Es un potente factor de crecimiento para las líneas celulares del míeloma y
el plasmocitoma humano, y tienen una acción autoenna y paracrina sobre
los mielomas humanos trasplantados al ratón. En los hepatocitos. la IL-6
estimula la producción de varios reactantes de fase aguda, y en los ratones
knockout por IL-6. están muy disminuidas la liberación de reactantes de la
lase aguda y de Ig.
 CAPÍTULO 39 • CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
En las células hemalopoyéticas, la IL-6 origina la proliferación y diferencia-
ción de células T, aumenta la formación de colonias de progenitores hemato-
poyéticos multipotenciales e induce la maduración de los megacanocitos.
Estimula la formación de osteoclastos, la proliferación de las células del mús-
culo liso vascular, e induce la producción del factor de crecimiento derivado
de las plaquetas (PDGF). En el SNC, la IL-6 permite la supervivencia de las
neuronas colinérgicas, mientras que en el sistema reproductor induce la
secreción de gonadotropina coriónica humana (hCG) por el trofoblaslo.
Han sido observadas alteraciones en la producción de IL-6 en pacientes
con AR, y se ha demostrado una significativa correlación entre las concentra-
ciones de IL-6 e IgG en el líquido sinovial de pacientes con AR (Hirano. 1988;
Hermana 1989). En los modelos animales, la administración de IL-6 parece
participar en el desarrollo de la glomerulonelritis membranosa proliferatíva
acelerada, simulando cambios encontrados en pacientes con lupus eritema-
toso sistémico (LES) (Rytfel. 1994). Otros estudios en ratones transgénicos
sugieren un papel para la IL-6 en la aparición de la diabetes tipo I y en la
generación de los plasmocitomas monoclonales malignos (Suematsu, 1989;
Hirano, 1991). La evidencia clínica sugiere que la determinación de los nive-
les séricos de IL-6 en neonatos (Kusler, 1998) y en los pacientes con cáncer
en quimioterapia (de Bont, 1999) puede ayudar a identificar aquellos neona-
tos con riesgo inminente de sepsis, y aquellos pacientes cuyos episodios
febriles se deben a la quimioterapia más que a la sepsis.
lnterleucina-7
La IL-7 se identificó por primera vez como una glicoproteína murina de
25 kDa que mostraba electos poliferativos in vilro en las células pre-B
(Ñamen, 1988). Aunque inicialmente se describió como un factor de creci-
miento de las células B, después se encontró que la IL-7 era crítica tanto para
la linfopoyesis de las células T como B, así como para movilizar las células
progenituras mieloides (Grzegorzweski, 1994). En humanos, el ácido ribonu-
cleico mensajero (ARNm) de la IL-7 ha sido detectado en órganos inmunes y
hematopoyéticos, como el timo, el bazo, la médula ósea y el hígado fetal
(Komschhes. 1995) La atocina activa es producida por los queratinocitos epi-
dérmicos, las células epiteliales intestinales y las células estromales de la
médula ósea y el timo.
El receptor de la IL-7 (IL-7R) es un miembro de la superfamilía de recepto-
res de la hematopoyetina, teniendo una cadena y en común con los recepto-
res de las interleucinas, -2. -4, -7. -9 y -15, lo que explica en parte los efec-
tos solapados y redundantes que estas citocinas tienen en las poblaciones de
células T. El IL-7R ha sido identificad tanto en células mieloides como linfoi-
des (Foxwell. 1992)
Los ratones transgénicos para la IL-7 desarrollan un aumento del número
de células B y T y de sus progenitores. Los anticuerpos neutralizantes para el
IL-7R administrados a ratones originan una gran disminución del número de
timocitos, y células de linaje B medulares, con disminución del número de
células B y T en el bazo y en los ganglios linfáticos (Peschon, 1994). Los rato-
nes knockout para la IL-7 y el IL-7R muestran aún mayores reducciones de
las mismas poblaciones celulares. Debido a esta importante función linfopo-
yética, la IL-7 acelera la reconstitución de las células T y B en los ratones
irradiados letalmente. con mínimos efectos en el compartimento mieloide. La
IL-7 estimula el crecimiento y aumenta la actividad citotóxica sobre las célu-
las T maduras y las células T citotóxicas, respectivamente. In vitro. las célu-
las T aisladas de la lámina propia intestinal proliferan en respuesta a IL-7 exó-
gena y muestran un aumento de la capacidad de responder a anticuerpos
anti-CD3 y a IL-2, sugiriendo un papel para esta citocina en el aumento de las
respuestas inmunes mediadas por células (Watanabe, 1995).
Se han sugerido papeles clínicos para la IL-7. Estos van desde aumentar
los compartimentos de las células T de aquellos que padecen SIDA, hasta el
tratamiento de cánceres a través del aumento de la actividad LAK.
lnterleucina-8 y las quimiocinas
La IL-8. un miembro de la superfamilia de las quimiocinas, es responsable
de la acumulación de neutrófilos en los lugares de inflamación (Hoch. 1996)
Induce la traslocación del calcio, la quimiotaxis, el cambio de tipo, la polime-
rización de la actma. y posiblemente también la actividad de 'a cadena respi-
917
ratoria en los macrófagos También es quimiotáctica para los basófilos y para
un subgrupo de células T CD4/CD8+.
Muchos tipos de células producen el pequeño peptido IL-8 incluyendo las
células endoteliales, las células epiteliales, los fibroblastos, los neutrófilos. los
monocitos. los macrófagos y las células T y. dependiendo de la célula de ori-
gen, la IL-8 variará en la longitud de aminoácidos. Tras la degradación prote-
olitica de su secuencia precursora de 99 aminoácidos, la IL-8 es secretada
por las células endoteliales existentes predominantemente como una protei-
na de 77 aminoácidos y como una proteina de 79 aminoácidos cuando es pro-
ducida por los leucocitos mononucleares.
La IL-8 es liberada en respuesta a varios estímulos como los lipopoiisacan-
dos (LPS) y los leucotrienos, y aunque puede existir como un homodimero uni-
do no covalentemente, tiene su gran actividad quimiotáctica como un monome-
ro (Paohni. 1994). Dos receptores con significativa homología en los
aminoácidos median los electos biológicos de la IL-8: el receptor A de IL-8 (IL-
8RA) y el receptor B de IL-8 (IL-8RB), que difieren en su afinidad por el ligando.
El IL-8RA aparentemente tiene mayor afinidad y especificidad por el ligando,
mientras que IL-8RB muestra menor afinidad y especificidad por el ligando y es
capaz de unirse a otras proteínas quimioatrayentes relacionadas con la IL-8.
La inyección intradérmica de IL-8 origina una intensa e inmediata infiltra-
ción de neutrófilos alrededor de las venas con un exudado de plasma local.
Para alcanzar las áreas de inflamación, sin embargo, los leucocitos deben
primero atravesar el endotelio local. Esto está en parte facilitado por la IL-8.
que altera la expresión de integrinas neutrofilicas activando el CD11Ó/CD18
a su conformación de alta afinidad, y dispara la expresión de la L-selectina.
La IL-8 puede formar parte del gradiente quimioatrayente regulado a la alta
unido a la superficie celular de las células endoteliales vecinas a la inflama-
ción que siguen los leucocitos activados. Como proteina soluble, la IL-8 for-
ma un gradiente quimiotáclico en los tejidos, guiando a los leucocitos extra-
vasados a los lugares de inflamación. Además de la secreción de IL-8
inmediatamente tras su producción, la IL-8 puede ser almacenada en los
cuerpos de Weibel-Palade. donde está disponible para la liberación inmedia-
ta independíente de su síntesis (Rot, 1996). Interesantemente, aunque actúa
predominantemente como quimiotáctica. el aumento de los niveles de IL-8 en
el sistema circulatorio está asociado con la disminución de la acumulación de
neutrófilos en los lugares de inflamación, aunque se observa una neutroM ¡a
sistémica (Hechtman. 1991). Esto también sugiere una (unción antiinflamato-
ria para la IL-8.
Los estudios han destacado el papel de la IL-8 en varios estados inflama-
torios desde la artritis crónica a la sepsis. Algunos han sugerido medir los
niveles de IL-8 en orina como medida para monitonzar la severidad de la
enfermedad glomerular (Wada. 1994).
Desde la identificación de la IL-8 como la primera quimiocina en 1987. la
superfamilia de las quimiocinas ha sido una colección de pequeñas molécu-
las solubles siempre en aumento importantes para la migración de los leuco-
citos a los lugares de inflamación. Las quimiocinas desarrollan su papel efi-
cazmente y con gran especificidad por medio de la activación de integrinas
leucocitarias, particularmente la LFA-1, la MAC-1 y la VLA-4. para unir el
ICAM-1 y el VCAM-1 de las células endoteliales. Las quimiocinas son críticas
en la hematopoyesis, en la angiogénesis, en la activación de las células T y
las células NK, en la patogénesis del VIH y en el desarrollo del SNC
La superfamilia se divide actualmente en cuatro familias basadas en la
posición de sus primeras y segundas cuatro cisteinas en la secuencia de ami-
noácidos. La lamilia CXC (familia u) tiene un aminoácido que separa las pri-
meras dos cisteinas: la familia CC (familia |i) no tiene aminoácidos intercala-
dos; en la familia C (y), los miembros han perdido las cisteinas una y tres; y
la familia de quimiocinas CX3C (6) tiene tres aminoácidos intercalados.
La familia CXC se divide posteriormente en miembros que tienen un resi-
duo E-L-R en su secuencia amino-terminal. y que poseen actividad angiogé-
mca y actividad quimiotáctica neutrofílica.
La familia de quimiocinas CC contiene miembros quimiotácticos para los
monocitos, los linfocitos, los eosinófilos, los basófilos, los mastocitos y las célu-
las NK. Sus miembros pueden también regular la hematopoyesis en la cavidad
medular, e inducir la degranulación de los mastocitos y los eosinófilos. La linfo-
tactina es el único miembro de la familia de quimiocinas C. Tiene su mayor
expresión en el timo, donde sirve para reclutar precursores de células T inma-
duros de la médula ósea. Aún no se ha definido otras funciones para esta qui-
 918 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
miocína. La familia de quimiocinas CX3C también tiene un solo miembro en la
actualidad, la fractalcina (la neurotactína). Es diferente de las otras quimiocinas
en que es relativamente grande, con 373 aminoácidos, con el dominio quimio-
cina encontrado en los primeros 76 residuos. Anclada a las superficies celula-
res por un tallo tipo-mucina, la porción extracelular puede ser liberada de la
superficie celular para actuar como quimiotáctica para los monocitos, las célu-
las T y las células NK in vitro. Se ha sugerido un papel para la fractalcina en el
proceso inflamatorio debido a su regulación a la alta del endotelio en el SNC de
ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), en presencia de
factor de necrosis tumoral (TNF). Ya que la fractalcina también se expresa en el
cerebro normal, también puede jugar aquí un papel no patológico.
La mayoría de las quimiocinas se encuentran en la familia CC, mientras
que las familias C y CX3C tienen solo un miembro cada una. Las quimiocinas
ejercen sus efectos a través de la unión a miembros de la superfamilia de
receptores de siete dominios transmembrana, una familia de moléculas aco-
pladas a la proteína G que crece rápidamente. Las células no inmunes como
los fibroblastos y las células del músculo liso vascular pueden también pro-
ducir y liberar quimiocinas para dirigir a las células inflamatorias a los lugares
de inflamación, y pueden responder ellas mismas a las quimiocinas.
Las quimiocinas pueden promover la progresión de enfermedades. En la sep-
sis, la IL-8 es central en la acumulación de neutrófilos en varios órganos, y en la
progresión del desarrollo del estado final de enfermedad. Otras quimiocinas
incluyendo RANTES (reguladas en activación células T, normales expresadas y
secretadas), GROi/. y la MIP-1u son activas en el choque séptico, y puede pro-
porcionar dianas para la intervención terapéutica. En las respuestas granuloma-
losas, la presencia de MIP-1« se correlaciona con la formación de granulomas.
Del mismo modo, en la EAE, el modelo animal de la esclerosis múltiple, la pro-
gresión y la recaída de la enfermedad está afectada positivamente por la admi-
nistración de anticuerpos neutralizantes para la MIP-1u y la MCP-1.
lnterleucina-9
La proteína IL-9 humana todavía no ha sido purificada, pero a través de la
expresión del ADNc (Renauld, 1990) se cree que la proteína madura contie-
ne 144 aminoácidos con cuatro lugares de glicosilación potencial. Su gen se
ha secuenciado en el cromosoma 5, donde los genes de otros factores de cre-
cimiento y de los receptores de los factores de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-5,
GM-CSF y CSF-1R) se agrupan.
El ADNc para el receptor de IL-9 (IL-9R) codifica una cadena ot de 522
aminoácidos especifica de ligando miembro de la superfamilia de receptores
hematopoyéticos, que se asocia con una cadena y de señalización de trans-
ducción que es compartida con la IL-2, IL-4. IL-7 y la IL-15. El hecho de que
haya una subunidad del receptor común utilizada por estas citocinas puede
explicar algunas de las redundancias de la actividad observadas entre ellas.
Una vez unida a la IL-9, la cadena y recluta la actividad de la tirosina cinasa
JAK-3 (de la familia de las cinasas Jano), mientras que la IL-9Roc se asocia
con la JAK-1. También puede presentar un papel para la proteina de adapta-
ción 4PS/IRS2 (Yin, 1995).
En humanos, la expresión de IL-9 está aparentemente limitada a las pobla-
ciones de células T CD4+ CD45 RO positiva (células T memoria), y a las célu-
las T CD45-RA+ en presencia de IL-4 e IL-10 (Houssiau, 1995). Se requiere
una cascada de citocinas que incluya la IL-2, la IL-4 y la IL-10 para mediar su
expresión. Además, el virus tipo 1 linfotrópico de células T humanas (HTLV-1)
transformante de células T constitutivamente produce IL-9 en respuesta a una
ruta de inducción aún desconocida.
El papel fisiológico de la IL-9 en las células normales lodavía no es cono-
cido, pero las células T aisladas en fresco en cultivos a largo plazo responden
a la larga a una actividad de crecimiento promovida por la IL-9, y en cultivos
de células T murinas sufren transformación tumoral (Uyttenhove, 1988). Inte-
resantemente, del 5% al 10% de los ratones transgénicos que sobreproducen
IL-9 desarrollan espontáneamente linfomas linfoblásticos (Renauld, 1994). y
la IL-9 es producida en las células tumorales de la enfermedad de Hodgkin y
del linfoma anaplásico (Merz, 1991). Lo último muestra la posibilidad de una
curva de respuesta autocrina de la IL-9 (Demoulin. 1998).
En el sistema hematopoyético. la IL-9 y la eritropoyetina parecen reforzar
la maduración de los progenitores entroides in vitro, y pueden promover el
crecimiento de unidades formadoras colonias de granulocitos/macrófagos
(CFU-GM) a partir de progenitores CD34+. La IL-9 ejerce su actividad de pro-
mover el crecimiento sobre las líneas de mastocitos, y también puede regular
la diferenciación de los mastocitos (Eklund, 1993). Se ha sugerido que la IL-
9 induce la resistencia a parásitos in vitro de las células dependientes de los
mastocitos, y junto a la IL-4 puede facilitar la producción de IgE e IgG (Loua-
hed, 1995). Se ha sugerido un papel para la IL-9 en el SNC por su capacidad
de mantener el aumento de la extensión neuronal y promover la excitabilidad
sobre cultivos de lineas celulares del hipocampo de progenitores de ratones
inmortalizados (Mehler, 1993).
lnterleucina-10
La IL-10 es una potente atocina antiínflamatoria (Fiorentmo. 1989). Es una
proteína de 160 aminoácidos con una masa molecular de 18,5 kDa (Kim,
1992), que contiene cuatro residuos cisteína y dos puentes disulfuro que man-
tienen su estructura helicoidal y su actividad biológica. La codifica un gen
secuenciado en el cromosoma 1. El receptor de IL-10 (IL-10R) es expresado
sobre todo en las células hematopoyéticas, y es una proteina de 90 a 110 kDa
cuyo dominio extracelular se une a las moléculas dimerizadas de IL-10 (Tan.
1995). La transduccíón de señales de la IL-10 está mediada a través de la vía
de la JAK/'STAT (Lalani. 1997).
Aunque muchos tipos de célula, incluyendo las células Th2. las células T
CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrófagos, los mastocitos, los queratino-
citos, los eosinófilos, las células epiteliales y muchas células tumorales son
capaces de producir IL-10, es el monocito el que produce la mayor cantidad
de IL-10 en la mayoría de las situaciones inflamatorias (Lalani, 1997). Ya que
puede ser producida de un modo autocrino y regular su propia producción a
través de mecanismos de retroalimentación negativos, la IL-10 regula la res-
puesta inflamatoria necesaria en el foco inflamatorio (Tan, 1995). La IL-10
actúa Inhibiendo la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1et, la
IL-íB, la IL-6, la IL-8, el TNF-a. el G-CSF. el CM-CSF y las quimiocinas inclu-
yendo la IL-8 y la MIP-1u, suprimiendo la transcripción de sus genes corres-
pondientes (Goldman, 1997). La IL-10 también suprime la liberación de los
radicales libres del oxígeno e inhibe la actividad microbicida dependiente del
óxido nítrico en los macrófagos (Fleming, 1996).
En situaciones alérgicas como el asma, la producción de IL-5 es crucial en
la iniciación del evento. In vitro, la IL-10 previene la producción de IL-5 en las
células T ThO, Th2, y de reposo y regula a la baja la expresión de MHC de
Clase II sobre las APCs. También inhibe la expresión de MIP-1u en los neu-
trófilos, monocitos y macrófagos humanos; inhibe la producción de químio-
tácticos activos en los lugares de inflamación crónica; y puede ¡nactívar direc-
tamente la función de los eosinófilos y causar la muerte del eosinófilo. Estos
hallazgos sugieren el potencial de la IL-10 para limitar la inllamación aérea
crónica (Petrolaní, 1999).
Los estudios con animales también han sugerido un papel terapéutico para
la IL-10 en proporcionar una protección mucosa en la enfermedad inflamato-
ria intestinal, y en disminuir los niveles séricos de IL-8 en los animales con
pancreatitis aguda necrotizante. En los modelos de sepsis, los ratones inyec-
tados con IL-10 estaban protegidos frente a inyecciones intraperitoneales de
endotoxina que. de otro modo, serían letales. La IL-10 puede servir como fac-
tor de crecimiento para muchas líneas celulares malignas como los linfomas
de células B cultivados de pacientes con SIDA, el linfoma Burkitt y las células
del mieloma maligno. La producción de IL-10 en otras enfermedades malig-
nas puede proporcionar una forma de eludir las respuestas locales de las
células T. Sin embargo, los estudios también demuestran la capacidad de la
IL-10 de inhibir el crecimiento de las células de la leucemia mieloide crónica
in vitro (Benjamis, 1992; Kim. 1995).
La IL-10 puede participar en la inducción y perpetuación del LES y la acti-
vidad de la enfermedad se correlaciona con los títulos de IL-10 (Houssiau,
1995). Está implicada en otras enfermedades autoinmunes incluyendo la
miastenia gravis, la enfermedad de Graves, el síndrome de Sjógren, la poli-
miositis, la psoriasis, la esclerosis sistémica, el pénfigo vulgar, el penfigoide
ampolloso y la enfermedad de Kawasaki (Lalani, 1997). Además, la detección
de IL-10 elevada en suero determinada por ELISA en pacientes con carcino-
ma de células pequeñas de pulmón y adenocarcinoma de colon puede ser un
predictor útil de la progresión de la enfermedad clínicamente indetectable (De
Vita. 1999, 2000).
 CAPÍTUIO 39 • CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
lnterleucina-11
La IL-11 es una citocma pleotrópica con numerosos efectos en muchos teji-
dos incluyendo la médula ósea, el cerebro, el intestino y los testículos. El
ADNc de la IL-11 codifica un precursor polipeptidico de 23 kDa, 199 aminoá-
cidos, con una secuencia líder de 21 aminoácidos que parecer carecer de
lugares potenciales de glicosilación y de residuos cisteina. El gen codificante
se ha secuenciado en el cromosoma 19, y su estructura tridimensional con-
tiene probablemente cuatro residuos (5-hélíce (Czupryn, 1995).
El receptor de la IL-11 (IL-11 R) está formado por una asociación no cova-
lente de una cadena i/, específica de ligando y una cadena p de transduc-
ción de señal, la gpl30. El complejo IL-6R también utiliza la subunidad
gp130 como cadena de señalización, explicando algunos de los solapa-
mientos en las acciones de estas cilocinas (Cherel, 1996). Cuando se aso-
cia con el IL-11R|5 (gp130), la afinidad de unión para la IL-11 es mayor y se
genera una señal biológica a través de la formación de homodímeros de
gp130. Se cree que estos activan las vías de transducción incluyendo las
cinasas JAK. las cinasas MAPK. las proteínas cinasa ribosomales S6, y la
familia de cinasas Src (Fuhrer. 1996). El ARNm de la IL-11 ha sido detecta-
do en muchos tejidos estimulados incluyendo los fibroblastos, las células
epiteliales, los condrocitos. los sinoviocitos, los osteoblastos y las células del
glioblastoma.
Las evidencias indican que la IL-11 es una potente citocina antiinflamatoria
(Trepicchio. 1998: Redlich, 1996) que. al igual que la IL-6. puede regulara la
baja la función efectora macrofágica inhibiendo la expresión de los genes del
TNF-a, la IL-1p. la IL-12 y el óxido nítrico, a través de la prevención de la
translocación nuclear del factor de la transcripción nuclear NF-Kp" (Trepicchio.
1998). Sus efectos hematopoyéticos (Du. 1995) incluyen un papel en la
megacariocitopoyesis, y la estimulación de la eritropoyesis, la proliferación y
diferenciación macrofágica, y la producción de inmunoglobulinas por las célu-
las B. Además, regula la diferenciación y maduración de los progenitores de
células mieloides en combinación con el factor de células madre (SCF), y pue-
de participar en la linfopoyesis. En cultivos de médula ósea a largo plazo
(LTBNMCs). la IL-11 aumenta la celularidad de las células estromales adhe-
rentes y promueve la hematopoyesis en estos cultivos. En los pacientes en
quimioterapia, la terapia con IL-11 mejora la recuperación de la hematopoye-
sis y de la función inmune, y disminuye la morbilidad de la supresión de la
médula ósea por la quimioterapia.
La IL-11 tiene también extensos efectos no hematopoyéticos (Du. 1995). La
IL-11 puede funcionar en la inflamación pulmonar y es producida por la esti-
mulación alveolar y por las células pulmonares epiteliales en grandes canti-
dades. Los virus respiratorios son potentes estimuladores de la síntesis de IL-11
en el pulmón, y la IL-11 es detectada en las secreciones nasales de niños con
infecciones del tracto respiratorio superior (Einarsson, 1996). La IL-11 tam-
bién está implicada en el control del crecimiento de las células epiteliales gas-
trointestinales, ya que muestra una inhibición reversible de la proliferación de
las lineas celulares madre de las criptas intestinales in vitro. La IL-11 también
puede ser capaz de conferir protección mucosa al epitelio gastrointestinal tras
la radiación y la quimioterapia (Keith. 1994).
Otras actividades de la IL-11 incluyen el desarrollo de los osteoclastos in
vilro. un papel en la supervivencia tanto de las neuronas sensitivas como
motoras, la estimulación de la liberación in vivo e in vitro de reactantes de lase
aguda y la regulación del metabolismo de la matriz exlracelular (ECM). En la
biología lumoral, la IL-11 actúa sinérgicamente con otras citocinas para pro-
mover el crecimiento de las lineas celulares de la leucemia humana y estimula
la formación de la colonia de blastos leucémicos (Hu. 1993; Lemoli. 1995). Se
ha detectado un efecto trombootopoyético beneficioso en pacientes con
enfermedad de Crohn que reciben IL-11 recombinante (Sands. 1999).
Interleucina-12
La IL-12 es una citocina heterodimérica de 70 kDa formada por dos cade-
nas unidas covalentemete (p35 y p40), que son codificadas por dos genes
separados (Trinchieri. 1994). La IL-12 promueve la diferenciación de las célu-
las humanas tipo Th1, preparándolas para incrementar la producción de inter-
ferón-y (IFN-y). y aumenta las capacidades citolíticas de las NK y de las célu-
las T (Heufler. 1996). Estudiado inicialmente en las células T activadas y en
919
las células NK CD56+. el receptor de la IL-12 (IL-12R) es un miembro de la
superfamilia de receptores hematopoyéticos y tiene una homología significa-
tiva con la gpl 30 y con los receptores del G-CSF y del factor inhibidor de leu-
cemia (LIF). La IL-12 es producida principalmente por los monocitos y los
macrófagos, por las células dendriticas (APC profesionales) y, en una pequeña
cantidad, por los neutrófilos y los queratinocitos. Su producción está regulada a
la baja por la IL-10 y el TGF-p. y su síntesis esta aumentada por el IFN-y. La
síntesis de IL-12 es inducida rápidamente en las células fagociticas por cier-
tos tipos de bacterias, patógenos intracelulares incluyendo los protozoos y los
hongos, y en menor medida los virus. También puede producirse con la inter-
acción homotipica del antigeno CD40 en las células T activadas y en los fago-
citos (Trinchieri, 1997).
La IL-12 tiene un papel vital como citocina proinflamatoria. En modelos de
choque séptico implicando inyecciones intraperitoneales de endotoxina en
ratones, se encontró que la IL-12 promueve la sobreproducción de IFN-y. que
por un mecanismo de relroalimentación positivo induce la liberación de más
IL-12. Finalmente, la sobreproducción de IFN-y origina la muerte del animal.
El importante papel de la IL-12 en esta serie de eventos sale a la luz por la
observación de que la inyección de anticuerpos neutralizantes anti-IL-12 en
ratones rescata alrededor del 90% de estos de la muerte (Trinchieri, 1994).
Las evidencias sugieren que la IL-10 inhibe la producción de IL-12 por los
fagocitos, y que la IL-12 por si misma estimula la producción de IL-10, sir-
viendo por ello como regulador negativo de su propia producción (Meyaard,
1996).
Las evidencias experimentales en animales sugieren un papel exacerban-
te para la IL-12 en ciertas enfermedades autoinmunes incluyendo la diabetes
autoinmune. la artritis, el modelo animal de la esclerosis múltiple (EAE) y la
colitis (Trinchieri. 1997). En situaciones alérgicas, la IL-12 juega un papel
paliativo a través de su capacidad de regular a la baja la producción de IL-4,
IL-5 e IgE. El electo es asombroso en la hiperrespuesta de la vía aérea indu-
cida por antigeno en modelos de ratón (Gavett. 1995).
La IL-12 tiene significativos efectos antitumorales y antimetastásicos en
modelos de ratón in vivo (Zitvogel. 1995) que parecen estar mediados por la
producción de IFN-y y por otros mecanismos no especilicos. Sin embargo, se
ha notado toxicidad gastrointestinal, hepática y hematológica en ensayos clí-
nicos con rlL-12 sobre pacientes con carcinoma de células renales. Debido
a su papel en promover las respuestas de memoria de Th1 a las vacunas, la
IL-12 puede ser importante como adyuvante de las vacunas.
lnterleucina-13
La IL-13 es una proteina de 12 kDa. 132 aminoácidos, clonada por prime-
ra vez de linfocitos T activados y clones de células T en 1993, con cuatro luga-
res de N-glicosilación y dos puentes disulfuro. Su gen de 4.5 kb se ha secuen-
ciado en el cromosoma 5 en el grupo de genes que contiene la IL-3, la IL-4,
la IL-5, la IL-9 y el GM-CSF. Se cree que posee una estructura («-helicoidal,
con cuatro hélices r* y dos cadenas plegadas p,
El receptor de la IL-13 (IL-13R) se expresa en las células B. monocitos,
basófilos. eosinófilos. mastocilos. células endoleliales, fibroblastos, querati-
nocitos y ciertas células tumorales. Aparentemente, no se expresa en linloci-
tos T humanos La IL-13 y la IL-4 comparten un componente del receptor
común, el gp140, una proteína de 65 a 70 kDa que sirve como receptor de
baja afinidad (IL-13Ra) para la IL-13, como el receptor tipo II de IL-4 (IL-4Ru).
No es sorprendente, entonces, que la IL-13 simula muchas de las acciones
biológicas de la IL-4. Cuando se une a su ligando, el IL-13R y el IL-4R indu-
cen la fosforilación de la tirosina del JAK-1 en las células hematopoyéticas. y
del JAK-2 en las células no hematopoyéticas. seguido por la activación del
STAT-6 y de la PI3-cinasa (Keegan, 1996: Burd, 1995).
La IL-13 es liberada por las poblaciones clónales de células T CD4CD8+
ThO, Th1 y Th2 en respuesta a la estimulación antigénica específica o a la
activación policlonal, y por los mastocitos, los basófilos y los eosinófilos tras
la estimulación a través de sus receptores de alta afinidad para la IgE (CD23)
(Keegan. 1996). El ARNm de la IL-13 es inducido en las células B normales
tras la correcta estimulación, y la proteína IL-13 y su ARNm han sido detec-
tados en enfermedades malignas y en células B transformadas por el virus de
Epstein-Barr (VEB). sugiriendo un posible papel para la IL-13 en el desarrollo
de enfermedades malignas de las células B (de Vnes, 1998).
 920 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Sobre los linfocitos |3, monocitos y macrófagos, la IL-13 induce una aumen-
to significativo de la expresión de moléculas de MHC Clase II y CD23, sugi-
riendo un papel para la IL-13 en facilitar la capacidad de presentación de anti-
genos de estas células a las células T. Es quimiotáctica para los monocitos. y
promueve la proliferación de las células B activadas, e in vitro parece promo-
ver la formación de colonias de megacariocitos y aumentar la proliferación de
células progenitoras murinas en la médula ósea.
La IL-13 es en su mayor parte una citocina antiinflamatoria, y se ha notado
un importante papel para ella en la respuesta alérgica. La IL-13 es capaz de
inducir la secreción de IgE de cultivos de células B humanas y de aumentar
la expresión de la molécula de adhesión proinflamatona VCAM-1 en las célu-
las endoteliales. Este hecho y la observación de que la síntesis de IL-13 está
aumentada en situaciones atópicas en el pulmón en los asmáticos y en
pacientes con sinusitis crónica mientras que está disminuida en respuesta a la
administración de corticoesteroides pone de relieve la importancia de la IL-13
en las situaciones de alergia (de Vries. 1998). Al mismo tiempo, la IL-13 pare-
ce atenuar la respuesta alérgica regulando a la baja la capacidad de las célu-
las endoteliales y de las células del músculo liso de la vía aérea de liberar el
quimiotáctico RANTES de los linfocitos T y de las células inflamatorias (Tony.
1994).
El pretratamiento con IL-13 inhibe la producción de citocinas proinflamato-
rias como la IL-1i/ y la IL-1(i, la IL-12 y el IFN-ypor los monocitos activados
por LPS. Su regulación a la baja de la producción de factor tisular y su regu-
lación a la alta de la producción de trombomodulina pone de relieve también
su naturaleza antiinflamatoria.
Interleuc¡na-14
La IL-14 probablemente fue nombrada prematuramente y no parece ser
una molécula distintiva.
Interleucina-15
La IL-15 es una proteína de 14 a 15 kDa, 114 aminoácidos, identificada por
primera vez como un factor de crecimiento celular en los sobrenadantes de
las lineas celulares epiteliales de ríñones de mono (Grabstem. 1994). Aunque
su secuencia de aminoácidos primaria es única, su estructura tridimensional
contiene dos puentes disulfuro y se parece bastante a la de otros miembros
de la familia de citocinas de cuatro u hélices de unión, que incluye a la IL-2.
citocina con una actividad funcional similar. El gen que codifica la IL-15 se ha
secuenciado en el cromosoma 4. cerca del gen de la IL-2 (Anderson. 1995a).
El receptor de la IL-15 (IL-15R) está compuesto de tres subunidades pro-
teicas: una cadena IL-15Ra específica de ligando, y unas cadenas p y y
idénticas a las cadenas [J y y del IL-2R. Este hecho explica las actividades
similares de IL-15 y la IL-2. La IL-15Ru comparte homología con la IL-2Ra,
aunque su distribución tisular es diferente, y al igual que la IL-2R«, es inca-
paz de transducir una señal a menos que esté asociada con las cadenas
de Iransducción de señal |5 y y (Anderson, 1995b). Mientras que el IL-15R
en las células T utiliza al JAK-1 y al JAK-3. en los mastocitos emplea la vía
JAK-2/STAT-5 (Johnston, 1995).
Los macrófagos. los fibroblastos, los queratinocítos. las células epiteliales
y otros tejidos secretan IL-15. pero a diferencia de la IL-2. no es secretada por
los linfocitos. De cualquier modo, la distribución tisular de la IL-15 es amplia,
identificándose también transcripción de ARNm en monocitos y macrófagos,
células de Langerhans. células dendritas y células endoteliales. El ARNm de
la IL-15 parece almacenarse en una muestra translacionalmente inactiva que
está disponible para la traslocación precoz en la respuesta innata a la infec-
ción. La producción de IL-15 por los macrófagos en la fase inicial de la infec-
ción microbiana puede servir para activar a las células NK como parte de la
respuesta a la infección (Cosman. 1995).
Al igual que la IL-2, se ha mostrado que la IL-15 participa en la coestimu-
lación de las células T en proliferación, en la inducción de la actividad de cito-
cinas en las células T. en la proliferación de las células NK. y en la activación
de la proliferación de las células B y liberación de mmunoglobulinas (Kirman,
1998). Los modelos murinos sugieren un papel esencial para la IL-15 en el
desarrollo de las células NK. A diferencia de la IL-2. la IL-15 puede aumen-
tar anabólicamente la masa muscular esquelética, y se ha demostrado que
estimula la proliferación de mastocitos in vitro e m vivo. La IL-15 es qui-
miotáctica para las células T, recatándolas a los lugares de inflamación, y se
ha sugerido un papel similar en la sinovial de pacientes con AR (Mclnnes,
1996). Otras evidencias indican un papel para la producción de IL-15 en las
situaciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, la hepatitis C y la sarcoi-
dosis. En estas situaciones, la IL-15 puede servir para reclutar los linfoci-
tos activados hacia áreas de inflamación donde serán capaces de liberar
citocinas adicionales proínflamatorias y ejercer sus efectos citotóxicos (Kir-
man. 1998).
Interleucina-16
Reconocida inicialmente como un factor quimiotáctico en cultivos de
células mononucleares de sangre humana periférica estimuladas con mitó-
genos (Center, 1982), la IL-16 está reconocida como un quimiotáctico
promflamatorio de células T. Los linfocitos estimulados con mitógenos pro-
ducen IL-16 como una molécula precursora que es degradada y secretada
como una proteína de 17 kDa, 130 aminoácidos. Solo tras la agregación en
homotetrámeros la IL-16 parece poseer actividad biológica (Bazan, 1996).
Se cree que la IL-16 contiene seis láminas de pliegues (i incluyendo la
secuencia de aminoácidos, glicina-leucina-glicína-fenilalanma. que se cree
que facilita las interacciones proteina-proteína como la autoagregación. El
gen que codifica la IL-16 ha sido secuenciado en el cromosoma 15. La
superficie de las células CD4 parece servir como receptor de superficie
para la IL-16 soluble, y es absolutamente necesaria para la señalización
biológica (Cruikshank, 1994) a través de vías que pueden incluir la fosfori-
w
lación del p56 .
La IL-16 es liberada por las células T tras la estimulación con mitógenos.
antígenos, histamina y serotonina. Los cultivos de eosinófilos y mastocitos
también liberan IL-16 en presencia de GM-CSF. y también PMA e ionóforos
de calcio, respectivamente. La IL-16 también ha sido identificada en los
sobrenadantes de cultivos de células epiteliales respiratorias extraídas de
asmáticos.
La IL-16 sirve como quimioláclico para las células T CD4+ y otras célu-
las periféricas inmunes que expresan CD4. incluyendo los monocitos y
eosinófilos. y es un factor de crecimiento competente para ellos y estimula
la progresión del ciclo celular en células CD4+ humanas (Cruikshank.
1994). Además, la IL-16 promueve el aumento de la adhesión al ECM por
los eosinófilos, y regula a la alza la expresión de HLA-DR sobre los monoci-
tos (Wan, 1995). Sobre los cultivos de células T, la IL-16 inhibe la expresión
del IL-2R mediado por el TCR y la producción de IL-2, y puede hacer a estas
células insensibles al AICD. El resultado in vivo puede ser el aumento de la
acumulación de células T CD4+ cebadas que responden a citocinas en los
lugares de inflamación, que están protegidas de la AICD mediada por TCR
(Cruikshank, 1994).
Se ha informado que los asmáticos tienen IL-16 constantemente presen-
te en el epitelio de su vía aérea con células T CD4+, sugiriendo un papel
para la IL-16 en el reclutamiento de estas células en el asma. Los modelos
murinos sugieren un papel para la IL-16 en la inflamación granulomatosa.
La IL-16 también parece suprimir la transcripción del VIH en las células T
infectadas por el VIH a través de la activación de un factor represor no iden-
tificado.
Interleucina-17
Conocida inicialmente como antigeno 8 de los linfocitos T citotóxicos
(CTLA-8), la IL-17 es una citocina proinflamatoria de 32 kDa secretada como
homodímeros unidos covalentemente por un restringido grupo de células T
memoria activadas (Yao, 1995; Fossiez, 1996). El gen que codifica esta cito-
cina descrita recientemente ha sido mapeado en el cromosoma 2 y su expre-
sión parece estar estrechamente regulada. La IL-17 se expresa predominan-
temente por las células T CD4+ CD45-RO en respuesta a una variedad de
señales de activación incluyendo la Con A, el PHA, el anti-CD3 mAb, el anti-
CD28 mAb y el Pl (Fossiez, 1996).
Los estudios en ratones sugieren que. en contraste con la expresión res-
tringida de la IL-17. el receptor de la IL-17 (IL-17R) es una proteína novel
ampliamente distribuida especialmente abundante en el bazo y el riñór
 CAPÍTULO 39 • CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
Evidencias recientes implican la vía de señalización JAK/STAT en la trans-
ducción de señales por el IL-17R (Subramaniam. 1999).
Algunas evidencias parecen sugerir un papel para la IL-17 como inhibido-
ra del crecimiento de las células T activadas en ratones (Yao. 1995a). Esto
mismo aún no ha sido demostrado en sistemas humanos. La IL-17 también
parece regular al alza la producción de IL-6. IL-8. PGE y óxido nítrico, y su
; reparación y la angiogénesis. Sus efectos biológicos son transducidos a tra-
secreción por los fibroblastos cutáneos, los sinoviocitos. las células endote-
liales, las células del epitelio bronquial y las lineas celulares del carcinoma
de riñon. La IL-17 induce indirectamente la proliferación de células progeni-
toras hematopoyéticas CD34+ cocultivadas con fibroblastos, y finalmente
promueve la diferenciación de estas células a neulrófilos (Yao, 1995b). La IL-
17 también induce la expresión de ICAM-1 sobre los fibroblastos in vitro
(Fossiez, 1996).
Se ha sugerido un papel in vivo para la IL-17 en la protección frente a la
infección bacteriana, y debido a su capacidad para inducir la producción de
altos niveles de citocinas incluyendo la IL-6. la IL-18 y el MCP-l. puede ser-
vir para regular el proceso inflamatorio (Dalrymple, 1996). Evidencias recien-
tes sugieren la posibilidad de que la IL-17 pueda promover indirectamente los
tumores de cuello uterino en humanos (Tartour, 1999).
lnterleucina-18
Llamada originalmente factor inductor de IFN-y (IFIF), la IL-18 es una
proleina de aproximadamente 18 kDa producida por los macrólagos acti-
vados, las células de Kupffer, los osteoblastos y los queratinocitos (Tori-
goe, 1997). La formación de la IL-18 biológicamente activa requiere el pro-
cesamiento del precursor de 24 kDa por la caspasa-1 (ICE) en las células
de Kuplfer.
El receptor de la IL-18 (IL-18R) es idéntico a la proteína relacionada con el
IL-1R (IL-1 Rrp) (Torigoe, 1997), y cuando se une a su ligando el IL-18R indu-
ce la unión del ADN NF-vp. Se han identificado IL-18Rs de alta y baja afini-
dad, pero sus papeles en la transducción de señal no están claros.
La función primaria de la IL-18 parece ser la inducción del IFN-y en las
células Th1 activadas y en las células B anti-CD40 activadas (en presencia de
IL-12). La IL-18 también induce la síntesis por las células T de CM-CSF e IL-
6. y promueve la cilotoxicidad sobre las células NK permitiendo la exocilosis
de perforinas y granzima A (Ushio. 1996). Los estudios in vitro sugieren un
papel para la IL-18 fuera del sistema inmune (Udagawa, 1997; Stoll. 1997;
Conti. 1997).
Los papeles fisiológicos de la IL-18 pueden incluir la defensa contra la
infección, y un papel en el rechazo de tumores. A través de la supresión de la
producción de IgE. la IL-18 puede abortar la respuesta alérgica (Yoshimoto,
1997), pero la producción no regulada de IL-18 está asociada con el daño del
parénquima hepático en modelos animales. La IL-18 puede participar en la
patogénesis de la linlohistiocitosis hemolagocítica (HL) a través de la induc-
ción de células Th1. La medición de los niveles de IL-18 en la sangre perilé-
rica de los pacientes afectos puede facilitar un medio para la monitorización
de la actividad de la enfermedad HL latente (Takada, 1999).
Factor transformante del crecimiento [i
El TGF-p es una citocina de 25 kDa definida en un bioensayo por su capaci-
dad para mantener la formación de colonias por los fibroblastos del riñon de
ralas normales (NRK) en presencia de tactor de crecimiento epidérmico (Clark,
1998). En mamíferos, son producidas tres isoformas de TGF-|i (TGF-(11.
TGF-|12 y TGF-P3) (McCartney-Francis, 1998). El TGF-|i bioactivo es un ho-
mo- o heterodimero del péptido TGF-p de 12.5 kDa degradado por endopepti-
dasas desde el pro- TGF-p. Antes de su secreción, el dimero TGF-p de 25 kDa
se une al péptido de unión latente del TGF-p de 75 kDa (TGF-(3-lpb), y juntos
se unen al péptido de latencia asociado al TGF-|J de 135 kDa (TGF-(i-lap) for-
mando el complejo TGF-ji latente (TGF-(i-lc).
El TGF-p-lc se encuentra en grandes cantidades en los granulos a de las
plaquetas. Una vez liberado, el TGF-p-lc se puede unir a los receptores de
superficie celulares para el TGF-p o puede adherirse a los componentes ECM
y permanecer latente. Alternativamente, puede degradarse a su forma activa
una vez secretado a través de las serín proteasas liberadas ya sea por la
misma célula o por células vecinas. EL péptido de degradación bioactivo se
921
asocia después con los componentes o transportadores de ECM como la
a -macroglobulma. la albúmina o la IgG. lo que facilita la captación y el meta-
bolismo del TGF-p.
El TGF-p es bien conocido por su papel en el desarrollo, crecimiento y dife-
renciación de células epiteliales: en la carcinogénesis. y en la inflamación, la
vés de cualquiera de los seis receptores descritos incluyendo las tres clases
de receptores transmembrana y muchos receptores solubles. De estos, los
receptores del TGF-p" tipo I y tipo II son capaces de transducir señales bioló-
gicas, mientras que los receptores tipo III carecen de residuos de señalización
y sirven sobre todo para almacenar y presentar el TGF-|5 a los receptores de
señalización. La señal biológica es transducida al núcleo añadiendo proteínas
Smad (miembros de la familia relacionada con MAD) como intermediarios
(Lopez-Casillas. 1993; Derynck, 1996).
El TGF-jJ es producido por cualquier linaje de linfocitos desde linfocitos
hasta macrófagos y células dendríticas. y actúa tanto en la respuesta autocn-
na como paracrina. Sus actividades biológicas son muchas y bien equilibra-
das, provocando efectos perjudiciales tanto el exceso como la insuficiencia
(McCartney-Francis, 1998). En ratones knockoutóe TGF-p, el 30% al 60% de
los embriones demostraron fallo en la angiogénesis y en la hematopoyesis, y
abortos espontáneos, mientras que en ratones transgénicos con sobreexpre-
sión de TGF-p. la consecuencia es la hipoplasia pulmonar y la pérdida de la
diferenciación epitelial respiratoria originando la muerte perinatal.
El TGF-|i funciona tanto como laclor de proliferación como inhibidor del
crecimiento. Inhibe el producto del gen del retmoblastoma (Rb) e inhibe la
expresión del protooncogén c-myc, provocando una alteración del equilibrio
de las proteínas reguladoras positivas y negativas que controlan el ciclo
celular (Alexandrow. 1995) En ratones, la sobre o infraexpresión de TGF-|4
origina hipo o hiperproliferación de células epiteliales, en donde la hiper-
proliferación está asociada con carcinoma (Nogaard. 1995). En humanos, la
agresividad de las líneas celulares del melanoma y del carcinoma de colon
aumenta con el aumento de la pérdida de respuesta al TGF-|i. El TGF-|!
también puede servir como supresor de tumores, ya que los anticuerpos
contra el TGF-|i aumentan la carcmogenia de las células del carcinoma de
colon in vitro.
En el compartimento hematopoyético (McCarteny-Francis, 1998), el TGF-p
controla la mielopoyesis, la linfopoyesis y la supervivencia de las células den-
dríticas de Langerhans. En la respuesta inmune el TGF-J5 mantiene el proce-
so inflamatorio a través del aumento de la adhesión de las células inflamato-
rias a través de la regulación a la alta de las integrinas. y quimiotácticamente
reclutando y activando linfocítos nativos. Interesantemente, los ratones knoc-
kout de TGF-p desarrollan una hiperactividad frente a las células B parecida
a la autoinmunidad, con infiltración por un número considerable de macróla-
gos y linfocítos de órganos incluyendo el corazón, el pulmón y el hígado (Kul-
karni, 1993). El TGF-p puede promover normalmente la tolerancia a lo propio
regulando la maduración de los limocitos CD4+ y CD8+ de modo que clones
aulorreactivos sufren apoptosis. En la periferia, una población de TGF-|i pro-
ducidos por las células Th2 mantienen la tolerancia periférica promoviendo la
anergia clonal.
El TGF-p suprime la respuesta inflamatoria y promueve la curación a tra-
vés de la inhibición de la proliferación de células T y B. la inhibición de la fun-
ción de las células NK, la inducción de los antagonistas de citocinas, la regu-
lación a la baja de la expresión de integrinas, y la inhibición de la liberación
de IgG. Sin embargo, la sobreproducción de TGF-p no solo acaba con la res-
puesta inflamatoria sino que produce una "excesiva" curación, provocando
una fibrosis exuberante y una excesiva cicatriz (Wahl, 1994).
Se ha propuesto un papel para el TGF-p en la aterosclerosis, en donde el
TGF-ji insuficiente puede permitir la formación de la placa arteriosclerólica.
En esta via, la formación de la placa en algunos ratones seleccionados es
inhibida por la administración de tamoxifeno, que aumenta el TGF-p circu-
lante.
Factor de necrosis tumoral
El TNF es una citocina proinflamatoria de 17 kDa (Beutler, 1995) que
puede existir como forma transmembrana de 26 kDa, o como péptido solu-
ble que se homotrimenza para formar la citocina fisiológicamente activa de
 922 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA

52 kDa. Su nombre deriva de su capacidad para malar células tumorales y

para inducir la necrosis hemorrágica en tumores trasplantados a ratones. Es
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR
un miembro de la familia de los ligados parecidos al TNF. formados todos
por tres cadenas polipeptídicas y capaces lodos de unirse a miembros de El pegamento que une los tejidos vivos en complejos organismos multice-
una lamilia de receptores de TNF relacionados estructuralmente (Beutler, lulares está compuesto en parte de moléculas de adhesión que se describen
1994). a continuación. Estas compleías glicoproteinas permiten la migración celular
La mayoría de los efectos del TNF están mediados a través de dos recep- durante la embriogénesis y cicatrización de heridas, y gobiernan el tráfico de
tores de superficie celular de alta afinidad: el TNFR-I (CD120a, 55 kDa) y el leucocitos, que es de importancia clave en la linfopoyesis y en la respuesta
TNFR-II (CD120b, 75 kDa) (Hohmann. 1989). Cuando son ligados, estos inmune. Las moléculas de adhesión se dividen convencionalmente en cinco
receptores median señales para la proliferación y muerte celular programa- grupos basados en su homología estructural: cadherinas, mucinas, integrinas,
da (apoptosis), con evidencias que muestran que esto último está mediado selectinas y moléculas de la superfamilia de inmunoglobulmas. Las cadheri-
a través de la inducción de la pérdida de la integridad de la membrana mito- nas son expresadas en su mayoría en las células epiteliales e interaccionan
condrial y la liberación de proteínas del especio intermembrana. En relación con las otras de forma calcio-dependiente Las mucinas son proteínas muy
con esto, el TNFR-I tiene en su dominio mtracelular un residuo denominado glicosiladas que interactúan principalmente con las selectinas. Los miembros
"dominio mortal" que es necesario para la transducción de la señal apoptó- de la superfamilia de inmunoglobulinas tienen dominios semejantes a las m-
tica. munoglobulínas e interaccionan con las mtegrmas. las selectinas. y una con
la otra. Las integrinas y las selectinas se discuten ahora.
Principalmente, producen TNF los macrófagos y los monocitos. pero otras
células incluyendo los linfocitos, los mastocitos, los neutrófilos, los queratino-
citos. los astrocitos, las células microgliales, las células del músculo liso y las
células tumorales también lo producen. El TNF puede actuar localmente en Integrinas
una función paracrina, pero también actúa en lugares distantes a modo de
La familia de moléculas de adhesión de las integrinas (revisadas en Gon-
hormona.
zalez-Amaro. 1999) proporciona una unión física crítica entre los elementos
Los efectos biológicos del TNF-a son numerosos (Kollias, 1999) e incluyen
externos a la célula (otras células y el ECM) y los elementos del interior de la
un efecto citotóxico directo, la modulación del crecimiento y diferenciación
célula (el citoesqueleto, las moléculas intracitosólicas y el núcleo). Cada miem-
tisular, y un papel en las situaciones de inflamación e infección crónica. Ade-
bro de la familia de las integrinas está compuesto de un heterodimero de
más, el TNF-a es responsable del síndrome de caquexia tumoral y de la
subunidades a y p unidas no covalentemente (Tabla 39-1). Actualmente,
mayoría de las infecciones parasitarias. A través de la estimulación de los
están completamente descritas las 16 subunidades a y las ocho |1 pudiendo
neutrófilos. el TNF-a aumenta la fagocitosis, la degranulación y la actividad
originar más de 22 combinaciones de heterodímeros. Las 14 principales inte-
de la cadena respiratoria. Los efectos proinflamatorios adicionales incluyen la
grinas se dividen en cuatro subfamilias, difiriendo en los patrones de expre-
inducción del aumento de la formación del factor activador de plaquetas (PAF)
sión y en la especificidad de ligando.
en los neutrófilos, la estimulación de la secreción de ácido araquidónico, el
aumento de la citotoxicidad anticuerpo dependiente mediada por células, y el Las integrinas (i, (las integrinas de la activación final [VLAsJ) se crean por
aumento de la adherencia de los neutrófilos al endotelio activado por TNF a la asociación de una subunidad de cadena |i, (CD29) con cualquiera de las
través de la regulación a la alta de la E-selectina; los efectos muestran el subunidades de la cadena o (CD49a a CD49f). Son expresadas en todas las
papel proinflamatorio del TNF. células que requieren un firme anclaje al ECM, y en los leucocitos, plaquetas
y algunas células tumorales circulantes.
Los modelos animales implican al TNF en la AF¡ y en la enfermedad infla-
Las integrinas p , que tienden a ser expresadas principalmente por los leu-
?
matoria intestinal donde el TNF ejerce un efecto proinflamatorio a través de la
cocitos y las células mieloides, resultan de la asociación de la subunidad de
activación de las células endoteliales y de la inducción de las quimiocinas qui-
la cadena p (CD18) con cualquiera de las múltiples subunidades rx Cuando
2
míotácticas de neutrófilos. Además, se ha propuesto un papel para el TNF en
se combinan con la subunidad a, (CD11a), se forma la integrina p LFA-1
las enfermedades desmielinizantes inflamatorias del SNC sobre la base de
(CD11a'CD18). La LFA-1 juega un papel crucial en la adhesión leucocitana
múltiples estudios de esclerosis múltiple (EM) en humanos (Kollias, 1999).
al endotelio vascular durante la migración transendotelial. La subunidad de
En pacientes que sufren de fiebre recurrente transmitida por piojo (infec-
ción por Borrelia recurrenlis), la administración de anticuerpos bloqueantes
anli-TNF ha demostrado suprimir la reacción de Jarisch-Hexheimer (hipoten-
sión persistente) que acompaña a la administración del antibiótico (Fekade,
1996).
Tabla 39-1 Principales integrinas: estructura molecular
e interacción
Interferón-y

El IFN--/ (Samuel, 1991) es una proteina homodimera de 40 a 70 kDa, 143

aminoácidos, detectada por primera vez como un inhibidor derivado de las
células T de la replicación viral en cultivos de fibroblastos. Está codificado por
una gen simple que está mapeado en el cromosoma 12. La células T y las
células NK son las únicas fuentes conocidas de IFN. Las células T lo produ-
cen en respuesta a la estimulación antigénica o mitogénica, y las células NK
lo producen en respuesta a IL-2, anticuerpos anti-CD16, o en presencia de
macrófagos activados (Carson, 1995).
In vilro, el IFN es un potente estimulador de los macrófagos y aumenta
fuertemente su actividad tumoricida. Origina una regulación a la alta de las
moléculas MHC en muchos tipos celulares incluyendo las APCs. Además,
regula la producción de anticuerpos por las células B (Snapper, 1987). y esti-
mula a las células Thl. En respuesta a la infección, el IFN induce a los ma-
crófagos a matar a los microorganismos intracelulares a través de la pro-
ducción de metabolitos oxidativos y proteasas. Clínicamente, el IFN se ha
empleado para aumentar la capacidad bactericida de los fagocitos en los que LMN = laminina FBN = tibronectma FBGN • librinogeno. VN = vitronectina.
tienen enfermedades granulomatosas crónicas (Bolinger, 1992). Se ha mos- vWF = factor de von Willebrand. VCAM = molécula de adhesión celular, LFA =
trado poco prometedor como agente antitumoral. antigeno linfocitico funcional: ICAM= molécula de adhesión mtracelular
 CAPÍTULO 39 • CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
la cadena p en asociación con la subunidad « (CD11b) forma el Mac-1
? M
(CD11b/CD18), una integrina expresada en las células mieloides y en los
fagocitos mononucleares.
Las subunidades a. de las integrinas son proteínas de membrana con 120 a
180 kDa con dominios intracitoplasmáticos cortos, un fragmento extracelular
largo con siete dominios homólogos, y muchos residuos de unión para iones
metales (lugares de adhesión dependientes de iones metales [MIDAS]) que
se cree que funcionan convirtiendo la integrina de una conformación inactiva
a una activa. Tanto la subunidad a como la |i se unen a un ligando, pero se
cree que generalmente la subunidad a proporciona especificidad de ligando.
Los tallos intracitoplasmáticos de las subunidades de las integrinas a y p
se asocian con los componentes del citoesqueleto para transducir señales
mtracitoplásmicas. En el proceso de transducción de la señal, las integrinas
se asocian e interaccionan con las otras proteínas asociadas a la membrana,
con los componentes del citoesqueleto y con los componentes citoplásmicos
no citoesqueléticos. La proteina asociada a integrinas (IAP o IAP 50) desig-
nada como CD47, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una de
las proteínas asociadas a la membrana que a través, sobre todo, de su aso-
ciación con las integrinas (5-, puede funcionar como un transductor de señal.
Otras proteínas asociadas a la membrana implicadas en la señalización de
integrinas incluyen la caveolina-1 y el CD9, que están implicados en la for-
mación de picnosomas de la membrana celular y en la agregación plaqueta-
ria. respectivamente. Las moléculas citosólicas incluyendo la proteína asocia-
da a dominios citoplasmáticos de integrinas (ICAP-1) ayudan a orquestar la
compleja actividad de la migración de célula mediada por integrina p,.
Quizás las asociaciones intracítoplasmáticas de las moléculas de integri-
nas mejor estudiadas son aquellas asociadas con las proteínas del citoes-
queleto rx-actinina, talina filamina, vinculina, tensina y paxilina. Estas proteí-
nas del citoesqueleto a través de su asociación con las subunidades de las
integrinas p,, |1 , y p , unen la integrina al citoesqueleto y dirigen la migración
2 3
celular, la fagocitosis, la formación de fibras de estrés en los lugares de con-
tacto, la transducción de señal intracelular, y unen las proteínas del citoes-
queleto separadas.
El patrón de distribución de las integrinas es amplio, especialmente entre
aquellas integrinas (principalmente las |5,) implicadas en anclar las células a
los componentes del ECM general como el colágeno y la laminina. Para estas
Figura 39-1. El movimiento de los linfocitos del torrente sanguíneo hacia los tejidos está regulado por la interacción de la adhesina de la
superficie del leucocito y de la superficie de la célula endotelial a través de un proceso de varias etapas que incluye el atrapamiento, lami-
nación, aplanamiento y transmigración (o diapédesis) cuya dirección la proporciona el gradiente quimiotáctico.
923
integrinas que median la unión a los componentes menos ampliamente distri-
buidos, la distribución tisular está más restringida.
La expresión de las moléculas de integrina depende de la activación celu-
lar, y puede estar regulada a la alta o a la baja en respuesta a estímulos espe-
cíficos del ambiente externo, incluyendo la estimulación local por citocinas o
la interacción inmune. La interacción de las integrinas leucocitarias con las
células endoteliales es crítica para la evolución de las respuestas inflamatoria
e inmune. Además, el trasporte de las células linfoides a sus lugares de resi-
dencia y la diseminación intravascular de las metástasis implican similares
interacciones endoteliales mediadas a través de las integrinas de superficie y
otras poblaciones de moléculas de adhesión, las selectinas y sus ligandos.
La extravasación de leucocitos ocurre durante el transporte celular como el
tráfico de las células T y/6 a las placas de Peyer, y como parte de la respuesta
inflamatoria. Ambos procesos implican etapas similares, empleando diferen-
tes moléculas de adhesión. En la inflamación el proceso comienza con la libe-
ración local de citocinas proinflamatorias como el TNF-ot, la IL-1 y el IFN-y,
que activan el endotelio local para aumentar la expresión en su superficie de
moléculas de adhesión incluyendo miembros de la superfamilia de inmuno-
globulinas, el VCAM-1 y el ICAM-1. Además, las células endoteliales liberan
agentes quimiotácticos incluyendo la IL-8, formando una superficie de unión
y un gradiente quimiotáctico soluble reconocible por la transmigración de
células inflamatorias, que las localiza en los focos inflamatorios.
Este proceso para los linfocitos y los eosinófilos (Fig. 39-1) implica: (1) unión
de los leucocitos circulantes a la superficie endotelial principalmente por
las selectinas endoteliles (selectinas E y P) y sus ligandos leucocitarios; y
(2) movimiento leucocitario {rolling), en donde a través de la expresión rápi-
da secuencial, principalmente de la integrina leucocitaria VLA-4 y u p , la 4 ?
fuerza de cizallamiento (shean forcé) proporcionada por el torrente sanguíneo
mueve los leucocitos a lo largo de la superficie endotelial, permitiendo poner
estas integrinas en contacto con sus ligandos endoteliales, el VCAM-1 y el
MAdCAM-1. respectivamente. En el caso de los neutrófilos, el movimiento o
rodamiento está mediado solo por las selectinas. A medida que ruedan, las
moléculas de adhesión celular leucocitarias desencadenan acontecimientos
bioquímicos conduciendo a (3) la activación leucocitaria y a la conversión de
sus integrinas en estados activados. La ahora aumentada avidez y afinidad
de, principalmente, LFA-1 e ICAM-1 lleva a aumentar la adhesión celular
5. M i g r a c i ó n
quimiotáctica
 924 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
leucocitaria endotelial, y a la larga (4) a detener el movimiento leucocitario, y
(5) la transmigración leucocitaria del endotelio, aunque siguiendo a un gra-
diente quimiotáclico. Es todavía tema de debate si los leucocitos pasan direc-
tamente a través de las células endoteliales individuales, o simplemente
pasan entre las células endoteliales adyacentes. Una vez atravesado el endo-
telio, la migración celular mediada por integnnas a través de la matriz extra-
celular por medio de un gradiente quimiotáctico completa el viaje de los leu-
cocitos a los focos de inflamación.
Los estados de deficiencia para las integrinas |l, (deficiencia de adhesión
leucocita tipo I) y los defectos congénitos en la expresión de las selectmas
y de los ligandos demuestra el papel indispensable que juegan estos recep-
tores en producir la respuesta inflamatoria y en el tráfico linfocita. En estos
pacientes los neutrófilos son incapaces de salir del torrente sanguíneo y de
migrar a los lugares de inflamación o infección, creando en efecto un estado
de supresión inmune con aumento de la susceptibilidad a las infecciones bac-
terianas y un neutrofilia periférica paradójica (Bullard, 1996). Los eventos que
acontecen en el choque séptico, en la trombosis, en la lesión de reperfusión
y en las metástasis también requieren la actividad de las integrinas y las
selectinas. Este conocimiento ha llevado al empleo terapéutico de anticuerpos
monoclonales, ligandos de moléculas de adhesión solubles y otras interven-
ciones, incluyendo los oligonucleóticos antisensibilizantes para superar la
enfermedad mediada por las moléculas de adhesión (Gonzalez-Amaro. 1998:
Buckley. 1997).
Selectinas
La familia de las selectinas (Gonzalez-Amaro. 1999) contiene tres proteí-
nas homologas. La L-selectina (CD62L) es expresada por la mayoría de los
leucocitos y se cree que juega un importante papel en el transporte o tráfico
de los linfocitos nativos y de memoria. La P-selectina (CD62P) es almacena-
da en los granulos </ y en los cuerpos de Weibel-Palade de las plaquetas y
de las células endoteliales. respectivamente, y es expresada en la superficie
celular Iras la activación celular. La E-selectina (CD62E) se encuentra en la
superficie de las células endoteliales activadas. Las selectinas interaccionan
con los grupos carbohidrato como el sialil-Lewis" y el sialil-Lewis* y posible-
mente con otros ligandos incluyendo las integrinas y los glicolípídos. No se ha
determinado la total extensión de ligandos fisiológicos de las selectinas, pero
se espera que la lista incluya moléculas expresadas en los leucocitos y el
endotelio, ya que las selectinas son importantes para las interacciones leuco-
cito-leucocito y leucocito-endotelio.
El papel de las selectinas es doble: mediar la interacción célula-célula y
contribuir a la activación celular a través de la señalización intracitoplas-
mática. Al igual que las integrinas, las selectinas son críticas en el contac-
to y movimiento (rolling) inicial de los leucocitos sobre el endotelio activado
antes de la extravasación. Tras la unión a la forma soluble de la glicoprote-
ina similar a la mucina GlyCAM-1 (un produelo de alta expresión endote-
lial), la L-selectina es capaz de mediar la activación de las integrinas B, y
su adhesión a la fibronectina. La P y la E selectina también pueden servir
como moléculas receptoras de transducción de señal, ya que producen un
aumento del Ca2+ mtracelular libre en los leucocitos que se adhieren a las
células endoteliales (Huang, 1993).
PERSPECTIVAS
Claramente, muchas de las citoemas y moléculas de adhesión presenta-
das aquí juegan un papel en los estados de enfermedad. Los médicos espe-
ran que un día se estimule la remisión de las lesiones patológicas mediadas
por citocinas a través de la manipulación tn vivo de los niveles y proporcio-
nes de las citocinas pro y antiinflamatorias. Antes de que esto se pueda con-
siderar seriamente, los investigadores y los laboratorios deben continuar
descifrando el lenguaje de las citocinas en las células, y desanoliando y reti-
nando los ensayos significativos de éstas. De momento es posible monitori-
zar la enfermedad subclinica (IL-18), identificar poblaciones de nesgo para
la sepsis (IL-6). predecir la progresión de la enfermedad (IL-10) y disminuir
los efectos adversos de la enfermedad (TNF) a través de la monitorización
de los niveles de citocinas seleccionadas y administrando las citocinas apro-
piadas. En la actualidad, mientras no esté claro, los ensayos clínicos conti-
nuados y las mejoras en los ensayos con citocinas dilucidarán finalmente
qué intervenciones y mediciones de laboratorio son realmente útiles en la
práctica clínica.
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 C A P Í T U L O 40

Antigene leucocitario humano: compie о

mayor de h istocompatibiIidad del hom зге
• Armead H. Johnson, Ph.D.
• Carolyn Kafovich Hurley, Ph.D.
• Robert J. Harfzman, Capt, MC, USN, M.D.
• Judith A. Wade, B.Sc.

GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR RECONOCIMIENTO DE LAS MOLÉCULAS

DE HISTOCOMPATIBILIDAD 928 MHC EXTRAÑAS 936
Genética básica
REPETICIÓN EN TÁNDEM Y POLIMORFISMO
Composición del MHC
NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL MHC 936
Localización de los genes del MHC
Herencia MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR 936
Desequilibrio de unión
Variación étnica NOMENCLATURA HLA 937
Especificidades serológicas y celulares
MOLÉCULAS DE CLASE I:
SUBREGIONES HLA-A. -B. -C 930 Designaciones alélicas basadas en el ADN

Estructura de las moléculas de clase I TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN

Organización de los genes de clase I DEL POLIMORFISMO DEL HLA 938
Regulación de la expresión de los genes de clase I Tipificación basada en el ADN de los alelos
Función de las moléculas de clase I de clase I y clase II
Otros genes de clase I Detección serológica de las moléculas
de clase I y clase II
MOLÉCULAS DE CLASE II: SUBREGIONES HLA-DR.
-DQ, -DP 934 Detección celular de las moléculas de clase II

Estructura de las moléculas de clase II TRASPLANTE DE ÓRGANOS/TEJIDOS 941

Organización de los genes de clase II Bases genéticas del trasplante
Desequilibrio de unión de los genes en la Concordancia de histocompatibilidad
región de la clase II Trasplante renal
Regulación de la expresión de los genes de clase II Trasplante de órganos no renales
Función de las moléculas de clase II Trasplante alogénico de células
Otros genes de clase II progenitoras hematopoyélicas
CARACTERÍSTICAS DE LOS FRAGMENTOS RESUMEN 946
ANTIGÉNICOS UNIDOS POR LAS MOLÉCULAS
MHC DE CLASE I Y CLASE II 936 BIBLIOGRAFÍA 946

La supervivencia depende de la capacidad del sistema inmune de recono-
cer y responder a una multitud de sustancias extrañas (antígenos). Aunque
este mecanismo de defensa es básico para la supervivencia en un mundo de
microorganismos hostiles, este mismo sistema de defensa tiene un impacto
negativo cuando se trasplantan tejidos de uno a otro individuo o cuando su
mal funcionamiento dispara las reacciones autoagresivas. Los genes del com-
plejo mayor de histocompatibilidad (MHC) codifican proteínas esenciales en
el reconocimiento inmune: las moléculas de clase I y clase II (Fig 40-1). En
el hombre, las moléculas de clase I incluyen el antigeno leucocitario común
(HLA-) HLA-A. HLA-B y HLA-C. y las moléculas de clase II incluyen el HLA-
DR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas moléculas son los clásicos antigenos del tras-
plante. Otras moléculas codificadas en el MHC son las moléculas de clase III
(véase Cap. 41). Estas incluyen los componentes del complemento ligados al
MHC (C2, C4 y Bl), la 21-hidroxilasa (CYP21), la proteína 70 del golpe de
calor (Hsp70) y el factor de necrosis tumoral (TNF).
Durante una infección, los microorganismos invasores pueden tanto infectar
como ser ingeridos por las células y entonces ser degradados a fragmentos pep-
tidicos. Dentro de la célula, las moléculas del MHC de clase I o de clase II se
unen a los fragmentos antigénicos derivados de los microorganismos. Una vez
que los fragmentos antigénicos se han unido a las moléculas del MHC y han sido
translocados a la superficie celular, los receptores de los linfocitos T interaccio-
nan con el complejo fragmento antigenico-molécula de MHC, disparando tanto
la respuesta inmune humoral como la celular (Fig. 40-2). Las moléculas de
superficie celular específicas de las células T, CD4 y CD8. actúan para potenciar
esta interacción celular y para transmitir las señales de activación. Otras molé-
culas de superficie celular actúan para aumentar la afinidad de las interacciones
celulares (p. ej.. el CD2 y su ligando, el CD58 [LFA-3] o el CD11a/CD18 (LFA-1J
y su ligando, el CD54 [ICAM-1]) y para transmitir las señales coestimuladoras (p.
ej., el CD28 y sus ligandos, el CD80/CD86 [B7j y el CD40 y su ligando, el CD154)
(véase Cap. 39). El polimorfismo de los genes que especifican las moléculas
 928 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Región HLA clase II

Figura 40-1. Mapa del compiejo de ge-

nes del MHC en el cromosoma 6. El
HLA-DPB2 en la región HLA clase II
está localizado cerca del centrómero.
El HLA-F es el más leioménco. La re-
gión entre el HLA-DRA y el HLA-B no
se muestra. (De The Anthony Nolan
Bone Marrow Trust: www.anthonyno-
lanorg.uk/HlG. con permiso.)

MHC de clase I y clase II afecta a la especificidad de unión al antigeno de las cromosomas (es decir, un número haploide) se transmite por cualquiera de
moléculas, originando diferencias en las respuestas inmunes sobre los miem- los gametos dados. El doble, o número diploide de cromosomas, se restable-
bros de las especies. El mismo patrón de interacciones entre el exterior celular y ce cuando se fusionan los gametos masculino y femenino para formar el cigo-
el complejo MHC clase I o clase ll-antígeno y un linfocito T ocurre no solo en el to. De este modo, para un rasgo determinado por un gen, siempre habrá cua-
reconocimiento de los patógenos invasores, sino también en el reconocimiento tro combinaciones genéticas posibles en la descendencia, cada una con una
de las moléculas extrañas de clase I y clase II (aloantigenos) y en el reconoci- probabilidad de incidencia igual. Estas leyes de la segregación y de división
miento de los antigenos propios (autoantígenos) (véase Cap. 41). aleatoria se aplican a los genes del sistema MHC. Las definiciones para tér-
Ya que las moléculas MHC extrañas de clase I y clase II son reconocidas minos genéticos que serán empleados este capítulo se dan a continuación
como antigenos "de trasplante", es beneficioso garantizar que el donante y el (Crow. 1976; www.nhgri.nih.gov).
receptor son hislo- (es decir. Tejido) compatibles (es decir. HLA emparejado).
Las moléculas de clase I y clase II tienen múltiples alelos posibles en la pobla-
ción. Por ello, garantizar la compatibilidad es a menudo una tarea difícil, que
requiere la colaboración del personal médico, del personal clínico que tipifica
el HLA, y de los coordinadores del tejido donante (p. ej., redes de donantes de
órganos y registros o bancos de donantes de células hematopoyéticas).
En este capítulo se trata la genética, estructura, lunción, nomenclatura y
las técnicas de detección de los productos génicos del MHC humano, el HLA-
A, -B y -C (clase I) y el HLA-DR, -DQ y -DP (clase II). También se discute la
importancia de la concordancia del HLA en el trasplante. Además de las listas
de referencia del final del capitulo, en la Tabla 40-1 se nombran páginas web
útiles que proporcionan tanto material de referencia como actualizaciones de
resúmenes clínicos.

GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR

DE HISTOCOMPATIBILIDAD

Genética básica
La primera ley de Mendel, la ley de la segregación, eslá basada en el prin-
cipio de que los rasgos hereditarios están determinados por factores que
están distribuidos en la progenie. En cualquier individuo, estos factores, o
genes como ahora se llaman, están presentes en los cromosomas (véase
Cap. 62). Cada gen tiene múltiples formas (esto es. alelos). Como los huma-
nos son diploides. hay dos genes por cada par de cromosomas homólogos.
En la meiosis. los cromosomas se separan al azar durante la formación de los Figura 40-2. Modelo de las interacciones moleculares implicadas en el reconoci-
gametos (ovocito y espermatozoide) de modo que solo ur,o de cada par de miento antigénico.
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD... 929

Tabla 40-1 Sitios web sobre HLA y trasplante

Dirección Información

www swmed edu/horne_pages/ashi/ashi.htm Sociedad Amencada para la Histocompatibilidad e inmunogenética. tipificación estándar del HLA
www wbi.ac.uk/imgi/hla/ Base de datos de la secuencia HLA, herramientas para la presentación de alelos y para la
manipulación de secuencias
www anlhonynolan org uk/hig Información de nomenclatura de la Organización Mundial de la Salud
www ihwc org o ww ihwg.org Taller Internacional de Histocompatibilidad
www marrow.org Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea
www.bml.org Información para el Trasplante de Médula Ósea
wwwbmdw.org Banco de Donantes de Médula Ósea
www worldmarrow org Asociación Mundial de Donantes de Médula
www.ibmtr.org Registro Internacional de Trasplante de Medula Ósea
www.ctstransplant.org Estudio Colaborador de Trasplante
wwwunos.org United Network lor Organ Sharing
www nhgn.nih.gov Instituto de Investigación Nacional del Genoma Humano

Gen El factor unitario de la herencia.
Cromosoma Transportador de los factores unitarios de la herencia.
Locus Posición de un gen en un cromosoma.
Alelo Forma alternativa de un gen en un locus único.
Homocigoto Tener idénticos alelos en un locus, uno en cada cromosoma.
Heterocigoto Tener diferentes alelos en un locus. uno en cada cromosoma.
Codominancia Estado en el que el alelo de cada locus expresa su efecto
característico igualmente en el heterocigoto.
Genotipo Composición genética de un organismo o individuo.
Fenotipo Características observables producidas por los genes.
Polimórfico Tener dos o más genotipos frecuentes distintos mantenidos en la
población.
Cromosomas homólogos Los dos miembros de un par de cromosomas que
tienen su correspondiente locus génico, uno derivado de cada progenitor.
Entrecruzamiento Cambio de segmentos entre cromosomas homólogos. Es-
te proceso también puede llamarse recombinación.
Alo- (antígeno. injerto) Se refiere a diferencias antigénicas entre individuos
de la misma especie.
Auto- (antígeno, injerto) Se refiere a tejidos o antigenos del mismo individuo
(es decir, propios).
Composición del MHC
El complejo de genes de histocompatibilidad mayor en humanos está loca-
lizado en el brazo corto del cromosoma 6 (es decir, 6p2l). Abarca 3.600 kb
(kilobases) e incluye 224 locus génicos identificados, de los que 128 está
previsto que se expresen. Se estima que aproximadamente el 40% de los ge-
nes expresados tienen una función en el sistema inmune (Aguado. 1999).
Los genes HLA del MHC están localizados en seis subregiones: HLA-A.
HLA-C. HLA-B. HLA-DR. HLA-DOy HLA-DP (Fig. 40-1). Cada subregíón co-
difica un mínimo de una glucoproteína de superficie celular. Con una única
excepción, los genes del HLA son altamente polimórficos. esto es, cada uno
de los genes del HLA tiene múltiples alelos en la población humana. De
hecho, los genes del HLA son los locus más polimórficos conocidos en el
hombre (Parham, 1995; Tabla 40-1, www.anthonynolan.org/uk/hig). Debido a
que los genes del HLA especifican moléculas que tienen un papel importan-
te en la respuesta inmune, se cree que el polimorfismo es esencial para la
supervivencia de las especies y para mantenerse en la población por la se-
lección.
decir, estudios de entrecruzamiento en familias) y por técnicas de biología
molecular incluyendo la clonación génica. la secuenciación de ADN y elec-
Iroforesis en gel con campo pulsátil. La última técnica detecta la presencia
de genes en grandes fragmentos simples de ADN El orden de mapeo de los
genes en el MHC es HLA-A. -B. -C. -DR. -DO. -DP. siendo el HLA-A distal al
centrómero (Fig. 40-1).
Herencia
Los genes del MHC están muy ligados, esto es, se segregan en bloque a
la descendencia. El complejo de genes ligados que reside en uno del par de
cromosomas homólogos y que se segrega en bloque a la descendencia se
denomina "haplotipo". Cada individuo hereda dos haplotipos MHC (uno de
cada progenitor) y por ello tiene dos alelos para cada uno de los genes. Esos
alelos se expresan codominantemente. La herencia de los genes del MHC
sigue las reglas de la segregación definidas por Mendel. En una familia, cada
niño hereda un haplotipo del MHC de la madre y otro del padre. Por conven-
ción, los haplotipos paternos se designan como a y ó y los haplotipos mater-
nos como c y d. Por ello, hay cuatro genotipos posibles del MHC en el des-
cendiente: ac. ad. be y bd. Ya que la posibilidad de heredar un haplotipo
determinado es aleatoria, la probabilidad de incidencia de cualquiera de los
cuatro genotipos es una entre cuatro para cada emparejamiento. En una fami-
lia con cinco hijos, al menos dos de los niños tendrán un HLA idéntico (asu-
miendo que no hay entrecruzamiento). En la Figura 40-3 se da un ejemplo de
emparejamiento y de los cuatro posibles genotipos. Aunque los genes del MHC
están muy ligados, hay casos de familias en las que se ha producido un entre-
cruzamiento (Fig. 40-4). Se pensó en la frecuencia de entrecruzamiento entre
dos genes ligados como medida de la distancia de separación entre los genes;
sin embargo, los datos moleculares han sugerido la existencia de puntos calien-
tes de recombinación en el ADN implicado que puede aumenlar o disminuir la
probabilidad de recombinación durante la meiosis (Uematsu, 1988)
Desequilibrio de unión
La observación de que alelos en diferentes locus genéticos ocurren en la
población en el mismo haplotipo significativamente más frecuentemente de lo
que cabria esperar sobre la base de la posibilidad aislada se denomina des-
equilibrio de unión. La frecuencia esperada de que ocurran a la vez dos ale-
los (f 1. f2) es el producto de la frecuencia génica de cada alelo en dicha pobla-
ción ([Lj—u, = f1 x f2]). La frecuencia observada se determina por estudios
familiares en la misma población. El desequilibrio de unión es una caraclerís-

Localización de los genes del MHC

Los genes del MHC fueron asignados al brazo corto del cromosoma 6 (6p)
sobre la base de estudios citogenéticos de cromosomas aberrantes (esto es,
cromosomas que han sufrido una traslocación). El orden y la posición de ma-
peo de los genes del MHC fue determinada por análisis de unión meiótica (es
 930 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA

tica del MHC humano y se extiende desde el HLA-A hasta el HLA-DQ. El
ejemplo mejor conocido de desequilibrio de unión es el haplotipo A1, Cw7. B8,
DR17(3), DR52, DQ2 en caucasianos que es observado aproximadamente
cuatro veces más frecuentemente de lo esperado. El significado del desequili-
brio de unión como aplicación a la competencia inmune y a la enfermedad se
discute posteriormente en el Capítulo 41 en el apartado Haplotipos extendidos.
Variación étnica
Los datos acumulados del estudio de los grupos de población mundial
(Dausset. 1973; Imanishi, 1992; Cadavid, 1997; Bugawan. 1999) demuestran
que las frecuencias de los alelos del HLA difieren significativamente entre los
grupos de población étnica. Los haplotipos del MHC y el desequilibrio de
unión de los alelos también difieren. Estas observaciones deben tenerse en
cuenta cuando se desarrollan alotrasplantes de células progenitoras hemato-
poyéticas de registros y bancos de donantes no relacionados como en el Pro-
cación de acontecimientos recombinacionales que separaban las dos series
alélicas. Estas dos series alélicas fueron llamadas la primera o LA (ahora
HLA-A) y la segunda, o cuatro series (ahora HLA-B). Estos nombres deriva-
ban de la descripción de las series alélicas LA 1, 2, 3 hecha por Payne en
1967 y de las series alélicas 4a, 4b de van Rood en 1969. Un tercer locus fue
propuesto por primera vez en 1970; sin embargo, no se confirmó hasta 1975,
cuando se identificó una familia con recombinación entre el HLA-B y el nuevo
locus. Este tercer locus fue designado HLA-C tras el Taller Internacional de
Histocompatibilidad de 1975. Dausset (1981) recibió el Premio Nobel de Me-
dicina en 1980 por su original trabajo sobre el sistema HLA humano.
Estructura de las moléculas de clase I
Las moléculas clásicas de clase I, denominadas HLA-A, HLA-B y HLA-C en
el hombre, son heterodímeros formados de un polipéptido glicosilado trans-
membrana (cadena pesada, 44 kDa) asociado no covalentemente con la |3- ;

grama Nacional de Donantes de Médula de los Estados Unidos (NMDP) (Per- microglobulina (12 kDa) (Fig. 40-5) (Bjorkman, 1990). La cadena pesada de
kins. 1994). Tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos dictan el la molécula de clase I se ancla a la membrana celular y está orientada con
número de voluntarios requeridos para encontrar un donante HLA-idéntico no sus aminos terminales en el exterior celular. La p^microglobulina está aso-
emparentado para cualquier paciente. Algunos pacientes (i.e., aquellos con ciada con la región extracelular de la cadena pesada y es necesaria para la
tipos raros o inusuales) no pueden encontrar donantes idénticos no empa- expresión de la superficie celular.
rentados de entre más de 6 millones de voluntarios listados en todos los regis-
tros de donantes mundiales (Beatty 1995; Mori, 1997). La mejora en los méto-
dos para el injerto de células progenitoras de donantes parcialmente
HLA-idénticos puede permitir el trasplante en pacientes para los que no se
pueden encontrar combinaciones cercanas (véase Cap. 33).

MOLÉCULAS DE CLASE I:
SUBREGIONES HLA-A, -B, -C

Las moléculas HLA-A y -B fueron las primeras moléculas del MHC descritas
en humanos (Dausset, 1981; van Rood, 1993). Ya que estas moléculas fueron
definidas por respuestas de anticuerpos frente a los glóbulos blancos (WBCs),
son denominadas "antígenos" leucocitarios humanos. Los anticuerpos leucocita-
rios fueron observados en humanos muy pronto, en los años 20, pero no fue
hasta los años 50 cuando comenzó el estudio sistemático. En 1952, Dausset
demostró convincentemente la existencia de los anticuerpos leucocitarios (leuco-
aglutininas). Ya que estas leucoaglutíninas no reaccionan con los leucocitos del
anticuerpo productor pero reaccionan con un porcentaje de leucocitos del grupo
de O de los eritrocitos de individuos no emparentados, sugirió que estas leucoa-
glutíninas eran aloantjcuerpos. Poco después, Payne (1964) informó de que el
suero de pacientes que tenían reacciones febriles no hemolíticas a la transfusión
de sangre contenia frecuentemente leucoaglutíninas que demostraban la aloes-
pecificidad. En 1958, Dausset describió el primer aloantígeno HLA "MAC* (ahora
HLA-A2+HLA-28) y mostró que estaba genéticamente determinado.
Originalmente, se pensó que las especificidades de leucocito eran produc-
to de un locus simple. Se estableció un modelo de dos locus, cada locus con Figura 40-5. Modelo esquemático de la estructura de las moléculas de clase I y
múltiples alelos, a través de los estudios HLA en familias mediante la identifi- clase II.
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD... 931

Tabla 40-2 Ejemplos d e antigenos H L A r e c o n o c i d o s por la O M S (especificidades) definidos por tipificación serológlca y alelos HLA
definidos por secuenciación d e A D N ' '
A n t í g e n o s HLA-A A n t í g e n o s HLA-DQ Alelos' HLA-A Alelos* HLA-DQ A1 Alelos HLA-DBQI

A1 DOI A0101-0I04N DOA1 0101-0105 DOB 10501-0504

A2 DQ2 A 02011-0230 DOA 10201 DOB 1 06011-0615
A203' DQ3 A 03011-0304 DOAI03011-0303 DQB1 0201-0203
A2I0 DQ4 A1101-1105 DQA 10401 DOB 1 03011-0309
A3 DQ5(1) A2301 DQA1 05011 - 0505 DOB 1'0401-0402
A9 DQ6(I) A2402101-2420 DOAI06011-06012
A10 DQ7(3) A2501-2502
A11 DQ8(3) A2601-2612
A19 DQ9(3) A 2901-2904
A23(9)' A 3001-3007
A24(9) A 31012-3104
A2403 A3201-3203
A25(10) A3301-3304
A26(10) A3401-3402
A28 A3601
A29(19) A4301
A30(19) AGG01--6603
A31(19) A68011-'6809
A32(19) A6901
A33(19) A7401-7403
A34(10) A 8001
A36
A43
A66(I0)
AG8(?8)
A69(28)
A74(19)
A80
Adoptado de www anlhonynolan org uk/HIG con permiso de SGE Marsh
Cada columna de la tabla es independiente.
!
Lósatelos HLA-A especilican los antígenos HLA-A. El antigeno A1 se especilica por lósatelos A'0101 o AVI 02 o A 0103. El AOfOíNesun alelo nulo o no expresado
• Los alelos HLA-DQ) y HLA-DOBl especifican los antigenos HLA-DQ. El antigeno D05 (I) es especilicado por múltiples combinaciones diferentes del DOAI y el
DOB1 incluyendo (1) los alelos DOA1V101 y DAB1V501 y (2) DOAV0101 y DOB10502
En el pasado las designaciones de la división seroiógica eran dadas a especificidades que parecían identificar el antigeno especificado por un alelo HLA simple
(p ej. A2 se divide en A203. A210. B7 se divide en B703: B39 se divide en B3901 y B3902) Ahora se ha reconocido que otros átelos pueden también codificar anli
genos que llevan estas especificidades serctógicas y Comité de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que se desechen estas divisiones
1
Los números entre paréntesis indican la vieía especificidad seroiógica El tipo seroiogico puede listarse sin la vieja especificidad Por ejemplo, tanto A23(9) como
A23 son designaciones correctas

La región extracelular de la cadena pesada de clase I está dividida en tres otro a través de estas hojas plegadas (i y su estructura simula mucho la desen-
dominios llamados (/.,, u¡ y a , teniendo cada uno alrededor de 90 residuos
3 ta para el dominio de la región constante de la inmunoglobulina. Los dominios a,
de aminoácidos. El dominio a, aminoterminal contiene un lugar de glicosila- y a¡ están unidos para formar hoja plegada |5 de 8 cadenas. Esta hoja se detie-
ción en el residuo asparragina en la posición 86. El segmento transmembra- ne por dos hélices ct formando una ranura en la parte alta de la molécula. Esta
na (TM) de aproximadamente 24 aminoácidos es el más hidrofóbico. mientras ranura es el sito para la unión de los fragmentos peptidicos antigénicos por la
que el segmento intracelular carboxiterminal de la molécula está formado molécula de clase I (Fig. 40-6S). Los lados y el fondo de la ranura están forma-
principalmente por residuos hidrofilicos con un grupo de residuos básicos dos por cadenas laterales de aminoácidos que componen las hélices y las hojas
adyacentes a la superficie citoplásmica (CY) de la membrana celular. plegadas |i Muchos de los aminoácidos que alinean esta ranura son polimórfi-
El polimorfismo de las moléculas de clase I (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997. cos. creando diferencias alelo-específicas en la especificidad de unión al antíge-
1999) se define por el empleo de (1) anticuerpos específicos de clase I (anti- no entre los diferentes productos alélicos de clase I (Stern, 1994). Otros residuos
cuerpos aloantisuero y monoclonales) que se unen a las moléculas del HLA: (2) en las regiones helicoidales de la ranura interaccionan con el receptor de célu-
línfocitos T citotóxícos (LTCs) que reconocen y destruyen en respuesta a la esti- las T durante el reconocimiento del complejo clase l-fragmento antigénico por el
mulación in vitro por moléculas de clase I extrañas o alogenicas; (3) imagen iso- linfocito T (véase Fig. 40-2).
eléctrica de las moléculas de clase I aisladas: (4) reacción en cadena de la poli-
merasa (PCR) basada en la tipificación del ADN de los alelos de clase I; y (5)
secuenciación de los nucleótidos de los alelos de clase I. La mayor parte del Organización de los genes de clase I
polimorfismo de la clase I proviene de las diferencias en las secuencias de ami- Las cadenas pesadas del HLA están codificadas en el MHC en el cromo-
noácidos encontradas en los dominios ot, y ce, de la cadena pesada. El dominio soma 6 (Fig. 40-1) (Shiina, 1999) y son altamente polimórficas. mientras que
(«,es altamente conservado entre las moléculas HLA de clase I. la IVmicroglobulina está codificada en el cromosoma 15 y no se conoce que
Nuevas perspectivas en la estructura de la molécula del HLA llegan cuando sea polimórfica en humanos. El gen típico de clase I está codificado por ocho
se define la estructura tridimensional de la molécula de clase I utilizando crista- exones que corresponden a los segmentos de la molécula recién descrita
lografía con rayos x (Bjorkman. 1987). La estructura de la porción extracelular se (Fig. 40-7). El primer exón codifica la región 5 no traducida y el péptido hidro-
muestra en la Figura 40-6A La molécula está formada por dos pares de domi- fóbico líder. Los exones 2 a 4 codifican los tres dominios extracelulares: el
nios estructuralmente similares: el u, tienen la misma conformación terciaria que exón 5 codifica la región transmembrana. Los exones sexto y séptimo codifi-
el it¡, mientras que el u- y la |5,-microglobulina lienen similares conformaciones can la región citoplasmálica y el exón octavo codifica la región 3' no traduci-
terciarias. Los dominios a, y [5,-microglobulina están formados cada uno por dos da incluyendo el lugar de adición poly(A). Las secuencias intermedias (llama-
hojas 3 plegadas antiparalelas. una con cuatro cadenas y otra con tres cadenas, das mtrones) entre los exones son transcritas a ácido ribonucleico (ARN) pero
conectadas por un puente disulfuro. Los dominios (t, y ix¡ interaocionan uno con son eliminadas durante el corte y empalme del mensajero (ARNm).
 932 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 40-6. A. Modelo tridimensional de la porción extracelular de la molécula de clase I. B. Vista superior de la misma molécula mostrando
la ranura de unión al péptido (De Bjorkman PJ, Saper M.A, SamraouiB, el al: Structure of the human Class I histocompatibility antigen, HLA-
A2. Nature 1987; 329:506. con permiso.)

Regulación de la expresión de los genes de clase I antigénicos en los linlocilos T (véase Cap. 36). La presentación del antíge-
no por las moléculas de clase I permite a las células T detectar y crear una
Las moléculas HLA de clase I son expresadas como glucoproteínas trans-
respuesta citotóxica contra el material extraño (p. ej., un virus o proteínas
membrana en la superficie de muchos tipos celulares. Sin embrago, el nivel de
anormales de células malignas). En el citosol. los antigenos mtracelulares
expresión de superficie puede variar importantemente (Singer, 1990). El nivel
(incluyendo las proteínas propias y las proteínas virales o anormales) son
basal de moléculas de clase I es mayor en las células linfoides; las moléculas
degradados en fragmentos peptidicos (Rock, 1999). Los fragmentos peptídi-
de clase I son indetectables en la membrana de otros tipos celulares como las
cos son transportados al retículo endoplasmático donde se unen a la ranura
células del cerebro, las células musculares y los espermatozoides. La secuen-
de la parle alta de las recientemente sintetizadas moléculas de clase I y
cia de elementos localizados por encima de los genes de clase I se unen a fac-
entonces son transportadas a la superficie celular (Pamer. 1998; T.H.Hansen,
tores reguladores que controlan la expresión en la superficie celular de las
1997) (Fig. 40-2). Cuatro genes, localizados en la región de clase II del MHC
moléculas de clase I. Durante una respuesta inmune, la expresión en la super-
(Figs. 40-1 y 40-8), están implicados en este proceso. Dos de estos genes
ficie celular de los genes de clase I puede ser regulada al alza por las citocinas
(LMP2 y LMP7) codifican componentes del complejo del proteosoma. una
(p. ej., el interferón-Y y el TNF) uniéndose a los elementos reguladores supe-
estructura macromolecular que degrada las proteínas en el cilosol (Tanaka,
riores. Los tumores y ciertos virus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana
1997). Los otros dos genes {TAP1 y TAP2) codifican componentes de los
[VIH]) pueden suprimir la expresión de clase I (Brodsky, 1999).
transportadores peptidicos que mueven los péptidos del citosol al retículo
endoplasmático (Momburg, 1998).
Función de las moléculas de clase I Los LTC CD8+ reconocen el péptido procesado en conjunto con la molé-
Las moléculas HLA-A, -B y -C juegan papeles clave en la respuesta inmu- cula de clase I (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para
ne. Primero, en la respuesta inmune adaptaliva, las moléculas de clase I se determinar este mecanismo, los LTCs fueron generados por la estimulación in
unen a péptidos derivados de proteínas sintetizadas en el citosol y las pre- vitro con células autólogas infectadas con virus. El reconocimiento y la lisis de
senta en la superficie celular para que sean reconocidas por los receptores la célula diana fue específica para cada cepa de virus preparada. El recono-
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD... 933

Figura 40-8. Mapa de la región de clase II del MHC humano. Los producios génicos codificados por cada región se nombran debajo No están
incluidos lodos los genes.

cimiento también estaba afectado por el polimorfismo alélico de las moléculas taliva como en la innata (O Callaghan. 1998) Sus genes son homólogos a los
de clase I. ya que sólo las células diana infectadas viralmente que compartían genes de la clase I clásica en estructura y los polipéplidos codificados por
el producto(s) alélico de clase I apropiado con el que respondía fueron Usadas estos locus también se asocian con la |i,-microglobulina. Sin embargo, al igual
(Zmkemagel. 1997a. 1997b). El último requerimiento se denomina "restricción que un nivel alto de polimorfismo alélico es un marcador de los locus del HLA-
MHC". Znkernagel y su colaborador Doherty recibieron el Premio Nobel de A, HLA-B y HLA-C, un nivel ba|o de polimorfismo del locus del HLA-E. HLA-F
Medicina en 1996 en reconocimiento a la importancia del concepto de la res- y HLA-G es una característica definitoria de estos genes. Además, en compa-
tricción MHC en la inmunología. ración con las moléculas de clase I clásicas, la expresión en la superficie celu-
Segundo, la molécula de clase I tiene una función protectora en la res- lar de moléculas de clase I no clásicas es baja y la distribución de estas molé-
puesta inmune innata previniendo la lisis de la célula diana efectuada por las culas de clase Ib en los tipos celulares especilicos varia.
células asesinas naturales (NK). A diferencia de los LTC. las células NK no
HLA-G. El HLA-G se expresa principalmente en las células extravellosita-
requieren la activación a través del reconocimiento de péptidos unidos a la
rias del citotrofoblasto en la inlertase feto-materna, donde se cree que |uega
molécula de clase I sino que pueden lisar y destruir las células diana que han
un papel en la tolerancia matemofetal (Le Bouteiller. 1999). El HLA-G. como
perdido la expresión de la molécula del HLA clase I clásica en la superficie
ligando para al menos tres NK y otros receptores de inhibición celular, protege
celular. A través de este mecanismo innato, las células NK juegan un impor-
el tejido placentano de la acción citolitica de las células NK. Aunque el HLA-G
tante papel en la supervivencia frente a los virus y a las células tumorales quo
tiene la capacidad de unirse y presentar el antígeno procesado (es decir, pép-
regulan a la baja la expresión de la molécula de clase I para evitar el recono-
tidos) a las células T, la diversidad de péptidos unidos parece ser menor que
cimiento por los LTC (Lainer. 1998: Long, 1999).
la diversidad de péptidos unidos por las moléculas de clase I clásica. La regu-
Hay dos grupos de receptores de NK: (1) el receptor tipo C lectina CD94/NKG2 lación de la expresión del HLA-G también difiere de la de los genes de clase I
cuyos genes residen en el cromosoma 12. y (2) los receptores de célula ase- clasicos, ya que el gen no contiene una señal de respuesta al interierón; por
sina similares a inmunoglobulinas (KIR) codificados por genes del cromosoma ello, no es interierón mducible. Finalmente, las transcripciones del HLA-G son
19. La función de las células NK parece ser regulada por un equilibrio entre los unidas alternativamente originando al menos cuatro isoformas de unión a la
receptores de señal positivos que inician y los receptores inhibidores que membrana y dos isoformas solubles de HLA-G. Se ha hipotetizado que las for-
suprimen la activación celular. Ambos grupos de receptores reconocen los mas solubles pueden actuar como inmunosupresores específicos durante el
ligandos HLA de clase I. Por ejemplo, los receptores KIR2D diferencian entre embarazo (Le Bouteiller, 1999).
los ligandos del HLA-C basándose en la presencia de residuos de aminoáci-
dos específicos en los codones 77 y 80 (i.e.. asn77lys80 frente a ser77asn80). HLA-E. El HLA-E puede jugar un papel en la protección de la célula diana
Otro receptor de NK. el KIR3D. reconoce el polimorfismo del HLA-Bw4/Bw6 de la lisis mediada por la célula NK. Las moléculas de HLA-E se unen a un
(Fig. 40-9). Un lercer receptor NK. el CD94/NKG2. reconoce la molécula de grupo de péptidos hidrolóbicos bastante idénticos derivados de las secuencias
HLA-E en complejo con el péptido líder HLA de algunos de los productos alé- lider de las cadenas pesadas de la clase I clásica y del HLA-G. El HLA-E pre-
lieos de las moléculas del HLA-A, -B. -C y -G (Brooks 1999).
Las células NK pueden reconocer específicamente y lisar células alogéni-
cas que no expresan las moléculas específicas de clase I expresadas por la
célula efeclora (i.e.. "pérdida de lo propio") (Valíante, 1997). Esto puede ocu-
rrir potencialmente incluso en pares de trasplantes aparentemente HLA idénti-
cos donde un miembro de la pareja es homocigotico y el otro es heterocigóti-
co (p. ej., donante: Bw4, Bw6: receptor: Bw6). Por ello las células NK Bw4
específicas del donante pueden lisar las células sin Bw4 del receptor en un
injerto de progenitor celular hematopoyético. Esta respuesta puede ser unidi-
reccional en algunas situaciones. En el ejemplo, el donante no pierde ninguna
molécula HLA presente en el receptor, por ello, las células NK del receptor no A2 + B17
detectan ninguna pérdida de lo propio. Ya que las células NK son relativa-
mente radiorresistentes y comprenden una subpoblación de alrededor del
10% al 15% de los lintocitos de sangre periférica, la respuesta NK puede ser
sustancial: sin embargo, no se conoce hasta el momento el papel absoluto de
la actividad NK en la alectación al trasplante (Ruggeri, 1999).

Otros genes de clase I
Al menos se han identificado 20 genes adicionales no clásicos o de clase Ib
en la región de clase I del cromosoma 6p por clonación de genes (Aguado.
1999) Muchos de estos son seudogenes; sin embargo, muchos codifican y
expresan ARNm de tipo clase I y/o moléculas. HLA-E. HLA-F y HLA-G. Estas
moléculas pueden ser mediadores clave tanto en la respues'a inmune adap-
A2 - A69
Figura 40-9. Vista superior de la molécula de clase I con sus residuos aminoácidos
polimórticos indicados por las especificidades Bw4 y Bw6 y las especificidades de
reactividad cruzada A2 * A28 A2 - A69, y A2 + B17. (Modificado de Parham P. y
col: HLA-A. B. C: Patterns of polymorphism m peplide-bindmg. proteins. En Dupont
B [ed]: Immunobiology of HLA. Vol 1 New York. Springer-Verag. 1989, pág. 17.
con permiso.)
 934 SeccióN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
senta estos péptidos de unión a la superficie celular para el reconocimiento
por las células NK. proporcionando un chequeo para la integridad de la vía de
presentación antígénica (Lee, 1998a, 1998b; O'Callaghan, 1998). Los injertos
cutáneos en modelos de ratones transgénicos sugieren que el HLA-E puede
ser reconocido como un antígeno de trasplante (Pacasova. 1999).
HLA-F. El papel del HLA-F es desconocido. Los modelos por ordenador
predicen que ciertos residuos de aminoácidos del HLA-F pueden contribuir a
una unión del péptido putativo en la hendidura, lo que indica un papel en la pre-
sentación antigénica del HLA-F (O'Callaghan, 1998). La expresión del HLA-F
en la superficie celular no ha sido detectada en reproducciones.
MOLÉCULAS DE CLASE il:
SUBREGIONES HLA-DR, -DQ, -DP
Las moléculas de clase II en humanos fueron reconocidas por primera vez
por su capacidad para estimular a las células T alogénicas en los cultivos
mixtos de leucocitos (CfvlL). Durante el Taller Internacional de Histocompati-
bilidad de 1975, los CML fueron empleados para definir las series alélicas del
HLA-D (Thorsby, 1975). Ya que los cullivos mixtos de leucocitos requieren
siete días antes de que se puedan obtener los resultados, se buscó una
detección serológica rápida del HLA-D. En 1975, se determinó que el aloan-
tisuero contenía anticuerpos reactivos con las moléculas muy asociadas con
las especificidades previamente identificadas como HLA-D por técnicas
celulares (Dausset, 1981). Tras el Taller Internacional de Histocompatibili-
dad de 1977, estas especificidades serológicas fueron denominadas DR,
de especificidades D relacionadas, ya que se observó que el HLA-D y el
HLA-DR estaban asociados pero no eran idénticos el uno al otro. Los test
serológicos desarrollados con estudios genéticos e inmunoquimicos identifi-
caron moléculas adicionales de clase II. el DR52, el DR53, el DR51 y el DQ.
Las técnicas celulares identificaron aún otra molécula de clase II a finales de
los años 70 (Shaw, 1981). Esta molécula (ahora llamada HLA-DP) fue des-
crita inicialmente como un antígeno secundario de la célula B (SB) ya que
normalmente era muy baja o indetectable en CML primarios y requería una
segunda fase de estimulación en el cultivo para la detección. Posteriormen-
te, se siguió con la caracterización de las secuencias codificantes del ADN y
las localizaciones de estos genes en el MHC empleando técnicas de biolo-
gía molecular (Beck, 1999).
Estructura de las moléculas de clase II
Las moléculas de clase II HLA-DR. -DQ y -DP son heterodímeros for-
mados por dos glicoproteínas transmembrana no asociadas covalente-
mente, la cadena a (33 a 35 kDa) y la cadena |i (26 a 28 kDa) (Fig. 40-5)
(Gorga. 1992). Ambas cadenas polipeptídicas atraviesan la membrana
celular y están orientadas con sus amino-terminales hacia el exterior celu-
lar. Las regiones extracelulares de los polipéptidos u y |3 están divididas
cada una en dos dominios, denominados a, y a¡ y P, y P , y cada dominio
2 menos más de la mitad de la superficie celular total de las moléculas de clase
contiene aproximadamente 90 residuos aminoácidos. La cadena a tiene
dos grupos carbohidrato, uno rico en mañosa y un complejo tipo glicano,
en los aminoácidos 78 y 118, respectivamente. Las cadenas p tienen un
complejo tipo oligosacárido en el aminoácido 19. Los dominios amino-ter-
minales (/., y p, de las cadenas a y p contienen los residuos polimórficos,
mientras que los dominios de membrana proximales a¡ y p son altamen-
2
te conservados y son homólogos a los dominios de la región constante de
la inmunoglobulina. Una región de aproximadamente 12 aminoácidos de
tamaño conecta el segundo dominio extracelular a la región hidrofóbica
transmembrana (23 aminoácidos) y al pequeño dominio intracitoplasmático
(8 a 15 aminoácidos).
Basándose en la cristalografía, la molécula de clase II es similar en estruc-
tura a la molécula de clase I (Brown. 1993) (Fig. 40-6). En la molécula de
clase II, los dominios a, y p, de las cadenas a y p forman una cadena |5 ple-
gada de ocho filamentos unida a dos hélices u para formar la ranura de unión
al antígeno en la parte alta de la molécula. Los dominios a? y p forman cada
?
uno dos cadenas p plegadas antiparalelas que soportan la ranura en la parte
alta. Al igual que en las de clase I, muchos de las aminoácidos que alinean la
ranura de unión al péptido antigénico son polimórficos, creando diferentes
especificidades de unión al péptido para los diferentes productos alélicos de
clase II.
Al igual que las moléculas de clase I, las moléculas de clase II son alta-
mente polimórficas (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997, 1999). El polimorfismo de
clase II está definido por 1) anticuerpos especificos de clase II (anticuerpos
aloantisuero y monoclonales), que se unen a las moléculas de clase II; 2)
células T aloproliferativas que reconocen y proliferan in vitro en respuesta a
moléculas extrañas de clase II; 3) electroforesis en gel bidimensional de
moléculas de clase II aisladas; 4) hibridación por endonucleasa que difiere el
ADN codificante de los genes de clase II empleando sondas especificas de
locus (una técnica que detecta el polimorfismo ligado a los fragmentos de
restricción [RFLPIJ; 5) tipificación del ADN basada en PCR de los alelos de
clase II: y 6) secuenciación de nucleótidos de los genes de clase II. La mayor
parte del polimorfismo de clase II deriva de las diferentes secuencias de ami-
noácidos localizados en los dominios a, y p, de las dos cadenas polipeptídi-
cas.
Organización de los genes de clase II
En contraste con las moléculas de clase I, tanto la cadena u como la P de
las moléculas de clase II están codificadas en una sección de 1100-kb de la
región MHC (Figs. 40-1 y 40-8) (Beck, 1999). La región de clase II incluye tres
subregiones -DR, DQ y DP- cada una de las cuales codifica al menos un gen
expresado A (codificando una cadena «) y uno B (codificando una cadena [}).
Las comparaciones de secuencias sugieren que ambos genes de clase I y de
clase II surgen de sucesivas seríes de duplicaciones génicas durante la evo-
lución de este complejo génico. La duplicación original en la región de clase
II origina con mayor probabilidad los genes A y B primordiales. Duplicaciones
génicas más recientes generan las subregiones DR. DQ. y DP que contienen
múltiples genes.
Un gen A típico contiene cinco exones codificando: 1) la región 5' amino-
terminal no traducida y la secuencia líder; 2) el dominio a,; 3) el dominio tt¿
4) el péptido de conexión, la región transmembrana, el residuo citoplasmáti-
co, y una porción de la región 3' no traducida; y 5) el resto de la región 3' no
traducida incluyendo la señal de adición poly(A). Un gen típico de cadena |3
es similar al gen de la cadena a pero tiene un exón extra para el residuo cito-
plasmático.
Subregión DR La subregión DR codifica una o dos moléculas DR. depen-
diendo del haplotipo (Bodmer. 1997. 1999). La subregión contiene un gen
simple expresado DRA que es similar en diferentes haplotipos difiriendo solo
en la sustitución de un aminoácido simple conservativo en el dominio citoplas-
mático.
El gen más centromérico DRB, DRB1 (Fig. 40-8), codifica una cadena p al-
tamente polimórfica que, cuando se asocia con la cadena a, exhibe especifi-
cidades serológicas desde DR1 a DR18 (Tabla 40-3). Esta molécula es la
molécula de clase II predominante en la superficie celular, constituyendo al
II. Hay múltiples ácidos nucleicos y, por ello, diferencias en la secuencia de
aminoácidos entre los alelos DRB1.
El segundo gen expresado DRB, presente solo en algunos haplotipos de
clase II, está localizado entre el locus DRB1 y el locus DRA (Fig. 40-8). En
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO IEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..
Figura 40-10. Modelo de las asociaciones as y trans de las cadenas DQu. y DQp\
las células que expresan los alelos DR. DRBV03. '11, '12. '13. '14. el
segundo gen DRB se denomina DRB3 (la nomenclalura HLA se describe a
continuación). El gen DRB3 es polimórfico, aunque hasta el momento el
número de alelos identificados es aproximadamente 10 veces menor que el
número de alelos DRB1. El producto del DRB3 se combina con el produc-
to DRA para formar la molécula DR, que transporta la especificidad seroló-
gica del DR52 (Tabla 40-3). En las células que expresan los alelos DRB1
•4, 7 y '09. el segundo gen DRB se denomina DRB4. El producto DRB4
combinado con el producto DRA forma la molécula que trasporta la espe-
cificidad serológica del Df?53 (Tabla 40-3). Finalmente, en las células que
expresan los alelos DRBV15 y '16. el segundo gen DRB es denominado
DRB5. Este producto DRB5 combinado con el producto DRA transporta la
especificidad serológica del DR51 (Tabla 40-3). Los haplotipos que expre-
san los alelos DRBV01. '08 o '10 normalmente no transportan un segun-
do locus del DRB expresado. Hay excepciones a estas asociaciones. Por
ejemplo, se ha descrito un haplotipo que transporta DRBT15 sin un locus
DRB5 (Wade. 1993).
Subregión DO. Un grupo de genes A y B. DOA1 y DQB1. codifican el
heterodímero DO que transporta la especificidad serológica DQ1-9 (Tablas
40-2 y 40-3 y Fig. 40-3) (Bodmer, 1997, 1999). Las moléculas DO represen-
tan aproximadamente del 15% al 20% del total de moléculas de clase II
expresadas en la superficie celular. Los locus del DOAJ y del DQB1 son
polimórficos y debido a que sus productos proteicos pueden asociarse tanto
en trans como en cis. los heterocigotos pues expresar potencialmente cua-
tro moléculas DQ diferentes en sus superficies celulares (Fig. 40-10). Oíros
genes A y B tipo DQ en la subregión DQ como el DQA2 y el DQB2 son muy
similares a los genes DQA1y DQB1; sin embargo, no expresan ninguna pro-
teína funcional.
Subregión DP. La subregión DP contiene dos grupos de genes A y B (Tabla
40-3 y Fig. 40-8). Un grupo, el DPA1 y el DPB1. codifica el producto proteico
DP; el otro grupo está constituido por seudogenes. Tanto el gen OPA i como
el DPB1 son altamente polimórficos (Bodmer, 1997,1999). El nivel de expresión
del DP en la superficie celular es muy pequeño.
935
Desequilibrio de unión de los genes
de la región de clase II
Las combinaciones específicas de los alelos DRB1/DRB3, DRB1/DRB4.
DRB1/DRB5y DOA1/DQB1 son frecuentes. Las combinaciones encontradas
del DQA1/DQB1 pueden controlarse en parte por la capacidad de las cadenas
a y |i de aparearse (Kwok. 1993). Además, ciertos alelos DR y DQ son here-
dados conjuntamente más frecuentemente de lo esperado, originando un des-
equilibrio de unión en la población. La frecuencia de estas combinaciones di-
fiere importantemente entre los diferentes grupos étnicos de la población. Por
ejemplo, tanto los haplotipos DRBVttOI. DOBV0501 (DR11 [5]), DQ5[1¡yel
DRB V0901. DOBT0303 (DR9, DQ9 [3)) se encuentran frecuentemente en las
poblaciones de descendientes africanos directos; mientras tanto, estas combi-
naciones DR-DQ se encuentran raramente en poblaciones descendientes de
caucásicos. El entrecruzamiento entre locus DP y locus DR'DO es frecuente.
Por ello, hay un mínimo desequilibrio de unión entre los alelos DR/DO y los
DP. Se han publicado las listas de los haplotipos DRB1/DOA1DOB1 frecuen-
tes (Begovich. 1992: Imanishi, 1992)
Regulación de la expresión
de los genes de clase II
Las moléculas de clase II, HLA-DR, -DQ y -DP, se expresan constilutiva-
mente en las células presentadoras de antígenos (APCs) del sistema inmu-
ne incluyendo los monocitos, los macrófagos, las células dendrilicas y los
linlocitos B. Las secuencias de ADN encontradas por encima de las secuen-
cias codificantes de los genes de clase II son criticas para la expresión. La
unión de las proteínas a estas regiones regula la expresión de los genes de
clase II. Las alteraciones en la capacidad de las proteínas de unión al ADN
de interaccionar con las secuencias de ADN 5' reguladoras que eliminan la
expresión de los genes de clase II lleva a una inmunodeliciencia denomina-
da "síndrome del linlocito desnudo" (Kovats. 1994: Mach, 1996). Los genes
de clase II son inducibles por el interferón-y (IFN-y) en muchos tipos de cé-
lulas (Mach, 1996; Glimcher, 1992) y la expresión puede afectarse por otras
citocinas (véase Cap. 39) (Guardiola, 1993). La expresión de moléculas de
clase II en las APCs puede modularse, particularmente en las células den-
dríticas, tras el depósito antigénico y la inflamación. El nivel de expresión del
complejo antígeno peptídico-clase II asi como la presencia de una señal
coestimuladora en las APC maduras puede tener un importante papel en el
trasplante y en las enfermedades autoinmunes (Nepom, 1991: Banchereau.
1998) (véase Cap. 41).
Función de las moléculas de clase II
Las moléculas de clase II actúan como receptores antigénicos en la res-
puesta inmune (Fig. 40-2), uniéndose a fragmentos peptidicos antigénicos
procesados de antígenos exógenos como las bacterias. Los antígenos exó-
genos entran en la células a través de la vía de endocitosis y son degrada-
dos en fragmentos peptidicos en los últimos endosomas donde se encuen-
tran y se unen a las nuevas moléculas de clase II ensambladas (Watts, 1997).
La unión de los fragmentos proteicos procesados a las moléculas de clase II
se facilita por dos proteínas codificadas en la región de clase II del MHC. la
DM y la DO (Fig. 40-8). El péptido de unión está afectado por residuos poli-
mórficos localizados en la ranura de la molécula de clase II. El complejo del
fragmento antigénico unido a la molécula de clase II es transportado enton-
ces a la superficie celular para su presentación y reconocimiento por las célu-
las T circulantes.
Los receptores antigénicos de los linfocitos T CD4+ interaccionan con el
complejo clase ll-fragmento antigénico disparando la activación de la células
(Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para dilucidar este
mecanismo, los linlocitos T electores fueron estimulados in vitro con APCs
autólogas previamente incubadas con el antígeno. Como se observó para la
clase I, el reconocimiento del fragmento antigénico por las células T electoras
está influenciado por el polimorfismo alélico del MHC. La célula T efectora es
especifica para el péptido antigénico promotor en conjunción con el producto
alélico particular de clase II que originalmente presentó el antigeno (restricción
MHC) (Rosenthal. 1973).
 936 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Cada célula T activada por el reconocimiento del complejo del fragmento
antigénico unido a la molécula de clase II puede desenpeñar una o varias fun-
ciones (Paul, 1994), La célula T CD4+ puede ayudar a los linfocitos B a dife-
renciarse a células plasmáticas productoras de anticuerpo, o puede ayudar a
otros linfocitos T a diferenciarse a células citotóxicas o células con función
supresora. Además, la célula T puede por sí misma funcionar como célula cito-
tóxica, matando directamente células con la diana apropiada (p.ej.. células que
expresan complejos de moléculas de MHC de clase II con el antígeno especí-
fico), o como célula con función supresora, originando un debilitamiento de la
respuesta inmune. Las células T también producen un número de moléculas
biológicamente importantes (como el IFN-yj que aumentan la respuesta inmu-
ne e incrementan la expresión de moléculas de MHC en las células diana. Ade-
más, las células T producen factores de crecimiento como la interleucina-2 (IL-
2). Estos factores de crecimiento afectan a un amplio rango de células de las
células progenitoras hematopoyéticas para madurar a linfocitos.
Otros genes de clase II
Al menos han sido descritos otros cuatro genes de clase II, DOA. DOB.
DMA y DMB. que expresan sus productos proteicos (Fig. 40-8). Las proteínas
codificadas por los genes DMA y DMB forman el heterodímero DM. Las pro-
teínas codificada por los genes DOA y DOB forman el heterodímero DO. Es-
tos productos génicos no son detectados en la superficie celular pero son
expresados posteriormente dentro de la célula, localizados en compartimen-
tos intracelulares especializados donde las nuevas moléculas de clase II sin-
tetizadas (DR. DO, DP) se unen con sus péptidos antigénicos. La molécula
DM regula la unión al péptido del HLA-DR. -DQ. -DP, teniendo una lunción de
tipo acompañante o corrector (Morris, 1994) que favorece la presentación de
los péptidos estables unidos. La molécula DO regula negativamente la fun-
ción del DM (van Ham, 1997).
CARACTERÍSTICAS DE LOS FRAGMENTOS
ANTIGÉNICOS UNIDOS POR LAS MOLÉCULAS MHC
DE CLASE I Y CLASE II
La función de las moléculas de clase I y clase II como receptores de
unión a antigenos es similar; sin embargo, los péptidos que unen tienen
diferentes caracteristicas (Cresswell, 1994; Engelhard. 1994). Los péptidos
derivados de las proteínas sintetizadas de novo en la célula (antigenos
endógenos como los antígenos virales), se asocian con las moléculas de
clase I en el retículo endoplasmático. En contraste, los péptidos de los antí-
genos solubles y particulados captados por la célula por la vía de la endo-
citosis (antigenos exógenos) se unen con las moléculas de clase II en el
compartimento endosomal. Tanto las moléculas de clase I como las de clase
II pueden unirse alternativamente a péptidos propios encontrados en estos
compartimentos. Los péptidos surgen de la degradación normal de las pro-
teínas celulares. Algunos de estos péptidos propios son fragmentos de las
propias moléculas de histocompatibilidad. Normalmente, los péptidos pro-
pios unidos a las moléculas del MHC no activan a los linfocitos T. ya que son
moléculas a las que el sislema inmune del individuo es tolerante. Esos pép-
tidos propios pueden, sin embargo, disparar la respuesta inmune iniciando
un proceso autodestructivo que conduce a la autoinmunidad (Nepom, 1991 )
(véanse Caps. 43-45).
La unión del péptido a las moléculas del MHC ocurre solo cuando el frag-
mento peptídico es de un tamaño adecuado y contiene una secuencia parti-
cular de aminoácidos o un motivo que le permite unirse a una o más molécu-
las del MHC expresadas en dicho individuo. Un ejemplo de un motivo para un
péptido que se une a la molécula del HLA codificada por el A'0201 es la leu-
cina (o metionina o isoleucina) en el residuo 2 del péptido. un aminoácido
hidrofílico en el residuo 3, y una valina (o leucina o isoleucina o alanina) en el
residuo 9. Los aminoácidos que forman el motivo se denominan residuos de
"anclaje" del péptido. Las diferentes moléculas del HLA. ya sean las molécu-
las codificadas por diferentes alelos en el mismo locus {HLA-A'0203. '0211. o
'0301) o las moléculas codificadas por diferentes locus (B'4001 o DRBV0406)
se unen a péptidos con diferentes motivos. Los aminoácidos que forman el
motivo peptídico se unen a la molécula de MHC en los bolsillos que se en-
cuentran en la ranura de unión al antígeno (Stern. 1994). Los aminoácidos
polimórficos de las moléculas de MHC rodean esta ranura y crean asi dife-
rencias en las especificidades de unión a los péptidos para las diferentes mo-
léculas del MHC.
Los péptidos unidos a las moléculas de clase I tienen una longitud de 9 a
10 aminoácidos. Tanto los extremos carboxi- como aminoterminal del pépti-
dos son atrapados en la ranura de unión de clase I formando un complejo
péptido-MHC "cerrado". Los péptidos unidos a las moléculas de clase II va-
rían en longitud de 12 a 30 aminoácidos. A la vez que mantienen requeri-
miento para los residuos específicos que se encuentran la porción central del
péptido. tanto los extremos carboxi- como amino-terminal del péptido se ex-
tienden fuera de la ranura de unión de clase II formando un complejo péptido-
MHC "abierto" (Stern, 1994).
RECONOCIMIENTO DE LAS MOLÉCULAS
MHC EXTRAÑAS
El alo-reconocimiento implica el reconocimiento por un linfocito T de una
molécula de MHC extraña en una célula por un segundo individuo (alogéni-
co). Una vez reconocido, la interacción dispara una serie de acontecimientos
originando la activación de la células T y la iniciación de una respuesta inmu-
ne no muy diferente al reconocimiento de los patógenos (véase Cap. 36).
Basándose en los datos de los modelos de trasplante de órganos vasculari-
zados, se han propuesto dos vías de alo-reconocimiento (Sayegh. 1996). La
vía directa para el alo-reconocimiento implica la estimulación de las células T
receptoras por un complejo MHC-péptido del donante (es decir, reconoci-
miento directo de las moléculas MHC extrañas intactas). La segunda ruta de
alo-reconocimiento, la vía indirecta, implica la estimulación de las células T
receptoras por las moléculas de MHC propias a través de la presentación de
los fragmentos peptídicos de las células donante. La presentación indirecta
ocurre cuando las células presentadoras de antigenos del receptor ingieren
material celular del tejido injertado, degradan el material intracelularmente. y
presentan el péptido(s) alogénico en complejo con las moléculas de MHC pro-
pias. Los péptidos derivados de las regiones polimórficas de las moléculas
MHC del donante son los principales candidatos para la estimulación de la
respuesta inmune indirecta (Suciu-Foca. 1998; Gould, 1999; Harris, 1999).
REPETICIÓN EN TÁNDEM Y POLIMORFISMO
NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL MHC
Más de 300 repeticiones en tándem cortas (STRs) han sido identificadas
en la región MHC humana (Foissac, 1997). También están presentes múlti-
ples polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs). Un estudio de Abbal
(1997) examinó seis locus STR en el MHC en una población de individuos no
relacionados y encontró un fuerte desequilibrio de unión entre los haplotipos
HLA especificos y los marcadores STR. Ya que estos marcadores cubren
una región del MHC mayor que los marcadores del HLA clásico empleados
ahora, pueden proporcionar una aproximación más amplia para identificar a
los individuos MHC idénticos. Estos marcadores pueden, por ejemplo, ser
utilizados para identificar un haplotipo MHC recombinante en una familia
(Carrington, 1996) y aumentar la probabilidad de encontrar genes de histo-
compatibilidad del MHC apareados. Se han desarrollado métodos molecula-
res seguros y reproducibles para identificar tanto las STR como las SNP
(Carrington, 1998).
MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR
Los antígenos de histocompatibilidad menor (mHag) son péptidos inmuno-
genéticos que se unen a las moléculas de MHC y pueden ser reconocidos por
las células T. En las células progenitoras de injertos MHC idénticos, se puede
inducir una enfermedad injerto contra huésped (EICH) por las diferencias
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD. 937

Tabla 40-4 G e n e s H menores y sus epítopos e n las células T ción se hizo más discriminatoria. La definición más corta de la especificidad
es llamada la especificidad subtípica o privada. Las especificidades extensas
M o l é c u l a s de r e s t r i c c i ó n mHag Secuencia p e p t í d i c a y compartidas se denominan especificidades supertípicas. Por ejemplo, el
HLA-B7 H-Y SPSVDKAPAEL" B44 y el B45 son especificidades subtipicas de la especificidad supertipica
HLA-A2.1 H-Y FIDSYICQV B12 Por ello, una célula que es tanto B44+ como B45+ también debería ser
HLA-A1 H-Y IVDCLTEMY positiva para B12. La Tabla 40-5 enumera ejemplos de los equivalentes
HLA-B60 H-Y Desconocido
supertipicos para las "divisiones"
HLA-A2.1 H-A-2 YIGEVSVSV
HLA-A2.1 H-A-1" VLHDDLEA En los tests serológicos. algunos aloantisueros se unen a mas de un pro-
H-A-1" VLRDDLLEA ducto alélico del HLA. un fenómeno denominado reactividad cruzada. Esta
" Derivado de una proteina evolucionanamenlo conservada codificada en el reactividad cruzada serológica entre los productos alélicos de los locus HLA-A
cromosoma Y y HLA-B ha sido extensamente estudiada y se ha empleado para agrupar
• Derivado de un miembro de la familia miosina de clase I no formadora de fila moléculas en grupos antigénicos de reactividad cruzada (CREG) (Rodey,
mentos
Tres ag menores están en el articulo de levisiOn de Goulmy de 1997. pero esta
1987). Las moléculas de clase I en un CREG comparten uno o más determi-
tabla completa nos la proporcionó Els Goulmy No esta publicada y fue usada nantes que no son compartidos por moléculas de otro CREG En la Tabla 40-6
por la autora en su charla en el ASHI. Comunicación personal de Goulmy se enumeran ejemplos de CREG. Un determinante antigénico (epítopo) com-
(2000)
partido entre los miembros de un CREG se denomina especificidad pública.
Parte de la reactividad del CREG puede explicarse porque se comparten
entre el mHag del receptor y del donante (Mutis, 1999). Las mHag pueden ser secuencias de aminoácidos entre las moléculas HLA en un CREG (Terasaki.
cualquier producto génico polimórfico codificado fuera del MHC que difiriera 1992) La inclusión de especificidades HLA en un CREG no está estandari-
entre el donante y el receptor y que estimule la respuesta T celular (Goulmy, zada, ya que diferentes grupos de anticuerpos producen un único patrón de
1997; Simpson, 1998). En la Tabla 40-4 se dan ejemplos de mHag. Como reacción y dos investigadores diferentes con distintos grupos de reactantes
otras proteínas antigénicas, las proteínas polimórficas deben ser procesadas pueden identificar grupos de CREG ligeramente diferentes. Sin embargo, los
en fragmentos antigénicos y el fragmento(s) peptidico polimórfico debe unir- grupos CREG se solapan considerablemente (Ellison. 1994).
se con la ranura de las moléculas del MHC. Debido al requerimiento para la Las especificidades HLA-Bw4 y Bw6 son epitopos amplios, públicos, que
presentación antigémca por las moléculas del MHC, cualquier péptido poli- residen en la misma molécula como las especificidades subtipicas del locus
módico debe transportar un motivo apropiado de unión específica al MHC. HLA-B. pero están en lugares diferentes. Por ello el Bw4 y el Bw6 son un sis-
Por ello, no todos los individuos pueden presentar una respuesta a todas las tema dialélico. y todas las moléculas del locus В (y algunas del locus A) trans­
mHag incluso aunque exista una diferencia entre el donante y el receptor. portan tanto la especificidad Bw4 como la Bw6. La región de la molécula del
Muchas mHag son presentadas a las células T CD8+ por las moléculas MHC HLA que transporta las especificidades Bw4'Bw6 ha sido identificada en la
de clase I. Las respuestas de las células T son iniciadas cuando el receptor hélice (/.. entre los residuos aminoácidos 77 y 83 (Tabla 40-7 y Fig. 40-9) (Par-
de célula T reconoce los complejos formados por los péptidos polímórticos de ham. 1991).
las mHag unidos a las moléculas de MHC expresadas en las APC.
Las especificidades serológicas designadas por la OMS. localizadas en las
Las mHag fueron definidas originalmente por el rechazo de injerto cutáneo moléculas de clase II, HLA-DR y -DQ. han sido asignadas como se describió
y por ensayos citotóxícos con clones de células T. Estos péptidos polimórficos para las moléculas de clase I (Bodmer. 1999, 1997) (Tabla 40-2). Original-
tienen una unión restringida a las moléculas MHC de clase I, de modo que la mente se definieron por técnicas celulares seis tipos de HLA-DP. Las molécu-
definición bioquímica de los componentes del péptido antigénico de histo- las HLA-DP de clase II no se delinen adecuadamente por serologia.
compatibilidad menor fue determinada por la elución, purificación y secuen- Hay 26 especificidades del HLA-D que fueron identificadas en cultivos mix-
ciación del péptido del mHag unido a una molécula del MHC especifica (den tos de leucocitos. Todas las especificidades HLA-D mantienen la designación
Haan 1995). Estudios recientes han demostrado el significado potencial de
las mHag en el trasplante clínico (Goulmy, 1997.1996; Martin. 1997: Dupont.
1998). Se han demostrado linfocitos T con citotoxicidad específica para las
mHag en pacientes con EICH (Mutis. 1999). La disparidad del receptor para
una mHag (HA-1) se asoció con un aumento del riesgo de EICH tras el tras- Tabla 40-5 Ejemplos de divisiones* serológicas
plante de médula ósea empleando donantes hermanos genotípicamenle HLA Especificidades originales amplias Divisiones
idénticos La importancia del apareamiento para otras mHag (HA-2. HA-3.
A9 A23.A24
HA-4, HA-5, H- Y) está menos clara. Se han desarrollado técnicas basadas A10 A25.A26,A34,A66
en el ADN para detectar diferencias en las mHag (Wilke. 1998: Tseng. 1998) A19 A29.A30.A31. A32. A33. A74
y se han empleado en estudios para medir el impacto de estas disparidades A28 A68.A69
en los resultados del trasplante. B5 B51.B52
B12 B44.B45
B14 B64.B65
B15 B62.B63.B75.B76.B77
NOMENCLATURA HLA B16 B38.B39
B17 B57.B58
B21 B49.B50.B4005
Especificidades serológicas y celulares B22 B54.B55.B56
B40 B60.B61
B70 B71.B72
La terminología HLA está designada por el Comité de la Organización Mun-
DR2 DR15.DR16
dial de la Salud (OMS) para la Nomenclatura HLA (Tabla 40-2) (Bodmer 1999. DR3 DR17.DR18
1997). Históricamente, las especificidades serológicas y celulares definidas DR5 DR11.DR12
localizadas en las moléculas proteicas del HLA fueron asignadas en base a DR6 DR13.DR14
los resultados de los talleres internacionales durante los cuales los reactivos DQ1 DQ5.DQ6
de tipificación fueron intercambiados entre los laboratorios participantes (sitio DQ3 D07.D08.D09
4
web del Taller Internacional de Histocompatibilidad. 13 edición, Tabla 40-1). • En el pasado, las designaciones de divisiones serológicas eran dadas a espe-
Las asignaciones incluyen el nombre de la molécula de HLA y una designa- cilicidades que parecían idcnlilicar el antígeno especilico por un alelo HLA sim-
ple (p ei. A2 se dividía en A203. A210 B7 se divide en B703: B39 se divide en
ción numérica basada en el orden en que su especificidad serológica fue defi- B390I y B3902) Ahora se reconoce que otros alelos también pueden codilicar
nida. Por ejemplo, el HLA-A1 (o solo A1) fue la primera especificidad HLA-A antigenos que llevan estas especificidades serológicas y el Comité de Nomen-
asignada y el HLA-A80 fue la más reciente. A lo largo del tiempo las especifi- clatura de la OMS ha recomendado que no se hagan estas divisiones
Datos de Bodmer (1997)
cidades definidas serológicamente lueron "divididas" a medida que la defini-
 938 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 40-6 C R E G y antígenos a s o c i a d o s tificó una única especificidad serológica, al antígeno DR determinado por el
DRBV10103 se le dio la designación serológica DR103. El tercer y cuarto
Creg Antígenos asociados número en la designación alélica se refieren al orden en que el alelo fue des-
A01C Al, A3. Al 1. A29. A30, A31, A36, A80 crito. Por ejemplo, el A'0201 fue el primer alelo A2 secuenciado y el A"0203
A10C A10, A11. A19. A25, A26, A32. A33. A34. A43, A66, A74 fue el tercero.
A02C A2, A9. A23. A24, A28. A68, A69, A203 A210, A2403, Algunos alelos pueden diferir en la secuencia de ADN de sus regiones
B17, B57. B58
codificantes pero su secuencia de aminoácidos predecida no difiere (a menu-
B5C B5. B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102. B5103
B07C B7, B8. B13. B22, B27. B40. B41, B42. B47, B48, B54, do llamada sustitución imperceptible o sinonímica). Estas combinaciones de
B55, B56. B59. B60, B61. B67, B81, B82. B703 alelos son identificadas por designaciones de cinco dígitos. Los primeros
B08C B8, B14. BI6, B18, B38, B39, B59. B64. B65. B67. B3901. cuatro números son compartidos, mientras que el quinto dígito se utiliza para
B3902 distinguir las secuencias de ácido nucleico únicas de los alelos (p. ej.,
B12C B12. B13 B21. B37. B40 B41, B44, B45, B47, B49. B50. B'27051 y B'27052). Además, dos o más alelos pueden tener un nombre de
B60. B61. B400b
siete dígitos en el que se comparten los primeros cuatro dígitos (p. ej.,
B21C B5, B15, B17, B21, B35. B46. B49. B50. B51, B52. B53.
B57. B58. B62, B63. B70, B71. B72. B73. B75, B76, B77. DRB4'0103101 y DRB4'0103102). Los dígitos cinco a siete indican que los
B78, B4005, B5102. B5103 dos alelos difieren sólo fuera de la región codificante de la proteina. En el
Bw4 A9, A23. A24, A25. A32, B5. B13. B17, B27. B37, B38. ejemplo nombrado aquí, la diferencia afecta al lugar del empalme del ARN
B44, B47, B49, B51. B52. B53. B57, B58 B59. B63. B77 del DRB4'0103102 originando la pérdida de la expresión del alelo (Sutton,
A2403. B5102, B5103
1989). Finalmente, los alelos que no son expresados como proteínas en la
Bw6 B7. B8. B14, B18. B22. B35 B39. B40, B41. B42, B45.
B48. B50, superficie celular pueden tener añadida una Na sus nombres (p. ej„ A'0215N,
B54, B55, B56, B60. B61, B62, B64. B65. B6, B70, B71, DRB4'0103102N) para indicar "nulo". Ya que cada alelo tiene una única
B72. B73, B75, B76, B78, B81, B82, B703, B3901. B3902. designación numérica, la designación N no se escribe siempre (i.e., A'0215
B4005 y A'0215N son el mismo alelo).
Datos de Ellison (1994). Se describen nuevos alelos en las publicaciones habituales del Comité de
Nomenclatura HLA de la OMS (Tabla 40-1, www.anthonynolan.com/HIG/
nomenc.html; Bodmer, 1999), y las secuencias de nucleótidos de todos los
V, ya que estas especificidades son definidas funcionalmente por la medi-
alelos están depositadas en un banco de datos computerizado (bases de da-
ción de la estimulación de la célula que responde. La estimulación se genera
tos GenBank. EMBL, IMGT/HLA). Actualmente, hay, por ejemplo, más de 140
por diferencias en las moléculas DR expresadas en las células estimuladoras
alelos HLA-A designados. Continuamente se están identificando nuevos ale-
y. en menor medida, por estimulación adicional por las moléculas DQ y DP.
los y puede accederse a ellos a través del sitio web.

Designaciones alélicas basadas en el ADN

Se ha utilizado la secuenciación de nucleótidos para identificar los muchos
TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
alelos diferentes que codifican las moléculas HLA. Actualmente, la especifici-
dad simple serológicamente definida puede residir en dos o más de 25 pro- DEL POLIMORFISMO DEL HLA
ductos alélicos diferentes (Tabla 40-2). Cada alelo HLA es designado por el
nombre del locus génico seguido por un asterisco y un número de cuatro a Las pruebas de histocompatibilidad o la tipificación del HLA o la tipifica-
siete dígitos que indica el alelo. Por ejemplo, el A"0221 es un alelo del gen ción tisular se desarrolla en un número limitado de laboratorios ya que utili-
HLA-A. el B'1510 es un alelo del gen HLA-B; el DPBV0101 es un alelo del za técnicas y reactantes especializados. Existen disponibles en el mercado
gen HLA-DPB1 y el DQAV0601 es un alelo del gen HLA-DQA1. equipos para las pruebas basadas en ADN y serológicas; sin embargo, la
Los primeros dos números en la designación numérica de cada alelo se interpretación de los resultados de la prueba requiere una considerable
basan frecuentemente en el tipo serológico de la molécula resultante y/o de experiencia y conocimiento. Los laboratorios de histocompatibilidad normal-
la secuencia nucleotídíca similar a otros alelos del grupo. Por ejemplo, la mente se encuentran en centros médicos que tienen programas de tras-
molécula de HLA-A expresada por el alelo A'0201 porta la especificidad sero- plantes de órganos y/o de células progenituras hematopoyéticas. En esta
lógica A2 definiendo el antígeno HLA-A2. Sin embargo, la molécula de HLA-B sección las técnicas de identificación del HLA se tratan de forma general.
expresada por el alelo B'1510 no tiene la especificidad serológica asociada al Para técnicas detalladas, se remite al Laboratory Manual (2000) de la So-
B15 pero porta la especificidad serológica que define al antígeno B71. Se ciedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogenética (ASHI) (en la
designó B'1510 por su secuencia de aminoácidos prevista similar a los anti- Tabla 40-1 se incluye la página web de la ASHI). Los laboratorios de identi-
genos B15. Las células que expresan DRB1 '1003 fueron definidas serológi- ficación del HLA están acreditados por la ASHI, por la Fundación Europea
camente como DR-blank, DR1, o incluso DR13. Las secuenciación de nucle- de Inmunogenética (EFI) y por otras organizaciones.
ótidos identificó un alelo con similar estructura de ADN a los alelos que portan
la especificidad serológica DR1 (p. ej., DRBV01Q1 y '0102) y el nombre de Tipificación basada en el ADN de los alelos
este alelo se basó en su similitud estructural. Cuando posteriormente se ¡den-
de clase I y clase II
Aunque la tipificación serológica y celular de los antígenos HLA ha sido
/" —————— — —— - :
* muy útil, hay un número de inconvenientes en estas técnicas. Con la llega-
Tabla 40-7 Secuencias d e aminoácidos q u e definen los epítopos da de los métodos rápidos y fiables del aislamiento y caracterización de los
Bw4 y Bw6 y ejemplos de alelos q u e especifican estas genes de clase I y II y la determinación de las secuencias de nucleótidos de
secuencias los alelos de clase I y II, ha surgido la posibilidad de utilizar métodos basa-
Bw4 Bw6 dos en el ADN para la tipificación del HLA. La tipificación basada en el ADN
de los alelos HLA es ahora una técnica utilizada Irecuentemente en los labo-
Secuencia* Alelo' Secuencia' Alelo'
ratorios de tipificación del HLA (Middleton, 1999: Hurley, 1997a).
NLARIALR B'5301 SLRNLRG В-3501
NLRTALR B'2701 GLRNLRG B'7301 1. Es especifica. La especificidad de cada reactante tipificante de ADN
DLRTLLR B-2705 (p. ej.. sondas y cebadores de oligonucleótídos sintéticos) se define cla-
SLRTLLR B"2704 ramente y está basada en una secuencia de nucleótidos específica
SLRIALR A'2501
conocida. Como los oligonucleótídos empleados como reactantes en la
' Codones 77-83. véase Figura 40-9. tipificación del ADN son sintéticos, los reactantes no están limitados y
Solo se da un ejemplo de cada alelo no debería existir variación entre lotes en la especificidad.
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
2. Es flexible. Los nuevos reactantes pueden designarse a medida que se
descubran los nuevos alelos y se identifiquen las secuencias de nucle-
ótidos únicas. Las pruebas pueden llevarse a cabo en muchos niveles
de resolución dependiendo de los requerimientos de tipificación y del
tiempo disponible para hacer las pruebas.
3. Es más robusta que otras técnicas. La tipificación del ADN no requiere
linfocitos viables y no está influenciada por la salud del paciente. Ade-
más, las pruebas basadas en el ADN son altamente reproducibles cuan-
do se usan metodologías estandarizadas como el test con una secuen-
cia específica de una sonda oligonucleotídica (SSOP) usan en conjunto
un protocolo de test estándar (Ng, 1996; Hurley. 2000a).
4. Puede utilizarse para grandes escalas de tipificación. La cantidad de
muestras facilitada por las metodologías automáticas y computerizadas
reduce el coste y los errores. Los métodos basados en el ADN son par-
ticularmente aplicables a la tipificación HLA de grandes números de
voluntarios para los registros de donantes.
5. Puede ser discriminativa detectando toda la diversidad del HLA. Los
alelos del HLA pueden especificar proteínas HLA que son indistingui-
bles empleando tipificación serológica. Por ejemplo, un individuo que
transporte el alelo DRBV0401 tendrá el mismo tipo serológico (DR4)
que un individuo que transporte el alelo DRBV0412 (DR4). Por ello,
DRBt'0401 y DRBV0402 son divisiones de la amplia especificidad
DR4. Estas divisiones son identificadas por la tipificación del ADN. No
están disponibles reactantes serológicos suficientemente específicos
para definir esta división. Hasta ahora, se han definido 30 subdivisio-
nes del DR4. Hay otros muchos ejemplos de divisiones definidas utili-
zando tipificación del ADN que no pueden identificarse empleando tipi-
ficación serológica; algunas se enumeran en la Tabla 40-2.
Los problemas de la tipificación serológica son particularmente agudos
cuando hay que tipificar algunos grupos de poblaciones. Por ejemplo, las po-
blaciones de origen directamente africano pueden expresar antígenos de
clase I y clase II que son difíciles de identificar con los reactantes serológicos
disponibles actualmente (Mytilineos. 1998; Yu. 1997; Bozon, 1997). La tipifi-
cación del HLA basada en el ADN ha mejora muchísimo la capacidad de de-
finir los tipos de HLA en estas poblaciones.
Preparación y amplificación del ADN. Cualquier célula con núcleo
puede utilizarse como tuente de ADN. Mientras que los eritrocitos (RBC) no
tienen núcleo, otras células de la sangre como los linfocitos son bunas fuen-
tes de ADN. Las lineas celulares como los linfocitos B transformados por el
virus de Epstein Barr también son buenas fuentes de ADN. A medida que
las células transformadas pueden crecer en un cultivo de laboratorio, pro-
porcionan un suplemento de ADN que se puede reponer y son empleadas
para proporcionar un ADN de referencia para el control de calidad de las
técnicas de tipificación,
El ADN normalmente se prepara de una pequeña cantidad (0,2 mi a 1 mi)
de sangre total. Se puede emplear muchos protocolos diferentes para ais-
lar el ADN de las células, y también hay equipos disponibles en el mercado
para la preparación del ADN. La sensibilidad de la detección de los tipos del
HLA aumenta considerablemente con la amplificación del ADN que codifica
los genes HLA utilizando la técnica de la PCR (Saiki, 1998). Se debe com-
plementar con un par de oligonucleótidos sintéticos (cebadores) a las se-
cuencias alrededor de un gen específico HLA para generar millones de
copias de dicho gen para su uso en la reacción de tipificación del ADN. Algu-
nas reacciones de tipificación emplean secuencias promotoras que son
compartidas por todos los alelos de un locus HLA: otras técnicas de tipifi-
cación emplean grupos de promotores que son compartidos sólo por un
grupo de alelos del locus. El fijado de los cebadores a la muestra de ADN
durante la reacción PCR usa las condiciones de la reacción que garantizan
que los promotores se unirán a las secuencias perfectamente apareadas
(secuencias diana) y no a secuencias de otros locus o de otros alelos que
no están apareadas. Ajustando la temperatura del componente de fijado de
la reacción PCR, el laboratorio de tipificación puede controlar la especifici-
dad de la amplificación.
Promotor específico de secuencia. Un método de identificación de los
alelos HLA utiliza promotores específicos de secuencia (SSP) en la reacción
PCR (Olerup, 1992; Bunce. 1995). Los promotores se añaden para desnatu-
939
ralizar el ADN que contienen los alelos HLA de los que derivaban las secuen-
cias promotoras. En ia subsiguiente reacción PCR. solo estos alelos selec-
cionados son amplitícados. El ADN amplificado por los promotores es identi-
ficado por electroforesis en gel o, si el ADN es marcado con un colorante
durante la amplificación, por fluorescencia. Este procedimiento es de utilidad
en la tipificación de un pequeño número de muestras en un corto periodo de
tiempo. Hay equipos disponibles en el mercado.
Hibridación oligonucleotídica específica de secuencia. Ha sido po-
sible el empleo de la hibridación de SSOPs con ADN amplificado para iden-
tificar alelos (Gao, 1991; Cao, 1999; Williams, 1997). Suele requerirse el
empleo de múltiples sondas de oligonucleótidos diferentes para definir un
alelo HLA específico o el empleo de un promotor especifico de secuencia
unido con hibridación con paneles de sondas. Un grupo de oligonucleótidos
capaz de identificar cada alelo es hibridado a ADN amplificado desnaturali-
zado por PCR unido a un soporte sólido. Las condiciones de hibridación se
ajustan de modo que las sondas se añadan al ADN desnaturalizado que
contenga los alelos HLA de los que derivó la secuencia del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos se encuentran marcados con una terminación para
detectar la hibridación. Por ejemplo, el oligonucleótido puede asociarse a
una enzima como la fosfatasa alcalina. Tras la adición de un sustrato, la los-
fatasa alcalina degrada el sustrato para producir un componente coloreado
o para producir luz (quimioluminiscencia). Tras la visualización. puede leer-
se el patrón de hibridación para determinar los alelos presentes. La Figura
40-11 ilustra la aproximación con el empleo de una sonda de oligonucleó-
tido para el alelo DOS?, DQBV0302, para identificar pacientes con diabe-
tes dependiente de insulina que tienen este alelo (Todd, 1987). El método
SSOP es muy exacto, específico y fiable (Ng, 1996; Hurley, 2000a). A me-
nudo es utilizado en situaciones donde se tipifican muchas muestras en
grandes grupos. Están disponibles kits comerciales que utilizan este mé-
todo.
En una técnica relacionada, llamada el formato reverso, las sondas de oli-
gonucleótidos se unen a un soporte sólido (Bugawan, 1994). El ADN de las
muestras que va a ser analizado es amplificado empleando iniciadores mar-
cados con, por ejemplo, biotina. Entonces el ADN amplificado se híbrida a
sondas inmovilizadas, que contienen las secuencias encontradas en los ale-
los presentes en el ADN. Tras la visualización (empleando un sistema de
detección unido a la avidína), se puede leer el patrón de hibridación para de-
terminar los alelos presentes. Esta técnica es útil para la tipificación tanto de
un número de muestras pequeño como grande. Hay equipos disponibles en
el mercado que utilizan este método.
Polimorfismo conformacional de secuencia específica (SSCP) o
análisis heterodoble. Otro método, aunque poco usado, de identificación
de los alelos HLA analiza la movilidad del ADN amplificado, ya sea desnatu-
ralizado (SSCP) o como ADN doble renaturalizado (análisis heterodoble), tras
la electroforesis (Arguello. 1996). La movilidad del ADN es comparada con la
movilidad del ADN amplificado de los alelos HLA para definir un alelo HLA.
Esta técnica es útil en la tipificación de un pequeño número de muestras y
particularmente en las comparaciones entre individuos, por ejemplo, en una
familia.
Secuenciacíón del ácido nucleico. Un método final de identificación
de alelos HLA implica la determinación directa de las secuencias de ADN de
los alelos HLA transportados por un individuo (tipificación basada en la se-
cuencia [SBT]). Los alelos son identificados ya sea tras la amplificación PCR
para separar los alelos basados en SSP o como una mezcla de dos alelos.
La secuenciacíón es una labor intensa y altamente compleja pero puede
usarse frecuentemente para determinar el HLA emparentado en un nivel alé-
lico entre los pacientes de trasplantes de células progenituras hematopoyé-
ticas y sus futuros donantes (Petersdorf, 1995a; Rozemuller. 1996; Scheltin-
ga. 1997).
Resolución de la tipificación basada en el ADN. El nivel de resolución
(i.e., la capacidad de discriminar entre alelos) obtenido por los métodos de ti-
pificación de ADN eslá controlado por la elección y el número de iniciadores y/o
sondas empleados en el ensayo y por el método de tipificación. Esta elección
puede depender del tiempo disponible para el desarrollo de la tipificación, del
coste de la tipificación, de la experiencia del personal de laboratorio y del pro-
 940 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 40-11. 4, Secuencias de nucleólidos de múltiples ale-

tas D0B1. Las secuencias presentadas cubren los codones
para los aminoácidos 50 a 60. Una raya indica que el nucleó-
2 3 4 5 7 9 10 tido es idéntico a la secuencia de la pade superior. En un rec-
tángulo está un oligonucleotide que es especifico para la se-
• U I I H I I I I M B M W H M T I I I U B H H H H M H H H M H H U cuencia DQBI'0302. B. Análisis de transferencia en mancha
(oof blot) con oligonucleotides de 17 pacientes IDDM (DMI-
19) y un control. BML. El ADN amplificado que contiene se-
cuencias DQBf de clase II de los pacientes lúe unido a la
membrana e hibridado para el oligonucleotide específico
marcado para la secuencia DQB1 '0302 (descrita previamen-
te). Las señales de hibridación positiva indican los pacientes
que tienen esta secuencia génica DQB! (pacientes DM1. 2.
4,7,10-16,19). (De Todd JA. Bell J, McDevitt HO: HLA-DQB
gene contributes to susceptibility and resistance to insulin-
dependent diabetes mellilus. Nature 1987; 329-599. con per-
B II 12 13 14 15 16 17 IS 1') UML

pósito de la tipificación. Normalmente la tipificación para registros de donantes
a gran escala se lleva a cabo con una resolución baja-intermedia, mientras que
la tipificación de un posible donante de células progenituras hematopoyéticas
para un paciente específico se realiza a un nivel de resolución alélica.
A menudo se utiliza un abordaje con múltiples pasos para identificar los ale-
los HLA por tipificación basada en el ADN. Por esta razón, los tipos de HLA
definidos por la tipificación basada en el ADN pueden mostrarse con diferen-
tes niveles de resolución. El nivel de resolución bajo (o genérico o seroiógico)
de tipificación basada en el ADN produce un resultado similar en apariencia y
en detalle a un tipo seroiógico. Por ejemplo, un tipo definido por ADN. el
DRBI'tl o el DRBV11XX. es el equivalente aproximado del tipo seroiógico
DR11. El "XX" indica que el alelo no fue definido. En este nivel de resolución,
no es posible determinar cuál de los más de 30 alelos DRBI'11 tiene el indi-
viduo que está siendo analizado. Aunque la tipificación serológica pues ser
tan informativa como la tipificación de baja resolución, los resultados son más
fiables con el análisis basado en el ADN. El nivel intermedio de resolución de
tipificación basada en el ADN puede reducir las opciones enumerando múlti-
ples posibilidades diferentes para el tipo de un individuo, (p. ej., DRBV1101
o DRBl'1104). Finalmente, el nivel de resolución alto (o a nivel alélico) de la
tipificación basada en el ADN identifica el alelo especifico que transporta un
individuo (p. ej.. DRBV1104). Ya que la identificación de los alelos HLA puede
basarse en la secuencia de información parcial, es posible que la interpreta-
ción de los resultados pase por alto alelos que eran desconocidos en el
momento de la tipificación (Hurley. 1997b). Por esta razón, los laboratorios tie-
nen cuidado de mantener sus datos de tipificación brutos (p. ej., qué promo-
tores y qué sondas fueron positivos y negativos y las secuencias de nucieoti-
dos de los reactantes) de modo que los resultados puedan reinterpretarse a
mediada que se describan los nuevos alelos.
Detección serológica de las moléculas
de clase I y clase II
El análisis de la microcitotoxicidad de los linfocitos. que ongínalmente se
utilizo en el sistema del ratón por Gorer y Amos y después fue modificado por
Terasaki y McClelland para el empleo en el sistema humano, ha sido usado
para la tipificación del HLA desde los años 60. El análisis seroiógico del HLA-
A, -B, puede reproducirse en condiciones controladas y estandarizadas; sin
embargo, los análisis a gran escala (p, ej., para registros), pueden aumentar
los índices de error (Bozon, 1997; Yu, 1997). La reproductibilidad para espe-
cificidades determinadas serológicamente del HLA-C y clase II es mucho
menor. El HLA-DP normalmente no se define por serologia. El ensayo sero-
iógico de microcitotoxicidad todavía se utiliza ampliamente para las especifi-
cidades de clase I (HLA-A, -B) pero ha sido sustituido por el análisis basado
en el ADN para las especificidades HLA-C y de clase II (HLA-DR, -DQ, -DPj
en muchos laboratorios de tipificación. El análisis basado en el ADN con su
mayor resolución se utiliza para determinar el tipo de HLA de individuos no
emparentados y de miembros de una familia especialmente si la segregación
del HLA no puede discriminarse con seguridad por serologia (p ej.. familias
donde los padres no están disponibles o familias donde los padres comparten
un antígeno HLA). Por eiemplo. un descendiente hereda un DR4 de cada
pariente y por eso el es homocigotico para el antigeno DR4 (DR4. DR4). Sin
embargo, la tipificación del ADN de alta resolución puede identificar dos ale-
los distintos del antígeno DR4, el DRBf040t y el Dfl8r0403(heterocigóti-
co para el alelo DRBV04), proporcionando datos informativos para los análi-
sis de segregación del haplotipo.
Preparación de los linfocitos. Los linfocitos utilizados rutinariamente en
los ensayos de tipificación serológica del HLA se obtienen rápidamente de la
sangre total periférica sedimentándola con un gradiente de Ficoll-Hypaque
para separar los eritrocitos por densidad de centrifugación. Los linfocitos de
sangre periférica separados (PBLs) pueden emplearse para la tipificación del
HLA-A. -B. -C. Para analizar las especificidades serologicas del HLA-DR. -
DQ. es necesario o enriquecer los linfocitos B o utilizar una técnica de fluo-
rescencia de dos colores especial para diferenciar simultáneamente las célu-
las B y las células T no separadas.
Ensayo de microcitotoxicidad linfocitica. El fenotipo HLA se determi-
na analizando la preparación de linlocilos no separados (PBL) o los linfocitos
T (para el HLA-A. -B. -C) o los linfocitos B enriquecidos (para el HLA-DR, DQ)
frente a un panel de aloantisuero HLA bien caracterizado. El ensayo es un test
de dos etapas. Durante la etapa de de sensibilización, los linfocitos son incu-
bados con el antisuero. Se añade suero de conejo en exceso preanalizado y
estandarizado como fuente de complemento y la mezcla se incuba durante un
periodo adicional. Si los linfocitos llevan una molécula de superficie celular
reconocida por los anticuerpos fijadores del complemento del aloantisuero,
los anticuerpos se unen a las células y las células son usadas subsiguiente-
mente tras la adición del complemento. El ensayo termina con la adición dia-
cetato de fluoresceina y de bromato de elidió para las técnicas de detección
 CAPÍTULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
fluorescentes, o tanto con eosina y formalina como con trypan azul y ácido acé-
tico etilendiamineter (EDTA) para las técnicas de visualización de colorantes.
Las reacciones se leen en porcentaje de lisis y se gradúan numéricamente.
Cubetas de suero para tipificación del HLA. Los reactantes de tipifi-
cación del HLA derivan del suero de individuos aloinmunizados (mujeres mul-
típaras, receptores de trasplantes, pacientes multitransfundidos e inmuniza-
ción planificada en humanos). Las placas con múltiples pocilios de
aloantisuero humano (esto es. cubetas de tipificación del HLA) están disponi-
bles en el mercado. Debido a la complejidad antigénica de los anlígenos HLA.
deben utilizarse múltiples antisuero para definir cada especificidad. Muchos
de los laboratorios utilizan cubetas de al menos dos vendedores diferentes o
pueden utilizar aloantisuero obtenido localmente. Como muchos aloantisue-
ros no son verdaderamente monoespecílicos y muchos presentan alguna
reactividad cruzada, la reactividad de cada antisuero debe analizarse cuida-
dosamente y conocerse para la interpretación de los resultados. Esto requie-
re un estrecho control de calidad de cada nuevo lote de cubetas de tipifica-
ción con células de referencia bien caracterizadas. Como el titulo y la
especificidad del anticuerpo formado por un individuo sensibilizado puede no
ser constante con el tiempo, los suplementos de anlisuero son limitados. En
un intento de crear un suplemento consistente y no limitado de reactantes,
algunas compañías han producido anticuerpos monoclonales. Estos reactan-
tes monoclonales no están disponibles para todas las especificidades HLA.
Reactividad cruzada. El aloantisuero HLA puede reaccionar con más de
un producto alélico HLA. Este fenómeno puede proceder de la poliespecifici-
dad del antisuero y/o de la reactividad cruzada y es responsable de los com-
plejos patrones de reactividad de algunos aloantisueros. El suero poliespecí-
fico contiene dos o más anticuerpos, que pueden ser adsorbidos para retirar
uno, con pequeño efecto sobre la reactividad del otro(s). El antisuero con
reactividad cruzada contiene, más frecuentemente, un anticuerpo simple que
reacciona con un determinante antigénico compartido entre múltiples produc-
tos alélicos HLA diferentes (p. ej., CREG o determinantes amplios, como se
trató previamente) (Rodey, 1994). Las reacciones cruzadas ocurren más fre-
cuentemente entre los productos alélicos codificados por el mismo locus pero
pueden ocurrir entre productos alélicos codificados por locus diferentes (p. ej.,
A2 + B17). En la Figura 40-9 y en la Tabla 40-6 se dan ejemplos y la locali-
zación de los determinantes de la reactividad cruzada.
Detección celular de las moléculas de clase II
La respuesta de una célula en el cultivo tisular a los aloantígenos en la
superficie de una segunda célula se denomina cultivo mixto de leucocitos
(CML) o reacción linfocitica mixta (MLR) (Hartzman. 1971). El CML es consi-
derado una medida in vitro de la disparidad de clase II entre individuos que
reconocen determinantes encontrados en las moléculas de clase II. que son
conocidos colectivamente como HLA-D. La respuesta de las células T se pro-
duce unidireccionalmente impidiendo que se dupliquen las células de uno de
los dos individuos tratando dichas células con radiación o mitomicina-C antes
de su adición al cultivo. El CLM representa una respuesta sumatoria de una
célula respondedora a las diferencias en los múltiples determinantes en las
moléculas HLA de clase II (DR, DQ y DP) codificadas por los haplotipos de
células estimuladoras irradiadas. La respuesta a las moléculas DR parece
predominar.
El empleo del CLM en los laboratorios clínicos para determinar la histo-
compatibilidad ha declinado debido a las limitaciones inherentes a la técnica.
El CLM puede estar influenciado por la salud del paciente, por el tipo de enfer- renales (Cecka, 1999; Opelz. 1999) (Fig. 40-12; para datos actuales véanse
medad y por la historia de una transfusión previa (Mickelson, 1996). Por estas
razones el ensayo CLM se ha reemplazado por métodos de tipificación basa-
dos en el ADN, más precisos. Actualmente, en algunos centros de trasplan-
tes, el cultivo mixto de leucocitos se emplea para identificar receptores de
aloinjerto renal con hiporreactividad especifica a las moléculas HLA del
donante tras el trasplante como una guia para reducir la inmunosupresión
(Reinsmoen, 1993).
Se ha utilizado el análisis de dilución limitada para definir la frecuencia de
los linfocitos T citotóxicos (LTC ) o coadyuvantes (LTC) para predecir la
P p
extensión del alorreconocimiento en trasplantes de células progenitoras
hematopoyéticas (Madrigal, 1997). Las correlaciones de estas frecuencias
941
con los subsiguientes acontecimientos, como la extensión de la EICH. toda-
vía son controvertidas.
TRASPLANTE DE ÓRGANOS/TEJIDOS
La supervivencia a largo plazo de órganos sólidos y de los injertos de célu-
las progenitoras hematopoyéticas representa uno de los retos más importan-
tes de la ciencia médica. El trasplante renal es la terapia de elección para la
mayoría de los pacientes con enlermedad renal en fase terminal. El trasplan-
te de progenitores celulares hematopoyétícos, de corazón, de pulmón, de
higado y de páncreas está ganando una amplia aceptación como técnicas
terapéuticas con resultados satisfactorios. El principal obstáculo al trasplante
de órganos sólidos y de progenitores de células hematopoyéticas es el recha-
zo mediado inmunológicamente al tejido extraño. Por lo tanto, el éxito de un
aloinjerto depende de la capacidad para detener la reacción inmune, lo cual
puede realizarse por: 1) concordancia de histocompatibilidad entre el donan-
te y el receptor; 2) terapia inmunosupresora del receptor (Suthanthiran, 1996);
y 3) lograr que el receptor no responda al aloantígeno o aloantigenos del
donante (esto es, tolerancia) (Remuzzi, 1995).
Bases genéticas del trasplante
Las bases genéticas del trasplante fueron determinadas por primera vez en
1916 como resultado de experimentos de trasplantes tumorales en ratones y
posteriormente se extendió a trasplantes de tejido normal (Snell, 1981). Se
demostró que los injertos cutáneos en linajes nativos que eran homocigotos
en el locus de histocompatibilidad (esto es, injertos singénicos) tenían éxito,
pero los injertos entre dos linajes nativos diferentes (alotrasplantes) eran
rechazados. Además, los aloinjertos de cualquier linaje nativo emparentado
(dos copias de los mismos genes MHC; homocigotos) o de la primera gene-
ración (F1) hibridada (una copia de cada uno de los dos grupos diferentes de
genes MHC de dos padres homocigotos) sobrevivían en animales; mientras
tanto, los injertos de descendientes F1 híbridos de cualquier progenitor (un
haplotipo no emparentado) no sobrevivían. Estas observaciones establecie-
ron las leyes del trasplante. En 1948, Gorer (Snell, 1981) delinió el locus de
histocompatibilidad mayor en el ratón, el H-2. Hay otros antigenos de histo-
compatibilidad o H, que son denominados mHag. Aunque son llamados
menores, la discordancia para estos antígenos puede tener efectos importan-
tes (Goulmy. 1997: Dupont, 1998).
A medida que existían evidencias convincentes en modelos animales expe-
rimentales de que las moléculas codificadas por el MHC representan la mayor
barrera genética del éxilo del aloinjerto. la tipificación del HLA fue utilizada en
humanos para determinar y para optimizar la compatibilidad entre el injerto
del donante y el receptor. Inicialmente, la influencia de los antígenos HLA en
la supervivencia del injerto fue investigada injertando piel no vascularizada
entre miembros de una familia. Como en los estudios de ratones hijos, los
injertos cutáneos entre hermanos HLA idénticos sobrevivieron significativa-
mente más que los injertos entre hermanos padres o donantes no relaciona-
dos con un haplotipo emparentado. Estas observaciones se extendieron al
trasplante renal durante los últimos años de la década de los 60 y los prime-
ros de la de los 70. Los datos más recientes del Estudio Colaborador Inter-
nacional de Trasplante (CTS) en Heidelberg y de la United Network for Organ
Sharing (UNOS) Registry en los Estados Unidos (analizado en UCLA), confir-
man que el MHC es la principal barrera genética en el trasplante de injertos
las páginas web señaladas en la Tabla 40-1). Los datos para el trasplante de
células progenitoras hematopoyéticas también reafirma el papel del MHC en
la evolución del trasplante determinado por la supervivencia del paciente y por
la EICH (Hansen, 1999) (Fig. 40-13).
Concordancia de histocompatibilidad
Concordancia de HLA. Aunque el nivel de concordancia del HLA es un
elemento importante en el resultado del trasplante, la concordancia de la his-
tocompatibilidad significa diferentes cosas en diferentes situaciones y las
estrategias para determinar esto varían. Los criterios difieren con variables
 942 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

100, Tabla 40-8 E j e m p l o s d e asociaciones entre los alelos HLA

y sus tipos serológicos
Alelos HLA Antigenos HLA
A'0201 A2
A '2603 A26
A-660V A26 о A66
B'2702 B27
B'2708' B7 о B27
B'1502 B75(15)
B-1503 B72 (70)
B' 1536' No definido
DRBV0301 DR17(3)
DRB1V404 DR4
' El laboratorio puede asignar A66. o más recuentemente. А26 a las células
que transportan este alelo.
' Muchos laboratorios tipan serologicamente una células con este alelo como
B7: sin embargo, la reactividad serológica sugiere que la tipificación difiere
levemente del B7 "estándar'
1
Las células que transportan este alelo no han sido carácter i/adas soioiogí
camenle

HLA-ID III RMANO n 4.343 dantes para cuatro de seis alelos o anligenos se denominan 4/6 concordan-
1 -IIAPI. PARIATI-.se» n- 18.071 cias. Las diferencias aparentes en el nivel de concordancia pueden surgir a
causa de la metodología de tipificación empleada para asignar los tipos de
CADÁVER n 105.360
HLA (p. ej„ tipificación serológica frente a basada en el ADN). Las nomencla-
Figura 40-12. Supervivencia a cinco años de aloinjerto renal (primer trasplante) de turas serológicas y ADN, aunque están relacionadas, pueden diferir. En la
tres categorías de histocompalibilidad: hermanos HLA idénticos; un haplolipo de Tabla 40-8 se dan ejemplos de estas relaciones y se ha publicado una lista
vida relacionado: donante de cadáver, llenos de hermanos donantes HLA idénti- completa (Schreuder. 1999). La definición de una concordancia también puede
cos (ambos con cromosomas HLA concordantes) tienen los mejores resultados Se variar dependiendo del tipo de resolución. Un paciente y un donante pueden
indica el numero de trasplantes estudiados (regresión p < 0.0001) (De Opelz G, parecer ser concordantes en el nivel serológico (p. ej.. receptor: A2. A26:
Wujoak T, Dohler B. y col: HLA compatibility and organ transplant survival. Rev donante: A2. A26): sin embargo, la pareja puede ser discordante en el nivel de
Inmunogenet 1999; 1:334, con permiso) alelos HLA (p. ej., receptor: A'0201. A'260l: donante: A'0205. A'6601).
El nivel de concordancia alélico para las moléculas de HLA clásicas puede
optimizar el resultado de todos los injerios, tanto de órganos vasculares como
que incluyen el tipo de injerto (p. ej., órgano sólido vascularizado frente a pro- de células progenituras hematopoyéticas (Opelz, 1999; Petersdori, 1998). Sin
genitor de célula hematopoyética), la enfermedad (p. ej.. leucemia mieloíde embargo, debido al gran número de alelos HLA, el nivel de concordancia alé-
crónica (rente a anemia aplásica), la edad del paciente y el protocolo clínico lico es difícil. Por lo tanto, debe considerarse un nivel de concordancia que
(p. ej., sangre de médula frente a sangre de cordón umbilical: depleción garantice un buen resultado para el máximo número de pacientes de todas las
medular de células T frente a no depleción de células T) (véase Cap. 33). poblaciones étnicas.
La concordancia normalmente incluye la evaluación de al menos tres locus, Tras el trasplante de células progenitoras hematopoyélicas, los determi-
el HLA-A. el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordantes, en cualquier nantes subtipicos o las diferencias alélicas inician una importante respuesta
resolución, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o 0 discor- citotóxica de células T conduciendo al rechazo del injerto y a la EICH. De
dancias. Cero discordancias (un término empleado en el trasplante de órganos hecho, los estudios han mostrado que la concordancia de alta resolución para
sólidos) también puede referirse a pares de donante/receptor, donde el donan- los alelos de clase I y clase II del donanle y el receptor puede mejorar el resul-
te no tiene diferencias HLA detectables con el receptor, esto es, donde el tado tras el trasplante de médula no emparentado. Los datos recientes sugie-
donante es homocigoto para los alelos en uno o más de los locus (p. ej., donan- ren que múltiples discordancias son malas para el resultado; sin embargo, el
te homocigoto: A'0101: B'0801: DRBT0301: receptor heterocigoto: A'0101: impacto tanto de las discordancias simples como del locus especifico todavía
A'0301: B'0801: B'0702: DRBV0301. DRBV1501). Los individuos concor- no está bien definido (Petersdorf, 1998: Sasazuki. 1998: Hansen. 1999). Solo

Figura 40-13, Probabilidad de EICH aguda grados ll a

IV en hermanos HLA idénticos (concordancia genotípi-
ca HLA) y variabilidad en trasplantes de donantes
medulares haploidénticos emparentados con concor-
dancia para el HLA-A. -B o DR/Dw (discordancia HLA:
3 locus, 2 locus, 1 locus o 0 locus). La concordancia
para el HLA-A, -B y -DR fue definida por seroiogia. y la
concordancia para el HLA-Dw fue definida por CML o
por tipificación de los alelos HLA-DRBl con SSOP.
Todos los pacientes recibieron médula no modificada
(sin depleción de células T) tras un régimen de prepa-
ración que incluyó la irradiación corporal total. Se dieron
ciclosporina y metotrexato para la profilaxis de la EICH
(De Hansen JA. Yamamoto K. Petersdori E. y col: The
role of HLA matching in hematopoietic cell transplanta-
tion. Rev Immunogenet 1999; 1:359, copyright © 1999
Munksgaard International Publishers Ltd. Copenhagen.
Denmark, con permiso.)
 CAPÍTULO 40 • ANTIGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD.
una minoría de pacientes que están esperando el trasplante recibirán injertos
de donantes totalmente concordantes (Hurley, 2000b). Para permitir a todos
los pacientes beneficiarse de trasplantes que salven la vida, la identificación
de los alelos no emparentados que son bien tolerados permitirá la selección
de donantes no emparentados estableciendo prioridades de acuerdo con el
riesgo biológico de los HLA específicos no concordantes.
La concordancia óptima para los injertos de órganos sólidos puede diferir
de los requerimientos de concordancia para el trasplante de células progeni-
turas hematopoyélicas. Los datos recientes sugieren que tanto el locus HLA
emparentado como el nivel de resolución del análisis del HLA contribuyen al
resultado del injerto renal (Opelz. 1999). Actualmente la UNOS facilita la com-
paración de ríñones de cadáveres basándose en las especificidades subtipi-
cas. Ya que las concordancias subtipicas se identifican infrecuentemente, se
ha propuesto que las moléculas HLA de clase I sean emparentadas para los
amplios determinantes CREG. El CREG puede definir los determinantes
mmunodominantes reconocidos en la respuesta inmune humoral. Rodey
(1994) mostró que del 80% al 90% de los aloanticuerpos HLA formados por
el receptor tras el trasplante de riñon están dirigidos contra los determinantes
CREG. Los determinantes CREG son compartidos entre las dilerentes molé-
culas HLA de clase I y. en contraste con las especificidades subtípicas. tienen
una distribución similar entre los grupos de población étnica. En el CREG se
incluyen especificidades subtípicas raras. Ya que el número de CREGs es
menor que el número de especificidades subtípicas. la probabilidad de empa-
rentar un nivel CREG es mayor que para un nivel subtípico o alélico de HLA
clase I. Por lo tanto, la distribución de órganos basándose en la concordancia
CREG debe originar una alta probabilidad de que se distribuyan equitativa-
mente injertos emparentados a receptores de todas las poblaciones étnicas.
Un análisis retrospectivo de los datos de la UNOS corrobora estas prediccio-
nes sobre la distribución (Ellison, 1994), aunque los estudios todavía están en
progreso. El impacto de la concordancia CREG en el resultado del injerto es
desconocido, pero se está evolucionando. En Europa, una estrategia para
eliminar el excesivo tiempo de espera de los receptores con fenotipos HLA
raros se implantó en 1996 mientras se mantenía la distribución de los injertos
bien emparentados (Opelz. 1999).
Otras estrategias se centran en la concordancia de los fragmentos biológi-
camente relevantes de las moléculas del MHC (p. e|„ concordancia de epíto-
po) (Suciu-Foca, 1998; Harris, 1999). Hasta hace poco, el reconocimiento
directo de los aloantígenos se pensó que era la principal via de respuestas de
los injertos. Sin embargo, los estudios sugieren que la respuesta indirecta
juega un papel significativo en el rechazo del injerto, al menos en los injertos
de órganos sólidos (Sayegh, 1996). Si se activa la via indirecta, entonces los
epitopos peptidicos generados por la ruptura proteolitica de la molécula HLA y
no por la molécula HLA en si misma serán el estímulo inmunogénico. Por ello
pueden diseñarse nuevas estrategias innovadoras para la definición de las dis-
cordancias deducíbles basándose en el reconocimiento de los fragmentos pep-
tidicos. Por ejemplo, una estrategia puede considerar si las moléculas HLA del
donante no emparentado serán interpretadas como inmunogénicas en el
receptor (es decir, si las moléculas HLA del receptor se unirán y presentarán
estos epitopos). Teóricamente, uno puede identificar secuencias peptídicas de
HLA extraño no presentado por las moléculas HLA específicas del receptor y
por ello definir las discordancias deducíbles para las moléculas HLA dadas.
La complejidad inherente en la interpretación de los resultados de la tipifi-
cación del HLA y en la selección de un donante hace crítico incluir un exper-
to en los análisis de hislocompalibilidad. Los expertos en la tipificación del
HLA conocerán las ventajas y las limitaciones de cada método de tipificación
asi como la frecuencia de los alelos y los haplotipos en la población, informa-
ción importante tanto en la búsqueda como en la selección de un donante
adecuado.
Detección de anticuerpos específicos del HLA en el suero del
receptor. Los pacientes pueden sensibilizarse a moléculas HLA extrañas
específicas a través de una transfusión, el embarazo, o trasplantes anteriores.
La evaluación de la compatibilidad entre el receptor y el posible donante inclu-
ye el análisis para esta sensibilización. El suero del receptor es analizado
antes del trasplante en un panel (linfocitos o moléculas de HLA solubles inmo-
vilizadas) de un perfil HLA conocido para medir la reactividad anticuerpo panel
(PRA). En el momento del trasplante, el suero del receptor es analizado con
943
los linfocitos prospectivos del donante para identificar la reactividad específi-
ca para el donante potencial en la prueba cruzada específica de donante.
Aunque las técnicas utilizadas para detectar el anticuerpo de unión pueden
diferir entre los laboratorios, los propósitos siguen siendo obtener un perfil de
factores de riesgo inmunológico del receptor en la lista de espera, que será
de ayuda al equipo médico tanto en las decisiones pretrasplante como en las
postrasplante. La unión del anticuerpo en el suero actual del receptor a los lin-
focitos Tdel donante es una contraindicación para el trasplante renal
Análisis del suero (PRA). La caracterización cuidadosa del perfil de anti-
cuerpo de los pacientes en espera de un trasplante es de ayuda en la inter-
pretación de las concordancias cruzadas especificas de donante pretrasplan-
te. Los objetivos del análisis PRA son:
1. Identificar el nivel de presensibilización del paciente a los antígenos
HLA. Un paciente con un exceso de PRA del 60% (i.e., el suero del
paciente reacciona con especificidades encontradas en al menos el
60% del panel) tiene una menor probabilidad de concordancia cruzada
donante-específica negativa y, por ello, de recibir un trasplante de un
trasplante no emparentado.
2. Identificar la especificidad HLA de los anticuerpos para predecir el anti-
geno(s) HLA que serán evitados cuando se seleccionen los donantes.
3 Identificar pacientes con anticuerpos irrelevantes (p. ej.. IgM autoanti-
cuerpos) de modo que se puedan seleccionar las técnicas apropiadas
para evitar falsos positivos en la lectura en el momento de la concor-
dancia cruzada donante-específica.
La caracterización del anticuerpo HLA específico presente en el suero del
receptor requiere un análisis en un panel seleccionado de especificidades
HLA bien definidas. Se deben incluir en el panel de control los linfocitos o los
antígenos solubles de un número suficiente de individuos para asegurarse de
que se detectarán todos los anticuerpos dirigidos contra el HLA salvo los más
raros. En la medida de lo posible, el panel de control debe permanecer igual
de modo que los resultados sean comparables en el tiempo. El receptor de un
trasplante renal forma frecuentemente anticuerpos frente a CREGs más que
frente a especificidades subtípicas (Rodey. 1994,1997) de modo que el aná-
lisis de la reactividad del panel debe considerar la identificación de CREG asi
como la de especificidades subtípicas. La identificación de especificidades de
anticuerpo en los pacientes que esperan el trasplante ayuda a la preselección
de un donante potencial del que el receptor tendrá una concordancia cruzada
final negativa. Los programas de ordenador ayudan en la selección (Claas,
1999: Duquesnoy, 1999).
La frecuencia del control y la selección de los ensayos empleados para el
control son decisiones basadas en el perfil inmunológico del individuo recep-
tor. El descenso del empleo de las transfusiones sanguíneas ha hecho inne-
cesaria la necesidad de un control mensual de las muestras de suero de todos
los pacientes (página web ASHI: Tabla 40-1). La presencia tanto de anticuer-
pos específicos HLA de clase I como de clase II es detectada por el análisis
del suero en un panel de linfocitos (p. ej., por citotoxicidad directa dependien-
te del complemento o por ensayos de citotoxicidad aumentados con antiglo-
bulina) o en un panel de moléculas HLA soluble inmovilizadas con placas (es
decir, ensayo con enzima unida mmunoabsorbente [ELISA]) o en gotas (es
decir citometría de flujo). (Los ensayos se describen con detalle en el manual
ASHI [2000].) Una ventaja del ensayo con antigeno soluble de fase sólida es
que puede ser diseñado para detectar solo IgG. anticuerpos especílicos fren-
te al HLA de clase I.
Las muestras de suero de los receptores potenciales deben almacenarse a
-70 C y protegerse del dióxido de carbono y de la evaporación Las muestras de
suero caracterizadas almacenadas serán utilizadas en la prueba cruzada espe-
cifica de donante para evaluar la compatibilidad con un donante prospectivo.
Prueba cruzada específica de donante. La concordancia cruzada de
linfocitos analiza la presencia de anticuerpos, si los hay, en el suero de un
receptor potencial que reaccionan con los linfocitos del donante específico.
En el test de reactividad cruzada, el linfocito es la célula diana de elección, ya
que expresa altos niveles de moléculas HLA y es fácil de aislar. Este test es
probablemente la contribución más importante de los laboratorios de tipifica-
ción de tejido HLA al trasplante renal. El propósito de la reactividad cruzada
es prevenir el rechazo hiperagudo y detectar anticuerpos que identifiquen fac-
 944 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
lores de riesgo inmunológico en pacientes que esperan un trasplante. La apa-
rición del rechazo hiperagudo se correlaciona significativamente con la reac-
tividad cruzada de la citotoxicidad directa dependiente del complemento posi-
tiva (CDC) entre los linfocitos T del donante y el suero del receptor en el
momento del trasplante. La reactividad del suero válido actual del receptor a
los linfocitos T del donante es una contraindicación para el trasplante de injer-
to renal. La detección de anticuerpos reactivos al donante en muestras ante-
riores de suero de receptores no es una contraindicación pero puede repre-
sentar un nesgo para la pérdida del injerto distinto del rechazo hiperagudo
inmediato (Cardella, 1982; Geddes. 1999). La reactividad cruzada especifica
de donante también se utiliza en algunos centros para predecir el fallo del
injerto de células progenitoras hematopoyéticas (Hansen, 1997).
Los requerimientos u métodos para la reactividad cruzada especifica de
donante están determinados en los estándar de la Sociedad Americana de
Histocompatiblidad e Inmunogenética (Tabla 40-1) y en el manual de técnicas
ASHI (2000). Las técnicas aceptadas hasta el momento incluyen el Amos
modificado CDC, la extensión del tiempo de incubación de la CDC. la CDC
aumentada con antiglobulina y la citometria de flujo.
Técnicas de detección de anticuerpos. Diferentes laboratorios pueden
utilizar diferentes combinaciones de ensayos para detectar anticuerpos. El
nivel de sensibilización detectado variará con el ensayo. El anticuerpo espe-
cifico detectado variará con la célula diana.
Citotoxicidad directa dependiente del complemento (CDC). La CDC
directa incluye todos los ensayos que utilizan la adición de complemento para
detectar la unión directa del anticuerpo con los linfocitos. La fijación del com-
plemento por los complejos anticuerpo-antigeno sobre la superficie de las
células originará la muerte celular o la citotoxicidad. Los métodos de CDC
incluyen la técnica básica (no hay periodo de lavado antes de añadir el com-
plemento), la técnica Amos modificada (etapa de lavado añadida antes de la
adición del complemento) y técnicas de aumento del tiempo de incubación La
etapa de lavado elimina el suero que puede contener sustancias que dificul-
tan la activación del complemento. Las ventajas de las técnicas de CDC direc-
ta son que son reproducibles y que la correlación con la incidencia de recha-
zo hiperagudo es excelente.
Técnicas de reactividad cruzada indirecta. Las técnicas indirectas
incluyen la citotoxicidad aumentada con antiglobulina (AHG) y la citometria de
flujo. Ambas utilizan un reactante especifico para la inmunoglobulina humana
para aumentar la detección de anticuerpos dirigidos contra el HLA. Las técni-
cas indirectas detectan la presencia de anticuerpos específicos frente a anti-
genos de reactividad cruzada (CREG) que frecuentemente no son detectados
en los ensayos CDC. Las ventajas del ensayo por citometria de flujo incluyen
la discriminación de las subclases de células unidas a las inmunoglobulinas
(IgG frente a IgM) y la caracterización de la célula diana que se une al aloan-
licuerpo (linfocito T frente a linfocito B frente a monocito).
Autoanticuerpos. Se sabe que la presencia de autoanticuerpos circulan-
tes en el receptor es nociva. Por ello, debe llevarse a cabo una autorreactivi-
dad cruzada, preferiblemente cuando el paciente se incluye en la lista de
espera del trasplante. Si están presentes autoanticuerpos. el suero utilizado
para la reacción cruzada con el donante debe tener la autorreactividad elimi-
nada. Los autoanticuerpos son primariamente IgM y los anticuerpos HLA
específicos son primariamente IgG (Barger, 1989) Tanto la inactivación con
calor a 63° ± 1° C o la reducción con los agentes químicos ditioeritrítol (DTE)
o ditiotreitol (DTT) de cualquiera de los anticuerpos IgM potencíales se utiliza
para diferenciar entre anticuerpos IgM e IgG en las muestras de suero. Si la
muestra de suero inactivada con calor o tratada con DTT es negativa, aun
cuando la muestra no tratada sea positiva, la mayoría de los centros seguirán
adelante con el trasplante. Sin embargo, el DTT o la inactivación con calor
deben emplearse con precaución, ya que no todos los anticuerpos HLA espe-
cíficos son IgG y por ello, si no se controla correctamente, ambas técnicas
pueden eliminar la actividad IgG y la IgM.
Anticuerpos frente a las células B. En algunos centros puede llevar-
se a cabo una reactividad cruzada utilizando linfocitos B del donante (reacti-
vidad cruzada de célula B) en los pacientes sensibilizados. Una prueba de
reactividad cruzada positiva frente a células B específicas del donante no es
una contraindicación para el trasplante. El significado clínico todavía no se
ha resuelto, pero la prueba positiva puede ser un factor de riesgo, particu-
larmente en pacientes que han sido trasplantados previamente. Los anti-
cuerpos detectados en la reactividad cruzada de célula B pueden ser (1)
específicos de clase II, HLA-DR. -DQ. (2) anticuerpos de baja especificidad
para el HLA-A. -B. -C (las células B tienen una alta densidad de moléculas
de clase l y son más sensibles a los ensayos dependientes del complemen-
to que las células T). y/o (3) anticuerpos no específicos del HLA (p. ej., auto-
anticuerpos). Para interpretar una reactividad cruzada de célula B positiva,
puede ser necesario juntar el suero del receptor con plaquetas antes de des-
arrollar la reactividad cruzada con el donante. (Las plaquetas expresan molé-
culas de clase I pero no de clase II.) Las dos técnicas de reactividad cruza-
da de célula B utilizadas más frecuentemente son el CDC y los ensayos de
citometria de flujo.
Selección de las muestras de suero del receptor para la reactividad
cruzada con el donante. En pacientes con sensibilización no detectable (es
decir. 0% PRA). puede usarse la muestra de suero disponible más reciente
para la reactividad cruzada especifica de donante. Si el paciente tiene anti-
cuerpos preexistentes o ha tenido un acontecimiento sensibilizante reciente,
debe recogerse una muestra de suero en el momento (Le., en las 48 horas
antes del trasplante). En receptores sensibilizados, las muestras representati-
vas, incluyendo la más reactiva o muestra de suero "pico", son analizadas en
muchos centros ya que una muestra positiva de donante anterior puede ser
considerada un factor de riesgo particularmente en el paciente que rechazó
precozmente un injerto anterior en el periodo postrasplante (Mahoney, 1996).
Trasplante renal
La práctica actual es seleccionar donantes para receptores que son ABO
compatibles, tienen reactividad cruzada específica de donante de células T
negativa con un suero receptor adecuado y la mejor concordancia HLA dis-
ponible. El hallazgo original de que los injertos de riñon entre hermanos HLA
idénticos sobrevivían significativamente más que los injertos transplantados
entre hermanos HLA no emparentados o combinaciones de hermanos-parien-
tes se ha confirmado consistentemente. La Figura 40-12 muestra el análisis
más reciente de supervivencia a cinco años de aloinjertos renales del registro
internacional CTS entre tres categorías de donantes: (1) hermano HLA idén-
tico, 84% de supervivencia; (2) pariente vivo con un haplotipo, 73% de super-
vivencia; (3) todos de cadáver. 66% de supervivencia. El impacto de la con-
cordancia para el MHC en trasplantes de parientes vivos se observa
claramente comparando las categorías 1 y 2. Resultados similares se obser-
van en la base de datos de la UNOS (Cecka, 1999).
Aunque los resultados de los análisis sobre injertos de parientes vivos con-
firman el papel del MHC como la mayor barrera genética en el éxito del resul-
tado del injerto, la demostración y la aceptación de la influencia positiva de la
concordancia HLA en el resultado del injerto en los trasplantes de cadáver no
emparentados ha sido más controvertida. Sin embargo, los datos de la super-
vivencia a largo plazo de estudios multicéntncos colectivos son consistentes
a la hora de mostrar un efecto altamente significativo de la concordancia del
HLA en la supervivencia del trasplante renal de cadáver (Fig. 40-14) (Opelz.
1999; Cecka. 1999). Más aún, dos estudios de centros independientes, uno
de Europa (Oslo) y otro del norte de América (Toronto) han informado de una
mejora significativa en la supervivencia del injerto como una función de la con-
cordancia del HLA (Fig, 40-15) (Leivestad, 1999: Geddes, 1999). Un centro
aislado puede requerir la priorización basada en la concordancia HLA para
trasplantar a suficientes receptores con injertos bien emparentados para
mejorar la significación estadística en el resultado de los análisis. Aunque los
números son pequeños, se ha observado una influencia altamente significati-
va de la concordancia del HLA en el resultado de los injertos de riñon de
donantes vivos no emparentados (Opelz, 1999).
Los injertos con cero discordancias (0 MM) de donantes cadáver sobre-
viven significativamente mejor y aproximadamente tan bien como los injer-
tos de hermanos HLA idénticos (Figs. 40-12 y 40-14): por ello, la UNOS
ordena compartir de 0 MM ríñones La supervivencia del injerto en pacien-
tes tras los primeros trasplantes de riñon disminuye proporcionalmente a
medida que aumenta el número de discordancias de 0 MM a 6 MM (Cecka,
1999; Opelz, 1999). Sin embargo, para asegurar la distribución equitativa de
 CAPITULO 40 • ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD. 945

órganos a lodos los receptores, incluyendo aquellos con haplotipos HLA

raros, se han adoptado por los programas de distribución de órganos nue-
vos algoritmos para la priorización de receptores en lista de espera (Opelz,
1999). Los resultados de los datos más recientes tanto de supervivencia de
injerto como de paciente pueden verse a través de página web de la CTS
(Tabla 40-1).
La concordancia del injerto inicial no solo aumenta el tiempo de superviven-
cia del injerto, sino que disminuye la probabilidad de sensibilización del recep-
tor y facilita el retrasplante. La acumulación de pacientes altamente sensibili-
zados en la lista de espera es un problema significativo en muchos centros, ya
que los pacientes esperan durante largos períodos de tiempo y pueden pre-
sentar problemas clínicos de difícil tratamiento (Sanfilippo, 1992).

Trasplante de órganos no renales

La supervivencias de los injertos de corazón, hígado, pulmón y páncreas
es buena, con entre un 58% y un 67% de supervivencia de los primeros injer-
tos en cinco años (Fig. 40-16). Los donantes normalmente no tienen concor-
dancia en el tipo de HLA. y no se hace rutinariamente una reactividad cruza-
da pretrasplante con el donante. Se recomiendan los controles de anticuerpos
séricos para identificar el estado de sensibilización como un factor de riesgo
inmunológico para el receptor. Si es posible, los receptores de injerto y los
donantes cadáveres de injertos vascularizados no renales deben ser clasifi-
cados para el HLA para permitir análisis retrospectivos. Los datos recientes
de la CTS internacional no muestran el efecto de la concordancia HLA en el
resultado del trasplante de hígado: sin embargo, los datos de la CTS mues-
tran un impacto significativo de la concordancia del HLA-A. -B y -DR en el
resultado de los primeros trasplantes de corazón (Opelz, 1999). El período
aceptable para la preservación de la isquemia fría puede limitar la extensión
de la posible concordancia HLA en el trasplante cardíaco.
Figura 40-15. Supervivencia a cinco años de injerto cadavérico como una (unción
del número de antigenos HLA discordantes. El análisis Kaplan-Meier de la supervi-
vencia del injerto con respecto a los antigenos discordantes HLA no se muestra pero
fue estadísticamente significativo (p = 0,01). (De Geddes CC, Cole E. Wade J. y col:
Factors influencing long-term primary cadaveric kidney transplantation-importance
of functional renal mass versus avoid-ance of acute rejections- the Toronto Hospita
experience 1985-1997. En Cecka M, Terasaki P [eds]:Clinical Trasplants 1998.
Copyright © UCLA Tissue Typing Laboratory. Los Angeles. CA. 1999. con permiso.)
Trasplante alogénico de células progenituras
hematopoyéticas
El trasplante de células progenituras hematopoyéticas alogénicas se lleva a
cabo en neoplasias malignas y trastornos hematológicos, en el fallo de la medu-
la ósea, en ciertos trastornos metabólicos heredados, como las enfermedades
de depósitos de lípidos. y en el síndrome de inmunodeficiencia congènita. A par-
tir de una histocompatibilidad inicial, el mejor donante es o uno mismo (tras-
plante autólogo) si la neoplasia maligna no implica a la médula ósea o si la

Figura 40-14. Electo combinado de las discordancias serológicas para el HLA-A.

HLA-B y HLA-DR en la supervivencia de los primeros injertos de riñon de cadáver.
(MM = discordante). La asociación de la concordancia con el resultado del injerto
fue estadísticamente signilicativa (regresión p < 0. 0001). El análisis fue restringi-
do a los trasplantes para los que se informó la división de especificidades HLA-A y
HLA-B al centro de estudio para el receptor y el donante (De Opelz G. Wujciak T.
Dohler B. y col: HLA compatibility and organ transplant survival. Rev Immunogenet
1999; 1:334. con permiso.)
Figura 40-16. Supervivencia a cinco años del injerto de los primeros trasplantes
para el trasplante de órganos vascularizados en injertos de corazón, riñon de cadá-
ver, hígado, páncreas, pulmón y cardiopulmonar. (Del Collaborative Transplant
Study, proporcionado por y con permiso del Dr.Gerhardt Opelz y tratado en Opelz,
1999.)
 946 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
enfermedad no es genética, o un gemelo idéntico (trasplante smgénico). Las
células progenitoras de donantes hermanos HLA idénticos son una fuente fre-
cuente. Estas células donantes normalmente serán genéticamente idénticas a
las del paciente a lo largo de toda la región MHC. El empleo de un hermano
donante también aumenta la probabilidad de que los genes no HLA que pueden
afectar el éxito del trasplante y que no están bien definidos (i.e., genes de his-
tocompatibihdad menor) sean concordantes (Goulmy. 1997). Los miembros de
una familia haploidénticos también pueden ser elegidos como donantes (Aver-
sa, 1998), aunque hay un mayor riesgo de EICH severa que en los donantes
HLA no emparentados. Basándose en los datos del Registro Internacional de
Trasplantes de Médula Ósea (IBMTR) (Tabla 40-1; www.ibmtr.org). se llevaron
a cabo más de 16.000 trasplantes alogénicos de médula osea desde 1996
hasta 1997: el 75% utilizaron donantes emparentados.
Muchos pacientes (-70%) no tienen hermanos HLA concordantes y se
puede considerar el trasplante con células de un HLA concordante, de donan-
te no emparentado. Para facilitar la búsqueda de un donante concordante, se
han desarrollados registros nacionales de donantes no emparentados alrede-
dor del mundo (Hansen, 1996), El NMDP en los Estados Unidos es uno de
estos registros y contiene más de 3,9 millones de donantes HLA tipados, sien-
do el mayor registro de donantes no emparentados del mundo (Perkins, 1994;
véase Tabla 40-1; www.marrow.org). Aproximadamente, el NMDP ha facilita-
do 8.100 (en el año 2000) trasplantes de donantes no emparentados desde
que el registro comenzó en 1987.
Los injertos de células progenitoras hematopoyéticas están entre los más
difíciles de todas las técnicas clínicas por varias razones (Madrigal. 1997;
Hansen. 1997). Primero, en el momento del trasplante, los receptores están
casi totalmente inmunodeficientes. ya sea debido a la deficiencia heredada
(inmunodeficiencia combinada severa [IDCS]) o a causa del acondiciona-
miento pretrasplante (quimioterapia citotóxica y radiación). El acondiciona-
miento se requiere para eliminar las células malignas y para prevenir al siste-
ma inmune del receptor del rechazo de las células progenitoras del donante
que son infundidas muchos días después del acondicionamiento. La cantidad
de pretratamiento citotóxico es suficiente para eliminar los leucocitos circu-
lantes, casi eliminar las plaquetas, y abrogar la producción de nuevos eritro-
citos. Por ello, el receptor es profundamente susceptible a todo tipo de infec-
ciones y ciertamente morirá si no se le rescata con cuidados médicos
extraordinarios y con translusión de células progenitoras.
El segundo nesgo es el potencial del ataque inmunológíco del receptor por
las células progenitoras alogénicas trasplantadas originando una EICH. La
EICH tiene muchas formas y puede ser letal. A pesar de las dificultades, algu-
nos centros de trasplantes han obtenido un éxito excepcional. Los recientes
informes de instituciones determinadas y la IBMTR sugieren una superviven-
cia libre de leucemia del 40% al 60% a los cinco años tras el trasplante de
células progenitoras hematopoyéticas no emparentadas a pacientes con leu-
cemia mieloide crónica en fase crónica (Tabla 40-1, www.ibmtr.org) (Hansen.
1998). La supervivencia de los pacientes con anemia aplásica severa tras-
plantados con células de donantes no emparentados varía de un 30% a un
50% a los cinco años dependiendo de la edad del paciente (véase Tabla 40-1,
NMDP en www.marrow.org y www.ibmtr.org) y se ha informado en algunos
centros de índices de supervivencia cercanos al 90% (Deeg. 1998).
Además de médula como fuente de células progenitoras hematopoyé-
ticas. la obtención de células progenitoras hematopoyéticas de sangre peri-
férica movilizadas con factor de crecimiento (Anderlini. 1997) o de células
progenitoras de sangre de cordón umbilical (Cairo, 1997) aumenta la dispo-
nibilidad de donantes no familiares. Las nuevas aproximaciones a la inmu-
nosupresión. incluyendo protocolos de acondicionamiento menos agresivos
(p. ej., "minitrasplantes") (Storb, 1999). pueden aumentar la disponibilidad
del trasplante de células progenitoras como técnica terapéutica en pacientes
actualmente excluidos por su edad o por su disfunción orgánica. El tras-
plante de células progenitoras hematopoyéticas puede usarse también para
generar respuestas inmunes dirigidas contra las células tumorales. La reca-
ída de la enfermedad tras el trasplante es mayor en pacientes que han reci-
bido un injerto HLA concordante, lo que sugiere que algún grado de discor-
dancia puede ser beneficioso en la estimulación de la respuesta inmune
contra las células tumorales (Beatty, 1993). A medida que se vayan resol-
viendo los problemas de esta técnica tan difícil, el trasplante de células pro-
genitoras hematopoyéticas puede convertirse en uno de los métodos más
ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de enfer-
medades (véase Cap. 33).
Tipificación HLA para el trasplante de células progenitoras.
Muchos factores, incluyendo la histocompatibilidad. influyen en el resultado
del trasplante de células progenitoras hematopoyéticas (Madrigal. 1997). El
trabajo pretrasplante incluye la tipificación del HLA-A. -B y -DR de todos los
miembros disponibles de los familiares más cercanos para identificar un
donante concordante relacionado y para establecer la herencia de los haplo-
lipos. También puede ser apropiada la tipificación basada en el ADN de los
genes de dase II. que se ha convertido en un estándar, y la tipificación basa-
da en el ADN de los genes de clase I se ha incorporado en muchos centros.
La tipificación de la familia completa, la tipificación del nivel alélico (i.e.. alta
resolución) de los locus específicos HLA de clase I y II. la tipificación de otros
locus en el MHC (repeticiones en tándem cortas o locus complementario), o
el empleo de otras pruebas (p. ej., reactividad cruzada: mediciones de pre-
cursores de células T citotóxicas) para medir la compatibilidad (Hurtey. 1999)
también puede ser adecuado.
El nivel de resolución de la tipificación del HLA requerido difiere para el
trasplante de células progenitoras hematopoyéticas y renal. Parece que para
el trasplante de células progenitoras se necesita una alta resolución de tipifi-
cación HLA. mayor de la que es necesana para el trasplante renal, debido a
que el trasplante de células progenitoras incluye la transferencia de un siste-
ma inmune completo al paciente. Las investigaciones actuales se centran en
definir los locus que deben considerarse en la selección del donante, el nivel
de resolución que debe emplearse para la concordancia, y el efecto aditivo de
las múltiples discordancias. El nivel de concordancia requerido puede variar
en cada enfermedad o protocolo. Las evidencias sugieren que la concordan-
cia de un donante y un receptor no emparentados para los alelos HLA-A. -B
y -DRB1 está relacionada con una mejora del resultado. El impacto de la con-
cordancia en el otro locus HLA (p. ej.. HLA-C y HLA-DQ) está bajo estudio.
Las discordancias aisladas pueden ser toleradas; sin embargo, las discor-
dancias múltiples parecen tener un impacto negativo en el resultado (Sasa-
zuki, 1998; Petersdorf, 1998,1995b: Madrigal, 1997; Hansen. 1997). Además,
el efecto positivo de la concordancia de histocompatibilidad en el resultado
debe evaluarse por el impacto positivo del trasplante precoz en el curso de la
enfermedad. Los datos de la IBMTR y de la NMDP muestran que la supervi-
vencia tras el trasplante está reducida a medida que avanzan las lases de la
enfermedad (dalos en las páginas web señaladas en la Tabla 40-1).
RESUMEN
Las moléculas HLA de clase I y clase II codificadas en el complejo mayor
de histocompatibilidad tienen un papel significativo en la especificidad y en el
carácter de las respuestas inmunes. El extenso polimorfismo de estas molé-
culas proporciona la diversidad necesaria para asegurar la supervivencia en
un ambiente de patógenos hostiles y adaptativos. Desgraciadamente, esta
capacidad del sistema inmune de distinguir lo propio de lo extraño se extien-
de al reconocimiento de las moléculas de HLA extrañas tras el trasplante tísu-
lar. La definición y la caracterización de los alelos y las moléculas del HLA se
han combinado con los protocolos clínicos para maximizar la compatibilidad y
minimizar el impacto de la respuesta inmune sobre el tejido extraño. Estos
avances han contribuido al desarrollo del trasplante como una modalidad de
tratamiento con éxito en la sustitución del tejido enfermo.
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 CAP
Complejo mayor de
histocompatibilidad y enfermedad
Julio C. Delgado, M.D.
Edmond J. Yunis, M.D.
GENES EN LA REGIÓN NO-HLA O CLASE III 949
Genes BF. C2y C4
Factor de necrosis tumoral (y ) y genes
de linfotoxina y Polimorfismo genético
Genes de la proteína 70 del golpe de calor
COMPLOTIPOS 952
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS 952
TIPIFICACIÓN DEL COMPLEMENTO 953
PAPEL DE LAS MOLÉCULAS MHC CLASE I Y CLASE II
COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE 954
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC 955
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de
defectos en genes de MHC
Enfermedades de etiología y patogénesis desconocidas
Para comprender el papel del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) en las respuestas inmunes y en la patogénesis de la enfermedad se
requiere la definición de polimorfismo en la Clase I y Clase II, y los genes en
la región central del MHC. algunas veces llamada región no-HLA o región Cla-
se III. Debe mencionarse desde el principio que existen regiones del ADN
donde aparecen recombmaciones con más frecuencia de lo esperado (esto
es, en el intervalo de HLA-DR a HLA-DP). Pero tiene particular importancia el
hecho de que hay zonas del ADN, o ADN fijado, donde raramente se obser-
van recombinaciones. Las dos mayores constelaciones son la región del com-
plemento en la región central, y HLA-DR. DO en la región Clase II Además,
el análisis de los haplotipos MHC en muchas poblaciones ha permitido reco-
nocer que una proporción considerable de individuos tienen haplotipos espe-
cíficos del grupo familiar que tienen un intervalo de HLA-B a HLA-DR. DQ
idéntico. Eslos haplotipos. llamados haplotipos extendidos se deberían consi-
derar como unidades genéticas fijadas que. estudiadas junto con variantes
MHC que no forman parte de estos haplotipos. sirven para ayudar a com-
prender las respuestas inmunes y la asociación con la enfermedad. Las
variantes de los genes clase I y clase II se describen en el Capítulo 40. Aquí
se tratarán los genes y alelos de la región no-HLA, haplotipos extendidos,
asociaciones con la enfermedad y los métodos para detectar la asociación de
las enfermedades con los marcadores genéticos.
GENES EN LA REGIÓN NO-HLA O CLASE III
Existen alrededor de 1.100 kilobases (kb) de ADN entre la región clase I
y Clase II. generalmente llamada región no-HLA o clase III. Esta región
4 1
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O
CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS
MARCADORES GENÉTICOS 959
Fuerza de la asociación
Análisis del modelo de herencia basado
en parejas de hermanos
Análisis del modelo de herencia basado
en estudios de población
Método de cálculo de probabilidades
(Lod Score Method)
RESUMEN 964
BIBLIOGRAFÍA 961
contiene genes que codifican proteínas de diversa función. Aunque las
moléculas clase I y clase II se distinguen por parecidos estructurales y fun-
cionales compartidos con los miembros de cada clase, las moléculas de
clase III pueden definirse sólo como no-I y no-ll. porque sus genes y sus
productos no tienen rasgos comunes y no son reconocidos por las células
T. Incluye genes que codifican las proteínas del complemento C2 (C2). fac-
tor B {BF). C4 (C4A y C4S), el esteroide microsomal enzimático P-450 21-
hidroxilasa (CYP21). las citocinas como lactor de necrosis tumoral (TNF).
linfotoxina- (LT ). linfotoxina . (LF- ). tres miembros de la mayor fami-
lia de la proteína 70 del golpe de calor (HSP70-1. -2, -Hom) y varios genes
más (Trowsdale. 1995).
Se ha analizado toda la región clase III mediante electroforesis en gel con
campo pulsátil o clonando cromosomas artificiales de levaduras y vectores
cósmidos (Dunham, 1987; Kendall, 1990; Ragoussis, 1991; Sargent, 1989;
Spies. 1989). Se piensa que esta es una de las regiones con más genes del
genoma humano, con aproximadamente un gen por 15 kb (Fig. 41-1). Se
han secuenciado varios genes entre los genes C4A y HLA-B Algunos de
ellos se han llamado G, genes localizados en bandas Giemsa-negativas
(G1-G11) o BAT. trascripciones asociadas a HLA-B (BAT 1-9) (Sargenl,
1989; Spies. 1989). Gf codifica el factor 1 inflamatorio de alomjerto, y la
transcripción del interterón- (INF- ) (Utans. 1995) Los genes G6 a G7
codifican proteínas putativas que pertenecen a la superfamiha Ly-6. que se
sabe son importantes en la maduración de los leucocitos (Ribas, 1999). El
transcriptor-1 específico de leucocitos representa el homólogo humano del
transcriptor del ratón B144 y codifica un transcriptor inducible de IFN- . que
existe en los tejidos linfáticos, células T. macrólagos y lineas celulares his-
tocitarias (Holzinger, 1995). IKBL codilica un miembro putativo de la familia
 CAPÍTULO 41 • COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
de proteínas ikB involucradas en la regulación de la expresión de los genes
de citocinas (Albertella. 1994). La secuencia completa de 1C7 ha revelado
que este gen codifica un nuevo miembro putativo de la superfamilia Ig (Nevi-
lle, 1999). RD. SK12W, DOM3Zy RP1 son cuatro nuevos genes encontra-
dos entre Bf y C4. Las proteínas RD y Ski2w pueden estar relacionadas a
empalmes del ARN, renovación del ARN y la regulación de la traducción.
Las funciones de Dom3z y RP1 están siendo investigadas (Yu. 1998).
La región entre los genes C4A y HLA-DR se ha estudiado con los mismos
métodos. Se han identificado vanos genes, incluyendo NOTCH-4, G18.
PBX-2 (G17), RAGE. G16, G15, G14. G13 (Creb-rp). GI2y TNX, en un seg-
mento de 160 kb del ADN centromérico al gen C4A (Aguado, 1996). Alguno
de ellos (G13-G15). expresa proteínas involucradas en el metabolismo lipi-
dico (Aguado, 1998. 1999). Un par de genes, TNXA y TNXB. organizados
en la orientación transcripcional opuesta a otros genes en esta agrupación,
codifican proteínas extracelulares similares a tenascina y restrictina, que
están presentes en el sistema nervioso central y periférico y en el músculo
liso (Yang, 1999).
Genes BF, C2 y C4
Los C2 y C4 de la via clásica y el factor B de la vía alternativa del com-
plemento son codificados por una región 120 kb del ADN genómico de unos
300 kb de HLA-DR y 650 kb de HLA-B (Carrol. 1984). C2 y BF muestran una
semejanza considerable en la secuencia de aminoácidos y comparten un
número de características físico-químicas y funcionales, lo que sugiere que
ambos genes surgieron por duplicación en tándem de un gen ancestral simi-
lar al factor B. Ambos son serín-proteasas (de la familia SERPIN de proteí-
nas del plasma) y median la escisión de C3 durante la activación de las res-
pectivas rutas. C4, por otra parte, está relacionada estructural y
funcionalmente con C3 y C5 y como contiene un tioléster interno muy reac-
tivo, se relaciona con C3 y el inhibidor de la proteasa « -macroglobulina.
¿
Aunque el gen para C3 está ligado ligeramente al MHC en el ratón, en el
hombre está en un cromosoma completamente diferente. Junto a 3' en cada
locus C4 hay dos locus para el enzima adrenocorticoideo 21-hidroxilasa
(CYP21A y CYPB). (Carroll, 1985: Higashi. 1986: White. 1986). Los dos
genes tienen aproximadamente 3.4 kb de longitud y se dividen en 10 exo-
nes. En cierto modo son homólogos, pero tres mutaciones causan una ter-
minación prematura de la transcripción del gen CYP21A. conviniéndolo en
unseudogen (White. 1988).
El factor B es sintetizado por el gen BF. Durante la activación de la vía
alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en un frag-
mento aminoterminal Ba de 30 kDa y un fragmento Bb de 60 kDa. Median-
te electroforesis con gel de agarosa. la proteína muestra un moderado poli-
morfismo con dos alelos muy comunes, BF'F (rápido) y BF'S (lento), dos
alelos menos comunes, BF'F1 (más rápido) y BF'SÍ. también llamado
BF'S07. (más lento), y un huésped de alelos raros. Con electroforesis,
BF'F puede subdividirse en dos subtipos, BF'FA y BF'FB. BF'FB tiene dos
variantes, FB1 y FB2. Hay variantes de BF'S. llamados SSf, 2y 3. La sus-
titución del aminoácido responsable de las variantes comunes de BF'FA.
BF'FB y BF'S viene determinado por los residuos encontrados en el Irag-
mento Ba. mientras que los de BF'F1 y BF'Sí están localizados en el frag-
mento Bb. En las poblaciones caucásicas europeas, BF'F tiene una fre-
cuencia de 0,2, BF'S 0,77. SF'Ff 0,01. BF'Sí 0,01, y un recuento de
alelos raros sólo un 0,002. BF'S es el más común en las poblaciones cau-
cásicas, mongoloides y australoides, mientras que BF'F es la más común
en las poblaciones negroides. BF'F1 se observa en grupos africanos asi
como en algunas poblaciones caucásicas.
El gen C2 tiene 18 kb de longitud. Durante la activación de la vía alter-
na del sistema de complemento, la proteina se escinde en los aminoácidos
223 y 224, un enlace arginina-lisina, en dos fragmentos. C2a y C2b. C2a
es hemolíticamente activa. A nivel proteico, C2 muestra por electroforesis
un polimorfismo menor. Los alelos son C (común), un alelo 6 (básico)
menos común con tres variantes básicas raras y cuatro variantes A (acidí-
cas) raras. La localización polimórfica para el alelo C2'B es transportada
por el fragmento C2A. C2'C supone más del 95% de los genes C2 en la
mayoria de las poblaciones. C2'B supone del 3% al 4% de los genes C2.
951
Hay un alelo no expresado (C2'QO) que se encuentra en el 2% de la
población caucásica europea.
C4 se sintetiza como un único gran polipéptido de unos 200 kDa que
sufre un proceso postsintético que incluye la proleólisis de una estructura
de tres cadenas unidas por enlace disulfuro. La cadena más larga, de unos
87 kDa. es la cadena a y transporta el tioléster interno. Durante la activa-
ción de la vía clásica del sistema de complemento. Cls activado escinde un
pequeño péptido con propiedades de analilotoxina por el extremo ammo de
la cadena (/. C4. Hay dos locus distintos C4A y C4B que codifican dos for-
mas de C4. C4A y C4B se diferencian sólo por cuatro residuos aminoácidos
en la cadena a. entre las posiciones 1101 y 1106. Asombrosamente, C4A
acetila preferentemente grupos ammo, mientras que C4B acetila preferen-
temente grupos hidroxilo. Así, C4B es hemolíticamente más activo, pero
C4A es más activo que C4B inhibiendo la formación y disolviendo inmuno-
complejos. Las variantes de C4 generalmente transportan determinantes
antigénicos Rodgers (un epitopo Val-Asp-Leu-Leu de la cadena C4A), y
variantes de C4B transportan determinantes Chido (un epitopo Ala-Asp-
Leu-Arg de la cadena o. de C4B). Hay un polimorfismo genético amplio,
detectable por electroforesis de gel de agarosa en proteínas C4A y C4B en
todas las poblaciones examinadas (Awdeh, 1980). Se han reconocido al
menos 18 alelos C4A. 21 alelos C4B y un gen no expresado (C4'Q0) de
cada locus C4 (Mauff.1990). Se han identificado producios genéticos abe-
rrantes o híbridos con características en parte C4Ay en parte C4B Más sor-
prendente es la variación en el número de genes C4 en algún haplotipo indi-
vidual. Aunque es más habitual tener un C4A expresado y un C4B
expresado, la homoduplicación y la heteroduplicación son habituales, como
son los haplotipos con un solo gen C4 expresado. C4A'3y C4B'1 son los
alelos más comunes en casi todas las poblaciones. C4A'4. C4A'2. C4B'2y
C4B'5 muestran una distribución universal. C4A'6 también se observa en
muchas poblaciones excepto en algunos grupos mongoloides. C4B'3 se
identifica principalmente en grupos caucásicos y africanos.
Factor de necrosis tumoral a (y |5) y genes
de linfotoxina a y p
Los genes TNF y LTA o TNFB codifican potentes citocinas inmunomo-
duladoras que son producidas en respuesta a varios estímulos inflamato-
rios. El TNF-rx se produce en una variedad de células hematopoyéticas y
no hematopoyéticas, y LT-a específicamente por linfocitos (Carroll. 1987).
TNFo. y LT-a forman trímeros biológicamente activos y ambos se unen a
los mismos receptores de 55 kDa y 75 kDa (Bazzoni. 1995).TNF-</ y TNF-
jj son codificados cada uno por genes separados y comparten aproxima-
damente el 34% de la identidad de aminoácidos (Carrol. 1987). Los genes
que codifican TNF y LTA están localizados en una región 7kb centromérica
250 kb del gen para HLA-B y telomérica 355 del gen para C2. TNF-a y LT-
a se mantienen como moléculas de superficie de las células o son libera-
das de las células. LT-a se retiene en la superficie de la célula por una
región transmembrana. La superficie TNF-a no resulta de la presencia de
una región transmembrana sino más bien de una membrana glicoproteica
de 33 kDa conocida como linfotoxina-p" (LT-(i) (Browning, 1993). LT-js" tie-
ne un 21% y 24% de identidad con TNF y LT-a. respectivamente El gen
para LTB contiene cuatro exones, giros de 2 kb y está localizado entre los
genes TNF y LST1.
Hasta la fecha, se han identificado nueve polimorfismos en los iniciado-
res TNF-a, localizados en los nucleótidos -1031,-863, -857, -575. -376, -
308. -244. -238 y +70 relacionados con el lugar del comienzo de la trans-
cripción (Brinkman. 1994,1995: D'Alfonso, 1994: Hamann. 1995: Higuchi.
1998: Uglialoro, 1998; Wilson. 1992: Zimmerman, 1996). Dos endonuclea-
sas, EcoRI y Ncol, han mostrado modelos polimórficos con el gen LTA
(Messer, 1991; Partanen. 1998). La secuencia polimórfica para el enzima
EcoRI está localizada en el exón 4. mientras que la secuencia para Ncol se
ha localizado en el primer intrón del gen LTA. Se han identificado las
secuencias de ADN que constan de longitudes variables de repeticiones
TC.'GA o AC'GT o microsatélites dentro de la región de los genes TNF
usando secuenciación con gel de poliacrilamida. (Nedospasov, 1991) Hay
 952 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
cinco microsatélites: los microsatélites TNFa y TNFb están localizados en
la región telomérica 3.5 kb al gen TNFB y se han identificado 7 y 13 alelos,
respectivamente. El microsatelite TNFc está localizado en el intrón 1 del
gen TNFB y tiene dos alelos. TNFdy TNFe, que tienen siete y tres alelos,
respectivamente (Jongeenel. 1991).
Genes de la proteína 70 del golpe de calor
Las proteínas de estrés o proteínas de goipe de calor se expresan en res-
puesta a una variedad de estímulos de estrés a las células. Esta respuesta se
ha observado en todas las especies examinadas hasta la fecha. La familia de
las proteínas de estrés de 70 kDa tiene una alta identidad de secuencia de
aminoácidos desde los primitivos eucanotas hasta los humanos. Varios estu-
dios han demostrado el locus para la proteína 70 del golpe de calor (HSP70)
en los cromosomas 6. 14, 21 y al menos en otro cromosoma autosómico
(Hunt. 1985: Sargent, 1989). Tres genes que codifican a los miembros de la
familia HSP70 están localizados en la telomérica 92 kb al locus C2 {HSP70-
1, HSP70-2 y HSP70- Hom).
Los análisis secuenciales de genes HSP70-1 y -2 han mostrado que hay
genes carentes de intrón que codifican un compuesto proteico idéntico de
641 aminoácidos. HSP70-Hom también es un gen carente de intrón que
codifica una proteina de 641 aminoácidos y tiene un 90% de identidad de se-
cuencia con HSP70-1 (Milner. 1990). Debido al alto grado de similitud de
secuencias entre las regiones codificadoras de los genes HSP70. las sondas
de ADN que corresponden a las regiones codificadoras tienden a la hibrida-
ción cruzada. Sin embargo, hay suficiente diferencia de secuencias entre
las regiones no traducidas 5' y 3' del HSP70-1. -2 y -Hom para designar
cebadores de oligonucleótido y sondas que permitan la ampliación especí-
fica e hibridación de los tres genes (Milner. 1992). Se han detectado tres
sustituciones de nucleótidos en las regiones 5' flanqueadoras y no traduci-
das de HSP70-1: una transversión A-*C en la posición -110, una transición
T-»C en la posición +120, y una transversión G->C en la posición +190. Se
ha demostrado que variaciones en la posición -110 y +120 influyen en la
movilidad en la electroforesis en gel de políacrilamida. Se han reconocido
tres formas alélicas: HSP70-1 A (lenta), 8 (rápida) y C (intermedia). Las
sondas de oligonucleótidos que contienen variaciones de secuencia en la
posición -110 y +120 pueden también detectar los tres alelos. después de
una reacción de ampliación en cadena de la polimerasa específica (PCR)
del gen HSP70-1. En HPS70-2. una transición G->A en la posición 1267
provoca la pérdida de un lugar de restricción Psl-I. La hibridación de ADN
digerido genómico Psl-I con una sonda HSP70 provoca un fragmento poli-
mórfico de ADN. de 8,5 kb o 9 kb de longitud. En el gen HSP70-Hom. hay
una transición T~*C en la posición 2437 que se encuentra dentro de un
lugar de restricción Nco-I y produce dos fragmentos alélicos de 1.5 kb y 0,5
kb, respectivamente.
COMPLOTIPOS
En humanos, los genes C2 y BF están muy cercanos el uno al otro,
separados por menos de 2 kb. pero BF y C4A están separados por unos
30 kb. C4A y C4B están separados por unos 10 kb. Los cuatro genes com-
plementarios muestran un notable desequilibrio de ligamiento en haploti-
pos determinados por estudios de familias. Es decir, aparecen en pobla-
ciones juntas como grupos y en el mismo cromosoma con más frecuencia
de la esperada a la de sus alelos individuales más o menos de la misma
manera que los alelos en los sistemas de grupos sanguíneos Rh y MNS.
No se han documentado recombinaciones entre los genes complementa-
rios. Por estas razones, se consideran de forma correcta como unidades
genéticas únicas, o complotipos. arbitrariamente designados por sus alelos
¡ SB42
BF. C2. C4A y C4B. Asi, BFS. C2'C. C4A'00. C4B 1 es un complotipo
que en forma abreviada es SC01. Hay más de una docena de complotipos
en caucásicos que tienen frecuencias de casi un 0,01 o más (Tabla 41-1).
El complotipo SC31 es el más común en la mayoría de las poblaciones. En
las poblaciones negroides, FC31 es común, como lo es SC42 en los mon-
goloides asiáticos.
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS
Del estudio de la distribución de los complotipos según las especificidades
HLA-B y HLA-DR en haplotipos normales caucásicos determinados por estu-
dios de familias, se hizo evidente que existia un notable desequilibrio de liga-
miento que afectaba a toda la región. Se podía fácilmente reconocer el HLA-
B. complotipo, grupos de alelos DR que mostraban tres puntos de
desequilibrio de ligamiento estadísticamente significativos (Fig. 41-2) y que
definían los que se denominan haplotipos extendidos (Awdeh. 1983). Estos
haplotipos extendidos, que suponen al menos un 30% de los haplotipos nor-
males caucásicos, tienen una estructura voluminosa y una secuencia de ADN
relativamente fija y transportan alelos si no idénticos, muy parecidos, incluso
cuando se encuentran en individuos sin relación aparente. Otro rasgo impor-
tante de los haplotipos extendidos es su asociación con ciertos grupos racia-
les. En su mayoría, son muy característicos de un subgrupo étnico y tienen
frecuencias más bajas o no existen en absoluto en otros grupos étnicos. Tie-
nen presumiblemente su origen en el grupo donde su frecuencia como haplo-
tipos intactos es la más alta. Hay más de una docena de haplotipos extendi-
dos comunes en los caucásicos (Alper. 1992). Se han descrito diferentes
haplotipos extendidos para diferentes razas (p. ej. afroamericanos) (Fraser,
1990).
Estudios iniciales definieron los haplotipos extendidos como el intervalo
entre HLA-B y DR. Entonces se observó que otros alelos del MHC no carac-
terizados en el intervalo probablemente estaban incluidos. Al contrario, a
pesar de que los alelos HLA-A han mostrado una variación limitada para los
haplotipos extendidos, sólo la mitad de estos haplotipos muestran asociacio-
nes únicas significativas de alelos HLA-A (Alper. 1982). El gen HLA-Olue el
último en ser determinado. Según la distancia genética y los datos de identi-
ficación previamente incompletos de los pares HLA-B/Cw. era evidente que
los haplotipos conservados también incluirían la región genética HLA-Cvt.
Recientemente, se han asociado diferentes alelos HLA-Cw con diferentes
haplotipos extendidos (Tabla 41-2) (Clavijo, 1998).
El autor ha desarrollado el concepto de que los haplotipos extendidos
poseen una fijación al ADN al menos en el intervalo HLA-B/DR y. por lo tan-
to, si transportan un gen de susceptibilidad para una enfermedad, implícita-
mente todos los eiemplos independientes de ese haplotipo mostrarán aso-
ciación con esa enfermedad. Y al contrario, si el haplotipo extendido no tiene
un gen de susceptibilidad para una enfermedad, entonces él y los alelos que
lo constituyen protegerán frente a la enfermedad. Es esencial conocer la dis-
tribución étnica de un haplotipo extendido para evaluar si el haplotipo exten-
dido en pacientes está aumentado comparado con una población control
étnicamente equivalente o es realmente de hecho un marcador para la dis-
tribución étnica de la enfermedad.
Tabla 41-1 Complotipos comunes e n cromosomas normales d e
poblaciones caucasoides*
Complotipo Frecuencia
SC31 0,43
SC01
FC31 0.096
SC30 0.053
SC42 0,04
SC61 0.034
FC30 0,031
FC01 0.029
SC02 0.029
SC21 0.022
0.019
SC33 0,014
SC2(1, 2)- 0.013
SC32 0.011
"Los complotipos so dan como letras abreviadis y números, con cuatro alelos
en orden arbitrario: BF. C2. C4A. C4B
- El locus C4B esta heleroduplicado
 CAPÍTULO 41 • COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD 953

Figura 41-2. La distribución de haplotipo de los complotipos (haplotipos de los alelos complementarios) SC01 {BF'S. C2'C. C4A'00. C4B'1)
y SC21 (BF'S. C2'C. C4A'2. C4B'/)en relación con los alelos HLA-B en ordenadas y los alelos HLA-DR en abcisas. Las alturas y anchuras
que representan cada especificidad HLA son proporcionales a las frecuencias de los alelos para las respectivas poblaciones. Los racimos
representan los desequilibrios de ligamiento y los círculos los haplotipos extendidos (HLA-B16(38). SC21. DR4) en los judíos asquenazies y
[HLA-B8. SC01. DR3) en los ingleses y. con un alcance mucho menor, en los judíos. (De Alper CA. Awdeh Z. Yunis EJ: Conserved. extended
MHC haplotypes. Exp Clin lmmunogen1992; 9:58; con permiso de S. Karger)

varse por electroforesis de inmunofijación usando la insolubilidad de los

TIPIFICACIÓN DEL COMPLEMENTO
El sistema complemento está dividido en dos vías: la vía clásica que con-
tiene nueve diferentes componentes totalizando al menos 12 proteínas, y la
vía alterna que contiene cuatro. Tres de las 16 proteínas están codificadas
dentro del MHC y manifiestan variantes estructurales heredadas que pue-
den estudiarse por técnicas que detectan diferencias en la carga superficial
neta debidas a diferencias en los aminoácidos. Se utilizan dos métodos
para separar las proteínas (1) electroforesis en gel de agarosa de alto vol-
taje para detectar variaciones de movilidad entre proteínas a un pH deter-
minado y (2) electroforesis en geles de poliacrilamida de capa fina, que
demuestra diferencias en puntos isoeléctricos. Las proteínas pueden obser-
complejos antígeno-anticuerpo o por la detección de actividad hemolítica
funcional con geles sobrepuestos donde los hematíes de oveja sensibiliza-
dos con anticuerpos se combinan con suero deficiente en complemento
(Awdeh. 1983) (véase Cap. 38).
Las proteínas de la vía clásica |C2. C4A y C4B) y una de la vía alterna (BF)
están codificadas dentro del MHC. son polimórficas. y por lo tanto útiles para
la misión de los haplotipos del MHC. Para la tipificación de C2. las proteínas
se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida y se visualizan por
hemolisis C2-inducida en geles superpuestos. El suero humano normal dilui-
do puede reemplazar el suero deficiente en C2 como un reactivo porque C2
es el factor limitante en la vía clásica (Fig. 41-3).
La tipificación de C4 requiere tres técnicas diferentes:

1. Electroforesis de inmunofijación tras el tratamiento con neuramimdasa.

Los patrones producidos muestran tres bandas para cada variante con
alguna coincidencia entre ciertas variantes. Un tratamiento adicional de la
Tabla 41 -2 Distribución d e l alelo HLA-Cw e n relación c o n muestra con carboxipeptidasa reduce cada variante a una sola banda.
haplotipos extendidos c o m u n e s * 2. Detección de C4A frente a C4B mediante un ensayo funcional hemolitico.
Este método distingue C4A o patrones sobrepuestos de C4B porque las
Haplotipo extendido Alelo HLA-Cw variantes de C4B tienen de 5 a 10 veces la actividad hemolítica de las
[HIA-R8. SCOI. DR3¡ 0701 variantes de C4A.
¡HLA-B7. SC31. DR2¡ 0702 3. Reactividad serológica Rodgers (C4A) o Chido (C4B). El suero se incuba
[HLA- B44. FC31. DR7] 1601 bien con anti-Rodgers humanos o con anti-Chido humanos para probar la
[HLA-B44. SC30. DR4] 0501
(HLA-B57, SC6I. DR7¡ 0602 inhibición de la aglutinación con eritrocitos positivos apropiados.
[HLA-B14. SC22. DR1] 0802
[HLA-B35. SC31. DR5] 0401
¡HLA-B38, SC21. DR4] 1203 Alternativamente, las variantes de C4 pueden tipificarse por reactividad
¡HLA-B 15. SC33. DR4) 0304 Chido o Rodgers mediante inmunotransferencia. Hay dos formas de detectar
[HLA-B 18. F1C30. DR3I 0501 alelos nulos de heterocigotos C4. La electroforesis de muestras de C4 nulos
[HLA-B 18. S042. DR2]' 1203
(C4AVO y C4B'QO) demuestra ausencia de bandas en homocigotos pero
[HLA-B42. FC(1.90) 0. DR3f 1701
en heterocigotos requiere la cuantificación por inspección visual, por inmuno-
'Dalos Oe cromosomas de población normal caucasoide de Boston.
•Datos de pacientes con deficiencia de C2 De Clavijo OP. Delgado JC. Awdeh
electroforesis cruzada o por barrido densitométnco de los patrones de inmu-
ZL. y col: Tissue Antigens 1998. 52 282 nofijación. Un método alternativo consiste en determinar la presencia y las
:
Datos de cromosomas de población normal negra que vive en Boston De Cla- relaciones de las cadenas (/ de C4A y C4B tras la electroforesis de inmuno-
VIJO OP, Delgado JC. Yu N. y col Tissue Antigens 1999: 54 303 precipitados en gel de poliacrilamida en dodecil sulfato sódico.
 954 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Hl 1)2 B3 B4 »5 B6 1)7 Al A7 A2 A3 A4 A3
C4
La tipificación del factor B se realiza después de una electroforesis prolon-
gada en gel de agarosa e inmunofi|ación. Los modelos homocigóticos cons-
tan de una banda mayor y unas bandas menores rodeando, y los patrones
heterocigóticos son la suma de dos patrones homocigóticos.
PAPEL DE LAS MOLÉCULAS MHC CLASE I Y CLASE II
COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE
Los genes que controlan la respuesta inmune a antígenos extraños fueron
descritos inicialmente en modelos animales. Se demostró que estaban locali-
zados dentro de la región de la clase II del MHC. Se ha demostrado que las
células presentadoras de antigenos (APC) procesan fragmentos de antígeno
y presentan a estos péptídos como complejos con las moléculas clase I y cla-
se II, iniciándose así la respuesta inmune.
En los últimos años, se han producido avances significativos en la com-
prensión de la base molecular de la presentación del antígeno MHC, básica-
mente como resultado de la determinación de la estructura tridimensional de
A6
Figura 41-3. Posiciones electroloréticas de vanantes de C4 relacio-
nadas unas con otras (diagrama) Las variantes del locus C4B (Chi-
do) se muestran a la izquierda, y las del locus C4A (Rodgers) se
muestran a la derecha Cada gen consta de tres Bandas. Se observa-
rá que alguna de las variantes de C4B corresponden exactamente a
la posición de las variantes de C4A (B7 y A2. por ejemplo) La distin-
ción entre ellas se hace mediante un gel de agarosa superpuesto sen-
sible a C4 donde sólo las variantes de C4B tienen una actividad
hemolítica activa C4 (Awdeh, 1980). El BQOy AQO (alelos nulos) no
muestran bandas. En la posición más baja (lado izquierdo) de la figu-
ra, se muestran ejemplos del tipo común C2 (C) y un heteroogoto
(BC) mediante electroloresis en gel de poliacrilamida con gel de aga-
rosa superpuesto, conteniendo hematíes de oveja sensibilizados con
anticuerpos y una dilución 1/90 de suero humano normal. En la por-
ción más baja (lado derecho) de la figura, se muestran ejemplos de
patrones electroloréticos de vanantes BF tras eleclroforesis con gel
de agarosa e inmunofi|ación con antisueros anti-lactor B Cada gen
consta de una banda mayor y otras dos menores. El ánodo estaba a
la derecha.
las moléculas de clase I (Bjorkman. 1987). y clase II (Brown. 1993). y la carac-
terización de la unión de los péptídos a las moléculas MHC (Jardetzky, 1991;
Stem. 1994). La estructura cristalina del péptido ligado a las moléculas Clase
II ha demostrado que las cadenas laterales del péptido están localizadas en
pequeñas cavidades, llamadas bolsillos, en el lugar de unión. Estos bolsillos
varían de acuerdo a los aminoácidos codificados por cada alelo HLA. Las
mutaciones puntuales en los genes clase II son criticas para la unión del pép-
tido y la presentación y ocurre normalmente dentro o cerca de los bolsillos de
unión al péptido. Así, la diferenciación de los alelos HLA es crucial para la
interpretación de HLA y asociaciones con la enfermedad. Los métodos para
la caracterización de los alelos clase I y clase II se han descrito en el Capítu-
lo 40. Parece que algunos bolsillos juegan un papel en algunas enfermeda-
des. Por ejemplo, ciertos alelos que codifican el bolsillo de unión al péptido.
P4 o la cadena DRp\ están asociados con artritis reumatoide (Hammer. 1995)
y lepra tuberculoide (Zerva. 1996), mientras que otras que codifican el bolsi-
llo P9 o la cadena DQ|i están relacionadas con la tuberculosis clínica (Gold-
feld, 1998), pénfigo vulgar (Delgado, 1997) y protección frente a diabetes
insulino-dependiente (Todd, 1987).
 CAPÍTULO 41 • COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC
Hay un número notable de enfermedades que muestran asociación con
HLA. La mayoría, aunque no todas, son autoinmunes y no muestran una
herencia mendeliana bien definida. El gran número de enfermedades aso-
ciadas con HLA se debe al hecho de que el MHC contiene muchos genes
importantes y porque los genes de la región, incluso los genes no-HLA, son
extraordinariamente polimórficos. En una región donde la densidad de genes
se muestra anormalmente alta, esto provoca un gran número de genes de
potencial susceptibilidad. Un problema importante con los genes de sus-
ceptibilidad de MHC es su penetrancia incompleta, haciendo muy difícil,
sino imposible, la segregación formal habitual y los estudios de ligamiento.
Además parece probable que muchas enfermedades asociadas a MHC
sean poligénicas. Debido a estos problemas, el autor comenzará su exposi-
ción con las alteraciones determinadas por MHC que muestran herencia
mendeliana y un 100% de penetrancia, al menos para el defecto bioquími-
co primario.
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de
defectos en genes de MHC
Las variaciones frecuentes de los componentes del complemento humano
y la cantidad de genes, junto al amplio polimorfismo de las proteínas, hace
que los genes de complemento sean excelentes marcadores de asociaciones
de enfermedad con el complejo de histocompatibilidad (Yang, 1999).
Deficiencia de C2
La deficiencia del segundo componente del complemento se ha descrito
sólo en caucásicos y es el estado deficitario de proteína del complemento
más común en esa población. Aproximadamente la mitad de los pacientes
son asintomáticos. Sin embargo, la deficiencia de C2 se ha asociado con
polimiositis, infecciones piogénicas recurrentes, púrpura Henoch-Schónlein
y vasculitis. El cuarenta por ciento de los casos descritos tienen una enfer-
medad sistémica tipo lupus; sin embargo, sólo el 16% de los hermanos
homocigóticos deficientes en C2 han tenido alteraciones tipo lupus. Esto
aconseja con firmeza la investigación de errores sistemáticos. No obstan-
te, existe una clara tendencia aumentada de los sujetos homocigóticos
deficientes en C2 a tener alteraciones tipo lupus, quizá relacionado con
una depuración o desagregación defectuosas de los inmunocomplejos. La
deficiencia de C2 tipo I resulta de la homocigosidad del alelo nulo. C2"QO,
que tiene una frecuencia de gen de un poco menos de 0,01. Hay aproxi-
madamente 1 homocigoto por cada 10.000 individuos. Casi todos los
pacientes tienen elementos de un haplotipo extendido [HLA-A25. Cw'1203,
B18. S042. DRBV1501. DQBI'0601. DQAV0102] que contiene un gen de
deficiencia en C2 (Awdeh, 1980; Clavijo, 1998; Truedsson, 1993). Las aso-
ciaciones de complotipo son más frecuentes, seguidas por las asociacio-
nes del DR, HLA-B, HLA-CW y HLA-A, de acuerdo con el orden de gen
conocido. C2"Q0 resulta de la deleción de un gen de 28 pb que genera un
marco de lectura y un codón finalizador de 14 pb distal al final del exón 5.
La deficiencia de C2 tipo II (no asociada con ningún elemento de los haplo-
tipos tipo I) es muy rara y produce un bloqueo selectivo de la secreción de
C2. El motivo del bloqueo de esta secreción no se conoce (Colten, 1992;
Zhu, 1998).
Deficiencia de C4
Hay una alta incidencia de alelos nulos C4 en la población general. El trein-
ta y cinco por ciento de individuos de todas las razas no expresan un gen C4A
o C4B (esto es, portan C4A'Q0 o C4B'Q0), del 8% al 10% portan dos alelos
nulos, y menos del 1% no expresan tres alelos. Las deficiencias completas de
haplotipos C4 (Irans C4A'Q0. C4B'Q0) son extremadamente raras y pueden
detectarse en heterocigotos sólo con estudios de familia. En contraste con la
deficiencia de C2, la deficiencia de C4 se ha descrito en al menos nueve
haplotipos MHC diferentes, incluyendo aquellos con tipos BF diferentes, lo
que sugiere que la deficiencia surge de un número de mutaciones diferentes.
C4A'O0 y C4B'O0 proceden de deleciones de genes, codones finalizadores
955
y otras mutaciones que producen fallos en la transcripción (Braun, 1990;
Lokki, 1999). El alelo C4A'O0. particularmente en individuos homocigóticos o
en aquellos con deficiencia completa de C4, se ha asociado con lupus erite-
matoso discoide y sistémico (Dunckley, 1987; Nousari, 1999). Esta suscepti-
bilidad probablemente se relaciona también con un manejo defectuoso de
inmunocomplejos, como en la deficiencia de C2 y otras deficiencias del primer
componente del complemento (Fielder, 1983). Los homocigóticos C4B'Q0se
han asociado con nefropatia de inmunoglobulina A (IgA). Además, hay una
incidencia 3.5 veces mayor de homocigóticos C4B'Q0 en niños con meningi-
tis bacteriana (Colten, 1992). El nivel de C4 en suero en pacientes con alelos
C4 nulos es extremadamente variable y no puede utilizarse con fiabilidad para
detectar heterocigotos para una deficiencia completa, incluso aunque haya
una correlación aproximada entre el nivel de C4 y el número de genes C4
expresados.
Hiperplasia suprarrenal congénita por deficiencia
de 21-Hidroxilasa
Esta alteración es clínicamente heterogénea, con una forma grave con
depleción salina, una forma más leve tardía manifestada en gran parte por
masculinización en las chicas, y una forma leve oculta. El vínculo con el
MHC de esta alteración lúe descubierto antes de que tuese detectada nin-
guna asociación de MHC y antes de que se supiera que los locus CYP21
estaban localizados en el MHC. Posteriormente se encontró que en los cau-
cásicos europeos estudiados en el noreste de Estados Unidos y en Inglate-
rra, el 20% o más de los haplotipos en los pacientes con la forma con deple-
ción de sales tenían el haplotipo extendido raro [HLA-A1. Cw6, B47, FC
(91)0. DRB1 '07. DRB4'0101. DQAV0201. DQBV0201] (Fleischnick,
1983). Se ha demostrado que este haplotipo tiene una deleción tanto de
C4B como de CYP21B. explicándose asi la gravedad de los síntomas y la
deficiencia completa del enzima en homocigotos para este haplotipo. Entre
los pacientes con la enfermedad más leve y oculta, es común un haplotipo
extendido diferente; [HLA-B65. SC2(1.2>, DR1] (Sinnot, 1991). Este haploti-
po es común, particularmente en el sur de Europa, y tiene una frecuencia
en caucásicos de Boston por encima de 0,01. En todas las formas de defi-
ciencia de 21-hidroxilasa, la mayoría de haplotipos de MHC no están exten-
didos y hay una gran variedad de complotipos, lo que sugiere que muchas
mutaciones independientes han provocado una deleción o una alteración
del gen CYP21B.
De estas observaciones, se pueden extraer algunos principios generales
para la posible aplicación a estas enfermedades de herencia y patogénesis
desconocidas que presentan asociación o ligamiento con MHC. Primero, si un
gen de susceptibilidad para una enfermedad se produce en un haplotipo
extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán asociaciones positivas
con la enfermedad. Y al contrario, si esto no ocurre en un haplotipo extendi-
do, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán una asociación negativa con
la enfermedad. Como los haplotipos extendidos tienen fijación al ADN en
eiemplos independientes de haplotipo extendido asociado a enfermedad, y
son comunes, las personas sanas deben transportar genes de susceptibili-
dad. Todos los marcadores de enfermedad de MHC, y particularmente los
haplotipos extendidos, muestran un alto grado de especificidad en la pobla-
ción, Es por tanto particularmente importante en estudios de marcadores de
MHC para la enfermedad comparar alelos de enfermedad y haplotipos (los de
pacientes) con aquellos controles cuidadosamente emparejados étnicamente.
Idealmente, el apareamiento étnico debería incluir regiones específicas de ori-
gen o subgrupos étnicos.
Enfermedades de etiología y patogénesis
desconocidas
Se han descrito un gran número de enfermedades que muestran aso-
ciaciones con MHC. Estas alteraciones son muy diferentes de unas a otras
y, aunque la mayoría tienen al menos algún aspecto inmunológico, otras
pocas no. Hay muchos problemas que impiden comprender los mecanis-
mos por los que se producen estas enfermedades, y los análisis de mar-
cadores de MHC en pacientes y sus familias han clarificado el panorama
sólo secundariamente. El origen más importante de confusión es un fenó-
 956 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
meno denominado penetrancia incompleta. Se ha observado más clara-
mente en gemelos homocigóticos que presumiblemente tienen genes idén-
ticos. Si uno de estos gemelos tiene una de estas enfermedades (p. ej.,
diabetes mellitus tipo I). el otro gemelo no tiene necesariamente la enfer-
medad. Para la diabetes tipo I. la relación de concordancia no es superior
al 50°c (Ftubinstein. 1977). Esto sugiere que la penetrancia de una enfer-
medad en un huésped completamente susceptible es incompleta: aunque
hay una importante razón para considerar a los genes en el MHC como
determinantes de la susceptibilidad para la diabetes tipo I. sólo el 15% de
los hermanos con MHC idéntico de los pacientes tienen diabetes insulino-
dependiente. La diferencia entre el 50% y el 15% muestra la influencia de
los genes en un segundo locus (o locu) no ligado a MHC, y también sugie-
re un factor o factores ambientales en la susceptibilidad determinante. La
penetrancia incompleta hace difícil la asignación de una forma especifica
de herencia y provoca que la probabilidad de encontrar familias con más
de un miembro afectado en una o más generaciones sea ba]a. Normal-
mente se utilizan las lamilias para determinar las formas de herencia. Otros
factores que complican la situación son la incapacidad para determinar si
se está estudiando un grupo de pacientes homogéneos en términos de
determinación genética. Casi el 5% al 6% de las familias seleccionadas al
azar con un miembro diabético tipo I tendrá un segundo niño afectado. De
estas parejas hermanas, aproximadamente el 60% tendrá un MHC idénti-
co, el 35% serán haploidénticos, y un pequeño porcentaje no compartirá
haplotipos MHC. Este patrón sugiere una herencia recesiva de un gen de
susceptibilidad ligado a MHC para la enfermedad. Esta conclusión también
se basa en los resultados de los análisis de distribución de homocigotos y
heterocigotos para BF'F1 entre 1.100 diabéticos tipo I (Raum. 1981). Sin
embargo, todavia se ha de explicar la desviación del 100% de identidad
MHC de hermanos afectados. Entre las explicaciones que se barajan están
el entrecruzamiento del locus de susceptibilidad y el MHC, genes impene-
trantes en padres susceptibles, y heterogeneidad en la forma de herencia,
incluyendo penetrancia variable en homocigotos comparado con heteroci-
gotos. Esto ha conducido a un vasto número de modelos de enfermedad
sin encontrar una manera de hacer distinción entre ellos. Al menos, sin
embargo, los estudios de familia proporcionan datos de haplotipos muy úti-
les y generalmente permiten la asignación de homocigosidad para un mar-
cador HLA en los individuos de prueba. También se ha establecido que la
asociación MHC está basada en un ligamiento entre un gen de susceptibi-
lidad y el MHC.
Se desconoce todavia el número de alelos de susceptibilidad diferentes
para una enfermedad en una población específica. Con respecto a esto, los
haplotipos extendidos pueden ser útiles porque, si están aumentados en los
pacientes, probablemente representan un alelo único de susceptibilidad que
pudiera estar en cualquier lugar en la región de fijación. Sin embargo, algu-
nos pacientes presentan sólo porciones de esos haplotipos y esto proporcio-
na indicios para localizar la participación de los alelos específicos. Otro indi-
cio puede ser el reparto de alelos específicos por dos o más haplotipos
extendidos diferentes.
Enfermedades especificas sin evidencia de herencia
mendeliana y con asociaciones MHC
La Tabla 41-3 enumera algunas enfermedades asociadas a MHC y sus
marcadores. Esta lista no es exhaustiva y sólo se tratarán algunas de ellas.
La aplicación de los métodos de análisis ya citados sólo ha permitido enten-
der unas pocas de estas alteraciones.
Existe una asociación marcadamente potente entre HLA-S27 y espondi-
litis anquilosante (EA) en poblaciones caucasoides. orientales y africanas
(Khan, 1992). Entre los pacientes con EA, artropatías reactivas y uveitis
aguda anterior, alrededor del 90% de los pacientes caucásicos, comparado
con un 5% o 10% de los controles sanos, tienen HLA-B27(Rubin. 1994). La
asociación de B27 con estos síndromes en cuatro grupos raciales (caucási-
cos, negros, japoneses, indios americanos) sugiere que B27 por sí mismo o
un gen estrechamente ligado a B27 está involucrado en la patogénesis de
estas enfermedades. Las diferencias en la prevalencia regional de EA se
relaciona también con la frecuencia de HLA-B27. Entre los individuos HLA-
B27 positivos en la población en general, sólo el 2% desarrolla EA Si hay
una historia familiar de la enfermedad, la prevalencia entre los parientes
HLA-B27positivos es aproximadamente del 20%. Se han descrito al menos
14 alelos de HLA-B27, HLA-B'2705 es el alelo que se encuentra más
comúnmente en los sujetos normales. Se ha propuesto que la presencia de
HLA-B40o HLA-B39en el otro haplotipo HLA. incrementa más la suscepti-
bilidad a EA. lo que corrobora la hipótesis de que los alelos no-B27contri-
buyen a una susceptibilidad aumentada de EA. Las proteínas bactenanas
que muestran homología estructural con HLA-B27 incluyen una secuencia
de seis aminoácidos entre los residuos 72 y 77 del HLA-B'2705 y los resi-
duos 188 y 193 de una nitrogenasa reductasa de Klebsiella pneumoniae, y
entre las posiciones 71 y 75 de los subtipos mayores HLA-B27 y una
secuencia de cinco aminoácidos de un plásmido de una cadena atrilogéni-
ca de Shigella flexnerii (Stieglitz, 1989).
De todas las enfermedades ligadas al MHC. la diabetes mellitus tipo I es
la que más se ha estudiado (Lernmark. 1999; Nepom, 1991; Thorsby, 1992;
Winler, 1993). La contribución de HLA a la diabetes tipo I no se ha explica-
da adecuadamente. Existen considerables aumentos en el HLA-DR3y DR4
en pacientes caucásicos. En muchas pero no en todas las poblaciones de
pacientes caucásicos con diabetes tipo I hay un exceso de heterocigotos
DR3/DR4 por encima del número de homocigotos DR3 o DR4 predecibles
por el equilibrio Hardy-Weinberg. Las razones de esto no están claras. Por
análisis del ADN. el aumento en DR4 se encuentra ante todo en el subgru-
po de DR4 en desequilibrio de ligamiento con DOBT0302. Aunque actual-
mente se considera que el último gen es un marcador principal y quizás un
determinante primario de la susceptibilidad a la diabetes tipo I, existe sólo
en el 70% de los pacientes caucásicos, e incluso en aquellos que lo trans-
portan, hay una variabilidad en el nesgo relativo para diabetes: DRBV0401.
DOBV0302 y DRBV0402 DOBV0302 están asociados en gran medida
con la enfermedad, mientras que DRBV0404, DOB1'0302\o están menos.
Además, se ha observado que los pacientes HLA-DR1/DR4 transportan el
alelo DOBV0302 en el haplotipo DR4. Por lo tanto, parece probable que
haya múltiples contribuciones de la región clase II a la susceptibilidad a dia-
betes DQA 1'0301 esta presente en todos los haplotipos Dispositivos,
transporten DOB1 '0302 o no. y es posible que pueda contribuir al nesgo.
Por otra parte, DQ6 se encuentra negativamente asociado a la diabetes tipo
I. Los individuos heterocigoticos para DRBV1501 que también transportan
un gen de susceptibilidad para la diabetes tipo I en el otro haplotipo no
sufren riesgo en absoluto para la enfermedad (prolección dominanle), como
se espera en una alteración recesiva. Un modelo recientemente propuesto
para la diabetes tipo I que asume que DOB1 es un determinante directo de
la susceptibilidad, sugiere una jerarquía de afinidades entre las diferentes
moléculas clase II que compiten por unirse al mismo péptido de diabetes
tipo I (no identificado). La susceptibilidad sucede si un producto del gen (por
ej., DQBV0302) se une y presenta el péptido. En presencia de un competi-
dor de alta afinidad {DRBI'1501). esto no ocurre. El sinergismo (DR3/DR4)
podría explicarse por la unión de un péptido de alta almidad a un dímero cla-
se II frans-asociado. Un nesgo relativo diferente (DR1/DR4 o diferentes
haplotipos transportando DOBV0302) puede explicarse por diferentes afini-
dades de aquellas moléculas por el péptido. Otro modelo propone que un
ácido aspártico en el codón 57 de la cadena DOS protege (rente a la dia-
betes tipo I. La presencia excesiva en pacientes de un aminoácido dileren-
te. más frecuentemente valina o serina. en esa posición en haplotipos
transportando HLA-DR3 o DR4 respalda este concepto. Varios estudios han
confirmado este hallazgo en caucásicos pero no en diabéticos orientales.
Otros estudios proyectan la hipótesis de que la presencia de arginina en la
posición 52 del DQA1 es otro factor genético. Se ha propuesto que la com-
binación del ácido no aspártico en la posición 57 de DOB1 y arginina en la
posición 52 de DQA 1 es un importante determinante de susceptibilidad para
la diabetes tipo I mediada por genes DOB1.
Existe datos significativos respecto a la asociación entre marcadores
MHC y artritis reumatoide (AR) (Auger. 1998: Nepom, 1992: Ollier, 1992).
Para la mayoría de las poblaciones estudiadas, el marcador asociado pri-
mario es HLA-DR4. En los caucásicos, por ejemplo, los alelos DR4 más
comunes asociados con AR son DRBV0401, 0404 y 0408. y en pacientes
japoneses, israelíes y chinos, es DRBV0405. Otras especificidades HLA-
DR también se asocian con AR: DR1 se ha descrito en asociación con AR
en pacientes caucásicos, japoneses, españoles, griegos e israelíes: DR3
 CAPITULO 41 COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD 957

Tabla 41-3 Ejemplos de asociación entre HLA y enfermedad'

Enfermedad Etnia Antígeno HLA Riesgo relativo
Enlermedad de Behcet Japoneses B51 79
Chinos B51 3.4
Enfermedad celiaca Caucásicos británicos DRB1-0301 26.7
DQB1*0201 51 8
DQAV0501 139
Caucásicos italianos DRB 1-0301 6.9
DQB1*0201 368
DQ Al'0501 10.9
DRB 1 "0701 4
DQA1-0201 67
Caucásicos checos DRB t '0301 12.2
DOAt-0501 11
DRB1-0701 3.1
DQA 1-0201 2.9
Enfermedad de Graves Caucásicos germanos DR3. B8. Cw7 3.?-5.5
DOAt'0102 9.2
Japoneses A2 2.9
DPB1-0501 5.3
Caucásicos sardos DRBT1601 2,3
Chinos de Singapur DRB 1 -0301 3,5
DR5? 7,3
Tiroidilis de Hashimoto Caucásicos húngaros DR52 3.4
DR53 4.1
Caucásicos canadienses DOA1-0301/0302 DQBV0201 3.6
Caucásicos británicos DQA 1 "0301/0302 DQB 1 '0301 9.7
infección VIH Caucásicos europeos Cw7 1.5
DQB 1 '0601 2,2
Progresor rápido" B7 3,4
B35 2.5
Cw7 2,1
Progresor lento DQB 1-0605 9,2
Enfermedad de Hodgkin Caucásicos (Europa/América) DPB 1'0301 1,95
Nefropatia membranosa idiopatica Caucásicos británicos DRB3-0101 5.5
DRB 1 "0301 9.8
DQB 1-0201 21.6
DQA 1'0501 6.7
Japoneses DRB1M501 14,2
DQB 1-0602 16,8
DQAV0102 7,1
Síndrome nelrótico Caucásicos franceses DR7 6,4
idiopatico DQA 1-0201 5,3
Caucásicos germanos DR7 2,8
DQA 1-0201 3.3
Esclerosis múltiple Caucásicos franceses DRBT1501, DQB 1*0602. DQAT010? 3.0
Caucásicos europeos Uno de DQAr010?/0103 o 0501 mas uno de DQB1 0602/ 13.0
0603/0604/0302/ o 0303
Narcolepsia Japoneses DRB T1501 1 030
DRB5-0101 1 263
DR15 384
DQB 1 '0602 1 468
DQAT0102 537
Caucásicos canadienses DRBV1501 93.5
DR15 13.2
DQB 1-0602 85.4
DQA 1-010? 28.6
Artritis reumatoide Caucásicos franceses DRB 1'01 3,5
DRB t-0401 4,1
DRB1'0404 107
Indios asiáticos DR1 34
DRBI-IOOt 3.8
Chinos DR1 6.8
FB-FS 3.1
Japoneses DRB 1-0405 3.6

'Individuos infectados con VIH que transportan el haplotipo [HLA-B8. SC0I. DR3] tienen un d( ledad mas rapido
(Véase Stool CM. Ludían CA. Beatson. D. y col: HLA haplolype Al B8 Dr3 as a risk for HIV re t 1988: 1:1185).
Datos extraídos de Tsuii K. Aizawa M. Sasa/uki T (eds) HLA 1991 Proceedings of the 11'" Inter id Conference New York. Oxford University Press,
1992

en kuwaitíes; Dfl6en indios Yakima americanos; DR9 en chilenos, y DflfOen susceptibilidad a AR. Los alelos asociados con AR comparten una secuen-
pacientes españoles, griegos e israelies. Para explicar este amplio espectro cia de aminoácidos muy bien conservada en su tercera región hipervaria-
de diferentes asociaciones HLA-DR con AR. se ha propuesto que la ble (aminoácidos 70 a 74). Estos residuos podrían afectar a la unión de
secuencia de un péptido DRB1 compartido está involucrada en conceder péptídos y a su presentación a las células T. Así. sí existe un péptido artri-
 958 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
togénico. puede unirse preferentemente a moléculas con la secuencia
DRB1 de la AR. Por el momento, no se ha identificado tal péplido. Una
explicación alternativa puede involucrar un mimetismo molecular entre el
DRB1 de la AR compartido y secuencias antigénicas de un patógeno que
pueda inducir AR. Se ha encontrado una homología de secuencia entre la
secuencia compartida de AR y una HSP de 70 kDa de Escherichia Coli.
Varios artículos han demostrado una relación entre la gravedad de la AR y
la frecuencia HLA-DR4 en aumento, en particular con DRBV0401. Se ha
detectado que los pacientes HLA-DR4-positivos con AR tienen una evolu-
ción grave de la enfermedad, y los pacientes homocigóticos HLA-DR4 tie-
nen más probabilidad de sufrir una AR mas grave. También es posible que
la producción de factor reumatoide esté asociada con DR4 El riesgo aso-
ciado con DRBV04 generalmente es mayor que el alribuible a DRBI'01 o
DRBV10.
La AR se diferencia clínicamente de la artritis reumatoide juvenil (ARJ). En
contraste con la asociación con DR4 en la artritis reumatoide. las asociacio-
nes HLA con ARJ son bastante diferentes. Además, otras asociaciones HLA-
DR varían con los subgrupos clínicos de ARJ (Stastny. 1993). Por ejemplo,
se ha descrito que el haplotipo HLA-DRB1'0801. DQAV0401. DQBV0402
está aumentado en todo el grupo pauciarticular y en pacientes con la forma
persistente pauciarticular. El haplotipo HLA-DRBV1301. DRB3'0101.
DOA1 '0103. DQB1 '0603 también se asoció con pacientes con ARJ pauciar-
ticular persistente (Fernández-Vina, 1994). Otras especificidades asociadas
con la ARJ pauciarticular persistente son DRBV1104 y DPBV0201. La ARJ
pauciarticular que pasa a la forma poliarticular se ha asociado con:
DRBI'01. DRBV0801. DRBV1401. DQBV0501, DQBV0503. DQAV0101
y DPB1'0201. La ARJ pauciarticular con iritis crónica muestra una fuerte
asociación con DRBV1104. DR8y DR6. Además de las asociaciones Clase
II, se ha observado un aumento significativo en HLA-A2 en pacientes con
ARJ pauciarticular. Los pacientes varones con comienzo después de los
ocho años tienen una frecuencia marcadamente aumentada de HLA-B27. En
pacientes con ARJ poliarticular y factor reumatoide negativo, DRBV0801 y
DPBI'0301 han mostrado asociación con la enfermedad. Teniendo en cuen-
ta que la forma poliarticular de ARJ es un caso de AR en la juventud, el
DRBV0401 muestra una fuerte asociación.
En caucásicos, los dos haplotipos extendidos suponen más del 60% de los
haplotipos en pacientes con enteropatía sensible al gluten (ESG) (Goggins,
1994; Marsh, 1992): [HLA-B8. SC01. DR3] y [HLA-B44. FC-31. DR7). De
manera análoga a la diabetes, existe un aumento en HLA-DR5/7. Tanto HLA-
DR3 como DR7 están en desequilibrio de ligamiento con HLA-DQ2
(DQBV0201. DQAV0501). Esta combinación de genes DQB y DQA se
encuentra en el 98% de los pacientes con enfermedad celíaca (EC). El pépti-
do gliadina, que previamente se ha visto que exacerba la lesión EC in vitro e
¡n vivo, parece que se unía a DQ2, aportando más credibilidad a su posible
papel en la patogénesis de EC (Shidrawi, 1998). Este hallazgo sugiere que
HLA-DQ2 podría presentar al péptido gliadma a las células T para su recono-
cimiento inmune. Diferentes estudios han apuntado la posibilidad de la exis-
tencia de alelos específicos HLA-DP asociados con ESG: DPBV01 y
DPB1'03en el sur de Europa, y DPB1'03y DPBV04 en el Norte de Europa.
El aumento en DBP'01 se encuentra asociado con HLA-DR3. lo que indica
que el haplotipo extendido [HLA-B8, SC01. DR3] a menudo se extiende a tra-
vés de DP en EGS. Los determinantes de susceptibilidad DP y DQ compar-
ten un residuo cargado positivamente alrededor del codón 71 de la cadena-(5.
pero su papel específico aún no está claro. Otro marcador MHC reciente-
mente asociado con ESG es el alelo de 8,5 kb del gen HSP70-2. que se cono-
ce por estar ligado de forma inestable con haplotipos transportadores de HLA-
DR3 (Partanen, 1998). ESG y la dermatitis herpetiforme (DH) comparten
algunos rasgos clínicos y marcadores MHC. Los pacientes con DH han
aumentado la frecuencia de los mismos haplotipos extendidos asociados a
ESG. Sin embargo, comparando el halotipo. es evidente que las dos altera-
ciones son diferentes: los genes de susceptibilidad para ESG están dentro o
cerca de la región HLA-DR/DQ. mientras que los de DH parecen estar entre
el complemento y la región HLA-DR/DQ. más cercanos a la región del com-
plemento (Ahmed. 1993a).
El pénligo vulgar (PV) se ha asociado a dos tipos de haplotipos HLA-
DR4. DQ8 entre los pacientes judíos [HLA-B38. SC31. DR4. DQ8] y [HLA-
635, SC31. DR4. DQ8] y un haplotipo HLA-DR6. DQ5 [HLA-B55. SB45.
DR6. DQ5] en pacientes no judíos. Estos hallazgos indican que dos muta-
ciones dieron origen a genes de susceptibilidad MHC para el pénfigo vulgar.
Uno, quizá el más antiguo, surgió en un precursor de [HLA-B38/35.
SC2I/31. DR4. DQ8] en una población judia y se difundió a poblaciones no
judías. El otro, más reciente, parece haber surgido sobre [HLA-B55. SB45.
DR14(6). DQ5] en el sur de Europa o en Asia y se difundió a otras pobla-
ciones (Ahmed, 1991). La presencia de autoantícuerpos PV (desmogleina 3)
ha mostrado una fuerte evidencia de ligamiento con DRB1'1404,
DQB1 '0503. DQA V0101 (Delgado. 1997). El cuarenta y ocho por ciento de
los parientes de los pacientes con PV que comparten los haplotipos de sus-
ceptibilidad tienen bajos niveles de anticuerpo PV. Asi. la enfermedad pare-
ce producirse en individuos susceptibles con bajos niveles de anticuerpo
cuando un segundo factor, genético o ambiental, induce niveles altos, sufi-
ciente para producir vesículas (Ahmed, 1993b). La evidencia que establece
un papel directo de los genes HLA en PV surge de estudios que muestran
que un péptido de 15 residuos, idéntico a un segmento de la desmogleina
3. se une a un punto de un DRB1'0402 {Bho\. 1995).
En el penfigoide cicatricial (PC), HLA-DRBT04 y DQBV0301 se han
asociado con la forma ocular de la enfermedad (Ahmed, 1991). La forma
oral de PC también está asociada con DQBV0301 (Delgado. 1996). Estos
resultados indican que DQBV0301 es un marcador común para ambas for-
mas, oral y ocular, de PC, lo cual puede formar un espectro de una sola
enfermedad. Los análisis de la secuencia de aminoácidos presentes en los
alelos DQB1 en los pacientes con formas ocular y oral de PC mostraron
que comparten residuos comunes en las posiciones 57 y de la 71 a la 77,
y es posible que puedan ser también marcadores para esta enfermedad
(Yunis, 1994).
El MHC se ha asociado con una variedad de enfermedades infecciosas
En la malaria, ambas moléculas HLA clase I y clase II se han asociado con
la prolección de la enfermedad grave en Gambia (Hill, 1991). Un alelo
especifico, HLA-DQBV0503. se ha asociado con la tuberculosis clínica
progresiva (Goldfeld, 1998) Esta asociación es particularmente intrigante,
ya que el alelo DQBV0503 codifica un cambio en la posición 57 del ami-
noácido de la cadena [i (|i57), que afecta a la carga existente en el bolsi-
llo de la unión al péptido putativo. P9. de la molécula DQ. Se sabe que este
bolsillo contiene residuos hidrofóbicos. El alelo DOS V0503 codifica el áci-
do aspártico negativamente cargado en |557 en lugar del aminoácido vali-
na más común, sin carga e hidrofóbico Es posible que la presentación de
péptidos restringida a MHC por los macrófagos infectados de tuberculosis
esté afectada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo en par-
ticular. El bolsillo de unión a P9 cargado negativamente puede unirse a
antigenos de tuberculosis con menos efectividad o puede obtener una res-
puesta inmunogénica disminuida. HLA-DRBV0901 esta más representado
en pacientes tuberculina (PPD) positivos en comparación con pacientes TB
anérgicos. DfíBJ '0901 es el único alelo que codifica un cambio en la posi-
ción 9 del aminoácido de la cadena (i (|}9). que influye en la carga en el
bolsillo de unión al péptido putativo. P9. de la molécula DR El alelo
DRBV0901 codifica el aminoácido lisina cargado positivamente en (59 en
lugar del ácido glutámico más común y cargado negativamente Es posible
que la respuesta restringida a MHC a los péptidos PPD esté aumentada en
el grupo de pacientes que expresan este bolsillo particular. El bolsillo de
unión a P9 cargado positivamente puede unirse a residuos de PPD con
más eficacia o puede obtener una respuesta inmunogénica aumentada
Los antígenos HLA-B. B-27. B51 y B57 se han asociado a la falta de pro-
gresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) (Kaslow. 1996)
Las moléculas HLA-B pueden ser clasificadas por la presencia de un epi-
topo molecular Bw4 o Bw6 o especificidad pública, que está definida por
los residuos 79 a 83 en el extremo carboxi-terminal de la hélice a, (Salter,
1989). El autor ha encontrado recientemente que la profunda supresión de
la viremia por el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1). en
ausencia de terapia antiviral con fármacos, está significativamente asocia-
da con la homocigosidad para alelos HLA-B que comparten el epítopo
HLA-Bw4 (Flores-Villanueva, comunicación personal). Estos datos sugie-
ren que los péptidos que se unen a los alelos HLA-Bw4 pueden mostrarse
útiles en el desarrollo de vacunas basadas en péptidos.
Los polimorfismos de genes HLA clase III se han asociado a enferme-
dades. Se han estudiado varios sistemas de alelos TNFy HSP-70 y micro-
 CAPÍTULO 41 • COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD 959

satélites en relación con los haplotipos extendidos (Tabla 41-4). El poli- Es posible calcular la frecuencia del gen (g) sin conocer el tipo de herencia
morfismo en la región promotora TNF-ot, localizada en el nucleótido -308 usando la fórmula:
afín al lugar de comienzo de la transcripción, se relacionó con una aumen- ¡7 = i-v7
tada susceptibilidad a la malaria cerebral (McGuire, 1994), espondilitis
anquilosante (McGarry, 1999), mortalidad por choque séptico (Mira, 1999)
y leishmaniasis mucoculánea (Cabrera, 1995). Los microsatélites del TNF
d3 y b4 y la vanante HSP-70-1 9.0 fueron encontrados en frecuencias más Fuerza de la asociación
altas en dos poblaciones distintas con agranulocitosis inducida por cloza-
Se han ideado varios métodos para detectar el grado de asociación de los
pma (Corzo, 1995; Turbay, 1997). Otros sistemas de microsatélites se han
marcadores genéticos con los hipotéticos genes para la susceptibilidad a la
asociado con artritis reumatoide (Mu. 1999) y lupus eritematoso sistémico
enfermedad. Uno es calcular el riesgo de enfermedad entre individuos que
(Sturfelt. 1996).
transportan un alelo especifico de un sistema polimórfico. En este cálculo, el
riesgo relativo (RR) o relación de probabilidad (odds ralio) calcula el riesgo de
transportar un marcador en una población de individuos enfermos compara-
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O do con una población control. Más interesante, pero más dificil de estimar, es
CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS el riesgo de tener una enfermedad en un individuo que transporta el marca-
MARCADORES GENÉTICOS dor (Tabla 41-5, véase también Tabla 41-3).
Esta fuerza de asociación es el A de Bergston y Thomson (Svejgaard.
Polimorfismo genético 1983), que es lo mismo que la fracción etiológica (FE) (Miettinen. 1976). Si.
en una población de pacientes, individuos a transportan el carácter especifi-
El polimorfismo genético se define como la existencia en la misma pobla- co pero individuos ó no y. en la población normal (control), individuos c trans-
ción de dos o más alelos en un gen. cada uno con una frecuencia importan- portan el carácter, la información puede ser escrita convenientemente en la
te. La frecuencia se ha determinado de forma arbitraria como mayor que el tabla 2x2:
1%. Hay dos grupos de polimorfismo genético; equilibrado o estable y transi-
torio. Un polimorfismo equilibrado se produce cuando dos o más alelos se
Carácter positivo Carácter negativo
mantienen en una población por selección. La ventaja heterocigótica es el clá-
sico ejemplo de polimorfismo equilibrado. El polimorfismo transitorio repre- Paciente a b
senta una fase de cambios alélicos conducida por deriva genética o por selec- Control c d
ción. El polimorfismo de un gen puede ser estable en una población y
transitorio en otra, dependiendo del efecto de la selección. La frecuencia del carácter en esta población de pacientes (l\) es
Para determinar el polimorfismo genético es necesario encontrar una
muestra representativa de la población, valorar los individuos, contar los
genes y estimar el número de genes contenidos en la población total. Por
ejemplo, asumiendo que se ha estudiado una población de 100 individuos
para un rasgo genético particular o alelo en un determinado gen, se puede
definir la frecuencia de fenotipo como el número de individuos que transpor-
tan el rasgo o la variante genética. Para calcular la frecuencia (/) de cada ale-
lo, se suman las frecuencias de cada alelo, y luego se divide entre el número
total de alelos analizados:

f(x)+t(<i)+f{z)

Tabla 41-4 Constelación de g e n e s TNF en relación c o n haplotipos e x t e n d i d o s c o m u n e s

Complotipo HSP70 Marcadores en el locus TNF

HLA-DR C4B C4A BF C2 2 1 e d -308 -856 862 u b HLA-B HLA-Cw

3 1 0 s c 8.5 C 3 I 2 1 1 2 3 8 0701
2 1 3 9 .A 3 3 1 1 1 11 4 7 070?
s c
7 1 I c g A 3 3 1 1 1 7. 8 4 44 1601
4 c 3 s c 9 M 3 3 1 1 1 6. 7 5 44 0501
7 1 6 9 3 4 l 1 1 2 5 57 060?
s c •••

5 1 3 s c 9 A 3 3 1 1 1 S 5 35 0401
i 1. 2 2 9 A 4 1 1 2 2 1 14 080?
s c •

•; 1 2 s c 9 A 3 3 1 2 1 10 4 38 1203
•i 3 3 s c 'i A 1 4 1 1 2 2 1 62 0304
2 2 I s 0 9 A 3 3 l 2 1 10 A 18 1203
3 0 3 I1 c 8,h C 3 4 1 1 1 1 5 18 0501
hl numero de letras debajo de cada columna se refiere a una variante del alelo particular del complemento, proteína 70 del golpe de calor (HSP70). polimorfismo de
microsatélite TNF o promotor TNF-« están asociados con las especificidades HLA como se reseña Véase texto para explicación
En el caso de TNF-a -308 I y 2 representan las vanantes -307/G y 307/A. respectivamente
El alelo TNF-a -856/C se resena como 1 y el alelo -856/T como 2 El alelo 862/C TNF-a se resena como 1 y el -862/A como 2
Dalos extraídos y modificados de Clavijo OP Delgado JC. Awdeh ZL y col Tissue Antigens 1998. 54 303.
 960 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 41-5 Riesgo relativo (RR)* para alelos M H C e n varias e n f e r m e d a d e s

HLA-A HLA-B HLA-DR BF
Enfermedad Alelo RR Alelo RR Alelo RR Alelo RR
Diabetes melhtus tipo 1 A1 1.6 B8 2.5 DR3 •\:
B15 2.5 DR4 4,5
B18 2,5 BF'Fl 8
B7 0,2 DR2 0.1
Esclerosis múltiplo A3 1.8 B7 3,5 DR2 4,2
Enteropalía gluten A1 i8 B8 8,0 DR3 17,0
Hepatitis crónica activa A1 1,7 B8 3,0 DR3 2.2
Glomerulonefritis B8 2,3 DR3 4,4
membranosa idiopàtica B18 2,3 BF'Fl 16,0
Hemocromatosis A3 4.8 B7 1.9 BF'Fl 2,0
idiopatica Al 2.0 B14 4.9 DRw6 3.1
B15 3.5 DR4 2.9
. n „ pacientes con marcador controles sin marcador
H n = — x
pactonte9 sin marcador controles con marcador
. ,

De manera similar, en riesgos disminuidos, para los cuales RR es menor
de 1, se puede usar el factor de prevención (FP).
0-RRK
FP
RR (i-<v)
Las fracciones FE y FP pueden variar entre 0 (no asociación) y 1.0 (máxi-
ma asociación)
Aparte de facilitar estimaciones de tener un marcador si uno ya tiene la
enfermedad, estos cálculos ignoran el modo de determinación genética de la
enfermedad en cuestión, Esto es particularmente problemático para modos
recesivos o más complicados en los cuales ambos haplótipos son importan-
tes para determinar la enfermedad pero se da el mismo peso a los heteroci-
gotos y homocigotos para un marcador dado (esto es, ambos son positivos
para el marcador).
Análisis del modelo de herencia basado en parejas
de hermanos
El análisis de la forma de herencia basado en pareas de hermanos se
introdujo para ayudar a superar los problemas de penetrancia incompleta de
los genes de la enfermedad y las variaciones en edad al comienzo (Penrose.
1935). El método se basa en la suposición de que si el HLA y/o los genes
estrechamente ligados a HLA no influyen en el desarrollo de la enfermedad,
entonces las parejas de hermanos afectados compartirán haplótipos HLA con
una frecuencia normal: el 25% compartirán ambos haplótipos. el 50% com-
partirán uno y el 25% no compartirá ninguno. Así, se comparan distribuciones
observadas y esperadas de haplótipos compartidos. Si los genes de suscep-
tibilidad o sus marcadores estrechamente ligado son raros y totalmente pene-
trantes, en una enfermedad determinada recesivamente, la distribución de los
hermanos que comparten 2.1 y ningún haplotipo seria 100, 0. 0. respectiva-
mente. Para la determinación dominante, la relación sería 33, 66, 0. Lo que
se observa en diabetes, por ejemplo (Rubinstem. 1977), es 60, 35, 5. más
cercano a las predicciones recesivas que a las dominantes. Una vez que se
ha establecido la forma de herencia, se pueden establecer la frecuencia y la
penetrancia del gen de la enfermedad (Thomson, 1977).
Análisis del modelo de herencia basado en estudios
de población
Thomson y Bodmer (1977) han ideado un método de análisis de los datos
de la población para marcadores estrechamente ligados a locus de suscepti-
bilidad para enfermedades con penetrancia incompleta. En esencia, este
método predice la proporción de homocigotos. heterocigotos y no portadores
para el marcador ligado esperado en casos de herencia dominante o recesi-
va. La diferencia principal entre los dos modos de herencia se obtiene por la
proporción de individuos que son homocigotos para el marcador. La aplica-
ción de este método al HLA-B27 y a la espondilitis anquilosante condujo, en
terrenos estadísticos, a la desestimación de un mecanismo recesivo. Asi, se
concluyó que la susceptibilidad a la espondilitis anquilosante es heredada
como un rasgo dominante.
De forma similar, el mismo método de análisis se aplicó a la distribución
de BF'Fl entre 1.107 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (Raum. 1981).
Para la herencia dominante, se pronosticaron 1,89 homocigotos y para la
herencia recesiva 6.2. Se encontraron siete homocigotos BF'Fl. un resulta-
do consistente sólo con la herencia recesiva. Otros modos de herencia que
podrian ser desestimadas por estas observaciones incluyen la dominante
simple, epistática (enfermedad resultante de la presencia de genes no aléli-
cos) o superdominante (enfermedad con mayor penetrancia cuando dos ale-
los específicos están presentes que cuando se producen otras combinacio-
nes, incluyendo homocigosidad para cada alelo específico). Aunque un
modelo mixto con diferente penetrancia para homocigotos y heterocigotos no
podría ser excluido completamente, otras consideraciones podrían hacer
insatisfactorio a tal modelo.
Método de cálculo de probabilidades
(Lod Score Method)
Este es un método estadístico de concordancia entre un locus marcador tal
como en el MHC y un gen de susceptibilidad a una enfermedad (Sutton,
1980): (1) el valor Zes la relación de la máxima probabilidad de encontrar o
no concordancia (P¡ F,/ 0]) en un valor de recombinación particular 0; y (2) el
valor o (q) de frecuencia de recombinación, que es una medida de la distan-
cia desde un locus determinado a un valor Z máximo. El cálculo de probabili-
dades expresa la probabilidad de que alelos en dos locus se separen juntos,
en términos de la relación entre la frecuencia de recombinación observada
con la pronosticada si concuerdan independientemente. Varios valores de (q)
de 0 a 0.5 se sustituyen en la ecuación:
P(F,/e) = 1/2 [& (i -or' + e-'ii - « ) ]
Donde n = el número de niños en una familia determinada y r= el núme-
ro de recombinantes. La probabilidad de obtener un estudio genealógico
para un valor determinado de 0 (frecuencia de recombinación de 0 a 0,5) se
expresa como la relación de P (FJ 0) en una familia en una fracción 0 (de 0
a 0,5) de recombinación dada a P (F./0.5) en la misma familia, asumiendo
que ninguna recombinación pueda ser expresada como el cálculo de proba-
bilidades (Z):
z - log
P(F,/0.5)
 CAPÍTULO 41 • COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
y Z= suma de lodos los valores z. Valores de Z mayores de cero están a favor
del ligamienlo y aquellos menores o igual a cero en contra del ligamiento. En
general, un valor de Z mayor de 3 (para algunos valores de 0<0,5) significa
que las probabilidades a favor del ligamiento son 1.000 a 1 (p = 0,05) en opo-
sición al no ligamiento o independencia. Es más fácil calcular la concordancia
para rasgos codominantes (es decir. HLA y GLO) que para rasgos recesivos.
En estudios de concordancia de HLA y enfermedad, los padres pueden tener
genes de susceptibilidad impenetrantes dominantes o recesivos. Hay proble-
mas básicos para usar el método de cálculo de probabilidades para detectar
concordancias de genes parcialmente penetrantes, aparte de hermanos sus-
ceptibles impenetrantes. Si los genes de susceptibilidad son comunes, como
parece ser en el caso de la diabetes tipo 1. por ejemplo, los cruzamientos
aparentes de hermanos no idénticos podrían sugerir genes de susceptibilidad
adicionales en un padre.
RESUMEN
El MHC consta de muchos alelos en muchos locus. La tipificación de alta
resolución de los genes MHC Clase I y Clase II y la identificación de genes
entre y cerca de ellos ha incrementado la posibilidad de definir la base gené-
tica de respuestas inmunes y enfermedades de etiología desconocida como
las enfermedades autoinmunes en el hombre. La asociación no fortuita de
marcadores para respuestas inmunes o asociaciones con enfermedades
autoinmunes debido a la presencia en la población de secuencias fijadas de
ADN MHC y haplotipos extendidos y sus fragmentos complica el estudio de
genes de susceptibilidad pero también proporciona las claves para su identi-
ficación. Aun cuando el MHC humano es la región más investigada del geno-
ma, no se han identificado todos los genes expresados Además, sólo se
conoce la función de los productos de relativamente pocos de estos genes.
Es probable que ciertos genes HLA no identificados antes que algunos genes
HLA ya conocidos, sean genes de susceptibilidad para algunas enfermeda-
des del hombre asociadas a HLA.
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Trastornos ¡nmunodeficitarios
Charlotte Cunningham-Rundles, M.D., Ph.D.
INDICADORES CLÍNICOS DE INMUNODEFICIENCIA 963
EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO 964
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL 964
Historia clínica y recuento sanguíneo inicial
Inmunoglobulinas
Rayos X y tomografía computarizada
Funciones pulmonares
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL 967
Producción de anticuerpos
Subclases de IgG
Inmunidad de células T
Valoración funcional de las células T
Análisis de leucocitos polimorfonucleares
Evaluación del complemento
La resistencia a la infección es una particularidad necesaria de la salud.
Las principales barreras a las infecciones son las barreras físicas naturales,
la piel, la producción de moco en las superficies mucosas expuestas, y la
función de las células ciliadas del tracto respiratorio, intestinal y genital que
tienen tendencia a eliminar los microbios invasivos. Además de estas barre-
ras, un importante número de funciones inmunitarias ejercen una continua
vigilancia: estas funciones pueden ser no especificas no requiriendo ningu-
na sensibilización previa, y especificas, que requieren una previa exposición
para sensibilizarse (Tabla 42-1). Las funciones inmunitarias están compues-
tas por un conjunto interrelacionado de células inmunitarias y funciones
inmunitarias, siendo los principales elementos 1) los Imfocitos B produciendo
anticuerpos, 2) los linfocitos T proporcionando funciones celulares, 3) el sis-
tema (agocitario conteniendo leucocitos polimorfonucleares (PMN) y mono-
citos / macrofagos 4) el sistema complemento y 5) las células asesinas (célu-
las NK). La enfermedad por inmunodeficiencia primaria surge debido a
anormalidades de uno o más componentes de este grupo interrelacionado
de funciones. Estas enfermedades fueron originariamente consideradas
como enfermedades bastante poco frecuentes, caracterizadas como enfer-
medades graves con un comienzo clínico en los primeros años de vida. Sin
embargo, como en los últimos años se ha esclarecido el espectro de estos
defectos, está claro que estas enfermedades son mucho más comunes de lo
que originariamente se creía, y la manifestación clínica puede ser benigna.
Lo más importante es que ahora está claro que estas enfermedades pueden
ser diagnosticadas en niños mayores, en adolescentes y en adultos de todas
las edades. La incidencia general de estas enfermedades de inmunodefi-
ciencia se estima en aproximadamente 1 de cada 10.000, excluyendo la defi-
ciencia selectiva de inmunoglobulina A (Ig A). Por razones desconocidas,
mas de la mitad de los defectos inmunes descritos incluyen defectos en la
producción de anticuerpos (Fig. 42-1). La Unión Internacional de Ciencias
Inmunologías ha catalogado los defectos conocidos del sistema inmunitano.
42
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL 969
Medidas enzimáticas
Histología
Ensayos con células asesinas naturales
Análisis adicionales de leucocitos
polimorfonucleares
Citocinas y receptores de citocinas
Marcadores adicionales de superficie celular
Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA
Utilización de nuevos inmunógenos para valorar
la producción de anticuerpos
Genética molecular y diagnóstico prenatal
RESUMEN 972
BIBLIOGRAFÍA 972
que periódicamente se actualizan {Primary Inmunodeliciency Diseases.
Report of an lUIS Scientific Committee, 1999). En la Tabla 42-2 se muestra
un enfoque general de los principales síndromes inmunodeficitarios, clasifi-
cados por tipo.
INDICADORES CLÍNICOS DE INMUNODEFICIENCIA
El indicador clínico más frecuente de un defecto inmune es la aparición de
"demasiadas infecciones". Esta es la principal manifestación en los bebés y
niños con deficiencias inmunitarias y representa un reto significativo para el
pediatra, ya que las infecciones son muy comunes en la infancia normal.
Cuando las infecciones frecuentes y prolongadas se acompañan de retraso
en el desarrollo o si aparecen infecciones poco habituales, debe realizarse
una evaluación del sistema inmunitano. La confirmación de una enfermedad
inmunodeficitaria en un hermano o pariente de primer grado debería implicar
una valoración clínica cuidadosa y una investigación de laboratorio, incluso
sin antecedentes de infecciones graves o inusuales.
Aprovechando las características comunes de infección que aparecen en
las enfermedades de inmunodeficiencia primaria, se han creado un grupo de
signos de alarma para ayudar a la identificación de individuos que tienen más
probabilidad de sufrir un defecto inmune (Tabla 42-3). Quizá los indicadores
más importantes para emprender una evaluación del sistema inmunitario sur-
gen al realizar una historia inicial cuidadosa. Junto con las señales de alarma
reseñadas en la Tabla 42-3, el médico deberia preocuparse por elementos en
la historia que son inusuales, como antecedentes de enfermedad autoinmu-
ne. adenopatía significativa, la necesidad en un adulto de realizar una mirin-
gotomia. herpes zóster grave, o herpes zóster que aparece en niños peque-
ños, etc. Estas manifestaciones adicionales pueden también indicar que
deberia considerarse un defecto inmune (Tabla 42-4).
 964 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 42-1 Mecanismos de defensa del huésped
No específicos
Barreras (piel, secreciones, moco, lágrimas, saliva)
Fagocitos (neutrofilos, macrófagos)
Células asesinas naturales
Complemento
Citocmas
Específicos
Anticuerpos
Funciones de células T
Por supuesto; no es práctico investigar todos los sistemas en todos los
pacientes; sin embargo; el cuadro clínico y la edad del paciente indicarán al
examinador qué parte del sistema inmunitario es con más probabilidad el
causante. Por regla general, la elaboración de una historia cuidadosa y el
examen físico completo puede reducir las posibilidades de problemas que
implican principalmente a células T. células B, granulocitos o el sistema com-
plemento. La Tabla 42-5 enumera los síntomas y signos clínicos y sus corre-
laciones con los elementos de defensa del huésped. En muchos casos el tipo
concreto de ínfección(es) que el paciente ha padecido puede proporcionar un
indicador útil sobre el defecto inmunitario más probable (Fig. 42-2). Si predo-
minan las infecciones por bacterias encapsuladas, se debería investigar la
célula B, el sistema de complemento o los sistemas fagocíticos: si hay predo-
minio de infecciones fúngicas o víricas, puede estar defectuoso el sistema de
las células T. Las infecciones recurrentes por Neisseria deberían alertar al
médico sobre la posibilidad de una deficiencia genética de uno de los com-
ponentes del complemento. Las infecciones recurrentes por Candida, inclu-
yendo las aftas orales, no suelen ser un problema alarmante si se han utili-
zado con frecuencia antibióticos. Sin embargo, la candidiasis oral adquiere
una mayor importancia cuando es resistente a una terapia local sencilla y
cuando persiste después de seis meses de edad. Las aftas orales no se con-
sideran igual que la candidiasis mucocutánea, una enfermedad caracterizada
por diseminación de la infección desde las membranas mucosas a la piel con-
tigua incluyendo generalmente las uñas de los dedos. Estas lesiones cutáne-
as pueden presentarse de forma granulomatosa. La candidiasis mucocutánea
siempre es anormal. También es importante observar las circunstancias clíni-
cas y no fijarse exclusivamente en el número o la gravedad de los episodios
infecciosos. Por ejemplo, cuando un proceso infeccioso afecta a la misma
zona anatómica repetidamente, es más probable que la etiología sea estruc-
tural y no un defecto de una de las defensas del huésped. La osteomielitis cró-
nica en una localización, o episodios recurrentes de neumonía que afectan
sólo a un lóbulo pulmonar, o infecciones recurrentes de una herida quirúrgica
son ejemplos de estas situaciones. Por razones desconocidas, las infecciones
recurrentes del tracto urinario no son características de deficiencia inmunita-
ria; el sistema inmune parece jugar un pequeño papel, si es que juega algu-
no, en la prevención de pielonefritis y cistitis.
EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO
Basados en las consideraciones previas, cuando se sospecha un defecto
inmunitario hay que hacerse estas preguntas: qué parte del sistema inmuni-
tario debería investigarse, qué pruebas se necesitan y hasta dónde deberían
llevarse estas investigaciones. La evaluación del sistema inmune se lleva a
cabo mejor por etapas, realizando primero las pruebas de delección básicas,
hasta llegar a las pruebas más complejas, según el caso. En la Tabla 42-6 se
ofrece una visión general de este abordaje por etapas.
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL
Historia clínica y recuento sanguíneo inicial
Aparte de realizar una historia inicial y exploración física, incluyendo medi-
ción de la altura y peso, la primera prueba inmune es el hemograma comple-
to (CBC). Un recuento de glóbulos blancos (WBC) y diferencial proporciona-
rá información sobre la morfología y número de linfocitos pequeños
(diámetro<10um). Se espera que haya más de 1.200 linfocitos por milímetro
cúbico. Puesto que menos (-10%) de los linfocitos son linfocitos B, una defi-
ciencia absoluta de linfocitos indica sobre todo deficiencia de células T. Parte
de la primera visita debe también incluir la obtención de todos los expedien-
tes médicos anteriores, incluyendo informes patológicos o diapositivas, y
resultados de cultivos previos y radiografías.
Inmunoglobulinas
Como las enfermedades por deficiencia de anticuerpos son más comunes
que otros defectos inmunes, se debe empezar investigando las inmunoglobu-
linas y producción de anticuerpos (Stiehm, 1996). Los análisis cuantitativos de
inmunoglobulinas se encuentran disponibles en todos los laboratorios comer-
ciales y hospitalarios, y para realizarse necesitan de muy poco suero (véanse
Capítulos 13 y 35). Como los valores de inmunoglobulinas aumentan con la
edad, es necesario para la correcta interpretación que se compare con con-
troles de edad (véase Tabla 37-7). Durante los primeros meses, la IgG de ori-
gen materno es la principal inmunoglobulina presente en el suero del niño. El
punto más bajo se ve aproximadamente a los tres meses. Sin embargo el niño
puede sintetizar IgA e IgM: asi. la presencia de estas dos inmunoglobulinas
(partícularmenle la IgM, que se sintetiza antes que la IgA) es una evidencia
Figura 42-1. Clasificando los defectos inmunes de una
amplia población de pacientes remitidos para análisis
inmunológicos y tratamiento, casi un 50% de todos ellos
presentaban defectos en la producción de anticuerpos,
incluyendo mmunodeficiencia variable común, deficiencia
selectiva de IgA, deficiencia de la subclase IgG, nipo-
gammaglobulinemia transiloria del niño y agammaglobu-
linemia ligada al cromosoma X. Dalos tomados del Mount
Sinai Medical Center, Immunodeficiency Clinic.

Tabla 42-2 Clasificación d e las inmunodeficiencias primarias'
Enfermedad
Deficiencia combinada de células B y
células T
Disgenesia relicular
Inmunodeficiencia severa combinada
(IDSC)
Síndrome hiper IgM
Ataxia-telangiectasia
Timoma
Síndrome Wiskott-Aldrich
Deficiencia primaria de célula T
Anomalia de DiGeorge
Síndrome de Nezelof
Deficiencia de inosina fosforilasa (PNP)
Ausencia de expresión de CD3
Candidiasis mucocutánea crónica
Deficiencia primaria de células B
Agammaglobulinemia congenita ligada
al sexo (Bruton)
Defecto de p-cadena, cadena sustituida
lig. etc.
Hipogammagiobulinemia transitoria
de infancia
Síndrome hiper IgM
Deficiencia selectiva de IgA
Deficiencia selectiva de IgM
Inmunodelicioncia común variable
Deficiencia do subclase de IgG
Defectos de complemento
Deficiencia de complemento
Defectos estructurales
Dismotilidad de cilios
Defectos de origen desconocido
Síndrome hiper IgE
Candidiasis mucocutánea crónica
Otros defectos
Deficiencia molecular de adhesión a la célula
(LFA-1/Mac-1)
• Para mSs delates vGase el articulo IUIS Primary Inmunodeliciency Diseases Report of an IUIS Scientific Committee. Clin Exp Immunol 1999: 17 311-321. con perrraso
convincente de que no existe panhipogammaglobulinemia. La panhipogam- dades significativas hasta la edad de seis meses; si embargo, después de la
maglobulinemia es la forma habitual de presentación de la agammaglobulme- edad de un año. un nivel de IgA de 10 mg/dl o menos indica que la deficien-
mia ligada al cromosoma X. La IgA habitualmente no se encuentra en canti- cía de Ig A será un defecto permanente (Plebani. 1986). En el sindrome hiper-
CAPÍTULO 42 • TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS 965
Comentarios
Hipoplasia hematopoyetica generalizada
Incluye: (1) La ligada al cromosoma X debido a un defecto en la cadena del receptor IL-2. (2)
herencia autosómica recesiva de naturaleza desconocida: (3) causada por deficiencia
de adenosma deammasa (ADA); (4) causada por enzima recombinasa (RAG 1.2) delecluosa,
(5) Síndrome de Omenn, en muchos casos debido a la mutación en el enzima RAG: (6)
asociada con defectos óseos (hipoplasia cartilago-pelo. enanismo de miembros cortos); (7)
síndrome del linfocito desnudo, baja expresión de la histocompalibilidad de los antigenos
HLA clase II; (8) causada por un defecto en la cinasa JAK; (9) causada por un defecto en
el receptor IL-7. (10) causada por un delecto en el enzima ZAP-70 de las células T
IgM normal-elevada; defecto en la expresión de gp 39. un ligando de las células T para CD40. el
receptor de células B responsable del cambio del isotipo; neumonía por Pneumocystis, a
menudo coiangitis asociada con neutropenia cíclica, alta incidencia de esclerosis, normalmente
no se ve en las enfermedades de las células B frecuente
Deficiencia común de IgE lgG2 y/o IgA: alta incidencia de malignidad linforrelicular defecto
de la reparación del cromosoma
Detecto en células T variable; hipogammagiobulinemia en algunos
Trombocitopenia (plaquetas pequeñas); no respuesta a anticuerpos de carbohidratos: eczema:
herencia ligada al cromosoma x alta incidencia de malignidad linforeticular, células CD43+
no detectadas
Facies características: lesiones cardíacas (lo más tipico arco aórtico interrumpido); hipoparatiroidismo;
la deficiencia en células T puede ser lo suficientemente grave como para ir asociada con
deficiencia de anticuerpos, el defecto inmune por lo general mejora espontáneamente: el limo
está ausente en su forma completa, casi siempre fracaso del declive normal
Se produce inmunoglobulina, pero la respuesta al anticuerpo específico está marcadamente
deteriorada; delecto timico no caracterizado
A menudo asociado con aplasia de glóbulos rojos primaria
Las células T presentan pero no expresan CD3, necesario para la función del receplor de las
células T
Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo
u otras endoermopatias. con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos
Ausencia de células B
Clínicamente se presenta en el primer año de vida, varones para la forma ligada al cromosoma X
y varones y hembras para las otras
Aparece a los 2-4 meses de edad: dificultad para diferenciarlo del nadir normal de IgG que se
produce durante ese periodo
IgM normal-elevada; defecto en la expresión de gp 39. un ligando de las células T para CD40, el
receptor de células B responsable de la mutación del isotipo; la neumonía por PiieumcKystis,
no observada normalmente en las enfermedades de células B. es frecuente: a menudo asociada
con neutropenia cíclica
lgA<10mg/dl: IgG normal a aumentada; alrededor del 12% con deficiencia de lgG2. deficiencia
selectiva de IgA; la deficiencia más común (1/500 de los caucásicos): asociado con herencia
de antigenos de histocompatibilidad
Bastante rara asociada a infecciones por Neisseha
Importante defecto de anticuerpos células B presentes: puede presentarse deficiencia de células
T y aumentar con el tiempo
Dobido a la supresión de los genes de las cadenas pesadas do IgG. o producción deficiente de
isolipos de IgG seleccionados; asintomálica o asociada con infecciones, si la producción
de anticuerpos esta deteriorada
Puede imitar síndromes de deficiencia de anticuerpos: deficiencias de C3 clínicamente similares
a panhipogammaglobulinemia; deficiencias de componentes de complemento, particularmente
C6-C9, tienen inlecciones recurrentes con especies de Neissena
Imita a los síndromes de de encía de anticuerpos; otitis recurrentes e infecciones pulmonares
crónicas con bronquéela característica
Sindrome de Job-Buckley (hiper-lgE); abscesos en piel y órganos, anormalidades óseas.
anormalidades dentales
Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo
u otras endocrinopalías, con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos
Imita algo a los síndromes de deficiencias de anticuerpos: separación retrasada del cordón
umbilical: respuesta inflamatoria pobre periodontitis. episodios sépticos recurrentes
 966 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 42-3 Diez signos de alerta d e inmunodeficiencia*
Dos o más episodios de neumonía
Pérdida inexplicable de peso en adultos, fallo en el desarrollo
en lactantes
Abscesos recurrentes en órganos profundos o piel
Uno o más episodios de infecciones senas tales como meningitis.
sepsis, celulitis u osteomielitis
Historia familiar de deficiencia inmunitaria
Infecciones recurrentes de oídos, necesidad de sondas en adultos
Candidiasis orales o cutáneas después de la edad de un año
Dos o más meses con antibióticos orales con poco efecto
Necesidad de antibióticos intravenosos para curar infecciones
Dos o más infecciones de sinus en un año
'Dos o mas pueden indicar inmunodeficiencia.
inmunoglobulina M. se han visto niveles normales o elevados de IgM con
ausencia de IgA (Ramesh, 1998; Levy 1997). En general, las desviaciones de
otros ¡sotipos de inmunoglobulinas no se diagnostican como síndromes espe-
cíficos. Sin embargo, los aumentos marcados de IgE forman casi siempre par-
te del síndrome de hiperinmunoglobulina E (Buckley, 1978), son comunes en
el síndrome de Wiskott-Aldrich, algunas deficiencias de células T aisladas y
se pueden encontrar en enfermedades crónicas granulomatosas. El síndrome
de Wiskott-Aldrich característicamente muestra también un marcado aumen-
to de IgA en suero con bajo IgM (Ochs, 1998).
Radiografías y tomografía computarizada
Las radiografías y la tomografía computarizada (TC) y los estudios de reso-
nancia magnética (RM) también pueden ser útiles para valorar las deficien-
cias inmunitarias. La neumonía crónica intersticial es frecuente en bebés,
niños o adultos con deficiencias en células T, y debería confirmarse con radio-
grafías de tórax. Con el tiempo, muchos pacientes con deficiencia primaria de
células B (agammaglobulinemia, inmunodeficiencia variable común) pueden
desarrollar fibrosis pulmonar crónica o bronquiectasias (Sweínberg, 1991;
Cunningham-Rundles, 1999). La tomografía computarizada de tórax en un
paciente que presenta infecciones recurrentes del tracto respiratorio es la
mejor prueba para investigar una bronquiectasias; si estos cambios se han
desarrollado, se necesita seguir investigando.
Antes se realizaban proyecciones laterales del cuello para objetivar el teji-
do linfoide faríngeo en niños. Sin embargo, no se recomiendan las radiografí-
as para la evaluación de tejido linfoide cervical porque la información que
éstas proporcionan se obtiene más fácilmente por otros métodos alternativos.
Las proyecciones anteriores del tórax pueden revelar una ausencia de la som-
bra timica en niños pequeños, pero como el timo puede disminuir fácilmente
debido al estrés, la evaluación del tamaño del timo por este método no es
fidedigna. Las anormalidades óseas, sin embargo, pueden alertar al radiólo-
go de un problema inmunológico presente en la infancia. Un subgrupo de
pacientes con inmunodeficiencias que implican anormalidades de células T o
B y T, sufren enanismo de extremidades cortas. Estos pacientes muestran
lesiones características, generalmente en las regiones metafisarias de los
huesos largos. Los pacientes con deficiencia de adenosina deaminasa mues-
tran biselado de los extremos costales, cuadratura de los omóplatos y articu-
laciones inusuales de las apófisis transversales costales (Cederbaum, 1976).
Tabla 42-4 Hallazgos clínicos q u e sugieren u n a
inmunodeficiencia de defecto o localización inciertos
Defectos en el desarrollo
Eczema intratable
Dermatitis seborreica generalizada (inmunodeficiencia grave
combinada)
Adenopatia, esplenomegalia
Colitis ulcerosa manifestada antes del primer año de vida
Diarrea intratable
Enfermedad autoinmune (son habituales PTI o anemia hemolitica)
Deficiencia hematológica inexplicable (de cualquier serie: eritrocitos,
neutrólilos, plaquetas)
PTI = púrpura trombocitopenica inmune.
Tabla 42-5 Síntomas clínicos d e deficiencia correlacionados
c o n el tipo de defecto
Se piensa en una deficiencia de células T cuando
1. Vacunas de virus vivos o bacterias atenuadas producen
enfermedades sistémicas o resultados inesperados
(p ej., viruela generalizada, neumonía de células gigantes
con rubéola, infección generalizada por Mycobacterium)
2. Un virus habitualmenie benigno ocasiona una infección
contundente (a menudo neumonía) como varicela o
citomegalovirus.
3. Candida oral no responde a la quimioterapia, no va asociada a la
dermatitis de pañal o anlibioterapia excesiva, o persiste después de
seis meses de evolución.
4. Candida está presente en superficies mucosas y se traslada a
áreas cutáneas contiguas a modo de candidiasis mucocutánea.
5 El paciente sufre enanismo de miembros cortos (El pelo puede
ser muy fino y tejidos laxos con hiperexlensibilidad de
articulaciones y gran hernia umbilical)
6. Hay signos de enfermedad intrauterina de injerto contra
huésped (p. ej. descamación, eritrodermia, alopecia, defectos
en el desarrollo).
7. Enfermedad de injerto contra huésped se produce tras la
infusión de un hemoderivado
8. Se produce tetania neonatal. (Buscar mandíbula hipoplásica.
surco nasolabial corto, orejas de implantación baja con el
pabellón corto, hipertelonsmo de anomalía de DiGeorge.)
9. Lintocitos pequeños (< 10 en diámetro) con recuento
3
permanentemente menor de 1 200/mm .
10. Infecciones debidas a organismos oportunistas o se produce
un sarcoma de Kaposi generalizado Buscar factores de riesgo
asociados con sida.
Se piensa en una deficiencia de células B cuando
1. Infecciones recurrentes con piógenos exlracelulares,
Streptococcus, Staphylococcus. Haemophilus.
2. Hiperplasia linfoide nodular de intestino es persistente
3 Infección intestinal por Giardia
j Se piensa en un defecto combinado de células T y B cuando
1 Hay signos del síndrome de Wiskot-Aldnch (supuración de oídos,
trombocitopenia, diarrea sanguinolenta, eczema en el varón).
2 Hay signos de ataxia-telangiectasia (La ataxia es el principal
signo de la enfermedad, especialmente cuando el niño crece
Una característica predominante es la telangiectasia de la
esclerótica y los oídos. La expresión facial es triste.)
3 Los síntomas antes mencionados de las enfermedades de
células T y B se producen juntos.
Se piensa en un defecto bioquímico cuando
1. Hay síntomas de defectos combinados T y B con cambios
característicos en las radiografías en costillas, omoplatos,
vértebras (deficiencia de adenosina deaminasa).
2. Hay aplasia medular primaria de glóbulos rojos y otros sintomas
del síndrome Blackfan-Diamond (deficiencia de nucleósido-
fosforilasa).
Se piensa en un defecto de leucocitos cuando
1. Hay abscesos estalilocócicos de piel recurrentes y graves; se
pueden observar abscesos prolundos de órganos internos,
pero menos habitualmente (síndrome hiperlgE o síndrome de
Buckley-Job). Más adelante aparecen abscesos en pulmón en
casi todos los pacientes con síndrome hiperlgE
2. Osteomielitis crónica o recurrente, nodulos linfáticos que
supuran, particularmente cuando son causados por especies
de Klebsiella o Serraba (enfermedad crónica granulomatosa).
Se piensa en una inmunodeficiencia secundaria cuando
1 Hay una infección viral concomitante o anterior (especialmente
virus de Epstein-Barr. VIH). La infección viral puede producirse en
el útero y producir una enfermedad inmunodeficitaria en el feto.
2. El paciente tiene determinadas enfermedades malignas
(p. ej.. leucemia linlocítica crónica, enfermedad de Hodgking.
mieloma múltiple).
3 Se produce acidosis, alopecia y convulsiones con candidiasis
mucocutánea crónica (deficiencia de botina) Deficiencias de
biolina, zinc y selenio pueden producirse en pacientes con
prolongada hiperalimentación.
4. El paciente está recibiendo inmunosupresores.
5. El paciente tiene una historia consecuente con posible
exposición a VIH.
6. El paciente tiene los sintomas clínicos de acrodermatitis
enteropática (deficiencia de zinc puede también ocurrir con
hiperalimentación prolongada).
I VIH = Virus de inmunodeficiencia humana
 CAPITULO 42 • TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
Figura 42-2. El espectro de agentes infecciosos encontrado puede indicar el sis-
tema mmunitario donde se encuentra el potencial detecto.
Pueden aparecer anormalidades óseas en pacientes con el síndrome de hi-
perinmunoglobulina IgE: estas anormalidades incluyen osteoporosis generali-
zada, fracturas ante un mínimo traumatismo, craniosinostosis y defectos en
huesos de la línea media (Grimbacher, 1999).
Funciones pulmonares
La inmunodeficiencia. especialmente si ha persistido durante algún tiempo,
a menudo afecta a las funciones pulmonares, a todos los volúmenes pulmo-
nares, debiendo evaluarse los volúmenes espiratorios forzados, incluso si la
radiografía de tórax es normal. Los pacientes con defectos de células B y T son
propensos a infecciones pulmonares, que terminan en broncoespasmo, enfer-
medad restrictiva u obstructiva, o combinaciones de estas anormalidades.
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL
Producción de anticuerpos
Para reconocer el significado clínico de los niveles algo reducidos de mmu-
noglobulina en suero, se miden las respuestas especificas de los anticuerpos
a antígenos previamente administrados o que ya existen. Si el niño o el adul-
to recibieron previamente las inmunizaciones habituales, pueden cuantificarse
los títulos de anticuerpos para los antígenos de esas vacunas. Si el niño no ha
sido inmunizado o para los adultos donde ha transcurrido más tiempo desde la
vacunación, se debe producir una respuesta tras la administración de la vacu-
na de recuerdo (Moen, 1986)). Las mejores respuestas a vacunas suceden
con el tétanos, difteria, haemophilus y neumococos; muchos laboratorios
comerciales han desarrollado pruebas de sensibilidad que pueden utilizarse
para calcular la producción de anticuerpos. Lo que no está tan claro es cómo
interpretar cada respuesta; en general un aumento de dos a tres veces o más
por encima de los niveles de referencia, y la existencia de niveles protectores
de anticuerpos, significa una adecuada respuesta a estas vacunas. Es impor-
tante recalcar que no deben administrarse vacunas de virus vivos a los niños,
o a cualquier miembro de la lamilia si se cuestiona el estado inmunológico. Las
vacunas del sarampión, paperas, rubéola, polio, bacilo de Calmette-Guerin
(BCG) y varicela no pueden ser usadas en esta población. Si el paciente no
tiene el grupo sanguíneo AB, se pueden determinar los niveles de las isohe-
maglutininas A o B que convengan (Parker, 1997). Sin embargo, debido a la
relativa inmadurez, o quizá a la inadecuada exposición a edades menores de
dos o tres años, las isohemaglutininas pueden ser negativas o de títulos baios
en niños pequeños, incluso en aquellos que tienen la inmunidad normal.
967
Subclases de IgG
La IgG consta de cuatro subclases, de la IgGl a la lgG4. que se distin-
guen por diferencias tanto estructurales como biológicas (véase Tabla 30-4
y Tabla 42-7) (Normansell, 1987; Schur, 1987). Aunque no se ha establecido
el papel individual de cada una de las subclases de la IgG para diferenciarse
del resto, los anticuerpos a los antigenos de los carbohidratos se concentran
en la subclase lgG2, y muchos antígenos de las paredes de las células bacte-
rianas tienen naturaleza de carbohidrato (Scott, 1988). Asi. la ausencia de res-
puesta a lgG2 podría traducirse en un defecto para desarrollar protección (ren-
te a infecciones bacterianas. Esta relación es más convincente en el paciente
ocasional con deficiencia de IgA que también tiene deficiencia de la subclase
lgG2 y que no responde con anticuerpos ante una vacuna como la del neu-
mococo. En aquellos pacientes con deficiencia de IgA e lgG2, las pruebas de
función pulmonar pueden ser significativamente anormales comparadas con
aquellos sólo con deficiencia de IgA (Bjorkander, 1985). Una deficiencia en la
subclase IgG también se ha señalado como causa de infecciones recurrentes
en pacientes con niveles normales o casi normales de IgG (Oxelius. 1979:
Shackelford. 1990: Wedgwood, 1986: Gross, 1992; Popa. 1994).
A pesar de estos indicadores, la importancia biológica de la deficiencia de
la subclase IgG no está clara. De hecho, algunos individuos que carecen total-
mente de genes para lgG2 IgA e IgE. están sanos (Lefranc. 1982: Migone,
1984). Además, los anticuerpos anticarbohidrato lgG2 no son la única fuente
de protección de anticuerpos para estos antigenos. En realidad, una deficien-
cia significativa de anticuerpos, limitada a reacciones frente a antigenos de
carbohidratos, o más defectos globales, se pueden encontrar en niños o adul-
tos con niveles normales de inmunoglobulina total en suero (Ambrosmo.
1988). La IgGl es el primer tipo de subclase de respuesta frente a antígenos
de carbohidratos, produciéndose una conversión a respuesta lgG2 a medida
Tabla 42-6 Niveles de pruebas inmunológicas
Nivel* Medida
Primer nivel Historia y exploración física
CBC y diferencial
Número de linfocitos (mortologia de linfocitos)
Niveles cuantitativos do inmunoglobulina
Radiografías
Cultivos
Funciones pulmonares
| Segundo nivel Respuestas a anticuerpos específicos
Análisis de subclase IgG
Prueba de complemento
Pruebas cutáneas de hipersensibihdad retardada
Análisis de marcadores de superficie de linfocitos
Estudios de proliferación de células mononucleares
(usando células mitogémeas. alogénicas y
estimulación de antigenos)
Reducción de neutrófilos con tinción (equivalente
al citómetro de flujo NBT)
Tercer nivel Medidas de enzimas (adenosina deaminasa. PNP")
Estudios de citotoxicidad de células NK
Estudios de fagocitos (movilidad, glucoproteinas
de superficie, bioquímica)
Análisis de estructura e inmunohistológico de
órganos linfoides
Producción de citocínas
Estudios complejos de complemento; defectos
genéticos
Nuevos antigenos a pruebas de producción de
anticuerpos
Biología molecular, delección de portadores.
diagnostico prenatal
" El nivel de medida se refiere a la localización clínica en la que se realiza y se
interpreta la prueba Las pruebas de primer nivel se obtienen fácilmente en
hospitales locales o en laboratorios comerciales El médico de primaria dobe
ser capaz de interpretar estos valores. Las pruebas de segundo nivel se reali-
zan si las condiciones clínicas lo justifican y algunas pueden necesilar médicos
con formación especializada para determinados análisis Las pruebas de tercer
nivel se realizan e interpretan en centros con un interés aelrvo de investigación
en el tema.
CBC • recuento completo de sangre NBT = nilroazul de tetrazolium; PNP =
purina nucleósido fosforilasa; NK = células asesinas naluraies
 968 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

, —__ . . ,
Tabla 42-7 Propiedades d e las inmunoglobulinas h u m a n a s
IgM IgG IgA IgD
A. Fisiológicas
Concentración normal en adultos, mg/ml 1.2-4,0 8.0-16.0 0,4-2.2 0,03 17-450 ng/ml
Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <10O
Porcentaje total de inmunoglobulina 13 80 6 1 0.002
Distribución intravascular, porcentaje 41 48 76 75 51
Ritmo de síntesis, mg/kg/dia 2,2 35 24 0,4 0.003
Ritmo de catabolismo en suero, 10.6 6 24 37 90
porcentaje/dia (o semivida. día) (5-6) (18-23) (5-6,5) (2.8) (2.3)
B. Biológicas
Capacidad de aglulinación +4 ± i ;

Capacidad de fijación de complemento por la ruta clásica +4 +

Hipersensibilidad homologa anafiláctica — — +4
— —
Anafilaxis heteróloga de cobaya +
±
—
Fijación a mastocitos y basófilos homólogos
Unión citofílica a macrótagos
— +4
+
Transporte placentario al feto — +
— —
Actividad de fijación al factor reumatoide
Presente en secreciones externas ±
+
+4
— +2
+
Otras propiedades características:
IgM Producida rápidamente en respuesta inmune, primera defensa electiva contra la bacteriemia
IgG: Combate microorganismos y toxinas en fluidos extravasculares
IgA Deliende las superficies externas del cuerpo
IgD- Presente en superficie de linfocitos o células inmunocompetent.es, importante para la activación y/o mmunorregulación de células B
i — — _ .—J

que el individuo madura (Scott, 1988). No hay evidencia de que los que se
limiten sólo a respuestas IgG 1 tengan ninguna desventaja. Es obligatorio
determinar la importancia biológica de una deficiencia en la subclase IgG, pro-
bando con una producción específica de anticuerpos, generalmente median-
te la administración de vacunas como tétanos, difteria, haemophilus y neu-
mococo. Solamente se debería considerar que tienen un defecto de
inmunidad significativo aquellos sujetos con una deficiencia clara de anticuer-
pos a un número de antígenos.
Inmunidad de células T
El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha permitido la rápida enume-
ración de células T y subgrupos de células T, usando sólo una pequeña can-
tidad de sangre. Estos marcadores de anticuerpos se han clasificado, con la
designación "CD". para "antígenos de diferenciación"("c/usfer ol differentia-
tion"). lo que quiere decir que un grupo de anticuerpos monoclonales identifi-
ca una proteína característica determinada de un subgrupo de células mono-
nucleares seleccionadas. La designación CD subdivide a las células T (como
un grupo, CD3-*-) en dos principales subgrupos, CD4+, algunas veces llama-
das células "colaboradoras", células involucradas en el inicio de las reaccio-
nes inmunes, secreción de citocinas y aumento de respuestas de células B, y
células T CD8+. asociadas con funciones citolilicas (asesinas). Aunque estas
actividades funcionales definen alguna de las actividades inmunológicas de
las células T CD4+ y CD8+. ambas moléculas sirven como moléculas señali-
zadoras, que funcionan en unión con las principales clases I y II de histo-
compatibilidad de antigenos (MHC), y sirven para ampliar y estabilizar la
unión del receptor de la célula T (TCR) con el antígeno. Las enfermedades
con inmunodeficiencia que derivan de la generación defectuosa de células T
pueden dar lugar a un número bajo o nulo de células T CD3+, produciendo un
bajo número de células CD4+ y CD8+, o un número reducido de células CD4+
o CD8+. El síndrome de DiGeorge, por ejemplo, provoca un número bajo de
células CD3+ en general (Hong, 1998); una deficiencia de la clase II MHC
provoca un número bajo de células CD4+ (Klein,1993); y una anormalidad de
la célula iniciadora, Zap-70. esencial a la actividad del receptor de las células
T, provoca un número reducido de células T CD8+ (Eider. 1998). En general,
si se sospecha un defecto inmunitario, se examina este panel de marcadores
de células T y se determina el número absoluto de células en cada grupo,
comparándolo con los controles normales de edad similar establecidos por el
laboratorio.
Valoración funcional de las células T
Las pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada se utilizan habitual-
mente como medidas de función de las células T. porque miden la capacidad
de reconocer y de presentar el antigeno, movilizar las células T y generar una
respuesta específica inflamatoria. Ya sean los números de células T norma-
les, bajos o nulos, se debe comprobar la función de las células T si existe
cualquier sospecha de existencia de un defecto celular de esta naturaleza.
Sin embargo, el principal inconveniente cuando se realizan pruebas cutáneas
en lactantes es que no han tenido suficiente exposición para responder a los
antígenos (Kniker, 1985). Asi, en el momento en que la valoración de las célu-
las T es particularmente importante, estas pruebas son inservibles. Entre los
tres y los cinco años de edad, las pruebas cutáneas adquieren más fiabilidad.
Otro problema con las pruebas cutáneas es que el antígeno debe ser inyec-
tado intradérmicamente con cuidado.
Una idea más definitiva sobre la capacidad funcional de las células T se
puede obtener mediante valoraciones funcionales. Junto con las pruebas
cutáneas utilizadas como métodos de detección, para valorar la función de las
células T se emplea habitualmente una respuesta proliferativa in vilro. Se
emplean generalmente tres tipos diferentes de estimulo: mitógenos. antíge-
nos y menos habitualmente, aloantígenos. Los mitógenos son inespecificos
(generalmente extractos de plantas), y estimulan linfocitos T tanto CD4+
como CD8+ independientemente de la especificidad de los antígenos. Los
aloantígenos (antígenos presentes en las células que controlan el rechazo en
los trasplantes de órganos o tejidos) también estimulan las células CD4+ y
CD8+ de una forma relativamente inespecífica; en la práclica se pueden usar
células mononucleares irradiadas de un individuo sin parentesco. Las res-
puestas proliferativas a estos estimuladores indican la presencia de células T,
pero una respuesta no garantiza la capacidad de eliminar los agentes infec-
ciosos del huésped. Los pacientes con deficiencias significativas de células T
pueden presentar alguna respuesta mitógena o aloantígena. La prueba mejor
relacionada con la capacidad a resistir infecciones es la de las respuestas
proliferativas a antígenos específicos (Lañe, 1985). En el caso de antigenos
específicos se usa habitualmente tétanos, difteria y candida. Se requiere una
exposición suficiente al antígeno para una respuesta positiva; por consi-
guiente la proliferación ante estímulos antigénicos es poco habitual en niños
durante el primer año de vida. Otra medida de respuestas específicas de célu-
las T, que puede incluso utilizarse en lactantes, es cultivar células mononu-
cleares de sangre periférica con concentraciones mitogénicas del anticuerpo
 CAPÍTULO 42 • TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
monoclonal anti CD3; este estimulador normalmente produce la proliferación
de lodas las células T CD3+, mientras que la ausencia de proliferación
demuestra un grave defecto de células T (Hong, 1996).
Análisis de leucocitos polimorfonucleares
La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es la principal enfermedad
de leucocitos polimorfonucleares. Sus principales manifestaciones son ade-
nopatia, neumonía, abscesos en el hígado o los nodulos linfáticos, y osteo-
mielitis; la forma de herencia es ligada al sexo (la más habitual) o recesiva
autosómica (debido a mutaciones que afectan a las posiciones de los cromo-
somas 16p24,7q11.23 o 1 q25). El principal defecto es el error metabólico que
provoca el fracaso de la reacción metabólica que sigue a la ingestión fagocí-
tica de las bacterias (Meischl. 1998). En consecuencia, no se reduce el oxi-
geno molecular a superóxido. No se produce el radical hidroxilo y el peróxido
de hidrógeno y se pierde un importante mecanismo intracelular de eliminación
bacteriana (Babior, 1978). Este defecto se compensa parcialmente por orga-
nismos que producen peróxido de hidrógeno en el interior de las células. En
la enfermedad crónica granulomatosa, los organismos productores de catala-
sa, que destruyen el peróxido de hidrógeno citoplásmico. sobreviven a la
ingestión intracelular, se multiplican y causan una respuesta de tejido granu-
lomatoso. El Staphylococcus aureus es el microorganismo involucrado más
habitual. Las infecciones crónicas con Serratia, especies de Klebsiella, Pseu-
domonas (ahora Burkholderia) cepacia, y especies de Aspergitlus son parti-
cularmente molestas (Gallin. 1983. 1990).
Ante una historia sugestiva, se debería considerar en la primera consulta
este diagnóstico. La prueba llamada la prueba del nitroazul de tetrazolium
(NBT) es el método clásico de laboratorio para detectar la EGC (Park, 1968),
pero ha sido sustituida en muchos laboratorios por un equivalente de citome-
tria de flujo (0' Gorman, 1995) que se adapta mejor al estudio de muestras
clínicas. Otra prueba de detección de la EGC es la medida de luminiscencia
y producción de superóxido (Gallin, 1983, 1990) pero estas pruebas no se
realizan en la mayoría de los laboratorios. La característica biológica tunda-
mental del leucocito en la EGC es que fagocítará a las bacterias normalmen-
te, pero no las destruirá. Este comportamiento constituye la base de un ensa-
yo de muerte de bacterias para EGC
El síndrome de hiperinmunoglobulina IgE (Buckley, 1978) es de alguna for-
ma fenotípicamente similar a la EGC, con abscesos recurrentes de piel y pul-
monares, pero incluyendo también anormalidades óseas, facies anormales y
candidiasis cutáneas: sin embargo, la función defectuosa de los PMN no es
un rasgo claro de esta enfermedad (Buckley, 1978). El defecto inmunitario en
el síndrome de hiperlgE todavía no está muy definido y es difícil la clasifica-
ción o asignación de una causa inmunológica o molecular. En una situación
de abscesos cutáneos recurrentes y profundos, que generalmente requieren
incisiones para su control, debería considerarse el síndrome de hiperlgE. El
diagnóstico se sugiere por la manifestación de niveles de IgE superiores a
2.000 Ul/ml (pero tan elevados como 20.000 a 60.000 Ul/ml) con las mani-
festaciones clínicas correspondientes (Grimbacker, 1999). Todavía no están
disponibles pruebas diagnósticas o de confirmación; ésta es una enfermedad
reconocida por un fenotipo clínico, aunque se ha identificado una posible loca-
lización cromosómica (Grimbacher, 1999).
Evaluación del complemento
Se han descrito un número de defectos congénitos del sistema comple-
mento: defectos individuales que conducen a 1) síndromes clínicos claros
como angioedema hereditario o la hemoglobinuria paroxistica nocturna, o a 2)
una tendencia a enfermedades bacterianas recurrentes, o a (3) enfermedades
autoinmunes (Schneider, 1999). Muchas de las deficiencias genéticamente
determinadas de la via de activación clásica (C1, C2, C3, C4) y de los com-
ponentes terminales (C5, C6, C7, C8 y C9) pueden detectarse mediante
hematíes de oveja sensibilizados con anticuerpos en un ensayo completo del
complemento hemolítico (CH50). Este ensayo requiere de la integridad fun-
cional de C1 hasta C9. Muchos laboratorios comerciales realizan este ensayo,
pero para realizar la prueba con exactitud es necesario el suero recién extra-
ído o que el plasma esté congelado. Lo menos habitual son las deficiencias de
los factores D, H, e I y properdina componentes de la vía alterna, que pueden
detectarse por un ensayo hemolítico distinto que utiliza hematíes no sensibili-
969
zados de conejo; estas células son potentes activadores de la via alterna. Si
alguno de los ensayos es anormal, la identificación del componente individual
que es deficiente depende de pruebas inmunoquímicas o funcionales espe-
cializadas que sean específicas para cada componente, (véase Cap. 38).
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL
Medidas enzimáticas
Las deficiencias enzimáticas relacionadas con el metabolismo de las puri-
nas, adenosina deaminasa (ADA) y purina nucleósido fosforilasa (PNP) están
asociadas con deficiencias inmunológicas. El mecanismo básico es el acumu-
lo de metabolitos tóxicos que inhiben la replicación celular, produciendo final-
mente la pérdida de importantes lineas celulares de linfocitos. La falta de ade-
nosina deaminasa, que cataliza el catabolismo de adenosina a inosina,
produce primero la pérdida de células T (células T CD4+ en particular) y con
posterioridad células B. conduciendo a una forma común de deficiencia grave
combinada de células T y B (Hirschhorn, 1995). Aproximadamente el 25% de
las inmunodeficiencias severas combinadas (IDSC) son causadas por la defi-
ciencia de ADA. A menudo se observan anormalidades óseas características
que afectan a las caderas, pelvis y omoplatos (Cederbaum, 1976). Como para
muchos de los defectos inmunitarios primarios que primero fueron identificados
en su forma grave, la deficiencia de ADA también se ha diagnosticado en adul-
tos con linfopenia de CD4 y defectos significativos de células T (Shovlin, 1994).
La deficiencia de PNP provoca deficiencia de células T con un efecto mínimo o
nulo sobre las células B. Las enzimas generalmente se miden en usados de
hematíes (Kizaki, 1977), pero si se han hecho transfusiones sanguíneas en los
tres meses previos, el ensayo puede no ser exacto, y en su lugar se deben
determinar en los fibroblastos de la piel, extraídos de una biopsia de piel.
Histología
El timo normal y tejidos linfáticos muestran rasgos estructurales caracterís-
ticos que están alterados o ausentes en las inmunodeficiencias (Borzy, 1979;
Hong. 19996: Abbas, 1994). En la práctica clínica actual, a menudo estos teji-
dos no están disponibles, pero cuando se obtienen estos materiales de las
biopsias, el examen microscópico de estos tejidos debería incluirse en la eva-
luación inmunológica. Las pruebas in vilro de las células obtenidas de estos
tejidos son bastante reveladoras cuando se estudian mediante reactivos
monoclonales dirigidos a tipos específicos de células y marcadores activos.
Ensayos con células asesinas naturales
Las células NK forman un subgrupo de células, relacionadas con las célu-
las T. pero carentes de un receptor para células T y con morfología de gran-
des linfocitos granulares. Las células NK son detectadas por CD16, CD56 y
CD57; la actividad lítíca se correlaciona mejor con la población CD56+ (Trin-
chieri, 1989). La actividad funcional de las células NK puede medirse por
ensayo de citotoxicidad Irente a una linea celular como K562; esto puede ser
importante en el diagnóstico de IDSC, el síndrome de Chédiak-Higashi y
casos raros de deficiencia de células NK aisladas. Sólo se ha descrito un caso
de ausencia completa de células NK. Este paciente presentaba importantes
complicaciones con varicela, herpes y citomegalovirus, pero era capaz de
resistir otras infecciones de manera normal (Biron, 1989).
Análisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares
Aparte de la EGC, otros defectos de los PMN incluyen los defectos de mie-
loperoxidasa. y enfermedades de adhesión y movilidad celular. La deficiencia
de mieloperoxidasa, heredada como un defecto autosómico recesivo, tiene una
importancia clínica desconocida, habiendo sido descrita tanto en individuos
asintomáticos como propensos a la infección (Lehrer, 1969; Klebanoff, 1999).
Los leucocitos, transportados a través del sistema circulatorio, son atraídos
a las áreas de inflamación interaccionando con los receptores de células
endoteliales conocidos como selectinas, que ¡nteraccionan con ligandos car-
bohidratos de los leucocitos tales como el sialyl-Lewís" (antigeno del grupo
sanguíneo Lewis). Esto provoca una lenta acción rodante (rolling) a lo largo
de la pared del vaso, que "aparca" esencialmente la célula circulante, Des-
 970 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOIOGÍA
pues, la activación del leucocito provoca una expresión aumentada de las |5-2
integrinas (CD11/18), que causa una firme adhesión de la célula a la pared del
vaso, siguiendo con la emigración y la infiltración del tejido (McEver, 1992).
Aparecen anormalidades de adhesión a la célula si hay defectos de la inte-
grina CD18. la cadena p común de LFA-1, Mac-1 y moléculas p150,95 (defi-
ciencia de adhesión al leucocito [LAD-1]) (Anderson. 1987). Esta anormali-
dad provoca un desprendimiento postergado del cordón umbilical, úlceras
cutáneas crónicas, periodontitis y leucocitosis. Las células afectadas son los
neutrófilos. monocilos. macrófagos. linfocitos y células NK. Hay defectos
demostrables de adherencia y funciones adhesión-dependientes como la difu-
sión, fagocitosis y orientación quimiotáctica (Anderson, 1987). También hay
una segunda forma de esta enlermedad deficitaria, que afecta principalmen-
te a los neulrófilos y macrófagos, donde un fallo en la expresión de un ligan-
do selectina sialyl- Lewis' y un fallo de conversión de GDP mañosa en fuco-
sa. provoca un síndrome clínico similar, pero aporta a los individuos el grupo
sanguíneo Bombay (LAD-2) (Etzioni, 1993),
Los defectos congénitos de la movilidad de los neutrófilos se producen en
las enfermedades de defectos de adhesión antes citadas, así como en otras
enfermedades de neutrófilos, síndrome de Schwachman. síndrome de Ché-
diak- Higashi y deficiencias de granulos específicas. Las dos primeras pue-
den reconocerse por los signos clínicos: hay anemia, trombocitopenia, insu-
ficiencia pancreática en la primera y albinismo parcial oculocutáneo en la
última (Inlrone, 1999). El examen morfológico de los neutrófilos teñidos
muestra las anormalidades características en la deficiencia de granulos
específicos (Ganz. 1988).
La quimiotaxis de los PMN técnicamente es una prueba de laboratorio difí-
cil y los resultados irregulares pueden deberse simplemente al laboratorio
(Cates. 1981) Una quimiotaxis escasa a menudo es un signo inconstante de
enlermedad; asi, no muestra una correlación consistente con la sintomatolo-
gia. La evaluación total de los trastornos del movimiento exige una relación
más estrecha con todo el cuadro clínico y extensa experiencia clínica. La
movilidad de los leucocitos generalmente se evalúa por la migración directa a
través de filtros de membrana o con agarosa (Nelson, 1975: Cates. 1981).
Otras pruebas para valorar la movilidad de los PMN incluyen inyecciones de
epinefrina y esteroides. que hacen que los PMN se desmarquen y abandonen
las reservas de la médula. Se ha descrito una alteración de actina, importan-
te en la migración de los PMN (Southwick. 1988).
La ventana cutánea de Rebuck. que muestra la duración y características
de las células de la migración en la piel, se utilizó en el pasado para describir
la respuesta inflamatoria pero no ha tenido mucha aplicación clínica (Sout-
ham. 1966); sin embargo, es un indicador biológico real de las funciones de
los neutrófilos in vitro.
Citocinas y receptores de citocinas
Las respuestas inmunitarias están reguladas por los mediadores solubles,
llamados citocinas. que producen una mulliplicidad de acontecimientos inmu-
nes mediante interacciones con los receptores de citocinas apropiados
Muchas de estas citocinas y receptores se han caracterizado. Los efectos de
las citocinas son a menudo múltiples, con diferentes efectos en diferentes
células (Lederer, 1995). Los receptores de las citocinas pueden contener
cadenas compuestas, comunes a receptores para varias citocinas diferentes;
esto se repite en el sistema hematopoyético. donde los receptores para inter-
leucina-3 (IL-3), IL-5 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrófagos (GM-CSF) utiliza una cadena p común, y el sistema linfático,
cuyos receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-5 comparten otra cadena p
común. En el último caso, esta cadena p está codificada en el cromosoma X:
la presencia común de esta cadena en este grupo de receptores de citocina
esenciales es la razón de por qué un defecto molecular a este nivel provoca
un estado de inmunodeficiencia profunda como la inmunodeficiencia ligada al
cromosoma X (Noguchi, 1993; Puck, 1993). Un mecanismo que es común a
un número de receptores de citocinas con dos o más cadenas es la fosforila-
ción y activación de varios miembros de la familia de la cinasa Jak: éstos
incluyen IL-2, IL-3, IL-4. IL-5, IL-6. IL-7. IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13. IL-15,
GM-CSF, interterón-a (IFN-u), IFN-ji e IFN-y. Podría esperarse que los
defectos en la cinasa Jak especifica simulasen un defecto de la citocina, o de
su receptor; un ejemplo de esto es la versión de IDSC provocada por una
mutación de Jak3, la cinasa asociada con la cadena p común de los recepto-
res de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, e IL-15 (Candotti, 1997). Como el IL-7 es esencial
para el desarrollo normal de las células T del timo, un defecto en el receptor
de IL-7 aislado provoca otra versión de IDSC (Puel, 1998).
Hay otras enfermedades congénitas de inmunodeficiencia donde se ha
identificado el defecto de una sola citocina. En varios casos raros, la caren-
cia de secreción de defectos del receptor IL-2 en un niño constituye la base
para el déficit inmunitario (Doi. 1988; Arnaz-Villena, 1992). Se ha descrito la
deficiencia de IL-1 (Chu, 1984). Otro defecto de citocinas, más reciente-
mente descrito, es el de la secreción de IL-12. que provoca una grave sus-
ceptibilidad a micobacterias y salmonela. Otros sujetos, que tienen una
mutación en el receptor de INF-y. tienen la misma presentación clínica
(deJong, 1998); Jouangy, 1999). En este momento se han clonado 18 cito-
cinas que tienen una acción primaria sobre el sistema linlático (llamadas
interleucinas). Se están investigando las actividades biológicas de cada una
(Véanse Caps. 38 y 39).
Marcadores adicionales de superficie celular
Para investigar la relación proporcional de vanas subpoblaciones presen-
tes de linlocitos. monocilos y células NK. existen un número de anticuerpos
monoclonales, que pueden utilizarse en el análisis de citometria de flujo en
muestras de sangre incluso muy pequeñas. Además de los marcadores de
superficie de células característicos de las células T, células T colaboradoras
o células T supresoras, células B o células NK. éstos y otros tipos de células
se caracterizan por moléculas superficiales funcionales, también designadas
como "CD" (del inglés: cluster oí dilferentiation). En la Tabla 42-8 se explica
un número de estos anticuerpos y sus blancos específicos.
Al igual que otros marcadores de células T, la mayoría de las células T se
unen al antigeno, mediante un receptor que consta de cadenas a y p Casi
un 5% tiene un receptor compuesto de cadenas y y 6. Estas células T se
conocen como células T <r. / p y y i 6. respectivamente; ambas pueden ser
evaluadas por anticuerpos monoclonales apropiados y técnicas de tinción
fluorescente. La selección positiva o negativa de las células T a /13 viene
determinada por la afinidad de la interacción del receptor de la célula T con
sus propios antígenos presentados como fragmentos de péptidos que están
en el retículo endoplásmico de las moléculas MHC clase II y /o clase I de las
células del estroma limico. Las células T y 1o" no expresan CD4 o CD8 duran-
te la maduración intratímica, y la selección clonal no aparece esencial para la
maduración. La función del grupo minoritario, las células y 15. no está clara.
En contraste con las células T a / |i. las células T yl 5 pueden unirse a dia-
nas que no forman complejo con los antigenos del trasplante. Asi, pueden
representar un mecanismo más primitivo de defensa, análogo a la activación
alternativa del sistema de complemento, capaz de responder a los microbios
previo al desarrollo de la inmunidad especifica. Las células localizadas en el
epitelio intestinal, linlocitos intraepiteliales, son principalmente del tipo y / 6
(Abbas, 1994). No ha aparecido ninguna enfermedad congénita de inmuno-
deficiencia que produzca una expresión defectuosa de las células T de las
cadenas ut' |i o y' 6. Sin embargo, se han descrito varios defectos de expre-
sión del receptor de CD3 (Alarcón. 1993) incluyendo una expresión escasa
del complejo CD3 en su conjunto y defectos heredados de las cadenas yo
Ó del receptor de células T.
Se han descrito mutaciones congénitas que afectan a la expresión de
moléculas MHC clase I y clase II. Las moléculas clase II se encuentran prin-
cipalmente en las células presentadoras de antígeno. que inician la respues-
ta inmune. Como se podría predecir, los defectos genéticos en las moléculas
MHC clase II (de mutaciones que implican activación del gen de transcripción
de las MHC clase II) provocan un profundo estado de inmunodeficiencia, donde
hay defectos de células T y de células B: en este síndrome, las células T
CD4-t pueden ser normales en número o deficientes (Klein, 1993). Los antí-
genos de clase I se expresan en casi todas las células, y la eliminación de un
antigeno extraño puede efectuarse por la unión de células T CD8+. Rara-
mente, los delectes inmunes que provocan deficiencia de clase I, una muta-
ción que incluye alguno de los transportadores peptidicos citoplásmicos de
las MHC clase I, TAP-1 o TAP-2. producen un delecto inmune caracterizado
por una enfermedad pulmonar grave que se manifiesta en la infancia tardía
(Donato, 1995. de la Salle, 1999). El diagnóstico de ambos defectos incluye
el examen de la expresión de estos antigenos MHC o células linfáticas de
sangre periférica.
 CAPÍTULO 42 • TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS 971

Tabla 42-8 Marcadores d e superficie d e leucocitos

Marcador Comentario

Series de células T
CD1a Timocilos corticales
CD2 Células T. células NK, receptor LFA-3
CD3 Parte del complejo del receptor de células T. un marcador pan-T
CD4 Células T reactivas con antigeno HLA clase II (células colaboradoras)
CD5 Marcadores pan-T; presentes en un subgrupo de células В
CD8 Células T reactivas con antígeno HLA clase I (células asesinas)
CD28 Células T; В activadas; limocitos, lugar de estimulo a la segunda señal
CD43 Leucocitos excepto células В (leucosialino): reducido en el síndrome de Wiskolt-Aldrich
CD45 Células T vírgenes (naive) (que no han reaccionado con antigenos), recientemente emigrado del timo
CD45RO Células T de memoria
Series de células В
CD10 Antigeno común de leucemia linloblastica aguda (ACLLA)
CD19 Marcador pan-B
CD20 Marcador pan-B
CD21 Receptor CR2, EBV
CD22 Marcador pan-B
CD23 Células В activadas macrófagos, eosinófilos, plaquetas; el FcRIl de baja afinidad
CD40 Células B, carcinomas, monocitos; asociado con cambio de isotipo
CD77 Linfoma de Burkitt
Series mieloides
CDl 1b CR3, receptor C3bi
CD11c Receptor CR4
CD14 Monocitos, granulocitos, células de Langerhans, macrófagos
CD16 Células NK, granulocitos, macrólagos: el receptor FcRIIIA, FcRIIIb
CD34 Células precursoras hematopoyéticas, células endoteliales
CD35 Granulocitos, monocitos, NK, células B: el receptor CR1/C3b
Series NK
CD16 FCYRIII
CD56 Células NK (N-CAM, NKH-1); con CD16 usados para enumerar el número de NK en sangre perilérica
CD57 Células NK. subgrupo células T (HNK-1)
Moléculas de adhesión
CD11a Leucocitos, cadena L-integrina (ligando ICAM-l)
CD11b Granulocitos. monocitos, células NK; cadena M integrma del complejo LFA-1 (MCA-1. fibrinógcno y receptor C30i)
CD11c Granulocitos. monocitos, células NK; cadena X integrma de LFA-1, gp 150-95
CD18 Leucocitos (integrina, cadena |5 de CD11)
CD62E E- selectina, ELAM-1. células activadas endoteliales
CD62L L-selectina, células T y B, monocitos, células NK. PMNs. eosinófilos. células progenitoras (LECAM-1.LAM-1)
CD62P P-selectina; plaquetas activadas, células endoteliales
Marcadores de activación
CD25 Células В y T activadas (receptor IL-2)
CD30 Células В y T activadas, células Reed-Sternberg
CD38 Células T activadas inmaduras
CD69 Células В y T activadas células NK. macrófagos
CD70 Células В y T activadas, células Reed-Sternberg (ligando CD27)
CD71 Receptor de transierrina
CD154 El ligando para CD40 en células B. asociado con hiper IgM

Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA
En el caso de ausencia completa de IgA. deberían determinarse los anti-
cuerpos para IgA, ya que la presencia de estos anticuerpos provoca anafílaxia
en el transcurso de la administración intravenosa de productos sanguíneos
que contengan IgA. Los pacientes con deficiencia en IgA presentan una inci-
dencia aumentada de enfermedad autoinmune y. dependiendo de la historia
clínica, puede estar indicada la búsqueda de otros autoanticuerpos (Cunning-
ham- Rundles. 1996). Ya se ha mencionado la asociación de deficiencia selec-
tiva de IgA con deficiencia de subclase de IgG (Bjorkander. 1985).
Utilización de nuevos inmunógenos para valorar
la producción de anticuerpos
Para investigar la producción de anticuerpos, en muchos casos es suficiente
investigar la respuesta a los antigenos de las vacunas, como la /acuna del téta-
nos, toxoide diftérico, o las vacunas de haemophilus o neumocócica. En la ma.
yoría de los casos, la respuesta indicará la capacidad relativa del sujeto para
producir una respuesta a la vacunación de recuerdo. Sin embargo, otra herra-
mienta valiosa es la vacuna de investigación, el bacteriófago <J>X 174. Como este
es un antígeno nuevo de vacuna provoca en principio una respuesta primaria de
IgM. y luego, tras la reexposición, una respuesta secundaria de IgG. Usando
<I>X174, los patrones de aclaramiento y las respuestas de isotipo se pueden
medir, definiendo varios grados y subgrupos de deficiencias de células B (Ochs.
1971). Esto es muy útil en pacientes que ya han estado recibiendo inmunoglo-
bulina intravenosa, ya que la infusión pasiva de estos anticuerpos a intervalos
provoca que no se puedan interpretar las respuestas a vacunas estándar.
Genética molecular y diagnóstico prenatal
Actualmente se han identificado, clonado y secuenciado un número de ge-
nes involucrados en los síndromes de inmunodeficiencia primaria (Conley,
 972 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
1992; Puck. 1993: Derry. 1994; Ramesh. 1998; Víhinen. 1999). En muchos
casos, los modelos de ratones knockout se producen para estudiar los efec-
tos de los genes involucrados en la inmunidad. En casos sospechosos de
inmunodeficiencia. los genes relevantes pueden ser examinados directamen-
te. Estas técnicas permiten el diagnóstico de pacientes, y la identificación de
portadores. Cada vez está siendo más posible el diagnóstico prenatal de un
número de defectos inmunes. Si la mutación especifica se conoce, o si se
sabe que el patrón de herencia está ligado al cromosoma X, se pueden rea-
lizar análisis de marcadores polimórficos ligados o detección de mutaciones
especificas usando muestras de vellosidades coriónicas. ADN de amniocitos
preparados directamente de células fetales, o de lineas de células cultivadas
y expandidas. Cuando el genotipo no se conoce, puede investigarse directa-
mente en las células letales el defecto funcional, aunque estas pruebas se
deben realizar más adelante durante el embarazo y suponen más nesgo. Por
ejemplo, en los sindromes de IDSC. se puede demostrar en la sangre fetal la
linfocitopenia. un número descendido de células T y una escasa transforma-
ción de linfocilos (Durandy, 1985). Se pueden determinar deficiencias de enzi-
mas en cultivos de fibroblastos obtenidos por amniocentesis. Se puede reali-
zar, si la sangre letal puede obtenerse sin contaminación de sangre materna,
ausencia de antigenos HLA o valoración de (unciones de las células T y qui-
mioluminiscencia de granulocilos.
RESUMEN
La valoración de las defensas del huésped es un proceso extraordinaria-
mente complejo que supone la cooperación del médico, científico investiga-
dor y del patólogo. Una aproximación lógica, basada en la apreciación de los
diversos sistemas involucrados en la defensa del huésped y las diversas
capacidades de los distintos laboratorios, pueden llevar a un diagnóstico en
casi todos los casos. El impresionante éxito de la terapia moderna, basada en
los antibióticos más recientes, la tecnología del ADN recombinante y los tras-
plantes de médula ósea, favorece la definición precisa y el tratamiento de los
estados de inmunodeficiencia inmunológica.
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 CAPÍTULO 43

Evaluación clínica y de laboratorio

de las enfermedades reumáticas sistémicas
• Carlos Alberto Von Mühlen, M.D., Ph.D.
• Robert M. Nakamura, M.D.

INTRODUCCIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS Anticuerpo frente al antígeno nuclear asociado a

ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS 974 artritis reumatoide
LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Y TRASTORNOS Anti-RA33 y relación con la artritis reumatoide
RELACIONADOS TIPO LUPUS 974
POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS 980
Factores etiológicos en el lupus eritematoso sistémico
SÍNDROME DE ASTENIA CRÓNICA 981
¿Cuáles son los criterios diagnósticos para
el lupus eritematoso sistémico? CONCEPTO DE SÍNDROMES DE SUPERPOSICIÓN 981
¿Qué son los síndromes y enfermedades "tipo lupus"? Enfermedad mixta del tejido conectivo
Perfil de autoanticuerpos en el lupus eritematoso
BIOLOGÍA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS
sistémico
AUTOANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES 981
Lupus crónico discoide
Lupus eritematoso inducido por medicamentos y PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS
ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS 981
anticuerpos antihistona

SÍNDROME DE SJOGREN 978 TABLA DE DECISIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE

ENFERMEDADES AUTOINMUNES 982
ESCLERODERMIA 979
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN LA DETECCIÓN DE
Anticuerpos frente a antígenos del centrómero
AUTOANTICUERPOS 982
Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I)
Anticuerpos frente a ARN polimerasas VARIACIONES EN LAS METODOLOGÍAS USADAS
PARA LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS
Autoanticuerpos frente al antígeno nucleolar fibnlarina
FRENTE A ANTÍGENOS NUCLEARES
(U3-snRNP)
E INTRACELULARES 983
Anticuerpos dirigidos a la región organizadora nuclear
Enzimoinmunoanálisis
ARTRITIS REUMATOIDE 980
Inmunotransferencia
Factor reumatoide
Anticuerpo antiqueratina RESUMEN 987

Factor antiperinuclear
BIBLIOGRAFÍA 987

INTRODUCCIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS
ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS
Las enfermedades reumáticas se caracterizan por la presencia de uno o más
anticuerpos que pueden estar dingidos contra componentes de la superficie,
citoplasma o núcleo de la célula. El último grupo, anticuerpos contra antigenos
nucleares (AAN), es el sello de las enfermedades reumáticas sistémicas (Naka-
mura, 1985.1986,1992; Tan, 1982a, 1989). Se ha progresado mucho en la acla-
ración de los mecanismos inmunes involucrados en las enfermedades reumáti-
cas durante los últimos 15 años. Muchas de las enfermedades reumáticas
tienen un perfil de anticuerpos distintivo con especificidades diagnósticas. Por
otra parte, las funciones bioquímicas y biológicas de muchos de los antígenos
están involucradas en la replicación del ácido desoxiribonucleico (ADN), el cor-
te y empalme de los precursores del ácido ribonucleico (ARN). y el procesa-
miento del ARN (Tan. 1989). La clasificación de las diversas enfermedades reu-
máticas ha sido difícil debido a la falta de una base etiológica constante para la
mayoría de las enfermedades. Un subcomité del Colegio Americano de Reu-
matologia (Decker. 1986) desarrolló una clasificación y vocabulario extenso La
clasificación de las enfermedades reumáticas sistémicas y las alteraciones rela-
cionadas realizada por el autor se muestra en la tabla 43-1.
LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Y TRASTORNOS
RELACIONADOS TIPO LUPUS
El lupus eritematoso sistémico (LES) es el prototipo de las enfermedades
reumáticas sistémicas y posee los siguientes rasgos significativos (Nakamu-
ra, 1994a):
1. LES es una enfermedad autoinmune que no es órgano-específica, donde
el daño tisular está mediado principalmente por inmunocomplejos ADN-
anti-ADN.
 CAPÍTULO 4 3 EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
Tabla 43-1 Enfermedades reumáticas sistémicas y trastornos
relacionados
Lupus erilematoso sistémico (LES)
Lupus erilematoso discoide (LED)
Síndromes tipo lupus
Lupus eritematoso inducido por medicamentos
Síndrome de S|0gren
Esclerodermia/síndrome CREST (calcinosis cutis, fenómeno de
Raynaud, trastornos de la mohlidad esofágica,
esclorodactilia y telangiectasia)
Artritis reumatoide (AR)
Dermatorniositis y polimiositis
Síndromes sobrepuestos
a) Enfermedad del tejido conectivo mixto (ETCM)
b) AR y LES (rupus)
c) LES y esclerodermia (lupodermia)
d) Esclerodermia y dermatomiositis (esclerodermatomiositis)
e) Otros
10. Síndromes de enfermedad del tejido conectivo que no están
definidos como para tener una categoría clínica
2. Es una enfermedad multisistémica que afecta a la mayoría de las perso-
nas de todas las edades y ambos sexos, aunque es más prevalenle en
mujeres en edad fértil.
3. La enfermedad manifiesta un sistema inmune hiperactivo con múltiples
anormalidades.
4. Los pacientes con LES manifiestan una respuesta de anticuerpos hetero-
géneos y policlonales, con reacción de formación autoanticuerpo incluyen-
do mecanismos similares a los vistos en una respuesta inmune típica a
inmunógenos extraños (Fatenejad, 1998).
5. El caso típico de LES presenta una media de tres anticuerpos circulantes
diferentes presentes de forma simultánea. La prevalencia de anticuerpos
varía por encima de un amplio rango, y se han identificado más de 25 tipos
diferentes de autoanticuerpos en LES (Nakamura, 1994a).
Factores etiológicos en ei lupus eritematoso sistémico
Su etiología sigue sin conocerse bien. Algunos de los factores etiológicos
importantes en LES son 1) endocrino-metabólicos, 2) ambientales y 3) gené-
ticos (Chan, 1989). El factor de riesgo más fuerte para el desarrollo de LES
es el género femenino (Hochberg. 1990). Se ha considerado que el LES pue-
de tener una posible etiología viral (Pincus. 1982). La presencia de anticuer-
pos antinucleares se observó en trabajadoras de laboratorio con diversos
niveles de exposición a sangre de pacientes con LES. La presencia de anti-
cuerpos antinativos ADN fue mayor en trabajadoras de laboratorio que en un
grupo de mujeres no expuestas que no trabajaban en un laboratorio (p<.00l)
(Zarmbinski. 1992). Estos resultados ayudan a mantener la hipótesis de que
un agente transmisible que puede existir en la sangre de pacientes con LES,
puede ocasionar la formación de anticuerpos. Se han implicado algunos pro-
ductos químicos en el LES (Hochberg, 1990). Se ha estudiado el síndrome
del lupus inducido por medicamentos tipo hidralacma. procainamida e iso-
niacida. como pista en la patogénesis del LES. Diversos artículos demues-
tran el mecanismo de acetilación como un factor de nesgo en el LES. Exis-
ten estudios que han demostrado una mayor relación de concordancia de
LES en gemelos monocigóticos y dicigóticos (Block, 1975). La concordancia
de LES estaba presente en 11 (58%) de 19 gemelos monocigóticos. El resul-
tado final de la interacción de múltiples tactores etiológicos es la activación
policlonal de células B en pacientes LES con producción de un amplio espec-
tro de anticuerpos (Nakamura. 1994a).
¿Cuáles son los criterios diagnósticos para el lupus
eritematoso sistémico?
En 1971, el Colegio Americano de Reumatologia (ACR: previamente la
Asociación Americana de Reumatismo (ARA)) publicó entonos preliminares
para la clasificación de LES (Cohén. 1971). Entonces se consideraba que
los pacientes tenían LES si cumplían cuatro de los criterios secuencial o
simultáneamente durante cualquier momento del examen. En 1982, el sub-
975
comité para los criterios de LES de ARA publicó criterios revisados que
incorporaban nuevos conocimientos inmunológicos y mejoraban la clasifi-
cación de la enfermedad del LES (Tan. 1982b). Los criterios revisados en
1982 para la clasificación de LES incluían 11 categorías añadiendo 1) título
anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofluorescencia o ensayo equi-
valente y 2) anticuerpo a ADN nativo y/o antígeno Sm. En contraste con los
criterios de 1971, los criterios de 1982 retiraban el fenómeno de Raynaud y
la alopecia por su falta de sensibilidad y especificidad. Cuando los criterios
de ARA de 1982 para la clasificación de LES fueron comparados con los cri-
terios de 1971, hubo una mejora definitiva en la sensibilidad y en la especi-
ficidad. Los criterios de 1982 mostraban un 96,7% de sensibilidad y un 96%
de especificidad al ser evaluados con pacientes con LES conocido y con-
troles (Tan. 1982b). Los criterios de la ARA de 1982 consideraban que los
pacientes tenían LES si cumplían cuatro de los critenos secuencial o simul-
táneamente en cualquier momento del examen. En 1997, se publicó una
actualización de los criterios, donde como cambios se elimino la prueba de
las células LE y se añadieron los anticuerpos anticardiolipina (Tabla 43-2)
(Gladman, 1999).
¿Qué son los síndromes y enfermedades tipo lupus?
Hay muchas enfermedades y síndromes que pueden compartir ciertos
rasgos clínicos con el LES pero no son LES y tienen diferentes etiologías y
patogénesis. Las enfermedades que se han enumerado en esta categoria
incluyen vasculitis, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedades
linfoproliferativas, fiebre reumática, glomerulonefritis, sífilis, hepatitis lupoide.
lupus inducido por medicamentos y neoplasia oculta (Panush, 1993). Hay
una categoria muy amplia de pacientes que manifiestan menos de cuatro de
Tabla 43-2 Actualización d e 1997 de los criterios revisados
en 1982 para la clasificación del lupus eritematoso
sistémico'
1 Exantema malar
2 Exantema discoide
3 Fotosensibilidad
4 Úlceras orales
5 Artritis no erosiva
6 Serositis (pleuritis o pericarditis)
7 Alteración renal (proteinuna persistente cilindros celulares)
8 Alteración neurología
9 Alteración hematológica
a) Anemia hemolitica con reticulocitosis. o
b) Leucopenia < 4.000/mm' en >2 ocasiones, o
c) Linfopenia < 1 500 mm en >2 ocasiones, o
d) Trombocitopema < 100 OOO/mm'en ausencia de un
medicamento culpable
10. Alteración inmunológica
a) Anti-ADN; anticuerpo contra ADN nativo en titulo anormal, o
b) Anti-Sm presencia de anticuerpo contra anticuerpo nuclear
Sm. o
c) Hallazgos positivos de anticuerpos antifosfolipidos basados
en: (t) un nivel anormal en suero de IgG o Igtvl anticuerpos
anticardiolipina (2) un resultado positivo para
anlicoagulante de lupus usando un método
estándar, o (3) un falso positivo en la prueba de la sífilis que
se sabe que es positivo durante al menos seis meses y
confirmado por inmovilización de Treponema palhdum o
prueba de absorción del anticuerpo
fluorescente de treponema
11, Anticuerpo antinuclear positivo
Un título anormal de anticuerpo antinuclear por
inmunofluorescencia o prueba equivalente en cualquier
momento en el tiempo y en ausencia de medicamentos que se
sabe están asociados con el síndrome de "lupus
inducido por medicamentos"
' La clasificación propuesta esta basada en 11 criterios Con el propósito de
identificar a los pacientes en estudios clínicos, se ova que una persona tiene
LES si están presentes 4 o mas de los 11 criterios, en serie o simultáneamen-
te, durante cualquier Intervalo de observación
De Hochberg MC Updatmg the American College of Rheumalology revised
criteria for the classification ol syslemic lupus erythematosus (Carla). Arthntis
Rheum 1997; 40 1725, con permiso.
/
 976 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

los criterios de clasificación de ARA de 1982 para LES (Lázaro. 1989: Lom- Tabla 43-3 Antígenos y autoanticuerpos en lupus eritematoso
Orta. 1980: Schur. 1993) pero se considera que tienen enfermedades "tipo sistémico
lupus". Estos pacientes se han clasificado del siguiente modo: 1) enfermedad
Frecuencia
reumática indiferenciada; 2) enfermedad no reumática; 3) síndrome sobre- Antígenos Estructura molecular autoanticuerpo'
puesto; y 4) lupus incompleto, latente o incipiente. Schur recomendaba, de
forma similar a los primeros criterios de ARA para el diagnóstico de la artritis ADN nativo ADN doble cadena 40-70%
reumatoide (AR), que los pacientes fueran calificados como LES clásico ADN desnaturalizado ADN cadena simple 70%
Hislonas H1. H2A. H?B. H3 H4 50-70%
(muchos criterios). LES definido (cuatro o más criterios), LES probable (tres Sm Proteínas. 29 (B ), 28 (B) 15-30%
criterios) o posible (dos criterios). Los pacientes con dos o tres criterios pue- 16 (D), y 13(E) kDa en
den ser considerados como incompletos, incipientes o latentes, además de complejo con U1, U2 y
lupus posible y probable (Schur. 1993). Si se sigue a estos pacientes, algu- U4-U6 snRNAs:
componente espliceosoma
nos permanecen con síntomas leves, y como tales quedan clasificados como
"enfermedad indiferenciada del tejido conectivo": unos pocos desarrollan un RNP nuclear Proleinas, 70, 33(A) y 22(C) 30-40%
(U1 RNP) kDa, en complejo conU1
LES definitivo, pero muchos pueden evolucionar a otras enfermedades con snRNA, componente
un pronóstico mejor. espliceosoma
SS-A/Ro Proteínas. 60 y 52 kDa, en 24-60%
complejo con Y1-Y5 RNAs
Perfil de autoanticuerpos en SS-B/La Fosfoproteínas. 48 kDa. 9-35%
(ormando complejo con Y1
el lupus eritematoso sistémico copias ARN Poi III naciente
Ku Proteínas. 86 y 66 kDa 1-19%
La característica del LES es la presencia de un amplio espectro de auto- proteínas unión a ADN
anticuerpos, incluyendo anticuerpos contra ADN nativo (ds-ADN), antígeno hnRNP proteína A1 Proteina nuclear. 34 kDa 31-37%
PCNA Proteina. 36 kDa, proteína 3%
Sm, U1-nRNP, SS-A/Ro, SS-B/La y otras varias proteínas no-histona o com-
auxiliar de ADN polimerasa
plejos proteína no-histona-ARN (Nakamura. 1994a). Existe una policlonalidad
RNP ribosomal Fosfoproteinas. 38. 16 y 10-20%
de anticuerpos en LES y esclerodermia. y se ve raramente en las otras enfer-
15 kDa asociado a ribosomas
medades reumáticas sistémicas. El anti-ADN nativo y anti-Sm generalmente Hsp '!(.: Proteina de golpe de calor.
son específicos para LES. El lupus eritematoso sistémico se caracteriza por 90 kDa 5-50%
una respuesta de anticuerpos policlonales y heterogéneos, y presenta una Proteína ALu ARN Proteína 68 kDa. 11 en raro
complejo con Alu-ARN
media de tres anticuerpos circulantes diferentes presentes simultáneamente.
HMG-17 Proteínas asociadas a ADN
La prevalencia de autoanticuerpos varia por encima de un amplio rango. Los 9 a 17 kDa 34-70%
anticuerpos contra ADN nativo e histonas se detectan en hasta un 40% y 70% B, glucoproteina I Fosfolípidos aniónicos. 25%
de los pacientes, respectivamente, y anticuerpos contra el antigeno nuclear cardiolipina
de proliferación celular (PCNA) y ciclina o proteina Alu-ARN en el 3% o menos • Las frecuencias están relacionadas sobre lodo con pacientes con enlotmedafl
(von Mühlen. 1995) (Tabla 43-3). activa.
Modificado de Nakamura RM, Bylund DJ. Tan EM Curent status of available
standards lor quality improvement ol assays lor the detection of autoantibodies
to nuclear and intracellular antigens J Clin Lab Anal 1994b. 8:360 y Krapf AR.
Anticuerpos contra ADN nativo o ADN bicatenarío von Mühlen CA. Krapf FE. y col Atlas of Immunofluorescenl Autoantibodies
Anticuerpos anti- ADN bicatenarío (ds-ADN) son bastante específicos para Munich. Urban & Schwar/enberg. 1996. con permiso
LES y se observan con una frecuencia del 75% al 90% en pacientes LES con
enfermedad activa (Buskila. 1992). Se han publicado muchos artículos pre-
vios de anticuerpos ds-ADN en otras enfermedades que no son LES. Sin
embargo, el pensamiento actual es que los anticuerpos reactivos a ADN en (1979) empleó las herramientas de la biología molecular para demostrar que
las otras enfermedades eran realmente anticuerpos anti ADN monocatenario. los antígenos Sm y nRNP eran partículas subcelulares compuestas de
Las pruebas del anticuerpo ds-ADN a menudo utilizaban preparaciones de pequeños ARN nucleares formando un complejo con proteínas. La partícula
ds-ADN contaminadas con ADN desnaturalizado o monocatenario. Una posi- unida por anti-nRNP está formada por un componente ARN llamado U1 (U por
ble excepción podría aparecer en el síndrome primario de Sjógren. una enfer- rico en uridina). formando complejo con al menos siete proteínas que varia-
medad a veces difícil de diferenciar del LES en gente de más edad. El anti- ban en peso molecular de 12 a 68 kDa (Tan. 1989), y encontrados con una
cuerpo contra ADN juega un papel definitivo en la patogénesis del LES. En frecuencia de 20% a 40% (ter Borg, 1990). Los antígenos de Sm constan de
estudios de pacientes LES. al anticuerpo contra ADN le sigue en aparición el varias proteínas, llamadas convencionalmente B1 (29 kDa). D (16 kDa) y E
antígeno circulante ADN, una secuencia de acontecimientos que terminan con (13 kDa) (Tan. 1989). Los anticuerpos anti B1/B purificados reaccionan de
la formación de inmunocomplejos. Estos inmunocomplejos ADN-anti-ADN tie- forma cruzada con la proteína D y viceversa, pero no se observa ninguna
nen un tropismo especial por las membranas básales y se depositan ense- reacción cruzada en pequeñas cantidades de sueros LES. Así. hay al menos
guida en el glomérulo renal. Esto inicia un daño renal por mecanismos infla- dos epitopos en la proteína B1/B reconocidos por sueros anti-Sm. Los anti-
matorios que terminan con la activación del complemento y la lisis de células genos reactivos con anti-Sm y ARN antinuclear están por consiguiente en
(Okamura. 1993). Los métodos previos de detección de anticuerpos ADN fue- unión de proteínas interactivas y ARN ocupados del corte y empalme del
ron el método de precipitación insensible, fijación de complemento y hema- ARNm precursor (Tan, 1989). No hay rasgos clínicos característicos aparen-
glutinación pasiva. Los métodos habituales son radioinmunoanálisis (RÍA), tes en pacientes LES con anticuerpos anti-Sm (Barada, 1981). aunque algu-
inmunofluorescencia indirecta (IFA) sobre Crithidia luciliae y enzimoinmunoa- nos autores afirman que estos anticuerpos se asocian a enfermedad renal u
nálisis (ELISA) (Buskila, 1992). Estos pueden detectar anti- ADN en el 75% al otras alteraciones del sistema nervioso central (SNC) Los pacientes que
90% de pacientes activos LES no tratados. sólo tienen anticuerpos a nRNP presetan una baja lasa de anticuerpos al
ADN y baja frecuencia de enfermedad renal clínicamente aparente (ler Borg,
1990). Los anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP pueden detectarse por inmuno-
Anticuerpos contra Sm y ribonucleoproteina nuclear difusión, hemaglutinación pasiva o contrainmunoelectroforesis. Sin embargo,
los métodos antes mencionados no distinguen exactamente entre anticuer-
Los anticuerpos de precipitación al antigeno Sm se han considerado mar-
pos y pequeños polipéptidos asociados a ARN nuclear Las reactividades
cadores altamente específicos para LES (Tan, 1989). Los anticuerpos contra
con los ARN individuales y polipéptidos pueden demostrarse mejor por téc-
Sm y contra ribonucleoproteínas nucleares (nRNPs) se encuentran en
nicas de inmunoprecipitación del ARN e inmunotransferencia, respectiva-
pacientes con LES. Los antígenos Sm y nRNPs se asociaban notoriamente,
mente. Se ha comprobado que la inmunotransferencia es más sensible que
porque el nRNPs no se pudo aislar bioquímicamente del antígeno Sm. Lerner
 CAPÍTUIO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
los métodos convencionales para la detección de anti-Sm y anti-nRNP
(Nakamura, 1994b). Habitualmente. las pruebas de laboratorio más amplia-
mente usadas para la detección de anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP son la
inmunodifusión y ELISA. Estas pruebas pueden diferenciar entre anticuerpos
Sm y nRNP pero no pueden definir los epítopos de los anticuerpos específi-
cos presentes en los sueros de los pacientes. La especificidad de los anti-
cuerpos y los epítopos se determinan mejor por métodos de inmunotransfe-
rencia Western Northern.
Anticuerpos contra SS-A/RO y SS-B/La
Los pacientes con LES pueden tener anticuerpos contra SS-A/Ro sólo,
o pueden tener ambos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. El poseer sólo anti-
SS-A/Ro está fuertemente asociado con el antígeno leucocito humano
(HLA) DR2 y con ser joven (<22 años de edad al comienzo). La presencia
de ambos. anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. en el LES está asociado con HLA-
DR3 y se ha visto en pacientes mayores (>50 años de edad al comienzo
de la enfermedad). (Hochberg, 1985). Un estudio con 55 pacientes con
LES mostró que los pacientes con anti-SS-A/Ro sólo tenían una enferme-
dad renal mucho más seria (Hochberg, 1985). Los pacientes LES sólo con
anti-SS-A/Ro también tenían una mayor incidencia de anticuerpos anti-
ADN concomitantes que aquellos pacientes LES con ambos anticuerpos
anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La (Chan. 1989). Los auloanticuerpos anti-SS-
A/Ro se han asociado íntimamente con la aparición de nefritis, vasculitis,
adenopatia, fotosensibilidad y leucopenia en pacientes LES. Los anticuer-
pos anti-SS-A/Ro, como los anticuerpos anti-SS-B/La, son anticuerpos
importantes por su fuerte asociación con el síndrome de Sjógren. que se
produce en más de dos tercios de los pacientes con este trastorno. El anti-
genoSS-B/La es una proteina celular unida a una especie de pequeño
ARN, formando un pequeño RNP que puede funcionar en el procesamien-
to de las copias de ARN polimerasa III (Chan, 1989)
Subgrupos clínicos de lupus eritematoso sistémico
asociado a anticuerpos contra SS-A/Ro
Los niveles elevados de anticuerpos SS-A/Ro están relacionados con
vanas alteraciones autoinmunes clínicas, incluyendo: 1) lupus eritematoso
cutáneo subagudo, 2) síndrome neonatal de lupus eritematoso con bloqueo
cardíaco congénito y lesiones cutáneas; 3) deficiencia homocigótica C2 y C4
con enfermedad tipo LES; 4) vasculitis primaria del síndrome de Sjógren,
positividad de factor reumatoide y síntomas sistémicos graves 5) pacientes
LES ANA-negativos y 6) LES con neumonitis intersticial (Bylund. 1991). Los
anticuerpos de precipitación contra SS-A'Ro se han visto en el 65% al 95%
de los pacientes con subgrupos asociados de anti-SS-A/Ro. y más del 90%
tienen niveles anti-SS-A/Ro cuando se detectan por métodos ELISA (Bylund,
1991).
Anticuerpos anti-Ku y anti-Ki
El sistema antigeno Ku consta de un par de proteínas llamadas p70/'p80
(Francoeur. 1986; Reeves, 1992). Estas proteínas poseen una alta afinidad
por el ADN y se sabe que son proteínas de unión al ADN. interaccionando
covalentemente con los extremos de ADN nativo. Mediante pruebas de
inmunoprecipitación e inmunotransferencia, se encontró el autoanticuerpo
Ku en el 10% de los sueros LES y no fue detectado en 100 de los sueros
de esclerodermia examinados. En esludios con un enzimoinmunoanálisis,
Reeves (1992) mostró que el 39% de LES. el 55% de la enfermedad mixta
del tejido conectivo (MCTD) y el 40% de los pacientes con esclerodermia
presentaban niveles bajos de anticuerpo contra la proteina Ku. El anticuer-
po anti-Ki fue descrito por primera vez en Japón (Tojo. 1981) y se observó
en casi el 10% de los pacientes LES. Se advirtió una relación entre el anti-
Ki y los rasgos clínicos de artritis, pericarditis e hipertensión pulmonar en
pacientes LES. El antígeno Ki lúe purificado del timo de conejo y tenía un
peso molecular de 32 kDa. Sakamoto (1989) realizó un ELISA y observó
anticuerpos anti-Ki en el 21.4% (30 de 140) de los pacientes LES. mientras
que 11 de 140 fueron positivos para anti-Ki por pruebas de doble inmunodi-
fusión.
977
Anticuerpos contra proteínas ríbosomales P
Cerca del 10% al 20% de los sueros LES muestran anticuerpos dirigidos
a tres fosfoproteinas ríbosomales de 15, 18 y 38 kDa en ensayos en san-
gre completa (WB). La asociación de anti-rRNP con las principales enfer-
medades del SNC en LES. principalmente los síntomas sicóticos, fue des-
crita en un estudio retrospectivo (Bonfa, 1987). No se mostró ninguna
asociación con el empeoramiento cognitivo o depresión en pacientes con
lupus. Se han encontrado diferencias significativas en la prevalencia de
anti-rRNP entre razas. Los estudios recientes se concentran en el papel
etiopatogénico de anti-rRNP en síntomas SNC en pacientes con lupus (Isshi.
1998; Nakamura, 1997),
Antígeno nuclear de proliferación celular
y anticuerpos Hsp-90
En el 3% de los pacientes con LES activo se detectaron anticuerpos con-
tra PCNA y no hay rasgos clínicos distintivos asociados con la presencia del
anticuerpo (Miyachi, 1978). Una posible asociación con los rasgos SNC,
como mielitis transversa, se ha visto en nuestros propios pacientes (C.A. von
Mühlen y R.M. Nakamura, resultados no publicados). Se ha determinado que
la proteína PCNA está relacionada con el ciclo celular, y se ha observado que
los anticuerpos PCNA son sondas útiles en el estudio de los agentes que
regulan la replicación del ADN, la proliferación celular y la transformación del
blasto. Se ha detectado un autoanticuerpo contra la proteina del golpe de
calor en mamíferos, Hsp-90 (Minota, 1988). La Hsp-90 es una proteína del
citoplasma y de la membrana plasmática de 90 kDa. El autoanticuerpo contra
Hsp-90 fue observado en el 50% de los pacientes con LES y dos de seis
pacientes con polimiositis.
Anticuerpos antifosfolípido en
el lupus eritematoso sistémico
El síndrome de anticuerpos antifosfolípido o anticoagulante lúpico se carac-
teriza por la presencia de anticuerpos circulantes contra fosfolipidos y rasgos
clínicos de trombosis venosa y arterial, trombocitopenia, anemia hemolitica y
varios síntomas sistémicos. Se han encontrado anticuerpos antifosfolipidos
frecuentemente en pacientes con LES y también en otras alteraciones como
las enfermedades infecciosas (Alarcón-Segovia. 1992: McNeil. 1991). Los anti-
cuerpos antifosfol ¡pidos se encuentran en hasla el 60% de los pacientes con
LES. Recientemente, se evidenció de forma clara que los anticuerpos antilos-
folípidos son muy heterogéneos, funcional e inmunoquimicamente, y son
policlonales (McNeil. 1991). La cardiolipina (fosfolipido aniómco) se ha utili-
zado ampliamente en la detección de anticuerpos antilosfolipidos. La mayo-
ría de los anticuerpos anticardiolipina reaccionan de forma cruzada con fos-
folipidos zwitterionic (McNeil. 1991). Los anticuerpos contra fosfolipidos
identificados pueden ser IgG o IgM, mientras que los anticuerpos a fosfoli-
pidos de ion dipolar son más frecuentemente IgM. Los anticuerpos contra
fosfolipidos son identificados en pacientes LES de tres maneras (Alarcón-
Segovia, 1992): 1) prueba falsa-positiva serológicamente para sífilis por
pruebas de Laboratorio de Investigación de Enfermedades Venéreas
(VDRL). que es un ensayo de floculación con partículas de carbón cubiertas
con colesterol, lecitina (fosfatidilcolina) y cardiolipina; 2) el ensayo anticoa-
gulante lúpico, que es la prolongación del tiempo de caolín parcial de trom-
boplastina (KPTT) que no está corregido por el plasma normal; y 3) el inmu-
noensayo de cardiolipina con el uso de cardiolipina u otros fosfolipidos
negativamente cargados como antígenos. Los pacientes con LES reaccio-
narán generalmente con un grupo fosfato cargado negativamente presente
en la cardiolipina, ácido fosfatídico. fosfatidilserina o fosfatidilinositol. Harris
(1987.1990) coordinó unos talleres internacionales para mejorar la precisión
y exactitud de los inmunoanálisis de los anticuerpos antifosfolipidos. Se pre-
pararon sueros de referencia y se definieron unidades estándar (GPL y
MPL). Una unidad GPL (MPL) es equivalente a 1mg/ml de una muestra
estándar IgG (IgM) purificada por afinidad. Sin embargo, López (1992) sugi-
rió que un ensayo IgA específico para anticuerpos antifosfolípido es impor-
tante para valorar el síndrome antifosfolípido en pacientes con LES. Parece
que se encuentra una mayor prevalencia del isotipo IgA para anticuerpos
 978 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
antifosfolípido en las personas negras. Los ensayos recientemente desarro-
llados para autoanticuerpos de la glucoproteína I |i, parecen aportar especi-
ficidad a los hallazgos, dado que se describió que la glucoproteína f¡¡ es el
epítopo específico para anticuerpos antifosfolípidos.
Lupus crónico discoide
Una forma benigna de lupus puede manifestarse como lesiones cutáne-
as discoides" (con forma de moneda o disco) sin síntomas de enfermedad
sistémica. Esta alteración se llama lupus eritematoso crónico discoide
(LEC) (Sontheimer.1992; Wallace,1992). Las características clínicas y de
laboratorio de LEC no se han definido claramente desde la adopción de los
criterios del Colegio Americano de Reumatología revisados en 1982 para
la clasificación de LES. Las lesiones cutáneas del lupus discoide crónico
son las siguientes: 1) eritema localizado persistente. 2) escamas adheri-
das, 3) taponamiento folicular, 4) telangiectasia y 5) atrofia (Wallace. 1992).
El lupus eritematoso subagudo cutáneo (LESC), otro cuadro cutáneo simi-
lar, consiste en lesiones papuloescamosas o no cicatriciales con una aso-
ciación principal al auloanticuerpo SS-A/Ro. También se han descrito
variantes adicionales del lupus crónico discoide, como la paniculitis lúpica
y el lupus urticarial (Sontheimer, 1992). Wallace (1992) ha definido el lupus
crónico discoide como el cumplimiento de la descripción del lupus crónico
discoide o LESC. o una de las variantes de LES donde no se reúnen los
criterios ACR para LES. Desgraciadamente, el lupus crónico discoide es
una alteración cutánea autoinmune que carece de anormalidad serológica
que unifique el diagnóstico. Es una forma leve del lupus eritematoso que
raramente evoluciona a LES. Por otra parte, hay una superposición consi-
derable entre el lupus discoide y LES, ya que hasta un 15% de los pacien-
tes con LES tienen lesiones cutáneas discoides. Alrededor del 6% al 12%
de los pacientes con LES tenían lupus discoide durante un número varia-
ble de años antes del comienzo de la enfermedad sistémica (Wallace,
1992). Habitualmente presentan anticuerpos antinucleares, con una esti-
mación de prevalencia en el lupus discoide del 6% al 50%. La relación
mujeres/hombres (2:1) está mucho menos inclinada hacia las mujeres que
la forma sistémica
Lupus eritematoso inducido por medicamentos y
anticuerpos antihistona
Una característica del lupus inducido por medicamentos es la presencia de
autoanticuerpos de histona. Las histonas son proteínas básicas moleculares
que contienen altas relaciones molares de aminoácidos cargados positiva-
mente, lisina y arginína. Las histonas se encuentran en las células eucarióti-
cas estrechamente asociadas al ADN genómico. La subunidad de este com-
plejo histona-ADN se llama nucleosoma, cuyo núcleo ("core") tiene dos
moléculas de cada (H2A, H2B. H3 y H4). y una molécula de H1. junto con
ADN de unos 200 bp de longitud (Rubín. 1985,1987),
En los estudios de lupus inducido por drogas, el enzima hepático acetil-
transferasa parece jugar un papel importante (Woosley, 1987). La acetil-
transferasa es un enzima que puede acetilar medicamentos como la hidra-
lazina y procainamida, jugando un importante papel en la desintoxicación y
excreción del medicamento. Los pacientes con bajos niveles de acetil-
transferasa eran más propensos a desarrollar ANA y síntomas clínicos que
pacientes que eran tratados con hidralazina y tenían fenotipicamente nive-
les altos de acetíltransferasa. Los pacientes con altos niveles de enzima y
que eran aceliladores rápidos no eran inmunes al desarrollo de ANA. Estos
pacientes, sin embargo, tuvieron una dosis acumulada de hidralazina
mayor y más prolongada antes de desarrollar la enfermedad. Estos hallaz-
gos relativos a los fenotipos de acetíltransferasa se han confirmado en
pacientes tratados con procainamida (Rubin. 1988). La procainamida es el
medicamento implicado más habitualmente en la autoinmunidad inducida
por medicamentos. La hidralazina, quinidina y otros medicamentos también
se han implicado como causantes de la autoinmunidad inducida por medi-
camentos. En el lupus inducido por medicamentos, existen anticuerpos
frente a ADN de cadena simple e histonas. La procainamida se utiliza para
tratar a los pacientes con arritmias, y la mayoría de los pacientes desarro-
llan anticuerpos anti-histona. Sin embargo, sólo del 10% al 20% de los
pacientes tratados con procainamida desarrollan una enfermedad autoin-
mune sintomática (Rubín, 1988). En pacientes asintomáticos. el anticuerpo
anti-histona es predominantemente IgM y manifiesta una amplia reactivi-
dad con todas las histonas individuales. Los pacientes con enfermedad sin-
tomática desarrollan un único tipo de anticuerpo anti-histona IgG que. más
que reaccionar con las histonas individuales, presenta una reactividad
específica con el complejo dimero de histonas H2A-H2B (Rubin. 1988)
(Tabla 43-4). Asi. la IgG anti-(H2A-H2B) es un marcador útil de diagnósti-
co, con alta sensibilidad y especificidad para la enfermedad sintomática, en
contraste con la forma benigna de autoinmunidad inducida por procainami-
da. con anticuerpos IgM contra la histona individual. En ambos tipos de
lupus eritematoso inducido por medicamentos (hidralazina y procainami-
da). existen anticuerpos IgM en concentraciones más altas que los anti-
cuerpos IgG. El cincuenta por ciento de todos los pacientes tratados con
procainamida desarrollaron ANA después de un año de tratamiento (Tan.
1989). Los acetiladores lentos desarrollaron ANA más rápidamente que los
acetíladores rápidos (Woosley. 1987). Todos los pacientes con tratamien-
tos prolongados de procainamida desarrollaron una respuesta ANA positi-
va con independencia del fenotipo acetilador.
SINDROME DE SJOGREN
El síndrome de Sjogren es una enfermedad inflamatoria autoinmune D e -
gresiva marcada por una progresiva sequedad de ojos, boca y otras muco-
sas (Schumacher, 1993). La enfermedad puede evolucionar desde las
glándulas exocrinas hasta una alteración sistémica asi como una alteración
linfoprolíferativa de células B. Se halla mucho más frecuentemente en
mujeres que en hombres, con una prevalencia creciente a lo largo de la
vida adulta. A menudo asociadas al síndrome de Sjogren están otras
enfermedades reumáticas, como AR. LES. cirrosis biliar primaria o escle-
rosis sistémica (Tabla 43-5). Las glándulas afectadas salivares o lacrima-
les son infiltradas con agregados de linfocitos. Las manifestaciones extra-
glandulares incluyen adenopatía. vasculitis cutánea, neumonitis intersticial,
etc. Esta enfermedad se ha clasificado dentro del síndrome primario de
Sjogren (1). que no está asociado con otras enfermedades del tejido
conectivo, y el síndrome de Sjogren secundario (2). donde está presente la
AR u otras enfermedades autoinmunes. Se sabe que el síndrome de Sjo-
gren se produce en una forma primaria, con el complejo seco (queratocon-
juntivitis seca y xerostomia) como marco característico. Los autoanticuer-
pos en el síndrome de Sjogren normalmente se confinan a los antígenos
SS-A/Ro y SS-B/La (Tan, 1989), pero el autor los ha observado con otras
especificidades solas, como complejo anti-Golgi o anti NuMA. El anti SS-
A/Ro y anti-SS-B/La están presentes en LES pero en prevalencías mas
bajas que en el síndrome de Sjogren. El anti ss-B/La se observa en un 60%
de los pacientes del síndrome de Sjogren y en un 35% de los pacientes
LES. y anti-SS-A/La en el 40% y 15%. respectivamente (Von Mülhen,
1995). La presencia de anti-SS-A/Ro cuando va asociado con anti-SS-B/La
Tabla 43-4 Especificidades de los autoanticuerpos en el lupus
inducido por medicamentos: asociaciones
o b s e r v a d a s m á s habitualmente en la bibliografía
Medicamento Especificidad a anticuerpo
inductor asociada (prevalencia)
Procainamida Complejo |H2A-H2B]-ADN (95%), H1 y
otras histonas individuales
Hidralazina Complejo |H2A-H?B]-ADN (35%). histonas
individuales
a-Metildopa H1. complejo |H2A-H2B)-ADN
Isoniazida Complejo |H2A-H2B)-ADN
D-Penicilamina Complejo [H2A H2BJ-ADN
Complejo [H2A-H2BJ-ADN (58%) histonas
Quinidina
individuales
Acebutolol Complejo [H2A-H2BJ-ADN
Carbamazepma Histonas totales
Gotas oftálmicas Timolol Complejo |H2A-H2B)-ADN
De von Muhlen CA, Tan. EM: Autoantibody specilicilies in autoimmune rheuma-
tic diseases Rev Bras Rheumatol 1994 34 173. con permiso
 CAPÍTULO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
Tabla 43-5 Asociaciones clínicas frecuentes c o n el s í n d r o m e
d e Sjogren
Artrilis reumaloide Tiroiditis auloinmune
Lupus entemaloso sistèmico Hepatitis crónica activa
Pohdermatomiositis Crioglobulmemia mixta
Enfermedad del tejido conectivo mixta Púrpura hipergammaglobuli-
némica
Cirrosis biliar primaria
Vasculitis necrotizante sistèmica
es indicativa de un síndrome de Sjogren primario, a veces coexistiendo con
LES. La presencia de anticuerpos anti-SS-B es menor del 1% en artritis
reumatoide (Tan, 1988). Existe también una asociación notable entre anti-
SS-A'Ro y la presencia de vasculitis sistémica y cutánea (Bylund. 1991). Se
ha observado una asociación de los anticuerpos SS-A/Ro y vasculitis en
pacientes con enfermedad de tejido conectivo no clasificada. Paprotnik
(1999) encontró títulos fluctuantes de anticuerpos contra SS-A'Ro tanto en
el síndrome de Sjogren primario como en el lupus eritematoso sistémico,
pero sin correlaciones principales con la actividad de la enfermedad clínica.
ESCLERODERMIA
La esclerosis sistémica (esclerodermia) es una enfermedad multisistémica
del tejido conectivo de etiología desconocida donde son rasgos prominentes
las lesiones vasculares y la fibrosis del tejido. La etiología de la esclerosis sis-
témica sigue sin conocerse bien. Los pacientes con esclerosis sistémica pro-
ducen espontáneamente anticuerpos frente a antígenos nucleares, nucleola-
res, y mitocondriales (Reimer, 1990; Rothfield. 1992). Un paciente con
esclerodermia generalmente tiene una heterogeneidad restringida de tipos de
anticuerpos. Un paciente determinado raramente tiene más de un autoanti-
cuerpo detectado. La Tabla 43-6 enumera los diversos tipos de autoanticuer-
pos descritos en la esclerodermia. Los pacientes con manifestaciones cutá-
neas difusas y de rápida progresión que afecten a las extremidades distales
y a menudo proximales y el tronco tienen un riesgo mayor nesgo de desarro-
llar manifestaciones viscerales precoces. Incluidos en la clasificación de
esclerodermia, se encuentra un subgrupo amplio de pacientes que tienen una
forma del síndrome CREST (calcinosis del culis, fenómeno de fíaynaud, alte-
raciones de la motilidad esofágica, esclerodactilia y íelangiectasia). El sub-
grupo de pacientes CREST puede representar del 20% al 30% de todos los
pacientes de esclerodermia (Fritzler, 1980). Los pacientes con la variante
CREST tienen una afectación cutánea limitada a las extremidades distales de
los dedos y la cara y generalmente un mejor diagnóstico y evolución clínica
que los pacientes con afectación cutánea difusa.
Tabla 43-6 A u t o a n t í g e n o s y autoanticuerpos en esclerodermia
Autoantígeno Estructura molecular
Scl-70 100 kDa nativo y producto de d e g r a d a c i ó n 70 kDa. ADN
topoisomerasa I
Centromero Proteinas. 17, 80 y 140 kDa, localizadas en las placas
de cinetocoro internas y externas
ARN Pol I Complejo ARN Poi l de proteínas subunidades. 210-211 kDa
ARN Pol II Transcribe RNAm
ARN Pol III Transcribe 5S RNAr. RNAt
Fibrilarina Proteína, 34 kDa, componente de partícula U3 RNP
U1-nRNP Complejo empalme-soma
V de esclerodermia
PM-ScL Complejo de 11 proteinas. 110-120 kDa
Ku Proteínas de unión a ADN
Th/To Proteina, 40 kDa, complejos con RNAs 7S y 8S
NOR-90 Proteina, 90 kDa. localizada en la región organizadora
del nucleolo
979
Anticuerpos frente a antígenos del centromero
Los autoanticuerpos frente a antígenos del centròmero fueron detecta-
dos inicialmente por microscopia de inmunofluorescencia. El antigeno del
centròmero fue localizado en la región condensada de la metafase de los
cromosomas. En estudios de inmunotransferencia, los antigenos del cen-
tròmero constan de tres proteínas: 16 kDa, 80 kDa y 120 kDa. Existen auto-
anticuerpos de las proteínas del centròmero en el 50% al 80% de los
pacientes con el subgrupo de esclerodermia llamado CREST. El veinticin-
co por ciento de los pacientes con fenómeno de Raynaud idiopàtico con
otros signos o síntomas de CREST tienen anticuerpos anlicentrómero
(Rothfield. 1992).
Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I)
Un antigeno importante es Scl-70. que fue detectado inicialmente como
una proteína de 70 kDa. Este fue más tarde reconocido como un producto
de degradación de una proteina de 95 kDa. ADN Topoisomerasa I (Tan,
1989). El antigeno fue localizado en distribución puntiforme en el nucleo-
plasma y el nucleolo. En primeros estudios, los autoanticuerpos frente a
Scl-70 se detectaron en el 20% de los pacientes con esclerodermia no
seleccionados por estudios de inmunodifusión (Tan, 1982a). En estudios
posteriores, se detectaron autoanticuerpos Scl-70 en el 75% de los pacien-
tes con la forma difusa severa de esclerodermia por pruebas de inmunodi-
fusión (Jarzabek-Chorzelska, 1986). Este último hallazgo probablemente
se realizó por la mejor conservación del antigeno topoisomerasa I en las
pruebas, asi como la demostración de una mayor prevalencia del autoan-
ticuerpo Scl-70 en pacientes con la forma difusa severa de esclerodermia
(Nakamura. 1992).
Anticuerpos frente a ARN polimerasas
Tres ARN-polimerasas catalizan la transcripción de genes en ARN (von
Mutilen, 1994). Los autoanticuerpos contra las ARN polimerasas tienden a
aparecer al mismo tiempo en el mismo paciente, parecen ser específicos
para esclerodermia y aparecen sobre todo en individuos con esclerodermia
difusa.
Autoanticuerpos frente al antígeno nucleolar
fibrilarina (U3-snRNP)
El nombre fibrilarina procede de la localización del antigeno en el compo-
nente denso librilar del nucleolo. Los anticuerpos antifibrilarina se ven en
hombres jóvenes con esclerodermia y minima afectación de las articulaciones
(von Mühlen, 1994).
Frecuencia de anticuerpo
70% en esclerodermia; 20-59% en todos los pacientes; 13%
en CREST
57%-82% en CREST. 8% en lorma difusa
4%-20% en esclerodermia. 13% en forma difusa
4%
23% en esclerodermia; 45% en forma difusa; 6% en CREST
6%-8%; 5% en forma difusa, 10% en CREST
2%-5% en todos los pacientes; 24% en PM/ superposición
2%-5%; 24% en PM7 superposición de esclerodermia
1%-14% en esclerodermia; 26-55% en PM/ superposición
de esclerodermia
4%-10% en esclerodermia; 1-11% en forma difusa, 8-19%
en CREST,
hasta el 3% en PM/superposición de esclerodermia
Raro
 980 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Anticuerpos dirigidos a
la región organizadora nuclear
Los anticuerpos de la región organizadora nuclear (NOR)-90 reconocen el
factor de transcripción hUBF (human upstream oinding /actor) de la ARN poli-
merasa I en el centro fibrilar del nucléolo. Los ÑOR son regiones donde los
nucléolos se reconstituyen después de la mitosis, con grupos de genes ARN
ribosomales, y zonas donde los antigenos Scl-70. U3-ARN/librilarina, NOR-90
y ARN polimerasa I pueden ser detectados (von Mutilen. 1994).
ARTRITIS REUMATOIDE
La AR es una alteración sistémica autoinmune que se caracteriza por una
artritis crónica, simétrica y erosiva de las articulaciones periféricas. Un gran
porcentaje de pacientes presenta títulos elevados de factores reumatoides
séricos. Existen manifestaciones asociadas no articulares, como nodulos
subcutáneos, vasculitis. fibrosis intersticial y otras similares. Los síndromes
de Sjógren y Felty se producen habitualmente con AR. Se desconoce la
causa primaria de AR. La mayoría de los pacientes con AR tienen los alelos
del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) Clase II DR4. DR1 o
ambos (Schumacher, 1993). La AR está asociada con varios anticuerpos,
que pueden servir como marcadores de diagnóstico y pronóstico (Aho,
1994; Viander. 1997). Estos incluyen:
1. Factor reumatoide (RF)
2. Anticuerpo antiqueratína (AKA)
3. Factor antipennuclear (APF)
4. Anticuerpo (rente a antígeno nuclear asociado a AR (RANA)
5. Anti-RA33
Los tres primeros, y posiblemente anti-RA33, pueden preceder al inicio de
la AR clínica.
Factor reumatoide
Este anticuerpo está dirigido contra la porción Fe de la molécula IgG. Los
estudios del FR monoclonal y policlonal han mostrado un RF polirreactivo
con especificidad de unión por sustancias distintas de IgG. como compo-
nentes nucleares (Schumacher. 1993). El FR polirreactivo generalmente es
de la clase IgM con baja afinidad. El FR no es específico para AR, y a menu-
do se observa en casos de infecciones crónicas y otras condiciones. El FR
en las enfermedades reumáticas tiene una heterogeneidad inmunoquímica
considerable. Junto con el FR IgM común, se han detectado tanto FR IgA
como FR IgG. El FR IgA se ha visto recientemente que está relacionado con
enfermedad grave con erosiones. La mayoría de los FR en suero de los
pacientes con AR reaccionan con la zona Ga no alotípica (o yl-2-4) pre-
sente en las moléculas de lgG1, lgG2 e lgG4. El FR reactivo con los grupos
GM alotípicos presentes en lgG1 e lgG3 también pueden existir en el sue-
ro de los pacientes con AR. Además, el grupo de los FR está entre los úni-
cos anticuerpos que claramente muestran que están involucrados en la
patogénesis de la enfermedad (Smolen, 1998).
Anticuerpo antiqueratína
Este anticuerpo reacciona con la capa córnea del esófago de rala (Young.
1979), El AKA es un marcador para AR bastante específico pero no muy sen-
sible. La aparición de reacciones positivas en suero AR es del 36% al 59% y
de 0% al 3% en individuos sanos normales (Aho, 1994). La mayoría de los
sueros antiqueratína positivo son también reactivos con el factor antíperinu-
clear, sugiriendo que ambos antigenos comparten algunas semejanzas.
Factor antiperinuclear
Este anticuerpo es reactivo con granulos de queratohialma perinucleares
de las células de la mucosa bucal. El aminoácido citrulina parece ser un com-
ponente esencial en los epítopos reconocidos por estos anticuerpos (Schelle-
kens. 1998). Esta prueba de inmunofluorescencia es sensible pero menos
especifica que AKA en pacientes con AR. Entre un 49% y un 87% de pruebas
APF-positivas se han descrito en pacientes con AR (Aho. 1994; Janssens.
1988) y hasta un 5% en otras enfermedades del tejido conectivo o en contro-
les normales. Tanto el AKA como el factor antiperinuclear se han descrito en
AR seronegativa en su primera etapa, permitiendo una clara mejora en el
diagnóstico de la enfermedad. Se llevó a cabo un ELISA utilizando lilagrina
publicada de epidermis humana, con una sensibilidad que iguala la de AKA
(Palosuo. 1998),
Anticuerpo frente al antígeno nuclear asociado
a artritis reumatoide
El anticuerpo frente a RANA se encontró en pacientes con síndrome de Sjó-
gren asociado a AR (Tan. 1989). Se descubrió, por estudios microscópicos de
inmunofluorescencia. que el RANA estaba localizado en el núcleo de forma
finamente moteada. El RANA no fue detectable en cortes tisulares de muchos
órganos en ratón, mono y humanos. Se detectó también en dos líneas de célu-
las T humanas (Molí 4 y 1301) pero fue detectado en los núcleos de tres line-
as de células B (WIL2. Raji y Daudi). Las líneas de células B albergaban virus
de Epstem-Barr (EBV). mientras que las líneas de células T no. Existia una cla-
ra relación entre RANA y EBV. Antes de la transformación de los linlocilos con
EBV, las células eran negativas para RANA. Sin embargo, después de la trans-
formación, los antígenos RANA se encontraban en el núcleo (Tan. 1989). El
anticuerpo anti-EA (un antigeno prematuro de EBV) estaba presente también
con mayor frecuencia en pacientes con AR. En un estudio, se observó un gran
número de pacientes con AR con títulos altos (>1:20) de anti-EA (Fenell.
1981). El lazo de unión entre EBV. AR y RANA no ha sido definitivamente esta-
blecido. El fenotipo HLA. EBV y, durante la infección, las deficiencias de inmu-
norregulación y reactivación de células infectadas por EBV latentes pueden
jugar un papel en la patogénesis de la enfermedad (Nakamura, 1992). En los
primeros estudios con análisis de inmunodifusión, se delectaron anti-RANA en
dos tercios de los pacientes con AR (Tan, 1982a, 1989). Sin embargo, en artí-
culos posteriores, se encontró que la incidencia de anti- RANA estaba por enci-
ma del 90% en pacientes con AR (Tan, 1988). En sujetos controles normales
3
la frecuencia de anti-RANA variaba del 6 c al 25% (Tan, 1988). Los estudios
seroepidemiológicos para anticuerpos virales de EB en AR han mostrado que
había una frecuencia mayor de pacientes con AR con títulos altos (>1:320) de
anticuerpos frente al antígeno de cápside viral EB. No hubo diferencia en la fre-
cuencia del antigeno nuclear anti-EB o los títulos entre los pacientes con AR y
los normales (Ferrell, 1981).
Anti-RA33 y relación con la artritis reumatoide
Hassfeld (1989) ha descrito un anticuerpo antinuclear (anti-RA33) que
puede ser específico para la AR. A partir de extractos de células Hela, se des-
cubrió un antigeno de aproximadamente 33 kDa que reaccionaba con el 36%
de los 95 sueros de pacientes AR y con sólo 1 de 170 pacientes control. El
antígeno fue denominado RA33. y el autoanticuerpo no tiene una relación per-
ceptible con otros anticuerpos antmucleares. El anli-RA33 no estaba relacio-
nado con anti-histona. De 11 pacientes AR con anti-RANA, seis fueron positi-
vos para anti-RA33. De los cinco sueros anti-RANA negativos, dos fueron
positivos para anti-RA33. (Hassfeld. 1989). Los análisis de inmunotransferen-
cia con extractos solubles de células Hela mostraban un autoanticuerpo diri-
gido frente a un antigeno de 33 kDa (anti-RA33) en el 30% de pacientes AR
austríacos y ninguno en pacientes con espondilitis anquilosante o artritis pso-
riásica (Aho, 1994). Sin embargo, se observó una prevalencia de anti-RA33
en finlandeses con AR del 6% (Aho, 1994).
POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS
La pohmiositis (PM) es una enfermedad inflamatoria del músculo estriado
de etiología desconocida. Se caracteriza por la presencia de infiltrados infla-
 CAPÍTULO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
matónos en el músculo esquelético, con necrosis de fibras musculares y
degeneración asociadas (Targoff, 1992). Cuando la enfermedad se acompa-
ña de cambios típicos en la piel, se denomina dermatomiositis. La polimiosi-
tis se caracteriza serológicamente por la presencia de un número de anti-
cuerpos de vanas especificaciones dirigidos contra diferentes sintetasas de
ARN de transferencia (RNAt) (von Múhlen, 1994) (Tabla 43-7). Estos anti-
cuerpos definen un subgrupo de pacientes con PM. artralgia. enfermedad pul-
monar intersticial y un diagnóstico más insuficiente que los pacientes sin los
autoanticuerpos. Los anticuerpos frente a Jo-1 (histidil RNAt smtetasa) apa-
recen en el 23% al 36% de los pacientes PM. teniendo la mayoría la enfer-
medad pulmonar intersticial (Targoff. 1992). Los autoanticuerpos frente a tre-
onil y alanil RNAt-síntetasa aparecen con una prevalencia más baja en la
miositis autoinmune. Se ha descrito en pacientes con un síndrome clínico que
muestren rasgos solapados de polimiositis y esclerodermia, un anticuerpo
denominado anti- PM-Scl (Tan. 1988). El anticuerpo anti- PM-Scl reacciona
con un complejo de 11 polipeptidos que van de 110 a 120 kDa. El Anti-PM-Scl
muestra coloración del nucléolo y nucleoplasma de las células del sustrato
por microscopía de inmunofluorescencia indirecta.
SÍNDROME DE ASTENIA CRÓNICA
Aunque no pertenece al clásico concepto de enfermedades del tejido
conectivo difuso, el síndrome de astenia crónica (SFC) en una enfermedad
con afectación sistémica que se ha demostrado que está relacionada con la
presencia de autoanticuerpos (von Mikecz, 1997). De 60 pacientes SFC, el
68% fueron positivos para ANA. Utilizando células Hep-2, los autores pudie-
ron obtener palrones nucleolares (13%), moteados (25%), periféricos (52%)
y moteados densos y finos (5%). Los estudios de co-localización mostraron
unas proteínas asociadas a láminas, factor SC-35 de empalme RNP, y
vimentina como posibles dianas, en lo que parece ser una selección para
antígenos celulares insoluoles. La alta frecuencia de autoanticuerpos en el
SFC puede ayudar a distinguir esta entidad de otras enfermedades sistémi-
cas reumáticas.
CONCEPTO DE SÍNDROMES DE SUPERPOSICIÓN
El síndrome de superposición se utiliza para describir a los pacientes que
muestran síntomas de más de una enfermedad. Por ejemplo, se han descrito
pacientes que reúnen los criterios diagnósticos para LES y también tienen
manifestaciones que sugieren un segundo diagnóstico como la AR (Lázaro,
1989). Se duda de si los síndromes de superposición pueden representar la
coexistencia de dos o más enfermedades diferentes, o si el síndrome consti-
tuye una entidad diferente.
Enfermedad mixta del tejido conectivo
El concepto de enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) fue pro-
puesto inicialmente por Sharp (1972). Los 20 pacientes descritos en la pri-
Tabla 43-7 A u t o a n t i g e n o s y autoanticuerpos e n pollmiosltis ( P M ) y dermatomiositis ( D M )
Autoanligeno Estructura molecular
Jo-1 Proteina histidil ARNt sintetasa. 52 kDa
PL-7 Proteina treonil ARNI sintetasa. 80 kDa
PL-12 Proteina alanil ARNt sintetasa. 110 kDa
Mi-2 Complejo proteina nuclear, proteínas 53 y 61 kDa
Partícula de reconocimiento Proteina, 54 kDa. en complejo con 7 SL ARN
de serial (SRP)
PM-Scl Complejo de 1t proteinas. 110-120 kDa
UtnRNP Complejo espliceosoma
56 kDa 56 kDa, componente RNP
EJ Glicil-RNAt sintetasa
0J Isoleucil-ARNt sintetasa
de Tan ( 1988). Nakamura (1992) y von Mühlen y Tan ( ¡994)
981
mera publicación presentaban una combinación de rasgos generalmente aso-
ciados a LES, esclerosis sistémica y polimiositis. De modo característico, por
hemaglutmación se detectó un título alto de autoanticuerpos frente a una ribo-
nucleoproteína nuclear en todos los pacientes (Sharp. 1972). La falta de anor-
malidades renales y neurológicas y la excelente respuesta de estos pacientes
a pequeñas dosis de corticoides orales justificó inicialmente la clasificación de
estos pacientes como un grupo separado de LES y esclerosis sistémica. Sin
embargo, el concepto de MCTD como un grupo separado ha cambiado con el
tiempo. Muchos piensan que MCTD representa un solapamiento de esclero-
sis sistémica. LES y polimiositis (Nimelstein, 1980). Un grupo de pacientes
diagnosticados inicialmente como MCTD lueron estudiados de nuevo ocho
años más tarde y mostraron una evolución general fuera del patrón de super-
posición al de una enfermedad única, siendo el diagnóstico más prevalente el
de esclerodermia (Nimelstein, 1980). Parece haber una gran superposición
que se manifiesta cuando los criterios antes mencionados se aplican a una
determinada población de pacientes, y los estudios no confirman totalmente
la existencia de MCTD como una entidad clínica individual
BIOLOGÍA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS
ANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
Muchos de los autoanticuerpos intracelulares, incluyendo los ANA, se han
identificado como marcadores de diagnóstico para las enfermedades reumá-
ticas, como el LES. esclerodermia. síndrome de Sjógren, MCTD. lupus indu-
cido por medicamentos y polimiositis/dermatomiositis (Tan. 1989). Los auto-
anticuerpos en las enfermedades del hombre se han utilizado como
herramientas para estudiar varias funciones biológicas moleculares y meca-
nismos. Los ANA se han utilizado para investigar bibliotecas de expresión de
DNAc. con posterior identificación de autoantigenos. Se han estudiado y acla-
rado las funciones biológicas de muchos de los autoanticuerpos inducidos por
autoantigenos. Las funciones biológicas que se han demostrado que los anti-
cuerpos inhiben son el empalme del pre-ARNm, replicación del ADN. repara-
ción del ADN, transcripción, transcripción de ARNr, movimiento del cromoso-
ma basado en el microtúbulo durante la mitosis, y aminoacetilación de ARNt
(Tan, 1988, 1989; Casiano. 1996; Tan. 1997).
PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS
ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS
Se ha observado que existen distintos perfiles de ANA en dilerentes enfer-
medades reumáticas sistémicas. Algunas características de éstas incluyen la
presencia o ausencia de ciertos anticuerpos y diferencias en los titulos
medios de estos anticuerpos (Nakamura. 1986; Tan. 1988). No obstante, se
debería tener cuidado del bajo valor predictivo positivo de la prueba de ANA
en grupos con una baja prevalencia de enfermedades reumáticas sistémicas
y en una población de edad (Slater, 1996). Deben reseñarse las siguientes
características:
Frecuencia de anticuerpo
23%-36%
4% en PM
3%
15%-35% en PM. 5%-9% en DM
4%-5% en PM, no se produce en DM
8%-12% en PM. 25% en PM/ superpo:
4%-17%en PM/DM
80%
<3% en PM
<3% en PM
 982 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
1 Múltiples ANA observados frecuentemente en LES. a menudo con altos
niveles de anticuerpos anti-ds-ADN.
2. Distinción de anti- Sm para LES.
3. Restricción de ANA en lupus inducido por medicamentos a anticuerpos
antihistona.
4. Anticuerpos frente a U1-RNP o anticuerpos nucleares frente a RNP pre-
sentes en varias enfermedades reumáticas con diferentes frecuencias.
5. La restricción de ANA en MCTD frente a U1-RNP o anticuerpos nucleares
RNP.
6. Sueros de síndrome de Sjógren caracterizados primariamente por la pre-
sencia de anticuerpos frente a SS-A'Ro y SS-B'La.
7. Pacientes con esclerodermia mostrando un perfil consistente en anticuer-
pos frente a Scl-70, el antígeno centrómero/cinetocoro y antígenos nuclea-
res.
8. La presencia frecuente de RE AKA. APF. anti-RA33 y RANA en artritis reu-
matoide.
9. La presencia de autoanticuerpos Jo-1. Mi-2 y PM-Scl en PM/DM.
TABLA DE DECISIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO
DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES
La microscopía de inmunofluorescencia mediante extractos celulares
humanos, como células Hep-2. permite la detección sensible de anticuer-
pos en suero que reaccionan muy específicamente con varias proteínas
celulares y ácidos nucleicos. Esta técnica es esencial en laboratorios de
inmunología dedicados al diagnóstico rutinario de las enfermedades
autoinmunes humanas. De una inmunofluorescencia positiva se puede
asociar el patrón específico con la presencia de un autoanticuerpo distinto
en el suero de ese paciente particular. Como los patrones de los distintos
autoanticuerpos aparecen en las distintas enfermedades, como se trató
previamente, los laboratorios ofrecen al médico la posibilidad real de redu-
cir la búsqueda del diagnóstico. En la Tabla 43-8 se desarrolla una tabla de
decisión teniendo en cuenta todo esto, así como la clasificación del patrón
citoplasmático para utilizarse en el laboratorio de rutina (Tabla 43-9). Las
Figuras 43-1,43-2 y 43-3 representan algunos ejemplos de los patrones de
inmunofluorescencia.
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN LA DETECCIÓN
DE AUTOANTICUERPOS
Los métodos que habitualmente se utilizan en la detección de anticuer-
pos se enumeran en la Tabla 43-10. Una prueba ampliamente utilizada en
el cribado de autoanticuerpos intracelulares es la microscopía de inmuno-
fluorescencia (IFM) y las pruebas de inmunoenzimas (Nakamura, 1994b).
Las pruebas secundarias definitivas para la identificación específica de ANA
son la inmunodifusión. inmunoprecipitación, aglutinación de partículas, m-
munoenzima, inmunotransferencia y métodos de radioinmunoanálisis (Teo-
dorescu. 1992).
La estandarización de la inmunofluorescencia indirecta (IF)-ANA ha resul-
tado muy difícil (Nakamura. 1992; Fellkamp. 1996: Smolen. 1997). Muchos
factores están implicados en la realización de las pruebas IF-ANA. Incluyen
1) el sustrato y las variaciones de fijación, 2) óptica microscópica, 3) méto-
do y cuantificación de resultados, 4) establecimiento del rango de referen-
cia, 5) interpretación de resultados, 6) sueros de referencia, y 7) especifici-
dad y avidez de los ANA. El Comité de Estandarización de ANA de la
Organización Mundial de la Salud recomienda que 1) los laboratorios debe-
rían comunicar los resultados IF-ANA a ambas diluciones, 1:40 y 1:60, y 2)
deberían proporcionar información del porcentaje de individuos normales
que son positivos a esas diluciones dentro de su propia experiencia (Tan.
1997).
Bylund y Nakamura (1991) han mostrado la importancia de la detección
de los autoanticuerpos SS-A/Ro en las pruebas de cribaje de autoanti-
cuerpos frente a antígenos nucleares. La detección de anti-SS-A/Ro
requiere de la implantación y cumplimiento de varias recomendaciones téc-
nicas y de garantía de calidad. Con el uso de las células de sustrato apro-
piadas que contengan el antígeno SS-A/Ro, muchos de los llamados
pacientes lupus eritematoso ANA-negativos mostrarán resultados positivos
en la inmunofluorescencia indirecta, Los análisis de inmunoprecipitina y
doble inmunodifusión (ID) se han utilizado para determinar la especificidad
de varios ANA. La especificidad del ensayo en doble inmunodifusión
depende generalmente de la calidad de los otros sueros control usados en
el procedimiento, asi como de la naturaleza de la preparación del antige-
no. Las pruebas de inmunodifusión no son muy sensibles. Las pruebas de
inmunodifusión positivas tienen un alto grado de especificidad como mar-
cador diagnóstico en ciertas enfermedades reumáticas Existen equipos
comerciales de inmunodifusión disponibles para la detección de anticuer-
pos frente a RNP. Sm, SS-A/Ro. SSS-B/La y Scl-70, asi como otros mar-
cadores menos comunes (Nakamura, 1994b). En la pasada década se han
desarrollado un número creciente de enzimoinmunoanálisis con el uso de
antígenos estándar purificados y recombinantes (Saitta, 1992). Muchos de
estos enzimoínmunoanálisis han demostrado ser más sensibles que los
métodos de inmunodifusión análogos. Asi, debido a la alta sensibilidad de
los enzimoínmunoanálisis, se necesita determinar el rango de referencia de
pacientes normales y los valores discriminantes apropiados. Comparadas
con las pruebas de inmunodifusión. las pruebas ELISA mostraron una sen-
sibilidad mucho mayor pero tenían una especificidad menor (Nakamura,
1992). Además, las pruebas ELISA eran frecuentemente positivas en títu-
los bajos para anticuerpos en sueros de pacientes con enfermedades reu-
máticas que no fueran LES. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos fren-
te a Sm en pruebas de inmunodifusión se considera como altamente
especifica para LES. Sin embargo, en las pruebas ELISA el anlicuerpo Sm
Tabla 43-8 Tabla d e decisión para la identificación de algunos
autoanticuerpos u s a n d o células HEp-2 y su asocia-
ción con la e n f e r m e d a d
1 Patrón nuclear
Envoltura (bordo)
Punteado, figura mitótica negativa -> CBP
Continuo, figura mitótica negativa -> enfermedades hepáticas
crónicas
Homogéneo, figura mitótica negativa -> LES, LES inducido por
medicamentos
Moteado
Grande -> hnRNP en LES,
Grueso -> Sm, RNP en LES. MCTD
Fino -» SS-A/Ro. SS-B/La en LES. SS
Pleomorfo -» PCNA en LES
Discreto
Figura mitótica positiva - * centrómero en SCL
Figura mitótica negativa -> p95 en PBC
2 Patrón nucleolar
Homogéneo -> PM-Scl en SCL
Con grumos -> librilarma en SCL
Moteado
Figura mitótica punteada -»ARN pol I. NOR-90 en SCL
Figura mitótica homogénea -» Scl-70 en SCL
3 Patrón citoplasmático
Manchas densas finas -•Jo-1. PL-7 PL-12 en PM/DM
Homogéneo -> rRNP en LES
Fibrilar -> actina, miosina en MCTD, CBP, HCA
Segmentario -> a-actinma, vinculina en MG. EC, CU
Reticular -> mitocondna en CBP
Polar -> Golgi en SS, LES, infecciones virales
Aparato fusiforme -> NuMA en SS, mediocuerpo, p330' en cáncer
CBP= Cirrosis biliar primaria: LES = lupus eritemaloso sistomico: MCTD =
enfermedad del tejido conectivo mixto. SS = síndrome de Siogron, SCL =escle-
rodermia. PM = polimiosilis; DM = dermatomiositis; HCA = hepatitis crónica
i autoinmune, EC = enfermedad de Crohn: CU = colitis ulcerosa. PCNA » antí-
geno nuclear de células proliferativas; NuMA = aniigeno nuclear milOlico-asc-
ciado
Modificado de Krapl AR. von Mutilen CA Krapf FE. y coi: Atlas ol Immunofluo-
^rescent Autoaniibodies. Munich. Urban & Schwarzenberg, 1996 con permiso J
 CAPÍTULO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS 983
Tabla 43-9 Clasificación de patrones citoplasmáticos en inmunofluorescencia indirecta
Patrones citoplásmicos Enfermedades y
en IIF (substrato celular) Antígenos representativos asociaciones clínicas
1. Fibroso
Fibras de estrés libras lineales Actina, míosina no muscular Ambos en hepatitis crónica activa,
citoesqueléticas. algunas veces cirrosis hepática y miastenia gravis: actina en hepatitis
con depósitos granulares pequeños autommune. enfermedad de Crohn СВР. hemodiálisis
(HEp-2. fibroblastos) a largo plazo. SHN. pero raro en DCTD
Filamentoso- filamentos y fibrillas Vimentina. queratina Antivimentina a menudo causada por reacción cruzada
separándose del borde nuclear con anticuerpos anti-hélix en muchas clases de
(HEp-2, PIK2 cólulas epiteliales) condiciones inlecciosas o inflamatorias, y en
hemodiálisis a largo plazo; raro en DCTD, ambos
vistos en SHN: la queratina es sistema principal en
EHA (69%). también común en DCTD y psoriasis
Segmental - sólo pequeños a-actinma, vinculina. tropormosina Miastenia gravis. enfermedad de Crohn. colitis ulcerosa
segmentos de fibras (cuerpos
densos periódicos) están decoradas
(HEp-2. fibroblastos)
2. Moteado
Moteado tino: pequeñas motas Muchas de las ammoacil-RNAt-sintetasas. PM: "sindrome Jo-1" (miositis y enlermedad pulmonar
esparcidas, la mayoría con londo principalmente Jo-1 intersticial)
homogéneo o moteado denso fino (HEp-2)
Moteado denso tino nuboso, casi rRNP. fosfoproteinas ribosomales LES neuropsiquiátrico
homogéneo en todo el citoplasma (HEp-2)
Polo granular, perinuclear, en forma Aparato de Golgi Raro en LES, SS y otras enfermedades reumáticas
de flecha, granular grueso, correspondiente sistémicas; descrito en ataxia cerebelosa idiopàtica,
a los apilados laminares del complejo degeneración cerebelosa paraneoplásica e infecciones
Golgi (HEp-2) virales, incluyendo EBV y VIH
Reticular gruesa reticular grueso difuso Proteínas en la membrana mitocondnai CBP; esclerosis sistèmica (43%). raro en otras DCTD.
interna (M2 principalmente) anticuerpos del centròmero están frecuentemente
y granular (HEp-2)
asociados
Pequeños moteados esparcidos: Lisosomas o peroxisomas Ninguno reconocido
irregularmente distribuidas molas
citoplasmáticas contables (HEp-2)
Reticular lino - reticular lino difuso y granular Retículo endoplásmico(¿); otras proteínas EHC. detectado en todos los tipos de condiciones
(HEp-2) desconocidas inflamatorias (crónicas)
AWCA-pANCA tinción perinuclear Dianas pANCA Descrito primero en vasculitis sistémica con
irregular; cANCA: motas densas, mieloperoxidasa. cANCA glomerulonefritis necrolizante y enfermedad
finas o gruesas (granulocitos de sangro dianas PR3 (proleinasa 3) pulmonar inflamatoria: granulomatosis de Wegener
periférica, línea celular de leucemia HL-60) (cANCA) y otras vasculitis necrotizantes (pANCA);
catepsma-G es el antigeno principal en colilis
ulcerosa, enfermedad de Crohn y colangitis
primaria esclerosante hepatitis autommune;
vasculitis en terapia PTU: recientemente descrito
en AR (32%). IgM ANCA en tuberculosis y malaria
ANCA = anticuerpos citoplásmicos antineutrotilos, EHA = enfermedad hepática alcohólica; EHC = enlermedad hepática crónica. DCTD • enfermedad ditusa del tejido conec-
tivo; EBV = virus EpsteinBarr; VIH = virus de inmunodeficiencia adquirida; IIF = test de mmunolluorescencia indirecta. SHN • suero humano normal; CBP = cirrosis biliar pri-
maria: PM = polimiositis. PTU - propiltiouracilo. RNP • ribonucleoproleina, SS = sindrome de Sjogren: LES • lupus eritemaloso sistemico
Modificado de von Múhlen CA, Tan EM Autoantibody specificities in autoimmune rheumatic diseases Rev Bras Rheumatol 1994 34:173. con permiso

era positivo en el 23% de 54 pacientes AR, 25% de 24 pacientes con escle-
rosis sistémica, 9% de 11 pacientes con polimiositis, y el 2% de 59 pacien-
tes normales (Maddison, 1985). Una sensibilidad creciente y una especifi-
cidad decreciente podrían provocar falsos positivos en las pruebas.
Ademas, se determinaron asociaciones clínicas con distintos anticuerpos
principalmente utilizando técnicas de ID.
VARIACIONES EN LAS METODOLOGÍAS USADAS
PARA LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE
A ANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
Los mejores estudios referentes a los diferentes métodos para la detección
de autoanticuerpos frente a antigenos intracelulares fueron descritos por un
Grupo de Estudio de Consenso Europeo. El Grupo de Estudio de Consenso
Europeo para la Detección de Autoanticuerpos frente a Antígenos Intracelulares
en Enlermedades Reumáticas se formó en 1988 y ha dirigido cuatro talleres
anuales desde 1989 hasta 1992 (Charles. 1992; Van Venrooij, 1991). En 1988
y 1989, se dirigieron talleres de consenso para definir la concordancia entre
laboratorios en la detección de especificidades de autoanticuerpos en enferme-
dades reumáticas. Veintiocho laboratorios participaron en el estudio y utilizaron
diversas metodologías. Los objetivos del estudio del consenso iniciado en 1989
fueron 1) definir el consenso entre laboratorios en cuanto a la detección de
autoanticuerpos y especificidades. 2) probar si las discrepancias eran debidas
a la metodología utilizada, y 3) hacer recomendaciones para la calidad mejora-
da de resultados con sensibilidad mejorada y mayor especificidad.
Enzimoinmunoanálísis
En los estudios de 1988 y 1989. se observaron muchas reacciones falso-
positivas. Las reacciones falso-positivas estaban causadas por reactivos
bloqueantes de baja calidad en el proceso; también, se usaban preparacio-
nes de antigeno impuro. En el estudio de cooperación de 1990 y 1991. el
laboratorio que usaba ELISA funcionó muy bien, con pocos falso-positivos o
resultados negativos extraños. Los ELISA también funcionaron bien al cla-
sificar los sueros con múltiples especificidades. El porcentaje de laborato-
SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
CAPÍTULO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS

Figura 43-2. Inmunolluorescencia indirecta de células HEp-2 con auloanticuerpos para distinguir amígenos citoplasmáticos (x400. mancha
FITC). A. Se observa el patrón característico de autoanticuerpos frente al aparato de Golgi. con granulos organizados en grupos en un poio
de la célula y respetando los núcleos. B. Los autoanticuerpos frente a miosina no muscular adornan las fibras de estrés del citoesgueleto.
Estos autoanticuerpos se encuentran en pacientes con miastenia gravis y enfermedades hepáticas crónicas. C, Autoanticuerpos antimito-
condriales presentan un patrón granular grueso que incluye todo el citoplasma, observado sobre todo en cirrosis biliar primaria. Distintos pun-
tos en el nucleoplasma obtenidos por el suero utilizado están determinados probablemente por una segunda población de autoanticuerpos
dirigidos contra un antígeno mtranucleoplásmico, un fenómeno no poco habitual en pacientes con enfermedades hepáticas. D. El patrón cito-
plasmático granular denso, casi homogéneo, obtenido con anticuerpos anti-r RNP. Ellos se dirigen a fosfoproteinas nbosomales. y se aso-
cian clínicamente con manileslaciones del sistema nervioso central en pacientes con lupus eritematoso sistémico. Como se puede ver en el
dibujo, no es infrecuente que estos anticuerpos también tiñan el nucléolo en un patrón homogéneo, aunque débilmente. (De von Mühlen CA.
Tan EM: Autoantibody specilicilies in autoimmure rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173; con permiso.)

Figura 43-1. Inmunolluorescencia indirecta con autoanticuerpos frente a antígenos nucleares y nucleolares en células HEp-2 (x40C. mancha
FITC) A, Autoanticuerpos frente a proteínas laminares A, B y C de la envoltura nuclear dan un patrón homogéneo nuclear en células HEp-2,
asociados con un borde nucleoplásmico continuo. No se observa ningún borde cuando los anticuerpos se dirigen contra histonas o ds-ADN.
Los artículos previos sobre un patrón periférico obtenido por anticuerpos anti-ds-ADN probablemente se debían a arielactos de fijación. El
patrón nucleoplásmico moteado que se ve en fies característico de autoanticuerpos dirigidos contra antígenos nucleares extraibles. como el
anli-U1-nRNP mostrado aqui. Los nucléolos y las células en metafase son negativos. C, Autoanticuerpos anticenlrómero, observados típica-
mente en pacientes con la forma limitada de esclerodermia (síndrome de CREST). pero también en cirrosis biliar primaria. Se observan dis-
tintas manchas en el núcleo en interfase. una por cada par de cromosomas, que se reúnen en las placas de metafase durante la división de
la célula (en el centro dos células en telofase). Autoanticuerpos frente a NOR-90 y ARN-polimerasa I obtienen el mismo patrón en células
HEp-2 (D). con motas nucleolares y puntos a lo largo de algunos husos de las células en metafase (en las dos células dividiéndose en el cen-
tro). Pueden diferenciarse por otros ensayos, como la mmunotransferencia o la mmunoprecipítación. Los autoanticuerpos que se dirigen con-
tra la fibrilarina (U3-nRNP) liñen de forma grumosa lodos los nucléolos (£). (De von Múhlen CA. Tan EM: Auloantibody specificities in autoim-
muñe rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173: con permiso.)
986 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

Figura 43-3. Algunos otros patrones distintos en ¡nmunofluorescencia indirecta de células HEp-2 (x 400, mancha FITC). A. Células al final de
la metalase muestran antigenos que se condensan en la mitad del cuerpo, también lamada la región de puente intercelular. Los polos del
huso de las células en división pueden estar adornados, como en 0, con anticuerpos frente al aparato mitótico. como NuMA (proteina nucle-
ar asociada a la mitosis). Los autoanticuerpos PCNA ofrecen un mosaico de patrones nucleoplásmicos (C), que oscilan desde homogéneos
a distintos moteados, según las fases de la división celular (detalles en el texto). D, El patrón obtenido con autoanticuerpos anti-p80-coilín,
donde se pueden ver de una a ocho manchas nucleoplásmicas. (De von Mühlen CA, Tan EM: Autoantibody specilicities in autoimmune rheu-
malic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173, con permiso.)

Tabla 43-10 M é t o d o s d e detección de anticuerpos contra antígenos nucleares e intracelulares

Método Extracción del antigeno Sensibilidad y utilidad
Inmunofluorescencia con microscopía (IFM) Sección tisular, lineas celulares Técnica sensible, utilizada a menudo como detección precoz
Inmunodilusión doble (ID) Tejido y extractos celulares Necesita una reacción de precipitación, alta especificada
pero baja sensibilidad
Recuento por mmunoelectroloresis Tejido y extractos celulares Elevada sensibilidad y velocidad comparada con las técnicas
de ID
Inmunoblot; Western blot (IB. WB) Extractos celulares Alta sensiblidad, permite la detección de anticuerpos Irente
a antigenos solubres c insolubles
ELISA Antígenos nativos purificados Alta sensibilidad y cuantilicación. puede determinar la clase
o recombinantes de anticuerpo
From Nakamura RM. Bylund DJ. Ian EM: Curent status ol available standards for quality improvement ot assays tor the detection of autoantibodies to nuclear and intra-
cellular antigens J Clin Lab anal 1994b: 8:360. con autorización.
 CAPÍTULO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
1 2 3 4
SDS-PACI : l- • yol
t u r a d o «Ir iinli|>i'iiii: I I K L I la célula VIOIT-4
Sislenia lie ili'li'ccii'in: l-pnuciiiu A
Figura 43-4. Ensayo de immunotranslerencia de autoanticuerpos comunes obser-
vados en enfermedades reumáticas. En la banda 1 la zona de nitrocelulosa fue
investigada en un suero humano normal (control negativo), no apreciándose ningu-
na reactividad, tal y como se esperaba. Las siguientes 3 bandas muestran distintas
franjas obtenidas por sueros controles positivos mezclados conteniendo especifici-
dades conocidas. La banda 2 representa reactividades con las nbonucleoproteinas
(RNP) SSA (52 y 60 kOa), SSB (48 kDa), Sm (B/B\ 28 kDa, y D. 14 kDa) y U1-nRNP
(la proteína de 70 kDa y una franja tenue alrededor 0e 19 kDa. el antigeno C; la pro-
teína A. con 32 kDa y también reconocida de modo característico por anticuerpos
U1- nRNP. no se ve en este experimento). La banda 3 muestra las franjas obtenidas
usando los prototipos de antisueros humanos frente a Jo-1 (52 kDa), Ku (dos ban-
das alrededor de las regiones de 70 y 80 kDa) y RNP ribosomal (15, 18 y 37 kDa).
La pequeña franja por encima del antígeno de 52 kDa no está identificada. La ban-
da 4 presenta las Iranias vistas más comúnmente utilizando sueros de pacientes con
esclerodermia, por ejemplo, anti-ADN topoisomerasa I (Scl-70. 95 kDa), y anticuer-
pos anticentrómero (16 kDa. CENP-A, y 80 kDa. CENP-B). A la derecha, se pueden
ver posiciones en kilodaltons del amplio rango de pesos moleculares estándares.
(De von MUhlen CA. Tan EM Autoantibody specificities m autoimmune rheumatic
diseases. Rev Bras Rheumatol 1994: 34:173, con permiso.)
ños clínicos que usaban ELISA aumentó del 25% al 47% durante un perio-
do de cuatro años, de 1989 a 1992. Homburger (1998) publicó una compa-
ración enlre un ELISA comercial y IF-ANA sobre células HEp-2, concluyen-
do que ambos métodos eran sustancialmente equivalentes para detectar
ANA clínicamente relevantes en pacientes con enfermedades reumáticas
sistémicas. Llegando a la conclusión opuesta, Emlen (1997) probó seis
equipos de ELISA comerciales y sacó como consecuencia que existían dife-
rencias significativas en la detección de ANA por inmunofluorescencia y ELI-
SA. Un grupo de científicos internacionales reunidos por la Organización
Mundial de la Salud llevaron a cabo la realización de muchos ELISA comer-
ciales, mostrando que 1) ningún fabricante en particular era claramente
superior a otros en lo que se refería a la sensibilidad, especificidad y preci-
sión de sus productos y 2) las áreas que necesitaban mejora estaban en los
equipos para la detección de anticuerpos frente a ds-ADN y antigenos Sm
(Tan. 1999). Se debe tener gran cuidado a la hora de seleccionar reactivos
ELISA y equipos comerciales. Una buena fuente de datos de control de cali-
987
dad para los mejores reactivos comerciales es la revisión periódica del
Colegio de Inmunopatólogos Americanos.
Inmunotransferencia
Esta técnica es muy sensible y es un importante método para la caracteri-
zación de la naturaleza específica de muchos de los autoanticuerpos. Una
importante ventaja del método es que un anticuerpo especifico puede ser
identificado mediante preparaciones de extractos de antígeno de células
natural (Fig. 43-4). El Estudio de Consenso Europeo observó lo siguiente con
el procedimiento de inmunotransferencia (Nakamura, 1994b):
1. La preparación del antígeno es muy importante en el procedimiento de
inmunotransferencia
2. La detección de anticuerpos frente a nRNP. Sm y Scl-70 fue aceptable.
Este método sensible es útil en la detección de múltiples especificidades
de anticuerpo en la misma muestra.
3. El método requiere controles cuidadosos a las bandas de peso molecular.
Por ejemplo, las bandas de histona pueden ser confundidas con un anti-
geno centromérico (CENP-A, 19 kDa) y Scl-70 (topoisomerasa I) puede
ser confundido con otras bandas de100 kDa.
4. La degradación de proteínas puede producirse en el extracto de células de
antigeno usadas para inmunotransferencia, especialmente Scl-70 y anti-
genos de centrómero.
5. El anti-Sm se distingue por la presencia de anti-D (el antigeno D es una
proteína de 16 kDa contenida en todas las partículas principales nRNP).
6. Anti-SS-B/La se detecta enseguida por inmunotransferencia. Anti-SS-A'Ro
se detecta mal por inmunotransferencia y es insensible, porque SS-A'Ro
puede no demostrar la estructura apropiada para el reconocimiento.
RESUMEN
Hay muchos tipos de autoanticuerpos trente a antigenos intracelulares y
nucleares en las diversas enfermedades reumáticas sistémicas. Normalmente,
se considera importante no sólo detectar la presencia y cantidad del autoanti-
cuerpo intracelular y nuclear en el paciente, sino también identilicar la especifi-
cidad inmunológica. Estudios anteriores han mostrado que distintos perfiles
diagnósticos de los autoanticuerpos se observan en muchas de las enfermeda-
des reumáticas. Algunas de las enfermedades se caracterizan por la presencia
o ausencia de un anticuerpo especifico, o por diferencias en el nivel cuantitati-
vo o titulo del anticuerpo. Se ha progresado mucho en mejorar la sensibilidad,
especificidad y control de calidad de las diversas pruebas de laboratorio para la
detección de autoanlicuerpos frente a antígenos intracelulares y nucleares. Los
biólogos moleculares han utilizado muchos de los anticuerpos como sondas
biológicas y han aclarado las lunciones biológicas de varios de los autoantíge-
nos. Se ha progresado mucho en el conocimiento de la patogénesis y meca-
nismos inmunes en las enfermedades reumáticas.
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 CAPÍTULO 43 • EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
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 C A P Í T U L O
Vasculitis
Rex M. McCallum, M.D.
David J. Bylund, M.D.
CLASIFICACIÓN 990
PATOGÉNESIS DE LA VASCULITIS 990
PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE PRUEBAS
CLÍNICAS DE LABORATORIO 991
Pruebas de rutina
Pruebas especiales
Algunos patrones de prueba en vasculitis
ANTICUERPOS ANTINEUTRÓFILOS
CITOPLASMÁTICOS 992
Métodos de detección
Especificidad antigénica
Asociaciones con enfermedad
Interpretación de la prueba
Las manileslaciones clínicas y patológicas de la vasculitis necrotizante sis-
témica son proteicas. Los clínicos se enfrentan a un paciente que presenta
una serie amplia de síntomas y/ o signos confusos y contradictorios. El diag-
nóstico de un síndrome vasculitico necrotizante sistémico requiere una eva-
luación minuciosa que relacione la historia de un determinado paciente y la
exploración física con los datos de laboratorio. Aunque la vasculitis se puede
producir en cualquier zona del cuerpo, se han definido patrones distintos de
la enfermedad y su tipificación apunta hacia alteraciones determinadas. El
diagnóstico específico es importante porque el Iratamiento y el pronóstico
dependen de los lugares y patrones de la afectación del órgano (Langford.
1995).
La vasculitis necrotizante sistémica puede definirse patológicamente como
una inflamación causante de lesiones vasculares. Estas lesiones pueden incluir
la proliferación de células íntimas dentro de la luz de los vasos, estrechando o
incluso cerrando ese espacio y causando isquemia y un posible infarto de
estructuras anatómicas distales al lugar del daño vascular. También, la pared
del vaso puede debilitarse hasta formarse un aneurisma o la ruptura del vaso.
La vasculitis idiopática (primaria) se produce cuando el daño inflamatorio
vascular es el principal hallazgo clinicopatológico y no hay enfermedad sub-
yacente. La vasculitis secundaria se produce cuando las lesiones vasculares
acompañan a una enfermedad subyacente (Tabla 44-1). El foco de este capí-
tulo es la vasculitis idiopática y aquellas pruebas clínicas de laboratorio útiles
para su diagnóstico y tratamiento. Como los métodos de diagnóstico y trata-
miento en los sucesos vasculares secundarios se centran en las enfermeda-
des subyacentes, se tratan en los capítulos correspondientes de este libro.
Sin embargo, los comentarios relacionados con la valoración de laborato-
rio del daño en el órgano distal en la vasculitis idiopática están relacionados
con la vasculitis secundaria.
44
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SÍNDROMES
VASCULÍTICOSIDIOPÁTICOS 993
Poliarteritis nodosa
Variantes de PAN
Síndrome de Churg-Strauss
Síndrome mixto de poliangeítis
Granulomatosis de Wegener
Granulomatosis linfomatoide
Púrpura de Henoch-Schónlein
Arteritis de células gigantes (temporal)
Arteritis de Takayasu
Angeítis primaria del sistema nervioso central
Enfermedad de Kawasaki
RESUMEN 998
BIBLIOGRAFÍA 998
CLASIFICACIÓN
No existe un sistema de clasificación estándar ampliamente aceptado para
las afecciones vasculares idiopáticas. Históricamente, su clasificación se ha
basado en varias combinaciones de hallazgos clínicos y patológicos (Jennel-
te, 1998, 1997). aunque en los últimos años las clasificaciones activas han
mejorado debido a los resultados en la nomenclatura estándar (Hoffman.
1998; Hunder, 1990; Jennette, 1994). El esquema de clasificación que apare-
ce en la Tabla 44-2 está modificado a partir del utilizado en los Institutos
Nacionales de Salud (NIH) (Langford, 1995).
PATOGÉNESIS DE LA VASCULITIS
Ni la etiología ni la patogénesis de las afecciones vasculares se conocen
excepto en los ejemplos de daño directo en los vasos sanguíneos por infec-
ción vascular, o vasculitis secundaria. La mayoría de las alecciones vascula-
res idiopáticas se atribuyen a daños vasculares mediados por la inmunidad
inducidos por alguno de varios mecanismos, incluyendo: 1) depósitos inmu-
nocomplejos; 2) autoanticuerpos directos ligados o a estructuras de las pare-
des de los vasos (p. ej., endotelio o antígenos de la membrana basal) o a neu-
trófilos cuando la vasculitis está asociada con el anticuerpo antineutrófilo
citoplasmático (ANCA); y 3) inflamación mediada por células T. Los efectos
patogénicos de todos estos mecanismos se unen en una vía final común de
daño vascular que activa los mediadores humorales y celulares de la infla-
mación. Las moléculas de adhesión que están involucradas en la respuesta
inmune normal parecen intervenir en las respuestas inmunes patológicas
 CAPÍTULO 44 • VASCULITIS 991

Tabla 44-1 Afecciones vasculares necrotizantes sistémicas Tabla 44-3 Anticuerpos a s o c i a d o s con vasculitis
secundarias
Asociación Prueba principal
Vasculitis relacionada con medicamentos Anticuerpo con e n f e r m e d a d Métodos
Vasculitis relacionada con proteínas extrañas ANCA (generalmente Granulomatosis IFM. ELISA
Vasculitis asociada con infección c-ANCA) de Wegener
Vasculitis en neoplasias malignas ANCA (c-ANCA o Poliarteritis microscópica IFM, ELISA
Granulomatosis linlomatoido p-ANCA)
Vasculitis urticarial hipocomplementémica Anticuerpos anli C1q Vasculitis urticarial unión C1 q
Púrpura hipergammaglobulinémica hipocomplementémica
Vasculitis cnoglobulinémica Anticuerpos antihepatilis B PAN asociado a hepatitis B ELISA
Vasculitis por radiación Anticuerpos antinucleares Lupus eritematoso sistemico IFM. ELISA
Vasculitis por trasplante (rechazo vascular) (ANA)
Vasculitis asociada a enfermedades del tejido conectivo Crioglobulmas mezcladas Vasculitis cnoglobulinémica Cnoprecipi-
Artritis reumatoide tación,
Lupus eritematoso sistèmico IEP.IF
Síndrome de Sjogren SSA (Flo). SSB (La) Sindrome de S|ógren IFM. ELISA, ID
Esclerodermia Factor reumatoide Artritis reumatoide LA, ELISA
Dermatomiositis/ polimiosilis ANCA = autoanticuerpos antineulróMos citoplasmaticos; c-ANCA = ANCA oto-
Sarcoidosis plasmáticos ELISA • ensayo inmunosorbente ligado a enzimas: GBM • mem-
brana basal glomerular. ID = inmunodilusion, IEP = inmunoelectroforesis; IF =
Policondritis recidivante inmunofijación IFM = microscopía de inmunoflorescencia indirecta; LA • aglu-
Síndrome del anticuerpo anlilosfolipido tinación del látex. p-ANCA = ANCA perinuclear; PAN = poliarteritis nodosa.
Enfermedad de Behcet
Adaptado de Langford CA, McCallum RM Idiophatic vasculitis. In Belch JJF
Zurier RB (eds): Connective Tissue Diseases London. Chapman & Hall, 1995 mente, la confirmación histológica o angiográfica de la vasculitis debería obte-
pag 179. con permiso nerse de una biopsia de tejido o angiografia para el diagnóstico definitivo pre-
vio a la terapia (Mandell. 1994).
Las pruebas clínicas de laboratorio tienen un valor limitado en el estableci-
observadas en la vasculitis. Se observan anormalidades cuantitativas y cualita- miento de un diagnóstico específico de la vasculitis (Mandell. 1994), aunque
tivas en la producción de citocinas en la vasculitis sistémica. Se han descrito los clínicos usan estas pruebas como ayuda en la identificación de los patro-
niveles aumentados de interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6. factor a de necrosis nes de la implicación del órgano característico de la vasculitis, evaluando el
tumoral (TNF-(x) y TNF-J5 (Arimura, 1993: Grau, 1998), asi como una produc- alcance y la gravedad del daño en el órgano final, diferenciando la vasculitis
ción aumentada de TNF-u por las células mononucleares circulantes (Deguchi, idiopática de las formas alternativas secundarias y estableciendo los valores
1990). Estos mediadores inician la infiltración de células inflamatorias, la acti- básales para su tratamiento. La asociación de ANCA con ciertas afecciones
vación del complemento y cascada de la coagulación, y la regulación ascen- vasculares idiopáticas se ha convertido en una importante ayuda en el diag-
dente de otras moléculas inflamatorias (Conn, 1993: Niles. 1995: Snellen 1997). nóstico y tratamiento. Los ANCA se tratan con detalle a continuación.
Cuando se evalúa a un paciente cuyo diagnóstico diferencial incluye vas-
culitis, resultan útiles los siguientes principios relativos al uso e interpretación
PERSPECTIVA SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLÍNICAS de las pruebas clínicas de laboratorio.
DE LABORATORIO
Pruebas de rutina
Cuando se evalúan pacientes con una enfermedad multisístémica compli-
Los pacientes cuya historia y exploración física sugieren vasculitis idiopáti-
cada, el objetivo del clínico es el diagnóstico correcto hasta un nivel que per-
ca a menudo presentan una serie confusa de dolencias multisistémicas que
mita un tratamiento adecuado. Como no existe una clínica patognomónica ni
han venido sucediendo durante algún tiempo. Las pruebas de primer orden
rasgos de laboratorio de la vasculitis, el clínico debe utilizar combinaciones de
que hay que considerar incluirían las siguientes: cultivos para agentes infec-
hallazgos clínicos y de laboratorio para reconocer los patrones de la enfer-
ciosos, si el paciente tiene fiebre; recuento completo de sangre (CBC) con
medad. Esto puede permitir un diagnóstico específico o, más comúnmente, la
recuento diferencial; velocidad de sedimentación globular (VSG); análisis de
clasificación de la enfermedad del paciente como una dentro de un grupo de
orina: panel químico de la sangre; y pruebas para la función de un órgano
trastornos vasculíticos con tratamiento similar, incluso cuando no se identifica
específico, como el hígado.
ninguna entidad específica.
Decidir si un paciente tiene vasculitis basándose estrictamente en los sín-
Pruebas especiales
tomas clínicos conlleva riesgos debido al amplio número de posibilidades de
diagnóstico diferencial y la falta de hallazgos patognomónicos. Consecuente- Las pruebas especiales ayudan a diferenciar la vasculitis idiopática de las
alternativas en el diagnóstico diferencial activo. Las pruebas relevantes de
laboratorio incluirían aquellas que identifican los auloanticuerpos circulantes
que se enumeran en la Tabla 44-3 e inmunocomplejos. La biopsia tisular diri-
Tabla 44-2 Afecciones vasculares necrotizantes sistémicas gida para la confirmación histológica de la vasculitis y/o la angiogralía se con-
idiopáticas (primarias) sideran las pruebas definitivas para la vasculitis idiopática.
Vasculitis de pequeños vasos
Granulomatosis de Wegener Algunos patrones de prueba en vasculitis
Púrpura do Henoch- Schónlem
Angeitis primaria del sistema nervioso central Son útiles ciertos patrones de resultados de pruebas clínicas de laborato-
Vascuhlis de vasos medianos rio:
Síndrome de Churg- Strauss • El hallazgo de leucopenia y/o trombocitopenia en afecciones vasculares
Poliarteritis nodosa idiopáticas es raro y sugiere diagnósticos alternativos tales como lupus eri-
Enlermodad de Kawasaki tematoso sistémico (LES), neoplasia, alteraciones de la médula ósea, gra-
Vasculitis de vasos grandes nulomatosis linfomatoide o hiperesplenismo (Mandell. 1994).
Arteritis de células gigantes (temporal) • VSG. aunque es un hallazgo no específico, está típicamente elevada en
Arteritis de Takayasu
afecciones vasculares idiopáticas. Si la VSG no está elevada antes del tra-
 992 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

tamienlo, el diagnóstico no es arteritis de células gigantes (temporal) o gra-

nulomatosis de Wegener (WG).
• Puede verse vasculitis con rasgos histológicos de poliarteritis nodosa (PAN)
asociada con pancitopenia en pacientes con leucemia de células peludas
(Mandell, 1994).
1
Anemia con hemoglobina por debajo de 9 g/dl se produce por circunstan-
cias distintas que la anemia de la enfermedad crónica, tal como la hemoli-
sis, el sangrado oculto o la enfermedad renal (Mandell, 1994).
1
Cuando se sospecha PAN, deberían realizarse las pruebas para la función
hepática, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV) y cito-
megalovirus (CMV) (Golden, 1994; Mandell, 1994). De forma similar, son
apropiadas las pruebas serológicas para los virus de la hepatitis B y C
cuando un paciente tiene crioglobulinas, vasculitis leucocitoclástica o biop-
sia cutánea y / o enfermedad renal.
Creatina-cinasa (CK) en sangre elevada puede indicar miositis o isquemia
muscular (Mandell, 1994).
Figura 44-1. Patrón de anticuerpo citoplasmàtico antineutrófilo citoplasmático
Las pruebas para los anticuerpos antinucleares (ANA) y el factor reumatoi-
(c- ANCA). La mayoría de los neutrófilos fijados con etanol muestran una fluores-
de (FR) son útiles sólo cuando se sospecha enfermedad del tejido conecti-
cencia citoplasmàtica finamente granular con acentuación central No hay tinción
vo o artritis. nuclear (x 400).
Pacientes con vasculitis reumatoide tienen un alto título de FR.
La eosinofilia en sangre periférica se produce en una amplia variedad de
alteraciones inflamatorias. Alrededor del 15% al 20% de los pacientes con
PAN o WG pueden tener eosinofilia pero no con los altos niveles vistos en demuestran tinción citoplasmática y 3) no especificidad por los neutrófilos (p.
el síndrome de Churg- Strauss (CSS). ej., los linfocitos en el portaobjetos no deberían teñir cuando el verdadero
La identificación de ANCA citoplasmático (c-ANCA) apoya el diagnóstico de ANCA está presente) y 4) granularidad citoplásmica heterogénea (Roberts,
WG en pacientes con hallazgos clínicos de WG (Mandell, 1994). 1992; Saviage, 1998).
Pacientes con WG no tratados no tienen leucopenia El p-ANCA se caracteriza por la tinción del área perinuclear (Fig. 44-2).
En la primera orina de la mañana, tanto antes como después de la centri- aunque la tinción nuclear mimetizando ANA puede producirse cuando existen
fugación, se deberían examinar cuidadosamente las proteínas, hematuria, títulos altos de este autoanticuerpo (Niles, 1993). El patrón de tinción perinu-
células y cilindros que acompañan a la glomerulonefritis que se puede pro- clear que define p-ANCA está causado por la redistribución de los antigenos
ducir en las afecciones vasculares. Si la amiloidosis renal está en el diag- diana desde el citoplasma neutrófilo hasta la región nuclear cuando se usa
nóstico diferencial, existe de forma típica proteinuria sin células. etanol para preparar neutrófilos humanos como sustrato (Jennette, 1993).
Cuando se utiliza formalina antes que alcohol para fijar neutrófilos. el antige-
no diana se inmoviliza, y el patrón de tinción inmunofluorescente entonces es
ANTICUERPOS ANTINEUTROFILOS CITOPLASMATICOS citoplasmático (Jennette, 1993). El papel del uso de neutrófilos fijados con for-
malina para detectar ANCA en la labor diagnóstica de rutina sigue siendo una
Los ANCA reaccionan con antígenos neutrófilos citoplasmáticos (Jennette, controversia (Chowdhury, 1999).
1993). La identificación de ANCA se ha convertido en un importante acceso-
rio para el diagnóstico de la vasculitis sistémica necrotizante (Niles, 1993). En
Especificidad antigénica
los últimos años, ha habido también un gran interés en cómo ANCA puede ser
importante en la patogénesis de WG y otras afecciones vasculares sistémicas La especificidad antigénica de c- ANCA se ha identificado como una serín
(Jennette, 1993,1994). proteasa nuclear de 29 kDa, proteinasa 3 (PR-3), situada dentro de granu-
los primarios de neutrófilos y lisosomas de monocitos (Niles, 1993; Roberts,
Métodos de detección 1992). El p-ANCA en vasculitis se debe generalmente a anticuerpos frente
a mieloperoxidasa ¡MPO-ANCA) (Falk, 1988). De manera interesante, mu-
Existen varios métodos de laboratorio incluyendo la microscopía de fluores- chos p-ANCA no se dirigen hacia MPO pero bastantes se dirigen a otros
cencia indirecta (IFM), enzimoinmunoanálisis (ELISA), radioinmunoanálisis.
transferencia western. transferencia en marcha, citometria de flujo e inmunopre-
cipitación que se han utilizado para detectar ANCA (Roberts. 1992; Wieslander,
1991). IFM y ELISA son los métodos de prueba usados más comúnmente con
este fin. El IFM es el método más sensible para la detección de ANCA.
IFM se realiza utilizando neutrófilos humanos normales aislados como sus-
trato. Estos neutrófilos son citocentrifugados frente a portaobjetos de cristal
multiperforado, fijados con un 99% de etanol, y después incubados con dilu-
ciones de sueros de pacientes. Los neutrófilos también pueden sujetarse a los
portaobjetos por adherencia, frotis o técnicas de gota (Roberts, 1992, 1990).
Los portaobjetos son teñidos con un conjugado de inmunoglobulina (Ig) polies-
pecífica marcada con fluoresceína; el conjugado poliespecífico se recomienda
porque se producen IgM e IgA c-ANCA (Roberts, 1992). Los portaobjetos se
leen en un microscopio de fluorescencia. Usando IFM. hay dos patrones prin-
cipales de tinción de neutrófilos; c-ANCA y ANCA perinuclear (p-ANCA).
El c- ANCA se caracteriza por una tinción finamente granular de citoplasma
neutrófilo con una acentuación central entre los lóbulos nucleares; el núcleo
por sí mismo no liñe (Fig 44-1).
Los criterios útiles para diferenciar c- ANCA de tinciones citoplasmáticas no Figura 44-2. Patrón de anticuerpo antineutrólilo citoplásmico perinuclear (p-ANCA).
específicas debidas a otros autoanticuerpos incluyen los siguientes: 1) La mayoría de los neutrófilos fijados con etanol muestran fluorescencia perinucle-
ausencia de acentuación central; 2) menos del 95% de los neutrófilos ar y nuclear sin tinción citoplasmática ( x 400).
 CAPÍTULO 44
enzimas ciloplasmáticos neutrófilos incluyendo elaslasa, laclolernna. lacto-
peroxidasa, lisozíma, azurocidma o catepsma G (Hoffman. 1998: Jennette.
1993; Niles. 1993).
Los ELISA para detectar autoanticuerpos (rente a PR-3 (PR-3-ANCA)
muestran una buena correlación con la presencia de c-ANCA cuando obser-
vadores experimentados realizan IFM (Niles. 1993; Robeds, 1992). Un ELI-
SA para detectar PR-3 ANCA debe ser validado cuidadosamente, lijándose
de modo especial en el uso de técnicas conocidas en la preparación del
antígeno en fase sólida y utilizando un control tanto de los pasos previos
como de pasos específicos en la absorción para enlaces no específicos de
inmunoglobulina a la fase sólida (Niles, 1993; Roberts, 1992: Wang, 1997).
En Europa se han hecho esfuerzos para estandarizar ELISA en fase sólida
(Hagen, 1996,1998).
Existen en el mercado disponibles ELISA autorizados tanto para PR-3
como para MPO. La mayoría utilizan un recubrimiento de antigeno estándar
directo de placas microperforadas de poliestireno para que la pureza del antí-
geno sea de vital importancia en la definición de la sensibilidad y especifici-
dad analítica (Niles. 1993; Roberts, 1992). Son importantes los intentos para
conservar la conformación del antigeno natural, ya que los ANCA frente a PR-
3 están dirigidos contra los epitopos conformacionales (Hoffman, 1998).
La correlación entre p-ANCA y la detección de mieloperoxida en ELISA,
sin embargo, no es buena (Roberts, 1992). Varios autoanticuerpos inclu-
yendo ANA, elastasa antineutrófila o ANA granulocito-especificos (GS-ANA)
pueden producir un patrón p-ANCA en IFM. Así los sueros que producen
fluorescencia nuclear en IFM requieren una prueba adicional para confir-
mar MPO-ANCA. MPO-ELISA se recomienda para confirmar la especifici-
dad anti -MPO porque se sabe que los verdaderos ANA o GS-ANA y MPO-
ANCA se producen simultáneamente. IFM usando células Hep-2 no hace
esta distinción adecuadamente porque ANA y MPO-ANCA pueden produ-
cirse juntos, y GS-ANA puede ser negativo en células Hep-2 (Robeds.
1992; Specks. 1994).
ELISA tiene limitaciones por lo que. por último, cada laboratorio debe veri-
ficar cuidadosamente las informaciones de un fabricante para que el clínico
pueda recibir información sobre las características de la realización Esto
adquiere especial importancia en las situaciones clínicas confusas donde
puede haber discrepancias entre la presentación clínica y los resultados de
laboratorio y/o resultados discordantes entre IFM y pruebas ELISA.
Asociaciones con enfermedad
Vasculitis
Tanto PR-3 ANCA (c-ANCA) como MPO-ANCA (p-ANCA) están asocia-
dos con WG, PAN incluyendo poliarteritis microscópica. CSS, glomerulo-
nefritis idiopática necrotizante pauciinmune y progresiva y síndromes de
superposición de poliangitis (Cohén, 1991; Niles, 1993). PR-3-ANCA se
identifica en alrededor del 90% de los pacientes con WG activa mientras
que MPO-ANCA se identifica en menos del 10% de estos pacientes. El
ochenta por ciento de los pacientes con poliarteritis microscópica activa tie-
nen o PR3-ANCA o MPO-ANCA más o menos con la misma frecuencia.
MPO-ANCA se identifica en pacientes con CSS o glomerulonefritis pauciin-
mune en el 70% al 80% de pacientes con enfermedad activa; raramente,
este último grupo de enfermedades puede asociarse con PR-3-ANCA antes
que con MPO-ANCA.
Se ha descrito la coexistencia de ANCA y anticuerpos antiglomerulares de
la membrana basal (anti- GBM) (Niles, 1993; Bonsib. 1993).
Enfermedad inflamatoria de los tractos gastrointestinal y
hepatobiliar
Se han publicado vanos artículos sobre la asociación de ANCA con enfer-
medades inflamatorias del tracto gastrointestinal (Gl) y hepatobiliar (Jennette,
1993). Los p-ANCA se han descrito en aproximadamente el 75%-80% de los
pacientes con colitis ulcerosa activa o colangitis esclerosante primaria (Eller-
broek. 1994; Klein, 1991: Lo, 1993), alrededor del 75% de los pacientes con
hepatitis crónica activa; alrededor del 30% de los pacientes con cirrosis biliar
primaria (Kallenberg. 1992: Mulder. 1993) y el 20% de los pacientes con en-
fermedad de Crohn (Jennette, 1993: Roberts, 1992). Las especificidades del
• VASCULITIS 993
antigeno diana en la enfermedad inflamatoria intestinal no se han definido ple-
namente, aunque se han descrito autoanticuerpos contra lactoperoxidasa.
proteina bactericida del aumento de la permeabilidad (Hoffman. 1998), lacto-
ferrina (Peen. 1993) o catepsina G (Jennette, 1993).
Otras enfermedades
Los ANCA también se han descrito en otras enfermedades incluyendo
lupus eritematoso inducido por medicamentos, LES. síndrome de Felty y
artritis reumatoide. síndrome de Siógren, polimiositis y dermatomiositis.
artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, policondritis recidivante, síndro-
me del anticuerpo antifosfolipido. síndromes mielodisplásicos. virus de in-
munodeliciencia humana (VIH), cromomicosis, amebiasis invasiva, endo-
carditis subaguda bacteriana, fibrosis quíslica y ciertas neoplasias (Choi,
2000; Hoffman. 1998; Jennette, 1993: Peter. 1993). En las alteraciones del
tejido conectivo, los ANA que mimetizan p-ANCA deben ser excluidos Mu-
chos pacientes tratados con hidralazina parecen desarrollar MPO-ANCA
(Roberts. 1992). Vasculitis asociada a propiltiouracilo se ha asociado con
ANCA positivo (Hoffman, 1998).
Interpretación de la prueba
La interpretación de las pruebas de ANCA debería considerar vanos facto-
res (Hagen. 1998; Hoffman. 1998: Vassilopoulos.1999):
• Las pruebas ANCA no deberían utilizarse como pruebas de detección sis-
temática en grupos de pacientes no seleccionados donde la prevalencia de
vasculitis es baja (Langford. 1998).
• Las pruebas de ANCA son más valiosas cuando se ordenan selectivamen-
te en situaciones clínicas donde alguna torma de vasculitis asociada a
ANCA sea una posibilidad seria.
• El patrón de inmunofluorescencia c-ANCA deberia confirmarse usando PR-
3 ELISA (Savige. 1999).
• La reactividad anti- PR3 se ve más a menudo en WG activo o PAN pero
puede verse en glomerulonefritis idiopática progresiva o CSS.
• c-ANCA en WG se considera altamente sensible al señalar la enfermedad
sistémica activa (67% a 97%) según Vassilopoulos y Hoffman (1999).
• El valor predictivo de un título aumentado de c-ANCA como presagio de
una recidiva de WG está controvertido, pues no todas las elevaciones en
el titulo de c-ANCA se siguen de un empeoramiento de WG (Specks,
1994).
• El patrón p-ANCA en IFM no es específico desde el punto de vista diag-
nóstico.
• Los sueros p-ANCA positivos deberían probarse con ELISA para MPO-
ANCA (Savige, 1999)
• MPO-ANCA se ve más a menudo en PAN, glomerulonefritis idiopática pro-
gresiva o CSS; sin embargo, puede verse en WG.
• Ni un diagnóstico de la vasculitis sistémica necrotizante ni una decisión para
tratar debería basarse sólo en un resultado de la prueba ANCA positivo.
• Un ANCA negativo no debería usarse para excluir la enfermedad
Los autores consideran un c-ANCA positivo como posible WG y una señal
para una evaluación más exhaustiva. Por último, la interpretación de una
prueba para ANCA depende de la filosofía y experiencia de los clínicos indivi-
duales que tratan las vasculitis (Jennette, 1998).
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SÍNDROMES
VASCULÍTICOS IDIOPÁTICOS
Poliarteritis nodosa
Epidemiología
PAN. como todas las afecciones vasculares, es una enfermedad poco
común. Las estimaciones de la prevalencia de PAN han vanado desde 4.6
por 1.000.000 en Inglaterra, hasta 9.0 por 1.000.000 en el Condado de
Olmstead. en Minnesota, y hasta 77 por 100.000 en una población de esquí-
 994 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
males de Alaska hiperendémica para hepatitis B (Langford. 1995: Conn,
1993). PAN puede producirse en cualquier género y a cualquier edad, pero
es más común en hombres (relación varones/hembras = 2:1) entre 40 y 60
años de edad (Langtord. 1995). No se ha observado predilección racial
(Conn.1993).
Rasgos clínicos
PAN es una vasculilis sistémica necrotizante que afecta predominante-
mente a arterias de pequeño a mediano calibre. Las manifestaciones clínicas
de la PAN clásica son muy variables. Los pacientes a menudo presentan sín-
tomas no específicos como fiebre, pérdida de peso y malestar. La hiperten-
sión es habitual y puede ser una importante clave diagnóstica. Aunque la PAN
puede producirse prácticamente en cualquier órgano, la afectación sintomáti-
ca de la piel, articulaciones, nervios periféricos, tracto Gl y ríñones normal-
mente dominan el cuadro clínico (Conn, 1993). Las pruebas que indican una
función hepática anormal sugieren la posibilidad de una infección por hepati-
tis B concurrente (Langford. 1995). La afectación pulmonar en la PAN clásica
es rara e incluso controvertida. Aunque algunos investigadores piensan que
la PAN pulmonar se produce (Lie, 1989), otros creen que estos pacientes tie-
nen CSS o WG, donde la enfermedad pulmonar es habitual (Langford, 1995:
Fauci, 1998). La evolución de la PAN se caracteriza por remisiones, recidivas
y, si no se trata, alia mortalidad (Faucí, 1998).
Hallazgos clínicos de laboratorio
Los resultados de las pruebas clínicas de laboratorio, aunque no específi-
cas diagnósticamente, refleja la naturaleza sistémica inflamatoria de la PAN.
Típicamente, se encuentra una anemia normocrómica, leucocitosis neutrofíli-
ca. hipoalbuminemía. hipergammaglobulinemia y una VSG marcadamente
elevada. La medida de la creatinina sérica y el nitrógeno de urea en sangre
(BUN) junto con un análisis de onna para controlar la proteinuria. hematuria y
sedimento anormal son importantes para evaluar la función renal normal. El
ANA positivo o FR encontrado en el 10% al 40% de estos pacientes puede
estar asociado con niveles disminuidos de componentes de complemento C3
y C4. En todos los pacientes con PAN deberían obtenerse pruebas serológi-
cas para el antigeno de superficie y anticuerpo de la hepatitis B (Langford.
1995; Conn. 1993). Con poca frecuencia se ve eosinofilia en sangre periféri-
ca y, cuando está presente en altos niveles, esto debería conducir a conside-
rar un CSS (Fauci, 1998).
Diagnóstico
La PAN puede ser difícil de diagnosticar, por su presentación no específi-
ca, el potencial para la afectación de diversos órganos de forma difusa, y la
baja prevalencia. Sin embargo, una vez que se sospecha, el diagnóstico de
PAN se basa en la angiografía y/o la demostración histológica de PAN en la
biopsia tisular de la(s) zona(s) sinlomática(s), como músculo, nervio, riñon y
testículos. Patológicamente, la PAN es una arteritís necrotizante focal pero
panmural de arterias musculares de pequeño y mediano tamaño, que prefe-
rentemente se produce en los puntos de ramificación de los vasos. La infla-
mación necrotizante de célula mixta con necrosis fíbrinoide, circunferencial o
segmentaria en la pared del vaso, es la lesión que marca una PAN activa. La
dilatación aneurismática o microaneurismática también son características de
la fase aguda de la PAN. El proceso inflamatorio se cura con librosis que pue-
de conducir a una endarteritis proliferativa. Un rasgo característico de la PAN
es una mezcla de lesiones activas y/o lesiones en curación adyacentes a seg-
mentos normales de vasos sanguíneos (Langford, 1995).
La angiografía puede ser especialmente valiosa para identificar anormali-
dades Gl o cuando una posible biopsia de una zona sea inasequible. En par-
ticular, se debería considerar una angiografía antes de intentar una biopsia
hepática o renal cerrada con aguja en pacientes con sospecha de PAN, debi-
do a la predilección por aneurismas en estos lugares que aumenta el riesgo
de sangrado grave (Langford. 1995).
Tratamiento y pronóstico
Los pacientes con PAN se tratan con glucocorticoides. El objetivo del tra-
tamiento con glucocorticoides es el control de la enfermedad sin complicacio-
nes significativas por la medicación en si. La ciclofosfamida puede utilizarse
para pacientes con PAN grave (afectación Gl, cardíaca y del sistema nervio-
so central [SCN]), aquellos en los que fracasan los corticoides solos, y para
restringir esteroides en pacientes que presentan efectos adversos significati-
vos a estos (Langford, 1995). El pronostico para pacientes con PAN ha mejo-
rado en gran medida con el uso de glucocorticoides. atendiendo la media de
supervivencia de cinco años del 13% al 50% y al 60%. La mayoría de los
fallecimientos se producen durante el primer año, pero ya sea antes o des-
pués de un año de enfermedad, la mortalidad se produce sobre todo o por
infección o por complicación del tratamiento o por secuelas de la obliteración
del vaso, como el infarto de miocardio o idus (Langlord. 1995).
Variantes de PAN
Dos importantes variantes de la PAN son la PAN cutánea y la PAN asocia-
da con hepatitis B. La PAN cutánea es una vasculitis necrotizante de las arte-
rias pequeñas musculares en el tejido subcutáneo. Por definición, este es un
proceso localizado que no afecta a arterias viscerales y por consiguiente, no
es una vasculitis sistémica. El diagnóstico se establece por hallazgos histoló-
gicos caracteristicos en biopsia de piel con una evaluación sistémica negati-
va. Las lesiones cutáneas histológicamente idénticas pueden verse en la PAN
sistémica; por lo tanto la PAN cutánea puede considerarse un diagnóstico de
exclusión. Como regla, la PAN cutánea sigue un curso benigno, no progresa
a enfermedad sistémica y tiene un excelente pronóstico a largo plazo (Lang-
ford, 1995).
La positividad del antigeno de superficie de la hepatitis B se ha encon-
trado en hasta un 54% de los pacientes con PAN. Hay indicios que indican
que la hepatitis C también se asocia con PAN, aunque actualmente se
conoce poco del espectro clínico de la enfermedad. La identificación del
intervalo entre la infección con hepatitis B y el establecimiento de la PAN ha
variado desde meses hasta años, en parte porque los pacientes tienen fre-
cuentemente hepatitis B subclínica, sin diagnosticar, hasta que se diagnos-
tica la hepatitis B asociada a PAN. Sin embargo, no se ha reseñado ningu-
na asociación entre la actividad inflamatoria en el hígado y la vasculitis. Los
pacientes con hepatitis B asociada a PAN tienen una mayor incidencia de
pruebas de función hepática elevadas y aneurismas que aquellos con PAN
no relacionada con hepatitis pero por otra parte son clínicamente similares.
Desgraciadamente, la presencia de hepatitis B complica el tratamiento
inmunosupresor, porque la replicación viral puede dar lugar a un riesgo
aumentado de la enfermedad hepática progresiva durante el tratamiento e
incluso la hepatitis tulminante cuando cesa la inmunosupresión. A pesar de
estas cuestiones, la terapia corlicoidea es importante, ya que los pacientes
con PAN asociada a hepatitis B no tratada tienen una alta tasa de mortali-
dad. La terapia antiviral con interterón-a debería utilizarse en todos los
pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Guillevin, 1997). El intercambio
de plasma puede ayudar a eliminar inmunocomplejos y mejorar el trata-
miento de algunos pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Langford,
1995: Guillevin, 1997).
Síndrome de Churg-Strauss
Epidemiología
Se piensa que CSS es una condición clínica rara; no hay datos epidemio-
lógicos amplios disponibles (Conn, 1993). El CSS comienza típicamente entre
las edades de 15 y 69 años, siendo los 38 años la media de edad para el esta-
blecimiento de la vasculilis (Langford. 1995).
Rasgos clínicos
El CSS. también llamada angeítis alérgica y granulomatosís, es una vas-
culitis necrotizante sistémica caracterizada por una inflamación granulomalo-
sa vascular y extravascular, afectación múltiple de órganos, y asociaciones
con rinitis alérgica, asma grave e hipereosinofilia (Fauci, 1998; Langford,
1995). Las manifestaciones clínicas de CSS pueden recordar a las de la PAN
en muchos aspectos pero difieren en que la enfermedad pulmonar es típica y
 CAPÍTULO 44
la enfermedad renal es poco común, generalmente menos grave en CSS que
en PAN (Faucí, 1998).
El curso clínico de CSS a menudo se divide en tres lases distintas, aunque
en realidad, estas tres lases no siempre se identifican o pueden superponer-
se (Langford, 1995): 1) una fase prodrómica caracterizada por enfermedad
respiratoria alérgica; 2) una fase eosinofílica caracterizada por hipereosmoli-
lia en sangre periférica y tejido: y 3) una fase vasculítica. La afectación cardí-
aca, bien carditis eosinofílica transmural o vasculitis coronaria, se produce en
el 25% al 62% de los pacientes con CSS y es la principal causa de muerte
(Langford. 1995).
Hallazgos clínicos de laboratorio
Un signo característico del CSS es la notable eosinofilia en sangre perifo-
nea, que puede verse en cualquier fase de la enfermedad. El recuento de
eosinófilos en sangre periférica alcanza los 1.000 eosinófilos por microlitro en
el 80% o más de los pacientes con CSS (Conn, 1993); sin embargo, la eosi-
nofilia no puede encontrarse en todos los pacientes debido a los previos tra-
tamientos con esferoides para el asma o a la amplia y rápida fluctuación que
se puede producir en el recuento de eosinófilos en esta enfermedad. La nor-
malización del recuento de eosinófilos en respuesta al tratamiento con este-
roides es un rasgo de CSS. distinguiéndolo del síndrome hipereosinofílico en
el cual la eosinofilia puede ser resistente a corticoides El grado de eosinofilia
puede relacionarse con la actividad de la enfermedad vasculítica en algunos
pacientes.
Otros hallazgos de laboratorio en CSS son no específicos. La anemia, leu-
cocitosis y aumento de la VSG frecuentemente acompañan a la enfermedad
vasculítica. Los niveles de IgE en suero pueden estar elevados. El FR en sue-
ro puede ser identificado, pero el titulo es generalmente bajo. El complemen-
to en suero está descrito como normal (Conn. 1993). A diferencia de la PAN,
no se ha descrito ninguna asociación entre CSS y hepatitis B (Langford,
1995).
Diagnóstico
Históricamente, el diagnóstico de CSS se realiza exclusivamente con la
demostración histológica de la vasculitis eosinofílica necrotizante. infiltración
eosinofílica del tejido, y granuloma extravascular. En la práctica, sin embargo,
pocas muestras de biopsia contienen todos estos hallazgos. Para aumentar
la probabilidad de la identificación y el diagnóstico de CSS. se puede dar
menos importancia a estos indicadores clínicos e incluir rasgos clínicos. Un
estudio ha recomendado los siguientes criterios:
1. Asma
3
2. Eosinofilia de sangre periférica por encima de 1,5 x1 o células u7l
3. Vasculitis sislémica incluyendo dos o más órganos extrapulmonares
(Conn, 1993)
El diagnóstico delinitivo todavía requiere la demostración de la vasculitis
comprobada con biopsia. Una biopsia abierta de pulmón frecuentemente no
confirma todos los rasgos histológicos de CSS pero debe considerarse antes
del establecimiento de la terapia, si se teme una posible infección. Cuando los
síntomas clínicos así lo indican, las muestras de biopsia útiles se obtienen la
mayoría de músculo, nervio safeno, próstata y riñon. El diagnóstico diferen-
cial de CSS incluye PAN, WG y el síndrome hipereosinofílico (Langford.
1995).
Tratamiento y pronóstico
Los corticoides son la base del tratamiento de CSS. La utilidad de la lera-
pia mmunosupresora con azalioprina y ciclofosfamida no está bien estudiada
(Langford. 1995). El diagnóstico precoz de CSS y corticoides ha llevado a
estos pacientes a tener una tasa de supervivencia de cinco años del 62%. La
insuficiencia cardiaca congestiva y el infarto de miocardio causan el 48% de
todas las muertes en CSS. La hemorragia cerebral, fallo renal, perforación o
hemorragia Gl. estado asmático e insuficiencia respiratoria también causan
fallecimiento de los pacientes con CSS. Todos estos rasgos deberían llevar a
considerar el uso de una terapia con un agente citotóxico (ciclofosfamida) en
combinación con corticoides (Langlord. 1977). La poca duracón del intervalo
• VASCULITIS 995
entre el establecimiento del asma y el establecimiento de la vasculitis se con-
sidera un signo pronóstico desfavorable.
Síndrome mixto de poliangeítis
El síndrome mixto de poliangeítis se produce en un grupo heterogéneo de
pacientes que. por definición, tienen una vasculitis sistémica necrotizante
pero no manifiestan la enfermedad de forma que se sitúen claramente dentro
de una categoría específica de diagnóstico. Los pacientes con el síndrome
mixto de poliangeítis pueden tener los rasgos combinados de varias enfer-
medades vasculíticas, signos patológicos mezclados de modo similar, o sín-
tomas atípicos que no encajan con una enfermedad/síndrome especifico
(Langford, 1995). El síndrome mixto de poliangeítis tiene la capacidad de
afectar a múltiples sistemas de órganos. Aunque el pronóstico para el síndro-
me mixto de poliangeítis no está establecido, existe la posibilidad de daño vis-
ceral serio y enfermedad potencialmente mortal. Tanto desde el punto de vis-
ta diagnóstico como terapéutico, estos pacientes deberían tratarse como sí
tuvieran un síndrome vasculítico bien definido. Una historia cuidadosa, una
exploración física y una evaluación de laboratorio deberían permitir definir el
alcance de su afectación sistémica. El diagnóstico del síndrome mixto de
poliangeítis debería demostrarse mediante biopsia o angiografía. Una vez que
se ha descubierto la presencia de una vasculitis sistémica necrotizante. y se
han descartardo otros diagnósticos, específicamente la infección, el trata-
miento debería iniciarse con corticoides y considerar el uso de agentes inmu-
nosupresores adicionales, como la ciclofoslamida (Langford, 1995).
Granuiomatosis de Wegener
Epidemiología
No existe una incidencia anual detallada disponible ni datos de prevalencia
para WG, pero se estima que WG es menos común que PAN. La WG se pro-
duce en personas de cualquier edad, raza o sexo, aunque se manifiesta pre-
dominantemente en caucasianos y tiene un cierto predominio en los varones
(Conn, 1993). La edad media de comienzo son los 41 años (Langford, 1995).
Rasgos clínicos
WG es un síndrome clínicopatológico de naturaleza desconocida caracte-
rizado patológicamente por una inflamación granulomatosa necrotizante de
los tractos respiratorios superior e inferior, glomerulonefritis focal segmenta-
ria, y una vasculitis necrotizante que afecta predominantemenle a las arte-
rias medianas y pequeñas. La WG se manifiesta en las regiones de
oido/naríz/garganla con sinusitis, obstrucción nasal o ulceración, otitis media
o pérdida de audición (Fauci. 1998: Lie. 1989). El cuarenta y cinco por cien-
to de los pacientes con WG tienen afectación pulmonar al principio, y el 85%
manifiestan una enfermedad pulmonar en algún momento durante el curso
de su enfermedad. Las manifestaciones habituales del pulmón incluyen infil-
trados pulmonares, nodulos pulmonares, hemoptisis o pleuritis (Faucí, 1998).
Aunque sólo alrededor del 18% de estos pacientes sufren inicialmente fallo
renal, el 80% manifiestan glomerulonefritis en algún momento en el curso de
WG (Faucí. 1998). Otros signos habituales de la enfermedad sistémica inclu-
yen exantema cutáneo, artralgias. liebre, manileslaciones oculares y pérdi-
da de peso (Faucí. 1998: Lie. 1989). Aunque se han descrito pacientes con
WG limitado al tracto respiratorio sin afectación renal ("WG limitado"), por
encima del 50% de los pacientes con esta enfermedad al inicio desarrollan
con el tiempo una enfermedad más generalizada (Langford, 1995).
Hallazgos clínicos de laboratorio
Los hallazgos clínicos de laboratorio típicos de WG incluyen leucocitosis
moderada sin eosinofilia acusada, anemia normocrómica leve y trombocitosis
(Conn. 1993. Langford, 1995). No se ha observado leucopenia en los pacien-
tes no tratados y, asi, esto ayuda a distinguir WG de otros trastornos. La pre-
sencia de c-ANCA apoya el diagnóstico. Los inmunocomplejos circulantes,
determinados por enlaces Clq. se pueden encontrar junto con niveles nor-
males de complemento e hipergammaglobulinemia: a menudo están elevadas
las cantidades de subclase IgA (Conn, 1993; Langford. 1995). Los indicado-
 996 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
res de afectación glomerular incluyen hematuria microscópica o gruesa, pro-
teinuria, cilindros de hematíes y/o creatinina sérica elevada y BUN. Más del
50% de estos pacientes son FR positivos, pero los ANA están generalmente
ausentes (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las pruebas serológicas para auto-
anticuerpos anti-GBM son negativos. Previo al tratamiento, el 80% de estos
pacientes presentan una VSG elevada.
Diagnóstico
Aunque los hallazgos clínicos y de laboratorio pueden ser sugerentes. el
diagnóstico de WG debería hacerse solo con una biopsia probada, confirma-
ción histológica o cuando se ha comprobado la existencia de c-ANCA en el
paciente con sinusitis, infiltrado pulmonar o nodulo y glomerulonelrilis (Lang-
ford, 1998). El tejido pulmonar obtenido mediante biopsia abierta de pulmón
olrece la mejor oportunidad para hacer un diagnóstico certero (Langford,
1995). La biopsia transbronquial no proporciona el tejido adecuado para el
diagnóstico más del 90% del tiempo. Aunque el tejido de cabeza y cuello es
directamente más accesible, los rasgos patológicos característicos se encuen-
tran en menos del 23% de estas muestras de biopsías El tejido útil desde el
punto de vista diagnóstico de cabeza y cuello que mejor se obtiene, según
orden decreciente de frecuencia, es el de los senos paranasals, tejido nasal
y región subglótica. Los cambios glomerulares en el tejido de la biopsia renal,
aunque sugerentes de WG, son raramente diagnósticos (Langford, 1995).
Aunque el espectro morfológico de WG es amplio, el marco de la lesión
patológica en WG es la vasculitis granulomatosa y necrolizante. Los vasos
afectados experimentan necrosis fibrmoide con infiltración precoz por leu-
cocitos polimorfonucleares seguidos de células mononucleares. El tejido
pulmonar puede revelar cualquier combinación de necrosis, vasculitis, e
inflamación granulomatosa. aunque las muestras de biopsia no incluyen
lodos estos rasgos característicos. El hallazgo más habitual en la biopsia
renal es la glomerulonefritis necrotizante segmentaria presente en diversos
grados en el 80% de las muestras. La vasculitis renal no relacionada con el
glomérulo es poco común y está presente sólo en el 8% de las biopsías.
Muchas alteraciones pueden imitar la WG, incluyendo las enfermedades
granulomatosas infecciosas o no infecciosas. CSS. síndrome de Goodpastu-
re, granuloma idiopático de media linea, granulomatosis Imfomatoide y neo-
plasias de las vías respiratorias altas o pulmones (Fauci, 1998). De estos, la
infección es una consideración importante, ya que un diagnóstico erróneo
puede tener fatales consecuencias cuando se trata de forma equivoca con te-
rapia inmunosupresora (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico
Un régimen de ciclofosfamída oral diaria y corticoides es la terapia de elec-
ción para la WG. Utilizando este régimen, el Instituto Nacional de la Salud
publicó el logro de una marcada mejora o remisión parcial en el 91% de los
pacientes, con remisión completa en el 75%. Se observó una tasa de morta-
lidad global del 20%, el 13% de la cual podría atribuirse de forma completa o
parcial a la WG. A pesar de esta marcada mejora en la supervivencia y la
remisión comparada con el 100% de mortalidad en los pacientes no tratados,
se observaron recidivas y morbilidad tanto de la enfermedad como del trata-
miento. La mitad de las remisiones completas fueron seguidas de una o más
recidivas, que se produjeron entre tres meses y 16 años después de alcan-
zarse la remisión (Langford. 1995) El metotrexato es una alternativa a la ci-
clofosfamída en pacientes que no sufren de enfermedades en las que peligra
la vida (Langford, 1997). Durante el primer año de WG. el alcance de la enfer-
medad renal es el factor más estrechamente relacionado con el pronóstico.
Después, la afectación del pulmón se convierte en el indicador de pronóstico
más importante, y la glomerulonefritis no parece afectar significativamente al
pronóstico.
Granulomatosis linfomatoide
La granulomatosis linfomatoide (GL) está considerada como una alteración
linfoproliferativa poco habitual que puede evolucionar a un linfoma maligno en
aproximadamente el 50% de los pacientes. La GL afecta pnncipalmente a los
pulmones, donde clínicamente imita a la WG. Sin embargo, los hallazgos his-
tológicos característicos incluyen la infiltración marcada de vasos sanguíneos
("angiocénlrica") y la destrucción imitando a la vasculitis, pero la morfología
celular es más sugerente de linfoma o alteración linfoproliferativa (Langford,
1995). No hay pruebas clínicas de laboratorio especificas.
Púrpura de Henoch-Schónlein
Epidemiología
La púrpura de Henoch-Schónlein (HSP) se produce principalmente e n
niños de edades comprendidas entre los 4 y los 11 años (Conn. 1993) pero
también aleda a algunos adultos. La HSP se presenta más habitualmente e n
primavera y generalmente sigue a una infección de las vías respiratorias
superiores (Conn. 1993). La HSP tiene un predominio en los varones de 3:2
(Langford, 1995).
Rasgos clínicos
La HSP. llamada a veces púrpura anafiladoide. es una vasculitis sistémica
de pequeños vasos clasificada como un subgrupo de la vasculitis de hiper-
sensibilidad. No se conoce la etiología de HSP. Los hallazgos clínicos típicos
en HSP incluyen púrpura palpable no trombocitopénica, artralgias, lesión
renal y anormalidades del tracto Gl (Langford. 1995). El 70% de los pacientes
con HSP manifiestan signos y síntomas gastrointestinales incluyendo dolor
abdominal espasmódico asociado con nauseas y vómitos, sangre o moco en
heces, hemorragia Gl potencialmente mortal, e invaginación (Langford. 1995).
La enfermedad renal asociada se caracteriza por glomerulonefritis focal proli-
ferativa que tiene una expresión clínica variable que va desde la hematuria
aislada con cilindros de hematíes, hasta insuficiencia renal aguda, y Iracaso
renal crónico raro (Fauci. 1998; Langford, 1995; Lie, 1989).
Hallazgos clínicos de laboratorio
Los estudios clínicos de laboratorio en HSP son no específicos y resul-
tan especialmente útiles para excluir otras alteraciones y buscar evidencia
de afectación renal. Se pueden observar leucocitosis y VSG elevada. Las
pruebas de CBC con recuento de plaquetas y de coagulación son impor-
tantes en la evaluación de púrpura cutánea; en HSP. las púrpuras no son
de trombocitopenia. Deberían realizarse coprocultivos intermitentemente
para buscar evidencia de pérdidas de sangre oculta. Los niveles de com-
plemento en suero generalmente son normales, aunque se ha descrito una
asociación entre HSP y la ausencia congenita del componente del comple-
mento C2 (Conn, 1993). Se deberían realizar análisis de orina y medidas
de creatinina en suero al comienzo de la enfermedad y dos veces a la
semana hasta que los signos sislémicos hayan cesado (Langford, 1995).
Diagnóstico
La dificultad para diagnosticar HSP es rara, excepto cuando la afectación
de otros lugares principales precede a la aparición de púrpura palpable. A
diferencia de otras vasculitis necrolizantes, el diagnóstico es clínico, con estu-
dios de laboratorio que se utilizan para excluir otras alteraciones. La biopsia
renal, que demuestra glomerulonefritis proliferativa, no es propiamente nece-
saria para el diagnóstico, aunque se utiliza para valorar la gravedad de la
enfermedad y estimar el pronóslico Las alteraciones que se han de conside-
rar en el diagnóstico diferencial de HSP incluyen cualquiera que cause abdo-
men agudo, nefritis o púrpura (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico
El tratamiento de HSP es de sostén y no existe un tratamiento especifi-
co de beneficio probado para la nefritis de HSP. Aunque los glucocorti-
coides pueden ser útiles para disminuir el edema, el dolor de articulaciones
y el malestar abdominal, la terapia de mantenimiento c o n glucocorticoides
no es beneficiosa, ya que no disminuye el nesgo de enfermedad recurren-
te o mejora el diagnóstico renal (Langlord. 1995). Los analgésicos no sali-
 CAPÍTULO 44
cilatos pueden suavizar el malestar de las articulaciones y tejidos blandos.
La terapia para adultos se parece a la de los niños, aunque la hipertensión
en adultos debe ser controlada cuidadosamente (Langford. 1995).
El pronóstico para esta enfermedad generalmente autolimitada, que dura
de 6 a 16 semanas, es bueno (Conn, 1993). La tasa de mortalidad está
alrededor del 1% al 3% (Langlord. 1995). y el Iracaso renal es la causa prin-
cipal de muerte (Langford, 1995). Aquellos que tienen una presentación
nefrítica aguda, particularmente con síndrome nefrótico. tienen el peor des-
enlace, con menos del 50% que recuperen la función renal y los análisis de
orina normales en dos años El porcentaje de glomerulos semilunares pue-
de ser también un indicador de pronóstico útil: sin embargo, es importante
tomar conciencia de que el curso de HSP puede ser extremadamente varia-
ble. Los pacientes con anormalidades graves clínicas o histológicas pueden
recuperarse totalmente, y aquellos con cambios benignos pueden evolucio-
nar a insuficiencia renal. La enfermedad se repite en el 25% al 40% de los
pacientes y consiste en su mayor parte en manifestaciones cutáneas. El
deterioro o la mejora puede ser más notable durante los primeros dos o tres
años tras la resolución del episodio agudo, aunque también se han obser-
vado cambios significativos con más posterioridad. Es extremadamente
importante una revisión regular con medidas de presión sanguínea y análi-
sis de orina durante al menos los cinco primeros años siguientes a un epi-
sodio de HSP. (Langford, 1995).
Arteritis de células gigantes (temporal)
Epidemiología
La arteritis de células gigantes (GC) es una alteración relativamente
común. Los estudios epidemiológicos han demostrado una incidencia cre-
ciente con la edad. Un estudio que incluía arteritis GC probadas con biopsia
demostró una tasa de incidencia anual de 23,3 por 100.000 personas mayo-
res de 50 años (Conn. 1993). Casi todos los casos de arteritis GC empiezan
después de la edad de 50 años.
Rasgos clínicos
La arteritis GC es una entermedad sistémica caracterizada por una infla-
mación vascular granulomalosa que afecta a las arterias medianas y grandes.
Aunque las arterias afectadas pueden estar en múltiples lugares, la arteritis
GC clásicamente afecta a la arteria temporal y/o otras ramas de la arteria
carótida (Faucí. 1998) Las manifestaciones clínicas incluyen fiebre, cefalea y
claudicación mandibular en pacientes con más de 50 años La neuritis óptica
isquémica puede provocar una ceguera repentina, particularmente en pacien-
tes no tratados (Faucí, 1988). La arteritis GC está estrechamente asociada
con la polimialgia reumática, que se caracteriza por rigidez y dolor cervical, de
hombros, zona inferior de la espalda, caderas y muslos que es peor por la
mañana y mejora con la actividad del día (Fauci, 1998).
Hallazgos clínicos de laboratorio
Los hallazgos clínicos de laboratorio incluyen una VSG elevada y anemia
normocrómica La fosfatasa alcalina en suero está habitualmente elevada. Se
ha descrito una hipergammaglobulinemia, asi como niveles elevados de com-
plemento e inmunocomplejos (Fauci, 1998).
Diagnóstico
El diagnóstico se basa en la identificación de las manifestaciones clínicas
típicas y una VSG alta en un paciente anciano que puede o no tener también
síntomas de polialgia reumática (Fauci. 1998). El diagnóstico se confirma por
biopsia de la arteria temporal.
Tratamiento y pronóstico
La arteritis GC se trata con glucocorticoides. y la respuesta clínica a esta
terapia es generalmente llamativa. El pronóstico clínico es bueno, pues la
mayoría de los pacientes consiguen y mantienen una remisión completa Iras
la terapia corticoidea (Fauci, 1998). Desgraciadamente, es rara la recupera-
• VASCULITIS 997
ción de la vista que sigue a la ceguera secundaria a la arteritis GC. incluso
con una terapia de corticoides rápida a altas dosis.
Arteritis de Takayasu
Epidemiología
Como muchas de las alecciones vasculares idiopáticas. la arteritis de
Takayasu es poco habitual, y la epidemiología de esta enlermedad no se
conoce exactamente. Esta alteración es más prevalente en adolescentes y
mujeres jóvenes en edades comprendidas entre los 10 y 30 años; en reali-
dad, entre el 80% y el 90% de los casos se produce en mujeres. Aunque es
más común en Japón, esta enlermedad no tiene limitaciones probadas
raciales o geográficas (Conn, 1993: Fauci, 1998).
Rasgos clínicos
La arteritis de Takayasu es una vasculitis granulomalosa de las arterias
elásticas medias y grandes que causa estenosis vascular u oclusión; existe
una fuerte predilección por la arteria aórtica y sus grandes ramas, incluyen-
do las arterias pulmonares (Fauci, 1998; Langford. 1995). Esta enlermedad
se llama a veces síndrome de la arteria aórtica o arteritis granulomalosa
idiopática. Los pacientes presentan síntomas sistémicos agudos que inclu-
yen fiebre, malestar, sudores nocturnos y pérdida de peso. La isquemia en
los órganos que reciben el aporte vascular a través dellos vaso/s afeclado/s
causa señales y síntomas órgano-específicos. En la fase crónica obliteran-
te, las pulsaciones de las arterias están disminuidas o ausentes en las arte-
rias implicadas (Langford, 1995), más habitualmente en la arteria subclavia
(Fauci. 1998). Son habituales los soplos vasculares y la hipertensión (Lang-
ford. 1995). Otros hallazgos incluyen la regurgitación aórtica, cardiomegalia
secundaria a hipertensión aórtica o pulmonar, e ictus (Fauci, 1998). La arte-
ritis de Takayasu puede progresar lentamente, puede estabilizarse, o puede
causar la muerte rápidamente (Fauci, 1998)
Hallazgos clínicos de laboratorio
Los estudios de laboratorio de la arteritis de Takayasu definen una alte-
ración inflamatoria sistémica (Langford. 1995). La VSG está elevada en el
75% al 100% de los pacientes, que tiende a volver a la normalidad a lo lar-
go del tiempo. Se cree que la VSG es un índice fiable de actividad inflama-
toria y se ha utilizado como herramienta para monitorizar la eficacia de la
terapia. El poder de resolución de la enlermedad. tanto sintomática como
angiográficamente. se ha visto que está correlacionado con la disminución
de la VSG.
Los estudios hemalológicos muestran con frecuencia una anemia normo-
crómica de leve a moderada y/o leve leucocitosis. El FR y ANA son gene-
ralmente negativos. Puede haber hipergammaglobulinemia, hiperfibrinoge-
nemia e hipoalbuminemia (Conn, 1993). Los inmunocomplejos circulantes
pueden estar presentes en hasta un 50% de estos pacientes pero no pare-
cen relacionarse con la actividad de la enfermedad.
Diagnóstico
La arteritis de Takayasu se diagnostica por los datos correlacionados de
la historia, la exploración física y la angiografia. La enfermedad debería
considerarse como una posibilidad diagnóstica en cualquier mujer joven que
carezca o tenga una frecuencia de pulso periférico marcadamente dismi-
nuida o que presente variaciones en la presión sanguínea yo soplos arte-
riales (Fauci. 1998). Los hallazgos angiográficos característicos ayudan a
confirmar el diagnóstico clínico. La biopsia del tejido de diagnóstico para la
confirmación raramente se requiere o se hace (Fauci, 1998). La predilección
de este síndrome por mujeres jóvenes es un rasgo importante que a veces
lo separa de otras consideraciones diagnósticas, particularmente de la arte-
ritis GC (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico
En pacientes con entermedad activa, la terapia corticoidea es el tratamien-
to inicial de elección. Si la enlermedad activa persiste a pesar de los corticoi-
 998 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGIA
des, se pueden administrar ciclofosfamida o metotrexato. Los vasodilatadores,
anticoagulantes y antiinflamatorios no esteroideos se utilizan para el alivio sin-
tomático. Puede ser necesana la intervención quirúrgica para la estenosis vas-
cular sintomática o la oclusión (Langford. 1995).
El curso clínico de la arteritis de Takayasu es variable. Aunque se produce
la remisión espontánea, la mayoría de los pacientes requieren tratamiento. El
pronóstico parece estar relacionado con la presencia y gravedad de las com-
plicaciones. Las principales complicaciones incluyen la retinopatia de Taka-
yasu. hipertensión secundaria, insuficiencia de la válvula aórtica y aneurisma
aórtico/arterial (Langford, 1995). La supervivencia desciende con el paso del
tiempo, a medida que aumenta el número y gravedad de estas complicacio-
nes. Las muertes relacionadas con la enfermedad generalmente se producen
por complicaciones vasculares, como insuficiencia cardiaca congestiva, ictus,
infarto de miocardio y rotura de aneurisma (Langford, 1995).
Angeítis primaria del sistema nervioso central
Epidemiología
La angeítis primaria del sistema nervioso central (PACNS) es una situación
rara donde la dificultad para hacer un diagnóstico definitivo impide los estu-
dios epidemiológicos. PACNS es ligeramente más habitual en hombres que
en mujeres (4:3) y comienza a una edad media de 43 años (Langford, 1995),
Rasgos clínicos
Los pacientes con PACNS presentan cefaleas; déficit focales neurológicos,
y estado mental alterado, paraparesia. cuadriparesia. neuropatías craneales,
ataques y ataxia (Calabrese, 1997; Fauci. 1998). Los síntomas iniciales están
más generalizados y los signos y síntomas focales generalmente se desarro-
llan más tarde en el curso de la enfermedad (Langford. 1995). El quince por
cíenlo de los casos tienen afectación de la médula espinal (Calabrese. 1997).
El curso puede ser progresivo rápidamente o crecer y decaer durante un lar-
go periodo de tiempo. Los síntomas sistémicos son raros.
Hallazgos clínicos de laboratorio
Los estudios de laboratorio no son útiles para hacer un diagnóstico de
PACNS, pero juegan un importante papel en la exclusión de otras enferme-
dades. La VSG está elevada en la mayoría, pero no en todos, estos pacien-
tes. Solamente se ha visto anemia en el 17% de ellos, y otros parámetros he-
matológicos son generalmente normales. El FR, ANA y ANCA están ausentes
típicamente. Sin embargo, el liquido cefalorraquídeo (LCR) es generalmente
anormal con hallazgos que incluyen presión de apertura aumentada, proteí-
nas elevadas y pleocitosis linfocítica. Como el LCR puede ser completamen-
te normal, estas pruebas no siempre excluyen la posibilidad de vasculitis
(Langford. 1995).
Diagnóstico
El diagnóstico de PACNS continúa siendo de exclusión. Los criterios
diagnósticos propuestos han incluido la disfunción del SNC que no se
explica por exploración clínica, de laboratorio o neurologica: documenta-
ción por angiograma y/o biopsia de una arteritis dentro del SNC; y ausen-
cia de una vasculitis sistémica u otra condición para la cual los rasgos
angiográficos o patológicos podrían ser secundarios. Debido a la inevita-
ble dificultad en cuanto al último criterio y el pobre poder discriminatorio
de la angiografía en cuanto a la enfermedad vascular inflamatoria frente a
la no inflamatoria (Calabrese, 1997), las biopsias de SNC están infrautili-
zadas. El papel de la biopsia cerebral en el diagnóstico de PACNS per-
manece en controversia, aunque algunos defienden que esta biopsia es
esencial para hacer un diagnóstico definitivo (Calabrese, 1997). La exclu-
sión de una biopsia cerebral como método generalizado se debe no sólo
a la naturaleza invasiva sino también por la incapacidad de demostrar la
vasculitis histológica debido a la naturaleza heterogénea del proceso. El
rendimiento de la biopsia puede aumentarse mediante la obtención de
muestras de vasos tanto de parénquima como de la leptomeninge. Por la
dificultad para obtener un diagnóstico certero de esta enfermedad, la biopsia
es igual de importante para descartar otras posibles etiologías. Histológica-
mente, existe una inflamación segmentaria mixta con necrosis que afecta
predominantemente a arterias craneales de pequeño y mediano tamaño. La
inflamación por granulomatosis puede estar presente. A menudo se detecta
trombosis; las arterias extracraneales raramente se afectan (Langford, 1995;
Rhodes, 1995). Por eso, deben realizarse en todos los casos diagnósticos
dilerenciales cuidadosos para decidir las pruebas apropiadas tanto para apo-
yar un diagnóstico de PACNS como para descartar otros procesos. La com-
binación de la resonancia magnética (RM) y LCR normales tiene un fuerte
valor predictivo negativo y excluye la consideración de PACNS en la mayo-
ría de las situaciones clínicas (Calabrese, 1997).
Tratamiento y pronóstico
El tratamiento intensivo está indicado para los pacientes donde se han des-
cartado otras alteraciones, el diagnóstico de PACNS se mantiene, y hay evi-
dencia de dificultades neurológicas progresivas (Calabrese, 1997). Se defien-
de la terapia combinada de corticoides y ciclofosfamida diarias; sin embargo,
el pronóstico de PACNS es malo, con un 60% a un 70% de pacientes que
fallecen por la enfermedad antes de un año desde el diagnóstico (Langford.
1995).
Enfermedad de Kawasaki
La enlermedad de Kawasaki o síndrome linfonodular mucocutáneo es una
forma de vasculitis que aféela a arterias de pequeño y mediano calibre. La
enfermedad se produce típicamente en niños que presentan linfadenitis cer-
vical y alteraciones en piel y mucosas. La enfermedad de Kawasaki general-
mente es autolimitada. pero la arteritis provoca aneurismas coronarios en el
25% de los pacientes. La muerte se produce en hasta un 3% de los pacien-
tes, generalmente por vasculitis coronaria. Los autoanticuerpos de células
anliendoteliales han sido determinados en pacientes con enfermedad de Ka-
wasaki (Fauci, 1995).
RESUMEN
El diagnóstico de las afecciones vasculares sistémicas necrotizantes re-
quiere un alto grado de sospecha y puede ser difícil debido al amplio número
de consideraciones de diagnóstico diferencial. No existen pruebas clínicas de
laboratorio patognomónicas en pacientes con afecciones vasculares sistémi-
cas necrotizantes. pero estas pruebas son útiles para definir el alcance y los
patrones de la afectación del órgano. Los ANCA y sus asociaciones con la
vasculitis sistémica necrotizante. particularmente la asociación de c-ANCA
con WG. se han convertido en una prueba serológica importante utilizada en
la evaluación de estos pacientes. Sin embargo, los médicos y técnicos de
laboratorio que usan esta prueba deben entender a fondo las características
operativas, incluyendo limitaciones, de la misma cuando la realizan en su
laboratorio, La biopsia de tejido del lugar(es) sintomático(s) con confirmación
histológica de vasculitis necrotizante continúa siendo el procedimiento de
laboratorio más importante para el diagnóstico de las afecciones vasculares
necrotizantes sistémicas.
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 4 5

Enfermedades autoinmunes
organoespecíficas
David J. Bylund, M.D.
Robert M. Nakamura, M.D.

MÉTODOS DE DETECCIÓN 1000 GLÁNDULA SUPRARRENAL 1011

Microscopía de inmunofluorescencia indirecta Enfermedad de Addison
PIEL 1001 PÁNCREAS 1011
Pénfigo Diabetes mellitus
Penfigoide TRACTO GASTROINTESTINAL 1013
Epidermólisis ampollosa adquirida y lupus
Anemia perniciosa
eritematoso ampolloso
Enteropatia sensible al gluten
Dermatitis herpetiforme
Dermatosis IgA lineal SISTEMA NERVIOSO 1013
Lupus eritematoso Miastenia gravis
Vasculitis Esclerosis múltiple
HÍGADO 1006 Neuropatías
Autoanticuerpos Autoanticuerpos contra proteínas neuronales
Enfermedades hepáticas Autoanticuerpos contra gangliósidos
GLÁNDULA TIROIDES 1009 neuronales
Enfermedades tiroideas OTROS ÓRGANOS 1014
Autoanticuerpos Corazón
RIÑON 1010 Músculo
Glomerulonefritis
RESUMEN 1014
Enfermedad por anticuerpos contra la membrana
basal glomerular BIBLIOGRAFÍA 1014

Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse como sistémicas o enfer-
medades específicas de órgano. En este capitulo se tratan la mayoría de las
enfermedades autoinmunes organoespecíficas enumeradas en la Tabla 45-1.
La principal característica clínica de estos trastornos autoinmunes es la infla-
mación crónica, que generalmente se localiza en un único órgano específico en
cada enfermedad. Dentro de este grupo de enfermedades autoinmunes, apa-
rece con cierta Irecuencia un agrupamiento familiar. Los autoanticuerpos más
relevantes pueden ser específicos de la especie o no serlo, pero si exhiben
especificidad por un antígeno presente en el tejido u órgano dañado.
En este capitulo también se incluyen algunas enfermedades con autoanti-
cuerpos y lesiones inflamatorias restringidas a uno o varios órganos, que
combinan las características clínico-patológicas de los dos tipos de trastor-
nos, las enfermedades autoinmunes sistémicas y las específicas de órgano.
Como ejemplo de éstas encontramos enfermedades autoinmunes hepáticas
como la cirrosis biliar primaria (CBP) o la hepatitis autoinmune (AiH). Si exclui-
mos los autoanticuerpos antireceptores tiroideos, la implicación de los auto-
anticuerpos en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes específicas
de órgano aún no ha sido demostrada.
MÉTODOS DE DETECCIÓN
La microscopía de inmunofluorescencia indirecta (IFID), descrita breve-
mente más adelante, es el método que se utiliza con mayor Irecuencia para
detectar la presencia de autoanticuerpos circulantes dirigidos contra órganos
o tejidos específicos. Sin embargo, gracias a la mejora de los aspectos técni-
cos, los laboratorios clínicos utilizan con mayor frecuencia los ensayos ELISA
(análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas).
Microscopía de inmunofluorescencia indirecta
Este procedimiento es esencialmente el mismo para las distintas pruebas,
excepto por los suslratos utilizados como objetivo para los autoanticuerpos.
El procedimiento general es el siguiente:
1. Preparar diluciones para el cribado o diluciones seriadas de los sueros
de los pacientes, y de los controles apropiados con fosfato salino tam-
ponado (PBS).
2. Incubar en cámara húmeda durante 20 a 30 minutos las diluciones de
los sueros de los pacienles y los controles sobre secciones de tejido
criopreservadas sobre portas de cristal multiporo. No permitir que se
sequen los portas.
3. Sacar los portaobjetos de la cámara húmeda. Lavar brevemente y con
cuidado cada portaobjetos, dos o tres veces, usando para ello PBS a
temperatura ambiente. Después lavar los portaobjetos en PBS durante
15 minutos, cambiando la solución de lavado una vez en este tiempo.
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS 1001

Tabla 45-1 Enfermedades autoinmunes organoespecíficas

E n f e r m e d a d del ó r g a n o Autoanticuerpos M é t o d o / s de d e t e c c i ó n
Glándula tiroides
Tiroiditis aulommune Peroxidasa tiroidea ELISA. IFID sobre tiroides de mono no lijada
Tiroglobulma IFID sobre tiroides de mono fijada en metanol;
hemaglutinación pasiva, aglutinación en látex
Enfermedad de Graves Receptor de TSH Ensayo de unión al radiorreceptor, bioensayo do cAMP

Glándula suprarrenal
Enfermedad de Addison Adrenocortical IFID en corteza adrenal de mono o humana no fijada
Glandula parattroides
Paratiroides Proteínas endoteliales paratiroideas IFID sobre glándula paratiroides bovina no lijada
Páncreas
Diabetes mellitus Células del islote IFID sobre páncreas humano no lijado, grupo sanguíneo O
dependiente de insulina Asociados a insulina Radioinmunoprecipitación
Anti-decarboxilasa de á c i d o glulámico
ELISA. RÍA. inmunotransferencia
Músculo
Dermatomiositis/polimiosilis PM-1. Jo-1 ELISA; inmunodifusión

Tracto gastrointestinal
Gastritis atròfica Células parietales gástricas IFID en estómago/riñón de ratón
Anemia perniciosa Factor intrínseco Ensayo de unión a vitamina B,. radiactiva
Células de conductos salivares IFID en glándula salival humana no fijada
Células panetalos gástricas IFID en sustrato de mucosa gástrica humana, de mono,
de ratón o de rala
Colitis ulcerosa Colon; lipopolisacárido; asociado a p-ANCA IFID sobre colon humano o de rata, hemaglutinación
IFID en neutrófilos fijados en elanol
Enfermedad de Crohn Reticulina IFID sobre riñon de ratón
Enfermedad celiaca Transglutammasa tisular ELISA
IgA de endomisio IFID sobre e s ó f a g o de mono
Gliadina ELISA
Reticulina IFID sobre n ñ ó n de ratón
Hígado
Hepatitis autoinmunc Músculo liso IFID en estómago/riñón de ratón
Microsomas hepáticos y renales IFID on oslómago/riñón de ralón; ELISA
ANA Células Hep-2
Cirrosis biliar primaria Mitocondrial ( M 2 ) IFID en estómago/nñón de ratón, ELISA
Colangitis esclerosante primaria p-ANCA IFID sobre neutrófilos fijados en elanol
Neurológicas
Miastenia gravis AChR Inmunoprecipitaaón de AChR conjugado con
,26
la-bungarotoxina (músculo esquelético humano); ELISA
Enfermedades desmielinizantes Mielina; lubulina, proteina básica de la mielina;
(a saber, esclerosis múltiple) glucoproleina asociada a mielina FID sobre m é d u l a espinal de mamitero; ELISA;
inmunotransferencia
Ríñones
Enfermedad por anticuerpos anti-GBM Membrana basal glomerular y pulmonar ELISA
Piel
Pénfigo Espacios intercelulares (desmogleinas) IFD sobre muestra de biopsia de piel. IFID sobre
e s ó f a g o de mono o cobaya
Penfigoide BMZ (proteínas de hemidesmosomas) IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre esófago de mono
Transglutaminasa tisular ELISA
Dermatitis herpetiforme IgA de endomisio IFID sobre e s ó l a g o de mono
ICS y BMZ IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre epitelio de ve|iga de
Pénfigo paraneoplásico rata
IgA BMZ IFD sobre biopsia de piel humana. IFID sobre esófago
Dermatosis lineal por IgA de mono
IgA ICS IFD sobre biopsia de piel humana; IFID sobre esófago
Pénligo por IgA de mono
AChR = receptor de acetilcolina; BMZ = zona de memprana basal; IFD = microscopía de inmunofluorescencia directa; ELISA • ensayo de inmunoabsorción ligado
a onzima; ICS = espacios intercelulares IFID - microscopía de Inmunofluorescencia indirecta; p-ANCA • anticuerpos perinucleares anticiloplasma de neutrófilos;
RÍA = radioinmunoensayo. TSH = hormona estimulante de litoides

4. Ir sacando cada portaobjetos por separado del baño de PBS. secar el

exceso de líquido de cada portaobjetos, y colocarlos de nuevo en la
cámara húmeda. Dispensar en cada pocilio la dilución de conjugado mar-
cado con fluoresceína. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente
durante 20 minutos. No permitir que se sequen los portaobjetos.
5. Lavar los portaobjetos con PBS y azul de Evans como colorante de con-
traste durante 10 minutos.
6. Montar los cubreobjetos.
7. Observar los portaobjetos al microscopio de fluorescencia.
8. Almacenar los portaobjetos en la oscuridad a 4°C.
PIEL
La detección de autoanticuerpos es muy útil en el estudio de las enferme-
dades cutáneas ampollosas. En pacientes con enfermedades autoinmunes
de la piel, los autoanticuerpos incluyen aquellos dirigidos contra la zona de
membrana basal (BMZ), los espacios intercelulares (ICS) o los vasos sanguí-
neos dérmicos, como se recoge en la Tabla 45-2. Se encuentran disponibles
algunas revisiones técnicas excelentes que detallan el uso de la inmunofluo-
rescencia para el examen de la piel (Flotte, 1995; Crosby, 1993).
 1002 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 45-2 Enfermedades autoinmunes de la piel tóxica, lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave (MG), penligoide y
liquen plano. Raramente se observan en individuos sanos (<1%) (Becker.
H a l l a z g o s inmunológicos esenciales para el diagnóstico 1993; Mutasim. 1993; Nousari, 1997).
Espacios intercelulares epidérmicos
Péntigo
Pénligo paraneoplásico
Pénfigo foliáceo
Zona de membrana basal
Penligoide
Los subgrupos de pénligo foliáceo incluyen el PF idiopático, PF endémico
Penligoide gostacional
Epidermólisis ampollosa adquirida (fogo selvagem), PF inducido por fármacos y pénfigo eritematoso (PE). El
Dermatosis lineal por IgA principal antígeno en el PF es la desmogleina 1 (Lin. 1998: Naparstek, 1993).
Dermatosis ampolloso crónica de la inlancia IFD. Para todas las formas de PF excepto para PE, el patrón de IFD es
Papilas dérmicas ± zona de membrana basal similar al de PV. En algunos casos, el mareaje predomina en la epidermis
Dermatitis herpetilorme superficial, a nivel de la capa granulosa. En PE, hay un depósito lineal de IgG
en ICS epidérmicos combinado con inmunorreactivos granulares a lo largo de
Hallazgos inmunológicos útiles para el diagnóstico
BMZ.
Manifestaciones cutáneas en enfermedades reumáticas sistémicas
Dermatomiositis/polirniosilis IFID. La IFID debe detectar autoanticuerpos IgG ICS en prácticamente el
Lupus eritematoso 100% de los pacientes de PF con enfermedad activa (Nousari, 1997). Casi el
Enfermedad mixta del tejido conjuntivo 90% de los pacientes con PF tienen autoanticuerpos detectables cuando se
Policondritis recurrente utiliza esófago de mono para los estudios indirectos. El esófago de cobaya es
Sindrome de Sjogren algo más sensible ya que detecta el 10% restante de los pacientes y los títu-
Esclerosis sistèmica los indirectos tienden a ser mayores que los obtenidos cuando se utiliza esó-
Vasculitis fago de mono (Jiao. 1997).

Pénfigo paraneoplásico
Pénfigo
El pénfigo paraneoplásico (PNP), una enfermedad poco común caracte-
El pénfigo se refiere a un grupo de enfermedades que se caracterizan clí-
rizada por la presencia de ampollas dolorosas o erosiones de las membra-
nicamente por ampollas e histológicamente por acantólisis. Existen tres sub-
nas mucosas y piel, es una afección de pacientes con neoplasias. Estas
tipos principales de pénfigo: pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo y pénfigo para-
ampollas o lesiones aparecen en la boca, pero también se han descrito en
neoplásico (Nousari, 1999). Cada uno de estos subtipos se caracteriza por la
mucosas de otros lugares. Las neoplasias malignas que se han asociado
existencia de autoanticuerpos contra las moléculas de adhesión de los des-
con PNP incluyen linfoma maligno, leucemia linfocitica crónica, limoma,
mosomas. Para maximizar la sensibilidad diagnóstica de las evaluaciones ini-
carcinoma broncogénico de células espinosas y sarcomas. PNP es rela-
ciales, se utilizan tanto la IFID para detectar autoanticuerpos circulantes como
cionado con neoplasias benignas rara vez (Mutasim, 1993; Flotte, 1995;
la microscopía de inmunofluorescencia directa, que resulta más informativa.
Camisa, 1993).

Pénfigo vulgar
El pénfigo vulgar es una enfermedad poco común que aparece en todos los
grupos raciales y étnicos, aunque la incidencia es ligeramente superior en la
población judía. La enfermedad afecta a ambos sexos y ocurre más común-
mente en individuos de entre 40 y 60 años (Becker. 1993). La desmoglema 3
es el principal antígeno en el PV (Lin, 1998; Naparstek. 1993).
IFD. La IFD de piel perilesional muestra inmunofluorescencia lineal/granular
de inmunoglobulina G (IgG) y C3 en ICS sin depósitos en BMZ (Fig. 45-1). Este
patrón se describe a menudo como en forma de "alambrada", que produce el
mareaje preferentemente de la mitad inferior de la epidermis. La IgG, espe-
cialmente lgG4, está presente en cerca del 100% de los pacientes mientras
que C3 está presente entre el 50% y el 100% de los pacientes, generalmen-
te en áreas acantolíticas (Becker, 1993: Flotte, 1995, Lin, 1998). Se observan
IgA o IgM inmunorreactivas en el 30% y el 50% de los pacientes (Izuno.
1986). Se muestra inmunofluorescencia debida a C3 exclusivamente, sin IgG.
en el pénfigo inducido por fármacos y en el impétigo (Nousari, 1997).
IFID. La IFID debe detectar autoanticuerpos IgG contra la superficie de
células epiteliales de la capa espinosa en el 100% de los pacientes con enfer-
medad activa (Nousari,1997). Se considera al esófago de mono como el
mejor sustrato tisular.
La presencia de autoanticuerpos de PV es anormal a cualquier titulo. El
título se suele correlacionar con la actividad de la enfermedad, y títulos que
van en aumento pueden ser predictivos de una recaída (Becker, 1993;
Crosby, 1993). Sin embargo, existen excepciones a esta correlación, por lo
que los exámenes seriados de títulos de IgG para monitorizar estos pacien-
tes se deben correlacionar cuidadosamente con los hallazgos clínicos. Los
pacientes que sólo muestran lesiones de la mucosa oral pueden no tener
autoanticuerpos de PV circulantes detectables. En estos pacientes, el diag-
nóstico se realiza utilizando IFD (Izuno, 1986). Figura 45-1. Inmunofluorescencia directa de lesión de piel en el pénfigo que
Se detectan bajos títulos de autoanticuerpos con las características de muestra depósitos lineales/granulares de IgG sobre las superficies celulares de los
ICS de forma poco frecuente en diversas condiciones como son las quema- queratinocitos (espacios intercelulares), sin fluorescencia en la zona de la mem-
duras de piel, alergia a penicilinas u oíros lármacos, necrólisis epidérmica brana basal (x 400).
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS 1003

Mutasim (1993) propuso los siguientes criterios para definir PNP:

• Erosiones mucosas dolorosas y erupciones polimorfas de la piel, con

lesiones papulosas que progresan a ampollas y lesiones erosivas que
afectan al tronco, las extremidades, las palmas de las manos y las plan-
tas de los pies, asociadas con una neoplasia oculta o clínicamente cono-
cida.
• Acantólisis suprabasilar, necrosis de queratinocitos y cambios en la mter-
fase vacuolar de secciones de tejido microscópicas y ligeras.
• IgG contra ICS combinado con depósito lineal / granular de complemen-
to e IgG a lo largo de BMZ.
• Autoanticuerpos circulantes contra ICS que se unen a epitelio vesical de
roedor y esófago de mono o cobaya.
• Inmunoprecipitación de un complejo de cuatro proteínas queratinociticas
unidas por los autoanticuerpos: esta es una herramienta de investigación
principalmente, pero puede ofrecer información clínica útil en casos difí-
ciles.

PNP asociado a neoplasias malignas señala un pronóstico extremada-

mente malo. Aunque se ha descrito la mejora clínica o la remisión de las lesio-
nes mucocutáneas tras la resección del tumor, el tratamiento de PNP asocia-
do a malignidad es de soporte. PNP asociado a una neoplasia benigna remitió
tras la resección del tumor (Mutasim, 1993).

IFD. La IFD de piel perilesional o de mucosa de pacientes con PNP detec-

ta IgG contra ICS mmunorreactivo con o sin componentes del complemento.
También están presentes depósitos granulares o menos frecuentemente line-
ales de componentes del complemento (C3, C1q) en BMZ. además de la
inmunofluorescencia de IgG contra ICS (Mutasim, 1993).
IFID. La IFID con esófago de mono o epitelio vesical de roedor pone de
manifiesto una IgG inmunorreactiva tanto en ICS como a lo largo de BMZ. La
unión a epitelio vesical de roedor (rata o ratón) es un hallazgo diferencial
importante que diferencia PNP de otros tipos de pénfigo (LIU, 1993: Mutasim,
1993).
Pénfigo IgA
(Dermatosis intercelular IgA)
IFD. La dermatosis intercelular por IgA es una enfermedad vesículo-ampo-
llosa inlraepidérmica poco frecuente. Los estudios directos muestran una
inmunofluorescencia lineal en ICS que es suprabasilar. y particularmente
acentuada en la epidermis superior.
IFID. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgA anti-ICS (Flotte.
1995: Teraki, 1991).
Penfigoide
Penfigoide ampolloso
El penfigoide ampolloso es una enfermedad ampollosa subepidérmica de
causa desconocida que aparece en pacientes de cualquier edad, pero que
principalmente afecta a adultos mayores de 60 años. Esta enfermedad invo-
lucra de forma típica las superficies flexoras de brazos, piernas, ingles, axilas
y abdomen inferior. Las membranas mucosas orales también pueden afectar-
se, pero estas lesiones raramente son el signo de presentación predominan-
te, un punto que diferencia el penfigoide del PV.
Los principales anlígenos en BP son dos proteínas hemidesmosómicas de
queratinocitos, una proteína ¡ntracelular de 230 kDa (antígeno penfigoide
ampolloso 1) y una proteína transmembrana de 180 kDa (antígeno penfigoi-
de ampolloso 2) (Nousari, 1997; Lin, 1998).
IFD. La IFD sobre piel perilesional libre de ampollas del borde de una ampo-
lla fresca es sensible para el diagnóstico y demuestra de forma típica inmuno-
fluorescencia lineal en BMZ en cerca del 100% de los pacientes (Fig. 45-2).
Los inmunorreactivos predominantes son C3 e IgG o C3 exclusivamente.
También IgA o IgM pueden estar presentes en casi un 25% de los pacientes,
generalmente en menor intensidad y en combinación con IgG (Korman, 1993;
Crosby, 1993; Izuno, 1986).
mi
Figura 45-2. Inmunofluorescencia directa de lesión de piel en el penligoide que
mueslra depósito intenso lineal de IgG a lo largo de la zona de membrana basal
(x 400).
Se puede identificar un patrón lineal epidérmico en BMZ en trastornos clí-
nicos dispares, incluyendo el penfigoide de la membrana mucosa benigno,
epidermólisis ampollosa adquirida (EBA). penfigoide gestacional (herpes ges-
tationis) y lupus eritematoso ampolloso (BLE).
Para ayudar a diferenciar estos trastornos, son útiles las biopsias directas
de piel separada en solución salina (Domloge-Hultsch, 1991). En BP y penfi-
goide gestacional, se localizan depósitos de IgG lineal en el lado epidérmico
o techo de la separación. Sin embargo, se puede observar inmunofluores-
cencia lineal de C3 a lo largo del lado epidérmico y dérmico de la separación.
En EBA y BLE, se observan inmunorreactantes en el lado dérmico de la sepa-
ración (Nousari, 1997). La correlación clínica se convierte entonces en un fac-
tor importante en la resolución de las alternativas diagnósticas.
IFID. La BP se caracteriza serológicamente por la presencia de autoanti-
cuerpos circulantes contra BMZ. tanto cutánea como de la mucosa oral. La
IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG contra BMZ en cerca del 50% de
los pacientes con penfigoide. pero la sensibilidad aumenta hasta el 70% y 80%
si se utiliza como sustrato piel separada en solución salina (Nousari, 1997;
Domloge-Hultsch. 1991: Izuno, 1986). En el BP los autoanticuerpos solo se
unen al techo de la piel separada en el 80% de los pacientes. En EBA y BLE.
los autoanticuerpos se unen a la base, o suelo dérmico, de la separación en el
50% de los pacientes (Korman. 1993; Crosby. 1993: Domloge-Hultsch. 1991).
Penfigoide benigno de membranas mucosas
El penfigoide benigno de membranas mucosas (BMMP) o penfigoide cica-
trizal afecta de forma constante a las mucosas orales y oculares. Otras muco-
sas afectadas por estas lesiones pueden ser la nasofaringe, laringe, genita-
les, recto y esófago (Mutasim, 1993). La curación de la lesión está seguida de
su cicatrización, y la ceguera es la complicación más temida.
IFD. El patrón de IFD es similar al que se observa en BP. La sensibilidad
es del 90% pero aumenta si se realizan biopsias adicionales. El penfigoide
cicatrizal localizado crónico, también conocido como penfigoide cicatrizal de
Brunstmg-Perry. es una variante del BMMP que se localiza en las regiones de
la cabeza y cuello (Sarret. 1991). En esta variante, la IFD demuestra la pre-
sencia de IgG exclusivamente, a lo largo de BMZ, sin IgA o IgM; los autoanti-
cuerpos circulantes contra BMZ son poco frecuentes (Izuno, 1986).
 1004 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

IFID. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG en menos del 33%

de los pacientes con BMMP cuando se utiliza exclusivamente mucosa oral
como sustrato pero sólo en el 5% a 15% de los pacientes si se utilizan sus-
tratos estándar (Crosby, 1993; Sarret. 1991; Nousan, 1997). El estudio de piel
humana separada en solución salina puede revelar IgA, IgG o ambos depósi-
tos en cerca del 80% de estos pacientes (Sarret. 1991).
No existe correlación entre la presencia y título de autoanticuerpos y la
actividad de la enfermedad.

Penfigoide gestacional
Aunque es poco frecuente, la enfermedad ampollosa subepidérmica
penfigoide gestacional (GP) (herpes gestationis) se desarrolla durante el
embarazo o poco tiempo después (Izuno, 1986). Las lesiones son de for-
ma tipica pruriginosas y se localizan predominantemente en el abdomen o
extremidades.
Figura 45-3. Inmunofluorescencia directa oe lesión de piel en dermatitis herpeti-
IFD. Con IFD tan sólo se pueden encontrar típicamente depósitos lineales forme mostrando deposición granular de IgA predominantemente en las cúspides
de C3 en BMZ. Se detectan depósitos de IgG asociados en el 30% al 40% de de las papilas dérmicas (x 400).
los casos, pero son raros los de IgA o IgM (Izuno, 1986).

IFID. Los depósitos de C3 sólo pueden ser visualizados a lo largo de BMZ,
pero los títulos de autoanticuerpos suelen ser demasiado bajos para ser
observados utilizando sustratos estándar de IFID. Sin embargo se puede
detectar el complemento utilizando inmunofijación de complemento si se utili-
za como sustrato piel humana normal separada en solución salina (Izuno,
1986; Nousari. 1997).
Epidermólisis ampollosa adquirida
y lupus eritematoso ampolloso
EBA y BLE son enfermedades ampollosas subepidérmicas adquiridas
caracterizadas por la presencia de autoanticuerpos contra la proteína de colá-
geno lipo VII en BMZ (Gammon, 1993). EBA puede aparecer a cualquier
edad, pero se presenta más comúnmente en adultos de entre 40 y 50 años.
Todos estos pacientes están afectados por una combinación de vesículas,
erosiones, cicatrices, milia y despigmentación de la piel, localizadas más a
menudo en superficies extensoras de piel susceptibles de traumatismo como
las rodillas, codos, o el dorso de manos y pies (Gammon. 1993) BLE ocurre
en pacientes con lupus eritematoso.
IFD. Utilizando IFD, se observan inmunorreactivos lineares en BMZ en los
pacientes con EBA y BLE, que suelen estar formados por IgG y C3. Utilizan-
do biopsias directas de tejido de piel separada por solución salina, los inmu-
norreactivos se localizan en el lado dérmico, o suelo, de la vesícula inducida.
IFID. Solo el 40% de los pacientes con EBA tienen autoanticuerpos demos-
trables cuando se utiliza piel humana sin tratamiento salino como sustrato.
Utilizando la técnica indirecta de piel separada en solución salina, se pueden
identificar autoanticuerpos circulantes en cerca del 50% al 85% de los pacien-
tes (Fine. 1994; Nousari. 1997).
Dermatitis herpetiforme
La dermatitis herpetiforme es una enfermedad ampollosa subepidérmica
pruriginosa asociada a enteropatia sensible al gluten. DH también está aso-
ciada al tipo de histocompatibilidad HLA-B8. DR3 (Crosby. 1993).
IFD. La biopsia directa debe ser de la piel perilesional porque una biop-
sia de la piel lesionada podria resultar negativa. La IFD delecta IgA granu-
lar en la cúspide de las papilas en aproximadamente el 80% al 100% de los
pacientes con DH (Flotte, 1995) (Fig. 45-3). Puede haber depósitos de IgA
a lo largo de BMZ de forma concomitante. Se encuentran con frecuencia
depósitos de C3 con IgA, pero IgG o IgM se detectan poco frecuentemente
(Izuno. 1986).
IFID. Los pacientes con DH no tienen autoanticuerpos contra BMZ detec-
tabas. Sin embargo, se detectan autoanticuerpos IgA contra endomisio en el
80% de los pacientes con DH. Estos autoanticuerpos son identificados por su
patrón característico de inmunofluorescencia en la mucosa muscular subepi-
telial de esófago de mono (Peters. 1989).
Dermatosis IgA lineal
La dermatosis IgA lineal es un cuadro subepidérmíco ampolloso poco
común considerado como una entidad clínica distinta en vez de ser una
variante de DH como se pensaba (Izuno. 1986; Crosby. 1993). La mayoría de
los casos son idiopáticos. pero algunos se asocian con fármacos (Nousari,
1999.1995; Kuechle. 1994). La dermatosis crónica ampollosa infantil es simi-
lar a la dermatosis IgA lineal, tanto clínicamente como inmunopatológicamen-
te (Elenitsas, 1995).
IFD. En casi el 100% de los casos, la IFD demuestra depósitos lineales
intensos de IgA a lo largo de BMZ pero ninguno en las papilas dérmicas (Izu-
no. 1986). Aunque casos ocasionales pueden mostrar de forma concomitan-
te un mareaje débil de C3 en BMZ, otros inmunorreactivos distintos de IgA no
suelen estar presentes.
IFID. Se pueden detectar autoanticuerpos circulantes IgA contra BMZ con
la IFID en cerca del 10% al 30% de los casos (Flotte, 1995; Crosby, 1993).
Lupus eritematoso
El lupus eritematoso es una enfermedad caracterizada serológicamente
por la presencia de autoanticuerpos múltiples incluyendo anticuerpos antmu-
cleares, anti-ADN nativo, antihistonas y anti-Sm.
IFD. Con la IFD, se observan depósitos característicos gruesos, granula-
res y continuos de inmunoglobulinas y complemento a largo de la BMZ epi-
dérmica en el 50% al 95% de los pacientes con LES (Izuno, 1986). Los depó-
sitos en BMZ del complejo de ataque a la membrana, C5b-9. en piel de la
lesión pueden ser marcadores de LES (Helm. 1993).
A pesar de que estos pacientes tienen comúnmente depósitos de IgG, IgM
y componentes del complemento (C3 o C1q) (Fig. 45-4), se pueden identificar
inmunoglobulinas de todas las clases (Izuno, 1986). Cuando la piel no lesio-
nada contiene al mismo tiempo inmunoglobulinas IgG, IgA o IgM en el patrón
típico, es más probable que el diagnóstico sea LES (Izuno, 1986).
Aunque es característico, este patrón de reacción se puede observar en otras
enfermedades como la enfermedad mixta del tejido conjuntivo, oermatomiositis.
reacción de injerto contra huésped, erupción por fármacos y vasculitis (Izuno.
1986). Por tanto es obligatorio correlacionar los resultados directos tanto con la
presentación clínica como con los resultados del estudio de una biopsia de piel
por microscopia óptica. Esta información es después interpretada en el contexto
de los hallazgos directos individuales para clasificar el tipo clínico de LE. Nume-
rosas publicaciones citan la IFD con la finalidad del diagnóstico de LES a partir
de piel obtenida por biopsia, con o sin lesiones, y de lugares expuestos o no
expuestos al sol. En pacientes diagnosticados con LES. la piel normal expuesta
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS 1005

al sol se confirma como positiva en cerca del 70% de los casos, mientras que la
piel normal no expuesta al sol es positiva en cerca del 40% de los pacientes (Izu-
no, 1986). Sin embargo, el potencial para predecir la actividad de la enfermedad
o la afectación renal de esta forma sigue resultando controvertida (Izuno, 1986).
Tal vez la aplicación clínica más práctica de las pruebas de laboratorio es el
diagnóstico diferencial de LES del LE discoide (LED). Casi el 95% de los indivi-
duos con LED tienen depósitos en BMZ gruesos, granulares y continuos simila-
res a los de LES (Izuno. 1986). Sin embargo, los hallazgos positivos con IFD en
LED están confinados a la piel lesionada, mientras que la IFD con piel con o sin
lesión puede dar hallazgos positivos en el LES (Izuno. 1986).
El lupus eritematoso cutáneo subagudo (LECS) está caracterizado clínica-
mente por artritis, manifestaciones sistémicas leves y autoanticuerpos anti-
SS-A/Ro. La IFD de biopsias de piel de estos pacientes detecta depósitos de
inmunoglobulina o complemento en tan sólo el 50% de las biopsias de piel
lesionada y en el 30% de biopsias de piel no implicada (Izuno. 1986). La IFID
es positiva en el 50% al 70% de los pacientes con LECS.
Otras enfermedades autoinmunes sistémicas importantes no ofrecen
hallazgos específicos para el diagnóstico ni por IFD ni por IFID. Aunque algu-
nos pacientes tienen depósitos granulares de IgM a lo largo de BMZ, se con-
sidera este hallazgo inmunopatológico un marcador completamente inespecí-
fico que puede ser detectado no sólo en enfermedades autoinmunes, sino
también en un gran número de dermatitis o en la piel expuesta al sol de indi-
viduos clínicamente normales (Izuno. 1986).
Vasculitis
Las vasculitis de la piel tienen varios sinónimos, incluyendo vasculitis leuco-
citoclástica, vasculitis alérgica y angeitis I vasculitis por hipersensibilidad. His-
tológicamente, los pequeños vasos sanguíneos de la dermis muestran células
endoleliales con tumefacción, exocitosis neutrofilica. detritus nucleares ("leu-
cocitoclasis") y trombos conjuntamente con eritrocitos extravasados.
IFD. La siopsia de tales lesiones dentro de las 24 horas de su comienzo, pue-
de exhibir depósitos de IgM. C3. fibrinógeno y algunas veces IgG (Fig. 45-5). Un
resultado negativo no excluye la vasculitis. La biopsia de una piel de más de
24 horas podría no ser útil puesto que el único hallazgo podría ser el marca-
je no especifico del fibrinógeno. La confirmación histológica del diagnóstico se
hace por tanto esencial. La púrpura de Henoch-Schónlem se diagnostica
cuando se observa inmunofluorescencia vascular granular IgA con o sin C3
dentro del marco clínico apropiado.

Figura 45-4. Inmunolluorescencia directa de piel en lupus eritematoso que muestra inmu-
norreactivos IgG (A), C1q (B) e IgM (C) granulares, bastante continuos a lo largo de la
zona de la membrana basal (x 400).
 1006 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

tes con PBC, pero se observan en pacientes con infección por virus Epsteín-
Barr, infección por citomegalovírus y otros trastornos infecciosos. Los
NOMA están dirigidos contra epítopos de los antígenos M2 y M9 en la PBC.
pero no contra los mismos antígenos que los AMA (Bylund. 1992). Aunque
la trascendencia de los NOMA no está aclarada, su presencia en personas
asociadas con pacientes de PBC ha generado preguntas sobre la posible
existencia de agentes contagiosos en los sueros de eslos pacientes
(Bylund, 1992).

Autoanticuerpos antimúsculo liso

Los anticuerpos antimúsculo liso (SMA) se encuentran en aproximada-

mente un 50% de los pacientes con AiH clásica y suelen aparecer junto con
ANA (Nakamura. 1991). Cuando se acompañan de un trastorno hepático,
los SMA están dirigidos contra actina F, que forma parte del citoesquelelo
Figura 45-5. Inmuno-fluorescencia directa de piel en vasculitis cutánea de pequeños de la célula hepática en asociación directa con la membrana plasmática de
vasos que muestra inmunofluorescencia vascular de los vasos del plexo capilar super- las células hepáticas (Nakamura, 1991). Es típico que el título de SMA sea
ficial. Esta biopsia es de un paciente con púrpura de Henoch-Schólnem y demuestra superior o igual a 1:80 en el suero de pacientes con AiH. Sin embargo, se
el inmunomarcaje vascular por IgA característico de esta enfermedad (x 400). pueden detectar títulos bajos de SMA en pacientes con otros trastornos y en
individuos que aparentemente están sanos (Nakamura, 1991).
Se utiliza con frecuencia la IFID sobre sustrato de tejido estomacal de roe-
HÍGADO dor para detectar SMA, de manera que se tiñe la capa muscularis propria del
estómago con un patrón uniforme y constante (Fig. 45-7). Es característica la
tinción específica de la muscularis mucosa y las paredes de los vasos san-
Autoanticuerpos guíneos. Si se utiliza como sustrato un bloque de tejido de estómago/riñón de
roedor, se puede producir un mareaje débil en las zonas mesangiales glome-
Autoanticuerpos antinucleares
rulares debido a la presencia de actina F en esta región. Si se utilizan células
Los autoanticuerpos antinucleares (ANA) se detectan más frecuentemente Hep-2 en vez de otros sustratos, la IFID revela un mareaje citoplasmático de
por IFID, aunque la identificación de autoanticuerpos específicos por ELISA se aspecto "cableado" cuando están presentes los SMA.
está haciendo más popular en los laboratorios clínicos. Los ANA son un grupo
muy heterogéneo, y casi todos los subtipos que aparecen en los trastornos
reumatológicos se pueden encontrar en personas con AiH. Los patrones tanto
homogéneos como moteados en células Hep-2 se pueden identificar más fre-
cuentemente en pacientes con AiH. También se han descrito autoanticuerpos
específicos contra el ADN de doble cadena en enfermedades hepáticas
(Manns, 1992). Se detectan títulos de ANA superiores a 1:80 en casi el 80%
de los pacientes con AiH (Nakamura. 1991). Sin embargo, también pueden
encontrarse ANA en el 60% de pacientes con PBC, 50% de pacientes con tras-
tomos hepáticos relacionados con el alcohol, en el 40% de pacientes con
hepatitis viral tipo B y en el 25% de pacientes con AiH que también tienen auto-
anticuerpos antimicrosomales renales y hepáticos (LKMA) (Nakamura, 1991).
Se pueden identificar autoanticuerpos anticentrómero en el 10% a 15% de los
pacientes con PBC.

Autoanticuerpos antimitocondriales
Se han identificado nueve antigenos mitocondriales por separado que
reaccionan con anticuerpos antimitocondriales (AMA). Los AMA dirigidos con-
tra los antígenos M2 y M9 se consideran los marcadores diagnósticos más
importantes de PBC (Bylund, 1992).
Los AMA que se detectan por IFID usando como sustrato bloques de tejido
de estómago/riñón de roedor muestran un patrón de fluorescencia típico que
refleja un mareaje citoplasmático homogéneo de las zonas correspondientes
a los túbulos renales y a las células parietales; también son positivos los túbu-
los distales (Fig. 45-6). Este mareaje de los túbulos distales es un punto
importante en la diferenciación de la reactividad de los AMA frente a los
LKMA. que no producen mareaje en los lúbulos renales distales.
El autoantigeno M2 es una mezcla heterogénea que contiene diversos
componentes del complejo mitocondrial 2-oxo-ácido dehidrogenasa. El
autoantigeno dominante M2 en pacientes con PBC es la subunidad E2 de
piruvato dehidrogenasa (PDH-E2), de 70 kDa (Manns, 1992). El segundo
autoantigeno mitocondrial más común es la subunidad de 50 kDa E2 de la
cadena ramificada oxo-ceto-ácido-dehidrogenasa (BCOADH-E2) (Manns,
1992). Se pueden encontrar autoanticuerpos mitocondriales de aparición Figura 45-6. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimitocondriales
natural (NOMA) en personas que han tenido contacto cercano con pacien- utilizando como sustrato estómago/riñón de ratón. Hay una inmunofluorescencia
tes de PBC e incluso en el personal técnico de laboratorio que procesa sue- difusa de los túbulos renales, incluyendo los túbulos distales (A, x 200) que tiene
ros con PBC (Bylund, 1992). Los NOMA se producen raramente en pacien- una apariencia citoplasmática homogénea a mayor aumento (B, x 400).
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
Figura 45-7. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimúsculo
liso utilizando como sustrato estómago/riñón de ratón ( x 400).
Autoanticuerpos antimicrosomales de hígado y riñon
Los LKMA producen el mareaje de los microsomas de hepalocitos y de
túbulos proximales renales cuando se utiliza un bloque de tejido de estóma-
go/riñón de roedor como sustrato para la IFID (Fig. 45-8). Los túbulos renales
dislates son característicamente negativos en la inmunolluorescencia. La
aparición simultánea de AMA y LKMA es posible pero muy poco probable.
Se está empezando a disponer de ELISA para detectar LKMA en los labo-
ratorios clínicos. La presencia de LKMA también puede ser confirmada utili-
Figura 45-8. Inmunolluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimicrosomales
de higado-riñón utilizando como sustrato estómago/riñón de ratón. Aparece inmu-
nofluorescencia de los túbulos renales proximales. pero no en los túbulos distales.
(A. x 200) que tiene una apariencia citoplasmática finamente granular a mayor
aumento (B. x 400).
1007
zando transferencia westem. aunque este ensayo no está disponible fuera de
los laboratorios de investigación.
Utilizando el procedimiento de transferencia western. los LKMA se han
agrupado en tres subtipos basándose en sus antigenos diana (Manns, 1992).
Se ha identificado un componente de 50 kDa del citocromo P-450IID6 como
el principal antígeno de los LKMA-1 (Manns, 1992). Se encontró LKMA-2,
dirigido contra el citocromo P-450 IIC9, en pacientes que estaban en trata-
miento con ticrinafeno (Manns, 1992). un fármaco que ha desaparecido del
mercado americano. Se ha identificado LKMA-3 en sueros de pacientes con
hepatitis viral crónica tipo D (Manns. 1992).
Otros autoanticuerpos hepáticos
Los restantes grupos de autoanticuerpos hepáticos incluyen los autoanti-
cuerpos anticitoesqueleto. anticitosol, antimembrana hepática, antiláminas
nucleares, específicos de hígado y autoanticuerpos antirreceptor de asialogli-
coproteína. Todos ellos han sido identificados en pacientes con enfermedades
hepáticas autoinmunes, pero su uso como marcadores diagnósticos no está
actualmente extendido (Nakamura, 1991).
Enfermedades hepáticas
La Tabla 45-3 recoge los perfiles serológicos típicos en AiH, PBC y colan-
gitis esclerosante primaria (PSC). Estos son trastornos crónicos típicamente
definidos por concentraciones séricas de transaminasas elevadas al menos
durante seis meses.
El diagnóstico clínico diferencial común incluye las enfermedades hepáti-
cas relacionadas con el alcohol, daño hepático inducido por fármacos, hepa-
titis virales, o hígado graso de diabetes mellitus u obesidad. Otros diagnósti-
cos diferenciales menos frecuentes son la hemocromalosis idiopática, la
enfermedad de Wilson, el déficit de a,-antitripsina y la afectación hepática en
enfermedades sistémicas.
Hepatitis autoinmune
La AiH aparece de forma clásica en mujeres de aproximadamente 35 años
que presentan una elevada concentración sérica de transaminasas. hiper-
gammaglobulinemia. amenorrea, artralgia y autoanticuerpos circulantes como
ANA. SMA y LKMA. Por delinición, estas pacientes no tienen evidencia sero-
lógica de hepatitis viral, enfermedad de Wilson u otras enfermedades en el
diagnóstico diferencial. Histológicamente, la biopsia hepática muestra hepati-
tis crónica con necrosis en sacabocados. La respuesta del paciente a corti-
coides es espectacular y el fallo en la respuesta siembra dudas sobre el diag-
nóstico de AiH.
La AiH es un grupo heterogéneo de enfermedades de etiología dudosa. No
hay características palognomónicas para la AiH. El Grupo Internacional de
Hepatitis Autoinmune (IAHG) ha integrado las características clinicas y de
laboratorio que puede presentar un paciente en un sistema de puntuación
para diagnosticar de forma definitiva o probable la AiH. La Tabla 45-4 recoge
los parámetros analíticos de laboratorio clínico utilizados como criteno para
diagnosticar AiH; en la bibliografía se recogen otros criterios e interpretacio-
nes por puntuaciones (Johnson, 1993: Manns, 1998). De manera relevante,
la ausencia de ANA, SMA o LKMA no excluye este diagnóstico.
Aunque la bibliografía médica muestra subtipos de AiH basándose en los
patrones de autoanticuerpos, la utilidad clínica de estos subtipos no está cla-
ra, y la IAHG no recomienda la subdivisión de AiH basada en los perfiles de
autoanticuerpos. Desde una perspectiva clínica, la AiH puede ser vista como
una enfermedad hepática crónica caracterizada por la presencia de gran
variedad de autoanticuerpos. La mayoría de los expertos están de acuerdo en
que los tipos 1 y 2 de AiH son las principales formas de esta enfermedad,
mientras que los subtipos adicionales aun deben demostrar sus resultados.
Puesto que los distintos subtipos de AiH están ampliamente citados, la clasi-
ficación de AiH de acuerdo con su perfil serológico se discute aquí brevemente.
Los ANA caracterizan la forma clásica de hepatitis autoinmune. el tipo 1.
Los SMA también se detectan con frecuencia. Aunque los AMA son marca-
dores diagnósticos de PBC específicos y sensibles, como se describe más
tarde, también pueden ser detectados en cerca de 15% de los pacientes con
 1008 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 45-3 E n f e r m e d a d e s hepáticas a u t o i n m u n e s

ANA LKMA SLA SMA AMA ANTI-HCV p-ANCA ACÁ Tratamiento

Hepatitis autoinmune
Tipo 1 Inmunosupresión

+ 1

-H
i i
i i i i i ++ i

1 1 1

i
Tipo 2a Inmunosupresión

i +
Tipo 2b

l
-H + 1 1 1
Inmunosupresión

i +
Tipo 3

i
Tipo 4 Inmunosupresión

1 + 1 1
PBC Soporte, traducir

1
PSC Soporte; traducir

+
AiC + Inmunosupresión

l
•
AiC = colangiiis autoinmune; ANA • anticuerpos antmucleares. p-ANCA = anticuerpos pennucleares anticitoptasma de neulrófitos. LKMA = autoanticuerpos antwru-
crosomales de hígado y riñon; SLA = anticuerpos contra antigenos hepáticos solubles; SMA = anticuerpos antimusculo liso. AMA = anticuerpos antimitocondriales.
HCV = virus de hepatitis C. PBC = cirrosis biliar primaria: ACÁ = anhidrasa carbónica, PSC = colangitis esclerosante primaria.
Modificado de Manns MP Autoinmmune diseases ot the liver Clin Lab Med 1992: 12 25-40 con permiso
- ... — — y

las características clínicas e histológicas de AiH, incluyendo la mejora clíni-
ca como respuesla a la terapia mmunosupresora. Se considera que dichos
pacientes tienen un síndrome con caracterislicas que se "superponen" tanto
con AiH como con PBC. El título de AMA en este subgrupo de AiH raramen-
te es superior a 1:40 (Bylund. 1992). Adicionalmente. el antígeno específico
Tabla 45-4 P a r á m e t r o s d e laboratorio y puntuación para el
d i a g n ó s t i c o de hepatitis a u t o i n m u n e (AiH)
Parámetros analíticos Puntuación
de estos AMA es similar al que se encuentra en la PBC clásica (Manns.
1992|. La enfermedad hepática en la que se detectan LKMA, denominada
AiH tipo 2, se ha subdividido en dos grupos, los tipos 2a y 2b. Generalmen-
te los pacientes con esta variante de AiH tienen ANA y SMA negativos. Sin
embargo, se detectan con frecuencia autoanticuerpos contra mtcrosomas
tiroideos, tiroglobulina y células parietales. La AiH de tipo 2 se caracteriza por
bajos niveles de IgA y porque la hipergammaglobulinemia es menos desta-
cada que la observada en la AiH tipo 1 (Manns. 1992). La de tipo 2a apare-
ce en mujeres jóvenes que tienen altos títulos de KLMA-1. serología negati-
va para virus de hepatitis C y enfermedad activa pero que responde a
esteroides.

Bioquímica La variante de tipo 2b aparece en pacientes mayores y la preponderancia

femenina es menor. Estos pacientes tienen títulos bajos de LKMA-1, mani-
Proporción de aumento de fosfatasa alcalina
respecto a transaminasas fiestan enfermedad hepática leve y a menudo tienen serología positiva para
> 3.0 -2 el virus hepatitis C. Su enfermedad tiende a responder menos a la inmunosu-
< 3.0 +2 presión que el tipo 2a.
Globulinas séricas totales, globulinas o IgG Algunos autores han propuesto un tercer grupo de AiH separado de los otros
(x nivel superior normal)
subgrupos de AiH basándose en la identificación de autoanticuerpos contra anti-
>2.0 +3
1,5-2.0 +2 genos solubles de hígado (SLA) (Manns, 1992). Aunque la determinación de
1.0-1.5 +1 estos autoanticuerpos podría convertirse en importante puesto que se ha evi-
<1.0 0 denciado como el único marcador serológico en cerca del 25% de los pacientes
Autoanticuerpos (IFID) de AiH, los test fiables para detectar SLA son técnicamente difíciles y aún no
Adultos están disponibles para su uso habitual en el laboratorio clínico (Manns. 1992).
ANA. SMA. LKM1 Puede ser que los altos títulos de SMA dirigidos contra actina F caracteri-
>1 80 +3
1 80 +2 cen un cuarto subgrupo de las AiH que se observa frecuentemente en niños
1.40 +1 (Manns. 1992).
<1:40 0
Niños
ANA LKM Cirrosis biliar primaria
>1:20 +3 La PBC es un trastorno crónico, progresivo y colestásico que sucede típi-
1:10 o 1:20 +2
camente en mujeres jóvenes o de mediana edad. Los pacientes pueden estar
< 1 10 0
SMA asmtomáticos o tener síntomas de colestasis (picores). Estudios de laborato-
>1:20 +3 rio han demostrado una elevación de la fosfatasa alcalina con o sin hiperbili-
1:20 +2 rrubinemia. así como un incremento de IgM y AMA. Pueden producirse fenó-
<1:20 0 menos inmunológicos extrahepáticos como el fenómeno de Raynaud.
AMA complejo sicca. artritis reumatoide. tiroiditis. esclerodermia o enfermedad
Delectado -2 celíaca (Manns, 1992: Bylund, 1992). Histológicamente, el hígado muestra
No detectado 0
Adultos y niños (si no se detectan ANA. SMA, LKM1) varios estadios de colangitis destructiva no supurativa.
Otros autoanticuerpos hepáticos (SLA. ASGP-R. LC1) Los AMA son los marcadores diagnósticos más sensibles y específicos
Detectados +2 para PBC. Como regla general, un título de AMA superior o igual a 1:160 es
No deteclados 0 altamente predictívo de PBC, aunque cerca del 10% de los pacientes de PBC
Marcadores virales tienen títulos de AMA de 1:16 o menores (Bylund. 1992). Cerca del 95% de
HAV o HBV aguda -3 los pacientes con características típicas de PBC han mostrado tener anti-M2
HCV por ELISA o RIBA -2
o anti-M9, mientras que el 5% restante de pacientes son AMA negativos.
ARN HCV por PCR -3
Otras inlecciones virales activas -3 La causa de la PBC es desconocida. Aunque esta enfermedad se asocia
Seronegativo para virus conocidos +3 clásicamente con AMA séricos, el daño inmune mediado por células T a los
Factores genéticos conductos biliares interlobuhllares intrahepáticos predomina en las lesiones
HLA-B8-DR3 o alotipo DR4 +1 tisulares (Manns. 1991.1998: Batts. 1991: Poupon, 1996). El reciente descu-
Adaptado de Johnson PJ. McFarlane IG. Convenors on behall ol the panel: brimiento de anticuerpos contra retrovirus en pacientes con PBC se ha atri-
Meeting report International autoimmune hepatitis group. Hepatology 1993: 18: buido a una respuesta inmune o a la reactividad inmune contra proteínas vira-
998-1008. con permiso les que comparten epítopos con retrovirus (Masón. 1998).
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS 1009

El diagnóstico de PBC AMA negativo deriva de la presentación clínica,

hallazgos en la biopsia hepática y colangiogratía, siendo esta ultima realiza-
do para descartar PSC.

Colangitis esclerosante primaria

La PSC ocurre de forma típica en varones con historia de enfermedad in-

flamatoria intestinal o diarrea. En el 50% de los pacientes, la enfermedad
inflamatoria intestinal ligada a PSC es la colitis ulcerosa. El diagnóstico de
PSC se basa de forma general en la colangiografía, que revela un patrón arro-
sariado característico de los conductos biliares debido a constricciones multi-
focales en estos lugares. La lesión histológica más destacada es la colangitis
fibrosa de conductos biliares grandes o pequeños, aunque en la práctica se
puede observar un amplio espectro de lesiones inflamatorias crónicas en la
biopsia hepática.
Estudios bioquímicos de rutina demuestran la elevación de la fosfatasa
Figura 45-9. Inmunolluorescencia indirecta de autoanticuerpos microsomales
alcalina y un aumento de transaminasas con o sin hiperbilirrubinemia. Aunque tiroideos utilizando tejido tiroideo de mono no lijado como sustrato (x 400).
pueden estar presentes los ANA, los AMA no lo están.
Además, la IFID en neutrófilos fijados en etanol y formalma exhibe una alta
prevalencia de anticuerpos citoplasmáticos perinucleares atipicos antineutró-
filos descritos (Bansi, 1996; Lo, 1994; Gur, 1995: Manns, 1992).
la población lemenina adulta sin enlermedad clínica tiene anti-Tg o anti-TPO
detectables. lo que desata la pregunta sobre su significado patogénico
Colangitis autoinmune (Patrick, 1993) El reemplazo de hormona tiroidea queda reservado para
pacientes con hipotiroidismo probado.
La colangitis autoinmune es una enfermedad hepática crónica colestásica
Existen semejanzas entre la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashi-
que no parece ser una variante de PSC (Goodman, 1995: Tsui, 1997). La pre-
moto (Utiger, 1991). Ambas están asociadas con HLA-B8: ambas comparten
sentación clínica y la apariencia histológica del hígado se asemejan a la PBC.
fundamentalmente una patogénesis similar, y se cree que la enfermedad de
pero los hallazgos serológicos imitan a los de la AiH tipo 1. No se detectan
Graves puede progresar hacia una tiroiditis de Hashimoto (Utiger, 1991;
AMA. Además se ha detectado un autoanticuerpo contra la anhidrasa carbó-
Patrick. 1993).
nica en algunos pacientes con AiC (Gordon, 1995).
Aunque la conexión entre AiC y PBC no está resuelta, la AiC podría ser lo
mismo que una PBC AMA negativa. Generalmente los pacientes responden a Autoanticuerpos
la inmunosupresión.
En las enfermedades tiroideas autoinmunes hay tres autoanticuerpos
principales, que incluyen los anti-TPO, anti-Tg y autoanticuerpos contra el
GLÁNDULA TIROIDES
receptor de la hormona estimulante de tiroides (anti-TSHR) (Naparstek,
1993). Aunque los anticuerpos anti-TPO y anti-Tg se consideran marcado-
Enfermedades tiroideas res de enfermedad tiroidea autoinmune. su papel etiológico no ha sido
Las enfermedades tiroideas autoinmunes incluyen la enfermedad de Gra- esclarecido. Pueden aparecer también en otras enfermedades autoinmunes
ves y la tiroiditis de Hashimoto (Burek, 1995). específicas de órgano. Los anticuerpos anti-TSHR. sin embargo, desempe-
ñan claramente un papel causal en la enfermedad tiroidea autoinmune
(Naparstek, 1993).
Enfermedad de Graves
El paciente con enfermedad de Graves presenta síntomas de hipertiroi-
Autoanticuerpos contra la peroxidasa tiroidea
dismo y bocio difuso. La máxima incidencia aparece entre la tercera y cuar-
ta décadas de la vida, y la razón mujer/hombre es de 4 a 8:1; entre el 60% Los anticuerpos anti-TPO van dirigidos contra un antígeno de 105 kDa con-
y el 70% de estos pacientes manifiestan adicionalmente trastornos ocula- tenido en la fracción microsomal del citoplasma de células epiteliales tiroide-
res (Patrick, 1993). Los datos de laboratorio muestran un incremento en los as (Burek. 1995). Aunque el método de laboratorio que se utiliza más comun-
niveles de triyodotironina (T¡) y tiroxma (T,). y también en la captación de mente para detectar anti-TPO es la técnica de hemaglutinación pasiva
Tj. La terapia está dirigida a reducir la capacidad de la glándula tiroides cuantitativa (Nordyke, 1993). el ELISA también puede utilizarse con este fin
para responder a la estimulación por autoanticuerpos. Esto se puede con- en los laboratorios clínicos.
seguir por una tiroidectomía subtotal, por administración de yodo radiacti-
Históricamente, IFID ha sido un método popular y sensible para la detec-
vo, o con la utilización de fármacos como propiltiouracilo o metimazol
ción de anti-TPO ("anticuerpos antimicrosomales"). El test de IFID utiliza
(Patrick, 1993).
como sustrato secciones de tejido crioconservado de mono o humano, no fija-
do y secado al aire. Los sueros positivos marcan el citoplasma de las células
Tiroiditis de Hashimoto epiteliales foliculares tiroideas pero no su núcleo (Fig. 45-9). Se debe dife-
renciar entre anti-TPO y AMA cuando se observe mareaje citoplasmático gra-
La tiroiditis de Hashimoto es la forma más común de tiroiditis. y se carac- nular grueso: esto puede hacerse analizando los sueros con tejido de esto-
teriza funcionalmente por una lenta progresión hasta hipotiroidismo. En mago/riñón de ratón.
pacientes con hipotiroidismo. los niveles de T „ T. y captación de T suelen ser
3 Se pueden detectar anti-TPO en el suero de pacientes tanto con enferme-
bajos y la cantidad de hormona estimulante del tiroides (TSH) se incrementa dad de Graves como con tiroiditis de Hashimoto, y su presencia y titulo se
anormalmente (Patrick, 1993). La incidencia de tiroiditis de Hashimoto es correlacionan luertemente con la enfermedad clínica activa (Burek. 1995).
máxima desde la tercera a la quinta décadas, con una razón mujeres/hom- Existe cierta controversia entre los investigadores acerca de si la determina-
bres de 10:1. Los autoanticuerpos dirigidos contra los antigenos de tiroglobu- ción de anti-TPO aislada es suficiente para detectar enfermedad tiroidea
Ima (anti-Tg) y peroxidasa (microsomal) tiroidea (anti-TPO). son clínicamente autoinmune de manera dable (Kaplan. 1999; Nordyke, 1993). El papel pato-
los más importantes para el diagnóstico (Patrick. 1993), pero hasta el 20% de génico de los anti-TPO permanece sin esclarecer (Naparstek. 1993).
 1010 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Autoanticuerpos contra tiroglobulina
Los anti-Tg están dirigidos contra la tiroglobulina, que es la forma de alma-
cenaje de las hormonas tiroideas en los folículos de la glándula tiroides
(Burek, 1995). Se encuentran disponibles varios métodos para la medida de
anti-Tg, incluyendo la técnica de hemaglutinacíón pasiva cuantitativa, IFID y
ELISA.
La técnica de hemaglutinacíón pasiva cuantitativa tanto con hemaglutina-
cíón con cloruro de cromo como con glóbulos rojos recubiertos es el método
más sensible y ampliamente utilizado para la detección de anti-Tg (Burek,
1995). Los anticuerpos anti-Tg detectados por hemaglutinacíón son identifi-
cados con títulos superiores a 1:1.000 en cerca del 80% de los pacientes con
tiroiditis de Hashimoto (Burek. 1995). Los pacientes con enfermedad de Gra-
ves (60%) o carcinoma de tiroides (30%) u otras enfermedades autoinmunes
como la anemia perniciosa o el síndrome de Sjógren, y entre el 3% y el 18%
de los individuos aparentemente normales, también pueden tener anti-Tg,
pero sus títulos de hemaglutinacíón son generalmente (>90%) inferiores a
1:1.000 (Burek, 1995).
Para localizar anti-Tg, se realiza una IFID utilizando secciones de tejido
criopreservadas de glándula tiroides de mono. Se requiere la fijación para
impedir la pérdida de tiroglobulina durante las etapas de lavado. Se describen
tres patrones de ¡nmunofluorescencia cuando están presentes los anti-Tg
(Burek, 1995): 1) patrón flocular; 2) espacios coloidales en sombra pero fluo-
rescencia periférica brillante; y 3) mareaje difuso, brillante, uniformemente
marcado en un patrón de "vidrio molido" atribuido a la reacción de anti-Tg con
CA2 (Burek, 1995). CA2, denominado segundo antígeno coloidal, se detecta
como único marcador serológico de las tiroiditis autoinmunes en el 5% y el 8%
de los pacientes que son positivos por IFID pero negativos para anti-Tg y anti-
TPO utilizando otros métodos (Bigazzi, 1992).
Autoanticuerpos contra el receptor de la hormona
estimulante de tiroides
Los autoanticuerpos anti-TSHR constan de dos grupos de autoanticuerpos
que pueden tanto estimular como bloquear los TSHR, causando respectiva-
mente hipertiroídísmo o hipotiroidismo. Los autoanticuerpos anti-TSHR que se
unen a estos receptores y estimulan la producción de hormonas se denomi-
nan inmunoglobulinas estimulantes del tiroides (TSI), mientras que los auto-
anticuerpos anti-TSHR que se unen a los receptores y bloquean la unión y
(unción de TSH se denominan inmunoglobulinas inhibidoras de la unión de
TSH (TBII) (Brunt, 1995, fvlooij, 1993). Los TSI son probablemente la causa
del hipertiroidismo en la enfermedad de Graves (Bigazzi, 1992; Brunt, 1995:
Wilkin. 1990). Su prevalencia varia desde un 55% hasta un 95%, dependien-
f
Tabla 45-5 Hallazgos por ¡nmunofluorescencia directa en las principales enfermedades glomerulares
Patrón de ¡nmunofluorescencia y enfermedad Reactivos inmunes
Depósitos granulares, mesangiales y en GBM
Glomerulonefritis aguda postestreptocócica
Nefritis lúpica proliferativa difusa
Glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN. tipo I)
Glomerulonefritis idiopática en semilunas por complejos inmunes
Enfermedad de depósitos densos (MPGN tipo II)
Infecciones crónicas (p.ej. endocarditis bacteriana)
Granulares, predominancia mesangial
Nefritis lúpica
Mesangial
Proliferativa focal
Púrpura de Henoch-Schónlein
Nelropatía IgA
Granulares, predominantemente GBM
Nefritis lúpica membranosa
Crioglobulinemia mixta
Lineal, en GBM
Nefritis por anti-GBM
Nefropatía por cadenas ligeras
GBM = membrana basal glomerular; TBM = membrana basal tubular.
Modificado a partir de McCIuskey RT, Collms AB, Niles JL Kmdney. En Colvin RB, Bhan AK, McCIuskey (eds): Diagnoslic Immunopatthology, 2> ed. New York, Raven
Press. 1995, pág 109. con permiso.
do del método de detección (Bigazzi. 1992; Brunt, 1995). Los TSI. que suelen
ser de la clase IgG, estimulan la producción de hormonas tiroideas activando
el sistema de adenilato ciclasa tras su unión al TSHR (Patrick, 1993).
Los ensayos para anti-TSHR son útiles para confirmar la enfermedad de
Graves en pacientes hipertiroideos con resultados equívocos en los estudios
habituales de laboratorio (Bigazzi, 1992). Adicionalmente, se puede utilizar un
ensayo de anti-TSHR para monitorizar la terapia de sustitución hormonal del
paciente o para diagnosticar la tirotoxicosis neonatal (Bigazzi, 1992).
Existen dos clases principales de ensayos para anti-TSHR, denominados
bioensayos y ensayos de unión; los aspectos metodológicos son revisados en
otros trabajos (Bigazzi, 1992; Patrick, 1993; Gupta, 1988). Nuevos ensayos
con el suero del paciente basados en la estimulación de adenosin monofos-
fato cíclico (cAMP) en células de tiroides de rata, mantenidas en cultivo tisu-
lar, pueden confirmarse como una mejora sobre las dificultades técnicas de
los bioensayos (Burek. 1995).
Los TSI son analizados en bioensayos que determinan el aumento de acti-
vidad mediado por TSHR por la medida del cAMP liberado o bien por la medi-
da de la captación de yodo por células tiroideas mantenidas en cultivo (Brunt,
1995). Los TBII son analizados por la determinación de la inhibición de la
unión de TSH marcada radiactivamente a su receptor o utilizando bioensayos
con cAMP (Brunt, 1995).
RIÑON
GLOMERULONEFRITIS
La glomerulonefritis es la principal causa de enfermedad renal primaria.
Se piensa que los mecanismos mediados por inmunidad juegan un papel
importante en la patogénesis de la glomerulonefritis, aunque la confirmación
experimental de dichos mecanismos autoinmunes aún no ha sido llevada a
cabo.
La IFD tiene un papel importante en el estudio y diagnóstico de la glome-
rulonefritis. Los patrones de reactantes inmunes pueden ser divididos a gran-
des rasgos en aquellos que causan depósitos granulares o lineales en el glo-
mérulo u otras estructuras del riñon examinadas con IFD. Los depósitos
granulares se han atribuido a complejos inmunes (IC) que abandonan la cir-
culación o se forman in situ (McCIuskey, 1995). Los patrones de IFD de depó-
sitos inmunes asociados con las principales enfermedades glomerulares se
resumen en la Tabla 45-5. Se encuentran disponibles revisiones minuciosas
de estos trastornos en varios textos (McCIuskey, 1995; Heplinstall, 1992). Sin
embargo, para esta exposición, sólo se presentan en mayor detalle los auto-
anticuerpos contra la membrana basal glomerular (anti-GBM).
C 3 ± IgG difuso, IgM
IgG, IgA, IgM, C 3
C 3 , IgG. IgM
IgG. C 3 ± IgM
C 3 (globular) ± IgM
IgG. IgM. C 3
IgG, C 3 , generalmente IgM e IgA
IgG, C 3 , IgA; depósitos focales en el asa capilar
Predominantemente IgA; IgG. IgM, C 3
predominantemente IgA: a menudo IgG. IgM. C 3
IgG C 3 . IgA. IgM
IgM IgG C 3 , masas mtravasculares
IgG, C 3 ; IgA e IgM poco frecuentes
Generalmente cadena ligera K, tal vez en TBM. vasos sanguíneos, intersticio
... .
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
Enfermedad por anticuerpos contra la membrana
basal glomerular
La presentación clínica en pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-
GBM varía en cuanto que cerca de un 50% tienen enfermedad limitada al
riñon mientras que el otro 50% tiene síntomas tanto renales como pulmona-
res. Esta última presentación es denominada frecuentemente síndrome de
Goodpasture. Raramente los pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-
GBM pueden tener enfermedad limitada a los pulmones (Wilson, 1987).
El diagnóstico de la enfermedad por anticuerpos anti-GBM requiere la
detección de autoanticuerpos anti-GBM contra el dominio NC1 del colágeno
tipo IV (McCIuskey. 1995), el denominado antígeno de Goodpasture. Los
métodos para la detección de anticuerpos anti-GBM incluyen IFID. ELISA y
radioinmunoensayo (RÍA) (McCIuskey, 1995: Wilson, 1987): algunos investi-
gadores han desarrollado adicionalmente un test sensible de transferencia
western (McCIuskey, 1995). Debido a que la IFID es difícil de estandarizar y
requiere experiencia para realizarse, los métodos para la detección se han
centrado, en lugar de esto, en la validación de RÍA o ELISA cuantitativos.
Actualmente se encuentra disponible un kit ELISA con licencia comercial para
la determinación de anticuerpos anti-GBM. Este ensayo determina los valores
del paciente a partir de una curva estándar y permite dar resultados como ran-
gos negativos, dudosos limitantes o positivos. La mayoría de los pacientes
con enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa parecen tener valores supe-
riores a 100 unidades. Aunque se pueden obtener valores dudosos limitantes
tanto en enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa como latente, también
hemos observado estos valores en pacientes con trastornos renales que no
son enfermedad por anticuerpos anti-GBM.
La coexistencia de anticuerpos contra el citoplasma de neutródlos (ANCA)
ha sido documentada en algunos pacientes con glomerulonefritis rápidamen-
te progresiva (RPGN) (McCIuskey, 1995). La coexistencia de estos dos auto-
anticuerpos varía desde un 0% hasta 40% de los pacientes con RPGN. lo que
se acompaña por alguna evidencia de que la presencia de ANCA en pacien-
tes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM proporciona un pronostico
renal mejor (McCIuskey, 1995).
GLÁNDULA SUPRARRENAL
Enfermedad de Addison
La insuficiencia adrenocortical crónica no tuberculosa, o enfermedad de
Addison, tiene una prevalence estimada de entre З у б casos por 100.000
personas (Muir, 1993). Del 65% al 70% de estos pacientes tienen autoanti­
cuerpos circulantes contra los microsomas y la membrana plasmática de las
células adrenocorticales. demostrable utilizando IFID sobre secciones conge-
ladas de corteza adrenal humana (Patrick, 1993; Burek. 1995; Muir. 1993). La
21 -hidroxilasa y la 17-t/hidroxilasa son dos autoantigenos que se han iden-
tificado como reactivos con autoanticuerpos adrenocorticales (Song, 1994).
No se han encontrado autoanticuerpos adrenocorticales en la enfermedad de
Addison causada por tuberculosis u otros agentes exógenos (Patrick, 1993).
De manera destacable, cerca del 45% de los individuos asintomáticos con
autoanticuerpos adrenocorticales desarrollan trastornos de la función adreno-
cortical en 2,5 años tras la identificación del autoanticuerpo (Muir, 1991).
La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos es la que se
diagnostica más frecuentemente en personas entre 20 y 50 años y es de dos
a tres veces más frecuente en mujeres cuando se diagnostica después de los
30 años (Patrick. 1993; Muir. 1993).
Las pruebas de laboratorio muestran acidosis metabólica. hiperpotasiemia.
hiponatremia y bajos niveles de cloruro y bicarbonato séricos. Los niveles de
Cortisol plasmático están disminuidos y los niveles de hormona adrenocorti-
cotropa elevados (VanArsdel, 1993). Consecuentemente, la terapia consistirá
en el reemplazo de glucocorticoides y mineralocorticoides (Patrick, 1993).
La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos puede ocurrir por
sí misma, pero es más común que esté acompañada por otras enfermedades
autoinmunes como parte de un síndrome autoinmune poliglandular (APS) (Muir.
1993). Estas enfermedades acompañantes pueden incluir tiroiditis autoinmune.
anemia perniciosa o diabetes mellitus insulino-dependiente (Patrick, 1993).
1011
Además de los autoanticuerpos adrenocorticales. se han detectado otros
autoanticuerpos en pacientes con enfermedad de Addison, incluyendo auto-
anticuerpos contra las células esteroideas y autoanticuerpos que se unen a
los receptores de la hormona adrenocorticotropa (Muir, 1993).
PÁNCREAS
Diabetes mellitus (véase Cap. 11)
Diabetes mellitus es el término diagnóstico aplicado a un grupo de trastor-
nos metabólicos que comparten la hiperglucemia como nexo común (Eisen-
barth, 1995). El que la DM sea un diagnóstico serio está documentado por el
hecho de que las complicaciones agudas y crónicas multiorgámcas justifican
un 15% del total del gasto económico del sistema sanitario en EE.UU.
(Schatz, 1995). Sin embargo, se ha hecho un progreso significativo en el cui-
dado de los pacientes diabéticos gracias al conocimiento de que un control
agresivo de la glucosa en sangre disminuye el riesgo de desarrollo y progre-
sión de complicaciones vasculares (Schatz, 1993).
Subtipos clínicos
Existen dos subgrupos principales de DM: el tipo 1. DM msulino-depen-
dienle (DMID); y el tipo 2, DM no insulino-dependiente (NIDDM) (Eisenbarth,
1995). La DM tipo 2 ocurre con más frecuencia en individuos obesos mayo-
res de 30 años. Estos pacientes tienen insulina plasmática, pero en concen-
tración insuliciente para prevenir la hiperglucemia (VanArsdel. 1993). Algunos
pacientes tipo 2 tienen autoanticuerpos asociados a insulina en su suero
(VanArsdel, 1993). Los pacientes tipo 2 carecen de la mayoría de las otras
características autoinmunes observadas en pacientes tipo 1, aunque la dife-
rencia entre tipo 1 y tipo 2 no siempre es tan fácil (Eisenbarth, 1995). Los
pacientes tipo 2 se tratan por medio del control del peso y con medicaciones
que estimulen la producción de insulina (VanArsdel, 1993).
La DM tipo 1 se considera una enfermedad autoinmune crónica que apa-
rece en individuos genéticamente susceptibles y está causada por la destruc-
ción de las células p productoras de insulina en los islotes de Langerhans
pancreáticos (Harrison, 1990). Esta destrucción de las células |5 da lugar con
el tiempo a una deficiencia de insulina e hiperglucemia crónica. En los Esta-
dos Unidos, la DMID aparece en 1 de cada 300 personas (esto es, una inci-
dencia media anual de 15 por 100.000 personas) (Eisenbarth, 1995).
Existe un sólido soporte para concluir que la DMID es una enfermedad cró-
nica autoinmune (Harrison, 1990; Eisenbarth, 1995: Schatz, 1995). La detec-
ción de autoanticuerpos circulantes precediendo a la manifestación clínica de
DMID refuerza esta conclusión y proporciona una información importante res-
pecto a la evolución natural de la DMID y la capacidad para predecir su apa-
rición (Schatz. 11995).
Los principales tipos de autoanticuerpos circulantes en DMID son los
siguientes: autoanticuerpos contra las células de los islotes, autoanticuerpos
contra el ácido glutámico descarboxilasa, autoanticuerpos contra insulina y
autoanticuerpos asociados a insulinoma-2 y 2|i.
Autoanticuerpos contra las células de los islotes
La IFID es el método clásico para la detección de anticuerpos contra las
células de los islotes (ICA) (Atkinson, 1993). Se utilizan secciones congela-
das de páncreas humano como tejido de sustrato para detectar fluorescen-
cia citoplasmática, finamente granular y especifica en todas las células de
los islotes pancreáticos (Fig. 45-10). Se recomienda sangre humana del gru-
po O como sustrato para reducir las interferencias de fondo no específicas
debidas a isohemaglutininas ABO. Utilizando IFID, los ICA son detectables
en cerca del 80% de los pacientes con DMID delectada de novo, entre el 3%
y el 4% de parientes no diabéticos de pacientes con DMID. y sólo en el 0.5%
de sujetos clínicamente normales (Atkinson, 1994). Los ICA consisten en
autoanticuerpos que incluyen aquellos específicamente reactivos con auto-
anticuerpos contra la descarboxilasa de ácido glutámico (GADA), asi como
aquellos que son ICA reactivos con anticuerpos no GADA (Atkinson, 1993;
Kaufman, 1992).
 1012 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
Figura 45-10. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra las células de
los islotes utilizando como sustrato páncreas humano de grupo sanguíneo O (x 400).
Los ICA deben ser titulados en las unidades de la Juvenile Diabetes Foun-
dation (JDF) en referencia a un suero estándar de 80 unidades del Immuno-
logy of Diabetes Workshop; títulos superiores a 20 unidades JDF parecen
tener significado pronóstico (Maclaren, 1992). Se encuentran disponibles
ensayos comerciales para ICA con sustrato de primate.
Autoanticuerpos contra insulina
Se han identificado autoanticuerpos contra insulina (IAA) en cerca del 50%
de los pacientes con DMID en el momento del diagnóstico y antes de empezar
con la terapia insulínica (Atkinson, 1994). Los IAA se suelen determinar utili-
zando ensayo de radioinmunoprecipítacíón competitiva técnicamente exigente.
Este ensayo no puede distinguir entre IAA de aparición espontánea de aque-
llos que aparecen como resultado de la terapia con insulina. Por tanto, se debe
realizar el ensayo para IAA antes de que la insulina sea administrada.
Autoanticuerpos contra la descarboxilasa
de ácido glutámico
Los GADA se detectan en la mayoría de pacientes recién diagnosticados de
DMID y en cerca del 80% de parientes de primer grado, prediabétícos, de
pacientes con DMID (Hagopian, 1993. Schatz, 1995). Los dos autoantígenos
GAD, clasificados por peso molecular, se denominan GAD65 y GAD67 (Atkin-
son, 1993). Los GADA en pacientes con DMID son dirigidos en primer lugar con-
tra la isoforma GAD65, que se encuentra principalmente en los islotes pancreá-
ticos y en el sistema nervioso central (SNC), donde actúa como una enzima
responsable de la formación del neurotransmisor inhibidor ácido y-aminobutírico
(Barmeier, 1992; Luhder, 1994; Maclaren. 1988; Kaufman. 1992). La forma
GAD67 predomina en los nervios periféricos (Falorni, 1994; Atkinson. 1993).
Los GADA también están asociados al raro síndrome del hombre rígido
(Eisenbarth, 1995). De manera a destacar, un alto porcentaje de estos pacien-
tes tiene DMID.
Interpretación y utilidad clínica de los
autoanticuerpos en DMID
Los autoanticuerpos ICA. GADA, IAA e IA-2 se usan frecuentemente como
marcadores predíctivos para DMID. Los ICA son un marcador específico aso-
ciado con un riesgo elevado de desarrollar DMID, pero los ICA no persisten.
Los GADA se detectan generalmente antes del diagnóstico de DMID y gene-
ralmente disminuyen su titulo tras el comienzo de la clínica de DMID (Schatz,
1994). Los GADA e IA-2, tanto separados como juntos, parecen ofrecer la
mejor utilidad predictiva para el cribado (Schatz, 1995).
La identificación de autoanticuerpos contra los islotes puede ser utilizada
para confirmar la autoinmunidad en pacientes con DMID aguda, lo que dife-
rencia la DMID de tipo 1 de la de tipo 2. El uso de estos marcadores para
identificar individuos con riesgo de DMID está siendo evaluado para deter-
minar la necesidad de estudios metabólicos que aseguraren la intolerancia a
la glucosa subclinica y demanda de inmunoterapia en la fase preclinica de la
DMID (Maclaren, 1992). La determinación de GADA utilizando ELISA puede
mejorar finalmente la viabilidad de la difusión del cribado de este autoanti-
cuerpo.
Además de los autoanticuerpos sobre los que se ha disculido antes, los
pacientes con DMID también pueden tener autoanticuerpos anti-TPO, contra
células parietales y anti-adrenocorticales, por lo que debe realizarse un criba-
do de estos autoanticuerpos en pacientes con DMID al menos una vez
(Maclaren. 1992).
TRACTO GASTROINTESTINAL
Anemia perniciosa
La anemia perniciosa (PA) se caracteriza por aclorhidria rápida resistente a
histamina, hipergastrinemia y déficit de vitamina B (Brown, 1995). El
tt
comienzo gradual de los síntomas neurológicos y el desarrollo de anemia
megaloblástica son características típicas del curso clínico de PA (Patrick,
1993). Morfológicamente, la biopsia de mucosa del cuerpo del estómago con-
tiene evidencias de grastritis atrófica crónica.
La PA está asociada con autoanticuerpos circulantes contra células parie-
tales (APC) en el 90% de los pacientes y contra el factor intrínseco (anti-IF)
en entre el 60% y 75% de los pacientes, aunque los anti-IF pueden ser más
específicos para PA(Burek. 1995; Brown, 1995). Los APC son detectados por
IFID llevada a cabo sobre bloques de tejido de estómago/riñón de ratón. Este
bloque de tejido combinado permite la identificación del mareaje específico de
células parietales cuando no hay mareaje concomitante de túbulos renales
como se vería en presencia de AMA(Fig. 45-11).
Los anti-IF son detectados más frecuentemente por RÍA. De los dos tipos
conocidos de anti-IF, los anti-IF tipo 1, o autoanticuerpos bloqueantes, impi-
den la unión de IF a la vitamina B. , y los de tipo 2, o autoanticuerpos de
;
unión, reaccionan con la vitamina B, libre o complejada para inhibir la acción
2
de IF (Karen. 1994; Patrick, 1993). Los anti-IF tipo 1 están considerados más
sensibles y específicos para el diagnóstico de PA (Karen, 1994). Sin embar-
go, la identificación de APC o de anti-IF no es necesaria para el diagnóstico
de PA, La PA puede ocurrir en asociación con otras enfermedades autoinmu-
nes como la liroiditis autoinmune o enfermedad de Addison y puede formar
parte tanto de APS 1 como de APS 2 (Patrick, 1993).
Enteropatía sensible al gluten
La enteropatía sensible al gluten (GSE), o esprúe no tropical, es una
enfermedad del intestino delgado caracterizada por malabsorción de la gra-
sa gastrointestinal, que puede estar infradiagnosticada en Estados Unidos
Figura 45-11. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra células
parietales gástricas utilizando estómago/riñón de ratón como suslralo (x 400).
 CAPÍTULO 45 • ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
Figura 45-12. Inmunofiuorescencia indirecta de autoanticuerpos IgA contra endo-
misk) utilizando estómago de mono como sustrato (x 400)
(Ferguson, 1997). La hipersensibilidad al gluten, o derivados del gluten, es la
causa de GSE (Brown, 1995). La biopsia de intestino delgado de un paciente
con GSE es anormal de forma variable, pero los cambios característicos inclu-
yen la atrofia vellosilaria, elongación de las criptas, lintocitos intraepiteliales y
mitosis en las criptas.
Los pacientes con GSE manifiestan varias alteraciones inmunes humora-
les. Es interesante que los niveles de IgA en suero están generalmente ele-
vados en pacientes con GSE, excepto en aquellos con un déficit de IgA, lo
que ocurre en pacientes con GSE más frecuentemente que en individuos
normales (Brown, 1995). Los pacientes con GSE pueden tener autoanticuer-
pos IgA circulantes antiendomisio, antireticulina o antigliadina. Los autoanti-
cuerpos IgA antiendomisio se detectan por IFID utilizando esófago de mono
como tejido sustrato (Fig. 45-12). La transglutaminasa tisular (ttg) es proba-
blemente el autoantígeno del endomisio (Dietench. 1997). Su identificación
está considerada sensible y específica para el diagnóstico de GSE o bien
GSE asociada con DH (GSE-DH) (Talal, 1997). La medición del título de auto-
anticuerpo IgA antiendomisio puede ser utilizada para monitorizar la adheren-
cia de un paciente a una dieta libre de gluten (Karen, 1994).
Los autoanticuerpos antirreticulina son detectados por IFID sobre un blo-
que de tejido combinado de estómago/riñón de ratón. Estos autoanticuerpos
son detectables en adultos (40%), asi como en niños (60%) con GSE y tam-
bién en adultos con GSE-DH (20%). Sin embargo, los autoanticuerpos anti-
rreticulina no son específicos para el diagnóstico, pudiendo estar presentes
también en pacientes con enfermedad de Crohn, miastenia gravis, síndrome
de Sjógren. y otras enfermedades del tejido conectivo.
Los anticuerpos antigliadina son deteclados por ELISA en casi todos los
pacientes con GSE o GSE-DH (Brown, 1995). El antígeno diana, la gliadina,
se purifica a partir de gluten y es utilizado en la fase sólida del ELISA para
detectar estos autoanticuerpos. Como los autoanticuerpos IgA antiendomisio,
los autoanticuerpos antigliadina pueden ser utilizados para monitorizar la
adherencia de un paciente a una dieta sin gluten.
SISTEMA NERVIOSO
Miastenia graves
La MG es un trastorno neuromuscular caracterizado por debilidad muscu-
lar asociada al ejercicio, fatiga y presencia de autoanticuerpos contra el
receptor de acetilcolina (anti-AChFt). El AChFt, localizado en las membranas
postsinápticas de las fibras musculares esqueléticas, une acetilcolina (ACh)
que proviene de las terminaciones nerviosas, lo cual causa una contracción
muscular cuando se ha liberado una cantidad suficiente de Ach (Naparstek,
1993: Rose. 1995). Los autoanticuerpos anti-AChR interfieren en esta función
neuromuscular, provocando debilidad muscular y fatiga.
Los autoanticuerpos anti-AChR se detectan en casi el 90% de pacientes
con MG (Rose. 1995). Se utiliza u-bungarotoxina marcada radiactivamente
1013
(u-BTx) en RÍA competitivo para medir las diferentes formas de anti-AChR
(Barna. 1995). La M-BTX es una proteina de veneno de serpiente que se une
irreversiblemente a AChR, pero se une al receptor de Ach en un sitio diferen-
te del lugar de unión de los anti-AChR (Rose, 1995). Los AChR se obtienen a
partir de extractos de músculo esquelético humano denervado, como puede
ser a partir de amputaciones diabéticas, o a partir de cultivo tisular. Para la
determinación, se marcan los AChR con u-BTx y después son incubados con
el suero del paciente para permitir que cualquier autoanlicuerpo anti-AChR
presente se una a los AChR en los sitios cercanos al lugar de unión de u-BTx.
Tras la incubación, los complejos radiomarcados son precipitados por inmu-
noglobulina anti-humana polivalente, y se procede a detectar la radiactividad
en el precipitado lavado, después de la corrección de las uniones inespecífi-
cas. El grado de radioactividad en el precipitado es directamente proporcional
a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente.
Se pueden utilizar modificaciones de este ensayo de unión para identificar
autoanticuerpos anti-AChR bloqueantes y moduladores. En un ensayo de blo-
queo, se permite que el suero del paciente, que contiene anti-AchR. incube
con AChR antes de la adición de a-BTx. La base de esta técnica es la pre-
misa de que los anti-AChR capaces de bloquear la unión de r/.-BTx también
bloquean la unión de Ach a AChR (Rose. 1995). La cantidad de radiactividad
en el precipitado es, por tanto, inversamente proporcional a la cantidad de
anti-AChR en el suero del paciente.
Se piensa que los autoanticuerpos anti-AChR moduladores aceleran la
degradación de AChR, pero su determinación en el laboratorio clínico es téc-
nicamente difícil y no está ampliamente instaurada.
Esclerosis múltiple
La MS es una enfermedad desmielinizante relativamente corriente que
involucra a la sustancia blanca del cerebro y la médula espinal. La MS ocurre
más frecuentemente en mujeres que en hombres (razón de 2:1) y se mani-
fiesta generalmente durante las primeras etapas de la edad adulta con una
amplia variedad de manifestaciones clínicas posibles. Cerca del 50% de estos
pacientes experimenta periodos alternantes de enfermedad activa y remisio-
nes, mientras que el resto sigue un curso progresivo crónico (Steinman, 1993;
McFarland, 1995). El diagnóstico de MS deriva de los hallazgos clínicos y la
exclusión de cualquier otro trastorno.
Aunque la causa de MS es desconocida, se considera a los mecanismos
autoinmunes como importantes en la patogénesis de esta enfermedad
(McFarland, 1995). Sin embargo, no hay ningún autoanlicuerpo circulante lo
suficientemente característico en la MS como para ser aceptado como diag-
nóstico en las determinaciones de rutina del laboratorio clínico.
Sin embargo, el examen de laboratorio de liquido cefalorraquídeo (LER)
proporciona información importante que ayuda al diagnóstico de MS en un
marco clínico apropiado (Barna, 1987). La síntesis de IgG se incrementa
anormalmente en el SNC de pacientes con MS, de tal forma que la deter-
minación del índice de IgG y la tasa de síntesis de IgG proporciona resulta-
dos útiles, pero no específicos (McFarland, 1995; Zweiman, 1991; Karen.
1994: Valenzuela. 1987). La determinación de bandas oligoclonales en el
LCR es también útil en un marco clínico apropiado, ya que son identificadas
en más del 90% de los pacientes con MS: sin embargo, su presencia no es
especifica, puesto que pueden ser detectadas en pacientes con diversos
trastornos como neurosífilis, vasculitis SNC, enfermedad de Lyme. panen-
cefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndro-
me de Guillain-Barré y neoplasias (Karen, 1994). La electroforesis de pro-
teínas séricas también debe realizarse para asegurar que las bandas
oligoclonales del LCR no son debidas a filtración en el LCR desde el suero.
Las bandas oligoclonales en el LCR se determinan generalmente por elec-
troloresis de alta resolución en gel de agarosa con LCR concentrado
(Karen. 1994).
Neuropatías
El centro de la atención más reciente es un grupo de síndromes neurológi-
cos que afectan tanto al SNC como al sistema nervioso periférico y están aso-
ciados con autoanticuerpos (Naparstek. 1993). Estos autoanticuerpos son
detectados por ELISA. IFID o inmunohistoquímica. La importancia de la iden-
 1014 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tílicación de dichos autoanticuerpos se incrementa indudablemente si los
estudios clínicos correlacionan su presencia con una enfermedad particular o
un beneficio terapéutico. Sin embargo, hasta la fecha, estos autoanticuerpos
no son específicos de una enfermedad y pueden incluso aparecer después de
un trauma al sistema nervioso. Los autoanticuerpos contra componentes pri-
marios neurales incluyen aquellos contra proteínas neuronales o contra gan-
gliósidos neuronales (Zeballos, 1992).
Autoanticuerpos contra proteínas neuronales
Un subgrupo de pacientes con degeneración cerebelosa paraneoplásica
(PCD) tienen autoanticuerpos anti-Yo que generalmente son detectados al
mismo tiempo que es descubierta la neoplasia maligna. Los anti-Yo son
detectables como fluorescencia citoplasmática en las células de Purkinje uti-
lizando IFID sobre tejido cerebeloso humano. La identificación de anticuerpos
anti-Yo en un paciente sin malignidad conocida debe iniciar una evaluación
minuciosa en busca de una neoplasia maligna (Zeballos, 1992).
Los anticuerpos anti-Ri son autoanticuerpos específicos de neurona, cuya
identificación parece limitada a pacientes con carcinoma de mama y opsoclo-
nus paraneoplásico (Zeballos. 1992). Los anti-Ri son caracterizados por fluo-
rescencia en el núcleo neuronal por IFID.
Los anticuerpos anti-Hu también son visibles como fluorescencia nuclear
neuronal con IFID. Estos autoanticuerpos pueden ser identificados en pacien-
tes con carcinoma de pulmón de células pequeñas y encefalomíelitis parane-
oplásica (Zeballos, 1992).
Autoanticuerpos contra gangliósidos neuronales
Los gangliósidos son componentes glicolipídicos que se encuentran en las
membranas extemas de las células nerviosas periféricas (Naparstek, 1993).
Las neuropatías motoras periféricas pueden producirse en pacientes con
gammapatías monoclonales IgM, cuya paraproteína IgM reacciona con los
gangliósidos GM. o GD,„ (Zeballos, 1992). Aunque los anticuerpos anti-GM,
o anti-GD„ pueden ser identificados en una amplia variedad de síndromes
neurológicos, su presencia en altos títulos es más característica de enferme-
dad de neurona motora que otras alternativas (Zeballos, 1992).
OTROS ÓRGANOS
Corazón
Autoanticuerpos contra miocardio
Los autoanticuerpos contra miocardio se han descrito como parte de varias
condiciones que dañan el músculo estriado cardíaco, incluyendo infarto de
miocardio, después de cirugía cardiaca, y miocardiopatía, aunque su identifi-
cación puede ayudar a diferenciar la miocardiopatía mediada por inmunidad
de otras causas de miocarditis (Naparstek, 1993; Burek, 1995). Se utiliza la
IFID sobre secciones congeladas de corazón de mono para detectar autoan-
ticuerpos contra miocardio. El mareaje específico de miocardio también pue-
de determinarse excluyendo la reactividad de músculo esquelético no cardía-
co. Desgraciadamente, los AMA o autoanticuerpos heterófilos pueden causar
mareaje fluorescente que puede ser confundido con el que es debido a auto-
anticuerpos contra miocardio.
Músculo
Autoanticuerpos contra músculo esquelético
Los autoanticuerpos contra músculo esquelético tienen una aplicación clí-
nica limitada. Se pueden observar títulos bajos (<1:30) en individuos sanos,
mientras que algunos pacientes con trastornos miopáticos pueden tener
títulos hasta 1:60. Aunque se han encontrado títulos altos (>1:60) de auto-
anticuerpos contra músculo esquelético en pacientes con MG. los ensayos
de anti-AChR tienen mayor utilidad clínica en el diagnóstico o monitoriza-
ción de MG. Los autoanticuerpos contra músculo esquelético se detectan
por IFID sobre secciones congeladas de músculo esquelético de los muslos
de mono.
RESUMEN
Los autoanticuerpos tienen un papel importante en el estudio de las enfer-
medades autoinmunes organoespecíficas. La detección de dichos autoanti-
cuerpos puede ser importante en el diagnóstico de algunas enfermedades
autoinmunes organoespecíficas, como la enfermedad de Graves, pero más a
menudo sirven como soporte más que como elemento esencial para el diag-
nóstico. De manera similar, aunque algunos de estos autoanticuerpos están
directamente involucrados en la patogénesis de una enfermedad, por ejemplo
el pénfigo. a menudo su presencia es un marcador de daño inmunológico
subyacente atribuible a otro mecanismo de enfermedad, como es el caso de
la DMID. Técnicas más recientes de biología molecular han revelado y conti-
nuarán haciéndolo, la naturaleza específica de muchos antígenos diana de
estos autoanticuerpos. Se espera que este trabajo llegue a elucidar los meca-
nismos de enfermedad subyacentes, permitiendo la mejora de las pruebas
diagnósticas y. tal vez. de nuevas direcciones en las terapias. Los avances
técnicos en los ELISA han hecho de ésta una tecnología asequible para la
mayoría de los laboratorios clínicos, de manera que muchos ensayos para la
determinación de autoanticuerpos específicos de órgano se encuentran dis-
ponibles donde la IFID no es factible.
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MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD
INMEDIATA 1016
Regulación de la síntesis de IgE: influencias genéticas e
interacciones celulares
Características estructurales de la IgE
Liberación de mediadores desde las células efectoras
sensibilizadas a IgE
EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE
LAS ENFERMEDADES ALÉRGICAS 1019
La prevalencia global de enlermedades alérgicas en los Estados Unidos
excede el 20%, y los síntomas y signos de la alergia son con frecuencia difí-
ciles de distinguir clínicamente de otras etiologías (Huang. 1993). Por estas
razones, los médicos con frecuencia consideran la alergia (hipersensibilidad
inmediata) como una posible etiología de enfermedad en pacientes que se
presentan con diversos signos y síntomas. Cuando se seleccionan apropia-
damente, las pruebas de laboratorio son útiles para evaluar pacientes con
enfermedades alérgicas, pero el conocimiento de los mecanismos básicos de
la hipersensibilidad inmediata y el conocimiento de las relaciones empíricas
entre los resultados de las pruebas y su valor diagnóstico predictivo son
necesarios para optimizar la eficacia de las pruebas de laboratorio. Este capí-
tulo aborda estos lemas, empezando con una perspectiva general de los
mecanismos básicos de la hipersensibilidad inmediata y procediendo a una
descripción detallada de las pruebas de laboratorio aplicadas a los modos de
cribado y diagnóstico para evaluar diferentes tipos de enfermedades alérgi-
cas. Se ha hecho una mención específica de las aplicaciones de las pruebas
de laboratorio que no son rentables o que pueden conducir a conclusiones
clínicas incorrectas.
MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA
Regulación de la síntesis de IgE:
influencias genéticas e interacciones celulares
Las investigaciones básicas a linales de los años 60 conducen a la des-
cripción de una clase distinta de inmunoglobulinas en humanos, la inmuno-
globulina E (IgE). con potentes propiedades reactivas (sensibilidad cutánea)
(Ishizaka, 1966a. 1966b, 1966c). Este resultado marcó el comienzo de la era
actual de investigación en cuanto a los mecanismos moleculares de las enfer-
medades alérgicas. Hasta ahora, se sabe mucho sobre los procesos que
acontecen dentro de las membranas celulares de las células efectoras sensi-
bilizadas por IgE, que conducen a la liberación de mediadores vasoactivos.
Estos mediadores causan directamente los signos y síntomas de la enferme-
dad alérgica (véase más adelante). Las investigaciones en este tema se han
'Mayo Foundation conserva los derechos sobre todos los dibujos e ilustraciones
del presente capitulo.
Proteína IgE: métodos de determinación, valores normales
y utilidad clínica
Anticuerpos IgE alérgeno-específicos: métodos de
determinación, calificación de resultados y utilidad clínica
Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibílídad
inmediata y para anticuerpos IgE alérgeno-específicos
BIBLIOGRAFÍA 1026
enfocado considerablemente en dos áreas: estudios dirigidos al descubri-
miento de genes que influyen en el desarrollo del fenotipo alérgico, y estudios
celulares y moleculares dirigidos al descubrimiento de mecanismos genéticos
y biológicos que influyen en la síntesis y secreción de la proteína IgE y los
anticuerpos IgE. Como el nivel de la proteína IgE en sangre se correlaciona
fuertemente con la presencia de signos y síntomas de enfermedad alérgica,
estas dos áreas de investigación se solapan.
Es bien sabido que las influencias genéticas afectan a la probabilidad de
que un individuo desarrolle una enfermedad alérgica (Meyers. 1998). Los
individuos predispuestos genéticamente a menudo se conocen como atópi-
cos, un sinónimo para el fenotipo alérgico clínico. Los resultados de los estu-
dios epidemiológicos genéticos sugieren que los niveles en suero de la pro-
teína IgE están influidos por lo menos por dos genes, y esa herencia recesiva
o codominante de alelos (aún no definida) sobre esos locus influye en el nivel
basal de la proteína IgE en suero (Meyers, 1991). El fenotipo IgE elevado está
caracterizado por niveles de proteína IgE en suero varias veces mayor que el
fenotipo IgE bajo (Martínez. 1994). Como es lógico, los niveles elevados de
IgE en suero se asocian a un fenotipo alérgico con aumento en la prevalen-
cía de enfermedades alérgicas, particularmente el asma.
A nivel estructural, se han propuesto varios genes candidatos que podrían
actuar para determinar el fenotipo alérgico (Tabla 46-1). Los estudios analíti-
cos de enlace han identificado las localizaciones aproximadas de estos genes
candidalos a nivel cromosómico. y los estudios posicionales de clonación
corroboran la relación de los genes putativos con genes conocidos para molé-
culas mmunorreguladoras incluyendo receptores de citocina, antigenos leu-
cocitos humanos y factores de transcripción nucleares (Caraballo. 1999). Una
región del cromosoma 5q incluye genes de diversas atocinas que se sabe
influyen en la producción de IgE por células inmunocompetentes o reactividad
bronquial incluyendo interleucma (IL)-3. IL-4. IL-5. IL-9 e IL-13 y el receptor
(5-adrenérgico. respectivamente (Caraballo. 1999). El cromosoma 6p contie-
ne el complejo del antígeno leucocitario humano (HLA) (véanse Caps. 40 y
41). Diversos haplotipos HLA están asociados con el fenotipo alérgico, más
marcadamente con el HLA-DR específico y haplotípo DQ. Los productos
genéticos de estos locus juegan un importante papel en la determinación de
respuestas inmunes a proteínas alergénicas a través de un papel en la pre-
sentación del antigeno (véase mas adelante). Otros diversos cromosomas
contienen genes que pueden jugar un papel en determinar el fenotipo alérgi-
co: el cromosoma 11q contiene un gen para el receptor de alta afinidad de IgE
(F B|. el cromosoma 12q contiene genes para interferón-yy el factor de ere-
 CAPÍTULO 46 • ENFERMEDADES ALÉRGICAS
cimiento basotilo. y el cromosoma 14q contiene genes para el receptor anti-
geno de células T y NF-KB1 (Caraballo. 1999). Se necesitan estudios adicio-
nales para determinar la extensión del polimorfismo de estos locus y los efec-
tos de diferentes alelos de estos locus candidatos sobre el fenotipo alérgico.
La habilidad de un individuo de responder a un anlígeno exógeno sinteti-
zando anticuerpos específicos está determinada genéticamente por genes de
la región HLA-D (véase Cap. 40). Los productos genéticos de estos locus alta-
mente polimórficos —moléculas de DR, DQ y DP de células presentadoras de
antigenos— son responsables del proceso de unión al antígeno procesado
para presentarlo a los linfocitos T inmunocompetentes. e iniciando por tanto
una respuesta de anticuerpos (Bach. 1985; Korman, 1985; Trowsdale. 1985).
La síntesis de anticuerpos específicos (incluyendo IgE) para antígenos T-
dependientes resulta de una sene de interacciones celulares que incluye la
señal relacionada (contacto célula a célula) y no relacionada entre células.
Varios pasos están implicados. Inicialmente. el antígeno es metabolizado por
una célula presentadora del antígeno, por ejemplo, una célula dendrítica o
macrófaga, y el antigeno "procesado" se muestra en la superficie de la célula
en una hendidura configurada para el antígeno constituida por moléculas
superficiales de la región HLA-D y Iragmentos procesados de un antigeno
nativo. La interacción afín entre el complejo antígeno procesado-HLA-D de
una célula presentadora del antígeno y los receptores antígenos específicos
en una población complementaria de linfocitos T colaboradores/inductores
(células Th) origina la activación de las células Th, secreción de citocinas y
expansión clonal de la respuesta de los linfocitos (Unanue. 1987). El mismo
antigeno puede estar unido a anticuerpos expresados constitutivamente en
las membranas plasmáticas de linfocitos B específicos de antígeno; y estas
células que procesan el antígeno internalizando el complejo antígeno-anti-
cuerpo también son capaces de metabolizar y presentar el antígeno procesa-
do. De nuevo, después de la interacción afín y la secreción de citocinas. se
produce una expansión clonal de linfocitos B antígeno-específicos seguida de
la síntesis y secreción de anticuerpos específicos (Fig. 46-1).
Figura 46-1. Interacciones reconocidas y no reconocidas de células presentadoras
de antigenos (APC). Células T colaboradoras /inductoras y células B originan la acti-
vación y la expansión clonal de las células IgE-B (véase texto para explicación).
1017
El modelo descrito anteriormente explica los mecanismos comunes que
provocan la síntesis de anticuerpos específicos IgG e IgE. pero ciertos meca-
nismos son particularmente pertinentes para la respuesta de IgE. Estos
mecanismos originan la expansión clonal de linfocitos B-lgE y el cambio de
isotipo con la expresión de transcnptores maduros más que de líneas germi-
nales. Los linfocitos B requieren por lo menos de dos señales activadoras
para iniciar la síntesis de anticuerpos específicos (Vercelli. 1989a). Una señal
es emitida como resultado de una interacción afín entre células T comple-
mentarías y linfocitos B que muestran los antígenos procesados. Estos linfo-
citos B, sin embargo, requieren de señales adicionales para iniciar la trans-
cripción del C Í ' mRNA reordenado. En el caso de las IgE. se emiten señales
importantes por IL-4 e IL-13. citocinas producidas por un subpoblación de lin-
focitos Th. Sin embargo, estas señales solas no son suficientes para inducir
la síntesis de anticuerpos IgE maduros.
La IL-4. junto con IL-13. IL-3 e IL-5, se produce por un subpoblación de lin-
focitos T llamadas células T2 (Mosmann. 1986: Parronchi. 1991) Los electos
de IL-4 e IL-13 son antagonizados por el interferón-y. que junto con la IL-2 se
produce en una segunda subpoblación de linfocitos T llamadas células TI.
Los productos de citocina de esas dos subpoblaciones T influyen de forma
opuesta en la síntesis de IgE. Otras citocinas también influyen en la síntesis
de IgE (véase Cap. 39). Las citocinas IL-5 e IL-6 originan la síntesis de anti-
cuerpos IgE por linfocitos B comprometidos, pero ninguna es suficiente para
emitir un señal "activadora" para desviar un isotipo relacionado con la pro-
ducción de transcriptores C, reordenados (Vercelli. 1989b).
Como se anotó previamente, en el curso de una respuesta inmune carac-
terizada por la producción de anticuerpos IgE. los linfocitos B deben diferen-
ciarse a células plasmáticas que producen más IgE que IgM (o IgD). Este pro-
ceso, llamado desviación de isotipo. incluye el reordenamiento de los genes
inmunoglobulinas a nivel del ADN. No se conocen todos los mecanismos aso-
ciados a la desviación del isotipo. pero se conocen mejor muchos de los
requerimientos para la desviación del IgE. Un elemento importante es el ajus-
te del CD40 a los linfocitos B por el ligando CD40 en los linfocitos T. Si no exis-
te ajuste del CD40, los linfocitos B expuestos a IL-4 e IL-13 en presencia de
las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T producirán transcrip-
tores C, de la línea germinal. Los esludios experimentales sugieren que los
efectos del ajuste de CD40 están mediados intraceluiarmente por la familia
Src de tirosina cinasas. que están implicadas en distintos niveles de la acti-
vación transcripcional (Vercelli. 1998)
Características estructurales de la IgE
La primera evidencia de que los anticuerpos IgE humanos poseen activi-
dad reagínica y son diferentes de otras inmunoglobulinas fue de los Ishiza-
kas (Ishizakas, 1966a, 1966b, 1966c). Estos investigadores cultivaron anti-
suero de ratón con una fracción aislada de inmunoglobulina rica en reagina
aislada del suero de un paciente atópico. Después de la absorción con inmu-
noglobulinas purificadas de todos los isótopos conocidos (IgG. IgA. IgM e
IgD), el antisuero aún reaccionaba con la globulina-y. presente en el suero
de pacientes alérgicos. Después de la inmunoprecipitación con este antisue-
ro, se suprimió la actividad sensibilizadora cutánea del suero de diferentes
pacientes atópicos
La evidencia definitiva de la singularidad inmunoquimica y la actividad
reagínica de IgE fue obtenida algo tarde cuando se descubrió que las pro-
teínas del mieloma humano reaccionaban con el antisuero antes menciona-
do (Bennich. 1969). Los experimentos realizados con fragmentos de inmu-
noglobulina aislados preparados por digestión enzimática de proteínas IgE
de mieloma indicaron definitivamente que la actividad sensibilizadora cutá-
nea requería de una región F, intacta y que los determinantes antigénicos
únicos para moléculas de IgE se encontraban en el fragmento F, (Bennich,
1969). Las propiedades fisicoquímicas y las funciones inmunologicas de
diferentes regiones de la molécula IgE. determinadas por experimentos lle-
vados a cabo con proteínas IgE de mieloma humano purificadas y frag-
mentos de inmunoglobulina preparados por digestión enzimática. están
resumidas en la Tabla 46-2. La estructura de la IgE humana se muestra en
un diagrama en la Figura 46-2.
Los anticuerpos IgE humanos sensibilizan la piel para liberar histamina, un
fenómeno llamado anafilaxis cutánea pasiva. La actividad sensibilizadora
 1018 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 46-2 P r o p i e d a d e s fisicoquímicas d e la ¡nmunoglobulina E eos IgE de superficie celular (homocitotrópica). receptores de alta almidad
para IgE (F , Rl) localizados difusamente en las membranas plasmáticas de
(

Cadena clase H E
las células efectoras. La unión de los anticuerpos IgE a F, Rl es reversible
Fórmula molecular E -L¡,
2
pero de muy alta afinidad (K = 10" M ') (Wank, 1983). Mientras que los anti-
a

Coeficiente(s) de sedimeniación
Peso molecular
Carbotndralo (%)
Determinantes antigénicos
Fijación complementaria (clasica)
Vida media en suero (días)
Transferencia placentaria
Actividad reaginica
8 cuerpos IgE en sangre tienen una vida media de sólo dos o tres días, la vida
190 000 media de los anticuerpos IgE en la piel delimitados por F„ Rl en mastocitos
11,7 se estima que es superior a los 10 días. Se eslima que el número de recep-
D,. D..2. D,3 tores por célula oscila entre 40.000 y 500.000. Mayores números de recepto-
Ninguna res se encuentran en cultivos de basófilos en presencia de IgE, posiblemen-
2 te reflejando la sobrerregulación de F., Rl expresada por IgE. F, Rl es un
Ninguna receptor multimétnco. compuesto por subunidades a, |i. y y como las siguien-
4+; Los fragmentos que
tes; (/.,. |i, y y . Los anticuerpos IgE están delimitados por la subunidad-u; las
contienen Fe son inhibidores ¿

de la actividad sensibilizadora subunidades -|i y -y contienen regiones transmembrana que funcionan en la

de la piel de IgE nalrvo. pero
los fragmentos con Fab. no
/ Las moléculas de F, Rl son móviles dentro de las membranas plasmáticas
cutánea de la IgE es lábil al calor; calentando a 56C durante dos horas se
modifican irreversiblemente los dominios C,3 y C,4 de la molécula IgE y se
suprime la actividad sensibilizadora de la piel (Ishizaka, 1967). La aglutinación
de células electoras también se suprime por la reducción y alquilación de los
puentes disulfuro entre las cadena-,. Los agregados de IgE humano no se
fijan al complemento por la vía clásica, y no hay paso placentario significativo
de IgE humano.
Liberación de mediadores desde las células
señalización transmembrana (Ravetch, 1991).
de las células sintetizadas, como indican estudios llevados a cabo con anti-
cuerpos anti-lgE conjugados con fluorescencia. Esta movilidad para distan-
cias cortas se cree que es importante en la liberación de mediadores desde
mastocitos y basófilos. Otros estudios más amplios con basófilos y mastoci-
tos sensibilizados In vitro con proteínas de mieloma IgE o con anticuerpos
específicos IgE han mostrado que la formación de puentes de receptores IgE
ocupados por antígenos multivalentes o por anticuerpos anti-lgE intactos o
sus fragmentos F(ab')^ desencadena la liberación de histamina. pero hapte-
nos univalentes o fragmentos Fab de anticuerpos anti-lgE no. La importancia
de la formación de puentes de receptores también se ha demostrado por estu-
dios llevados a cabo con anticuerpos obtenidos de F Rl. Los anticuerpos
u

efectoras sensibilizadas a IgE
Los mastocitos y basófilos son las células electoras principales de las reac-
ciones de hipersensibilidad inmediata. Ambos tipos de células contienen his-
tamina en granulos citoplasmáticos que se tiñen marcadamente con tintes
básicos metacromáticos (Siraganian, 1988). Los mastocitos y basófilos se
desarrollan en la médula ósea a partir de células madre pluripotenciales. un
proceso que se estimula por IL-3 (Schrader, 1986). Los basólilos que circulan
en la sangre tienen una vida corta, y están bien diferenciados, mientras que
los mastocitos que se encuentran en tejidos próximos a los vasos sanguíneos
y en tejidos conectivos adyacentes al epitelio del tracto respiratorio, del trac-
to intestinal y de la piel son células con una vida larga capaces de prolilerar
en respuesta a estímulos mitógenos. Los mastocitos son heterogéneos pero
contienen normalmente 10 veces más del total de histamina por célula que los
intactos de F„ Rl causan la liberación de histamina. pero los fragmentos Fab
no. Tomando en conjunto estos resultados se propone que los puentes entre
los receptores adyacentes son importantes en la iniciación de la liberación de
histamina (Siraganian. 1975). De acuerdo con la "hipótesis puente", los anti-
cuerpos IgE juegan un papel pasivo en la producción de la liberación de
mediadores vasoactivos. La señal inicial para la liberación de mediadores
está proporcionada por los puntes cruzados de F„ Rl por un alérgeno multi-
valente, con IgE sirviendo como puente.
A pesar de los ensayos en los sistemas modelo, las criticas rutas molecu-
lares que siguen al puente de F.,. Rl y que permiten la liberación de histami-
na de las células sensibilizadas no están bien definidas. Con respecto a este
tema, es suficiente mencionar que la señalización transmembrana mediada
por F Rl en los mastocitos y basófilos probablemente implica vanos pasos,
Q

basólilos.
El mecanismo primario de liberación de histamina desde los mastocitos y
basófilos incluye la señal transmembrana mediada por anticuerpos específi-
:
incluyendo la movilización de Ca-' desde los depósitos intracelulares y desde
fuentes extracelulares a través de la formación de canales de Ca •; activación
de proteínas aglutinadas de guanosin-trifosfato (GTP) unidas a moléculas de
F , Rl, que permiten la activación de proteínas cmasas y metil-translerasas
c

unidas a F,., Rl; activación de adenil ciclasa con el aumento de la producción

intracelular del adenosin monofosfato cíclico; e hidrólisis de fosfolípidos que
contienen inositol por activación de fosfolipasas A, y C, que generan diacil-gli-
cerol y, seguido de nuevas hidrólisis, ácido araquidónico (Bradlord, 1998).
Estos pasos son importantes por dos razones: muchas señales son impor-
tantes para la liberación de mediadores desde los mastocitos y basófilos. y el
tratamiento farmacológico de las enfermedades alérgicas a menudo implica el
uso de fármacos que interfieren con estos mecanismos de señalización. Por
ejemplo, la cromolma usada en el tratamiento de asma interfiere con la libe-
ración de mediadores desde los mastocitos bloqueando la formación de cana-
les de Ca^, y los corticoides interfieren con la señalización mediada por F u

Rl inhibiendo la hidrólisis de fosfolípidos mediada por la enzima (Mazeruk.

1984). Además, se sabe que el ácido araquidónico liberado por los basófilos
y mastocitos tras la activación de las fosfolipasas celulares es el sustrato para
las enzimas de las rutas metabólicas 5-lipoxigenasa y ciclo-oxigenasa, que
conducen, respectivamente, a la síntesis y secreción de mediadores de infla-
mación leucotrienos y prostaglandinas (Fig. 46-3) (Lewis, 1981). El leucotrie-
no B.,. y prostaglandina D producen el movimiento de leucocitos, incluyendo
?

eosinódlos. y ellos estimulan la agregación, liberación enzimática. y genera-

ción de superóxido en los neutrófilos. Los leucotrienos C , D y E, son libera-
4 ;

dos por muchos tipos de células, incluyendo mastocitos pulmonares, perifo-

néales y de la médula ósea, y leucocitos macrófagos. eosinófilos y basófilos.
Estos mediadores causan broncoconstricción. aumentan la permeabilidad
vascular en vénulas poscapilares y aumentan la secreción de moco. Estos
Figura 46-2. La estructura de la IgE humana.
 CAPÍTULO 46 • ENFERMEDADES ALÉRGICAS
Figura 46-3. Metabolismo del ácido araquidónico por las rutas de 5-lipoxigenasa y ciclooxigenasa.
también pueden mediar la pérdida reversible de capacidad pulmonar obser-
vada en el asma humano. Desde el punto de vista molar, los leucotrienos son
muchas veces más potentes que la histamina. siendo estos los principales
mediadores de los efectos inflamatorios que caracterizan las reaccionas de
hipersensibilidad inmediata (Samuelsson, 1983).
Otro mediador lípido de la inflamación, llamado factor activador plaquetario
(PAF). es un sustituto derivado del glicerol generado a partir de fosfolípidos
tras la activación celular. El PAF produce anafilaxia cuando se administra en
pequeñas dosis a animales, y el análogo en humanos se cree que es libera-
do por neulrófilos y macrófagos alveolares. Los efectos biológicos del PAF
que ocurren durante la anafilaxia incluyen la agregación y degranulación de
plaquetas, contracción del músculo liso y aumento de la permeabilidad capi-
lar (Barnes, 1988).
EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE LAS
ENFERMEDADES ALÉRGICAS
La enfermedad alérgica es un problema de salud pública significativo.
Como antes se comentó, más del 20% de los adultos sufren alguna de las for-
mas crónicas de la enfermedad alérgica. Como muchos individuos atópicos
desarrollan alergias durante la infancia, la prevalencia de enfermedades alér-
gicas en niños proporciona otra estimación de la magnitud de la totalidad de
este problema médico. El asma afecta aproximadamente al 5% de los niños
en edad escolar, y otras enfermedades alérgicas menos incapacitantes como
la rinitis alérgica y el eczema, afectan aproximadamente un 15% y un 5% de
los niños, respectivamente. Según una revisión, las enfermedades alérgicas
menores afectan a casi el 40% de todos los niños de Estados Unidos.
De forma rutinaria los médicos apenas utilizan unas pocas pruebas de
laboratorio para la evaluación de enfermedades alérgicas. Las pruebas para
proteina IgE y para anticuerpos IgE alérgenos específicos son los pilares.
Antes de tratar los detalles de estas pruebas, es importante apuntar que la uti-
lidad de cada prueba viene determinada por el contexto clínico en el que se
aplica. En el campo de la alergia clínica, las pruebas para proteína IgE y anti-
cuerpos IgE se piden principalmente para el diagnóstico y menos frecuente-
mente para la valoración pronostica, o como una ayuda en el tratamiento tera-
péutico. La utilidad de los resultados de la prueba en cada situación está
determinada empíricamente por si es difícil o no establecer un diagnóstico
1019
preciso de enfermedad alérgica o decidir un solo régimen terapéutico deter-
minado en el campo práctico. En niños y adultos, la hipersensibilidad inme-
diata puede ser el primer mecanismo de la enfermedad o un factor contribu-
yente; y mientras que en el campo práctico es posible establecer un
diagnóstico de presunción de una enfermedad alérgica, a menudo el diag-
nóstico definitivo y el tratamiento requieren de la identificación inequívoca del
alérgeno(s) en particular. Esto es particularmente importante en casos de
enfermedad alérgica grave que se produce en individuos sin un antecedente
atópico o un antecedente familiar de enfermedad alérgica.
La palabra atopia (o atópico) se utiliza sobre todo en la bibliografía médica
de la alergia para referirse a los individuos con una historia familiar de enfer-
medad alérgica que tienen sensibilidad demostrable a una variedad de alér-
genos. Estos individuos se incluyen aquí por tener un fenotipo alérgico. Los
individuos no atópicos pueden también sufrir enfermedades alérgicas y pue-
den desarrollan clínicamente reacciones de hipersensibilidad inmediata signi-
ficativas a alérgenos que se encuentran repetidamente en su entorno. La
característica que distingue a los individuos atópicos es su tendencia a des-
arrollar sensibilidad a una variedad de alérgenos encontrados en condiciones
ambientales rutinarias (Hoekelman. 1974). La atopia clínica existe asociada a
la normalidad.
No se puede explicar la utilidad de las pruebas de laboratorio en el diag-
nóstico y tratamiento de las enfermedades alérgicas sin mencionar las prue-
bas ín vivo de la hipersensibilidad inmediata, particularmente la prueba cutá-
nea y las pruebas de provocación órgano-especificas. Históricamente, se
consideraban las pruebas in vivo como un criterio de diagnóstico preciso y fia-
ble. La capacidad de reproducir una reacción alérgica específica por un meca-
nismo in vivo todavía se considera por muchos alergólogos como la técnica
más sensible para demostrar la presencia de hipersensibilidad inmediata y
para definir su especificidad.
Las pruebas cutáneas se realizan por la inyección inlradérmica y por los
métodos de pinchazo cutáneo (Bousquet, 1993). La respuesta a la inyección
intradérmica de un extracto alérgeno se gradúa determinando el diámetro del
grano y por la reacción eritematosa inmediatamente después de la inyección.
Una reacción con 1+ se corresponde con un grano de 5 mm a 10 mm. Una
respuesta de esta magnitud habitualmente se considera como evidencia de
una sensibilidad específica a un alérgeno. Los individuos altamente sensibles
a menudo desarrollan granos de diámetros mayores de 15 mm con seudópo-
dos. Las pruebas cutáneas realizadas mediante un pinchazo utilizan un alér-
 1020 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
geno exaclo más concentrado, a concentraciones 1.000 veces superiores a
las utilizadas en las pruebas intradérmicas. y su gradación a menudo se omi-
te. El diámetro medio del grano en milímetros se apunta como un indicador
del grado de sensibilidad. Se puede obtener una estimación más cuantitativa
de la sensibilidad a un determinado alérgeno mediante una técnica de ajuste
final. Esta técnica es una modilicación de los métodos mtradérmicos y de pin-
chazo cutáneo. De forma senada se utilizan diluciones con 10 veces el extrac-
to alérgeno estandarizado empezando con la solución más diluida. El objeti-
vo de la sensibilidad se define como la mayor dilución que produce una
reacción 1+.
Las pruebas de provocación a determinados órganos son útiles en la prác-
tica clínica y con propósitos de investigación. Las adaptaciones de esta téc-
nica incluyen la prueba de provocación bronquial en el diagnóstico de asma:
la prueba de provocación rinoconjuntival en el diagnóstico de rinitis alérgica:
la eliminación de comida y prueba provocación en el diagnóstico del asma
inducido por comida, urticaria y malabsorción: y la provocación de una pica-
dura en el diagnóstico de sensibilidad anafiláctica al veneno de insectos
(Naclerio. 1993). La aplicación de pruebas de provocación en situaciones clí-
nicas rutinarias está limitada por la necesidad de un alérgeno exlraído bien
caracterizado de potencia definida y por el número limitado de alérgenos que
pueden ser probados en un individuo en una única ocasión. Como ejemplo, la
eliminación de comida y procedimientos de provocación que requieren de
períodos de abstinencia de varios dias. durante los cuales el consumo inad-
vertido de un alimento determinado puede invalidar la prueba.
Un obstáculo importante para el diagnóstico exacto en el campo de la aler-
gia clínica es la falta de extractos de alérgeno disponibles de potencia unifor-
me y composición definida (Bousquet, 1995). Salvo en ejemplos seguros,
como las conocidas hierbas, céspedes, ácaros y mohos, los constituyentes
químicos que provocan reacciones alérgicas no están caracterizados para
muchos alérgenos reconocidos. A pesar de los esluerzos de los fabricantes
por producir materiales estandarizados, a menudo los diferentes lotes del mis-
mo alérgeno varian en potencia por apenas una sene de medidas.
Se han utilizado diversas técnicas para cuantificar la potencia de alérgenos
en el uso clínico, incluyendo medidas del contenido de nitrógeno de proteínas,
pruebas cutáneas de ajuste específico, análisis inmunoquimicos con antisue-
ro animal específico, e inhibición de la aglutinación de anticuerpos IgE espe-
cíficos por alérgenos solubles m w'fro (Gleich. 1974). La inhibición de la aglu-
tinación de anticuerpos IgE específicos por alérgenos en solución acuosa es
un método excelente para comparar extractos de alérgenos. La potencia de
un extracto alérgeno está inversamente relacionada con la dosis de alérgeno
soluble requerida para inhibir la aglutinación de los anticuerpos IgE en un con-
trol positivo de suero a una cantidad fija de alérgeno ajustado en fase sólida.
La semejanza cualitativa y antigénica de los diferentes lotes de alérgeno y la
cantidad de alérgeno presente se pueden estimar comparando las pendien-
tes y ED,„ de las curvas dosis-inhibición. Los diferentes lotes de alérgenos
que contienen la misma mezcla cualitativa de constituyentes alergénicos pro-
vocan lineas dosis-inhibición paralelas cuando el porcentaje de inhibición se
traza frente a la dosis de un extracto alérgeno soluble. El método de inhibición
in vilro es útil para comparar la potencia y las características antigénicas tan-
to de alérgenos puros como de mezclas.
Proteína IgE: métodos de determinación,
valores normales y utilidad clínica
Existen una variedad de métodos inmunoquimicos disponibles comercial-
mente para determinar el IgE en suero, incluyendo desplazamiento competi-
tivo e inmunoanálisis sandwich y nefelometría (Homburger. 1993). Los métodos
no isotópicos son los más populares. Cada uno de estos inmunoanálisis es
capaz de detectar IgE en suero a concentraciones tan bajas como 0,5 U/ml (1,2
ng/ml). Los métodos sandwich de inmunoanálisis utilizan una aproximación
analítica común; un anticuerpo anti-lgE policlonal o monoclonal, unido cova-
lentemente a una fase sólida, se incuba con una proporción de suero o están-
dar, y la IgE unida se detecta mediante incubación con el anticuerpo anti-lgE
marcado, purificado de afinidad, o monoclonal. La concentración de IgE en
muestras de suero se calcula comparándola con una curva estándar. La
máxima sensibilidad analítica se consigue en el rango de 7,5 a 50 U IgE /mi.
Las concentraciones menores pueden determinarse por métodos sandwich.
12.0(M)
pero la habilidad de detectar pequeños cambios de concentración en el ran-
go de 0,5 a 4 U /mi disminuye comparada con concentraciones más elevadas
(Fig. 464).
Se han realizado numerosos estudios clínicos de las concentraciones de
IgE en suero en sujetos sanos (no alérgicos). En todos los estudios, hay ten-
dencias estrictas en el desarrollo de niveles de IgE con la edad y con distri-
buciones de frecuencia de concentraciones de IgE observadas en adultos
sanos sin tener en cuenta los métodos analíticos (Homburger. 1986). La dis-
tribución de la frecuencia de las concentraciones de IgE en adultos sanos se
angula positivamente con los límites de percentil 95 y con un número exage-
rado de valores baios de IgE. Al calcular el percentil 95 de los limites norma-
les, la mayoría de los investigadores han tratado sus datos con transforma-
ción logarítmica, produciendo por lo tanto límites superiores a lo normal que
son al parecer muy elevados cuando se comparan con las medias aritméticas
(Barbee. 1981). Como se comentará más tarde, estos limites superiores de lo
normal sirven para reducir la sensibilidad diagnóstica de la prueba de IgE en
suero como una prueba de despistaje clínico de alergia cuando el límite supe-
rior al normal se usa como valor de corte.
La síntesis de IgE en el feto humano se produce incluso a las 11 semanas
de gestación en el tejido fetal pulmonar y hepático, aunque el cordón umbili-
cal contiene IgE virtualmente no detectable. La concentración media del cor-
dón umbilical es menor de 1 U/ml (Kimpen. 1989). Las concentraciones de
IgE en el suero materno y en el cordón umbilical no se correlacionan, indi-
cando que no hay paso placentario apreciable de IgE materna. La existencia
de anticuerpos IgE específicos para la leche de vaca en el cordón umbilical,
pero no en el suero materno, indica que puede existir una sensibilización
intrauterina y apoya la conclusión de que la proteína IgE detectada en el cor-
dón umbilical tiene un origen fetal.
Las concentraciones de IgE en suero de niños aumentan lentamente con
el desarrollo o alcanzan los niveles adultos aproximadamente a los cinco a los
siete años de edad (Homburger, 1986a). Varios estudios clínicos han mostra-
do un promedio un tanto más alto de la concentración de IgE en suero en
niños de edades entre los 10 y los 14 años que en adultos de 20 años. El sig-
nificado clínico de este descubrimiento no está claro. No se han observado
diferencias entre los niveles de IgE en niños y niñas de edades similares. En
individuos mayores de 70 años de edad, hay una tendencia a un promedio de
niveles de IgE más bajo que en los adultos jóvenes menores de 40 años de
edad.
La determinación de la proteina IgE en suero ha sido evaluada a fondo por
su utilidad clínica en el diagnóstico de vanas enfermedades alérgicas, por su
valor predictivo como un indicador de la probabilidad del desarrollo de enfer-
medad alérgica en bebés y niños asmtomálicos. y como indicador pronóstico
en adultos con algunos tipos de enfermedad alérgica crónica. La determina-
 CAPÍTULO 46 • ENFERMEDADES ALÉRGICAS
ción de IgE también es valiosa en la valoración de pacientes en los que se
sospecha que puedan tener enfermedades de inmunodeficiencia. enfermeda-
des parasitarias o el raro síndrome hiper-lgE.
El síndrome hiper-lgE fue descrito primero en 1972 por Buckley y col., que
publicaron dos casos de pacientes con niveles altamente elevados de IgE en
suero, dermatitis difusa, furunculosis recidivante y neumonía con neumatoce-
les secundarios a Staphylococcus aureus. Las publicaciones posteriores de
pacientes con este trastorno definen este síndrome clinico: las elevaciones de
los niveles de IgE en suero son extremas (de 2.000 a 50.000 U / mi), y los
pacientes tienen eosinofilia en sangre y tejidos y un habón fuertemente posi-
tivo inmediato y reacciones enlematosas a alérgenos inhalados, pólenes, ali-
mentos, y antígenos bacterianos y de hongos. A pesar de estos descubri-
mientos, el asma no es común en pacientes con el síndrome hiper-lgE
(Buckley, 1978).
La síntesis de IgE, como se refleja en los niveles de suero, se ha estudiado
en pacientes con un sinfín de enfermedades ¡nmunodeficientes primarias Se
han descrito niveles elevados de IgE asociados con deficiencias incompletas
de la inmunidad celular, incluyendo el síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome
parcial DiGeorge y alinfoplasia timica (síndrome de Nezelof) (Buckley. 1975).
Las inmunodeficiencias en las que hay ausencia completa de síntesis de
mmunoglobulinas G, A y M, como la enfermedad inmunodeficienle aguda
(SCID), muestran característicamente una disminución de la síntesis de IgE y
niveles de IgE marcadamente disminuidos en suero. Los niveles de IgE en
suero son variables en pacientes con deficiencia de IgA: los pacientes con
ataxia telangiectasia típicamente tienen niveles disminuidos, pero los pacien-
tes con deficiencia aislada de IgA pueden tener niveles normales o modera-
damente aumentados (Buckley, 1975). La enfermedad alérgica no es común
en pacientes con inmunodeficiencias, a excepción de los individuos con defi-
ciencia de IgA selectiva que tienen niveles de IgE elevados en suero. La sín-
tesis elevada de IgE en pacientes con síndrome hiper-lgE o con deficiencias
parciales de inmunidad celular posiblemente manifiestan una secreción de
IgE aumentada producida por los linfocitos B que escapan del control regula-
dor de los linfocitos T.
La infiltración parasitaria del tracto gastrointestinal o órganos parenquima-
tosos estimula intensamente la síntesis de IgE, y los estudios de laboratorio
con animales sugieren que los anticuerpos IgE específicos son importantes
en la defensa del huésped frente a parásitos como el Nippostrongylus brasi-
llensis y Schistosoma mansoni (Mulligan, 1965). Las concentraciones de IgE
en suero superiores a 1.000 U/ml se encuentran de forma habitual en niños
en áreas de infestación endémica con parásitos. Se sabe que existen otras
enfermedades parasitarias asociadas a niveles de IgE en suero aumentados,
incluyendo la larva visceral migratoria (Toxocara cams), capilariasis intestinal
(Capillana philippinensis). esquistosomiasis. anquilostomiasis y equinococo-
sis. En pacientes con enfermedad parasitaria intestinal, se han evidenciado
niveles de IgE en suero disminuidos considerablemente después de seguir un
tralamienlo exitoso con fármacos antiparasitarios.
Al revisar la utilidad de los niveles de IgE en suero como prueba diagnós-
tica para la enfermedad alérgica, es importante tratar su uso en niños y adul-
tos por separado. Los niveles de IgE en suero elevados al nacer o durante la
Tabla 46-3 Incidencia de c o n c e n t r a c i o n e s e l e v a d a s de IgE en s u e r o en n i ñ o s alérgicos de e d a d e s de d o s a 16 a ñ o s con diferentes
c o m b i n a c i o n e s d e e n f e r m e d a d e s alérgicas
№ de n i ñ o s
Diagnostico en cada grupo
Sólo asma
Asma y rinoconjuntivitis 33
Asma y dermatitis atópica más otras 70
enfermedades de hipersensibilidad
Asma y urticaria más oirás enfermedades 75
de hipersensibilidad
Asma y urticaria y dermatitis atópica más
otras enfermedades de hipersensibilidad
Asma y alergia gastrointestinal más otras 13
enfermedades de hipersensibilidad
1021
lactancia sucede a menudo antes del desarrollo de la alergia clínica (Kjellman,
1984). Se observaron niveles de IgE en suero por encima del percentil 95
para la edad en el 75% de los niños con antecedentes de ambos padres de
enfermedad alérgica; y entre los niños sanos con niveles de IgE mayores de
1 SD por encima de la media para una edad determinada, la incidencia de
desarrollo de enfermedad alérgica durante los siguientes 18 meses aumenta-
ba en 10 veces más en comparación a un grupo con niveles de IgE más
bajos. Aunque prevén el desarrollo de una futura enfermedad alérgica, estos
datos aportan relativamente poca información sobre cómo basar decisiones
clínicas especificas.
El diagnóstico de enfermedad alérgica en los laclantes es complicada debi-
do a que la rinorrea es la manifestación más común de alergia en este grupo
de edad, pero las infecciones respiratorias son comunes durante la lactancia
y puede ser imposible distinguirlas de la rinitis alérgica en la práctica clínica.
Sin embargo, como la enfermedad alérgica de inicio precoz parece estar aso-
ciada con manifestaciones clínicas más agudas, es importante establecer el
diagnóstico de alergia lo antes posible {véase más adelanté). El valor princi-
pal de las determinaciones de IgE en niños parece ser la alerta para el médi-
co de una posible enfermedad alérgica cuando el diagnóstico clínico de sos-
pecha es diferente. Los niveles de IgE en suero superiores a 20 U/ml en estos
casos apoyan el diagnóstico de enfermedad alérgica, pero un nivel normal de
IgE no excluye el diagnóstico de enfermedad alérgica durante la infancia o en
la vejez. Los resultados de otras pruebas diagnósticas, incluyendo pruebas
para anticuerpos IgE, pueden tomarse en consideración en el diagnóstico de
exclusión de enfermedad alérgica. En esas situaciones clínicas donde los
signos de enfermedad alérgica son inequívocos, por eiemplo eczema y rinitis
en un niño con antecedente familiar de atopia, el nivel de IgE en suero pro-
porciona una pequeña información adicional.
La situación es bastante similar en niños mayores. La determinación de la
proteína IgE en suero tiene una sensibilidad diagnóstica limitada para la
enfermedad alérgica cuando el limite superior del rango normal se utiliza
como una cota diagnóstica. En general, los niños con hipersensibihdad a
varios alérgenos diferentes y múltiples enfermedades alérgicas presentan
niveles en suero elevados, y aquellos con hipersensibilidad a menos alérge-
nos y afectación limitada a un órgano a menudo tienen niveles normales
(Berg. 1969). Este detalle se ilustra en los datos de la Tabla 46-3. La sensibi-
lidad diagnóstica es mayor en pacientes con sensibilidad clínica a un numero
de alérgenos diferentes.
En niños atópicos, la presencia de enfermedad cutánea y manifestaciones
gastrointestinales aumenta la probabilidad de que los niveles de IgE en suero
estén elevados (Havnen, 1973). También hay evidencias que apuntan que la
frecuencia de los niveles elevados de IgE en suero es mayor en niños con hiper-
sensibilidad a los alimentos y a alérgenos del polen que en niños con hipersen-
sibilidad a alérgenos de polvo o moho (Berg. 1969). Los niños con enfermedad
alérgica que afecta a varios órganos también suelen tener elevaciones en IgE
en suero de mayor magnitud que aquellos con enfermedades más limitadas;
las elevaciones extremas ocurren más a menudo en pacientes con manifes-
taciones cutáneas. La especificidad diagnóstica de un nivel elevado de IgE
para la enfermedad alérgica es excelente. La asociación es tan fuerte, que los
№ de niños con IgE Incidencia de IgE en suero
en suero e l e v a d o elevado (%)
3 14
13 39
41 58
46 61
12 50
11 84
 1022 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
niños asinlomálicos con niveles elevados de IgE a veces se califican como
prealérgicos, asumiendo que desarrollarán signos de alergia clínica en el
futuro.
La determinación de la proteina IgE en suero tiene una utilidad diagnóstica
moderada en la mayoria de los adultos con sospecha de padecer una enfer-
medad alérgica. Los resultados de estudios clínicos de alergia respiratoria
adulta indican que aproximadamente el 50% de los adultos con asma extrín-
seca y menos del 5% de adultos con la denominada asma intrínseca (no ató-
pica) tienen elevados niveles de IgE en suero (Wittig. 1980). Los adultos
asmáticos con hipersensibilidad a un número limitado de alérgenos habitual-
mente tienen niveles normales. Los mayores niveles de IgE en adultos carac-
terísticamente ocurren en aquellos pacientes con hipersensibilidad a diversos
alérgenos y combinaciones de asma, dermatitis atópica y rinitis. Al igual que
en los niños, la sensibilidad diagnóstica limitada de los niveles de IgE en sue-
ro limita la utilidad clínica de las determinaciones de IgE en aquellas situacio-
nes donde el diagnóstico de enfermedad alérgica es más incierto (Klink,
1990). Esto no quiere decir, sin embargo, que la IgE en suero no pueda deter-
minarse en estos casos, pues un nivel elevado tiene un alto valor predictivo
de enfermedad alérgica.
Los niveles de IgE en suero han recibido una atención particular en niños
y adultos con dermatitis atópica. Los mecanismos relacionados con la pato-
génesis de la dermatitis atópica se desconocen por completo, pero el descu-
brimiento de niveles muy altos de IgE en la mayoría de los pacientes con
dermatitis atópica y enfermedad activa ha provocado diversas investigaciones
de la relación entre la actividad de la enfermedad y los niveles de IgE. Aun-
que no hay un consenso, algunos estudios indican que las fluctuaciones en la
gravedad de las manifestaciones cutáneas paralelas cambian análogamente
al nivel de IgE en suero (Wuthrich. 1978). Las relaciones causales, si existen,
permanecen ocultas.
La aspergilosis broncopulmonar alérgica también se asocia a una marcada
elevación del nivel de IgE en suero. Esta enfermedad ocurre típicamente en
pacientes con asma extrínseca, generalmente de larga duración. Los niveles
de IgE en suero están elevados en casi todos los pacientes con aspergilosis
alérgica cuando existe una infiltración pulmonar aguda, pero los niveles de
IgE pueden fluctuar considerablemente durante el curso de la enfermedad.
Un nivel normal de IgE en un paciente con enfermedad pulmonar activa exclu-
ye prácticamente este diagnóstico (Imbeau, 1978).
Anticuerpos IgE alérgeno-específicos:
métodos de determinación, calificación de resultados,
y utilidad clínica
Las pruebas cutáneas y de provocación a un órgano son procedimientos
establecidos para la detección de anticuerpos IgE in vivo, como se comentó
previamente. También existen métodos in vitro para detectar anticuerpos IgE
en suero y en los granulocitos basófilos; los métodos principales son la prue-
ba del anticuerpo IgE específico y la prueba de liberación de histamina leu-
cocitaria, respectivamente. La prueba de liberación de histamina leucocitaria
lúe descrita por primera vez hace más de 50 años. Los leucocitos aislados de
sangre periférica por sedimentación de dextrano se lavan y se suspenden de
2, 2
nuevo en un tampón que contiene iones Ca y Mg \ Entonces, se añaden
concentraciones variables de un extracto alérgeno a un número determinado
de leucocitos lavados, y la mezcla se incuba a 37°C durante una hora. La
reacción se para congelando los tubos a 4°C, y las células se separan por
centrifugación. La histamina secretada por los basófilos como consecuencia
de la interacción del alérgeno con las células unidas a anticuerpos IgE se libe-
ra en el líquido sobrenadante y se aisla por extracción con butanol ya ácido.
La concentración de histamina en el extracto se mide de forma fluorométrica
o por inmunoanálisis específico. El procedimiento fluorométrico. realizado
manualmente, detecta aproximadamente 1 ng de histamina. El método de
inmunoanálisis es un poco más sensible. Los resultados se expresan como
un porcentaje del total de histamina celular liberada; la histamina total se
determina en los usados ácidos de leucocitos no expuestos al extracto de
alérgeno (Lichtenstein. 1964),
Los resultados de la prueba de liberación de histamina leucocitaria defi-
nen la especificidad de los anticuerpos IgE ligados a células e indican la
integridad funcional de los mecanismos mediadores de liberación. A pesar
de estas características, la prueba de liberación de histamina leucocitaria
presenta aplicaciones limitadas en la práctica clínica. Aproximadamente el
15% de los individuos tienen leucocitos que no liberan histamina in vitro.
Aunque se han desarrollado sistemas automatizados para la determinación
de histamina, este análisis es incómodo de realizar y caro. La prueba
requiere de células sanguíneas frescas y sólo se pueden analizar un núme-
ro limitado de alérgenos utilizando una muestra única de sangre. Actual-
mente, la prueba de histamina liberada se utiliza más en investigación que
en la práctica clínica.
La prueba de anticuerpo IgE. inicialmente conocida como prueba radioa-
lergoabsorción (RAST), es un inmunoanálisis sandwich análogo en principio
a la prueba de Coombs indirecta. Se mezcla la muestra de suero en la que se
quieren determinar los anticuerpos IgE con un alérgeno unido a un material
en fase sólida. Después de la incubación inicial, los componentes que no son
anticuerpos se retiran, y el alérgeno inmunoabsorbente se incuba en una
segunda fase del análisis con anticuerpos anti-lgE monoclonales o cromalo-
grafia marcada purificada. Los anticuerpos IgE específicos fijados en la pri-
mera fase del análisis se detectan con anticuerpos anti-lgE marcados unidos
a la fase sólida del complejo alérgeno (Gleich. 1975).
Las concentraciones reales de anticuerpos IgE no se determinan con pre-
cisión con estas técnicas. En el suero de algunos individuos alérgicos, las
concentraciones de anticuerpos IgE exceden la capacidad aglutinante de los
alérgenos inmunoabsorbentes, y los sobrenadantes incubados en la primera
fase contienen cantidades residuales de anticuerpos IgE específicos. En un
rango un tanto limitado de concentraciones, la aglutinación de anticuerpos en
la segunda fase incrementa en proporción directa a la concentración de anti-
cuerpos IgE en suero y se puede obtener alguna cuantificación. Sin embargo,
la aglutinación final refleja cantidades y afinidades de los anticuerpos presen-
tes (Schellenberg, 1975).
Como inicialmente describieron Wide y col. (1967). la prueba del anticuer-
po IgE empleaba alérgenos unidos covalentemente a gotas de Sephadex.
Una variedad de otros materiales de fase sólida se han utilizado con poste-
rioridad, incluyendo partículas de celulosa, gotas de agarosa. discos de filtro
de papel y placas de microtítulaciones de poliestireno. Muchos de estos mate-
riales de soporte pueden activarse químicamente a formas intermedias lábi-
les que reaccionan con alérgenos en solución acuosa para formar inmunoab-
sorbentes unidos covalentemente. La aglutinación de alérgenos en las placas
de microtítulaciones se realiza por absorción no covalente. Para la aplicación
clínica, la fase sólida alérgeno inmunoabsorbente puede contener todos los
constituyentes alergénicos presentes en el extracto alérgeno liquido, en las
mismas proporciones que el extracto alérgeno original. Aunque es posible
controlar la unión de todas las proteínas a inmunoabsorbentes, existen pocos
datos disponibles para determinar si todas las proteínas alergénicas relevan-
tes se han fijado a algunos sistemas alergénicos clínicamente importantes.
Existe un amplio rango de alérgenos disponible para la prueba de anti-
cuerpo IgE. Es posible adquirir los reactantes en kits o se puede enviar el sue-
ro a un laboratorio de referencia para su análisis. Las diversas clases de alér-
genos disponibles incluyen epitelio animal; alimentos; pólenes de árboles,
céspedes y hierbas; mohos; hongos: venenos de insectos; fármacos; y alér-
genos ocupacionales. La mayoría de las drogas son compuestos de bajo
peso molecular que no pueden fijarse fácilmente en una fase sólida por los
métodos químicos habituales. Algunas drogas macromoleculares, como la
insulina, pueden unirse para producir reactivos satisfactorios. En el caso de la
penicilina, el grupo peniciloil puede conjugarse a la polilísina o a la proteina
transportadora, que así puede fijarse a una fase sólida apropiada para utili-
zarse en la prueba de anticuerpo IgE (Wide, 1971). No hay reactantes análo-
gos disponibles para detectar anticuerpos IgE de los conocidos determinan-
tes antigénicos menores de penicilina, responsables de algunas reacciones
anafilácticas agudas a esta droga.
No hay un acuerdo unánime para notificar resultados de las pruebas de
anticuerpos IgE. Varios métodos comerciales utilizan un sistema de puntua-
ción que obtiene los resultados de las muestras de pacientes a partir de la
comparación con la curva dosis-respuesta de referencia obtenida de una
serie de diluciones de un control positivo (Fig.46-5). En un intento de maxi-
mizar la sensibilidad analítica de estos métodos, se consideran positivos
aquellos resultados superiores a 0,35 KU/L (unidades Killa por litro) están-
dar. La concentración de anticuerpos IgE puede expresarse tanto en KU / L
 CAPÍTUIO 46 • ENFERMEDADES ALÉRGICAS
2(1.0(10
0.35 0,7 3.5 17,5 50 100
Concentración (kU-1)
Figura 46-5. Curva dosis-respuesta para la determinación de anticuerpos IgE por
inmunoanálisis de enzima fluorescente comercial. FU = unidades fluorescentes.
como en clases numeradas del O al V o VI. La mayoría de los médicos
están más familiarizados con los sistemas de puntuación basados en cla-
ses. Sin tener en cuenta el sistema usado para expresar los resultados,
debería tenerse en cuenta que la mayoría de los resultados son semicuan-
titativos. Los resultados dudosos o débilmente positivos pueden deberse a
la variabilidad analítica (Jacob, 1982). El suero con niveles de proteina IgE
marcadamente elevados también pueden producir resultados falsos positi-
vos, debido a una unión incrementada no específica de IgE. Este fenómeno
habitualmente no ocurre a no ser que la concentración de IgE exceda de
1.000 KU / L, lo que puede ocurrir en pacientes con dermatitis atópica o
enfermedades alérgicas múltiples. Los resultados de falsos negativos cau-
sados por la inhibición de la unión de anticuerpos IgE puede ocurrir en algu-
nos sistemas analíticos debido a la competición por lugares de unión a alér-
genos por anticuerpos IgG. Estos anticuerpos tienen afinidades similares a
los anticuerpos IgE y habitualmente se encuentran en concentración de
microgramo por mililitro en el suero de pacientes tratados con inmunotera-
pia alérgena (Paull. 1978). Como las determinaciones de anticuerpos IgE no
son útiles en pacientes tratados para determinar si existe sensibilidad clíni-
ca residual, se entiende que este problema habitualmente ocurre cuando la
prueba de anticuerpo IgE se usa mapropiadamenle.
La sensibilidad analítica de una prueba de anticuerpo IgE en parte está
determinada por el anticuerpo anti-lgE marcado utilizado en la segunda fase
del análisis. Los anticuerpos anti-lgE comerciales con afinidad purificada y
marcados funcionan bien como proteínas detectoras y permiten la determina-
ción de cantidades en nanogramos de anticuerpos IgE específicos. Los anti-
cuerpos anti-lgE monoclonales marcados también están disponibles comer-
cialmente.
Las recomendaciones para el uso clínico de la prueba de anticuerpo IgE se
basan en los resultados de estudios clínicos donde los resultados de la sen-
sibilidad del anticuerpo IgE fueron comparados con oirás pruebas diagnósti-
cas. En algunos casos, la decisión de identificar los alérgenos específicos res-
ponsables de los signos clínicos está moderada al saber que la terapia no
será diferente si se identifican los alérgenos agresores. Este último punto es
importante en muchos pacientes cuyo tratamiento está basado en el uso de
fármacos que inhiben la liberación de mediadores inflamatorios, producen
broncodilatación o suprimen la inflamación. Sin embargo, en la mayoría de los
individuos alérgicos, el conocimiento de los alérgenos agresores es clínica-
mente útil para decidir qué tipo de alérgenos deben usarse en un régimen de
inmunoterapia, como en pacientes con rinitis alérgica o sensibilidad al vene-
no de insectos, o para conseguir evitar un alérgeno en casos de sensibilidad
anafiláctica a alimentos o fármacos.
Es difícil definir la sensibilidad diagnóstica absoluta y específica de los
resultados de anticuerpo IgE porque no hay un método de referencia umver-
salmente aceptado para definir la sensibilidad hacia un alérgeno determina-
1023
do. Sin embargo, en la mayoría de los esludios clínicos los resultados de las
pruebas de anticuerpo IgE se han comparado con los resultados de las prue-
bas de diagnóstico in vivo y los antecedentes de enfermedad alérgica. Está
claro según estos estudios que la sensibilidad diagnóstica varia considera-
blemente dependiendo del tiempo transcurrido desde la exposición a un alér-
geno y la prueba, la clase de alérgeno examinado, la edad del paciente y los
órganos diana afectados (Homburger, 1986a). En los objetivos de este capi-
tulo, es útil considerar las siguientes aplicaciones clínicas por separado:
enfermedad respiratoria alérgica, alergia a alimentos, sensibilidad al veneno
de insecto y alergia a lármacos u ocupacional.
Como los anticuerpos IgE asociados a células median en la enfermedad res-
piratona alérgica, es razonable tener en cuenta los resultados de las pruebas de
provocación a un órgano específico como un criterio para determinar la sensi-
bilidad hacia un alérgeno determinado. Diversos estudios en adultos con asma
o rinitis alérgica han mostrado una excelente relación general entre los resulla-
dos de pruebas de provocación y las pruebas de anticuerpo IgE llevadas a cabo
con alérgenos inhalados, incluyendo pólenes de árboles, céspedes y hierbas,
mohos y ácaros. Los resultados de las pruebas cutáneas y pruebas de anti-
cuerpo IgE también concuerdan en la mayoría de los casos. La mayoría de los
resultados discordantes fueron pruebas cutáneas débilmente positivas en
pacientes con pruebas de anticuerpo IgE negativo (Wide, 1967).
En niños con enlermedad alérgica, los estudios epidemiológicos recientes
han aportado un secuencia de desarrollo de signos y síntomas de enferme-
dad que se acompañan de una secuencia predecible de sensibilización a dife-
rentes clases de alérgenos (Bergmann, 1997). Esta denominada marcha alér-
gica a menudo empieza con alergia a alimentos en niños menores de tres
años asociada a manifestaciones gastrointestinales y dermatitis atópica
seguida de enfermedad respiratoria incluyendo asma y rinitis causadas por
sensibilidad a alérgenos inhalados. La secuencia de detección de anticuerpos
IgE que es paralela al desarrollo de manifestaciones clínicas avanza con la
edad de la siguiente forma: los anticuerpos IgE de proteínas de alimentos
especialmente huevo y leche se detectan primero sobre los tres años de
edad, luego anticuerpos de alérgenos inhalados, empezando con alérgenos
internos incluyendo epitelio animal y ácaros de polvo sobre los cinco años de
edad; y al final de la infancia, los alérgenos inhalados externos incluyendo
pólenes. El desarrollo de sensibilidades en esta secuencia tiene implicaciones
obvias para las pruebas clínicas en niños.
Entre los niños con enfermedad respiratoria alérgica, los estudios clínicos
han mostrado que los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE y las prue-
bas de provocación concuerdan en muchos casos. De nuevo, la mayoría de
los resultados discordantes se han observado en niños con pruebas de pro-
vocación positivas hacia extractos alérgenos altamente concentrados. Se
observó una concordancia importante en niños con alergia moderada o agu-
da, y en niños con pruebas de provocación negativas. Como muestran estos
resultados, la sensibilidad diagnóstica de estas pruebas de anticuerpo IgE
hacia alérgenos inhalados varia directamente con la magnitud de sensibilidad
clínica en pacientes con alergias respiratorias (Berg, 1974).
También es oportuno preguntarse si concuerdan bien los resultados de
anticuerpo IgE con las pruebas cutáneas en casos de sospecha de alergia
respiratoria. En los estudios previamente mencionados, si los resultados de
pruebas cutáneas realizados con el método del pinchazo se utilizaron para
definir la sensibilidad hacia un alérgeno, se obtuvieron muchos más resulta-
dos discordantes. La prueba de anticuerpo IgE fue negativa en pacientes con
pruebas cutáneas débilmente positivas, pero se obtuvieron resultados positi-
vos casi en el 90% de los pacientes con pruebas cutáneas fuertemente posi-
tivas. En general, las mejores correlaciones se observaron con alérgenos de
polen y alérgenos purificados, mientras que se observaron menores grados
de correlación con alérgenos de polvo y moho.
Los partidarios de la prueba cutánea defienden que datos como éstos indi-
can que la prueba cutánea es un método diagnóstico más sensible, mientras
los partidarios de la prueba de anticuerpo IgE señalan que un alto porcentaje
de las pruebas cutáneas débilmente positivas no son validadas por pruebas
de provocación positivas. El argumento es un tanto teórico; cualquier método
diagnóstico es fiable en pacientes con sensibilidad marcada a un alérgeno y
ninguno es completamente fiable para identificar ligeras discordancias de
sensibilidad clínica. En este último caso, los dos métodos pueden proporcio-
nar información diagnóstica complementaria.
 1024 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Las pruebas para anticuerpos IgE tienen ciertas ventajas comparadas con
las pruebas cutáneas. No presenta riesgo para el paciente, y los resultados
no están influidos por tratamientos concomitantes con antihistamínicos o
broncodilatadores. Además, la prueba de anticuerpo IgE puede ser mejor que
la prueba cutánea en ciertos grupos de pacientes, como los bebés, pacientes
con dermografismo o pacientes con dermatitis generalizada. También hay
desventajas. La prueba serológica es cara si se hace indiscriminadamente, y
los resultados no son inmediatos. Recientemente, la prueba de anticuerpo IgE
multíalérgeno realizada con inmunoabsorbentes que tienen más de un alér-
geno acoplado a su superficie se ha mostrado que es una prueba de detec-
ción sistemática sensible y eficaz en coste para la alergia por inhalación. Se
necesitan nuevos esludios para documentar la utilidad de esta prueba como
una prueba de detección sistemática en otras situaciones clínicas (Ownby,
1984).
Como se comentó previamente, la sensibilidad a alimentos sucede precoz-
mente en niños atópicos y se manifiesta con una variedad de signos clínicos
en bebés, niños y adultos, incluyendo eczema y dermatitis, rinitis y broncoes-
pasmo, angioedema, urticaria, y rara vez anafilaxia. La determinación de anti-
cuerpos IgE puede ser útil en estos casos, pero existen posibles riesgos al
interpretar los resultados de estas pruebas que deberían conocerse. En la
determinación total excepto de la sensibilidad anafiláctica a determinados ali-
mentos, el uso de provocación con un alimento a doble ciego se considera el
diagnóstico estándar (Bock, 1980). Sin embargo, las pruebas para anticuer-
pos IgE son útiles para seleccionar alérgenos para pruebas de provocación a
doble ciego y para confirmar el antecedente. Los resultados IgE positivos se
supone que son clínicamente significativos si los resultados están apoyados
fuertemente por la historia clínica. Sin embargo, a diferencia de las alergias
por inhalación, la incidencia de resultados falsos positivos (anticuerpos IgE a
comida detectables no parece que se asocien a signos clínicos) es conside-
rable, particularmente en niños. Los resultados de las pruebas de anticuerpo
IgE pueden utilizarse para predecir los resultados de la prueba de provoca-
ción a alimento (Sampson, 1997). Los resultados negativos rara vez se aso-
cian a provocación a alimento positiva: mientras que los resultados fuerte-
mente positivos pueden evitar la necesidad de pruebas de provocación. Se
necesitan nuevos estudios clínicos para definir los límites apropiados para
anticuerpos IgE a diferentes alimentos.
A menudo se considera la sensibilidad a alimentos en el diagnóstico dife-
rencial de enfermedades cutáneas, enfermedad gastrointestinal o enferme-
dad respiratoria en bebés y niños jóvenes. Los anticuerpos IgE específicos a
alimentos más comúnmente encontrados en bebés y niños pequeños son
para proteínas alérgenas en la leche de vaca y al huevo. Las principales pro-
teínas alérgenas en la leche de vaca son la w.-lactalbúmina, p-lactoglobulina,
albúmina bovina, y caseína. La relación entre los anticuerpos IgE hacía estas
proteínas y las manifestaciones de la alergia a leche de vaca está estableci-
da, pero existen anticuerpos IgE medióles en muchos niños atópicos que tole-
ran la leche de vaca. La prueba de anticuerpos IgE a leche de vaca no pue-
de establecer un diagnóstico de intolerancia a la leche debido a mecanismos
distintos de la hipersensibilidad (Liebman, 1981).
Los resultados de pruebas para anticuerpos IgE son mucho más específi-
cos y tienen valores predictivos positivos mayores en casos de sensibilidad
anafiláctica o angioedema causados por alérgenos alimentarios, por ejemplo,
alergia al pescado o a frutos secos. En un estudio publicado, los autores
encontraron al menos un resultado de anticuerpo IgE positivo en el 100% de
niños con sensibilidad anafiláctica alimentaria, 96% de niños con asma, y
92% de niños con angioedema. En estos casos, la prueba de anticuerpo IgE
es más útil porque la historia clínica a menudo incrimina a alimentos particu-
lares como alérgenos (Hoffman, 1974).
La prueba de anticuerpo IgE se utiliza comúnmente para investigar la espe-
cificidad de la sensibilidad a alérgenos alimentarios en pacientes con derma-
titis atópica. Como se citó anteriormente, las pruebas cutáneas pueden ser
imposibles de realizar en pacientes con enfermedad cutánea difusa o dermo-
grafismo. La interpretación de los resultados de las pruebas en pacientes con
dermatitis atópica es complicada por el hecho de que estos individuos a
menudo tienen asma y rinitis concomitantes con elevaciones extremas de IgE
en suero. En estos casos, no es infrecuente encontrar niveles bajos de anti-
cuerpos IgE a una diversidad de alérgenos. Las especificidades clínicamente
importantes se definen por resultados positivos varias clases superiores al
nivel inferior de resultados positivos. A menudo es posible definir la especifi-
cidad del alérgeno en estos pacientes mediante un proceso minucioso de eli-
minación alimenticia combinada con una prueba de anticuerpo IgE.
La prueba de anticuerpo IgE es útil en el diagnóstico de sospecha de sen-
sibilidad a veneno(s) de himenóptero. Los individuos sensibles a los venenos
de abejas de miel, abejas, avispones o avispas típicamente manifiestan sig-
nos de anafilaxís después de un picadura: después puede producirse urtica-
ria, angioedema, broncoespasmo o colapso cardiovascular. La mortalidad
publicada por reacciones sistémicas inducidas por picadura es de 30 a 40
casos anuales, pero esta cantidad probablemente subestima la incidencia
real. La evolución natural de sensibilidad al veneno no tratada no se conoce
completamente. En muchos pacientes con sensibilidad anafiláctica documen-
tada, es posible obtener una historia clínica de reacciones progresivamente
más graves a sucesivos episodios de picadura. Por otro lado, la sensibilidad
al veneno aparentemente mejora en algunos individuos. La decisión de tratar
a un paciente con inmunoterapia al veneno se basa en la evaluación clínica
del riesgo de anafilaxia en posibles picaduras futuras.
El indicador más fiable de la sensibilidad al veneno es la respuesla a una
provocación con una picadura controlada (Parker, 1982). Sin embargo, gene-
ralmente no se realiza esta prueba y raramente se requiere en pacientes pre-
viamente no tratados para establecer el diagnóstico de sensibilidad al vene-
no. Las pruebas cutáneas al veneno y pruebas de anticuerpo IgE son útiles
para confirmar la impresión de que existe sensibilidad clínica y para definir su
especificidad. En esta situación clínica, la mayoría de los esludios indican que
la prueba cutánea es la modalidad diagnóstica más sensible (Sobotka. 1978).
Las pruebas de anticuerpo IgE al veneno son útiles ante todo para confirmar
los resultados de pruebas cutáneas y para definir la especificidad alérgena de
la hipersensibilidad al veneno.
Excepto cuando se provoca la picadura, no hay pruebas in vilro o in vivo
que realmente anuncien la respuesta clínica a una picadura de insecto en un
paciente tratado después de inmunoterapia al veneno. Aunque los niveles de
anticuerpos IgG en suero aumentan marcadamente con la inmunoterapia al
veneno, no se ha definido un nivel límite que pueda utilizarse para identificar
a los pacientes que ya no son de riesgo. Las estimaciones semicuantitativas
de anticuerpos IgE no son útiles clínicamente, y los niveles de anticuerpos IgE
después de tratamiento muestran que no hay relaciones consistentes con el
estatus clínico.
Medidas de anticuerpos IgE han sido también aplicadas al diagnóstico de
hipersensibilidad a fármacos. Aunque muchos fármacos y sus metabolitos son
capaces de provocar la síntesis de anticuerpos, sólo hay datos clínicos y
resultados de determinaciones de anticuerpo IgE disponibles para la penicili-
na y sus metabolitos. La penicilina y su isómero, el ácido penicilinico, se com-
binan con proteínas del suero mediante uniones amidas. El conjugado peni-
ciloil-proteína es el mayor determinante antigéníco, y el conjugado ácido
penicilinico-proteina es el menor determinante antigéníco (Fig. 46-6). Los
niveles medióles de anticuerpos IgM e IgG específicos para el determinante
peniciloil se obtienen comúnmente en pacientes tratados con penicilina, y
aunque persisten títulos elevados de estos anticuerpos en plasma durante
periodos relativamente cortos, a menudo pueden detectarse títulos inferiores
después del tratamiento (Sheperd, 1991).
Los intentos realizados en el diagnóstico de hipersensibilidad a la penici-
lina han contado con pruebas cutáneas con penicilina, peniciloil-polilisina y
una mezcla menor de antígenos. Los resultados positivos de pruebas cutá-
neas ocurren infrecuentemente, especialmente cuando la prueba se realiza
mucho después del tratamiento con penicilina. Menos del 30% de los
pacientes con posibles antecedentes de hipersensibilidad inmediata a la
penicilina tienen pruebas cutáneas positivas, y las reacciones de hipersen-
sibilidad inmediata a la terapia con penicilina son raras en pacientes con
pruebas cutáneas negativas. Cuando se utilizan los resultados de las prue-
bas cutáneas como una referencia diagnóstica, los estudios clínicos han
encontrado anticuerpos IgE medióles al determinante peniciloil casi en el
100% de los pacientes con pruebas cutáneas positivas. Los anticuerpos
antipeniciloil son indetectables en sujetos control. Según estos datos, es
razonable recomendar las pruebas in vitro para anticuerpos IgE-peniciloil
sólo en pacientes con antecedentes de reacciones de hipersensibilidad
reciente. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir inmediatamente
después de reacciones mediadas por IgE y, aunque la mayoría de los datos
 CAPITULO 46 • ENFERMEDADES ALÉRGICAS
publicados indican que los resultados falsos negativos son raros, la ausen-
cia de anticuerpos específicos de peniciloil-polilisina no excluye completa-
mente la posibilidad de significado clínico de los anticuerpos IgE a otros
metabolitos de penicilina (Weiss, 1988).
Las enfermedades alérgicas, particularmente el asma, también pueden
deberse a una gran variedad de alérgenos encontrados en el lugar de traba-
jo. El asma puede resultar tanto de mecanismos alérgicos como no alérgicos.
La lista de agentes etiologicos relacionados con el asma alérgico ocupacional
es larga e incluye los siguientes: proteínas animales, enzimas, proteínas de
plantas, legumbres, anhídridos, sales metálicas, tintes, diisocianuros y polvo
de la madera. Existen pruebas de anticuerpos IgE disponibles para varios de
estos alérgenos. Recientemente, se ha puesto una especial atención en las
gomas de látex como un alérgeno en el cuidado de la salud laboral y en cier-
tos pacientes, por ejemplo, pacientes con espina bifida que han sufrido diver-
sos procedimientos quirúrgicos. La prueba de anticuerpo IgE a la goma de
látex es útil para identificar individuos sensibles (Yunginger, 1994).
Para finalizar esta sección respecto a la prueba de anticuerpo IgE. es
apropiado resumir algunos de los puntos principales marcados anteriormen-
te. La determinación de anticuerpos IgE es útil y puede recomendarse en las
siguientes situaciones clínicas: 1) la evaluación de niños con un anteceden-
te lamiliar de enfermedad alérgica importante y signos clínicos de enferme-
dad precoces: 2) la evaluación de niños y adultos sospechosos de tener
enlermedad respiratoria alérgica para establecer el diagnóstico y definir la
especificidad de la sensibilidad alérgena a pólenes, polvo, antígenos fungi-
óos y alimentos: 3) para confirmar la expresión clínica de sensibilidad a ali-
mentos específicos en pacientes con sensibilidad anafiláctica o con asma y
angioedema: 4) para evaluar la sensibilidad a alérgenos de veneno de insec-
tos, particularmente como una ayuda en la definición de la especificidad de
veneno en aquellos casos donde las pruebas cutáneas sean confusas; 5)
para confirmar el diagnóstico de hipersensibilidad a la penicilina en pacien-
tes con sensibilidad anafiláctica; y 6) para confirmar la presencia de anti-
cuerpos IgE a ciertos alérgenos ocupacionales, por ejemplo, goma de látex.
La prueba de anticuerpos IgE no es útil como una prueba de detección sis-
temática para enfermedad alérgica, excepto si se realiza por un método ana-
lítico multialérgeno; y los resultados no son útiles para evaluar los efectos de
1025
Figura 46-6. Metabolitos de penicilina, determinantes antigénicos
mayor y menor. (De Rose NR, De Macano EC, Fahey JL. et al [eds¡:
ManualotClinical Laboratoy Inmunoiogy. 4' ed. Washington DC. Ame-
rican Society tor Microbiology, 1992, pág. 719. con autorización.)
la mmunoterapia o excluir el diagnóstico de sensibilidad anafiláctica a vene-
nos de insectos en pacientes tratados. Las pruebas para anticuerpos IgE
están indicadas sólo en pacientes a los que se les ha realizado una historia
médica y exploración (¡sica completa.
Pruebas para mediadores de reacciones
de hipersensibilidad inmediatas y para anticuerpos
IgG alérgeno-específicos
Previamente, se han mencionado varios mediadores de reacciones de
hipersensibilidad inmediata, incluyendo la histamina y los mediadores lípidos
llamados leucotrienos y factores activadores de plaquetas. Cada uno de
estos mediadores causan inflamación en enfermedades alérgicas humanas
o en modelos animales de alergia y analilaxia. Estos mediadores inducen
muchos de los efectos biológicos característicos de las reacciones alérgicas
A pesar de estos descubrimientos, las determinaciones de los mediadores en
líquidos corporales tienen una utilidad limitada clínicamente en el diagnósti-
co diferencial de enfermedades alérgicas. Las determinaciones de histamina
en plasma u orina pueden ser válidas en pacientes con analilaxia cuando las
pruebas se realizan inmediatamente después del episodio anafiláctico
(Friedman, 1989), pero se requiere tener cuidado para obtener una muestra
apropiada. La hemolisis puede provocar niveles de histamina falsamente ele-
vados en la sangre y los alimentos ricos en histamina o colonización bacte-
riana pueden conducir a niveles falsamente elevados en orina. Una prueba
muy útil en este entorno clínico es la determinación de triptasa en sangre
(Schwartz, 1987,1989). La triptasa es una proteasa de suero de 134 kDa for-
mada por cuatro subunidades unidas no covalenlemente y se encuentra en
mastocitos y granulocitos basófilos. La liberación de triptasa desde las célu-
las sensibilizadas provoca una relación cruzada de anticuerpos IgE citofili-
cos. Tras la anafilaxia, los niveles de triptasa en sangre aumentan rápida-
mente (30 minutos a 1 hora) y permanecen elevados durante 12 horas. Por
comparación, la histamina se aclara rápidamente de la sangre con una vida
media de minutos. Los leucotrienos y factores activadores de plaquetas se
activan localmenle y se encuentran en concentraciones mínimas en los líqui-
dos corporales (Lewis, 1984).
 1026 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Otra clase de mediadores de la inflamación de interés en la alergia son los
péptidos anafilatóxicos del complemento. C3a. C4a y C5a. producidos duran-
te activación de la cascada del complemento (véase Cap. 38). El papel de
estos péptidos como mediadores de la inflamación en la enfermedad alérgica
no está bien establecido. Las anafilatoxinas humanas probablemente no se
producen por interacción del alérgeno y anticuerpos IgE. Sin embargo, como
el C5a provoca la contracción del músculo liso y aumenta la permeabilidad
vascular, hay razones para una nueva investigación de las anafilatoxinas
complementarias como mediadores inflamatorios en síndromes de anafilaxia.
Los anticuerpos del isotipo IgE sensibilizan basófilos humanos y mastoci-
tos durante largos periodos de tiempo, al menos 24 horas, y estos anticuer-
pos median directamente la liberación de histamina inducida por antígeno.
como se comentó anteriormente. En diversas especies de animales, los anti-
cuerpos IgG de una o más subclases también se ligan a células efectoras y
originan la liberación de histamina. No está bien establecido el papel análogo
de los anticuerpos IgG humanos. Algunos datos experimentales sugieren que
los anticuerpos IgG humanos de la subclase lgG4 se ligan a leucocitos basó-
filos y pueden mediar en la liberación de histamina, y a menudo la concen-
tración de la proteina lgG4 en suero se encuentra por encima de lo normal en
adultos con asma (Homburger. 1986b). Sin embargo, los estudios clínicos no
han podido demostrar un papel de la determinación de la proteina lgG4 o anti-
cuerpos lgG4 en el diagnóstico o evaluación pronostica en pacientes con
asma.
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 CAPÍTULO 46 • ENFERMEDADES ALÉRGICAS
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 C A P Í T U L O 47

ai Diagnóstico y tratamiento del cáncer

mediante marcadores tumorales serológicos
James T. Wu, Ph.D.

NEOPLASIA Y REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO 1028 EFECTO DE LOS ANÁLISIS DISEÑADOS 1036
TIPIFICACIÓN DE MARCADORES TUMORALES 1030 Unión competitiva
Respecto a la proliferación celular Formato sandwich
Respecto a la diferenciación celular Anticuerpo monoclonal frente al policlonal
Respecto a las metástasis Anticuerpo heterófilo
Respecto a otros procesos asociados al tumor MARCADORES TUMORALES PARTICULARES 1037
Respecto a la transformación maligna a- fetoproteína
Mutaciones heredadas Moléculas de adhesión
Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales específicos Factores angiogénicos
APLICACIONES CLÍNICAS 1031 P -microglobulina
?

Examen colectivo CA19-9. CA50yCA19-5

Diagnóstico CA125
Monitorización del tratamiento CA15-3
Detección de recidiva CA 72-4
Pronóstico Calcitonina

RECOMENDACIONES EN LA PETICIÓN Antigeno carcinoembrionario

DE MARCADORES TUMORALES 1033 Oncoproteína c-erbB-2 (HER-2/neu)
Nunca se base en los resultados de una sola prueba Cromogranina A
Cuando se piden pruebas consecutivas, asegúrese de pedir CYFRA21-1
todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo
Ciclinas
equipo de análisis
Receptores de estrògeno y receptores de progesterona
Asegúrese de que el marcador tumoral seleccionado para
controlar la recidiva esté elevado en el paciente antes de la Gonadotropina coriónica humana
cirugía LASA-P
Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete Enolasa neuronal específica
el resultado de la prueba p53
Valore cómo se elimina o metaboliza el marcador tumoral Proteína pS2
desde la circulación sanguínea
Hormona paratiroidea relacionada con péptidos
Trate de pedir múltiples marcadores para mejorar la sensibilidad
Antígeno prostético específico
y especificidad del diagnóstico
PSA libre
Pida marcadores no específicos para ahorrar costes y para una
Carcinoma de células escamosas
mayor sensibilidad
Antígeno polipéptido tisular
Controle la posibilidad de efectos falseados
Controle la presencia de marcadores tumorales ectópicos BIBLIOGRAFÍA 1041

Existe un gran número de marcadores tumorales en la circulación sanguí-

nea. Como el nivel sanguíneo de marcadores tumorales por lo general refleja
el volumen de células tumorales y la actividad tumoral. la determinación de los
marcadores tumorales en suero se ha convertido en un medio atractivo para la
detección y el diagnóstico de enfermedades neoplásicas. incluso para el con-
trol de su evolución, especialmente durante el tratamiento La facilidad en la
extracción de sangre y la sensibilidad de estos análisis de marcadores tumo-
rales no invasivos también hace que las pruebas serológicas sean muy supe-
riores respecto a otras exploraciones clínicas basadas en métodos físicos.
NEOPLASIA Y REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO
Para aprender cómo identificar, seleccionar y utilizar marcadores tumorales
para el diagnóstico de cáncer y para el tratamiento de pacientes con cáncer,
es imprescindible que uno esté familiarizado con los fundamentos de los pro-
cesos neoplásicos (véase Cap. 64). Es importante tener en mente que hay
dos importantes procesos involucrados en el crecimiento celular, diferencia-
ción y proliferación. En células normales, ambos procesos se encuentran bien
 CAPÍTULO 47 • DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS
Figura 47-1. Ilustración de cómo la pérdida de regulación en cé'ulas canceríge-
nas genera diferentes marcadores tumorales y cómo estos procesos tienen que
ver con las dos importantes reacciones en el crecimiento celular.
regulados y bajo un estncto control. Cuando alguno de estos procesos pierde
su regulación, aumenta el riesgo para las células normales de convertirse en
células tumorales (Fig, 47-1). De hecho, cada vez que se produce un creci-
miento tisular nuevo, es importante diferenciar entre dos posibles causas del
nuevo crecimiento: hiperplasia o neoplasia. La mayor diferencia entre estos
dos procesos similares también se relaciona con el control del crecimiento La
hiperplasía tiene un propósito útil y está controlado por estímulos, mientras
que la neoplasia no está regulada y no sirve a ningún propósito. Por tanto, se
puede entender que la proliferación no regulada es una característica funda-
mental de todas las células neoplásicas, sin reparar en si el tumor es benig-
no o maligno. El resultado de la proliferación incontrolada nos llevará a la for-
mación de una masa anormal de tejido, conocido como tumor. Seguidamente,
el tumor continuará creciendo de forma irregular incluso después de retirar el
Figura 47-2. Ilustración de cómo células normales, después de múltiples muta-
ciones, se convierten en células malignas. Los marcadores tumorales tienen dile-
rente capacidad de pronóstico para las células tumorales y diferentes estados de
desarrollo.
1029
Tumor -l marcadores inmorales
Figura 47-3. Ilustración de cómo los tumores están compuestos de células hete-
rogéneas. Cada tipo de célula puede producir un marcador tumoral diferente. Los
tumores de diferentes tejidos también son diferentes en cuanto a su composición
celular pero pueden compartir células similares. Las bañas de la derecha enseñan
la importancia del tratamiento de los múltiples marcadores tumorales para conse-
guir una sensibilidad del 100%. También indica que un patrón especifico de múlti-
ples marcadores puede estar asociado con un tipo especial de tumor.
estimulo que provoca el cambio. Los tumores benignos se quedarán en esta
primera fase y presentarán menos riesgo para el huésped. Los tumores
benignos también tienen más posibilidades de curarse mediante una extirpa-
ción completa. No obstante, la inestabilidad genética asociada a las células
tumorales las hace más susceptibles a mutaciones adicionales, que pueden
llevar eventualmente a una enfermedad maligna (Fig. 47-2). Los tumores
malignos habitualmente se asocian a diagnósticos erróneos y poca supervi-
vencia debido a su capacidad y tendencia para extenderse y metastatizar por
vía linfática y sanguínea.
En general, todos los tumores benignos se encuentran bien diferenciados.
Las neoplasias malignas, por otro lado, varían desde bien diferenciadas
hasta indiferenciadas. Aparentemente, el control de la proliferación y diferen-
ciación se pierde en los tumores malignos. Algunos de los tumores malignos
parecen tener la escasa diferenciación fetal y producir sustancias similares a
aquellas encontradas en tejidos fetales, las comúnmente conocidas como
proteínas carcinoembriogénicas (Figs. 47-1 y 47-2). Las células malignas
también pueden producir enzimas proteolíticas que facilitan su escape de su
entorno inicial.
El cáncer en el ser humano habitualmente se desarrolla a partir de clones
mulantes de células como resultado de transformaciones neoplásicas. La
mayoría de los cánceres tienen origen monoclonal, pero se requieren múlti-
ples mutaciones para producir células malignas. Las múltiples mutaciones
que suceden en los tumores pueden provocar el desarrollo de la heteroge-
neidad celular del tumor. Es interesante observar que los tumores no eslan
compuestos de células homogéneas; normalmente están constituidos por
subpoblaciones celulares con fenotipos claramente diferentes (Schnipper,
1986). El proceso de evolución y progresión tumoral puede también generar
diversidad biológica dentro y en los diferentes focos melastásicos. Una célu-
la obtenida de un determinado tumor puede ser distinta por varios factores:
 1030 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tasa de crecimiento, receptores superficiales celulares, inmunogenicidad.
expresión de marcadores tumorales (Fig. 47-3). capacidad de invasión y
metástasis, y respuesta a drogas citotóxicas (Fidler, 1982).
TIPIFICACIÓN DE MARCADORES TUMORALES
A pesar de que el cáncer se origina por una transformación maligna de una
célula normal, hay pocas diferencias en cuanto a la expresión fenotípica entre
una célula cancerígena y una célula normal. Las mutaciones inducidas por el
cáncer no parecen alterar ninguna de las expresiones genéticas o lenolípicas
excepto en las regulaciones del crecimiento celular. En consecuencia, en los
últimos años los esfuerzos para identificar un marcador tumoral especifico o
un epítopo tumoral específico no han tenido éxito. Por otro lado, cualquier
producto celular como enzimas, proteínas séricas, metabolitos, receptores,
proteínas carcinoembríonarias, oncoproteínas y proteínas codificadas por
genes supresores puede utilizarse como marcador tumoral siempre que tenga
relación con algún proceso durante la formación o el crecimiento tumoral. así
como en la transformación maligna, proliferación, diferenciación y metástasis.
La evaluación clínica de algún marcador tumoral determinado dependerá de
la intención de su utilidad clínica y de la especificidad y sensibilidad del mar-
cador tumoral. El uso de marcadores tumorales como factores pronósticos o
factores de riesgo también ha ganado más y más popularidad en estos últi-
mos años. La determinación de los factores de riesgo es muy valiosa en la
valoración de la agresividad de un tumor y útil en la selección de las estrate-
gias de tratamiento (Fig. 47-4).
Respecto a la proliferación celular
Muchas hormonas ¡gonadotropina coriónica humana (hCG)). proteínas
séricas, enzimas (lactato deshidrogenasa [LD], fosfatasa alcalina [АР]) y sus
metabolitos (ácido vanilmandélico [VMA], acido homovanílico [HVA], ácido 5-
hidroxiindolacético [5-HIAA]) pueden llegar a estar elevadas en los tumores
debido a la alia velocidad de proliferación de las células tumorales. Sus con-
centraciones en suero aumentan incluso a concentraciones mayores cuando
un tumor benigno se convierte en maligno y metastatiza. Como las enferme-
dades benignas y no malignas también pueden tener niveles de marcadores
altos, no es conveniente el uso de estos marcadores para la detección siste-
mática ni para el diagnóstico de cáncer debido al gran número de falsos posi-
tivos. Estos marcadores se utilizan para monitorizar a los pacientes durante el
tratamiento.
Cáncer de inania
Figura 47-4. Ilustración de cómo la afectación ganglionar determina el riesgo de
las pacientes con cáncer de mama y del propio tratamiento. Actualmente se utili-
za un panel con varios nuevos marcadores pronósticos determinados en el cito-
plasma del tumor junto con la determinación de ganglios para proporcionar una
valoración más correcta de los riesgos para las pacientes con cáncer de mama.
Respecto a la diferenciación celular
Las proteínas carcinoembnonanas encontradas en ambos tejidos, letal y
tumoral, pero no en el tejido adulto normal, normalmente carecen de alguna
función fisiológica conocida y presentan niveles de concentraciones en san-
gre de milímetros por nanogramo (Figs. 47-1 y 47-2) Por tanto, las determi-
naciones de las proteínas carcinoembríonarias en sangre se deben realizar
mediante inmunoanálisis. La especificidad y sensibilidad asociadas a estas
proteínas, aunque no son del 100°», si son mucho mayores que otras enzi-
mas y metabolitos utilizados como marcadores tumorales en el pasado. La
concentración serológica de estas proteínas carcinoembríonarias no sólo se
correlaciona bien con la actividad tumoral sino que también se utiliza para pre-
decir el pronóstico. En general, las proteínas carcinoembríonarias no son con-
venientes en el examen colectivo: primero, los anticuerpos policlonales con-
tra estas proteínas a menudo tienen reacciones cruzadas con otras proteínas
normales, y segundo estas proteínas carcínoembrionarias no aparecen lo
suficientemente pronto en la sangre de pacientes con cáncer. Sin embargo,
se han utilizado como pruebas complementarias de diagnostico de cáncer y
son extremadamente útiles para controlar el éxito del tratamiento y para
detectar recidivas.
Respecto a las metástasis
Las metástasis tumorales tienen varios pasos importantes (Liotta, 1987).
Primero, las células tumorales tienen que penetrar en zonas cercanas, des-
pués invadirán el torrente sanguíneo o los vasos linfáticos. Entonces, las célu-
las tumorales viajan a zonas distantes, hasta que se alojan en lechos veno-
sos o capilares de órganos distantes. En este nuevo entorno, estas células
tumorales han de penetrar de nuevo por las paredes vasculares para crecer
en este nuevo lugar. Todos los productos celulares liberados y sintetizados
durante estos pasos son posibles factores de nesgo. Su aparición en el tejido
tumoral o en la circulación sanguínea indica el riesgo o la aparición de metás-
tasis o un pobre pronóstico. Las determinaciones de muchos de estos mar-
cadores, sin embargo, están aún limitadas a tejidos tumorales o citosoles de
tejidos tumorales.
Respecto a otros procesos asociados al tumor
Aparentemente, las actividades enzimáticas de varias glucosiltransferasas
órgano-específicas están alteradas en células tumorales. Algunas de las glu-
cosiltransferasas elevadas se han utilizado como marcador tumoral. La
secuencia del azúcar y la composición de parte del hidrato de carbono de
muchas glucoproteínas séricas, incluidas sustancias del grupo sanguíneo y
mucinas como CA 19-9. son marcadores tumorales resultantes de la altera-
ción de la glucosiltransferasa. La AFP (alfa-fetoproteína) aislada en pacientes
con hepaloma primario tiene una fucosa adicional comparada con la AFP de
enfermedades benignas hepáticas, un ejemplo de la fucosiltransferasa altera-
da en células del hepatoma (Wu. 1990).
Respecto a la transformación maligna
Los oncogenes, que codifican proteínas que funcionan en todos los niveles
de regulación del crecimiento, juegan un importante papel en la transforma-
ción celular (Druker. 1989). Estas oncoproteínas son similares a los produc-
tos normales de los protooncogenes excepto en que han perdido la tuerza
reguladora de su actividad y no necesitan señales de activación externas para
originar una proliferación celular. La determinación de la expresión tisular de
estas oncoproteínas se ha utilizado para el pronóstico. Una de las oncoproteí-
nas más extensamente estudiadas, llamada, proteina c-erbB-2 (p185), se ha
detectado en el suero por inmunoanálisis. Una investigación posterior descu-
brió que el dominio extracelular del c-eroB-2 podría fraccionarse y liberarse a
la circulación sanguínea. El dominio extracelular del p185 parece que se rela-
ciona no sólo con la cantidad de p185 expresado en la membrana de la célu-
la tumoral, sino también con el cambio de la concentración de muchos impor-
tantes marcadores tumorales séricos (Wu. 1995). Como la transformación
maligna es un acontecimiento especifico en la carcinogénesis. cualquier pro-
ducto celular asociado a este evento tiene la posibilidad de ser un marcador
tumoral específico más. Es posible que otros receptores transmembrana reía-
 CAPÍTULO 47 • DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS
Figura 47-5. Ilustración de cómo se detinen e identifican los epítopos situados en
la superficie de una gran molécula del marcador lumoral mediante anticuerpos
monoctonales. Las diferentes moléculas pueden compartir los mismos epítopos.
pero la composición global o el modelo de múltiples epítopos en distintas molécu-
las particulares pueden diferir entre ellas.
cionados con la transformación celular puedan comportarse similarmente y
ser útiles como marcadores tumorales o indicadores de pronóstico. Se nece-
sitan amplios estudios detallados sobre el c-erbB-2 y otras proteínas codifica-
das por oncogenes para evaluar completamente el potencial de las oncopro-
teínas en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con cáncer.
Mutaciones heredadas
Aparte de los oncogenes, pero igualmente importantes, está un grupo de
genes supresores que han sido descubiertos incluso más recientemente. Las
proteínas codificadas por genes supresores son responsables de la supresión
del crecimiento celular. Estos genes supresores pueden sufrir supresiones o
mutaciones resultando en la producción de productos del gen inactivos, que
fueron encontrados en familias con alto riesgo de cáncer. Se han identificado
los distintos genes supresores y las proteínas que codifican. Por ejemplo, la
p53 se ha investigado considerablemente por su papel en distintos cánceres.
Los genes supresores y sus productos son potencialmente útiles como mar-
cadores tumorales para el examen colectivo e identificación de familias o indi-
viduos de alto riesgo.
El descubrimiento de dos genes susceptibles (o genes supresores tumora-
les) para el cáncer de mama, llamados BRCA1 y BRCA2. ha generado recien-
temente un tremendo interés (Miki, 1994; Wooster. 1994). Los estudios
(Easton. 1993) sugieren que las mutaciones en el BRCA1 son responsables
de aproximadamente la mitad de todos los casos de cáncer de mama heredi-
tario. Además, los portadores de las mutaciones del BRCA 1 también provo-
can un incremento del riesgo de cáncer de ovario, colon y próstata (Futreal,
1994). El BRCA2, segundo gen susceptible para el cáncer de mama, se cree
que se encuentra en casi el 70% de casos de cáncer de mama hereditario que
no se debe a mutaciones del BRCA1 y está relacionado con un aumento de
nesgo en el cáncer de mama en hombres. El desarrollo de inmunoanalisis
para la determinación de las proteínas que codifican BRCA1 y BRCA2 está
en proceso y debería servir para la identificación de individuos de alto riesgo
y sus familias.
Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales
específicos
El desarrollo de la tecnología del hibridoma ha tenido mucho impacto en la
identificación de marcadores tumorales. Antes de conocer una molécula com-
pleta de una estructura proteínica conocida, actualmente es posible centrarse
en una pequeña área de superficie, un epitopo o determinante antigénico
mediante anticuerpos monoclonales (Fig. 47-5). Ya no se necesita purificar el
antigeno para la preparación de anticuerpos policlonales en animales.
1031
Tampoco se necesita la caracterización e identificación completa de la molé-
cula que lleva el epitopo. Un hibridoma se puede preparar inyectando a un
ratón una fracción enriquecida de la membrana de la célula tumoral o incluso
toda la célula tumoral. Los hibridomas que producen los anticuerpos mono-
clonales de interés se seleccionan para el procedimiento posterior de detec-
ción sistemática. Una vez concretado el hibridoma, se obtendrá un número ili-
mitado y consistente de anticuerpos monoclonales para diferentes utilidades.
La especificidad tanto de los anticuerpos como del inmunoanalisis esta bien
definida y es reproducible. Muchos de los problemas relacionados con los
análisis que utilizan anticuerpos policlonales. como la reducción de una gran
parte de la variación del anticuerpo e inconsistencias del análisis, desapare-
cerán o se reducirán sobremanera.
También han fracasado las tentativas para identificar epítopos específicos
tumorales usando anticuerpos monoclonales. Como sucede con los marca-
dores tumorales identificados por anticuerpos policlonales, sólo hay epítopos
asociados al tumor (Fig. 47-5). No obstante, se ha demostrado que las prue-
bas para definir los marcadores tumorales para un tumor definido tienen una
sensibilidad y especificidad más alta que otros que utilizan anticuerpos poli-
clonales. Por ejemplo. CA 19-9. CA 125 y CA 15-3 son mucho más sensibles
y especificas que el antígeno carcinoembrionario (CEA) en el carcinoma pan-
creático, ovarico y de mama, respectivamente. Estos marcadores (Tabla 47-
1) están recomendados para reemplazar la prueba del CEA policlonal en el
diagnóstico y tratamiento de pacientes con los carcinomas previamente men-
cionados. Muchos epítopos asociados al tumor comparten con varios marca-
dores tumorales derivados de diferentes tumores. Por eiemplo. CA 19-9, CA
15-3. y CA 125 se expresan en casi todos los carcinomas de distintos grados.
Además de la participación de unos epítopos determinados en más de un car-
cinoma, también es posible que una sola molécula exprese más de un epito-
po (Yu, 1991); por ejemplo, como sucede cuando CA 15-3 y CA 125 son
expresados por la misma molécula de mucina en el suero.
APLICACIONES CLÍNICAS
Es esencial que se entienda el significado de las pruebas de sensibilidad y
de especificidad de los marcadores tumorales antes de hablar sobre las aplica-
ciones de los marcadores tumorales (von Kleist, 1988; Sell, 1990). De hecho, la
utilidad clínica de un marcador tumoral depende casi totalmente de la especi-
ficidad y la sensibilidad del marcador tumoral. Cuando el análisis de un mar-
cador tumoral se dice que tiene una sensibilidad del 100%. significa que el
análisis puede detectar a todos los pacientes con ese tipo concreto de cán-
cer, mientras que un análisis con una especificidad del 100% significa que el
análisis identificará solamente a los pacientes con ese tipo especifico de
tumor y no aquellos con enfermedad benigna o no maligna. En consecuencia,
la sensibilidad es una medida de los verdaderos positivos y se calcula con la
siguiente fórmula;
% Verdaderos positivos
Sensibilidad =
(% Verdaderos positivos + % Falsos negativos)
Por otro lado, la especificidad es una medida de los falsos positivos y se
calcula con la siguiente fórmula;
% Verdaderos negativos
Especificidad =
(% Verdaderos negativos + % Falsos positivos)
Tabla 47-1 Determinación de m a r c a d o r e s tumorales mediante
anticuerpos m o n o c l o n a l e s
M a r c a d o r tumoral E n f e r m e d a d maligna importante
CA 125 Carcinoma ovárico
CA 19-9 Carcinoma pancreatico
CA 15-3 Carcinoma de mama
CA 72-4 Carcinoma gástrico
 1032 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Teniendo en cuenta esta información, se puede comenzar a hablar de las
siguientes aplicaciones clínicas de los marcadores lumorales.
Examen colectivo
El primer intento por parte de Gold (1965) en detectar el carcinoma colorrec-
tal en hombres mediante radioinmunoanálisis (RÍA) de CEA en suero llevó al
autor a la comprensión de que ninguno de los marcadores tumorales descu-
biertos tenía la especilicidad y la sensibilidad para el examen colectivo. En la
actualidad no se recomienda el examen colectivo, especialmente en una
población asintomática. Además de la carencia deseada de especificidad y
sensibilidad de los marcadores tumorales, la baja prevalencia del cáncer y la
baja sensibilidad y especificidad de los marcadores tumorales en general tam-
bién se opone al examen colectivo de los cánceres. Se temia que la natura-
leza no específica de la mayoria de los marcadores tumorales examinados
pudiera crear demasiados falsos positivos y causar de forma innecesaria una
alarma o preocupación en la población general. Por otro lado, hay excepcio-
nes donde el examen colectivo del cáncer está comprobado usando marca-
dores tumorales. El examen colectivo del hepatoma primario en China
mediante el tratamiento de la AFP en suero es un buen ejemplo de estas
excepciones debido a la alta incidencia de cáncer hepático en esta área del
mundo (Wu, 1987). La posibilidad del examen colectivo de cáncer de ova-
rio en mujeres con la determinación en suero del CA 125 sigue en proceso
de investigación. El diagnóstico de cáncer oválico depende en principio de
la cirugía. Sin embargo, en la mayoria de los casos, en el momento de la
detección del tumor, éste se encontrará en estadio avanzado, donde la posi-
bilidad de curación es baja.
La recomendación de la identificación sistemática de cáncer de próstata
mediante la determinación del antigeno especifico prostático (PSA) en suero
junto con el tacto rectal digital (DRE) se debe a la especificidad del tejido para
el PSA (Wu. 1994) y a la alta prevalencia del cáncer de próstata en hombres
a partir de los 50 años de edad. Está especialmente recomendado en hom-
bres afroamericanos, debido a que el porcentaje de incidencia para este
grupo es casi el doble que para la población general, y el porcentaje de mor-
talidad es Ires veces superior. El examen colectivo permite el tratamiento con-
finado al órgano, potencialmente curable del cáncer de próstata descubierto
en hombres con una esperanza de vida superior a 10 años. La combinación
de la prueba del PSA y del DRE proporciona el mínimo coste considerado
para la detección precoz del cáncer de próstata (Littrup, 1993).
Diagnóstico
Los problemas tanto de la especificidad como de la sensibilidad asociados
a la mayoría de los marcadores tumorales excluyen su determinación en el
diagnóstico del cáncer. La frecuencia de detección de niveles elevados de
marcadores tumorales en enfermedades no malignas y la coexistencia obser-
vada entre las concentraciones normales y las concentraciones de marcado-
res tumorales en pacientes con cáncer se oponen a su uso en el diagnóstico.
La mayoría de los marcadores tumorales usados en la actualidad no pueden
distinguir las enfermedades malignas de las benignas. Los marcadores tumo-
rales, no obstante, siguen utilizándose con éxito como prueba complementa-
ria para la detección del cáncer.
Se han propuesto recientemente varios abordajes para mejorar la espe-
cificidad diagnóstica de muchos marcadores lumorales. El uso de múltiples
marcadores es un abordaje que ha tenido gran aceptación. Los patrones
específicos de múltiples marcadores tumorales parecen estar relacionados
con determinadas enfermedades malignas. Los principales inconvenientes
para el uso de múltiples marcadores tumorales son el coste y los rigores de
la propia selección de los marcadores tumorales para incluirlos en el panel.
Otro abordaje para mejorar tanto la especificidad como la sensibilidad de
un marcador tumoral. como en el caso de la prueba de PSA en suero, impli-
ca la medida de la velocidad (porcentaje de aumento en la concentración
de PSA en el tiempo) y la densidad (p. ej.. dividiendo la concentración de
PSA en suero entre el volumen de la glándula prostética, determinado por
ecogralía transrectal) (Benson, 1992). Un ligero aumento del nivel de PSA
en suero asociado con una glándula prostética pequeña puede indicar cán-
cer, mientras que la misma valoración en un paciente con una glándula
grande puede indicar sólo una hiperplasia prostética benigna (HPB).
Monitorización del tratamiento
Una de las dos aplicaciones más útiles de los marcadores tumorales impli-
ca el control del curso de la enfermedad, especialmente durante el tratamien-
to. En la Figura 47-6 se muestra el cambio en los niveles en suero de diver-
sos marcadores tumorales durante el curso de un cáncer ovárico en una
paciente. El nivel en suero de los marcadores tumorales refleja bien el éxito
de la cirugía o la eficacia de la quimioterapia. Cuando se detectan niveles ele-
vados de un marcador tumoral después de la cirugía, esto puede indicar una
extirpación incompleta del tumor recidiva, o la presencia de metástasis. La
determinación de los marcadores tumorales en suero durante la quimiotera-
pia también aporta una indicación de la elicacia del citostálico utilizado y una
guía para la selección de los medicamentos más efectivos para cada caso en
particular.
Detección de recidiva
La segunda aplicación más útil de los marcadores tumorales es controlar-
los para la detección de recidiva después de la extirpación quirúrgica del
tumor. Se sabe que la aparición de la mayoria de los marcadores tumorales
circulantes tiene un "tiempo de adelanto" de vanos meses (de tres a seis
meses) antes de cualquier procedimiento físico utilizado en la detección del
cáncer. La facilidad de su detección en sangre y la sensibilidad de los marca-
dores tumorales hacen que este proceso de control no invasivo sea aceptado
de forma generalizada en la actualidad. La especificidad de los marcadores
tumorales no presenta un problema para esta aplicación.
Pronóstico
La estimación de la agresividad tumoral y el pronóstico para la evolu-
ción del paciente con cáncer han ganado creciente popularidad en estos
últimos años. El conocimiento de la agresividad lumoral también ayuda al
desarrollo de una terapia apropiada para el paciente. Por ejemplo, la
detección de marcadores tumorales. altamente asociada con malignidad y
metástasis, apuntará un tratamiento más riguroso y sistémico. La mayoría
de los marcadores tumorales se elevan cada vez más cuando el tumor
metastatiza. Desdichadamente, muy pocos marcadores tumorales tienen
un límite bien definido entre estadios benignos y malignos. Los (actores de
riesgo asociados al proceso de metástasis tumoral, como proteasas y
moléculas de adhesión, son habitualmente mejores marcadores para pre-
decir el pronóstico. Sin embargo, la mayoria de estos marcadores aún se
determinan en tejidos tumorales y citoplasmas. El hallazgo del dominio
extracelular de la proteína c-eroB-2 en el suero y la correlación entre el
dominio extracelular del suero con los niveles de otros marcadores tumo-
Día
Figura 47-6. Ilustración del cambio de los niveles en suero de CA 125 en el trans-
curso de la enfermedad en una paciente con cáncer ovárico. También se acentúa
el hecho de que múltiples marcadores pueden aumentar o descender conjunta-
mente. Los niveles de los marcadores tumorales se normalizan dividiéndolos por
sus cotas superiores normales.
 CAPÍTULO 47 • DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
rales en suero es alentadora. Se espera que en un futuro cercano sea
posible la determinación en la circulación sanguínea de estos factores de
riesgo para el pronóstico.
RECOMENDACIONES EN LA PETICIÓN DE
MARCADORES TUMORALES
Cuando se solicitan marcadores tumorales como prueba diagnóstica com-
plementaria y para el tratamiento de los pacientes con cáncer, se deben con-
siderar las siguientes recomendaciones para evitar equivocaciones en los
resultados de las pruebas.
Nunca se base en los resultados de una sola prueba
Debido a que la mayoría de los marcadores tumorales no son específicos,
es difícil diferenciar entre enfermedades malignas y otras enfermedades
benignas o no malignas basándose en los resultados una sola prueba. La
mayoría de las elevaciones encontradas en las enfermedades no malignas
son frecuentemente transitorias, mientras que en el cáncer los niveles se
mantienen elevados o aumentan continuamente. La petición de pruebas con-
secutivas puede ayudar a detectar falsos niveles de elevación debidos a ele-
vaciones transitorias. El mejor ejemplo es la AFP en suero. La AFP elevada
en suero puede detectarse en pacientes con hepatoma primario o con enfer-
medades hepáticas. Sin embargo, en una segunda prueba dos semanas más
tarde la AFP en suero permanecerá elevada en pacientes con cáncer, mien-
tras que en pacientes con enfermedades hepáticas la AFP en suero volverá a
un nivel normal.
Cuando se piden pruebas consecutivas, asegúrese
de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio
utilizando el mismo equipo de análisis
Cada equipo comercial distinto puede generar diferentes resultados aun-
que todos estén diseñados para el mismo marcador tumoral. Cuando se
piden desde el mismo laboratorio también se garantiza una mayor seguri-
dad en la ejecución. Es importante asegurarse de que algunos cambios
observados durante el proceso controlado se deben al cambio del volumen
tumoral o a otras actividades tumorales y no a la variabilidad de laboratorio
(Fig. 47-6).
Asegúrese de que el marcador tumoral seleccionado
para controlar la recidiva esté elevado en el paciente
antes de la cirugía
Como ninguno de los marcadores tumorales tiene una sensibilidad del
100% en la detección de un determinado cáncer, para estar seguro es impor-
tante que el marcador tumoral concreto para detectar la recidiva esté elevado
antes de la cirugía. De lo contrario, se deberían detectar múltiples marcado-
res antes de la cirugía para seleccionar el marcador tumoral más elevado que
pueda controlar la actividad de la enfermedad.
Valore la vida media del marcador tumoral cuando se
interprete el resultado de la prueba
Estime el tiempo requerido para que el nivel determinado antes de la ciru-
gía disminuya al nivel normal o. en el caso del PSA, a un nivel indetectable
basándose en el conocimiento de la vida media de los marcadores tumora-
les. Es importante que la determinación de las concentraciones de marca-
dores tumorales para determinar el éxito de la extirpación quirúrgica de ese
determinado tumor no se realice antes de las dos semanas del postopera-
torio. Sería preferible esperar todo un mes debido al tiempo necesario para
que los niveles de marcadores tumorales preexistentes en suero descien-
dan a niveles más bajos. Por ejemplo, la vida media del PSA en suero es de
aproximadamente tres a cuatro días; por tanto, 50 ng/'ml de PSA en suero
1033
tardarán 30 días para disminuir a un rango no detectable después de un
éxito quirúrgico.
Valore cómo se elimina o metaboliza el marcador
tumoral desde la circulación sanguínea
A menudo se detectan marcadores tumorales elevados en suero en pacien-
tes con enfermedad renal o hepática, dependiendo de si el marcador tumoral
se elimina por filtración glomerular o se metaboliza por el hígado. Por ejem-
plo, el CEA en suero a menudo se eleva en pacientes con enfermedades
hepáticas porque el hígado dañado es incapaz de eliminarlo eficazmente de
la circulación sanguínea, mientras que una |J-microglobulina (|i2M) elevada
2
a menudo se detecta en pacientes con fracaso renal, donde hasta la peque-
ña molécula (Í2M tiene dificultad para atravesar la membrana glomerular de
una manera normal.
Trate de pedir múltiples marcadores para mejorar la
sensibilidad y especificidad del diagnóstico
Como se ilustra en la Figura 47-3, los tumores están formados por células
heterogéneas. Algunas pueden incluso ser células normales y otras pueden
ser células tumorales heterogéneas como resultado de una secuencia dife-
rente de múltiples mutaciones. Cada tipo de célula puede expresar un único
marcador o un numero de marcadores tumorales característico. El mismo
marcador puede también ser producido por diferentes tipos de células.
Puede que algunas células nunca produzcan un solo marcador. Como se
ilustra en la Figura 47-3, los distintos tumores que derivan del mismo tipo de
tumor aparentemente pueden incluso ser heterogéneos en su composición
celular. Igualmente, se necesita más de un marcador tumoral para propor-
cionar una sensibilidad en la detección del 100%. La heterogeneidad en la
composición celular y el porcentaje de la distribución celular de cada tumor
explican por qué se necesita un número de marcadores tumorales para
alcanzar el 100% de sensibilidad de detección y por qué la sensibilidad de
un marcador en particular también es diferente entre pacientes con cáncer.
En la Tabla 47-2 se detallan múltiples marcadores tumorales relacionados
con enfermedades malignas particulares: la aparición de marcadores tumo-
rales característicos en varias neoplasias se detalla en la Tabla 47-3. Esto
explica por qué ninguno de los marcadores tumorales utilizados actualmen-
te tiene una especificidad y sensibilidad del 100%. y por qué el uso de múl-
tiples marcadores mejorará la sensibilidad de detección. Sin embargo, un
único patrón de múltiples marcadores puede identificarse en tumores deriva-
dos de los mismos tejidos. Por tanto, al pedir múltiples marcadores tumora-
les también se mejorará la especificidad. Por ejemplo, un patrón específico
puede estar asociado a carcinomas de colon, de mama, de ovario y de pán-
creas cuando los cuatro marcadores tumorales determinados por anticuer-
pos monoclonales, como CEA. CA 19-9, CA 15-3 y CA 125, se miden simul-
táneamente. Esta información es clínicamente importante, ya que más del
60% de los cánceres que se tratan son carcinomas derivados del epitelio
celular (Wu, 1989). Se desarrollaron múltiples marcadores para una estrate-
gia de detección precoz mas especifica para el cáncer ovárico. Se vio que el
uso de CA 15-3 y TAG72 junto con CA 125 puede aumentar la especificidad
aparente de los análisis de CA 125 para distinguir enfermedades malignas
de benignas (Bast, 1991). Se debería tener en cuenta que durante la selec-
ción de los múltiples marcadores tumorales, sólo se deberían de seleccionar
los marcadores que son complementarios unos con otros. Aquellos numero-
sos marcadores tumorales que van paralelos a la actividad tumoral no debe-
rían seleccionarse para este propósito.
Pida marcadores no específicos para ahorrar costes
y para una mayor sensibilidad
Si el único objetivo es controlar la eficacia del tratamiento, debería consi-
derarse el uso de marcadores tumorales no específicos (Tabla 47-4). Aunque
estos marcadores no específicos carecen de especificidad para el diagnósti-
co y, en lo que respecta a algunos tipos específicos de tumores, sus concen-
traciones son sin duda muy sensibles a algunos cambios en la actividad tumo-
1034 SECCIÓN V INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

Tabla 47-2 Marcadores tumorales s e r o l ó g i c o s relacionados con enfermedades malignas particulares

Enfermedades malignas Marcador importante Otros marcadores

Tumores pituitarios acromegálicos Hormona del crecimiento IGF-I

Tumores pituitarios suprarrenales Cortisol Catecolaminas libres, DEA, 17-cetoesteroides, prolactina
Leucemia de lintocitos B crónica TdT B2M en suero. LASA-P
Linlocitos B malignos B2M LD
Cáncer de vejiga Antígeno-T, inhibidor de urocinasa, CEA, TPA.
citoqueratinas, glucosammoglucosas
Cáncer de hueso Foslatasa alcalina Protema de Bence Jones, hidroxiprolma. calcio en suero
Tumor cerebral Desmesterol Poliaminas
Cáncer de mama CA 15-3 CEA, calcitonina. CA 549, CA M26. CK-BB. termina,
B-hCG. LASA-P, prolactina, proteína P 21, PS-2
Carcinoma broncogénico Prolactina
Tumores carcinoides Histamina, ADH, bradicmina
Cáncer cervical SCC Anticuerpos AG-4. CA 125, CEA, TPA
Conocarcinoma hCG
Cáncer colorrectal CEA CA 19-5, CA 19-9, CA 72-4, CK-BB, NSE
Leucemia mieloide crónica TdT
Síndrome de Cushing ACTH Endorfina. lípotropina
Tumores pancreáticos endocrinos Polipéptido pancreático
Carcinoma gástrico CA 72-4 CA 19-9, CA 50, CEA, ferritina, CK-BB. hCG. LASA-P,
pepsinógeno II, prolrombina
Gastrinoma Gastnna
Glucagonoma Glucagón
Leucemia de células peludas Receptor IL-2
Tumores de cabeza y cuello SCC
Carcinoma hepatocelular AFP CEA, ferritina, rGT, ALP. TPA, y-glutamiltranspeptidasa
Hipercalcemia maligna Péplido relacionado con PTH
Enfermedad de Hodgkin LASA-P. ferritina
Insulinoma Insulina
Cáncer de duodeno ADH Péptido-C, proteina I aglutinante IGF-I
Tumores renales CEA
Leucemia TdT NSE
ALP, ß2M, ferritina, LDH. protema mielina básica.
Cáncer de pulmón NSE adenosine deaminasa, PNP
ACTH, CK-BB, calcitonina. CA 72-4. CEA, AFP, lerritina.
Lmfoma B2M LASA-P. TPA
Cáncer medular de tiroides Calcitonina TdT. Ki-67, LASA-P
Antigeno de melanoma LASA-P relacionado con melanoma, i-dopa NSE
Microadenomas (pituitaria) Prolactina NSE, catecolaminas plasmáticas
Mieloma múlliple Inmunoglobulina densa de cadena ligera y densa Proteína de Bence Jones. ß2M. IgA
Mesotelioma Ácido hialurónico
Microadenomas Prolactina
Neoplasias endocrinas múltiples Cromogranma A
Tumor testicular no seminomatoso AFP hCG
Neuroblastoma VMA HVA. NSE. cistationina, ferritina, metanefrinas
Tumores no-islotes Insulina como factor de crecimiento
Cáncer microcítico ACTH, ADH, CEA, CK-BB, NSE, bombesina, calcitonina
Osteosarcomas ALP
Carcinoma ovárico CA 125 UGF, inhibina. AFP, isoenzima amilasa, CEA. CK-BB.
hCG, galactosiltransferasas, LDH. TPA
Carcinoma pancreático CA 19-9 CA 19-5. CA 50. CA 72-4, CEA, CK-BB, ADH. ALP.
ferritina. isoenzima II galactosiltransferasa.
Y-glutamiltranspeptidasa, PAP
Tumores de islotes pancreáticos Insulina
Cáncer tiroideo papilar y folicular Tiroglobulina
Tumores paratiroideos PTH íntegro
Feocromocitoma Metanetnna Cromogranma A, catecolaminas plasmáticas
Tumores pituitarios othCG libre FSH, LH, prolactina, TSH
Tumores placentarios hCG a-hCG libre
Leucemia de células plasmáticas TdT
Carcinoma prostálico PSA PAR ALP, CEA, CK-BB, TPA
Carcinoma de células renales Renina, eritropoyetina, interleucina-4, prostaglandina A.
CA 15-3, hormona paratiroidea, NSE, prolactma
Sarcoma B2M
Seminoma NSE
Tumores de bazo Ferritina
Cáncer de células escamosas
Cérvix SCC
Pulmón SCC CYFRA 21-1
Cabeza y cuello SCC Ferritina
Cáncer de estómago CA 72-4 CEA, NSE
Teratoblastoma AFP hCG. ferritina
Cáncer testicular hCG
no seminomatoso AFP ß-hCG, LDH
Cáncer uterino SCC
Vipoma (páncreas) VIP

La labia continúa en la siguiente página

 CAPÍTULO 47 DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS 1035

Tabla 47-2 M a r c a d o r e s tumorales serológicos relacionados c o n e n f e r m e d a d e s m a l i g n a s particulares (continuación)

E n f e r m e d a d e s malignas M a r c a d o r importante Otros marcadores

Enfermedad de Waldenstrom Inmunoglobulinas IgM 2M

Síndrome de Zollinger-Ellison Gastrina
ACTH = hormona adenocorticolropa: ADH = hormona antidiurética; AFP • -letoproteina; ALP = tosfatasa alcalina; AMF = tactor de motilidad autocrino; 2M = beta -
microglobulina; HPB = hiperplasia prostática benigna; CEA = antlgeno carcinoembrionario; CK-BB = isoenzima BB creatina cinasa; DEA = dehidroepiandrosterona.
FDP = productos de degradación de fibrina; FSH = hormona lollculo-estimulanle: Gl = gastrointestinal; GT = gamma-glutamil Iransferasa; hCG = gonadolropina orlo-
nica humana. HVA = ácido homovanilico; IGF-I = factor de crecimiento insulinico I: IL-2 = interleucina; LASA-P = ácido siálico relacionado con lipidos: LD = laclato
deshidrogenasa: LH = hormona lutemizante; NSE = enolasa especílica neuronal PAP = fosfatasa ácido prostático: SCC = antigeno de células escamosas óe carci-
noma. TdT = deoxinucleotidol transferasa terminal; TPA = antlgeno de tejido polipéptido; TSH = lirotropina; VIP • pohpéptido intestinal vasoaclivo. VMA = ácido vanil-
mandélico.

Tabla 47-3 E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s relacionadas con m a r c a d o r e s t u m o r a l e s s e r o l ó g i c o s particulares

E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s asociadas
Marcador tumoral" Enfermedades importantes Enfermedades menos importantes
AFP Carcinoma hepatocelular primario Teratoblastomas de ovarios y testículos
-hCG. cadena libre Tumores pituitarios
2M Neoplasias de linfocilos B Mieloma múltiple, linfoma de linlocitos B. leucemia
linlocítica de linfocilos B crónica y células reticulares,
CA 15-3 Cáncer de mama sarcoma enfermedad de Waldenstrom
CA 19-9 Carcinoma pancreático y gástrico Carcinomas varios
CA 72-4 Carcinoma gástrico Carcinomas vanos
CA 125 Carcinoma ovárico Carcinomas varios
-hCG Coriocarcmoma Carcinomas varios
Proteína de Bence Jones Mieloma multiple Cánceres testiculares (no seminomatosos). tumores
Bombesina Cáncer microcítico trolobláslicos
CA 549 Cáncer de mama
CA M26 Cáncer de mama
Calcitonina Carcinoma medular
CEA Carcinoma colorrectal
c-erbB-2 oncoproteína Cáncer de mama Cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer renal
Cromogranina A Feocromocitoma. neuroblastoma Carcinomas varios
Carcinomas varios
CYFRA 21-1 Carcinoma de células escamosas del pulmón Neoplasias endocrinas múltiples, cáncer microcítico
Desrnesterol Tumores cerebrales de pulmón, tumores carcinoides
DEA Cáncer adrenal/pituitaria
ADN Carcinoma cervical
Ferritina Leucemia mieloide aguda

Galactosillranslerasa Cáncer de ovario Linfoma de Hodgkin, neuroblastoma y vanos

Isoenzima II galactosillranslerasa Cáncer pancreático carcinomas, leraloblastoma
Gastrina Gastrinoma
Histaminasa Cáncer medular/tiroideo
hCG Coriocarcinoma Síndrome de Zollmger-Ellison

Ácido hialurónico Mesotelioma Carcinoma gástrico, ovárico y de mama, tumores

IgA Mieloma múltiple trofoblásticos o de células germinales, cáncer testicular
IGF-I Cáncer hipofisario
Receptor IL-2 Leucemia
Inmunoglobulinas Mieloma múltiple Insulinoma

Inhibiría Tumores de célula granulosa Linfoma mediterráneo, macroglobulinemia de

Insulina como factor de crecimiento Tumores de células no-islotes Waldenstrom, linfoma maligno
Catacalcina Cáncer medular de tiroides
17-cetoesteroides Cáncer adrenal/pituitaria
LASA-P
Antígeno relacionado con melanoma Melanoma
Metanefrinas Feocromocitoma Carcinomas varios, leucemia, linfoma, enfermedad de
Enolasa neuronal especifica Carcinoma microcítico de pulmón Hodgkin
Polipéptido pancreático Tumor endocrino Neuroblastoma, ganglioneuromas
Proteina P 21 Cáncer de mama Neuroblastoma, tumores renales
Catecolaminas plasmáticas Feocromocitoma
PNP Leucemia
POA Cáncer pancreático
PSA Cáncer de próstata
PAP Cáncer de próstata
Proteína PS-2 Cáncer de mama Hipertrolia prostática benigna (HPB)
SCC
Algunas leucemias
TdT Leucemia Carcinoma de células escamosas del útero, cérvix,
Tiroglobulma Cáncer tiroideo SCC de pulmón y de cabeza y cuello
TPA No especifico
TAG 72 Carcinoma gástrico
Inhibidor de urocinasa Tumores de vejiga Carcinomas varios
VIP Vi poma
Cáncer colorrectal, de pulmón, pancreático y de ovario
'Véase Tabla 47-2 para abreviaturas.
 1036 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
/* ' " ' "' " " """"" . ' • . . . . .
Tabla 47-4 M a r c a d o r e s t u m o r a l e s n o específicos*
Antlgeno Tennessee CEA (policlonal)
Antigeno del tepdo polipéplido B2M
Ácido siálico relacionado con llpidos
•Véase Tabla 47-2 para abreviaturas.
ral. Muchos de ellos son económicos y fáciles de determinar y son. por tanto,
útiles para controlar la terapia y para detectar una recidiva en pacientes con
diagnóstico conocido. Por eiemplo. el ácido siálico P asociado a lípidos
(LASA-P) puede cuantificarse con un procedimiento de calorimetría simple,
rápido y económico y su concentración en suero está estrechamente relacio-
nada con las concentraciones en suero de muchos marcadores tumorales de
alta especificidad.
Controle la posibilidad de efectos falseados
Uno de los inconvenientes del popular inmunoanálisis de tipo sandwich es
la capacidad para provocar efectos engañosos (Wu. 1991). El efecto trampa
que tiene lugar en un inmunoanálisis tiende a dar un valor falsamente bajo
cuando la concentración del marcador tumoral en la muestra sube por enci-
ma de una muy elevada concentración. El nivel exacto de marcador tumoral
donde puede producirse un efecto trampa depende del diseño de la prueba y
de la concentración de anticuerpos utilizada en el análisis. El uso de la misma
muestra para dos diluciones distintas (sin diluir y dilución de 1:10) revelará el
efecto trampa. La muestra diluida 1:10 normalmente producirá un valor 10
veces menor que otra muestra no diluida. Si hay un efecto trampa, la mues-
tra diluida 10 veces producirá un valor más alto que la muestra original (des-
pués corregir con el factor de dilución). El análisis del marcador tumoral debe-
rá repetirse con una muestra diluida 10 veces cuando el resultado de un inmu-
noanálisis de tipo sandwich sea demasiado bajo para equiparar la gravedad
clínica del paciente.
Controle la presencia de marcadores tumorales
ectópicos
La expresión de marcadores tumorales tiene una regulación genética. Para
tumores benignos, los marcadores producidos por el tumor normalmente son
específicos para células y están relacionados con los productos celulares nor-
males en una elevada concentración (Figs. 47-1 y 47-2). Cuando el tumor
benigno se convierte en agresivo y más maligno, las células comienzan a
perder el control y se convierten en autónomas. Las proteínas que normal-
mente se encuentran en un estado fetal precoz, y no se expresan en el tejido
adulto normal, empiezan a aparecer en el tumor como resultado de la pérdi-
da de la regulación de la expresión genética. Esta es la razón por la que las
proteínas carcinoembrionarias y los marcadores tumorales ectópicos normal-
mente se expresan en enfermedades malignas avanzadas. En otras palabras,
la aparición de marcadores tumorales ectópicos se asocia a un mal pronósti-
co o metástasis. Por ejemplo, las concentraciones elevadas de AFP en suero
pueden detectarse en pacientes con cánceres del tracto gastrointestinal con
metástasis, aunque las pruebas de luncion hepática sean normales. En la
Tabla 47-5 se muestran algunos de los marcadores ectópicos conocidos y las
enfermedades malignas asociadas.
Hay que tener en cuenta las recientes directrices sobre el uso de mar-
cadores lumorales gastrointestinales y de mama publicados por la
Sociedad Americana de Oncología Clínica (Smith, 1999). Ellos recomien-
dan que se deberia realizar una autoexploración mamaria mensual, mamo-
grafia anual de la mama conservada y de la contralateral, y una historia clí-
nica detallada y exploración física cada 3 ó 6 meses durante dos años, y
después anualmente. No recomiendan el uso de marcadores tumorales.
como son CEA, CA 15-3 y CA 27.29. para el examen colectivo. Ni tampo-
co recomiendan de forma habitual la gammagrafia ósea, la radiografía de
tórax, el recuento hematológico sanguíneo, la ecografia hepática o las imá-
genes de tomografía computarizada.
El Colegio Americano de Médicos también ha publicado las directrices clí-
nicas en lo que se refiere a la detección precoz del cáncer de próstata.
Subrayan la importancia de la identificación sistemática del PSA y de la reali-
zación del DRE en la detección precoz del cáncer de próstata. Aunque el DRE
no es tan sensible como el de la identificación sistemática del PSA, detecla el
cáncer que de otro modo podría no detectarse con el PSA (Coley, 1997a b).
EFECTO DE LOS ANÁLISIS DISEÑADOS
El impacto del diseño de una prueba, incluida la selección de anticuerpos,
no sólo afecta a la sensibilidad y especificidad de la prueba y al porcentaje de
concentración, sino que también afecta al nivel de marcador tumoral donde
aparece el electo trampa y si un resultado falso negativo o falso positivo pro-
vocará interferencias.
Unión competitiva
El primer RÍA desarrollado se basó en el formato de unión competitiva. La
combinación de una prueba de unión competitiva con un antigeno marcado
radiactivamente aportaba la sensibilidad necesaria para cuantificar muchos
marcadores tumorales circulantes, especialmente las proteínas carcmoembrio-
narias, en los rangos de concentración de nano y picogramo por mililitro. La
base de este formato de prueba incluye la competición entre una cantidad fija
de antigeno marcado radiactivamente y del antigeno en la muestra con una
cantidad limitada de anticuerpo. Después de la separación del compuesto antí-
geno-anticuerpo del antigeno libre, la medida de la radiactividad del compues-
to permitirá la estimación de la cantidad de antigeno presente en la muestra. En
la Figura 47-7 se presentan dos formatos de prueba diferentes, uno para RÍA y
uno para el enzimommunoanálisis absorbente (ELISA). No obstante, algunas
sustancias que interfieren en la unión entre antigeno y anticuerpo provocarán
un resultado falsamente elevado. Lo que no se tuvo en cuenta es el hecho de
que la misma sustancia que interfiere y que está presente en un análisis emple-
ando el mismo antigeno y anticuerpo en formato sandwich producirá un resul-
tado falsamente negativo (Wu. 1983). En la década de los 80 se mostró que los
dos sistemas importantes comercializados de CEA, uno de Abbott empleando
un formato sandwich y uno de Roche usando el formato de unión competitiva,
no producían el mismo resultado de CEA de las mismas muestras cuando las
muestras contenían sustancias que interferían, como las giucosaminoglucanos.
Formato sandwich
El ELISA, usando el formato sandwich, se ha convertido en el método más
popular para la cuantificación de marcadores tumorales. En este caso, un
anticuerpo específico es adsorbido a la tase sólida. Después se añade una
solución del antigeno y se deja que se una. Después del tiempo suficiente de
incubación y lavado, se añade un anticuerpo marcado con enzimas en la
lase sólida y se deja incubar. El anticuerpo marcado que no esta unido se
retira y el resto de la fase sólida contiene el antigeno "en sandwich" entre el
anticuerpo adsorbido a la fase sólida y el anticuerpo marcado. Luego se
Tabla 47-5 M a r c a d o r e s tumorales ectópicos*
AFP Carcinoma Gl. renal, de pecho, de vejiga
y de ovario
Calcitonina Carcinoma de pulmón, de células no-islolos.
carcinoide. de mama, medular y de ovario.
feocromocitoma
C'omo(jr;irun;i A Para tumores endocrinos (carcinoma medular
de tiroides, adenoma de adenohipófisis.
carcinoma de células de islotes
pancreáticos)
rx-hCG libre Carcinoma colorrectal y tumores pancreáticos
endocrinos
hCG Carcinoma gástrico y pancreático, hepatoma,
adenocarcinoma ovárico tumores de
células germinales de los testículos
Tiroglobulina Carcinoma tiroideo diferenciado
"Véase Tabla 47-2 para abreviaturas
 CAPÍTUIO 47 • DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
Aglutinación competitiva Formato sandwich
Figura 47-7. Ilustración de las diferencias importantes entre los dos formatos de
prueba importantes de mmunoanáiisis. La interferencia en la aglutinación compe-
titiva produce un valor falsamente elevado; en un formato sandwich produce un
resultado falsamente bajo.
añade el sustrato enzimático y el desarrollo colorimétrico resultante es pro-
porcional a la cantidad de antigeno en la solución de la prueba. Aunque se
disponen de otros marcadores distintos de enzimas, la enzima sigue siendo
el marcador más popular. La sensibilidad de ELISA puede acercarse a la del
RÍA, especialmente cuando se usa un sistema de amplificación biotina-avidi-
nalEngvall, 1971).
Recientemente, el formato de prueba de la unión competitiva ha desplaza-
do al procedimiento de sandwich. A pesar de las muchas ventajas asociadas
al nuevo formato, puede persistir el problema de los efectos trampa al obte-
nerse un valor falsamente bajo de una muestra que contiene una concentra-
ción altamente elevada de marcadores lumorales. Por ejemplo, se produjeron
valores falsamente bajos de CA 19-9 en el equipo Centocor, empleando un
formato sandwich, con muestras que contenían niveles altamente elevados
de CA 19-9. Sin embargo, cuando se utilizó el equipo de RÍA Biomira, basa-
do en un principio de aglutinación competitiva, se pudieron evitar completa-
mente los valores falsamente bajos de CA 19-9. La utilización del equipo de
RÍA Biomira también reduce el número de repeticiones debido a que el nivel
de CA 19-9 en la muestra puede aproximarse por la canlidad de radiactividad
(Wu. 1991).
Anticuerpo monoclonal frente al polielonal
El desarrollo por Kohler y Milstein (Milstein. 1983) de anticuerpos mono-
clonales murinos (MAb) con técnicas de hibridación de células somáticas per-
mite un análisis inmunoquímico mucho más detallado y molecular de antige-
nos asociados al tumor que antaño era imposible. Al combinar los anticuerpos
monoclonales con la fase sólida de la prueba en sandwich, se han desarro-
llado muchos análisis nuevos que han eliminado numerosos problemas rela-
cionados con los análisis pohclonales, que conllevan una escasa reproducibi-
lidad, muchas variaciones, pobre especificidad y reactividad cruzada no espe-
cifica (Diamond. 1981). También reduce las diferencias entre los diferentes
equipos y amplía el rango de concentración lineal del análisis. Siempre que
se disponga de un anticuerpo monoclonal, se recomienda su uso. Para con-
seguir una mayor sensibilidad de la prueba, parece que el uso de una combi-
nación de múltiples MAb mejora la afinidad entre los múltiples MAb absorbi-
dos en fase sólida y el antígeno soluble.
Anticuerpo heterófilo
El uso de MAb en inmunoanálisis y la creciente aplicación clínica de MAb
de ratones para dianas imaginarias y de la mmunoterapia establecen un
nuevo problema. Los individuos tratados producen aparentemente anticuer-
pos heterófilos contra anticuerpos murinos y esto interfiere con muchos de los
inmunoanálisis de marcadores tumorales (Nahm, 1990). La interferencia de
los anticuerpos heterófilos en suero humano puede aumentar o disminuir los
resultados de un inmunoanálisis. Estos anticuerpos reaccionan de un modo
similar frente a antígenos en términos de aglutinación a anticuerpos asocia-
dos a fase sólida y marcados con una señal. Estos anticuerpos heterófilos se
pueden aglutinar en otro lugar distinto que el sitio analizado para la aglutina-
ción, cruzando la señal del anticuerpo mediante el anticuerpo captura y gene-
1037
rando por tanto una respuesta analítica falsa. Se conoce que entre el 15% y
el 40% de los individuos puede tener uno o mas anticuerpos heterófilos.
El método estándar para reducir la interferencia de anticuerpos heterófilos
es incluir en el análisis mucho suero de ratón o inmunoglobulmas de ratón no
especificas en el inmunoanálisis.
MARCADORES TUMORALES PARTICULARES
cx-fetoproteína
La AFP es una proteína fetal importante del suero y también una de las más
importantes proteínas carcinoembrionarias (Wu, 1987). La AFP se parece a la
albúmina en muchas propiedades fisicoquímicas. En el feto, la AFP es sinte-
tizada por el saco vitelino y por los hepatocitos fetales y en menor grado por
el tracto gastrointestinal fetal y el riñon. La AFP elevada puede encontrarse en
pacientes con hepatoma primario y en tumores de células germinales deriva-
das del saco vitelino. La AFP es el marcador serológico más útil para el diag-
nóstico y tratamiento de carcinoma hepatocelular (HCC). Sin embargo, la AFP
también se eleva de forma transitoria durante el embarazo y en muchas
enfermedades hepáticas benignas. Debido a la alta prevalencia de cáncer de
hígado en China y en otras ciudades en el sudeste de Asia, las pruebas de la
AFP se han usado con éxito en el examen colectivo de hepatoma en esa zona
del mundo. Las pruebas tanto de AFP como de hCG son útiles para reducir
los errores en el estadiaje clínico en pacientes con algunos tumores testicu-
lares y ayudan en el diagnóstico diferencial de varios tumores de células ger-
minales. Como se observó un aumento de la fucosilación de la AFP (de ahí la
reactividad de lecitina de lenteja de AFP serológica) en el carcinoma hepato-
celular primario, la determinación de la reactividad en suero de lentil lecitina
con AFP ha sido útil no sólo para diferenciar entre hepatoma pnmario y enfer-
medades benignas de hígado, sino también para proporcionar una señal pre-
coz que indique cuándo se puede empezar a desarrollar un hepatoma en
pacientes con enfermedades hepáticas.
Moléculas de adhesión
Las moléculas de adhesión celulares (CAM) pueden dividirse en cuatro
grupos importantes: caderinas. selectinas, una superfamilia de inmunogtobu-
linas e integrinas (Wu. 1997). Estas moléculas de adhesión, especialmente la
E-selectina, pueden contnbuir al crecimiento tumoral y a las metástasis. Las
moléculas de adhesión intercelulares solubles pueden encontrarse en el
suero de pacientes con enfermedades malignas (Hebbar. 1998).
Factores angiogénicos
La angiogénesis es la formación de vasos sanguíneos in situ; incluye la
migración ordenada, la proliferación y la diferenciación de células vasculares.
La neoformación de vasos sanguíneos también es importante en la patogenia
del crecimiento rápido y metástasis de tumores sólidos. Se han identificado
muchos factores angiogénicos incluyendo factores de crecimiento fibroblásti-
co ácido y base, angiogenina y factores de crecimiento -o. y -|i transformados
(Folkman, 1992; Wu, 1997). Ambos factores angiogénicos y antiangiogénicos
se han encontrado en el suero de pacientes con enfermedades malignas
(Morelli. 1998).
|i -microglobulina
2
La [52M es la cadena ligera constante del antigeno del locus antigénico de
histocompatibilidad humano (HLA) expresado en la membrana de la mayoría
de las células nucleadas. La |J2M sólo tiene un peso molecular de 11,8 kDa.
Cuando las células nucleadas son metabolizadas. la cadena ligera (o |)2M) se
vierte al líquido extracelular. La |52M es un marcador tumoral no especifico
debido a que está elevado no sólo en los tumores sólidos sino también en las
enfermedades linfoproliferativas (incluyendo leucemia de linfocitos B crónica,
linfoma de no Hodgkin y mieloma múltiple) (Wu. 1986a). La concentración de
(32M se correlaciona con la actividad lintocítica y es un buen marcador para
las neoplasias de la linea de linfocitos B. Se ha utilizado como un indicador
de la respuesta de los pacientes al tratamiento. Los niveles de |Í2M en el liqui-
 1038 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
po cefalorraquídeo (LCR) es útil para detectar metástasis en el sistema ner-
vioso central (SNC). Se debería saber que las elevaciones sucesivas de
en estas situaciones pueden también deberse al deterioro de la función renal,
como sucede en el riñon del mieloma.
CA19-9, CA 50 y CA 19-5
El CA 19-9 es el primer marcador tumoral de un grupo de nuevos epíto-
pos. incluyendo CA 125 CA 15-3 y CEA, definidos por anticuerpos mono-
clonales. Estos nuevos equipos de monoclonales detectan los recién des-
cubiertos epilopos y estaban destinados a sustituir las determinaciones
policlonales de CEA en vanos carcinomas (Wu, 1988a). El análisis de CA
19-9 mide un carbohidrato angiogénico determinante expresado en una
mucina de alto peso molecular. El CA 19-9 es un epítopo reconocido por el
anticuerpo monoclonal 1116NS-199; se define como una lacto-W-fucopen-
tosa II sialilada. La molécula, que transporta el epitopo CA 19-9, aparece
como una mucina en el suero de pacientes con cáncer pero como un gan-
glíósido en las células tumorales. El CA 19-9 también está relacionado con
las sustancias del grupo sanguíneo de Lewis y sólo el antigeno serológico
de pacientes con cáncer pertenecientes al grupo sanguíneo Le(a b) o
- embargo, sólo se puede detectar CA 72-4 moderadamente elevado en la
Le(ab ) serán positivos para CA 19-9. Además del CA 19-9, también se ha
definido otros dos marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales
que son sólo ligeramente diferentes del CA 19-9. Son el CA 19-5 y CA 50.
El epitopo relacionado a CA 50 es muy similar al de CA 19-9 pero carece
de residuo de lucosa, el mismo epítopo encontrado en individuos con
Lewis-negativo Le(ab~). Las concentraciones en suero de CA 19-9 no sólo
suelen estar altamente elevadas en carcinomas gástricos y pancreáticos
sino que son útiles para controlar el éxito de la terapia y para detectar reci-
diva en estos pacientes de cáncer. Sin embargo, se ha visto que el CA 19-9
y CA 50 se complementan el uno al otro en el carcinoma pancreático y en
otros carcinomas: su uso simultáneo mejorará la sensibilidad en la detec-
ción de estas enfermedades malignas. El CA 19-5 es detectado por el anti-
cuerpo monoclonal en ratones CC3C-195 y reacciona tanto con el epítopo
a
Le" como con el sialil-Le . El CC3C-195 se aglutina con alta afinidad con el
1
antigeno del grupo sanguíneo Le sialilado, pero exhibe una baja afinidad
con la forma no sialilada. Los niveles elevados en suero de CA 19-9, CA 50
y CA 19-5 también pueden verse en pacientes con carcinomas de colon,
pancreático y hepatocelular. La elevación encontrada en enfermedades
hepáticas benignas puede deberse a coleslasis en estos pacientes (Wu,
1992).
CA125
El CA 125 es otro determinante angiogénico definido por anticuerpos
monoclonales y también está relacionado con glucoproteinas parecidas a
mucinas con un alto peso molecular (>200 kDa). El CA 125 se expresa en
más del 80% de los carcinomas epiteliales no mucinos ováricos. El CA 125 se
encuentra en la mayoría de los carcinomas de ovano serosos, endometriales y
de células claras (Jacobs. 1989). Sin embargo, los pacientes sometidos a qui-
mioterapia pueden mostrar un (also descenso del antigeno CA 125, y un
resultado negativo no siempre descarta la recidiva del tumor. El CA 125, tam-
bién se ha utilizado clínicamente en el seguimiento de tumores uterinos
(>60% están elevados) y en tumores benignos, incluyendo endometnosis.
Recientemente, se está probando la determinación de CA 125 en suero
para determinar si puede utilizarse en la identificación sistemática del cán-
cer ovárico Se ha indicado el uso de múltiples marcadores para mejorar la
especificidad y sensibilidad de las pruebas para cáncer ovárico (Wu. 1988b:
Jacobs, 1989).
CA15-3
El CA 15-3 es un antigeno circulante relacionado con el cáncer de mama
identificado por dos anticuerpos monoclonales distintos. El análisis emplea
un anticuerpo monoclonal conjugado en fase sólida, MAb 115D8. para cap-
turar el antigeno MAM-6 en el plasma humano y uno denominado MAb DF3
como marcador. MAb 115D8 se preparó contra los glóbulos grasos de leche
desnalada humana mientras que MAb DF3 se preparó contra la linea celular
MCG-7 del carcinoma de mama. El antigeno CA 15-3 está presente en una
variedad de adenocarcinomas, incluyendo mama, colon, pulmón, ovario y
páncreas.
El CA 15-3 es un marcador muy sensible y específico para controlar el curso
clínico de pacientes con cáncer de mama metastálico. Significativamente más
pacientes tienen elevados niveles circulantes de CA 15-3 que de CEA (96.2%
frente a 69,8%). En general, el CA 15-3 se correlaciona con la progresión, la
regresión, o la estabilidad de la enfermedad en un mayor número de pacien-
tes que el CEA Determinado CEA y CA 15-3 no se mejoran los resultados
obtenidos sólo con CA 15-3. Sin embargo, CA 15-3 también puede estar ele-
vado en hepatitis crónica, cirrosis hepática, sarcoidosis, tuberculosis y lupus
eritematoso sistémico (Tondini, 1988).
CA 72-4
El análisis de CA 72-4 detecta un antigeno relacionado con adenocarcino-
ma humano parecido a la mucina, TAG-72, que tiene un alto peso molecular
I,
(>10 MW), como la compleja molécula de mucina. Debido a que TAG-72
puede detectarse en el epitelio fetal y en el suero de pacientes con diversos
carcinomas, también se considera como una proteina carcinoembnonaria. Sin
mayoría de los carcinomas. Actualmente, el CA 72-4 está considerado como
el único marcador útil para el tratamiento de pacientes con carcinoma gástri-
co, a pesar de su baja sensibilidad. El CA 72-4 puede ser útil como uno de los
múltiples marcadores para tumores derivados de células epiteliales. Los RÍA
de CA 72-4, CA 19-9 y CEA son complementarios unos con otros en la detec-
ción de diversos carcinomas (Wu, 1992).
Calcitonina
La calcitonina es una de las hormonas peptidicas circulantes que pueden
llegar a elevarse en pacientes con una tasa de recambio ósea incrementada
asociada a metástasis óseas. La calcitonina puede encontrase ectópicamen-
te elevada en carcinomas broncogénicos. También se eleva en el carcinoma
medular de tiroides.
Antigeno carcinoembrionario
El CEA es una glucoproteina con un peso molecular de aproximadamente
200 kDa. El CEA es la primera de las denominadas proteínas carcinoembrio-
narias que fue descubierta por Gold y Freedman (1965). El CEA sigue siendo
el marcador tumoral más extensamente usado en la actualidad para el cáncer
gastrointestinal, pero la mayoría de los análisis de CEA han reemplazado el
anticuerpo policlonal por el anticuerpo monoclonal anti-CEA.
Aunque el RÍA de CEA en suero no cumple con las expectativas iniciales,
las intensas investigaciones sobre el CEA en los últimos 20 años nos han
enseñado muchas lecciones valiosas que tienen gran beneficio en el campo
de los marcadores tumorales. En un principio se pensó que el CEA era un
marcador específico para el cáncer colorrectal. pero en nuevos estudios
resultó ser un marcador no especifico. Se aprendió en los estudios de CEA
que los marcadores tumorales podian utilizarse para seguir a los pacientes
durante la terapia y para detectar las recidivas después de una cirugía exito-
sa. También se descubrió a través de los estudios de CEA una asociación
entre una concentración elevada en suero de marcador tumoral con metásta-
sis y mal pronóstico. Como el CEA se metaboliza en el hígado, los daños
hepáticos pueden alterar la aclaración del CEA y con ello provocar un aumen-
to de los niveles en la circulación sanguínea. Se han observado concentración
elevadas de CEA en algunos pacientes después del tratamiento con radio y
quimioterapia (Wu. 1986b).
Oncoproteína c-erbB-2 (HER-2/neu)
El gen c-eroB-2 (HER-2/neu) es un miembro de la clase de los oncoge-
nes relacionados con la proteina tirosma cinasa. Se ha descrito que el gen
c-erbB-2 se encuentra amplificado del 25% al 30% de cáncer humano de
mama y ovario. Se ha demostrado que la amplificación del c-eroB-2 es un
predictor independíente tanto de la recaída como de la supervivencia glo-
bal, y es superior a todos los demás factores pronósticos conocidos
excepto cuando los ganglios linfáticos son positivos. Recientemente se ha
 CAPÍTULO 47 • DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
deteclado que el c-eroB-2 es un útil marcador para identificar a pacientes
con cáncer de mama, que se beneficiarán más de altas dosis de quimio-
terapia adyuvante (Tandon, 1989: Duffy, 1990). Hay una relación directa
entre la amplificación del gen c-erbB-2 y la sobreexpresión de la proleina
c-eróB-2. Como consecuencia, se ha visto que tanto la amplificación como
la sobreexpresión de c-eroB-2 están relacionadas con un mal pronóstico
y con una escasa supervivencia y recidiva en diversos carcinomas.
La proteína codificada por c-erbB-2 es un receptor transmembranoso de
185 kDa (p185); también es una glucoproteína que tiene dominios intracelu-
lar, transmembrana y extracelular. La proteina c-erbB-2 muestra una seme-
janza estructural y funcional con el receptor del factor de crecimiento epidér-
mico (EGFR). Recientemente se ha publicado que el ectodominio de la onco-
proteina c-erbB-2 se podría separar proteolíticamente del receptor intacto y
podría eventualmente descubrirse en la circulación sanguínea Parece que el
ectodominio secretado en la matriz extracelular del tumor de mama corres-
ponde con niveles de expresión de p185 en el tejido del tumor de mama.
También parece existir una relación entre el ectodominio serológíco y pl85.
aunque no se ha probado. En la actualidad hay estudios en marcha para
determinar si el ectodominio serológico de la proteina c-eróB-2 puede utili-
zarse como un marcador pronóstico (Wu, 1995).
Cromogranina A
La cromogranina A es una importante proteína soluble de los granulos
cromafines. La cromogranina A puede liberarse de la médula adrenal junto
con catecolaminas tras la estimulación de nervios esplácnicos; sin embar-
go, no está limitada a células cromafines de la médula adrenal y neuronas
simpáticas: también existe en diversos tejidos neuroendocrinos. Los niveles
elevados de cromogranina A en suero pueden detectarse en feocromocito-
mas y en el carcinoma microcítico de pulmón (OConnor, 1984).
CYFRA 21-1
CYFRA 21-1 es un fragmento de la citoqueratina 19 encontrada en el
suero. Es una subunidad del filamento de citoqueratina intermedio expresa-
do en el epitelio simple y su análogo maligno. La elevación de CYFRA 21-1
indica un mal pronóstico en el carcinoma de células escamosas de pulmón
(Pujol, 1993).
Ciclinas
La progresión en el ciclo celular de las células eucariotas está controla-
da por la familia de ciclinas y las quinasas afines dependientes de ciclinas.
Las distintas proteínas ciclinas se pueden encontrar en diferentes estadios
del ciclo celular. Tres ciclinas diferentes marcan las diferentes fases del
ciclo celular —E para G, y S precoz. A para S y G,. y B para G, tardía—;
la fracción de células positivas para un cíclico determinado predecirá la
fracción en una fase determinada del ciclo celular. La apariencia periódica
de las ciclinas en las distintas lases del ciclo celular sugiere que pueden
utilizarse como marcadores de proliferación tisular. Se ha detectado expre-
sión elevada de varias ciclinas en extractos de cánceres humanos (Sherr.
1996).
Receptores de estrógeno y receptores de progesterona
La determinación de receptores de estrógeno (RE) y receptores de pro-
gesterona (RP) en el citoplasma del tumor de mama se utiliza para identificar
a las pacientes que probablemente se beneficien más de terapia endocrina.
Los RE y RP positivos también indican buen pronóstico, largo intervalo libre
de enfermedad y larga supervivencia en general. Aproximadamente del 55%
al 60% de las pacientes cuyos tumores primarios tienen RE positivos, y casi
el 85% de las pacientes con RE y RP positivos, responderán a la terapia
endocrina (Wu. 1997).
Gonadotropina coriónica humana
La gonadotropina coriónica humana es un miembro de la familia de las
hormonas glucoproteicas, se sintetiza y secreta por los trofoblastos de la
1039
placenta y es una hormona heterodimérica compuesta por subunidades </.
y p unidas no covalentemente. Los trofoblastos malignos y no malignos
sintetizan y secretan no sólo el dímero-(/p biológicamente activo sino tam-
bién las subunidades u y p no combinadas (o libres). Además del dímero
intacto, se ha detectado una subunidad p libre de hCG en el suero de las
mujeres al inicio del embarazo y en pacientes con tumores malignos
(véase Cap. 22).
Sin embargo, se puede encontrar una elevación de hCG en tumores trofo-
blásticos, coriocarcinoma y tumores testiculares. Más del 60% de los pacien-
tes con tumores no seminomatosos y entre un 10% y un 30% de los semino-
mas tienen una |i-hCG libre elevada. La determinación de la subunidad p libre
es útil para la detección de recidiva de metástasis en el coriocarcinoma cuan-
do la hCG intacta sigue normal El análisis de las subunidades hCG en suero
puede ser especialmente útil en el tratamiento de pacientes con cancer semi-
nomatoso, ya que en estos pacientes no se encuentra otro marcador tumoral
elevado.
El cáncer testicular seminomatoso contiene hCG intacta y p-hCG o
subunidades o libres en la misma proporción; por tanto, sólo se necesita
un análisis para controlar a estos pacientes. Por otro lado, en pacientes
con cánceres no seminomatosos sólo se encuentran hCG o subunidades
p-hCG. La determinación de las subunidades libres y de hCG intacta
aumentará la sensibilidad de la prueba en pacientes con cánceres no semi-
nomatosos.
La producción de p-hCG ectópica libre se produce casi en el 30% de los
pacientes con cáncer urotelial, pero sólo se detectaron la subunidad p-hCG
libre y sus respectivos productos de degradación, (i-core, en estas muestras
clínicas. La «-hCG es un marcador de malignidad en tumores endocrinos
pancreáticos (Madersbacher. 1992).
LASA-P
Los ácidos siálicos (ácidos /V-acetilneuraminicos) son los derivados acilados
del ácido neuramínico y los residuos terminales del extremo no reducido de las
cadenas de carbohidratos en glucoproteinas y glucolipidos. La LASA-P. por
otro lado, se considera como un marcador tumoral no especifico; se encuen-
tra elevada en una variedad de enfermedades malignas, aunque también en
enfermedades inflamatorias no malignas. Esta ausencia de especificidad
tumoral limita sustancialmente su utilidad como un marcador tumoral para el
diagnóstico. La LASA-P tiene una sensibilidad muy baja, y sólo se puede
detectar en suero que contenga marcadores tumorales en elevadas concen-
traciones, hablamos de rangos de mil nanogramos por milímetro de concen-
tración El método más comúnmente usado para medir la LASA-P en suero
es un procedimiento colonmétrico simple y baralo que utiliza ácido tíobarbitú-
nco y resorcinol (Katopodis, 1982).
Enolasa neuronal específica
La subunidad y de una isoenzima enolasa en la vía glucolítica. que se
encuentra predominantemente en células neuronales y neuroendocnnas,
se llama enolasa neuronal específica (NSE) y se identifica por inmunoaná-
lisis. Los niveles elevados de NSE se pueden encontrar en tumores que se
originan de células del sistema neuroendocrine Los niveles de NSE en
suero parecen ser marcadores relativamente específicos del cáncer mi-
crocítico de pulmón (SCLC) (85%). Se ha visto que es un marcador útil
para controlar el tratamiento y predecir recaídas en pacientes con SCLC
(Burghuber, 1990).
p53
La p53 es una fosfoproteina nuclear de 53 kDa y un regulador negativo del
crecimiento celular. Funciona como un supresor tumoral induciendo la expre-
sión de productos del gen que son responsables de la inhibición o detención
del crecimiento y la proliferación celular. La habilidad de la proteina p53 para
regular la transcripción de estos genes diana se basa en la actividad agluti-
nante de la secuencia específica del ADN y en la presencia de un dominio que
puede activar la transcripción cuando se une al dominio unido al ADN de otra
proteína. Es el dominio unido al ADN el que parece ser sensible a la disrup-
 1040 SECCIÓN V • INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
ción por mutación y a más lesiones relacionadas con cánceres humanos que
producen en este dominio. Se ha visto que el gen codificador para p53 está
mutado en casi la mitad de prácticamente todos los tipos de cáncer surgidos
desde un espectro amplio de tejidos. La inhibición funcional de la activación
de p53 también parece jugar un papel en la génesis tumoral humana. La
sobreexpresión de algunos productos de oncogenes en ciertos tumores sirve
para aglutinar y enmascarar la activación del dominio de p53.
La p53 puede determinarse tanto en tejido como en fibroblastos, células
blancas o en suero. Existe disponible en el mercado un inmunoanálisis de
enzima sandwich de Oncogene Science para la cuantilicación de proteínas
p53 desnaturalizadas mulantes. Debido a la corta vida media (20 minutos), no
se detecta la proteína p53 en estado puro en la circulación sanguínea (Harris,
1993; Malkin. 1990).
Proteína pS2
La pS2 es un péptido rico en cisteina inducido por estrógenos. Es una
pequeña proteína secretada por las células de la mama. Su detección en los
citoplasmas de tumores de mama permite que se pueda prever la respuesta
a la terapia endocrina. Se ha visto que la expresión de pS2 está asociada a
una supervivencia larga en general y libre de enfermedad. La pS2 negativa
está asociada con recidiva precoz y mortalidad:
RE+ / RP+ / pS2+, del 85% al 97% tiene buen pronóstico frente a
RE+ / RP + / pS2-, sólo del 50% al 54% tiene buen pronóstico
Hormona paratiroidea relacionada con péptidos
Las concentraciones en plasma de la hormona paratiroidea relacionada
con péptidos (PTH-RP) se encuentran elevadas en la mayoría de pacien-
tes con cáncer asociado a hipercalcemia. Son secretadas por tumores aso-
ciados con hipercalcemia. Las formas circulantes de PTH-RP en estos
pacientes incluyen tanto un péptido aminoterminal largo como un péptido car-
boxitermínal con una secuencia similar homologa a la paratirina (PTH). El
mecanismo por el cual PTH-RP induce hipercalcemia incluye aglutinación y
activación de receptores que también aglutinan PTH. La determinación de las
concentraciones de PTH-RP puede ser útil en el diagnóstico diferencial de
hipercalcemia relacionada con malignidad y asociada también con hiperpara-
tiroidismo primario, sarcoidosis, toxicidad de vitamina D o diversas neoplasias
(incluyendo carcinomas de células escamosas, renales de vejiga y de ovario).
Se debería conocer que los pacientes con afectación de la función renal, pero
sin hipercalcemia o cáncer, pueden presentar concentraciones en plasma de
PTH-RP aumentadas (Burtis, 1990).
Inmunoanálisis sandwich
En la circulación sanguínea, la mayoría del PSA presente se para el complejo PSA-ACT
encuentra como complejo PSA-ACT
Antígeno prostético específico
El PSA se sintetiza en las células epiteliales de la glándula prostética y quizá
sea el mejor marcador tumoral descubierto hasta ahora. La especificidad tisu-
lar del PSA hace que sea el marcador tumoral más útil disponible para la detec-
ción sistemática y el tratamiento del cáncer de próstata. La ausencia de espe-
cificidad es el único inconveniente del PSA. Los procesos benignos como la
HPB. la prostatitis y el infarto también se correlacionan con niveles elevados
de PSA en suero.
Debido a su especificidad tisular, el análisis del PSA es particularmente útil
para controlar el éxito después de una prostatectomia quirúrgica. La comple-
ta extirpación de la próstata resultaría en un nivel de PSA indetectable; cual-
quier detección de PSA después de una prostatectomia radical indicaría per-
sistencia de tejido prostético o metástasis. En estos pacientes, el incremento
en las concentraciones de PSA después de una cirugía con éxito indica una
recidiva de la enfermedad. Sin embargo, si la detección de PSA en suero des-
pués de una prostatectomia radical se debe a una resección glandular incom-
pleta y no de persistencia de enfermedad, el nivel permanecerá inalterable en
los posteriores seguimientos. Hay que saber que puede existir un aumento
leve pero pasajero de los niveles de PSA durante la radioterapia, que no debe
malinterpretarse como progresión de la enfermedad.
La especificidad tisular del PSA también permite que esta prueba sea un
excelente instrumento para detectar una recidiva después de una prostatecto-
mia radical. Ha surgido una gran demanda para el desarrollo de una prueba de
PSA ultrasensible. Una prueba de PSA muy sensible permitiría una detección
precoz de recidiva y metástasis y proporcionaría una mejor oportunidad para un
tratamiento con éxito. Muchas de las pruebas de PSA actualmente disponibles
en el mercado son capaces de detectar PSA en suero por debajo de 0,1 ng/ml.
Se recomienda el uso de PSA en suero junto con un DRE o ecografía trans-
rectal de la próstata como instrumento de examen para detectar cáncer de
próstata clínicamente significativo (Calalona, 1991; Brawer. 1992).
El PSA es una serin proteasa capaz de unirse formando complejos con
diversos inhibidores de proteasa. En consecuencia, existe PSA en suero
principalmente en forma de complejo PSA-ACT (PSA-ct.-anliquimotripsJna)
(Christensson. 1993) (Fig. 47-8). Hay convencimientos de que la determinación
directa del complejo PSA-ACT no sólo elimina muchos problemas técnicos rela-
cionados con el análisis del PSA sino que también mejora la dilerenciación de
la HPB (hipertrofia prostética benigna) del cáncer de próstata (Wu, 1994,1998).
PSA libre
La determinación del PSA libre (fPSA) y el cálculo del %fPSA (%fPSA =
[fPSA/PSA] x 100) se ha utilizado para diferenciar entre HPB y cáncer de
Figura 47-8. La ilustración muestra que la mayoría del
PSA existente en la circulación sanguínea se encuentra
en forma de complejo PSA-ACT. La figura de la derecha
indica cómo se puede desarrollar un análisis específico
para el complejo PSA-ACT mediante dos anticuerpos
diferentes, uno para el PSA libre y otro para ACT. en un
formato sandwich
 CAPÍTULO 47 • DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS
próstata, reduciendo por tanto las biopsias innecesarias en pacientes con
HPB. Un %fPSA alto (>23%) normalmente se asocia a HPB, mientras que
el cáncer prostético está asociado a un %fPSA bajo (<6%) (Catalona, 1995).
Carcinoma de células escamosas
El antigeno del carcinoma de células escamosas (SCC) es una subfracción
casi neutral del antígeno tumoral TA-4 purificado del tejido del carcinoma de
células escamosas del cérvix uterino. El peso molecular del antigeno SCC es
de aproximadamente 48 kDa, Más del 70% de las pacientes con cáncer de
cérvix avanzado tiene un SCC elevado. El RÍA de SCC es útil para el segui-
miento de pacientes con cáncer de cérvix durante el tratamiento. El SCC tam-
bién es útil para controlar carcinomas de células escamosas de cabeza y cue-
llo, pulmón, esófago y canal anal. Las concentraciones de SCC en suero son
mayores en pacientes con metástasis. En pacientes con fallo renal, incluso el
50% podría tener concentraciones aumentadas de SCC en suero debido a un
aclaramiento alterado de la circulación.
Antígeno polipéptido tisular
El antígeno polipéptido tisular (TPA) es una mezcla de citoqueratinas aso-
ciadas a epitelios de baio peso molecular (Weber. 1984). Como es más abun-
dante en células en mitosis y mucho menos en interfase. el TPA es una mezcla
de la proliferación celular. El análisis de TPA utiliza una combinación de anti-
cuerpos monocíonales específicos de citoqueratinas de epitelio simple. El TPA
es un marcador sensible pero no especifico para diferenciar entre enfermedad
en progresión y en remisión completa. Las elevaciones del TPA aparecen en
una gran diversidad de enfermedades inflamatorias y en el embarazo, asi como
en muchos tipos de tumor Muchos artículos insisten en el uso del TPA junto con
otros marcadores, especialmente el CEA, para controlar una gran diversidad de Futreal PA, Liu Q. Shattuck-Eidens D, et al: BRCAI mutations in primary breast and
carcinomas, incluyendo mama, colorrectal, ovario, vejiga y pulmón. El TPA tam-
bién es válido para detectar recidiva y para ayudar a diferenciar entre colangio-
carcinomas (positivo) y carcinoma hepatocelular (negativo).
Debe advertirse de que cualquier molécula puede utilizarse como mar-
cador tumoral siempre que las variaciones en su concentración reflejen
cierta actividad celular tumoral. La valoración de la utilidad clínica de un
marcador tumoral particular se basa en su sensibilidad y especificidad. Ha
existido una clara tendencia para mejorar la especificidad y sensibilidad de
la prueba al pedir múltiples marcadores tumorales. Sin embargo, todavía
existen discrepancias respecto a cuál y cuántos marcadores tumorales se
deben incluir en el panel de determinadas enfermedades malignas. El
coste que conlleva la petición de múltiples marcadores tumorales también
puede ser prohibitivo. Existen varios marcadores tumorales nuevos posi-
bles. Estos marcadores tumorales están compuestos de oncoproteínas.
proteínas supresoras, moléculas de adhesión, ciclinas y factores angiogé-
nicos. Éstos difieren sobre todo de los marcadores tumorales utilizados
actualmente en su asociación con rutas metabólicas específicas conocidas
o reacciones fisiológicas. La mayoría de los marcadores tumorales que se
emplean actualmente para el tratamiento de pacientes no están asociados
con ninguna reacción biológica específica conocida. Posiblemente, midien-
do estos nuevos marcadores tumorales se proporcionará información
sobre defectos más específicos, lo que ayudará al diseño de tratamientos
más apropiados. El mejor ejemplo es el célebre uso de Herceptin (un anti-
cuerpo monoclonal humano contra el ectodominio del receptor c-eróB-2)
en pacientes con cáncer de mama metastático. Sólo las pacientes con
sobreexpresión de la oncoproteina c-eroB-2 (HEfl2) en su tumor son
seleccionadas para el tratamiento Herceptin (Wu, 1999). Pronto estará dis-
ponible un análisis en suero de la oncoproteina c-erbB-2 (Wu, 1998).
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 S E C C I Ó N VI

Microbiología médica
Gail L. Woods, M.D.
John Bernard Henry, M.D.
 CAPÍTULO
Infecciones víricas
• Michael Costello, PhD.
• Margare» Yungbluth, M.D.
Cultivo de virus
Detección de antigenos y detección molecular
Serología vírica
Obtención y transporte de las muestras
Equipos y material
Síndromes clínicos infecciosos causados por virus
INFECCIONES HERPÉTICAS MUCOCUTÁNEAS 1050
Aislamiento del virus del herpes simple mediante
cultivo celular
Detección directa del virus del herpes simple
Diagnóstico serológico
INFECCIONES VÍRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO 1053
Gripe (Influenza)
Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial
Crup
Obtención de muestras
Ensayos para la detección de antigenos víricos
Aislamiento de virus
MONONUCLEOSIS INFECCIOSA E
INFECCIONES RELACIONADAS 1057
Diagnóstico serológico
La virología clínica es una ciencia que ha experimentado una profunda evolu-
ción en los últimos 40 años, de tal forma que hoy en día está claramente esta-
blecido que los virus son la causa más frecuente de enfermedades infecciosas
en el hombre. El ámbito de las enfermedades víricas es muy amplio, con mani-
festaciones que van desde el trivial resinado común hasta la reciente patología
consistente en un estado de inmunosupresión de consecuencias fatales, resul-
tante de la destrucción de los linfocitos T-CD4 por el virus de inmunodeficiencia
humana (VIH). Los métodos de cultivo inicialmente disponibles para llevar a cabo
el aislamiento e identificación de los virus eran complejos y tediosos y, en con-
secuencia, poco prácticos para ser utilizados de forma sistemática en el diag-
nóstico. Sin embargo, debido a la epidemia de infecciones venéreas producidas
por el virus del herpes simple, al incremento en el número de pacientes inmuno-
comprometidos que padecen infecciones oportunistas y al desarrollo de agentes
antivirales eficaces, se ha generado una fuerte demanda de servicios de virolo-
gía clínica que sean accesibles fácilmente. En este contexto, hoy en día los hos-
pitales, tanto los municipales como los universitarios, asumen como algo habi-
tual la confirmación de las infecciones respiratorias, del sistema nervioso central
(SNC), gastrointestinales (Gl) y diseminadas, causadas por virus. Un diagnóstico
específico de una infección vírica es de gran ayuda para el médico de cara a opti-
mizar las condiciones de hospitalización del paciente y a administrar la quimio-
terapia antivírica más apropiada en cada caso; de este modo, se evitan o redu-
cen los tratamientos innecesarios y se consigue un ahorro significativo en los
procedimientos diagnósticos, implementando al mismo tiempo los métodos de
aislamiento más eficaces para limitar la diseminación nosocomial de los virus.
Los beneficios secundarios para la salud pública de una diagnóstico preciso no
deben ser pasados por alto; los datos epidemiológicos sobre la gnpe, el sín-
drome de inmunodeficiencia adqumda (sida), las infecciones por arbovirus y
enterovirus y el herpes venéreo representan una información tan valiosa como
la compilada sobre la tuberculosis, la salmoneltosis. la gonorrea y la sífilis.
48
Mononucleosis infecciosa heterófilo-negativa
Síndrome de la fatiga crónica
INFECCIONES VÍRICAS CONGÉNITAS
Y PERINATALES 1059
Citomegalovirus
Rubéola
Virus del herpes simple
Virus de la inmunodeficiencia humana,
parvovirus, enterovirus
ENCEFALITIS Y MENINGITIS VÍRICA 1060
Diagnóstico de laboratorio
EXANTEMAS VIRALES 1063
GASTROENTERITIS VÍRICA 1064
Diagnóstico de laboratorio
HEPATITIS VÍRICA E INFECCIONES
POR RETROVIRUS 1065
Virus de la inmunodeficiencia humana
INFECCIONES VÍRICAS EN HUÉSPEDES
INMUNOCOMPROMETIDOS 1067
BIBLIOGRAFÍA 1068
Existen varios trabajos de excelente calidad que contienen información
sobre la taxonomía y patogenicidad de los virus humanos (Fields. 1996;
Topley, 1998; Murray. 1999). En este capitulo se revisan los síndromes infec-
ciosos de origen vírico más comunes y que son responsables de la mayor
parte de pruebas diagnósticas que se llevan a cabo en un laboratorio de micro-
biología clínica típico. Se analizarán los aspectos relativos a la organización
del laboratorio, equipos y suministros, recogida de muestras y selección de las
pruebas, junto con los métodos habituales de aislamiento e identificación que
tienen una mayor aplicación práctica en clinica. Ya que las enfermedades víri-
cas son tan comunes y afectan tanto a los niños y adultos sanos como a inmu-
nocomprometidos, la mayor parte de hospitales municipales registran una
mezcolanza de casos clínicos que justifica la existencia de un servicio de viro-
logía. En la Tabla 48-1 se recogen los datos relativos al número de pruebas de
aislamiento y de detección de anlígenos, asi como las frecuencias de recupe-
ración en el General Hospital Lutheran, un centro médico suburbano de 600
camas localizado en Chicago, con un gran volumen de atención pnmaria
pediátrica y de adultos y servicios de obstetricia, neonatologia y hematolo-
gía'oncologia de alto riesgo. Esta mezcla de pacientes conlleva una amplia
variedad de infecciones víricas comunes; en otros hospitales con diferentes
perfiles de especialidades médicas se recuperarán básicamente los mismos
tipos de virus, aunque pueda haber variaciones en los porcentajes relativos de
aislamiento. El tiempo medio requerido para la detección de la mayor parte de
virus es corto (a menudo, dos días o menos) y. desde luego, está en la misma
escala de tiempo que se necesita para el aislamiento habitual de baclenas
mediante cultivo. Ello es consecuencia del uso de pruebas rápidas para la
detección de antigenos y ácidos nucleicos (utilizando las correspondientes
sondas especificas) y de cultivos en "shell vial" que necesitan cortos periodos
de incubación. El porcentaje de recuperación es alto -del 15% al 38%- y, por
lo general, vanas veces superior al valor que se obtiene en el caso de los
 1046 SECCIÓN VI MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1
I . •—: — ~~ : " : ,
bles o fragmentos del virus relativamente intactos; las muestras deben obtenerse
Tabla 48-1 Detección de virus: frecuencias de aparición, tiempos
de detección medios y frecuencias de positividad del lugar en donde está teniendo lugar la replicación activa del virus, durante la
viral (Lutheran General Hospital, Park Ridge, II) fase aguda de la infección. Debido a su mayor sensibilidad, las técnicas de hibri-
dación con sondas de ácidos nucleicos específicas permiten una mayor libertad
Tiempos de detección
Virus 1995 1998 medios (días) a la hora de obtener el espécimen; sin embargo, la interpretación de los resulta-
dos puede ser más difícil, puesto que es posible seguir observando valores posi-
Virus del herpes simple 34% 25% 2 tivos con estas técnicas, incluso durante la fase de recuperación o convalecen-
Cilomegalovirus 3% 4% 3 cia. Los ensayos con sondas pueden discriminar entre infección activa y latente
Adenovirus 5% 6% 3 mediante la detección de componentes del genoma vírico que estén replicán-
Virus de la influenza A 6% 11% 2
Enlerovirus 8% 7% 4 dose activamente; por ejemplo, el ensayo de la reacción en cadena de la poli-
Virus de la vancela-zósler 2% 1% 3 merasa (PCR) utilizando la transcríptasa reversa (RT) (RT-PCR) para ARN espe-
Virus de la influenza B 1% <1% 2 cífico de CMV indica replicación activa del virus, mientras que la PCR específica
Virus de la parainfluenza 6% 4% 2 para ADN puede dar también un resultado positivo durante la fase de latericia. El
Virus respiratorio sincitial 27% 41% 0,33 diagnóstico serológico tradicional requiere el análisis de dos muestras de suero,
Sarampión y paperas <1% 0% 5 una tomada durante la fase aguda y la otra durante la de convalecencia de la
Total de muestras
procesadas 3.323 3.040 enfermedad, para poner de manifiesto un incremento de cuatro veces o superior
Porcentaje de en el título de anticuerpos específicos frente al virus entre ambas muestras.
recuperación de virus 21% 23% Aquellos métodos que detectan IgM específicas frente al virus permiten diag-
nosticar la enfermedad aguda a partir de una única muestra de suero obtenida
durante la lase aguda o al comienzo de la fase de convalecencia de la enferme-
dad. Por último, las pruebas que identifican inmunoglobuiinas especificas del tipo
hemocultivos o los cultivos de heces ordinarios, los cultivos de micobacterias
IgG se utilizan habítualmente para poner de manifiesto la existencia de un estado
y el examen en busca de parásitos y sus huevos (Costello, 1996).
inmune en el individuo frente a un determinado agente viral.
Muchos de los virus más comunes muestran variaciones estacionales. Las
epidemias de gripe y de las infecciones por virus respiratorio sincitial (VRS) se En la actualidad, todos los materiales y reactivos necesarios para llevar a
repiten anualmente durante los meses fríos, al igual que sucede para las infec- cabo el aislamiento de virus, los ensayos de detección de antígenos virales y
ciones por los virus tipo 1 y tipo 2 de la parainfluenza. Las infecciones por ade- los métodos serológicos están disponibles comercialmente. Los laboratorios de
novirus, virus tipo 3 de la parainfluenza, citomegalovirus (CMV) y virus del her- virología ya no necesitan mantener las líneas de cultivos celulares o preparar
pes simple (VHS) tienen lugar a lo largo de todo el año. Las enfermedades sus propios reactivos, al igual que un laboratorio de microbiología general tam-
provocadas por enterovirus se concentran al final del verano y principio del otoño poco utiliza medios de cultivo y colorantes preparados de forma casera. El
(Fig. 48-1). Estos patrones de distribución temporal de la incidencia de las dife- número de virus que puede identificarse y cuantificarse mediante ensayos de
rentes infecciones provocan fluctuaciones en las necesidades de personal de amplificación de ácidos nucleicos continúa aumentando, aunque sólo están dis-
laboratorio que son particularmente problemáticas en los hospitales pediátricos. ponibles unos pocos sistemas comerciales de aplicación general basados en
En la Tabla 48-2 se muestran los tres métodos principales para el diagnóstico esta tecnología. En este contexto, los procedimientos particulares son la regla
de laboratorio, todos los cuales tienen ventajas y limitaciones. Las técnicas de más que la excepción y necesitan una buena experiencia técnica y un severo
cultivo y detección de antigenos requieren que en la muestra existan virus via- control de calidad para garantizar la precisión y Habilidad del diagnóstico.

Adenovirus

Herpes simple

Citomegalovirus

Varieela-zóster

Sarampión

Paperas

Virus respiratorio sincitial

Parainfluenza tipos I y 2

Parainfluenza tipo 3

Influenza A y B

Enterovirus

Arbovirus

Rotavirus

Figura 48-1. Variación de la aparición de infecciones víricas en función de la estación del año.
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
Tabla 48-2 M é t o d o s d e laboratorio para e l diagnóstico d e las
infecciones virales
Cultivo de tejidos
Cullivo en tubo (monocapa estándar de células)
Métodos de cultivo potenciados mediante centrifugación (monocapa
de células en "shell-vials'/monocapa de células mixtas)
Detección de antigenos/ácidos nucleicos del virus en el espécimen
del paciente
Tinción directa con anticuerpos fluorescentes (DFA)
Enzimoínmunoensayo (EIA)
Ensayos directos con sondas de ácidos nucleicos (hibridación
in situ, HIS) y técnicas de amplificación (PCR, RT-PCR, SD.
bADN. LCR. TMA. HC. etc.)
Secuenciación de genomas (VIH. VHC. ele.)
Scrologia
Pruebas con anticuerpos policlonales
Métodos específicos para IgM. IgG. e igA
HIS = Inundación in situ. TMA » amplificación mediada po' transcripción. PCR
= reacción en cadena de la polimerasa; RT-PCR = reacción en cadena de la
polimerasa de la transcriptasa reversa SD = desplazamiento de cadena; bDNA
= ensayo de ADN ramificado, LCR • reacción en cadena de la ligasa. VIH =
virus de la inmunodeficiencia humana; VHC = virus de la hepatitis C
A pesar de estas restricciones, los métodos basados en la biología molecular
son particularmente atractivos para la identificación de virus que se propagan
lentamente, o incluso no lo hacen, en los cultivos celulares, y, en teoría, debe-
rían proporcionar una sensibilidad y una precisión cuantitativa superior a la que
tienen los sistemas convencionales.
Cultivo de virus
La propagación de virus en cultivos de tejidos se consiguió por primera vez
hace más de 50 años, y hoy en día aun continúa siendo el procedimiento más
versátil y amplio para el diagnóstico de las infecciones víricas. Muchos virus
(aunque no todos) de importancia clínica son capaces de replicarse en cultivos
celulares, existiendo una correlación entre la recuperación del virus y la fase
aguda de la enfermedad correspondiente. Sin embargo, el cultivo requiere
mucho esfuerzo y experiencia técnica, y generalmente implica al menos uno o
dos días de espera para obtener resultados positivos. La replicación en tejidos
de ratón recién nacido o en huevos embrionados puede ser preferible, o incluso
esencial, para algunos virus incómodos: sin embargo, la mayor parte de labora-
torios clínicos confían en los cultivos de líneas celulares in vitro. y, en conse-
cuencia, la inoculación en animales o huevos se realiza muy raramente fuera de
los laboratorios de investigación o de las instituciones de salud pública (Nalonen,
1998). Los cultivos de tejidos celulares se dividen en tres categorías: cultivos pri-
marios, lineas celulares diploides y líneas celulares heteroploides. Los cultivos
celulares primarios se preparan a partir del órgano original directamente (como
puede ser riñon de mono o de conejo). Las células son separadas individual-
mente mediante triturado y tratamiento con tripsina, y la mezcla de células resul-
tante se transfiere a tubos de ensayo o "shell-vials", donde las células se unen
formando una monocapa confluente. El cultivo de células se recubre con un
medio que mantiene su viabilidad, consistente en una solución salina tamponada
1047
a pH fisiológico que contiene sales minerales, glucosa, aminoácidos, vitaminas y
coladores. El medio mínimo esencial de Eagle en solución salina balanceada de
Earl o de Hanks es la combinación utilizada más frecuentemente como medio
nutritivo para los cultivos celulares: usualmente se le añade una baja concentra-
ción de suero letal bovino rico en proteínas y pobre en inmunogtobulinas. con
objeto de mantener en buenas condiciones fisiológicas la monocapa de células,
pero sin favorecer su proliferación. Las lineas de células diploides son general-
mente fibroblastos que derivan de pulmón o de prepucios de recién nacidos, la
mayoría de los cuales tienen una dotación diploide de cromosomas normal.
Estas células se propagan en un medio de cultivo rico, con suero, y pueden ser
subcultivadas de 20 a 50 veces antes de que pierdan su viabilidad; algunos tipos
celulares de esta categoría son MRC-5, wl-38 y los fibroblastos procedentes de
prepucio. Las líneas de células heteroploides derivan de tumores malignos y son
células "inmortalizadas" que pueden ser subcultivadas indefinidamente: tienen
un genoma aneuploide y se dividen rápidamente. Las líneas celulares hetero-
ploides más populares son HEp-2 (denvada de un carcinoma laríngeo). HeLa (de
un carcinoma cervical) y A549 (también de un carcinoma laríngeo). Los cultivos
primarios deben examinarse para comprobar que no están contaminados por
virus endógenos. Las líneas diploides y heteroploides deben examinarse perió-
dicamente para comprobar tanto la ausencia de contaminación por micoplasmas
como que sigan siendo susceptibles a la infección por virus. Lógicamente, si las
células son adquiridas comercialmente. todos estos controles, que implican una
gran inversión de tiempo, son responsabilidad de la firma suministradora. Las
lineas celulares "híbridas" representan un nuevo concepto: en este caso, la
monocapa está constituida por una mezcla de dos tipos celulares distintos capaz
de permitir el crecimiento de una amplísima gama de virus. Un ejemplo de esta
categoría es el sistema R-Mix (Diagnostic Hybrids) formado por células A549 y
células de pulmón de visón. en un medio de mantenimiento que contiene trip-
sina, y que permite la recuperación de varios patógenos respiratorios, como los
virus de la gripe y parainfluenza. VRS y adenovirus.
Los virus no infectan con igual afinidad todos los tejidos humanos y tam-
bién difieren en su capacidad para replicarse en las líneas celulares de los
cultivos de tejidos, por lo que para incrementar al máximo las probabilidades
de recuperación cada espécimen debe inocularse en diferentes líneas celula-
res. La Tabla 48-3 muestra una lista de varias líneas de cultivos de tejidos con
los virus que son capaces de infectarlas. Todas están disponibles en el comer-
cio y pueden suministrarse en tubos, shell-vials, o en frascos a granel (Fig. 48-
2). Cada laboratorio debe seleccionar las líneas que necesite para cubrir
todas sus necesidades, en tunción de los tipos de virus que más frecuente-
mente se aislan a partir de la población de pacientes que están bajo su res-
ponsabilidad, aunque los requerimientos en el número y tipo de cultivos celu-
lares puedan variar para aiustarse a los cambios estacionales en la incidencia
de las diferentes infecciones virales.
La replicación de los virus en las monocapas de células se pone de manifiesto
mediante el examen de la lámina de células con un microscopio invertido de con-
traste de fases, con objeto de observar las alteraciones citopáticas causadas por
la proliferación del virus. Las monocapas de células en tubo tienen una gran ver-
satilidad: una única línea celular puede permitir el crecimiento de varios virus,
siempre que cada uno de ellos cause un efecto citopático (ECP) distintivo, o bien
 1048 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Detección de antígenos y detección molecular

La identificación rápida (menos de un día de espera) de virus por métodos
directos es especialmente útil en los casos para los que hay disponible una
terapia antivírica específica (p. ej.. en las infecciones causadas por VHS. VVZ.
CMV. virus de la gripe o VRS) y cuando existe riesgo de infección nosocomial
(como es el caso del virus de la gripe, VRS, rotavirus y VVZ). Los antígenos
virales pueden ser detectados con una sensibilidad y especificidad semejan-
tes, tanto por inmunofluorescencia directa (DFA) como mediante enzimoinmu-
noensayo (EIA). El test DFA tiene la ventaja de que permite observar la celu-
laridad del espécimen, lo que permite establecer fácilmente si la muestra es
adecuada (Rossier, 1989). La realización del método DFA requiere una inver-
sión considerable de tiempo y esfuerzo, lo que es un inconveniente importante,
ya que implica una carga adicional de trabajo en aquellos laboratorios en los
que se procesa un gran número de muestras. El EIA puede ejecutarse de
forma mucho más automatizada y la interpretación de los resultados obtenidos
con el mismo es menos subjetiva que la de los datos del test DFA, aunque el
EIA no permite determinar la calidad de la muestra. Para el método DFA es
recomendable utilizar un microscopio equipado con epifluorescencia, y deben
Figura 48-2. Ejemplos de dilerent.es tipos de cultivos de tejidos suministrados por fir- realizarse en paralelo, de forma habitual, controles positivos y negativos. La
mas comerciales. En los sistemas tradicionales en tubos, la monocapa de células mayor parte de los procedimientos basados en el EIA están adaptados para el
crece en uno de los lados de los mismos, y son transportados e incubados en la análisis de muestras individuales, e incluyen tanto el control positivo como el
orientación correcta (horizonlalmente) para que el medio de mantenimiento esté
negativo incorporados directamente en las placas de un solo uso. Los proce-
siempre en contacto con la lámina de células. En los tubos shell-vial, la monocapa de
dimientos automatizados de EIA para el análisis masivo combinan en un
células está adherida sobre un cubreobjetos de vidrio que se encuentra en el fondo
del recipiente, junto con un volumen de 2 mi de medio de mantenimiento, y se alma- mismo equipo todos los componentes necesarios para el lavado, lectura
cenan, transportan e incuban en posición vertical. espectrofotométrica y procesado de datos. Los controles se realizan indivi-
dualmente para cada ensayo, y la interpretación de los datos de la lectura se
lleva a cabo de acuerdo con un valor de corte establecido previamente.
algún otro tipo de manifestación característica (hemaglutinación, hemoadsor-
ción, interferencia). Los ECP pueden aparecer entre uno y tres días (en el caso Los métodos de hibridación y amplificación detectan a los virus mediante el
del VHS), o pueden tardar de 5 a 20 días en ser detectados (VRS, virus de la reconocimiento de secuencias específicas del genoma de ADN o ARN vírico.
varicela-zóster [VVZ], CMV); por tanto, la mayor parte de cultivos deben ser La hibridación ir) situ (HIS) es una técnica directa utilizada en patología quirúr-
incubados dos semanas, o incluso más. En la técnica que implica la utilización gica para identificar, mediante sondas específicas, el virus del papiloma
de cultivos celulares en shell-vials, la lámina de células descansa sobre un humano (VPH), CMV, VHS y parvovirus B19: la especificidad de la misma es
cubreobjetos redondo, que se coloca en el shell-vial con la monocapa orientada excelente, aunque su sensibilidad por debajo de los valores óptimos limita, en
hacia arriba. El espécimen es inoculado en el recipiente, que es seguidamente gran medida, su aplicación en clínica. Los métodos de amplificación han incre-
centrifugado para favorecer la adhesión de los virus a las células. Tras un corto mentado la sensibilidad del diagnóstico molecular más allá de los valores que,
período de incubación, generalmente de uno a tres días, la monocapa de célu- en este contexto, tienen los ensayos para la detección de antígenos y las téc-
las es analizada mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de nicas de cultivo, mediante la amplificación exponencial de la secuencia oligo-
antígenos virales específicos (Gleaves, 1985). El cultivo en shell-vials es un pro- nucleotídica del virus elegida como diana (PCR y desplazamiento de cadena
cedimiento idóneo para identificar un único tipo de virus (VHS) o un número limi- [SD]), la amplificación de la señal quimioluminiscente (captura de híbridos [HC]
tado de virus (VRS y virus de la gripe), y para agentes de crecimiento lento (CMV y ADN ramificado [bADN]), o por amplificación de la sonda o la señal (reacción
y VVZ). El material procedente de las lesiones vesiculares causadas por el VHS en cadena de la ligasa [LCR] e Invader). La amplificación por las técnicas de
es un candidato excelente para intentar el aislamiento del virus mediante la téc- PCR y bADN se ha convertido en el estándar de elección para la monitoriza-
nica del cultivo en shell-vials, la sensibilidad roza el 100% y el tiempo de espera ción cuantitativa del VIH y el virus de la hepatitis C (VHC). La PCR es el
para los cultivos negativos se reduce de siete días a tan sólo uno. Los shell-vials método preferido por su gran sensibilidad para el diagnóstico de la meningitis
tienen una eficiencia comparable o incluso superior a la del método en tubo para por enterovirus y la encefalitis por VHS (Tang, 1998: Read, 1999); la detección
la recuperación de CMV a partir de orina, aunque se recomienda realizar un cul- del virus Epstein-Barr (VEB) en el liquido cefalorraquídeo mediante PCR es un
tivo suplementario en tubo a partir de una muestra de sangre periférica para diagnóstico positivo de linfoma del sistema nervioso central (SNC) en pacien-
aumentar las posibilidades de aislamiento de este tipo de virus. En la Tabla 48- tes con sida. La PCR cuantitativa de CMV en fluido bronquioalveolar o en san-
4 se indican diversas situaciones en las que la utilización de los cultivos en shell- gre permite predecir una neumonía viral en pacientes sometidos a un tras-
vials está recomendada para la detección de virus. plante de médula ósea. La automatización de los métodos de amplificación,
con la incorporación de estándares internos para detectar inhibición y de pro-
tocolos experimentales configurados para evitar la contaminación cruzada de
amplicones, ha acortado los plazos de obtención de resultados y reducido los
errores de interpretación debidos a los falsos positivos y negativos. Aunque
todavía no hay una gran cantidad de reactivos disponibles en el mercado, hay
varios sistemas para la identificación de virus patógenos comunes basados en
sondas génicas que están actualmente en fase de desarrollo.

La visualización directa de los viriones mediante microscopía electrónica

(ME), utilizando tinción negativa con ácido fosfotúngstico o fijación con osmio
seguida de tinción con acetato de uranilo. es un método empleado para detectar
aquellos virus que no crecen en las lineas celulares estándar o para una demos-
tración rápida de la presencia de virus en una muestra. La ME ha sido una téc-
nica de gran ayuda, particularmente para identificar el agente causal en casos de
gastroenteritis vírica: rotavirus. adenovirus intestinales, virus Norwalk, astrovirus
y calicivirus se multiplican muy pobremente, o no lo hacen en absoluto, en los
cultivos de células en monocapa. pero tienen características ultraestructurales
distintivas que permiten su identificación al microscopio electrónico.
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS 1049

Tabla 48-5 Aplicaciones de la serologia para el diagnóstico de especificas están presentes en sangre generalmente durante la primera semana
las infecciones virales de la infección primaria, para hacerse después prácticamente mdetectables
entre el pnmer y tercer mes siguientes: el enzimoínmunoensayo es más sensi-
Aplicación Virus
ble y es capaz de detectar IgM persistentes aproximadamente durante el doble
Demoslració inmunidad IgG VHA, VHB rubéola, sarampión, de tiempo del que es posible hacerlo con la inmunofluorescencia. Se puede
preexistente paperas. WZ incrementar la sensiblidad y especificidad de los ensayos para detectar IgM eli-
Método diagnóstico pretendo IgM VHA, VHB. VEB. sarampión. minando del suero el factor reumatoide y las IgG, para evitar la competición de
por su relación coste/eficacia
paperas, rubéola, parvovirus Bt9. estas últimas con las IgM con los antigenos virales. Las IgG especificas apare-
arbovirus cen entre una y dos semanas después de la infección primaria, y su titulo va
IgG: VIH. VHB, VHB. VHC, VLHT aumentando hasta alcanzar un pico entre las cuatro y las ocho semanas para
Diagnóstico de
Síndrome de Revé (influenza, WZ) comenzar a bajar a partir de este momento, aunque pueden ser detectadas oe
poslmlecciOn PEES (sarampión) forma indefinida. La respuesta inmune secundana que aparece como conse-
Control de la infecí IgG: VHB. VHC. VIH. CMV.
hemoderivados cuencia de una reinfección o reactivación vírica da lugar a un perfil serológico
VLTH diferente: las IgM pueden aparecer transitonamente. con un titulo baio, mientras
VHA = virus de la hepatilis A: VHB = virus de la hepatitis B: VHC = virus de la
hepatitis C VEB = virus de Epstein-Barr; VIH = virus de la inmunodeliciencia que el título de IgG aumenta muy rápidamente, alcanzando el peo a unas con-
humana VLTH = virus de la leucemia humana de células T, PEES = panencela centraciones más altas que las observadas durante la respuesta primana Por
lilis esclerosante subaguda.
supuesto, estos son patrones o perfiles generales: la intensidad, especificidad y
Pora ver el signilicado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 48-3 y 48 4
tipo de respuesta (clase de mmunoglobulina producida) están condicionados por
el tipo del virus infectivo, el sitio donde se ha producido la infección y la situación
Serologia vírica inmunológíca del paciente. En las infecciones congémtas, los anticuerpos (IgG)
matemos pasan a la circulación fetal a través de la placenta, aunque cualquier
El diagnóstico serológico de las infecciones virales representa una alternativa
otra clase de mmunoglobulinas (IgM, IgA o IgE) presentes en la sangre del leto,
atractiva, ya que las muestras de suero pueden obtenerse, transportarse y alma-
del cordón umbilical o del recién nacido, son producidas por el feto o por el neo-
cenarse con gran facilidad. La serologia viral tiene dos ámbitos de aplicación
nato en respuesta a una infección primana perinatal
principales: diagnosticar una infección reciente y poner de manifiesto la existen-
cia de inmunidad previa. El diagnostico de infección actual o reciente requiere la La serologia puede ser utilizada como un respaldo a los métodos de detec-
detección de IgM especificas frente al virus en una muestra de suero obtenida ción directa y de cultivo de virus, especialmente en el caso de que la calidad del
durante la lase aguda de la infección o durante la observación de un incremento espécimen o las condiciones de transporte del mismo no hayan sido las más
de cuatro veces o superior en título de IgG específicas entre dos muestras de adecuadas. Si durante el primer examen del paciente no ha existido nada que
suero, una tomada durante la fase aguda y otra en la de convalecencia. Las IgM hiciese sospechar la existencia de una infección vírica, la serologia puede ser el

Tabla 48-6 Obtención de muestras para el diagnóstico de los s í n d r o m e s virales c o m u n e s

E s p é c i m e n preferido
Validación de
Síndrome Virus y condiciones Pruebas más útiles
de transporte los e s p e c í m e n e s

Bronquiolitis/bronquitis VRS. parainfluenza SNF LBA transportar Células columnares o DFA. EIA cultivo
1,3, adenovirus. inmediatamente en hielo macrófagos alveolares
influenza A y B
Gripe Influenza A y B SNF o hisopado de garganta en Células columnares o DFA. EIA, cultivo
MTV. esputo. LBA. transportar macrólagos alveolares
inmediatamente en hielo
Neumonía VRS. parainfluenza 3, SNF. LBA. hisopado de garganta Células columnares o DFA, EIA. cultivo
influenza A y B, en MTV: transportar macrófagos alveolares
adenovirus inmediatamente en hielo
Conjuntivitis VHS. adenovirus. Hisopados o exfoliados de la Células epiteliales DFA, EIA. cultivo
clamidias. enterovirus. conjuntiva en MTV. transportar
WZ. sarampión inmediatamente en hielo
Exantema vesicular VHS. WZ. enterovirus Fluido de vesículas/células en MTV, Células epiteliales DFA cultivo
frotis secados al aire, transportar
inmediatamente en hielo
Infección genital VHS Fluido de vesículas/células en Células epiteliales Cultivo. DFA
MTV, frotis secados al aire;
transportar cuanto antes
Meningitis Enterovirus. VHS. paperas LCR", hisopado de garganta, heces. PCR. cultivo
WZ. adenovirus. transportar inmediatamente
VLCM, sarampión
Encefalitis VHS, arbovirus, Biopsia de tejido cerebral fresco. PCR. cultivo. DFA.
Enterovirus, rabia LCR. suero (arbovirus); serologia
transportar inmediatamente
Enteritis Rotavirus, adenovirus Heces frescas (heces, pañales El hisopo debe estar EIA, látex. ME
(40.41), calicivirus. o hisopados rectales), cubierto más de un
Coronavirus, asirovirus. transportar cuanto antes 75% con las heces
virus Norwalk
Infección viral CMV, VHS. WZ, Orina (en hielo), sangre (a temperatura Cultivo, prueba cuantitativa
diseminada adenovirus ambiente), LBA, biopsia pulmonar para CMV. PCR
(en hielo); transportar inmediatamente cuantitativa (en
investigación)
SNF = secreción nasofaríngea: LBA = lavado bronquioalveolar. DFA = fluorescencia directa con anticuerpos; EIA = enzimoínmunoensayo; MTV = medio de transpone
para virus; VLCM = virus de la linlocoriomenmgitis LCR = liquido cefalorraquídeo. PCR = reacción en cadena de la polimeíasa; ME = microscopía electrónica
Para ver el signilicado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 4 8 - 3 y 4 8 - 4
'Los cultivos a partir de muestras de LCR pueden ser positivas en el caso de neonatos, pero raramente lo son en el caso de adultos con encefalitis causada por el
VHS.
 1050 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
único procedimiento diagnóstico disponible, una vez se haya descartado el
empleo de otras alternativas analíticas como son el cultivo y la detección de anti-
genos o ácidos nucleicos vírales. La serología también puede ayudar a clarificar
los resultados obtenidos mediante la técnica del cultivo; por ejemplo, el aisla-
miento de enterovirus a partir de heces en un paciente con encefalitis cobra una
importancia mayor si el título de anticuerpos frente a estos virus aumenta. La
serología es la elección lógica para el diagnóstico de infecciones causadas por
virus que requieren el empleo de métodos complejos para su aislamiento (VEB.
VIH, herpesvirus humanos [HVH-6). o inoculación en animales (arbovirus. algu-
nos virus Coxsackie A), o de aquellos cuya manipulación implica riesgos biológi-
cos graves (VIH, arbovirus). Para algunos tipos de infecciones, la serología es
una alternativa más rápida y barata; tanto el sarampión como las paperas pue-
den diagnosticarse mediante el aislamiento del virus responsable, aunque las
IgM específicas están presentes en el suero del paciente, a partir del tercer día
desde el comienzo de la enfermedad, y su detección requiere menos tiempo y
expenencia que el diagnóstico mediante cultivo. Los virus pueden incluso no ser
detectados cuando comienzan a manifestarse los síntomas de la infección: por
ejemplo, los arbovirus pueden desaparecer, a menudo, del líquido cefalorraquí-
deo en el momento en el que el paciente desarrolla la encefalitis, lo que hace que
la serología sea el método diagnóstico de elección en este caso. Frecuente-
mente, en las infecciones con un pródromo prolongado puede existir un título
detectable de anticuerpos cuando se manifiestan los síntomas (VEB y mononu-
cleosis). Las situaciones clínicas específicas para el diagnóstico serológico están
resumidas en la Tabla 48-5.
Obtención y transporte de las muestras
El éxito en cualquier diagnóstico de infección viral depende de que la
muestra sea recogida y transportada en condiciones adecuadas. El laborato-
rio debe establecer unas directrices realistas para una óptima manipulación
del espécimen y una política de rechazo de muestras inapropiadas. y hacer
circular esta información entre el personal médico y las unidades de enfer-
mería (Tabla 48-6). Las muestras para cultivo y detección de antígenos y áci-
dos nucleicos virales deben obtenerse durante la fase aguda de la enferme-
dad, cuando la liberación de los virus es mayor; la recuperación de los virus
es esporádica y poco fiable durante la fase de convalecencia.
Un medio de transporte para virus (MTV) contiene una solución salina tam-
ponada. un estabilizador proteico, un indicador de pH y antibióticos para inhibir la patología que sufre el paciente. El laboratorio debe solicitar información
el crecimiento indeseado de bacterias y hongos contaminantes. Se han des-
arrollado medios de transporte muy versátiles, que sirven tanto para virus como
para clamidias y micoplasmas (M4. Flextrans): la mayor parte de formulaciones
pueden conseguir estabilizar a los virus durante 24 horas como mucho (Johnson. que sea más rápida y eficiente y rinda los mejores resultados. En este capi-
1990). Todas las muestras, excepto las de sangre, deben transportarse y alma-
cenarse a 4'C hasta el momento de proceder a su análisis. A veces puede ser
inevitable tener que transportar el espécimen a temperatura ambiente, aunque el
clínico debe ser consciente de los efectos negativos que esta circunstancia
puede tener en la recuperación del virus. Las muestras de sangre para el aisla-
miento de virus deben mantenerse a temperatura ambiente todo el tiempo. Los
cultivos deben realizarse el mismo día en el que las muestras lleguen al labora-
tono, preferiblemente dentro de las 36 horas siguientes al momento de la reco-
gida; al menos debe programarse una sesión de inoculación de cultivos durante
S Infecciones víricas en el huésped inmunocomprometido.
los fines de semana. Las muestras pueden congelarse a -70 C sólo como último
recurso; las muestras de sangre y orina y los especímenes respiratorios para el
aislamiento de CMV y VRS. respectivamente, no deben congelarse.
Equipos y material
La mayor parte de los equipos utilizados en virología son relativamente bara-
tos y, a menudo, están disponibles en las secciones de microbiología e inmuno-
logia de los laboratorios. Para la inoculación de los cultivos, y siempre que los
mismos vayan a ser manipulados, debe utilizarse una cabina de flujo laminar de
clase II para proteger al personal técnico de los aerosoles infectivos y reducir la
contaminación accidental de los cultivos. También debe encontrarse disponible
una centrifuga adaptada para acomodar los shell-vials. Asimismo son necesarios
incubadores para mantener las lineas celulares no inoculadas e incubar los cul-
tivos inoculados; los incubadores deben estar equipados, a ser posible, con un
dispositivo que permita instalar un tambor giratono en su interior. Finalmente, es
necesario disponer de un microscopio invertido con contraste de fases para iden-
tificar los ECP en las monocapas de los cultivos celulares, un microscopio equi-
pado con epilluorescencia para los ensayos de DFA e IFA y espacio de almace-
a
namiento a -70 C y a -20 C. para reactivos y especímenes
Todos los equipos y productos esenciales para la identificación de los virus
más comunes están disponibles en el mercado. Los cultivos celulares son ali-
mentados con una solución salina balanceada (SSB; puede utilizarse tanto la
Hanks como la de Earle). a la que se añaden sustancias tampón. suero y una
mezcla nutritiva como el medio mínimo esencial (MME) de Eagle. El MME de
Eagle es una mezcla definida de aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, cofac-
tores y el resto de requerimientos nutricionales que necesitan las células en la
monocapa. El suero bovino fetal (SBF) es el suplemento nutricional y hormonal
que con mayor frecuencia se añade al MME; se añade entre un 5% y un 10% de
SBF en el medio de crecimiento para el cultivo de tejidos y un 2% en el medio
de mantenimiento. Los mayores problemas del SBF son la variabilidad que pre-
senta de lote a lote y su alto coste: como alternativa más económica al SBF se
puede utilizar suero de ternera enriquecido (OmniSerum), que además tiene una
composición mucho mas estable y funciona aceptablemente para cultivar las
líneas celulares utilizadas para el aislamiento del VHS y otros tipos de virus. En
el laboratorio también debe existir una reserva de tripsina (solución al 0.25%).
tampón fosfato salino (PBS). soluciones de glutamina y bicarbonato de sodio,
medio de transporte para virus, mezclas de antibióticos para descontaminar los
especímenes y ácido fosfotúngstico al 2% para microscopía electrónica.
Los laboratorios que toman a su cargo por primera vez los sen/icios de diag-
nóstico de infecciones virales deberían comenzar su actividad con pruebas
sencillas, como el cultivo de VHS y la detección de antígenos virales. Durante
los meses de invierno se pueden ir añadiendo otros protocolos analíticos para
el virus de la gripe. VRS y rotavirus. La identificación de CMV es prioritaria en
aquellos hospitales en donde existen pacientes inmunodeprimidos. En principio,
puede considerarse el aislamiento de enterovirus durante el verano y el otoño.
A medida que la experiencia del personal técnico vaya incrementándose se
pueden ir incorporando las técnicas necesarias para el cultivo y detección de
antígenos de VVZ, adenovirus y virus de la parainfluenza.
Síndromes clínicos infecciosos causados por virus
Un enfoque habitual en el diagnóstico de laboratorio consiste en separar
las enfermedades virales de acuerdo con síndromes clínicos específicos,
aconsejando al médico que asocie un grupo, lógico pero limitado, de virus con
específica sobre el paciente (datos demográficos), el diagnóstico clínico y los
posibles agentes virales asociados a la patología, con objeto de que el trabajo
analítico pueda racionalizarse y enfocarse hacia la utilización de la prueba
tulo se analizarán las siguientes enfermedades virales:
Infecciones herpéticas mucocutaneas.
Síndromes respiratorios en niños y adultos.
Mononucleosis infecciosa.
Infecciones congénitas y neonatales.
Infecciones virales del sistema nervioso central.
Exantemas e infecciones intestinales en niños.
Hepatitis vírica e infección por VIH
INFECCIONES HERPÉTICAS MUCOCUTANEAS
La familia Herpesviridae contiene dos virus que tradicionalmente producen
infecciones en la piel y en las membranas mucosas del cuerpo: el VHS y el
VVZ. Ambas infecciones son muy comunes, y aunque no ponen en peligro la
vida, el hecho de que el tratamiento de las mismas con aciclovir sea muy efec-
tivo ha incrementado la demanda de diagnósticos rápidos, especialmente en
el caso del VHS (Corey. 2000). El VVZ se describirá más adelante en el apar-
tado de Exantemas virales.
El VHS es ubicuo e infecta a lodos los grupos raciales humanos a nivel mun-
dial. Las dos cepas del VHS. el serotipo 1 y el serotipo 2. comparten muchas
características biológicas y moleculares e infectan preferentemente a las célu-
las epiteliales escamosas; sin embargo, cada una de ellas tiene un perfil anti-
génico distinto y una epidemiología un tanto diferente. El VHS1 es altamente
infeccioso y se transmite por la saliva para infectar la boca, la faringe, los labios
y la piel de la cara. Las lesiones pueden aparecer, ocasionalmente, en la piel
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS 1051

Figura 48-3. Esquema del protocolo experimental para el cultivo del VHS mediante el método tradicional en tubo (izquierda) y el sistema shellvial (derecha).

expuesta de los combatientes de lucha libre o en las manos del personal aparecen 500.000 casos nuevos. La recuperación del VHS2 a partir de niños es
médico tras un contacto directo con saliva infectada. La mayor parte de las muy rara y generalmente suscita la sospecha de que pueda ser consecuencia
infecciones por VHS1 se producen antes de la pubertad, especialmente en indi- de un abuso sexual; sin embargo, con el comienzo de la adolescencia la sero-
viduos pertenecientes a grupos con un nivel socioeconómico baio. A menudo la prevalencia aumenta de forma constante hasta la madurez, siendo proporcional
infección primaria es asintomática. aunque una minoría significativa de infecta- al número de contactos o compañeros sexuales (Fleming. 1997). La prevalenoa
dos tienen fiebre y desarrollan una gingivoeslomatitis dolorosa (Kuzushima. del VHS2 en Estados Unidos es del 22%: en individuos de 13 o más años, la
1991). El VHS1 infecta las células del ectodermo y. a medida que el virus se seropositividad en relación con la edad ha aumentado un 30% desde 1980. El
replica en el núcleo, las células pierden su integridad citoplasmática. pierden
líquido y se separan unas de otras, formando una vesícula. Las bacterias de la
microbiota de la piel y las mucosas transforman las vesículas en pústulas, que
terminan por ulcerarse cuando las células epiteliales dañadas se lisan por com-
pleto. Por lo general, las lesiones herpéticas curan sin dejar cicatriz a medida
que se van regenerando las capas de la epidermis.
La respuesta inmune trente a la infección por VHS1 implica la actuación de
las células natural killer (NK), linlocitos T citotóxicos. y la producción de anti-
cuerpos neutralizantes. Sin embargo, ni los mecanismos de la inmunidad humo-
ral y celular son capaces de impedir la migración del VHS a lo largo de los ner-
vios sensoriales hasta los ganglios trigéminos, donde persiste por tiempo
indefinido, en un estado durmiente, en el núcleo de las neuronas (Straus. 19891.
Esporádicamente, el VHS se reactiva y viaja de vuelta a través de los axones
neurosensonales hasta llegar a la boca y la piel, donde vuelve a replicarse otra
vez en el epitelio escamoso. La mayor parte de las infecciones recurrentes son
asinlomáticas o producen vesículas que sólo tienen importancia desde el punto
de vista estético. Sin embargo, en los casos en los que existe un problema
grave en los mecanismos de la inmunidad celular (enfermos de sida o pacien-
tes trasplantados), las inlecciones recurrentes por reactivación del virus pueden
ser graves e incluso látales. La encefalitis es otra forma gravísima, aunque poco Figura 48-4. Cultivo en monocapa de células de riñon de conejo, que presentan ECP
frecuente, de infección por VHS1. Estas dos complicaciones se describirán más debidos a la multiplicación del VHS. Las células de riñon de mono tienen, habitual-
adelante, en otras secciones de este capitulo. mente, una forma poligonal y se encajan lateralmente unas con otras para formar un
mosaico celular continuo. Las células infectadas por el VHS en este cultivo de tres días
La infección por VHS2 tiene lugar a nivel del epitelio escamoso de la mucosa exhiben una forma redondeada e hinchada, y varias células adyacentes se han fusio-
del aparato genital, se transmite por contacto sexual directo y se ha convertido nado para formar sincitios celulares gigantes. Las zonas vacias en la preparación
en un grave problema de salud pública en los últimos 30 años Millones de ame- corresponder a aquellas áreas de la monocapa del cultivo en donde las células infec-
ricanos se encuentran infectados en la actualidad, y se estima que cada año tadas han muerto y se han lisado (aumento: x 200: microscopía de contraste de fases).
 1052 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 48-5. Monocapa de fibroblastos MRC-5 en s/iefl-wálque muestra la presencia
de antigenos del VHS en el citoplasma y núcleo de las células tras 16 horas de incu-
bación. El aspecto de la monocapa de células es normal, y los ECP característicos
aún no son detectables (aumento: x 250: tinción DFA para antígenos del VHS)
VHS2 produce un patrón de infección primaria y recurrente, con lesiones muco-
cutáneas semejantes a las que se observan con el VHS1. El virus se encuentra
latente en los ganglios neurales sacros, y la reactivación se produce con una fre-
cuencia del doble, al menos, de la observada en el caso del VHS1.
Aislamiento del virus del herpes simple
mediante cultivo celular
Los especímenes tomados con una torunda y depositados en medio de
transporte (MTV) con antibióticos pueden conservarse entre 12 y 24 horas a
temperatura ambiente (22"C), con una reducción mínima en la viabilidad del
virus. Los especímenes deben sembrarse en los cultivos celulares en el
momento que llegan al laboratorio, aunque pueden almacenarse en refrigera-
ción durante una noche, si así fuese necesario. El aislamiento del VHS es
todavía el mejor test de diagnóstico y es más sensible que cualquier otro
método basado en la detección de antígenos virales o hibridación con sondas
de ácidos nucleicos específicas; sin embargo, las técnicas de amplificación de
ácidos nucleicos son claramente superiores al cultivo. El VHS crece excepcio-
nalmente bien en una amplia variedad de líneas celulares: los fibroblastos
humanos (WI-38. MRC-5. prepucio) son una de las alternativas más popula-
res, aunque otras líneas celulares como HeLa, Vero y HEp-2, así como culti-
vos celulares de rabdomiosarcoma (RD), pulmón de conejo y pulmón de visón,
también permiten un buen crecimiento del virus. Los cultivos primarios de riñon
de mono (PMK) no son adecuados y. en consecuencia, no deben utilizarse.
Generalmente se inoculan dos tubos con distintas líneas celulares (uno con RK
y otro con MRC-5): el procedimiento se resume en la Figura 48-3.
El VHS se replica a gran velocidad y los ECP aparecen entre el segundo y ter-
cer día, después de la inoculación, especialmente si los tubos son incubados en
Tabla 48-7 Sensibilidad (%) de las técnicas de aislamiento
mediante cultivo, preparación de Tzanck (frotis teñidos
por el método de Giemsa), inmunofluorescencia directa
( D F A ) y tinción con inmunoperoxidasa (IP) a partir de
las lesiones del herpes simple
Estadio Sensibilidad (%) del m é t o d o
d e la
lesión Cultivo Tzanck DFA IP
Vesícula 70-95 67 76-87 76
Pústula 67-83 55 58-67 75
Úlcera 32-67 — 30-38 55
Costra 17 10
Los valores mostrados son una combinación de los indicados por Pindak (1986).
Langenberg (1988) y Mavromoustakis (1988) en sus respectivos trabajos
un tambor giratorio (Mavromoustakis. 1988). Aquellos cultivos inoculados a par-
tir de muestras de lesiones genitales, en los que no es posible detectar los ECP
característicos del VHS tras cinco/siete días de incubación, pueden considerarse
negativos: debido a que también pueden recuperarse otros virus (p. ej., VVZ.
adenovirus. enterovirus) a partir de ciertas localizaciones anatómicas no relacio-
nadas con el aparato genital, como la boca, la córnea o el cerebro, estos cultivos
deben incubarse durante dos semanas, al menos. Las células individuales infec-
tadas por el VHS se hinchan y adquieren forma redondeada, y el daño celular se
extiende rápidamente por toda la monocapa del cultivo, El VHS2 induce fre-
cuentemente la formación de sincitios. debido a la coalescencia de las membra-
nas plasmáticas de las células infectadas (Fig. 48-4). Este ECP es característico,
aunque no el único, del VHS: un técnico con poca expenencia puede interpretar
incorrectamente como ECP provocados por VHS las alteraciones o cambios
causados por otros virus, por toxinas bacterianas o incluso por tricomonas. por
lo que se recomienda confirmar los resultados de la observación con una tinción
DFA. Para ello, la monocapa de células es retirada, transferida a un portaobje-
tos de vidrio, lijada con acetona y seguidamente teñida con anticuerpos mono-
clónales o policlonales frente al VHS (Lipson. 1991). Los anticuerpos monoclo-
nales específicos de tipo pueden distinguir entre VHS1 y VHS2 mediante el test
DFA, aunque el tiempo y los reactivos adicionales necesarios para ejecutar la
prueba hacen que se incremente el coste de la misma, añadiendo, por lo gene-
ral, muy poca información a los datos del examen clínico. El serotipado debe
reservarse para aquellos casos en los que existan discrepancias de criterio entre
médicos o manifestaciones clínicas ambiguas.
La gran cantidad de peticiones de cultivo para VHS conducen al empleo de la
técnica de cultivo en shell-vials. mediante la que es posible detectar los antíge-
nos virales en la monocapa de células por medio del test DFA tras un día de incu-
bación solamente (Gleaves, 1985) (Fig. 48-5). La detección del VHS en los cul-
tivos de los shell-vials empleando enzimoinmunoensayo o hibridación in situ, es
una alternativa igualmente sensible y especifica (Espy. 1988; Patel, 1991;
Michalski, 1986). También se han utilizado, aunque con resultados variables,
algunas adaptaciones del método de cultivo favorecido por centrifugación que
utilizan placas de microtitulación en lugar de tubos (Woods, 1988; Ziegler, 1988)
Detección directa del virus del herpes simple
La preparación de Tzanck consiste en realizar un frotis directo del conte-
nido de una vesícula herpértica. que se tiñe por el método de Giemsa para
revelar la presencia de células gigantes epiteliales multinucleadas (sincitios) y
de inclusiones intranucleares. Estos hallazgos no son específicos de una infec-
ción por VHS; en este contexto, también se han visualizado cambios celulares
idénticos, consecuencia de la infección por VVZ (en vesículas de la varicela y
del herpes zóster). La preparación de Tzanck es positiva en el 67% de las
lesiones herpéticas, cuando éstas se encuentran en fase de vesícula; a pesar
de la rapidez con la que se ejecuta este procedimiento, la baja sensibilidad del
mismo limita su utilidad práctica.
La inmunotinción de los frotis directos con anticuerpos frente al VHS, marca-
dos con fluoresceína o peroxidasa, elimina la posibilidad de confusión con el
WZ y permite la detección de antígenos virales incluso en ausencia de sinci-
tios y en células que no muestran, todavía, las inclusiones nucleares. Sin
embargo, cuando se compara con el método del cultivo, el test DFA tiene, como
mínimo, entre un 20% y un 30% de error por falsos negativos (Lafferty, 1987;
Moseley, 1981) (Tabla 48-7). Todos los resultados negativos en el test de detec-
ción directa deben ser considerados potencialmente como falsos negativos, que
deben ser validados mediante cultivos realizados en paralelo. Por otro lado, el
diagnóstico por PCR del herpes mucocutáneo genital tiene entre un 20% y un
30% más de sensibilidad comparado con el método del cultivo (Slomka, 1998).
La PCR es ocho veces más sensible que el cultivo para la identificación de
infecciones asintómaticas (Cone, 1994). La amplificación de señal mediante
captura de híbridos para detectar el ADN del VHS también es superior al cultivo
como método diagnóstico (Cullen. 1997). En su formato de ensayo múltiple
para la evaluación de la enfermedad genital ulcerosa, la PCR mostró un 100%
de sensibilidad para la detección del VHS. asi como una mejora sustancial en
el diagnóstico del chancroide y de la sífilis primaria (Orle, 1996).
Diagnóstico serológico
Debido a que existe una homología antigénica considerable entre los seroti-
pos 1 y 2 del VHS, es necesano utilizar antigenos purificados que sean especí-
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
VRS
ticos de serotipo en los ensayos serológicos. Utilizando antígenos selectos de la
envoltura de ambos serotipos del VHS y los métodos de ELISA o de transferen-
cia electrolorélica {Western ¡mmunoblotting) se puede evitar la detección de anti-
cuerpos con reactividad cruzada (Ahsley, 1988; Lee. 1986). Hasta el momento,
sólo existe un sistema comercial de ELISA que ha mostrado una sensibilidad,
especificidad y capacidad discriminatona aceptables (Ahsley. 1998). Sin
embargo, un estudio longitudinal en adultos jóvenes seropositivos puso de mani-
fiesto que la pérdida de reactividad era un comportamiento habitual, tanto en los
ensayos comerciales como en los métodos de laboratorio (Schmid, 1999). El
error debido a los falsos negativos conduce a una subestimación de los datos
sobre seroprevalencia y limita, también, la utilidad clínica práctica del serodiag-
nóstico. En cualquier caso, una vez que estén disponibles los métodos que per-
mitan llevar a cabo una serotipificación precisa, su aplicación más importante
será la determinación de anticuerpos específicos frente al VHS2 en mujeres
embarazadas para establecer el riesgo de transmisión neonatal (Brown. 1991).
INFECCIONES VÍRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO
Cada año se producen en Estados Unidos varios millones de visitas ambu-
latorias y hospitalizaciones debido a las infecciones del tracto respiratorio, que
en su mayoría están causadas por virus. Las infecciones van desde resfriados
irrelevantes hasta patologías graves como la laringotraqueobronquitis (crup), la
bronquiolitis y la neumonía. Los niños y adultos sanos tienen el nesgo poten-
cial de enfermar durante las epidemias anuales de crup, bronquiolitis y gripe y
la morbilidad y mortalidad asociadas a estas infecciones pueden ser drásticas.
El brote de gripe durante 1998-1999 en Estados Unidos tuvo sólo una grave-
dad moderada, pero el porcentaje de muertes debidas a la neumonía asociada
a la gripe alcanzó el 8,8% (Update. 1999)
1053
Resfriados y faringitis son tratados clinicamente sin necesidad de realizar
pruebas de laboratorio; sin embargo, el número de peticiones de ensayos
para la determinación de antígenos o de cultivos para el diagnóstico de las
infecciones virales del tracto respiratorio inferior puede sobrepasar fácilmente
el de las pruebas equivalentes para la detección del VHS (Tabla 48-1 ). El virus
de la gripe y el VRS son los patógenos más importantes en adultos: en niños
pequeños, la mayor incidencia corresponde al VRS, virus de la parainfluenza,
virus de la gripe y adenovirus.
Gripe (Influenza)
Los virus de la gripe A y B causan anualmente, durante los meses fríos, bro-
tes de enfermedades febriles, agudas, del tracto respiratorio superior e inferior,
que están acompañadas de una serie de manifestaciones sistémicas. Por lo
general, la influenza A es más común y produce una enfermedad más grave que
el tipo B. Debido a que los antígenos virales experimentan cambios determina-
dos por mutaciones puntuales o por recombinación de fragmentos de ARN vírico
y humano, los anticuerpos producidos durante episodios anteriores de gripe pro-
porcionan una protección escasa durante brotes subsiguientes de la infección.
La gripe es altamente contagiosa, y se extiende de persona a persona a través
de aerosoles o por contacto con las manos contaminadas (Troanor. 2000).
El virus de la gripe se multiplica rápidamente en las células columnares cilia-
das de la fannge y el árbol traqueobronquial. La fiebre suele manifestarse de
manera brusca: la necrosis del epitelio respiratorio causada por el virus provoca
dolor de garganta y tos, aunque otras manifestaciones asociadas, como mial-
gias, dolor de cabeza y un estado generalizado de debilidad, son, por lo gene-
ral, más importantes y graves que los problemas respiratonos. Si no hay com-
plicaciones, la enfermedad remite en cuatro o cinco días. Cada año se
producen aproximadamente 100.000 hospitalizaciones y 20.000 muertes en
 1054 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MEDICA
Estados Unidos como consecuencia de la gripe. En un porcentaje pequeño de
afectados, la necrosis viral aguda se extiende hasta las células que recubren los
bronquios, causando una forma grave de neumonía potencialmente fatal (Yel-
dandi. 1994). Sin embargo, la mayor parte de fallecimientos relacionados con la
gripe están provocados por una neumonía secundaria de origen bacteriano,
que aparece como consecuencia de la colonización del epitelio de la mucosa
respiratoria dañado por el virus, por Staphylococcus aureus, Streplococcus
pneumoniae, Haemophilus inlluenzae y otras bacterias presentes en la oróla-
ringe. La infección bacteriana es más frecuente en pacientes con una enferme-
dad pulmonar crónica o fallo congestivo cardíaco preexistente. Muy raramente
aparecen otras complicaciones asociadas a la gripe, como miocarditis, menin-
goencefahtis, síndrome de Reye y síndrome de Guillain-Barré.
La gripe se diagnostica mejor durante los dos o tres primeros días de la
enfermedad, cuando se produce una máxima liberación de virus. El cultivo
representa el método diagnóstico más sensible, siendo los especímenes más
adecuados para este fin un aspirado de secreciones nasofaríngeas (SNF),
esputo obtenido mediante expectoración y material recogido de la garganta
con hisopo. El cultivo en shell-vials es una alternativa que ofrece una exce-
lente sensibilidad y permite obtener los resultados tras un periodo de incuba-
ción de uno o dos días (Beekmann, 1996; Leonardi, 1994), lo que puede afec-
tar positivamente al tratamiento del paciente y a la prevención de los
contagios por contacto. El cultivo medíanle las tradicionales monocapas celu-
lares puede tardar entre dos y siete días en ofrecer resultados.
La detección de antígenos del virus mediante DFA es un procedimiento útil
para realizar un diagnóstico rápido; el aspirado de SNF contiene abundantes
células columnares epiteliales infectadas por el virus, por lo que representa el
tipo de espécimen preferido para este fin. La sensibilidad del ensayo varia
entre un 77% y un 93% para la detección del virus de la influenza A y entre
un 70% y un 80% para la influenza B; la especificidad es superior al 95% y
está fuertemente condicionada por la experiencia del observador y la calidad
de la muestra. El material recogido de la garganta con hisopo contiene pocas
células columnares y, por tanto, no es adecuado para la tinción DFA. Los enzi-
moinmunoensayos comerciales tienen una buena sensibilidad para detectar
antigenos virales, si se utilizan con aspirados de SNF como muestra; la sen-
sibilidad es menor si el espécimen utilizado es el material recogido con hisopo
de la garganta del paciente (Leonardi, 1994). La delección de un antígeno
específico de los tipos A y B del virus (neuraminidasa) mediante inmunoen-
sayo óptico tiene una buena sensibilidad diagnóstica que oscila entre un 80%
cuando se utiliza el aspirado de SNF y un 83% con espulo obtenido por
expectoración (Mulford. 1999).
Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial
El VRS es la principal causa de infección grave en el tracto respiratorio infe-
rior en niños y jóvenes (Anderson, 1990; Hall, 1998). El VRS se transmite fácil-
mente mediante gotas de aerosoles, y los brotes aparecen de forma recunente
cada invierno en Estados Unidos (Fig. 48-6). La inmunidad generada por el
huésped frente al virus es incompleta y de corta duración, siendo frecuentes las
reinfecciones, cada vez con manifestaciones más leves, a lo largo de la vida,
aunque el VRS puede causar también enfermedades pulmonares graves en los
ancianos y los individuos inmunocomprometidos (Pohl. 1992; Hamngton. 1990).
El VRS infecta, al igual que el virus de la gnpe. las células columnares epite-
liales, desde la nasofannge hasta los bronquiolos más distales: la forma más
grave de presentación de la infección es la bronquiolitis, especialmente en niños
de menos de un año. cuyas vías respiratorias, poco desarrolladas, son obstrui-
das fácilmente por las células epiteliales necrosadas y los residuos originados
como consecuencia del proceso inflamatorio. La obstrucción de los bronquiolos
produce un atrapamiento del aire e hipoxia, que puede ser lo suficientemente
grave como para necesitar hospitalización. Las infecciones más graves por
VRS se producen en niños prematuros, en niños que tienen una patología car-
diopulmonar subyacente o una inmunodeficiencia y en receptores de trasplan-
tes. Aproximadamente un 1% de los niños con bronquiolitis por VRS hospitali-
zados mueren por hipoxia, fallo cardíaco accesorio o sobreinfección bacteriana.
Es importante un diagnóstico rápido del VRS en los pacientes hospitali-
zados para instaurar medidas de control con objeto de impedir la infección
nosocomial (uso de mascarillas y guantes: aislamiento de los pacientes con
diagnóstico positivo) y para que comience a administrarse inmediatamente
Tabla 48-8 R e c u p e r a c i ó n de virus a partir de secreciones
nasofaríngeas (SNF): relación con la calidad
del e s p é c i m e n *
Número de % de muestras a partir
Muestra (N = 2.173) muestras de las que se logró la
de SNF recuperación de virus
SNF con <1 células columnares 243 6
por campo (observación a x 250)
SNF con 22 células columnares 1 930 27
por campo (observación a x 250)
• Datos del Lulhoran General Hospital, desde enero 3e 1985 a mayo de 1990. un
11% de especímenes tenían insuficientes células y ueron obtenidos de nuevo
ribavirina por vía mtranasal o inmunoglobulmas frente al VRS por vía intrave-
nosa (Ottolmi. 1997: Hall. 1998).
El VRS es particularmente frágil y lábil, y puede inactivarse si la muestra
tarda un cierto tiempo en llegar al laboratorio. Una vez inoculado en los culti-
vos celulares, se replica lentamente, y los ECP aparecen tardíamente; el
tiempo necesario para el aislamiento oscila entre 3 y 10 días (Arens, 1986;
Tristram, 1999). La centrifugación de la muestra en cultivos celulares en shell-
vials incrementa la recuperación del VRS y acorta a dos días el tiempo nece-
sario para el aislamiento (Beekmann, 1996; Pedneaull, 1994: Smilh. 1991). La
delección de antígenos del VRS en secreciones respiratorias mediante DFA o
EIA representa otra posibilidad para el diagnóstico igual de sensible, o incluso
más, que el cultivo, y permite obtener resultados en una banda de tiempo rele-
vante desde el punto de vista clínico: por tanto, estos métodos se han conver-
tido en la alternativa práctica definitiva para el diagnóstico del VRS (Rossier.
1989; Smith, 1991) El enzimoinmunoensayo es rápido y fácil de realizar, aun-
que los reactivos necesarios son caros y los procedimientos existentes no per-
miten evaluar la adecuación de la muestra. El test DFA necesita más tiempo
para su ejecución y experiencia para la interpretación de los resultados, aun-
que puede implementarse fácilmente para la detección de múltiples virus y per-
mite confirmar, de una forma sencilla, la calidad de la muestra.
Crup
El crup es una enfermedad generalmente causada por el virus de la parain-
fluenza (VPI) (Hennckson. 1994: Vainionpaa. 1994). La incidencia del VPI1 y
VPI2 se incrementa durante el otoño o la primavera, mientras que el VPI3
causa infecciones respiratorias por igual a lo largo de todo el año. Los dife-
rentes tipos del VPI, particularmente el VPI3. son la segunda causa de infec-
ción viral del tracto respiratorio inferior en niños de menos de 6 meses. La
necrosis epitelial que produce la multiplicación del virus en la laringe, la tra-
quea y los bronquios, estrecha la luz de los conductos, dificultando el paso del
aire y causando ronquera, tos y un patrón de estridencias respiratorias debi-
das a la obstrucción que son características del crup. La inmunidad desarro-
llada es transitoria y las reinfecciones son frecuentes; sin embargo, en niños
mayores y en adultos, los síntomas son menos graves y se circunscriben al
tracto respiratorio superior. El cultivo de las SNF es el método con mayor sen-
sibilidad para el diagnóstico, aunque la detección de antígenos del VPI en
muestras de SNF es otro procedimiento que tiene también una buena sensi-
bilidad, que oscila entre el 69% y el 85% (Costello. 1993). Aquellas muestras
que dan resultados negativos con el test DFA deben ser cultivadas para
aumentar las posibilidades de recuperación.
Obtención de muestras
Todos los mixovirus y adenovirus respiratorios pueden infectar las células
columnares ciliadas del epitelio respiratorio, desde la nasofaringe a los alvéo-
los. Por tanto, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad respira-
toria (crup, bronquiolitis. neumonía o gripe), la mucosa del tracto respiratorio
superior es la localización más accesible para lomar una muestra para el cul-
tivo o un test de detección de antígenos. Los especímenes deben obtenerse
durante los primeros días de la enfermedad, cuando la rephcación del virus
está en sus cotas más altas. El material recogido con hisopo de la garganta,
depositado en MTV con antibióticos, es un material aceptable para el cultivo
del virus de la gripe, aunque el rendimiento es entre un 10% y un 20% menor:
las muestras de esputo tomadas por expectoración también son adecuadas
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS 1055

para el cultivo (Kimball. 1983: Yungblulh, 1998). en especial en el caso de tra de SNF debe homogeneizarse con ser tampón fosfato salino que contenga
aquellos pacientes que tienen tos productiva. una sustancia mucolitica (Sputolysin) y ser centrifugada a continuación; el
Las SNF se recogen mediante la inserción de un catéter adosado a una sobrenadante resultante se utiliza para el cultivo, y el sedimento se resus-
jeringuila a través de los orificios nasales hasta alcanzar la nasofaringe, insti- pende en tampón fosfato salmo: a partir de esa resuspensión se hace un fro-
lando seguidamente entre 1 mi y 2 mi de suero salino y aspirando a continua-tis en láminas de teflón o en portaobjetos recubiertos con polk-lisina. Las
ción las secreciones de la mucosa por medio de la leringa. Todas las muestras extensiones se dejan secar al aire, se fijan seguidamente con acetona al
deben ser transportadas rápidamente en un baño de hielo para minimizar la 100%. y se tiñen con anticuerpos específicos frente a antigenos virales, con-
pérdida de viabilidad del VRS. La calidad de las muestras debe venlicarse antes jugados con fluoresceina, utilizando azul de Evans como colorante de con-
de intentar levar a cabo el cultivo o la detección de antigenos. Aquelas mues- traste. Hay que observar el número de células columnares ciliadas asi como el
tras de SNF en las que se detectan al menos dos células ciliadas columnares grado de tinción inespecifica debida a la presencia de moco residual en el
del epitelio respiratorio por campo microscópico (observación a x 250) rinden fondo de la preparación o de neutrólilos. La Figura 48-8 muestra una tinción
una recuperación cuatro veces mayor de patógenos respiratorios virales. DFA de una muestra de SNF positiva para influenza A. La especificidad de los
anticuerpos acoplados a fluoresceina se ensaya frente a una batería de culti-
Ensayos para la detección de antígenos víricos vos de células control positivas; los patrones de tinción deben mostrar una dis-
En la Figura 48-7 se describe un procedimiento basado en el cultivo y la tin- tribución celular e intensidad constantes de la fluorescencia en todos los lotes
ción mediante DFA para la identificación de virus respiratorios. Una detección de células analizados. En conjunto, los métodos de tinción fluorescente tienen
reproducible y precisa de antígenos virales mediante DFA requiere cierta u n a gran especificidad y sensibilidad (Cheeseman, 1986; Hughes, 1988).
experiencia para la interpretación de la observación al microscopio, por lo En la actualidad están disponibles en el mercado varios enzimoinmunoen-
que. si es posible, debe realizarse simultáneamente un cultivo de virus y un sayos (EIA) para la detección del VRS y el virus de la gripe. La especificidad
ensayo de detección de antígenos. Los hospitales con una unidad pediátrica y sensibilidad de estos sistemas comerciales es bastante buena, comparable
de gran tamaño examinan de forma periódica las muestras respiratorias para a la tinción DFA (Hughes. 1988: Miler, 1993;Thomas. 1991). Las muestras de
detectar diferentes virus (VRS, influenza A y B. distintos tipos de VPI y ade- SNF utilizadas para EIA deben examinarse para detectar la presencia de célu-
novirus) durante los meses de invierno, si el presupuesto lo permite. Los las ciliadas epiteliares columnares: para ello, se realiza un preparación en
pacientes adultos deben ser analizados en busca del virus de la gripe; el VRScámara húmeda, mezclando una gota de la muestra con una gota de solución
debe tenerse también en cuenta en el caso de pacientes geriátricos. La mues- salina, que se observa al microscopio (x 250) para verificar que en el espéci-

Figura 48-7. Esquema del protocolo experimental para el diagnóstico de infecciones respiratonas virales mediante cultivo (izquierda) y por el método de inmunofluores-
cencia directa (DFA) (derecha).
 1056 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 48-8. Tinción Oe inmunofluorescencia directa de un frotis de un aspirado
nasofaríngeo que revela la presencia de antigenos fluorescentes en el núcleo y el
citoplasma de las células columnares ciliadas del epitelio y en los mononucleares
(aumento x 250; tinción para antígenos específicos del virus de la influenza A).
men existen suficientes células columnares nasofaríngeas. Las muestras
tomadas de la garganta o de la nasofaringe con un hisopo contienen muy
pocas células para poder llevar a cabo un preanálisis citologico.
Aislamiento de virus
En el caso del aislamiento de virus mediante cultivo, tienen validez los mis-
mos requerimientos y restricciones respecto a la muestra que se tienen en
cuenta en los ensayos de detección de antigenos. Los cultivos a partir de SNF
procedentes de adultos y niños no inmunodeprimidos pueden modificarse para
ajustarse a las epidemias estacionales de infecciones causadas por el virus de
la gripe, VRS y VPI (Fig. 48-6). Como mínimo, debe intentarse llevar a cabo el
aislamiento del VRS y del virus de la gripe durante el invierno; si las disponibili-
dades de personal asi lo permiten, también deben realizarse cultivos para el ais-
lamiento del VPI y adenovirus a partir de pacientes pediátricos. En la Tabla 48-
3 se muestra un listado de las lineas celulares que permiten el crecimiento de
virus patógenos del tracto respiratorio mfenor. La técnica del cultivo mejora glo-
balmente el rendimiento diagnóstico, más allá del que se obtiene mediante el
método de detección de antígenos, aproximadamente entre un 10% y un 20%,
para lodos los agentes virales, excepto en el caso del VRS. El ámbito de apli-
Figura 48-9. Cultivo de células primarias de nñón de mono infectadas por el virus
de la gripe A. según se desprende de la aparición de fluorescencia, tras una tinción
con anticuerpos específicos frente al virus (izquierda). Se observa la hemoadsor-
ción de eritrocitos de cobaya sobre la monocapa de células inducida por la repli-
cación del virus (derecha).
Figura 48-10. Monocapa de un cultivo de células HEp-2. donde son apreciadles ios
ECP debidos a la multiplicación del VRS en las mismas. Es patente la presencia
de s^ncitios multinucleados tras una incubación de 9 días (aumento • 200: micros-
copia de contraste de fases).
cación del sistema basado en el cultivo puede ampliarse para la recuperación
de virus que no están incluidos en los ensayos de detección de antígenos,
como el virus del sarampión y los enterovirus (Johnston. 1990; Rabalais, 1992).
El matenal recogido con hisopo de la garganta, cuya finalidad única sea ser-
vir de muestra de partida para el cultivo del virus de la gripe, debe depositarse
en MTV con antibióticos inmediatamente después de ser obtenido y transpor-
tarse rápidamente hasta el laboratorio, preferiblemente en un baño de hielo: la
inoculación de los cultivos celulares no debe demorarse más allá de 48 horas y
debería realizarse, preferiblemente, el mismo día en que el espécimen es obte-
nido. El recipiente con MTV debe agitarse enérgicamente antes de retirar y des-
echar el hisopo. El líquido sobrenadante se utiliza para inocular, por duplicado,
tubos shell-vial que contengan cultivos tripsmizados de las líneas celulares
MDCK (células Madin-Darby de nñón de perro) o PMK. Tras la centrifugación
para favorecer la adsorción de los viriones a las células, se añade a los tubos
un volumen de MME (medio mínimo esencial de Eagle) sin suero bovino fetal
(SBF), ya que el SBF puede contener anticuerpos frente al virus de la gripe.
Después de uno o dos días de incubación a 35 C, las monocapas de células
son teñidas mediante la técnica DFA, con objeto de detectar los antígenos del
virus de la gripe (Reina, 1997). Adicionalmente. se puede inocular un tubo más
con células PMK o MDCK. que se incuba en un tambor rotatorio y se examina
para detectar la multiplicación del virus, añadiendo eritrocitos de cobaya recién
obtenidos. Al igual que los virus del sarampión y de la parainfluenza. el virus de
la gripe no produce ECP de forma constante, aunque es capaz de inducir la
integración de hemaglutininas en la membrana plasmática de las células de los
cultivos, lo que provoca que los eritrocitos se adhieran a las células de la
monocapa, hecho que revela que el virus se está replicando en éstas. Si la
cantidad de trabajo lo permite, los tubos deben examinarse diariamente para
detectar la hemoadsorción (Minnich. 1987). Una vez se ha apreciado la exis-
tencia de hemoadsorción. la monocapa de células debe analizarse con una
batería de anticuerpos para determinar qué tipo de virus está presente. En la
Figura 48-9 se muestra una monocapa de células PMK en un tubo shell-vial en
la que se ha multiplicado el virus de la influenza A. tras dos días de incubación,
y un cultivo estándar de células PMK infectadas por el mismo virus, que mues-
tra la hemoadsorción de los eritrocitos de cobaya, tras tres días de incubación.
La Figura 48-7 muestra un esquema del procedimiento de cultivo en tubos
shell-vial aplicado a las SNF, empleando una monocapa híbrida de células,
formada por células A549 y ML (de pulmón de visón), que conjuntamente per-
miten el crecimiento del VRS, adenovirus, virus de la influenza A y B y los dis-
tintos tipos del virus de la parainfluenza En comparación con las líneas celu-
lares tradicionales, el cultivo de tejidos híbrido tiene, globalmente. unos
porcentajes de recuperación de entre el 96% y el 100%. con tiempos de
espera más cortos, y unos costes totales reducidos (Schindler, 1999).
Aquellos laboratorios que se dedican exclusivamente al cultivo del VRS
deben considerar la utilización de los tubos shell-vial en lugar de los tubos Ira-
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
dicionales para realizar los cultivos de tejidos, con objeto de reducir el tiempo
necesario para el aislamiento. Las células HEp-2 o A549 en MME de Eagle enri-
quecido con suero bovino fetal (entre un 2°= y un 5%) permiten la replicación
del VRS. Las monocapas de células contenidas en los tubos deben examinarse
diariamente para detectar la aparición de ECP. En la Figura 48-10 se observan
los típicos ECP causados por la multiplicación del VRS en las células (forma-
ción de sincitios multinucleados), patrón que depende del contenido en cationes
y de la frescura del medio de mantenimiento (Tristram. 1999). Los adenovirus
también son capaces de replicarse en las líneas celulares A549 y HEp-2. pro-
duciendo un redondeamiento de las células de la monocapa. que se hinchan,
adquiriendo una morfología que semeía un grano de uva, generalmente entre
cinco y siete días de incubación; el empleo de tubos shell-vial acorta el tiempo
de detección de los adenovirus hasta los tres días
Existen una serie de métodos serológicos para detectar anticuerpos espe-
cíficos frente al virus en la sangre del huésped infectado, aunque son poco
prácticos para llevar a cabo un diagnóstico rápido de cara a la gestión clínica
habitual. Sin embargo, el diagnóstico serologico es de la mayor utilidad en los
estudios de salud pública.
MONONUCLEOSIS INFECCIOSA
E INFECCIONES RELACIONADAS
La mononucleosis infecciosa (MI) es una enfermedad linfoproliferativa sis-
témica, bastante común, que está causada por una inleccion primaria con el
virus de Epstein-Barr (VEB), El VEB pertenece a la familia Herpesviridae y. al
igual que el VHS. tiene una distribución mundial, pudiendo infectar a la mayor
parte de la población. El VEB se disemina mediante la saliva contaminada: la
infección primaria en la niñez temprana es generalmente asinlomática, pero
si se retrasa hasta los años de la adolescencia o la juventud adulta, entonces
provoca, a menudo, la entidad clínica conocida como mononucleosis infecciosa.
En EE.UU. se detectan unos 150.000 casos de MI anualmente (Schooley. 2000:
Straus. 1993).
El VEB infecta primero el epitelio faríngeo, por lo que el dolor de garganta y la
fiebre son los síntomas que se manifiestan típicamente al inicio de la enferme-
dad. El VEB es fuertemente linfotrópico. uniéndose al receptor para el C3d
(CD21) presente en la superficie de los Imfocitos B e iniciando una proliferación
policlonal blástica de células B. La respuesta de la inmunidad celular está
mediada por las células NK y los linfocitos T-CD8 cítotóxícos. que se encargan
de destruir las células B infectadas, aunque estas células defensivas también
contnbuyen a la patología sistémica de la MI. Los linfocitos B infectados por el
VEB se acumulan en los ganglios linfáticos del cuerpo, y los linfocitos T cilotóxi-
cos infiltran las áreas nodales interfoliculares, el bazo y el hígado y circulan como
linfocitos atipicos en sangre periférica (Strickler. 1993). A medida que los meca-
nismos celulares van controlando la replicación del VEB, los síntomas de la MI
disminuyen y la Imfadenopatía, la esplenomegalia y la hepatitis remiten.
Como otros herpesvirus, el VEB puede persistir en el huésped en un estado
latente. Un pequeño porcentaje de linfocitos B contienen en su núcleo ARN
codificados por el VEB (EBER). asi como el antigeno nuclear del VEB (ANEB)
y otro antígeno, la proteina latente de membrana (PLM), que mantienen el
genoma durmiente del VEB en las células B transformadas; una excesiva pro-
liferación de las células B es controlada por los linfocitos T-CD8. La reactivación
asinlomática del VEB es un hecho frecuente, y hasta un 20% de los adultos
sanos liberan, esporádicamente, un pequeño número de viriones completos,
con capacidad infectiva, en su saliva. En individuos que se encuentran en una
situación de mmunodepresión (enlermos de sida, pacientes sometidos a trata-
Tabla 48-9 Perfiles s e r o l ó g i c o s e n las infecciones producidas por el virus. d e E p s t e l n - B arr
Anticuerpos
heterófilos (IgM)
Ausencia de infección
Infección primaria silenciosa +/-
Mononucleosis infecciosa ++
Infección primaria reciente -/+
Infección pasada remota
Paciente inmunodeprimido con reactivación reiterada *h
ACV = antígeno de la capsida viral EA= antígeno que se expresa tempranamente, ANEB = antígeno nuclear del VEB.
1057
miento para evitar el rechazo tras ser sometidos a trasplante, individuos afecta-
dos por la enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X). la reactivación
del VEB no puede ser mantenida bajo control y se desarrollan enfermedades
como la leucoplaquia oral vellosa y el linfoma de células B. El VEB también está
ligado al carcinoma nasofaríngeo en asiáticos y al linfoma de Burkitt en África;
aparentemente, el VEB actúa como un iniciador en estas patologías, aunque
son otros factores, como la coinfección o la desregulación del sistema inmune,
los que conducen, posteriormente, a la malignización.
Diagnóstico serologico
Los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos apoptósícos circulan por la sangre
durante la enfermedad (Fisher. 1996): la linfocitosis atipica |>10% de linfocitos
totales) tiene, relativamente, una ba|a sensibilidad como criterio diagnóstico de la
MI causada por el VEB. aunque tiene una especificidad total de al menos el 95%.
El VEB puede ser cultivado en líneas celulares linfoblastoides, pero el aisla-
miento del virus no es un hecho que permita distinguir entre inleccion primana o
infección por reactivación. Las pruebas serológicas constituyen el principal
método de laboratorio para el diagnóstico de la MI (Schooley. 2000). La prolife-
ración policlonal de linfocitos B en la infección aguda por el VEB tiene como con-
secuencia la generación de diversos autoantícuerpos transitónos y generalmente
inocuos, tales como IgM anti-i (aglutininas trias), factor reumatoide, y anticuerpo
antinuclear. Quizás el tipo más inusual de inmunoglobulinas producidas durante
la MI sean los anticuerpos heterófilos de Paul-Bunnell. Estos anticuerpos, que
pertenecen a la clase de las IgM, tienen afinidad por los erilrocitos de bóvido.
caballo y oveja, pero no están dirigidos contra antígeno alguno del propio virus.
Estos anticuerpos son, aparentemente, producidos de forma aleatoria como con-
secuencia de la proliferación policlonal de los linfocitos B. inducida por el VEB. y
aparecen durante la primera semana de la enfermedad, disminuyen durante la
fase de convalecencia y dejan de ser detectados, usualmente, entre tres y seis
meses después. Durante la enfermedad del suero y ocasionalmente en otras
infecciones virales, se generan diferentes anticuerpos heterófilos; sin embargo,
los anticuerpos de este tipo, con una fuerte afinidad por antígenos de los eritro-
citos vacunos, que no es alterada por adsorción con antígeno de riñon de cobaya
(test de la adsorción diferencial), son específicos de una MI causada por el VEB.
En algunas de las pruebas se mezcla directamente sobre un portaobjetos el
suero del paciente con una suspensión del antigeno de nñón de cobaya, y
seguidamente se añade el antigeno de eritrocitos vacunos o equinos, que fre-
cuentemente se encuentra adhendo a partículas de látex; si es positiva, la aglu-
tinación aparece de forma casi inmediata si en el suero del paciente hay anti-
cuerpos heterófilos. Los test de aglutinación rápida, y sus modificaciones en fase
sólida, tienen una especificidad enlre el 80% y el 90%, con un porcentaje de fal-
sos positivos menor del 2% y un valor prediclivo positivo del 95% o supenor, por
lo que son herramientas de gran valor en la atención primaria (Rogers, 1999:
Farhat, 1993: Lmderholm. 1994). Su principal limitación es la sensibilidad, puesto
que aun cuando los anticuerpos heterófilos están presentes en más del 80% de
adolescentes y adultos este porcentaje baja hasta el 40% en el caso de niños
pequeños con MI por VEB.
A medida que la infección por VEB evoluciona desde la fase primaria a la de
latencia, van expresándose varios antígenos virales, de tal forma que los anti-
cuerpos específicos que se generan frente a los mismos son unos marcadores
valiosos para determinar el estadio en el que se encuentra el proceso infeccioso.
Los antígenos que se expresan tempranamente (EA) la ADN polimerasa y la timi-
dma (cinasa) se sintetizan durante la fase aguda de la infección, durante la repli-
cación activa del virus, al igual que el antigeno proteico estructural (ACV) de la
nucleocápsida del virus. Las IgM frente al ACV son un marcador sensible y espe-
ACV (IgM) ACV (IgG) EA (IgG) ANEB (IgG)
+/- + + +
++ + ++ +
-/+ + + +
• + + +
+/- + ++ ++
 1058 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
cílico de infección primaria por el VEB. A medida que la mononucleosis aguda va
remitiendo, un pequeño porcentaje de linfocitos B infectados por el virus esca-
pan a la destrucción mediada por las células T y albergan en estado de latericia
el ADN del VEB en forma de un episoma circular; el ANEB (antígeno nuclear del
VEB) es el responsable de la replícación y supervivencia de dicho episoma. En
consecuencia, las IgG trente al ANEB aparecen, típicamente, después de que la
fase aguda de la enfermedad haya remitido
Los patrones serológicos que se detectan a lo largo de las diferentes fases
de la infección por VEB se muestran en la Tabla 48-9. Los métodos con anti-
cuerpos fluorescentes (IFA) utilizan líneas de células linloblásticas. en las que
la replícación del VEB ha sido interrumpida en diferentes etapas, con objeto de
caracterizar la expresión de antígenos específicos en cada una de ellas. Los
tesl IFA tienen una buena sensibilidad y especificidad, aunque están sujetos a
una cierta subjetividad en lo referente a la interpretación de resultados. Los
enzimoinmunoensayos (EIA) que utilizan el antígeno ACV purificado u obte-
nido mediante técnicas de ADN recombinante muestran una sensibilidad supe-
rior al 95% y una especificidad de casi el 100%. y además tienen la ventaja de
poderse llevar a cabo de forma automatizada, y de que la interpretación de los
resultados no está afectada por criterios subjetivos de ningún tipo (Tranchard,
1999; Chan. 1998). Muchos médicos confian en la demostración de linfocitos
atípicos en sangre periférica, en el rastreo rápido de anticuerpos heterófilos y
en la detección de IgM e IgG frente al ACV para diagnosticar la MI. Los méto-
dos de referencia de detección cuantitativa de anticuerpos heterófilos en tubo,
IgG anti-ANEB y anti-EA (antígenos que se expresan tempranamente), son de
ejecución más compleja y tienen una menor aplicación práctica.
Mononucleosis infecciosa heterófilo-negativa
Entre los pacientes que presentan las manifestaciones clínicas caracterís-
ticas de la MI, un 70% o más dan positiva la prueba de anticuerpos heterófi-
los, lo que identifica al VEB como el agente causal de la enfermedad. Del 30%
de enfermos restante, aproximadamente la mitad de ellos tienen IgM anti-
VCA, lo que también representa una evidencia de infección aguda por el VEB.
Aproximadamente en un 15% de pacientes con un síndrome febril de MI lin-
foproliferativa, el agente etiológico identificado es Toxoplasma gondii, o bien
otros virus como CMV, el virus del herpes humano 6 (VHH6) o VIH; en el 5%-
10% restante de los casos no es posible determinar la etiología.
La toxoplasmosis se describe en el Capítulo 55. La infección primaria por
CMV adquirida durante la infancia es, a menudo, asinlomática, mientras que
en los adolescentes y en los adultos puede manifestarse como una enferme-
dad sistémica, febril y linfoproliferativa. El aislamiento del CMV de la orina o
de la saliva no es de gran ayuda, ya que la reactivación asintomática del virus
es bastante frecuente. La recuperación del CMV a partir de sangre periférica
representa una alternativa diagnóstica válida por su sensibiliaad. pero es pro-
cedimiento caro, que requiere más tiempo para su realización que el diag-
nóstico serologico. La detección de IgM frente al CMV mediante IFA se com-
plica por el hecho de que las células infectadas por el CMV, utilizadas como
sustrato antigénico, expresan también un receptor para el fragmento Fe de la
molécula de inmunoglobulina; el test de la inmunofluorescencia anticomple-
mentaria (ACIF) es más complejo desde el punto de vista técnico, pero reduce
la aparición de resultados falsamente positivos. Los enzimoinmunoensayos
(ELISA) específicos para IgM tienen, en conjunto, una precisión comparable
a la del ensayo ACIF-IFA para la detección de este mismo tipo de anticuerpos
(Roseff. 1993: Schaefer. 1988: Smith. 1987; VanEnk, 1991).
El VHH6 también es un virus linfotrópico que produce la roseola infantil
(exantema súbito), una enfermedad exantemática febril común en niños peque-
ños (Pruksananonda, 1992; Braun. 1997). Pasada la infancia, la infección pri-
maria puede producir mononucleosis (Akashi. 1993). La enfermedad aguda se
puede diagnosticar mediante ensayos IFA y EIA específicos para IgM. y lambién
por PCR, aunque en la actualidad estos métodos aún no están disponibles
comercialmente (Steeper, 1990: Sumiyoshi, 1993; Chiu. 1998).
La infección por VIH-1 puede producir un síndrome retroviral agudo que
mimetiza. desde el punto de vista clínico, a la mononucleosis causada por el
VEB (Kessler. 1987: Steeper. 1988). Hasta un 50% de pacientes desarrollan fie-
bre, linfadenopatia. linfocitosis atípica y, ocasionalmente, daño hepatocelular
leve o meningoencefalitis (Fox. 1987). Los métodos estándar de enzimoinmuno-
ensayo específicos para el VIH son incapaces, por lo general, de detectar anti-
cuerpos específicos durante esta fase temprana de la infección, aunque la cuan-
tificación por RT-PCR de virus en suero da usualmente valores elevados (del
orden de 10' copias/ml) (Henrard. 1994). A partir del segundo o tercer mes. las
pruebas serológicas (ELISA, inmunotransferencia electroforética [Western
immunoblottingj e IFA) dan sistemáticamente resultados positivos en lo que res-
pecta a la detección de anticuerpos anti-VIH específicos, al mismo tiempo que
las manifestaciones asociadas a la infección aguda van remitiendo (Clark, 1991).
La Figura 48-11 muestra el esquema general de trabajo para llevar a cabo la
evaluación serológica de un paciente que presente síntomas de una mononu-
cleosis aguda. En cualquier caso, a pesar de la gran variedad de métodos ana-
líticos disponibles para la identificación de los agentes causales de mononucleo-
sis, la etiología no llega a ser determinada en el 5% al 10% de los casos.
Síndrome de la fatiga crónica
En los últimos 15 años se ha prestado una considerable atención, tanto en
la prensa médica especializada como en la no especializada, a una entidad
clínica que se caracteriza por el hecho de que los pacientes alectados sufren
una fatiga persistente incapacitante, acompañada, a menudo, de fiebre, farin-
gitis, linfoadenopatía suave, artralgias y mialgias (Holmes, 1988; Klonoff,
1992). En los pacientes sospechosos de padecer esta enfermedad, debe
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
investigarse también la posibilidad de que existan tumores malignos ocultos,
enfermedades endocrinas y dolencias psiquiátricas, aunque las característi-
cas clínicas de esta enfermedad sugieren, con gran fuerza, un origen infec-
cioso para la misma, En los estudios iniciales se propuso al VEB, tanto en
infecciones primarias persistentes como reactivadas, como responsable del
síndrome, ya que muchos pacientes tenían títulos elevados de anticuerpos
frente a los antígenos VCA y EA del virus de Epstein-Barr. Sin embargo, los
ensayos serológicos nunca fueron estandarizados y los resultados descritos
no fueron reproducibles (Holmes. 1987). y la detección del VEB mediante téc-
nicas de cultivo a partir de saliva y de hibridación in silu (HIS) en linlocitos cir-
culantes no mostró diferencias entre pacientes con síndrome de fatiga crónica
y población control normal. Distintos estudios han implicado a otros agentes
infecciosos como CMV, VHH6, VLHT (virus de la leucemia humana de célu-
las T), e incluso Toxoplasma gondii. aunque no existe consenso sobre la etio-
logía de la enfermedad (Gold, 1990). Las pruebas inmunológicas y serológi-
cas no son de ayuda para el diagnóstico o la prognosis. En resumen, el
síndrome de la latiga crónica sigue estando definido por los síntomas clínicos
más que por los resultados de las pruebas de laboratorio (Lloyd. 1998).
INFECCIONES VÍRICAS CONGÉNITAS Y PERINATALES
El útero de la mujer embarazada es un entorno estéril y aislado que protege
al feto de la agresión de los microorganismos extemos. La mayor parte de infec-
ciones durante el embarazo son provocadas por las bacterias que se encuentran
en la vagina, y que ascienden a través de una barrera cervical defectuosa, aun-
que las infecciones maternas pueden alcanzar al feto por el torrente circulatorio
a través de la placenta, o bien afectar directamente al niño en el momento del
parto vaginal. Algunos ejemplos de infecciones perinatales son la toxoplasmosis
(véase Cap. 55), las causadas por diversos virus, como el de la rubéola, CMV,
VHS. VIH, parvovirus. enterovirus, y por bacterias como Treponema palüdum
(véase Cap. 52). Muchas de las infecciones maternales son silenciosas o pro-
ducen síntomas leves solamente: sin embargo, el sistema inmunológico inma-
duro del leto es incapaz de desarrollar una respuesta celular o humoral eticaz,
por lo que la necrosis tisular puede ser muy grave o incluso fatal.
El diagnóstico de las infecciones perinatales se centra en dos aspectos: iden-
tificación de la infección aguda en la madre (en particular, la infección primaria)
y verificación de que el feto o el recién nacido está implicado. La mejor forma de
establecer la infección materna es mediante el aislamiento del microorganismo
sospechoso, aunque para ciertos agentes infecciosos esto es poco práctico o
imposible de llevar a cabo y, en consecuencia, la detección de IgM especificas,
aunque imperfecto, sigue siendo el método diagnóstico más aceptado. La infec-
ción en la madre atraviesa la placenta para alectar al feto entre el 30% y el 60%
de los casos. La ecografia puede detectar el daño en los órganos del feto (p. ej.,
microcalcificaciones. microcefalia, hidrocefalia, organomegalia, hidropesía), aun-
que para probar que existe infección fetal es necesario aislar el microorganismo
mediante cultivo, demostrar la presencia de antigenos o secuencias de ácidos
nucleicos del mismo en la sangre o en tejidos del feto, o detectar la existencia de
anticuerpos específicos. En la Tabla 48-10 se muestra una selección de métodos
para el diagnóstico de las infecciones perinatales y congénitas más comunes.
Aun cuando la monitonzación de todas las mujeres embarazadas en busca de
anticuerpos frente al virus de la rubéola es, en la actualidad, una práctica habi- ción genital primaria por el VHS. más que las infecciones recurrentes, implica
tual de atención primana. la realización de pruebas para detectar anticuerpos
frente a Toxoplasma gondii. VHS y CMV no está establecida. En particular, los
métodos serológicos para IgM pueden exhibir una gran variabilidad intra e inter-
laboratorio, con errores debidos a falsos negativos y posilivos: los ensayos para
IgG por si solos no son capaces de diferenciar entre infección materna primaria
y recurrente o latente, y no pueden predecir que el feto esté implicado.
Citomegalovirus
El CMV es la causa más frecuente de infección intrautenna y afecta aproxi-
madamente a un 1% de los recién nacidos vivos en EE.UU. Alrededor de un
90% de estos niños son asintomáticos en el momento del nacimiento; el aisla-
miento del virus a partir de la orina o de la saliva o la detección de IgM especí-
ficas pueden ser los únicos indicadores de infección congénita. Sin embargo, el
restante 10% de individuos sintomáticos presenta ictericia junto con hepatoes-
plenomegalia y pancitopenias: aproximadamente un 10% muere y el resto
queda con secuelas neurológicas durante mucho tiempo. La infección primaria
1059
por CMV en la madre se manifiesta como una viremia que se extiende hema-
tógenamente al feto por vía transplacentaria. y que comporta el nesgo más ele-
vado de provocar daños graves en los tejidos leíales. La reactivación del CMV
en la madre conlleva que el virus pueda atravesar la placenta, aunque las IgG
anli-CMV de la madre ejercen un cierto efecto protector; en este caso, estos
niños son, por lo general, asintomáticos. aunque entre un 5% y un 15% de ellos
pueden desarrollar una pérdida sensorial auditiva o tener problemas de des-
arrollo neuronal (Istas. 1995: Lazzarotta, 1998).
La detección del CMV a partir del liquido amniótico mediante PCR junto
con el aislamiento del virus por cultivo son los métodos más seguros para el
diagnóstico prenatal (Hagay. 1996; Lazzarotta, 1998). La recuperación del
CMV mediante cultivo o PCR a partir de la orina, saliva, líquido cefalorraquí-
deo o sangre del recién nacido también es una alternativa diagnóstica de gran
sensibilidad, aunque los especímenes deben obtenerse dentro de las tres
semanas siguientes al nacimiento para evitar confusiones con una posible
infección posnatal (Warren. 1992: Nelson. 1995). La presencia de IgM frente
al CMV en muestras de sangre tomadas del cordón umbilical, intrautenna-
mente o en el momento del parto, posee valor diagnóstico, aunque tiene un
porcentaje del 30% de falsos negativos (Fowler. 1992). La visualización de las
típicas inclusiones nucleares producidas por el CMV en frotis otológicos pre-
parados a partir de orina tiene carácter específico, aunque es una aproxima-
ción diagnóstica que tiene muy poca sensibilidad; incluso las muestras obte-
nidas mediante autopsia pueden poseer muy pocas células apropiadas para
el diagnóstico si la necrosis tisular está muy avanzada
Rubéola
El virus de la rubéola (sarampión alemán) produce fiebre suave y una erup-
ción cutánea transitoria en niños y adultos. El virus circula por la sangre,
incluso en los casos leves, y la diseminación transplacentaria de la viremia
durante el primer trimestre del embarazo provoca gravísimas maltormaciones
cardíacas, oculares y cerebrales en el feto (Schluter, 1998). El síndrome con-
génito de la rubéola es raro en la actualidad, debido a las eficaces campañas
de vacunación pediátrica y a los programas sistemáticos de revisión prenatal
(Miller, 1984). Cuando se sospecha un caso de rubéola aguda en una mujer
emDarazada. el método más sencillo para el diagnóstico es el análisis del
suero de la madre para detectar IgM especificas frente al virus, mediante
enzimoínmunoensayo o IFA. El aislamiento del virus en cultivos de tejidos es
una técnica compleja que requiere mucho tiempo para su ejecución, por lo
que no se realiza de forma ordinaria en la mayor parte de laboratorios clíni-
cos. La detección del ARN del virus de la rubéola a partir de liquido amniótico
mediante RT-PCR tiene un 100% de sensibilidad y especificidad, pudiéndose
llevar a cabo también con muestras de placenta o de tejidos procedentes de
autopsias (Revello. 1997). Los recién nacidos infectados congenitamente libe-
ran, a menudo, el virus durante muchos meses e incluso años.
Virus del herpes simple
La infección genital primaria por el VHS durante el embarazo conlleva un
riesgo elevado de corioamnionitis herpética ascendente que puede conducir
a un aborto espontáneo, alumbramiento prematuro y a la exposición del niño
durante el parto vaginal por contacto mucocutáneo (Brown, 1987). La infec-
un grave peligro para el niño por dos razones: la carga viral en la madre y el
número total de lesiones son normalmente mayores durante la infección pri-
maria y, por otro lado, aunque el suero de la madre tiene IgM específicas, pre-
senta pocas (o incluso carece de ellas) IgG que puedan ejercer un electo pro-
tector transplacentario en el lelo (Prober, 1987).
La mayor parte de los niños tienen una presentación cefálica durante el parto,
por lo que el cuero cabelludo y la cara son las partes del cuerpo del feto que pri-
mero entran en contacto con el VHS durante el tránsito por el tracto genital de la
madre; otras zonas que también quedan expuestas con bastante frecuencia a la
infección por el virus son el pecho y las nalgas, especialmente durante el parto
de nalgas. Las vesículas se desarrollan en todas aquellas localizaciones de la
piel y las mucosas donde ha tenido lugar la inoculación directa con el virus.
Puesto que el sistema inmunitario del recién nacido está todavía relativamente
inmaduro, el único recurso que el niño tiene para alterar el curso de la infección
es la IgG de la madre frente al VHS; cuando esta protección pasiva está ausente,
tiene lugar de forma incontrolada tanto la replicación del virus como su disemí-
 1060 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

nación a diferentes órganos (Whitley, 1988). Las lesiones que aparecen en la
conjuntiva, en la mucosa oral y en la piel son, generalmente, reas en virus: si se
produce la diseminación, virtuaimente cualquier órgano puede resultar infectado.
Hoy en día, en plena era del herpes genital, todavía existe cierta controversia
sobre cuál debe ser la estrategia más adecuada que debe utilizarse en el parto,
aunque algunos esludios al respecto merecen ser destacados. El aislamiento
mediante cultivo, realizado de forma sistemática a partir de todas las madres o
niños en el momento en que se inicia el parto y en el de dar a luz. tiene un ren-
dimiento bajísimo (0.2%) y, en consecuencia, no es un método recomendado
(Prober, 1988). Los cultivos de control del VHS a partir de mujeres embarazadas
con un historial de herpes genital recurrente tampoco pueden predecir qué
madres liberarán el virus en el momento del parto (Arvin, 1986). Estudios reali-
zados con mujeres que han experimentado su primer episodio, reconocido clíni-
camente, de herpes genital durante el embarazo han demostrado que tan sólo
una mitad, aproximadamente, de estas mujeres habían tenido un verdadero her-
pes genital, aunque estas madres expenmentaron complicaciones (amnionitis
herpética, parto prematuro e infecciones neonatales graves) muy frecuente-
mente. En las mujeres con infecciones recurrentes se detectaron infecciones
neonatales con mucha menor frecuencia, que quedaron confinadas a las super-
ficies mucocutáneas, sin diseminación visceral (Brown, 1987,1991).
Es una práctica aceptada que las mujeres que están de parto y tienen lesio-
nes genitales que hacen sospechar la existencia de un herpes deben ser
sometidas a una cesárea para prevenir una posible exposición del niño al
virus. Aquellas mujeres que tienen un historial previo de herpes genital recu-
rrente pueden dar a luz por vía vaginal siempre que no se delecten lesiones
activas, aunque en este caso se recomienda que se lleve a cabo un control
cuidadoso de los recién nacidos, incluyendo cultivos del VHS a partir de la
conjuntiva, mucosa oral y cualquier lesión cutánea sospechosa. La infección
neonatal por el VHS puede permanecer silenciosa durante varios días antes
de que la enfermedad se manilieste clínicamente A pesar de la terapia anti-
vírica, la inlección generalizada es. con frecuencia, mortal; aquellos niños que
tienen la infección confinada en el sistema nervioso central pueden sobrevi-
vir, aunque con un grave retraso mental permanente.
El diagnóstico de laboratorio de la infección por el VHS fue descrito pre-
viamente en otra sección de este capitulo. Las pruebas rápidas como los fro-
tis de Tzanck o las técnicas para la detección de antígenos dan resultados
positivos a partir de las lesiones vesiculares, aunque no son lo suficiente-
mente sensibles como para reemplazar al diagnóstico por cultivo (que ahora
está disponible en muchos laboratorios y permite obtener resultados positivos
en 24 horas, en especial si se utilizan los cultivos en shell-viat). La técnica de
la PCR puede identificar el ADN del VHS en el suero del neonato o en el
liquido cefalorraquídeo con una sensibilidad mayor de la que tiene el cultivo,
aunque en ocasiones no es posible utilizar este procedimiento diagnóstico en
el momento preciso, lo que limita su utilidad (Kimura. 1991: Kimberlin. 1996)
Virus de la inmunodeficiencia humana,
parvovirus, enterovirus
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede diseminarse hemató-
genamente al feto, actuando como reservono del virus los trofoblastos de la pla-
centa y los macrófagos de Hofbauer. Sin embargo, aproximadamente un 75%
de las infecciones perínatales se contraen en el momento del parto, al entrar en
contacto el feto con la sangre materna infectada El nesgo de infección penna-
tal por VIH oscila entre el 13% y el 45%, dependiendo de la carga viral (VIH-1)
en la madre, aunque el porcentaje de transmisión baja hasta un 8% si se admi-
nistra cidovudina a la madre durante el embarazo y el parto. El parto por cesá-
rea y el tratamiento con cidovudina reducen el riesgo de contagio por debaio del
1% ¡Connor, 1994; Sperling, 1996).
El diagnóstico de la infección por VIH en la madre es sencillo (determinación
mediante enzimoinmunoensayo de anticuerpos frente al VIH y posterior confir-
mación de los resultados por medio de inmunotranslerencia electrolorética
¡Western immunoblottingj o IFA), y a todas las madres positivas se les debe
administrar tratamiento profiláctico. Las inmunoglobulinas maternas pasan a
través de la placenta y permanecen en la sangre del niño hasta 15 meses; por
tanto, los métodos estándar de ELISA no pueden ser utilizados para diagnos-
ticar la infección neonatal. Las modificaciones del enzimoinmunoensayo o de
la inmunotransferencia electrolorética, encaminadas a la detección de IgM o
IgA (ninguna de estas moléculas de anticuerpos pueden ser transferidas de
forma pasiva al feto y, por tanto, si están presentes en el suero, sólo puede ser
debido a que el niño las haya producido), podrían permitir el diagnostico de la

Tabla 48-10 Métodos de laboratorio para el diagnóstico de las infecciones virales congénitas y perinatales*
' i ni ni

A g e n t e pagóteno Serologia materna Cultivo, detección de antígenos. PCR Serologia del feto o
del recién nacido
CMV EIA o ACIF para IgM Cultivo de CMV. sangre de la madre EIA o ACIF para IGM
Cultivo de CMV orina, saliva, sangre, tejidos
(del recién nacido, primeras tres semanas)
PCR para CMV liquido amniótico, saliva, orina,
LCR (del recién nacido, primeras tres semanas)
Detección de inclusiones nucleares del CMV tejidos
Rubéola EIA o IFA para IgM Cultivo de virus de la rubéola: orina EIA o IFA para IgM
RT-PCR para virus de la rubéola liquido amniótico.
glóbulos blancos letales, tejidos
VHS EIA para IgM frente a Cultivo de VHS conjuntiva, mucosa oral, piel, LCR. tejidos EIA o IFA para IgM
VHS1 y VHS2 (del neonato) PCR para VHS: LCR. sangre (del neonato)
Detección de inclusiones nucleares del VHS te|idos, piel
VIH EIA o WB para el VIH; Cuantificación de VIH (RT-PCR o bADN). PCR del EIA para IgM e IgA, WB
ensayos cuantitativos ADN del VIH (en el recién nacido), detección del Monitorizar VIH mediante
(HT-PCR o bADN) antigeno p24 (en el recién nacido) EIA para comprobar
serorreversión
Enterovirus RT-PCR para enterovirus LCR y sangre (del neonato)
Cultivo de enterovirus: sangre. LCR. tejidos, heces,
hisopados de garganta (del neonato)
Parvovirus E 19 EIA o IFA para IgM frente Visualización de inclusiones nucleares del virus EIA para IgM'
al PB19: PCR para el HIS para PB19 en entroblastos
ADN del PB19 ADN del PB19 (a partir de sangre)
PCR para el ADN del PB19: plácenla, tejidos leíales, sangre
"Se recomienda eliminai las IgG y el lactor reumaloide antes de llevar a cabo la determinación de IgM para ovilar los errores debidos a lalsos negativos
'Métodos de investigación y de laboratorios de referencia.
EIA = enzimoinmunoensayo. ACIF = inmunolluorescencia anticomplementaria; PCR = reacción en cadena de la pdimerasa LCR * liquido cefalorraquídeo. RT-PCR
• reacción en cadena de la polimerasa de la iransciiptasa reversa VIH = virus de la inmunodeficiencia humana. bADN = ensayo de ADN ramificado. WB = Wes-
tern blotting (inmunotransferencia electrolorética). IFA = ensayo de inmunofluorescencia indirecta; PBI9 = parvovirus B19. HIS = hibridación in sitir. para ver el sig-
nilicado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 48-3 y 48-4.
k, J
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
infección perínalal con una gran precisión; sin embargo, la sensibilidad de
estos métodos depende de la edad del paciente, y son poco fiables durante los
tres primeros meses después del nacimiento (Quinn. 1991). La detección del
antígeno p24 del VIH tiene una sensibilidad subóptima durante el periodo
inmediatamente posterior al nacimienlo (Burgard. 1992; Miles. 1993: Sisón.
1992). El ensayo de la PCR para el ADN del VIH detecta el genoma vírico que
ha sido transcrito e integrado en las células linfoides circulantes y tiene una
sensibilidad de casi un 100% al mes de edad (Rogers. 1989). debido a la típica
estabilidad del ADN, este ensayo es válido incluso cuando se lleva a cabo a
padir de especímenes de sangre seca. La RT-PCR se utiliza para el control
cuantitativo de aquellos niños con diagnóstico positivo de infección que están
recibiendo una terapia antirretroviral combinada.
El parvovirus B19 (PB19) produce un tipo de exantema infantil, benigno y
autolimitado, denominado eritema infeccioso (en ocasiones denominado "quinta
enfermedad" o exantema escolar). Aproximadamente un 50% de mujeres jóve-
nes son seronegativas para esta enfermedad. La infección durante el embarazo
conlleva un riesgo de infecciones fetales del 25%; las estimaciones de muerte
fetal oscilan entre el 2% y el 38% (Alder. 1993). El PB19 tiene como diana las
células inmaduras del linaje eritrocitano. y la citotoxicidad virolitica causa ane-
mia y provoca hidropesía fetal (Anand, 1987; Gratacos. 1995). Los eritroblastos
infectados exhiben una inclusiones nucleares características que recuerdan a
vidrio molido. Los parvovirus sólo han podido cultivarse en suspensiones de
médula ósea humana que contengan células precursoras eritrocitarias. La
infección aguda se diagnostica mediante la detección de IgM específicas en la
sangre de la madre o del feto, hibridación in silu o amplificación del ADN viral
por PCR en muestras de líquido amniótico o de sangre del cordón umbilical
(Erdman, 1991; Bruu, 1995: Zerbini, 1996).
La infección por enterovirus es muy habitual en la población en general, con
más de 10 millones de casos detectados anualmente en EE.UU. La infección
de la madre en un momento próximo al parto puede provocar la diseminación
del virus a través de la plácenla y alcanzar el feto, sin que exista al mismo
tiempo una transferencia de IgG neutralizantes de la madre. El niño nace,
entonces, con el virus diseminado por las visceras, pero sin anticuerpos que
puedan modificar el curso de la infección. Algunos virus ECHO y Coxsackie A
y B se han asociado con infecciones de la madre en el último trimestre de
embarazo y del feto dentro del útero materno o en el momento del parto; se
han registrado brotes nosocomiales en los que el virus ha sido transmitido por
el personal sanitario. El virus ECHO 11 es particularmente virulento, causando
necrosis hepatocelular y meningoencefalitis. Generalmente, la infección peri-
natal debida a otros enterovirus es benigna. Los virus ECHO crecen bien en
cultivos de tejidos en tubos estándar y en tubos shell-vial (utilizando las líneas
celulares PMK. HDF y RD [cultivos celulares de rabdomiosarcoma]): los tipos
de especímenes empleados para el cultivo incluyen sangre del neonato,
liquido cefalorraquídeo, hisopados rectales y de garganta o tejidos (en casos
de muerte). La tipificación de los enterovirus puede realizarse en laboratorios
de referencia nacionales o locales (Modín, 1986).
1061
nostico en estos casos. El virus que se aisla con mayor frecuencia en los casos
de encefalitis es el VHS. como consecuencia de una reactivación del VHS1
latente que se extiende (a través de los nervios craneales, trigémino y olfativo)
hasta el córtex cerebral, produciendo una masa de tejido necrosado que ocupa
una cierta extensión. Anualmente se detectan unos 700 casos, con un patrón
esporádico no ligado a cambios estacionales. La progresión de la enfermedad
es muy rápida y la mortalidad elevada, aunque un diagnostico rápido y el trata-
miento con aciclovir reduce tanto la mortalidad como el grado de incapacidad
permanente (Whitley, 1995; Mitchell. 1997).
Los mosquitos son los vectores de cientos de virus neurotrópicos en el
mundo, pero sólo cuatro arbovirus (de arthropod borne, transmitidos por artró-
podos) son encontrados de forma regular en EE.UU.: el virus de la encefalitis
equina oriental, de la encefalitis equina occidental, de la encefalitis de San Luis
y el virus Calilomia-LaCrosse. El número total de casos varía desde unos 100
hasta más de 2.000 en años de epidemia. La gravedad y mortalidad son más
elevadas en el caso del virus de la encefalitis equina oriental, que es el menos
frecuente dentro del grupo (Calisher. 1994). La información actualmente dispo-
nible sobre la actividad global de los arbovirus y los riesgos para los viajeros
está disponible a través de los Centros para el Control y Prevención de Enfer-
medades en la siguiente dirección: wvvw.cdc.gov/travel.
Diversos enterovirus. especialmente los virus Coxsackie y ECHO, producen
encefalitis ocasionalmente; la poliomielitis (causada por el poliovirus, que pro-
duce una necrosis de la médula espinal y de las neuronas motoras cerebrales)
ha sido eliminada en EE.UU. y en la mayor parte del mundo. El virus de la rabia
se desplaza hasta alcanzar el SNC a través de las fibras nerviosas, produciendo
lesiones necróticas en el cerebro (Smith, 1999). Raramente se detectan compli-
caciones del tipo de la encefalitis en otras enfermedades virales como el saram-
pión, la parotiditis, la MI por VEB y la varicela (Kennedy. 1991): el VHH6 también
causa encefalitis focal (McCullers, 1995). La demencia en las fases avanzadas
del sida está causada, a menudo, por una replicacíón progresiva del VIH en las
células ghales del SNC (Atwood. 1993). En los pacientes inmunocompromelidos
también se producen infecciones necrotizantes por VHS, CMV y WZ, asi como
destrucción de la oligodendroglia por papovavirus JC.
Cerca del 75% de los casos de meningitis vírica en EE.UU. están causa-
dos por enterovirus, que típicamente siguen un curso benigno. La meningo-
encefalitis crónica grave puede manifestarse en niños con hipogammaglobu-
Imemia, y cualquier infección del SNC por enterovirus. con un componente de
encefalitis, es más virulenta y tiene riesgo de dejar secuelas permanentes.
Los enterovirus se transmiten fácilmente de persona a persona por vía oro-
fecal, existiendo una variación estacional, con brotes anuales durante el
Tabla 48-11 Virus a s o c i a d o s c o n e n f e r m e d a d e s d e l sistema
nervioso central
Causas menos
Síndrome Causas frecuentes
frecuentes

Meningitis aséptica Enterovirus VHS

ENCEFALITIS Y MENINGITIS VÍRICA VIH CML
Parotiditis WZ
Las infecciones virales del sistema nervioso central son relativamente infre- Hepatitis B
cuentes, aunque la morbilidad y mortalidad asociadas a las mismas son con- Poliovirus
Sarampión
siderablemente altas. El diagnóstico de laboratorio es importante para que los
hospitales puedan organizar eficientemente el tratamiento de los pacientes y Parálisis Enterovirus Poliovirus
Encefalitis Allavirus Rubéola
para que los organismos públicos responsables lleven a cabo el control de los Flavivirus Rabia
insectos que son vectores para los arbovírus. La proliferación de los virus en Bunyavirus Hepatitis B
las membranas meníngeas que rodean el cerebro provoca una inflamación VHS Adenovirus
aguda que cursa con fiebre, dolor de cabeza, rigidez de nuca y pleocitosis en Parotiditis CML
el líquido cefalorraquídeo. En la encefalitis, la replicacíón del virus tiene lugar Sarampión VVZ
VIH VRS
en el parénquima cerebral: la inflamación y la necrosis de los tejidos puede Enterovirus Vacuna
ser difusa o puede dar lugar a una lesión espacialmente definida y masiva. influenza
Muchos virus están asociados con cada una de las dos patologías (meningi- CMV
tis y encefalitis), aunque el daño puede solaparse implicando a ambas locali- Síndrome de VEB
zaciones anatómicas (meningoencefalitis) (Tabla 48-11). Guillain-Barré CMV
Síndrome de Reye Inlluenza A y B
La encefalitis es una enfermedad relativamente poco frecuente en EEUU VVZ
registrándose unos 2.000 casos anuales, aproximadamente El diagnóstico pre- HIV = virus de la mmunodeficien
ciso está limitado por el hecho de que algunos virus neurotrópicos son delica- linfocitica. para ver el significadc
dos, siendo necesario el empleo de técnicas moleculares par? realizar el diag- 48-3 y 48-4
 1062 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

9 y i) i) 9 9 9 '» 9 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
MESES/AÑOS

Figura 48-12. Variación estacional en el aislamiento de enterovirus (Lutheran General Hospital. Park Ridge. IL)

verano-otoño (Figura 48-12). Las infecciones por los virus de las parotiditis, (diferentes combinaciones de células PMK, HDF, HEp-2, RD y de mono verde
sarampión y adenovirus raramente se complican con una meningitis aguda. Buffalo) permite el crecimiento de muchos enterovirus y de otros virus (VHS,
Las infecciones agudas por el VIH producen ocasionalmente una inflamación VVZ, sarampión, parotiditis y adenovirus). Si se intenta llevar a cabo el aisla-
meníngea aguda (Fox, 1987). Aproximadamente en un 1% de infecciones pri- miento de virus, se debe inocular sin demora alguna un volumen de 0.1 mi a 0,2
marias de herpes genital por VHS2 se manifiesta una meningitis transitoria mi en los cultivos celulares en tubo estándar o en tubo shell-vial. Los ECP indu-
asociada: el VHS2 es la principal causa de la denominada meningitis linfocí- cidos por los enterovirus comienzan como un cambio picnólico focal, con células
tica benigna recurrente de Mollaret. aisladas que comienzan a redondearse y que rápidamente se extienden por la
monocapa del cultivo celular (Fig. 48-13). El ECP es detectable al cabo de unos
Diagnóstico de laboratorio cuatro días hasta en el 69% de los cultivos positivos. La tipificación de enterovi-
El método más sencillo y sensible para diagnosticar la encefalitis viral es la rus puede realizarse en los laboratorios de salud pública.
amplificación del ácido nucleico del virus a partir de una muestra de LCR. La En la Figura 48-14 se muestra un esquema de trabajo para el diagnóstico de
identificación de enterovirus por RT-PCR y de VHS, VVZ, VEB. CMV y HHV6 laboratorio de las infecciones víricas del SNC. Esta aproximación experimental
mediante PCR es una alternativa diagnóstica más sensible que la basada en el mejora el rendimiento del diagnóstico y favorece un uso eficiente de los recursos
aislamiento en cultivo de los virus responsables, tanto de LCR como de tejido de los laboratorios, especialmente en lo relativo a la identificación de las in-
cerebral; se han desarrollado algunos sistemas comerciales para la identifica- fecciones del SNC asociadas a los artrópodos. Un brote inesperado de encefa-
ción por PCR del VHS (Tang, 1998, 1999a). Se recomienda llevar a cabo un litis por el virus West Nile fue delectado rápidamente gracias a los esfuerzos
examen del LCR para detectar la presencia de proteínas, así como un recuento combinados de los laboratorios hospitalarios y gubernamentales (MMWR, 1999).
de células, puesto que los herpesvirus raramente son identificados cuando
ambos parámetros son normales en el LCR (Tang, 1999b). Ocasionalmente
puede realizarse una biopsia de cerebro, si existen sospechas clínicas de un
3
posible tumor o una infección no viral. Una biopsia de un tamaño de 0,5 cm es
más que suficiente para llevar a cabo el estudio anatomopatológico. realizar
extensiones citológicas para el examen directo, el análisis por PCR y el cultivo
pormenorizado de los posibles agentes infecciosos. La obtención del espéci-
men se describe en el Capítulo 57. La recuperación del VHS mediante cultivo
celular se ha descrito con anterioridad en otra sección de este mismo capítulo;
lambién debe intentarse el aislamiento de otros virus, y la muestra debe ser ino-
culada en todas las líneas celulares disponibles en el laboratorio. Las extensio-
nes teñidas mediante Giemsa o FDA pueden poner de manifiesto la existencia
de inclusiones nucleares herpéticas o de antígenos virales específicos. Muchos
arbovirus y algunos enterovirus han de ser inoculados en animales de labora-
torio para poder replicarse; si es necesario, la muestra de tejido puede conge-
larse a -70'C y enviarse a un laboratorio de referencia.

Los enterovirus son el agente infeccioso más común en la meningitis aséptica

aguda: la RT-PCR se ha convertido en la técnica idónea para la identificación de
enterovirus en LCR, con unos rendimientos del 128% al 142% cuando se com-
para con el aislamiento mediante cultivo celular (Rotbar, 1994, 1997; Kessler,
1997). Se necesitan entre 10 pl y 100 ul de LCR para la RT-PCR; los formatos Figura 48-13. Monocapa de un cultivo de tejidos de células A549 donde aparecen
simplificados de las pruebas de microtitulación han permitido acortar el tiempo de los ECP causados por la multiplicación de un enterovirus ECHO (aumento: x 200;
espera a 6 horas. El cultivo del LCR con la inoculación de varias líneas celulares microscopia de contraste de fases).
 CAPÍTULO 48
Figura 48-14. Esquema del prolocolo para el diagnóstico de la meningoencefalitis viral.
EXANTEMAS VIRALES
Varios tipos de virus atacan primariamente la piel: algunos infectan la epi-
dermis escamosa directamente (herpes oral y genital, verrugas causadas por
papilomavirus humanos o el molluscum conlagiosum provocado por poxvirus).
pero la mayoria de los exantemas son debidos a virus que afectan la piel y las
membranas mucosas por diseminación hematógena (VVZ, sarampión, rubéola,
enlerovirus. parvovirus. VHH6) (Cherry, 1993). La mayor parte de estas infec-
ciones son relativamente benignas y típicas de la infancia, que se diagnostican
clínicamente, sin necesidad de pruebas de laboratorio; sin embargo, el aisla-
miento del virus por cultivo, la identificación de antígenos virales o la confirma-
ción por métodos serológicos pueden ser de utilidad a la hora de elegir la tera-
pia antiviral, delimitar la extensión de la enfermedad en los casos graves o
aplicar medidas de control de la infección en los pacientes hospitalizados. Los
procedimientos diagnósticos de laboratorio se resumen en la Tabla 48-12.
El VVZ causa la varicela y el zóster. En la varicela, el VVZ se disemina
mediante gotítas de líquido infectadas en aerosoles que son inhalados, se
multiplica en la nasofaringe y seguidamente penetra en el torrente circulato-
rio, por donde circula hasta alcanzar la piel (Weller, 1992). La replicación del
virus en el epitelio escamoso da lugar a la aparición de unas vesículas pruri-
ginosas que rápidamente se transforman en úlceras que eventualmente se
recubren con una costra y curan sin dejar cicatriz. En los niños, los síntomas
sístémicos son suaves y las secuelas son raras: en los adultos, mujeres
embarazadas, neonatos y pacientes inmunocomprometidos, la enfermedad
puede ser más grave, con neumonía y afectación visceral además de las típi-
cas lesiones en la piel (Gershon, 1976), Una vez que la varicela ha remitido,
la infección por el VVZ se mantiene latente en los ganglios sensitivos neuro-
nales (Mahalingham, 1991; Straus. 1989); con la reactivación, el VVZ se
extiende desde las raíces de los ganglios trigéminos o dorsales hasta alcan-
zar nuevamente la piel, donde origina unas vesículas cutáneas dolorosas. con
una distribución en dermatoma (zóster). El zóster es más frecuente en ancia-
nos y en pacientes francamente inmunocomprometidos; cuando aparece en
adolescentes y adultos jóvenes, puede ser indicativo de una infección subya-
cente por el VIH (Pana, 1994)
Tabla 48-12 Diagnostico d e laboratorio de las e n f e r m e d a d e s e x a n t e m á t i c a s víricas c o m u n e s
Exantema Virus
Vancela/zósler Varicela-zóster
Erupción cutánea por enterovirus Enterovirus
(enfermedad de mano, pie y boca)
Sarampión Sarampión
Rubéola Rubéola
Eritema infeccioso Parvovirus B19
Exantema súbito VHH6
VHS VHS1 y VHS2
'Método recomendado
'Métodos utilizados en los laboratorios de investigación y/o referencia
VHH = herpesvirus humano; para ver el significado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 48-3 hasta la 48-6
• INFECCIONES VÍRICAS 1063
El liquido de las vesículas es rico en virus, siendo el espécimen ideal para el
aislamiento por cultivo y la tinción DFA. Las células HDF permiten el crecimiento
del VVZ. El cultivo en tubos tradicionales es un método lento y de poca sensi-
bilidad, pero si se utilizan tubos shell-vial para el cultivo, aumenta el rendimiento
(hasta un 75%) y la rapidez en la detección (Brinker. 1993). La recogida de
muestras a partir de las lesiones de la piel sospechosas de estar producidas por
el VZZ se lleva a cabo de la misma forma que en el caso de las vesículas cau-
sadas por el VHS. De igual modo, el protocolo para el cultivo del VVZ es simi-
lar al que se sigue para el VHS (Fig. 48-3); sin embargo, los cultivos estándar
en tubo se incuban durante dos semanas y las monocapas de células en los
tubos shell-vial se tiñen a los tres y cinco días con la técnica DFA, utilizando un
conjugado para el WZ. Los ECP causados por el WZ aparecen como peque-
ños parches de células redondeadas, hinchadas y retráctiles en la monocapa
de fibroblastos, y son semejantes a los que aparecen como consecuencia de la
proliferación del CMV. Debido a que la conducta del VVZ en los cultivos de teji-
dos es algo problemática, la tinción DFA de las células presentes en las vesí-
culas para detectar los antígenos virales es el método diagnóstico más rápido y
sensible (Schrim, 1989).
De los aproximadamente 70 serotipos de enterovirus. varios son capaces de
producir erupciones vesiculares o maculopapulares generalizadas (Coxsackie
B1 y A9, y virus ECHO 2, 4. 9,11,19 y 33). habitualmente durante los meses
cálidos. La enfermedad de mano, pie y boca (causada pnncipalmente por el
virus Coxsackie A16) es típica de niños pequeños, y se manifiesta con la apari-
ción de vesículas en la lengua y en la piel de la palma de las manos y la planta
del pie. Los miembros adultos de la familia del niño infectado también pueden
desarrollar, ocasionalmente, la enfermedad con los síntomas característicos. El
diagnóstico de laboratorio está limitado a la recuperación del virus en cultivos
celulares: la piel que recubre las vesículas, especialmente las de la palma de la
mano y planta del pie. debe levantarse completamente para dejar expuestas las
células escamosas, que deben recogerse frotando enérgicamente con un
hisopo. Las infecciones por enterovirus también afectan al tracto gastrointesti-
nal, por lo que el material recogido con hisopo de la garganta y el recto es apro-
piado para llevar a cabo el cultivo. La identificación de enterovirus en cultivos
celulares ha sido descrito en una sección anterior de este capitulo. Ni la tinción
Cultivo/Detección de antigenos Serologia
Preparación de Tzanck EIA o IFA (varicela)
Extensión para DFA* para IgM
Cultivo (mayor sensiblidad en tubos s/tell-vial)
Cultivo*
Cultivo EIA o IFA para IgM"
Cultivo de interferencia' EIA para IgM"
1 :
HIS en eritroblastos infectados EIA o IFA para lgM
+
PCR
Co-cullivo en linfoblastos* EIA para IgM'
Cultivo*
Frotis para tinción DFA
 1064 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
DFA ni la serología tienen utilidad para el diagnóstico de los exantemas produ-
cidos por enterovirus (Cherry, 1963,1993; DeChamps, 1988).
El sarampión es una enfermedad viral altamente contagiosa que tiene sín-
tomas sistémicos y respiratorios (liebre, conjuntivitis, coriza, lesiones orales,
tos y una erupción cutánea eritematosa y maculopapular generalizada)
(Bellini, 1994). La vacunación ha reducido en gran medida la incidencia del
sarampión en EE.UU., pero la enfermedad continúa siendo un grave pro-
blema en países pobres, en donde está asociada con una gran morbilidad y
mortalidad, debido a las complicaciones acompañantes (neumonía) y a la
malnutrición. El virus causante puede aislarse de la nasofaringe al comienzo
de la enfermedad, aunque la infección aguda se diagnóstica más fácilmente
por técnicas serológicas, detectando las IgM específicas frente al virus. La
inmunidad adquirida tras la infección permanece, presumiblemente, de por
vida y se comprueba mediante la detección de IgG especificas: sin embargo,
la inmunidad debida a la vacunación puede desvanecerse durante los últimos
años de la adolescencia y la madurez. La infección que pueda producirse en
estas circunstancias produce una enfermedad atípica, con unas grandes posi-
bilidades de sufrir neumonitis y con una erupción no característica. El diag-
nóstico serológico es particularmente útil en el caso del sarampión atípico.
El parvovirus B19 produce un tipo de exantema infantil denominado eritema
infeccioso (en ocasiones denominado "quinta enfermedad" o exantema escolar),
una enfermedad febril infantil que presenta una erupción cutánea maculopapular
distintiva que da a la cara una apariencia de "mejillas abofeteadas" (Erdman,
1991: Plummer, 1985). La infección en los adultos puede producir también ar-
iralgias (Naides, 1990). Los parvovirus infectan las células precursoras inmaduras
del linaje eritrocitario, presentes en la médula ósea, y pueden provocar crisis aplá-
sica en pacientes con hemoglobínopatía o con infección por VIH (Harris, 1992).
La infección primaria durante el embarazo puede ocasionar una aplasia de gló-
bulos rojos en el feto, con anemia grave e hidropesía fetal. El diagnóstico de
laboratorio fue objeto de análisis con anterioridad dentro de este mismo capítulo.
El virus de la rubéola produce el denominado sarampión alemán, una enfer-
medad febril suave con una erupción cutánea maculopapular transitoria (Cherry,
1993). La infección en los niños no tiene mayores consecuencias, aunque en los
adultos puede provocar artralgias. La única complicación seria de la rubéola es
la diseminación transplacentaria del virus hasta alcanzar al feto, lo que conlleva
un riesgo muy elevado de aparición de malformaciones congénitas. La infección
aguda se diagnostica mediante la detección de IgM específicas frente al virus. La
comprobación de la situación mmunitaria de una persona se determina fácil-
mente investigando si posee IgG específicas frente al virus.
El VHH6, un virus linfotrópico capaz de infectar a los linfocitos B y T, causa
el exantema súbito (roséola infantil), una enfermedad autolimitada, común de la
primera infancia, que se caracteriza por una fiebre elevada y la aparición de una
erupción cutánea maculopapular fugaz, que desaparece al mismo tiempo que
la fiebre remite bruscamente (Asano, 1994; López. 1988: Salahuddin, 1986). La
infección primaria, por el VHH6 en niños mayores y en adultos está asociada a
una enfermedad febril linfoproliferativa, con características de MI aguda (des-
crita con anterioridad en este capítulo) y que pudiera estar asociada con el sín-
drome de fatiga crónica, y posiblemente con retinitis y neumonitis en pacientes
inmunosuprimidos (Cone, 1993). También se ha descrito el diagnóstico de labo-
ratorio de la infección causada por el VHH6 en este capítulo.
GASTROENTERITIS VÍRICA
La gastroenteritis vírica es una importante causa de morbilidad y mortali-
dad en todo el mundo, con una mayor incidencia en los niños pequeños en paí-
ses en vías de desarrollo. En EE.UU., la enteritis de origen vírico raramente es
mortal, aunque se detectan del orden de 3 millones de casos anualmente, con
unas 200.000 hospitalizaciones pediátricas, aproximadamente ¡Parashar,
1998). Los virus responsables son muy diversos, pero todos comparten la
característica de ser ubicuos. En bebés y niños pequeños, la diarrea grave está
causada por rotavirus, adenovirus entéricos, calicivirus, astrovirus y coronavirus
(Bates, 1993: Barnes, 1999). El virus Norwalk y otros virus parecidos provocan
náuseas, vómitos y diarrea, principalmente en adultos (Hedberg, 1993) (Fig. 48-
15). El tratamiento de todas la gastroenteritis virales es de mantenimiento.
Los rotavirus son responsables de al menos el 50% de los casos de diarrea
acuosa en niños pequeños y bebés en EE.UU.; la enfermedad tiene un pico
en su incidencia entre los 3 y los 15 meses de edad (Haffejee, 1991). Tam-
Figura 48-15. Detección de virus que producen gastroenteritis mediante enzimoin-
munoensayo (EIA) y microscopía electrónica (ME).
bien se detectan infecciones sintomáticas por rotavirus en ancianos ingresa-
dos en residencias (Marríe. 1982).
La transmisión es por vía orofecal. y en las áreas de clima templado las epi-
demias por rotavirus tienen lugar durante los meses frios: sin embargo, en cli-
mas cálidos los casos aparecen durante todo el año. La deshidratación con des-
equilibrio electrolítico es la complicación más grave de la infección por rotavirus,
y es la razón principal para hospitalizar al paciente. Los rotavirus pueden sobre-
vivir transitoriamente en superficies inertes, razón por la que deben extremarse
las medidas de control y aislamiento para prevenir la diseminación nosocomial.
Los serotipos 40 y 41 de adenovirus están asociados con procesos de gas-
troenteritis y son responsables de un 10% a un 20% de las infecciones de este
tipo en niños (Brandt, 1983). La enteritis por adenovirus es similar a la enferme-
dad causada por rotavirus, aunque no muestra variaciones estacionales. Los
astrovirus han sido identificados como responsables de infecciones nosocomia-
les y de brotes en asilos (Mitchell, 1993; Sastri, 1998): también se han detectado
casos de gastroenteritis suave en adultos y de diarrea en pacientes infectados
por el VIH (Grohman, 1993). Los calicivirus son responsables de entre el 1% al
6% de casos de gastroenteritis en niños pequeños y, ocasionalmente, en ancia-
nos (Dinulos. 1994). Los coronavirus raramente causan diarrea en niños.
El virus Norwalk y otros virus morfológicamente relacionados con él (Hawaii;
Snow Mountain) se incluyen dentro del grupo de los calicivirus; todos ellos pro-
vocan gastroenteritis aguda, que se caracteriza por que los afectados manifies-
tan náuseas y vómitos más intensos que la propia diarrea acompañante. Los
niños mayores y los adultos son los más frecuentemente afectados, aunque
todos los grupos humanos pueden ser afectados con independencia de la edad.
Los virus Norwalk sobreviven en aguas contaminadas, crustáceos y alimentos
preparados, y son responsables de numerosos brotes en todo el país (EE.UU.)
(Hedberg. 1993).
Diagnóstico de laboratorio
Todos los virus causantes de gastroenteritis crecen pobremente, o no lo hacen
en absoluto, en las líneas celulares estándar. El diagnóstico se ha basado tradi-
cionalmente en la morfología distintiva de cada uno de ellos mediante microsco-
pía electrónica (ME) (Fig. 48-16). Las muestras de heces se centrifugan y se fil-
tran, y una alícuota de la muestra procesada se transfiere a una rejilla para ME
y se tiñe con ácido fosfotúngstico. Los virus son teñidos negativamente mediante
este procedimiento, lo que permite visualizar con gran facilidad sus característi-
cas morfológicas (tamaño, organización de la cápsida, características distintivas
de la superficie). Si se añade un anticuerpo especifico al filtrado de la muestra
de heces, se consigue aglutinar las partículas víricas en acúmulos, lo que facilita
su reconocimiento e identificación (inmunomicroscopia electrónica).
Los rotavirus son virus con una cápsida icosaédrica sencilla o doble, sin
envuelta, que miden entre 55 nm y 75 nm de diámetro y tienen un aspecto que
recuerda a una rueda. Los adenovirus entéricos son morfológicamente idénticos
al resto de adenovirus; tienen una cápsida icosaédrica y tienen un diámetro
entre 70 nm y 90 nm. Los calicivirus también carecen de envuelta, tienen entre
30 nm y 35 nm de diámetro y presentan una serie de depresiones en forma de
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS 1065

copa ordenadas regularmente en su cápsida. Los astrovirus tienen entre 27 nm

y 30 nm de diámetro: ciertas estructuras de su cápsida dan lugar a una morfo-
logía que semeja a una estrella de seis puntas. Los virus Norwalk miden entre
24 nm y 40 nm, y son virus sin envuelta, geométncamente simétricos. Los coro-
navirus son los únicos virus, dentro de este grupo, que presentan una envuelta
lipídica: los viriones son más grandes (tienen un diámetro entre 75 nm y 100 nm)
y presentan unas estructuras en forma de bastón que se proyectan desde la
cubierta, dando al conjunto la apariencia de una corona.
La morfología de cada tipo de virus al microscopio electrónico es muy carac-
terística, pero la ME no está disponible en muchos laboratorios. Se puede lle-
var a cabo una detección sencilla y precisa de rotavirus en heces mediante
¡nmunoensayos o aglutinación con látex. Ambos métodos tienen una gran espe-
cificidad, pero el EIA tiene una sensibilidad ligeramente superior (Dennehy.
1994,1999: Thomas, 1994). El diagnóstico rápido es de gran ayuda en el caso
de pacientes hospitalizados para aplicar las medidas que eviten o reduzcan la
diseminación nosocomial de los virus. Está disponible comercialmente un EIA
para detectar antigenos de adenovirus entéricos que también es sensible y
específico. Se han desanollado una serie de métodos (EIA, técnicas de hibri-
dación directa o previa amplificación con sondas de ácidos nucleicos, y ensa-
yos genotípicos) para otros virus que producen gastroenteritis que están dispo-
nibles en los laboratorios de investigación y de sanidad pública; estos métodos
han sido de particular utilidad en la evaluación de los brotes relacionados con
la ingestión de alimentos contaminados.
HEPATITIS VÍRICA E INFECCIONES POR RETROVIRUS
Muchos virus afectan directamente al hígado. El virus de la fiebre amarilla y
otros arbovirus hepatotóxicos provocan una necrosis hepatocelular masiva. La
agregación de linfocitos atípicos en el hígado asociada a la infección por VEB.
CMV. VHH6 y VIH también provoca daño hepático como parte del síndrome de
la mononucleosis. En pacientes inmunodeprimidos. adenovirus. VHS, VVZ. CMV
y virus ECHO causan, ocasionalmente, una hepatitis muy agresiva (Hierholzer,
1992). De todos modos, la mayor parte de enfermedades víricas del hígado
están producidas por los virus de la hepatitis A, B, C. D y E. que son todos hepa-
totrópicos y causan una lesión debida a la destrucción litica de los hepatocitos
(Iwarson, 1992).
El contagio por los virus de la hepatitis A (VHA) y de la hepatitis E (VHE)
tiene lugar de persona a persona, transmitiéndose por vía oro-fecal. El VHA
es un picomavirus sin envuelta relacionado con los enterovirus que puede
sobrevivir en agua contaminada y alimentos; los mariscos contaminados con
aguas residuales sin depurar han sido responsables de varios brotes de gran
envergadura. Las personas que viven en condiciones sanitarias deficientes,
los niños en los asilos y en instituciones masificadas. y personal sanitario o
que está al cuidado de niños representan los grupos que tienen mayor riesgo
de resultar infectados por el VHA (Iwarson, 1992). En los niños, la enferme-
dad aguda es suave y, a menudo, asintomática: ocasionalmente, los adultos

Figura 48-16. Observación al microscopio electrónico de preparaciones de muestras de

heces teñidas negativamente con ácido losfotúngstico. A, Rotavirus: se aprecian distintos
monotipos con cápsida sencilla o doble (aumento: x 200.000). 6. Adenovirus: se aprecia el
característico patrón triangular en la superficie (aumento: x 100.000). C. Calicivims: se apre-
cian las depresiones superficiales en forma de copa (aumento: x 200.000). En la microgra-
fia se pueden observar también dos rotavirus (de mayor tamaño) por encima de los calicivi-
ms. (Fotografías cortesía de Teresa Valdivieso.)
 1066 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 48-13 Características clínicas de las infecciones por virus de la hepatitis

Hepatitis A Hepatitis B Hepatitis C Hepatitis D Hepatitis E
Clasificación Picornaviridae Hcpadnavindae Flaviviridae Virus satélites Calicivirus
(Enterovirus 72)
Via de iransmisión Fecal-oral Percutánea. mucosas Percutánea, mucosas Percutánea, mucosas Fecal-oral
Genotipos Uno Al menos 8 Al menos 6 Uno Uno
Tiempo medio de 4 semanas 12 semanas 8 semanas (21-91 días) 6 semanas
incubación (rango) (10-50 dias) (14-180 dias) (14-182 dias) (14-63 dias)
Cronificación No 10% en adultos, 85% (un 20% 5%-10% Poco (recuente
25% en niños. desarrolla una
80% en beóés cirrosis)
?
Riesgo de carcinoma hepatocelular No Si. elevado Sí, bajo No
Porcentaje de mortalidad. -0.3% -1,4% t%-2% 2%-20%, con cointección 1 %-2%; hasta un
hepatitis aguda con VHB, 30% 20% en mujeres
con sobreinlección embarazadas

pueden desarrollar una enfermedad grave, aunque la hepatitis fulminante con
resultado de muerte es rara (un 0,6% o menos de los afectados). La recupe-
ración es total y no existe estado de infección crónica. Existen vacunas para
el VHA que son seguras y eficaces (Ashur, 1999). Se han producido brotes de
la enfermedad debidos al VHE en países en vías de desarrollo que tienen
unas condiciones de alimentación y de potabilización del agua por debajo de
los niveles óptimos, habiéndose descrito muy pocos casos en EE.UU. (Viswa-
nathan, 1957: Wald, 1995). Los más frecuentemente afectados son los ado-
lescentes y los adultos jóvenes. La mortalidad es muy baja, excepto en el
caso de las mujeres embarazadas, en las que el porcentaje de fallecimientos
puede alcanzar el 20% (Duff, 1998). El VHE no provoca infección crónica.
El virus de la hepatitis B (VHB) se transmite normalmente a través de la san-
gre, y la infección se contrae, clásicamente, mediante transfusiones con sangre
infectada o pinchazos con agujas hipodérmicas contaminadas. Sin embargo, la
transmisión vertical de la madre al feto durante el embarazo, el contagio por con-
tacto sexual directo y la exposición a fluidos corporales, como la saliva en el
ambiente familiar, también son rutas importantes para la diseminación de la
enfermedad. La infección aguda es, frecuentemente, sintomática y puede ser ful-
minante, causando una necrosis hepatocelular masiva de pronóstico fatal en un
1% o 2% de los casos. La infección por el VHB puede hacerse crónica, aunque
el carácter crónico depende de la edad en la que se contrajo la infección. Hasta
un 90% de los niños que adquirieron la infección en el útero, por transmisión ver-
tical desde la madre, pueden convertirse en portadores crónicos, comparado con
el 25% que se detecta entre niños infectados con postenoridad al nacimiento o
el 10% entre los adultos. El daño hepatocelular es continuo durante la infección
crónica: en el 2% de los casos de infección crónica puede manifestarse una
forma crónico-activa de hepatitis con riesgo eventual de cirrosis (Lee, 1993;
Overby, 1992). La cirrosis por VHB es un factor de riesgo para desarrollar un car-
cinoma hepático (CCH). La infección por VHB puede ser prevenida en gran
medida mediante vacunación. La vacunación masiva de niños en Taiwan ha
reducido de forma significativa la incidencia del CCH pediátrico (Chang, 1997).
La coinfección o sobreinfección del VHB con el virus de la hepatitis D
(VHD) provoca una aceleración en la destrucción de hepatocitos y un incre-
mento en los porcentajes de mortalidad hasta valores de un 30%. El VHD es
un virus incompleto que necesita la intervención de ciertos antígenos del VHB
para poder expresarse y replicarse completamente. El VHD puede transmi-
tirse de persona a persona en entornos familiares, en aquellas áreas donde
el virus tiene carácter endémico (América del Sur. África. Italia), aunque en
EE.UU. las transfusiones sanguíneas y la drogadicción por vía intravenosa
son las principales causas de transmisión (Hadziyannis. 1997).
En EE.UU., el virus de la hepatitis C (VHC) es el responsable de la denomi-
nada hepatitis no A, no B, siendo el responsable del 80% al 90% de los casos de
hepatitis adquirida tras una transfusión sanguínea, antes de que se establecie-
sen, a partir del año 1990. los análisis habituales para el control de la sangre y
los hemoderivados (Cuthbert, 1994). El consumo de drogas por vía parenteral
es, en la actualidad, el principal factor de riesgo; el personal sanitario infectado
por haberse pinchado inadvertidamente con agujas contaminadas constituye un
porcentaje minoritario de casos. La transmisión del VHC durante el embarazo, o
como consecuencia de relaciones sexuales o contacto entre miembros en el
entorno familiar, se da con una eficiencia mucho menor de la observada para el
VHB (Rooney, 1998). El porcentaje de casos de hepatitis fulminante con resul-
tado de muerte es semejante al que se observa asociado a la infección por el
VHB. Sin embargo, más del 75% de infecciones por el VHC se hacen crónicas
y hasta un 20% acaban en cirrosis; el riesgo de desarrollar un carcinoma hepa-
tocelular también es elevado. El tratamiento con interferón-u y ribavirina ha tra-
ído como consecuencia una disminución progresiva de los casos de infecciones
crónicas por VHB y VHC, lo que puede modificar o prevenir, a largo plazo, las
secuelas duraderas (Yoshioka, 1992; Christie, 1999). Desafortunadamente, el
porcentaje de respuesta es menor en las infecciones por el genotipo 1 del VHC.
que representan el 75% de todos los casos en EE.UU. (Gitnick, 1998).
Las técnicas de segunda y tercera generación de inmunotransferencia con
proteínas recombinantes y los métodos de enzimoinmunoensayo (EIA) tienen

Tabla 48-14 M a r c a d o r e s s e r o l ó g i c o s y antigénicos en el diagnóstico de la hepatitis

VHA - aguda
Antigua/pos-
vacunación
VHB - temprana
Período ventana
En resolución
Crónica
Antigua
Posvacunación
VHC -aguda
Crónica
Antigua
VHD - cointección
Sobreinlección
VHE
+ = posUivo - = negalivo
Adaptada de Biesemier KW. Parks D. Gertis C y cols : Viral hepatitis serology at the University ol North Carolina Hospitals Update. Bull Lab Med 1994; 134:1; con
permiso del editor.
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
una elevada sensibilidad y especificidad en la delección de anticuerpos (rente
al VHC. Los pacientes seropositivos deben ser evaluados adicíonalmente en
busca de una infección persistente por el VHC. realizando estudios de la fun-
ción hepática en los mismos y. en algunos casos, una biopsia hepática, cuanti-
ficando mediante RT-PCR la carga de ARN del VHC y, si procede, caracteri-
zando el genotipo del virus (Lam, 1999).
Los cinco virus de la hepatitis no se replican en las líneas celulares están-
dar. La fase en la que se encuentra la infección queda definida mediante la
detección de IgM e IgG específicas y de antígenos virales (Biesemier, 1994).
Las características clínicas de los virus do la hepatitis y los marcadores sero-
lógicos de infección se resumen en la Tabla 48-14.
A partir de individuos que han desarrollado una hepatitis después de haberles
sido realizada una transfusión, se han aislado el virus de la hepatitis G'GVB-C
(un flavivirus relacionado con el VHC) y el virus transmitido por transfusión (VTT),
un virus con ADN de cadena sencilla. Sin embargo, ambos virus se encuentran
frecuentemente en personas asintomáticas, por lo que su asociación con una
patología hepática no está clara (Hadziyannis, 1998; Abe. 1999: Ding, 1999).
Virus de la inmunodeficiencia humana
El VIH-1 es un retrovirus incluido dentro de la subfamilia Lentivirinae que
en la actualidad parece estar diseminado por todo el mundo. El VIH infecta y
destruye a los Imfocitos T-CD4, lo que da lugar a que se produzcan numero-
sas infecciones oportunistas y tumores secundarios en los individuos afecta-
dos (Phillips, 1992; Stein. 1992; Poli, 1993: Schnittman, 1990). El VIH también
es neurotrópico y puede causar meningitis aguda y una encefalopatía des-
tructiva lenta (Atwood, 1993).
La mitad de los individuos con intección aguda manifiestan unos síntomas
parecidos a los de la mononucleosis (véase la sección titulada Mononucleo-
sis infecciosa heterófilo-negatíva, en este mismo capitulo) antes de entrar en
una fase asintomática en la que va teniendo lugar una destrucción progresiva
de las células T-CD4. El tiempo medio necesario para manifestar todas las
características del sida es de 10 a 11 años: entre el 5% y el 10% de los afec-
tados desarrollan el sida en dos o tres años, mientras que entre un 5% y un
10% de infectados mantienen estables los valores de recuento de linlocitos y
permanecen asmtomáticos indefinidamente (Muñoz, 1995). Los niños que
han sufrido una infección vertical en el momento del nacimiento muestran
generalmente una progresión muy rápida de la enfermedad (Downs. 1995).
Existen varios sistemas comerciales basados en la técnica del enzimoinmuno-
ensayo, preparados con antígenos purificados del VIH u obtenidos mediante
recombinación, que son capaces de detectar IgG especificas frente al VIH, entre
dos y cuatro semanas después de que se haya producido la infección, con unos
niveles de especificidad y sensibilidad excelentes. Los bancos de sangre buscan
de forma habitual los anticuerpos frente al VIH-2: esta es una estrategia desea-
ble también en las áreas de África, donde la infección es endémica. Un EIA que
ha dado positivo para anticuerpos frente al VIH debe ser repetido y a continua-
ción confirmado con un test adicional como la mmunotransferencia [Western
immunoblotting, mediante el cual sea posible verificar que los anticuerpos del
paciente reaccionan con antígenos específicos del VIH (MMWR, 1991). Los
resultados que se muestren en los informes serológicos de laboratorio en rela-
ción con el VIH deben ser concisos, y debe evitarse el empleo de comentarios
ambiguos o confusos (Hewitt. 1992).
El VIH puede propagarse en cultivos de tejidos, co-cultivando linlocitos o
muestras de tejidos infectados del paciente con linfocitos de un donante sano
que hayan sido estimulados con fitohemaglutinma. mterleucina-2 e mterferón.
Esta es una técnica cara y compleja, y potencialmente peligrosa, que no debe
realizarse en los laboratorios de diagnóstico ordinario. La necesidad de tener
que aislar el VIH mediante cultivo ha sido reemplazada por los métodos de
diagnóstico molecular.
La amplificación por PCR del ácido nucleico proviral del VIH se utiliza, en
principio, para diagnosticar la infección Iransmitida verticalmente durante los pri-
meros meses de vida del recién nacido (véase la sección titulada Infecciones
víricas congénitas y perinatales, en este mismo capitulo). Los ensayos para
determinar la carga viral cuantifican los transcritos de ARN del VIH en el plasma.
Estas determinaciones tienen un valor prognóstico y han representado una
revolución en el uso de la terapia antirretroviral. Las reducciones en el número
de copias de ARN viríco. hasta un valor de 0,5 unidades logarítmicas por mi.
inducidas por el tratamiento, se asocian con una progresión clínica más lenta.
1067
El tratamiento antirretroviral de gran eficacia (TARGA) con drogas pertenecien-
tes al menos a dos clases distintas de antirretrovirales (análogos nudeósidos
inhibidores de la transcriptasa inversa, inhibidores no análogos e inhibidores de
la proteasa) ha mejorado de forma espectacular las expectativas de supervi-
vencia y la calidad de vida de los afectados (Saag, 1996; Shafer, 1999). La
terapia también ha reducido enormemente la transmisión perinatal. Desgracia-
damente, continúan apareciendo variantes del virus resistentes a los antirretro-
virales, incluso en aquellos pacientes que están recibiendo una terapia combi-
nada, lo que refuerza la necesidad de trabajar constantemente en la búsqueda
y producción de nuevos tipos de agentes antirretrovirales.
El VLHT (virus de la leucemia humana de células T) infecta a los linlocitos
T-CD4- y causa una leucemia adulta de células T (LAT); la enfermedad se da
entre el 2% y el 4% de las personas infectadas por el VLHT-1 en áreas endé-
micas del Japón (Folks, 1998). El VLHT-I también causa mielopatia/parapa-
resis espástica tropical (HAM/TSP). una enfermedad degenerativa crónica
caracterizada por un debilitamiento progresivo de las extremidades inferiores,
espasticidad y pérdida de la función sensorial y del control de la vejiga
(Manns, 1999). El VLHT-II se ha aislado a partir de pacientes con leucemia de
células T peludas o tricoleucemia, aunque la relación del virus con la enfer-
medad no está claramente establecida. Existen técnicas de enzimoinmuno-
ensayo para la detección de anticuerpos que se utilizan en bancos de sangre.
INFECCIONES VÍRICAS EN HUÉSPEDES
INMUNOCOMPROMETIDOS
La respuesta inmune a la infección por virus implica una compleía interac-
ción tanto de factores humorales como celulares. El control de la infección
aguda es llevado a cabo por los procesos de la inmunidad celular. Los granu-
locitos natural M/er(NK) de gran tamaño que circulan por la sangre y los teji-
dos identifican aquellas células que expresan antígenos virales (antigenos
extraños o no propios) y las destruyen por lisis proteolítica. Al principio de la
infección aguda, los antigenos virales son procesados por los macrofagos y
presentados a los Imfocitos T: las células T-CD4 producen citocinas que pro-
mueven la expansión clonal de las células T-CD8 citotóxicas. las cuales elimi-
nan, a continuación, las células hospedadoras que contienen antigenos vira-
les. Cualquier alteración en la normal interacción entre las células CD4, CD8 y
los NK reduce la capacidad del huésped para controlar la enfermedad vírica.
La inmunidad mediada por células también juega un papel crítico en la
supresión de virus que se encuentran en fase de latencia en el hospedador
(tales como VHS. CMV y VEB). En los individuos sanos, la mayor parte de
infecciones por reactivación con estos virus son asintomáticas o producen
una enfermedad limitada que queda confinada a localizaciones anatómicas
concretas (p. ej.. el herpes oral o genital). Si los mecanismos de la inmunidad
celular están alterados, cualquier infección recurrente puede dar lugar a un
Figura 48-17. Monocapa de fibroblastos MRC-5 que muestra los ECP causados
por la replicación del CMV tras 11 días de incubación (microscopía óptica de con-
traste de fases: aumento: x 100).
 1068 SECCIÓN VI MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 48-15 Direcciones d e interés e n Internet
Nombre de la página
Centers tor Disease Control and Prevention
Wold Health Organization
Association for Professionals m Infection Control and Epidemiology
Medscape
American Society tor Microbiology
European Society lor Clinical Virology
National Centers lor Inlectious Diseases
Pan American Society lor Clinical Virology
Lab Explorer
All the Virology on Ihe WWW
Johns Hopkins Infectious Disease
proceso altamente agresivo a nivel local o bien a la diseminación del agente
patógeno, produciendo lesiones multiorgánicas graves.
El número de pacientes inmunodeprimidos se ha incrementado de forma
espectacular en los últimos 20 años. Los tratamientos con corticosteroides, qui-
mioterápicos, radiaciones, drogas inmunosupresoras, asi como la eliminación de
los linfocitos T-CD4 por la acción del VIH, causan daño en los mecanismos que
regulan la respuesta inmune celular y aumentan la susceptibilidad a la infección
por una gran variedad de virus. Infecciones pnmanas como la mononucleosis por
el VEB. la gripe y la varicela son, a menudo, mucho más graves en estas cir-
cunstancias. También puede tener lugar una proliferación de los condilomas
genitales causados por papilomavirus humanos, con una progresión acelerada
hacia la displasia escamosa y el carcinoma, tanto en mujeres como en hombres.
A menudo, las enfermedades víricas más graves son consecuencia de la reacti-
vación en el hospedador de virus durmientes endógenos (CMV, VHS y VVZ). En
este contexto, se han descrito casos de necrosis de las lesiones mucocutáneas
orales y perianales causadas por el VHS, y zóster con afectación de varios der-
matomas. Las infecciones víricas oportunistas más comunes están causadas
por CMV. en pacientes infectados por el VIH y en trasplantados. Los enfermos
de sida con unos valores de recuento de células CD4 por debajo de 100 por mnv
padecen retinitis por CMV como complicación más frecuente. También se dan
casos de neumonía, así como de infecciones del tracto gastrointestinal y del
SNC causadas por CMV. Tampoco es infrecuente observar afectación multior-
gánica en autopsia (Drew, 1992).
La infección por CMV produce las típicas inclusiones específicas en las célu-
las infectadas, aunque la observación de las mismas carece de sensibilidad de
cara al diagnóstico. La sensibilidad se incrementa ligeramente realizando tin-
ciones con inmunoperoxidasa o hibridación in silu (HIS). aunque el aislamiento
del virus es la técnica que goza de una mayor precisión diagnóstica. El CMV se
replica casi exclusivamente en la línea celular HDF: su crecimiento es lento,
siendo necesario incubar durante siete dias. e incluso más. para que se des-
arrollen los ECP. Los fibroblastos infectados conservan inicialmente su morfolo-
gía fusiforme, mientras que su núcleo se hincha y se hace más refringente.
Figura 48-18. Cultivo de fibroblastos MRC-5 en tubos shelt-vial donde se aprecia un
gran número de núcleos fluorescentes tras la tinción con el anticuerpo específico
frente al antigeno precoz del CMV, conjugado con fluoresceina (aumento: x 250).
Dirección en la web
http:/Avww cdc gov/
http:/Avww who.mt/
http://www.apic.org/
http://www medscapc.com
http//www asmusa org/
http://www.eur nl/FGG/VIRO/ESCV/
http://www cdc. gov/nc idod/
hllp://www virology.org/
http://www.labexplorer.com/
hltp://www. virology.net
http/Avww.hopkins-id.edu/
Eventualmente. toda la célula puede redondearse y distorsionarse, a la vez que
el virus se extiende a las células adyacentes, formando una zona de células
dañadas que va aumentando de tamaño progresivamente (Fig. 48-17).
La detección del CMV se acorta en uno o dos días si se utilizan los cultivos
en tubos shell-vial y se lavorece la adsorción de los virus a la monocapa de
células mediante centrifugación (Gleaves, 1984, 1987). Las monocapas de
células HDF se inoculan con leucocitos de sangre periférica (separados
mediante centrifugación en gradientes de densidad), liquido del lavado bron-
quioalveolar (LBA). orina o tejidos homogeneizados; tras unas 16 a 40 horas de
incubación, la monocapa se tiñe con un anticuerpo especifico frente al antigeno
precoz del CMV. conjugado con fluoresceina. Los fibroblastos infectados mues-
tran una fluorescencia homogénea por todo el núcleo (véase Fig. 48-18) La
especificidad del método es del 100% y la sensibilidad excelente cuando los cul-
tivos celulares se inoculan con orina, tejidos homogeneizados o LBA (del 95%
al 100%). Sin embargo, la inoculación de leucocitos de sangre periférica en cul-
tivos en tubos shell-vial tiene tan sólo una sensibilidad del 75% comparada con
la que se obtiene cuando la inoculación se lleva a cabo en monocapas en tubos
estándar: por tanto, se recomienda siempre efectuar un cultivo suplementano.
En los pacientes inmunocomprometidos. el CMV es la causa más frecuente de
viremia. aunque ocasionalmente estos individuos pueden desabollar infeccio-
nes por VVZ, VHS. adenovirus y. a veces, enterovirus. Los cultivos tradiciona-
les en lubo de células HDF y A549 incubados durante 14 días luncionan ade-
cuadamente para la recuperación de todos esos agentes y también del CMV
(Stanberry, 1994). Otra ventaja del aislamiento del CMV en tubos shell-vial es
la facilidad con que esta técnica permite realizar cultivos semicuantilativos
(Buller, 1992: Slavin, 1992). El empleo de un inoculo estandarizado de células
(leucocitos o células del LBA) y un recuento de los núcleos fluorescentes que
aparecen en el cultivo celular tras la tinción con el anticuerpo especifico frente
al antigeno precoz del CMV. conjugado con fluoresceina, proporciona unos
datos que tienen una cierta utilidad clínica a la hora de eslimar la gravedad de
la infección, controlar la respuesta al tratamiento y realizar una estimación pro-
nóstica. En cualquier caso (cultivos celulares en tubos estándar o en tubos
shell-vial), la recuperación del CMV se incrementa si los especímenes se ino-
culan inmediatamente después de haber sido obtenidos en cultivos celulares
frescos (Brumbach, 1997; Roberts, 1997).
La infección por CMV en receptores de trasplantes de órganos o de médula
ósea (alogénico) compromete seriamente el resultado de los mismos El virus
puede dañar directamente los órganos trasplantados, y la toxicidad de las dro-
gas antivíricas asi como la deliberada disminución de la terapia inmunosupre-
sora anti-rechazo también pueden representar una seria amenaza para la
supervivencia del injerto. Los cultivos de vigilancia ordinarios del CMV :¡enen
una utilidad escasa para predecir el desarrollo de una enfermedad por CMV y
tomar decisiones clínicas (Falagas, 1997). La determinación cuantitativa del
antigeno pp65 del CMV en leucocitos de sangre periférica y la delección del
ADN del virus mediante PCR son técnicas más sensibles que el cultivo y tam-
bién son capaces de detectar la viremia con mayor antelación (Méndez, 1998;
Boeckh. 1998). Los análisis secuenciales suministran datos de alerta temprana
que permiten ajustar con la mayor precisión posible las terapias antivirales e
inmunosupresoras. La detección del antígeno del CMV se lleva a cabo en los
leucocitos de sangre periférica, mediante el método IFA (Erice, 1995; Storch,
1994; Landry, 1996); la principal limitación de esta técnica es la leucopema. La
PCR cuantitativa parece ser un procedimiento útil para predecir infección por
CMV en personas sometidas a un trasplante de hígado o riñon (Drouet. 1994.
 CAPÍTULO 48 • INFECCIONES VÍRICAS
Roberts. 1998). La detección de un número alto y constante de copias del ADN
vírico es un dato que indica riesgo de padecer retinitis por CMV en individuos
infectados por el VIH con bajos niveles de células T-CD4 (Rasmussen. 1997).
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Infecciones causadas por clamidias,
rickettsias y micoplasmas
Gail L. Woods, M.D.
David H. Walker, M.D.
INFECCIONES POR CLAMIDIAS 1072
Estructura
Multiplicación
Chlamydia trachomatis
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae
Diagnóstico de laboratorio
Tratamiento
INFECCIONES POR RICKETTSIAS 1076
Infecciones causadas por organismos del género Rickettsia
Tifus "scrub" (tifus de las malezas) causado por
Orientia tsutsugamushi
Las infecciones causadas por clamidias. rickettsias y micoplasmas en
humanos se consideran independientemente en este volumen porque los
microorganismos responsables de las mismas son diferentes de la mayor
parte del resto de bacterias en varios aspectos: son de tamaño más pequeño,
la estructura de su pared celular es distinta y son parásitos intracelulares obli-
gados, en particular las clamidias y la mayor parte de rickettsias.
INFECCIONES POR CLAMIDIAS
Las clamidias tienen tropismo por las células epiteliales columnares. Su
pared celular es semejante a la de las bacterias gramnegativas; poseen tanto
ácido desoxirribonucleico (ADN) como ácido ribonucleico (ARN). tienen ribo-
somas procariotas y son capaces de sintetizar sus propias proteínas, ácidos
nucleicos y lipidos: se dividen por bipartición; y son sensibles a ciertos anti-
bióticos. A diferencia de otras bacterias, las clamidias son "parásitos energé-
ticos"; son bacterias intracelulares obligadas que no pueden multiplicarse
fuera de las células que las albergan y son incapaces de sintetizar compues-
tos ricos en energía como el adenosín Irilosfato (ATP).
Las clamidias están incluidas en el orden Chlamydiales. Una revisión
reciente de la taxonomía ha sugerido la creación de tres familias, una de las
cuales, Chlamydiaceae, incluiría las especies patógenas para el hombre (Eve-
rett, 1999). Se han propuesto dos géneros en donde estarían englobadas tres
especies patógenas humanas: Chlamydia trachomatis. Chlamydophila (origi-
nalmente Chlamydia) psittaci y Chlamydophila (originalmente Chlamydia)
pneumoniae. En la Tabla 49-1 se indican algunas características útiles para dife-
renciar las tres especies mencionadas. Además, estos géneros incluyen también
otras seis especies que no han sido asociadas con infecciones en el ser humano.
Estructura
Las clamidias presentan dos formas morfológicamente distintas. Por un
lado, el denominado cuerpo elemental, una forma esférica, densa, con un diá-
metro entre 0.2 pm y 0,4 pm, que contiene ARN ribosomal procariótico y
posee una pared celular rígida, debido a la gran cantidad de enlaces que se
establecen entre los componentes proteicos de la misma, a través de puen-
CAPÍTULO 49
Infecciones causadas por organismos del género
Ehrlichia
Infecciones causadas por Coxiella burnetii
Infecciones causadas por organismos del género Bartonella
(Rochalimaea)
INFECCIONES POR MICOPLASMAS 1083
Mycoplasma pneumoniae
Micoplasmas genitales
Diagnóstico de laboratorio
Tratamiento
BIBLIOGRAFÍA 1085
tes disulfuro. El cuerpo elemental es la forma infecciosa del organismo, y tiene
una capacidad de supervivencia limitada fuera de la célula hospedadora. Por
otro lado, el cuerpo reticular, con un diámetro entre 0.6 iim y 1.0 pm. es la
forma mtracelular, metabólicamente activa, incapaz de sobrevivir en el medio
ambiente exocelular. El ADN circular de ambas formas se encuentra organi-
zado, de forma compacta, en un nucleoide central y su genoma tiene un
tamaño de enlre 1,0 y 1,2 millones de pares de bases (pb).
Entre los componentes de la membrana externa del cuerpo elemental, dos
tienen importancia para el diagnóstico. El más importante es la proteina mayo-
ntaria de la membrana externa (MOMP), una especie transmembranal que
posee epitopos, definidos en base a su reactividad frente a anticuerpos mono-
clonales, específicos de serovariedad. especie, género y familia. La infección
por clamidias induce en el huésped la aparición de anticuerpos anti-MOMP
específicos, aunque el papel protector de estos anticuerpos no está clara-
mente establecido. La membrana extema de las clamidias también posee un
antígeno de naturaleza hpopolisacaridica (LPS), que es el antigeno mayorita-
rio detectado mediante pruebas serológicas, especificas de género, como indi-
cador de infección por clamidias. Se han utilizado anticuerpos monoclonales y
anticuerpos polivalentes monoespecificos frente al LPS o la MOMP, para
detectar la presencia de antigenos de clamidia en especímenes clínicos,
mediante mmunofluorescenoa directa (DFA) y enzimoinmunoensayo (EIA).
Multiplicación
Las clamidias se multiplican en el citoplasma de la célula hospedadora infec-
tada. El ciclo biológico de desarrollo comienza con la adhesión del cuerpo ele-
mental a microvellosidades de una célula columnar susceptible; en cualquier
caso, los receptores específicos implicados en esta interacción no han sido
identificados todavía. El cuerpo elemental desciende entonces por la microve-
llosidad, hasta alcanzar la membrana plasmática de la célula hospedadora,
localizándose en invaginaciones o indentaciones de la misma Seguidamente,
la clamidia penetra en la célula en un endosoma, donde las diferentes especies,
C. psittaci C. pneumoniae y C. trachomatis, permanecen durante su desarrollo
mtracelular. El contenido de los endosomas que contienen los cuerpos elemen-
tales de C psittaci no se acidifica, y no se produce la fusión de aquellos con los
lisosomas celulares; sin embargo, los endosomas con cuerpos elementales de
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
Tabla 49-1 Características útiles para diferenciar las e s p e c i e s de
Chlamydia y Chlamyodophila p a t ó g e n a s del h o m b r e
Especies
Chlamydia Clamydophila Clamydophila
Característica trachomatis psittaci pneumoniae
Susceptibilidad a las S R R infeccioso está constituido por personas infectadas pero asintomáticas o por
sulfamidas
Tinción de glucógeno +
de las inclusiones
Forma del CE Redondeada Redondeada De pera o
redondeada
CE = cuerpo elemental. S • susceptible; Fl = resistente: * = positivo. - = negativo.
C. trachomatis pueden fusionarse entre ellos y. probablemente, con los lisoso-
mas. Entre seis y ocho horas después de que el cuerpo elemental haya pene-
trado en la célula huésped, comienzan a producirse cambios en la estructura de
la pared celular asociados a la transición a cuerpo reticular, se inicia la síntesis
de ADN, ARN y proteínas y comienza la división por bipartición. Las mitocon-
dnas de la célula hospedadora migran y se sitúan frente al endosoma, cuyo
tamaño va creciendo, lo que permite que los cuerpos reticulados en multipli-
cación utilicen el ATP generado por la propia célula infectada. Los cuerpos
reticulados comienzan a reorganizarse tras 18 a 24 horas después de la
infección; y, presumiblemente, cuando se agotan los nutrientes, tiene lugar su
maduración y transformación a cuerpos elementales, que son finalmente libe-
rados al medio extracelular. Las células infectadas por C. psittaci sufren daños
importantes como consecuencia de la multiplicación de los microorganismos en
su interior, teniendo lugar la liberación de las clamidias por la lisis de la célula
huésped 48 horas después de que se haya producido la infección. Por el con-
trano, C. trachomatis es liberada, entre 72 y 96 horas después de la infección,
tras la fusión de la membrana que delimita el cuerpo de inclusión que contiene
los cuerpos elementales con la membrana plasmática, dejando una lesión en la
misma y permitiendo la supervivencia de la célula hospedadora.
Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis es la causa más frecuente de enfermedades trans-
mitidas por contacto sexual en EE.UU. Asimismo, en regiones de Oriente
Medio y del norte de Africa y de la India, donde el tracoma es endémico, es
una importante causa de ceguera.
Epidemiología, patología y manifestaciones clínicas
El ser humano es el único hospedador conocido para todas las cepas de
C. trachomatis conocidas. Las manifestaciones clínicas, asi como la especifici-
dad por el órgano afectado en el cuerpo, vienen determinadas tanto por el meca-
nismo de transmisión como por las propiedades de la cepa infectante. Desde un
punto de vista epidemiológico, las infecciones por C. trachomatis se dividen en
tres categorías: el clásico tracoma, las enfermedades transmilidas por contacto
sexual en adultos y las infecciones perinatales. oculares y del tracto respiratorio.
El tracoma clásico es una causa importante de ceguera en aquellas áreas
donde las condiciones sanitarias son inadecuadas y la higiene personal
escasa, aunque es la causa de ceguera que, a nivel mundial, puede ser pre-
venida más fácilmente. Típicamente, la infección se transmite entre los niños
a través de los dedos, mediante fómites y probablemente por las moscas. En
áreas donde la enfermedad es endémica, la conjuntivitis aguda provocada
por clamidias en adultos o en niños es poco frecuente, aunque muchos
niños quedan infectados crónicamente pocos años después de su naci-
miento. Exposiciones repetidas a C. trachomatis conducen, eventualmente, al
desarrollo de queratoconjuntivitis folicular crónica, cicatrización de la conjun-
tiva y pannus (invasión de la córnea por los vasos sanguíneos).
Entre las enfermedades que se transmiten por contacto sexual directo en
adultos, y que están provocadas por C. trachomatis. se encuentran el linfogra-
nuloma venéreo (LGV) y la uretritis/cervicitis, con las complicaciones asociadas
a las mismas. El LGV tiene carácter endémico en Asia, África y América del Sur.
En EE.UU. se registran alrededor de 500 casos anualmente: la enfermedad
afecta más al hombre que a la mujer, en una relación de 3 a 1, y es más fre-
cuente entre personas pertenecientes a un estrato socioeconómico bajo en los
1073
estados del sureste, homosexuales e individuos que han visitado paises fuera
de EE.UU., donde el LGV tiene carácter endémico. El LGV se transmite por
contacto sexual directo, aunque también se ha observado transmisión del
microorganismo a través de fómites y por aerosoles formados durante acci-
dentes de laboratorio, asociada a casos de neumonitis. derrames pleurales y
lintadenopatia mediastinica o hiliar (Jones. 2000). El reservono del agente
individuos con infección uretral, cervical o anorrectal ignorada.
El LGV es la única infección causada por C. trachomatis que produce
manifestaciones multisistémicas y constitutivas. Durante la lase primaria se
forma una vesícula indolora o una pápula no indurada, de pequeño tamaño,
que aparece, frecuentemente, en los genitales externos, entre tres días y
tres semanas después de la exposición al microorganismo, y que desaparece
rápidamente sin dejar cicatriz. La lase secundaria se caracteriza por una lin-
fadenopatía supurativa local y otros síntomas como liebre, escalofríos, ano-
rexia, dolor de cabeza, mialgias y artralgias. comenzando entre dos y seis
semanas después de la infección. El examen histológico de los ganglios lin-
fáticos afectados muestra la existencia de granulomas que rodean abscesos
estrellados. Los ganglios linfáticos afectados aparecen enmarañados y even-
tualmente supuran, dando lugar a fistulas que sanan, con cicatrización, varios
meses después. La fibrosis y el drenaje linfático anormal resultante son res-
ponsables del estrechamiento uretral o rectal y de la induración y edema lin-
fático de los genitales que aparece durante la tercera fase.
El espectro clínico de las enfermedades de transmisión sexual debidas a
cepas de C. trachomatis que no causan LGV (cepas no LGV) es semejante al de
las infecciones debidas a Neisseria gonorrhoeae (véase Cap. 50). En el hombre.
C. trachomatis es responsable del 30% al 50% de casos de uretritis no gonocó-
cica. aunque un tercio de varones que albergan a C. trachomatis en su uretra no
manifiestan síntoma alguno (Stamm. 1984). Muy raramente, la uretritis producida
por C. trachomatis evoluciona hasta una epidídimitis. Entre los varones homose-
xuales, las cepas no LGV de C. trachomatis se han asociado a casos de procti-
tis. El microorganismo se ha aislado también de la uretra de un 70% de indivi-
duos con síndrome de Reiter no tratado asociado con uretritis (Keat, 1983). La
infección genital por C. trachomatis tiene una incidencia mayor en la mujer que
en el hombre y es más frecuente entre mujeres jóvenes, solteras o divorciadas,
negras, de nivel socioeconómico bajo y que tengan múltiples compañeros
sexuales. La infección de la endocérvix por C. trachomatis puede ser asintomá-
lica o bien producir una cervicitis mucopurulenta. que puede extenderse hasta la
uretra y la vejiga unnaria. dando lugar al "sindrome uretral agudo" o piuría sin
bacteriemia, o hasta el endometno y las trompas de Falopio. causando entonces
endometritis o salpingitis. Las infecciones del tracto reproductivo superior pue-
den evolucionar hasta una enfermedad inflamatoria pélvica o provocar cicatriza-
ción y dislunción del sistema de transporte de los oviductos, lo que puede tradu-
cirse en infertilidad o embarazo ectópico. La diseminación intrapentoneal de la
infección puede provocar peritonitis aguda, perihepatitis (síndrome de Fitz-Hugh-
Curtis), periapendicitis o inflamación del bazo. Un pequeño porcentaje de adul-
tos con infección genital por clamidias desarrollan una conjuntivitis de inclusión.
En los paises desarrollados donde las infecciones de transmisión sexual por
C. trachomatis tienen carácter epidémico, el microorganismo puede pasar de
la madre al hijo durante el tránsito por el canal del parto. Estudios llevados a
cabo en Norte América indican que entre el 60% y el 70% de los niños expues-
tos a C. trachomatis durante el parto por via vaginal resultan infectados por la
bacteria, mientras que la infección en aquellos que nacen mediante cesárea
es muy poco frecuente (Jones, 2000). Es posible recuperar a C. trachomatis
de la conjuntiva de los niños infectados tras una o dos semanas y a partir de
la nasofaringe inmediatamente después. La frecuencia de aislamiento a par-
tir de la conjuntiva disminuye a partir de la quinta/sexta semana, aunque C.
trachomatis puede ser recuperada de la nasofaringe, conjuntiva, recto y
vagina (habitualmente sin producir síntomas) durante varios meses.
La conjuntivitis de inclusión, la manifestación más frecuente de la infección
por C. trachomatis en niños, aparece en casi el 80% de aquellos en los que
el cultivo a partir de la conjuntiva o el examen citológico revela la presencia
del microorganismo (Jones, 2000). Entre 2 y 25 días después del nacimiento
se produce un Huido mucopurulento y la conjuntiva se inflama y se vuelve
edematosa. Los síntomas generalmente desaparecen sin tratamiento en unos
cuantos meses y sin dejar secuelas, aunque puede quedar cierto grado de
cicatrización en la conjuntiva.
 1074 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Aproximadamente un 20% de niños que son infectados por C. trachomatis
durante el nacimiento desarrollan neumonitis intersticial. La enfermedad
comienza entre las dos semanas y los tres meses de edad (con un pico entre
las tres y las seis semanas) con una congestión nasal, seguida de una carac-
terística tos staccato con taquipnea y crepitantes, pero sin fiebre. La mitad de
ellos tienen o han tenido conjuntivitis. Los síntomas se manifiestan durante
varias semanas, aunque los crepitantes inspiratorios y los cambios en el exa-
men radiológico del lórax pueden persistir durante meses.
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci
La neumonía asociada con el contacto con pájaros fue descrita en Suiza
por primera vez en 1879. La enfermedad fue rara en EE.UU. y Europa hasta
finales de 1920. cuando comenzaron a ponerse de moda los pájaros tropica-
les como mascotas. El agente patógeno responsable fue aislado por Bedson
en 1930 a partir de muestras de tejido humano y de ave durante la investiga-
ción de un brote epidémico en el zoológico de Londres.
Epidemiología
La infección causada por ChiamydophUa (originalmente Chlamydia) psttacci
(llamada psitacosis) aparece distribuida mundialmente. Las aves de la familia
de las psitaciformes se consideran el principal reservorio del microorganismo
responsable de la enfermedad, aunque la mayor parte de especies de pájaros
pueden ser infectadas por la bactena. Los animales infectados pueden, obvia-
mente, enfermar y morir, aunque frecuentemente sólo muestran síntomas lige-
ros como anorexia, diarrea, letargo y plumaje rizado. La enfermedad en huma-
nos tiene carácter esporádico y ha sido asociada con el contacto con loros,
canarios, palomas, gorriones, patos, gallos, aves de corral (principalmente pa-
vos) y ocasionalmente mamíferos. Más de la mitad de los 40 a 60 casos de psi-
tacosis que se detectan anualmente en EE.UU. se dan entre las personas que
poseen pájaros como mascotas. Los empleados de las tiendas de anímales,
criadores de palomos, trabajadores en zoológicos, veterinarios y todos aque-
llos que por su actividad laboral están en contacto con las aves tienen un
mayor riesgo de padecer la infección. Se han detectado brotes epidémicos en
plantas procesadoras de pavos, principalmente entre los empleados que
matan a las aves y las despluman y aquellos que realizan la evisceración de
los cuerpos (CDC, 1990). En las últimas dos décadas, la prevalencia de la psi-
tacosis en EE.UU. se ha reducido enormemente como resultado de la adición
de tetraciclma a los piensos que se les suministran a las aves para su alimen-
tación, el tratamiento de las aves psitaciformes importadas antes de entrar en
el país y la cría doméstica de periquitos.
C. psittaci está presente en la sangre, tejidos, excrementos y plumas de los
pájaros infectados y puede permanecer acantonada varios meses después
de la infección aguda. La infección se transmite al ser humano generalmente
a través de la inhalación de aerosoles infectivos procedentes de heces, heces
pulverizadas, y secreciones de aves infectadas por C. psittaci. pero puede
producirse también por la manipulación de plumaje o tejidos contaminados,
picotazos o por contacto directo entre boca y pico. El contacto con los pája-
ros no tiene por qué ser directo o prolongado. La diseminación persona a per-
sona de C. psittaci es poco frecuente.
Patogenia y patología
Chlamydophila psittaci penetra en el cuerpo a través del tracto respiratorio
y es transportada por los macrófagos hasta el hígado y el bazo, donde tiene
lugar la multiplicación de la bacteria. Seguidamente, los microorganismos
pasan a la sangre y llegan al pulmón, que es el blanco primario de la infección,
y a otros órganos. El examen histológico del tejido pulmonar revela la pre-
sencia de linfocitos en los espacios alveolares e intersticiales. Se pueden
apreciar también pequeñas hemorragias y macrófagos con inclusiones mtra-
citoplasmáticas. El hígado, el bazo y los ganglios linfáticos hiliares aumentan
de tamaño y pueden mostrar focos de necrosis, y en los casos graves pue-
den verse también afectados el miocardio, el pericardio, las meninges, el
cerebro y las glándulas suprarrenales
Manifestaciones clínicas
La psitacosis comienza bruscamente tras un periodo de incubación de una a
dos semanas, con fiebre y escalofríos, o se manifiesta gradualmente con un
aumento paulatino de la fiebre y la sensación de malestar general. Un sintoma
prominente es la aparición de una tos seca y persistente que, ocasionalmente,
puede producir un esputo sanguinolento. El pulso cardíaco es. a menudo, lento
para la temperatura corporal del paciente, y también es frecuente padecer una
jaqueca intensa y difusa. Son comunes otros síntomas como malestar general,
mialgias dolorosas y artralgias. y también puede aparecer una erupción macu-
lar (manchas de Horder) que semeja las manchas rojizas de la fiebre tifoidea.
Un cierto grado de obnubilación puede manifestarse al final de la primera
semana, y unos pocos afectados tienen molestias gastrointestinales (Gl). Chla-
mydophila psittaci raramente causa endocarditis destructiva: la mayor parte de
personas afectadas tienen un historial de enfermedad reumática cardiaca o de
malformaciones congénitas de las válvulas cardíacas (Jones. 1982).
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae
En 1986, una especie particular de clamidia se asoció con una patología
aguda del tracto respiratorio humano. El organismo, inicialmente considerado
como una cepa de Chlamydia psittaci, fue denominado TWAR, siglas que
correspondían a las letras de identificación de los dos primeros aislamientos
de la bacteria obtenidos: TW-183. aislado en 1965 del ojo de un niño de un
grupo control durante un ensayo de vacunación realizado en Taiwan, y AR-39,
recuperado ese mismo año de la garganta de un estudiante de la Universi-
dad de Washington afectado de faringitis. Muy poco tiempo después de su
detección, los datos de los estudios de homología de ADN y de las observacio-
nes al microscopio electrónico pusieron de manifiesto que se trataba de una
especie diferente, inicialmente designada como Chlamydia pneumoniae, y que
recientemente ha sido reclasilicada como Chlamydophila pneumoniae (Eve-
rett, 1999; Chi. 1987: Campbell, 1987; Cox. 1988). Las cepas de C. pneumo-
niae y C. psittaci tienen un 10% o menos de homología en la secuencia de
ADN. y ba|0 ciertas condiciones el cuerpo elemental de C pneumoniae tiene
forma de pera, mientras que en otras es redondeado, como los cuerpos ele-
mentales de Chlamydophila psittaci y Chlamydia trachomatis.
Epidemiología
El concepto actual de la epidemiología de la infección por Chlamydophila
pneumoniae se basa en los datos de estudios retrospectivos con muestras de
suero recogidas a partir de pacientes con enfermedades del tracto respiratorio.
Alrededor del 50% de los adultos tienen anticuerpos frente a C. pneumoniae.
La tasa de prevalencia de anticuerpos en niños es baja, aumenta de forma
abrupta en los adolescentes, continúa aumentado durante la madurez y per-
manece con valores elevados en la vejez; las tasas son entre un 10% y un 25%
más elevadas en varones. Los datos de los estudios serológicos retrospectivos
y prospectivos indican que la enfermedad causada por C. pneumoniae tiene
carácter endémico en EE.UU. y epidémico en Escandinavia y Finlandia, aunque
los brotes epidémicos no aparecen con una periodicidad estacional consistente
(Grayston, 1990. 1989).
C. pneumoniae parece ser un patógeno bumano primario que se transmite
de persona a persona, sin que en la transmisión participe un reservorio aví-
cola o animal alguno. El mecanismo y lugar de la transmisión, el periodo de
incubación y la infectividad del microorganismo no han sido determinados
todavía. Los datos obtenidos a partir de estudios retrospectivos realizados en
soldados finlandeses han puesto de manifiesto que los brotes epidémicos
causados por C. pneumoniae se prolongan de cinco a ocho meses, lo que
sugiere que la infección se disemina lentamente, incluso en grupos de pobla-
ción cerrados (Kleemola. 1988).
Patogenia
La patogenia de la infección por C. pneumoniae es desconocida. Debido a
que la enfermedad es. generalmente, suave y autohmitada. no hay disponi-
bles dalos de autopsias.
Manifestaciones clínicas
Se estima que C. pneumoniae es responsable de alrededor de un 10% de
los casos de neumonía detectados en una comunidad (Grayston, 1990). La
neumonía es. usualmente, suave, con la aparición de un único infiltrado sub-
segmentano. aunque puede tener un carácter grave, especialmente en per-
sonas ancianas y en aquellos que tienen enfermedades crónicas. Frecuente-
mente comienza con faringitis y ronquera, seguidas de una tos persistente.
Aunque la neumonía es el síndrome más frecuentemente asociado con la
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
Tabla 49-2 Tipos d e e s p e c í m e n e s clínicos para la detección d e
C. trachomatis
Entermedad Espécimen
Cervicitis mucopurulenta Hisopo endocervical orina"
Síndrome ureiral agudo (mujeres) Hisopo uretral, orina"
Endometritis aguda Aspirado endometrial
Salpingitis aguda Biopsia de trompas de Falopio
Uretritis no gonocócica (hombres) Hisopo uretral, orina"
Hisopos o raspados conjuntivaies
Conjuntivitis de inclusión
Hisopos o raspados conjuniivales
Tracoma
Aspirado de nodulo linfático,
biopsia de la lesión ulcerosa,
Linfogranuloma venereo suero
Suero, aspirado traqueobronquial.
hisopo nasofaríngeo
Neumonitis (niños)
"La orina es u n espécimen aceptablo para algunos enzimoinmunoensayos y
.pata las pruebas comerciales de amplilicación de ácidos nucleicos
> En la actualidad hay disponibles anticuerpos monoclonales procedentes de
infección por C. pneumoniae, los estudios serológicos realizados durante bro-
tes epidémicos entre soldados han mostrado que tan sólo un 10% de las
infecciones por C. pneumoniae evolucionan a neumonía, lo que sugiere que
la infección es, frecuentemente, suave o asintomática y no detectada. Otras
manifestaciones de la infección por C. pneumoniae son bronquitis, faringitis,
fiebre de origen desconocido, otitis, procesos seudognpales, miocarditis,
endocarditis y posiblemente ateroesclerosis (Campbell, 1998).
Diagnóstico de laboratorio
Chlamydia trachomatis
El tipo de espécimen utilizado para el diagnóstico de las infecciones causadas
por C. trachomatis está determinado por las manifestaciones clínicas de la enfer-
medad (Tabla 49-2). Los procedimientos específicos empleados para la recolec-
ción de los diferentes tipos de muestras se describen en el Capitulo 57. La mayor
parte de las infecciones afectan al epitelio de las membranas mucosas, por lo
que los especímenes deben recogerse directamente de la superficie afectada y
contener una muestra adecuada y representativa de células epiteliales Los flui-
dos purulentos no son un tipo adecuado de espécimen, por lo que deben ser eli-
minados antes de proceder a la recogida de la muestra con un hisopo o un cepi-
llo. De entre los diferentes tipos de hisopos existentes, los que tienen la torunda
de dacrón o rayón son los preferidos. Los hisopos con mangos de madera no
deben ser utilizados, ya que la madera es tóxica para la bacteria. Los hisopos de
alginato calcico pueden resultar tóxicos para las clamidias o para las células que
permiten su crecimiento. Los hisopos con torundas de algodón son aceptables,
aunque ocasionalmente pueden resultar tóxicos para las clamidias.
Cultivo celular
Los cultivos celulares son actualmente el método de referencia para el diag-
nóstico de las infecciones causadas por clamidias y deben utilizarse cuando el
diagnóstico es objeto de controversia y en los casos en los que existe sospecha
de agresión o abuso sexual. Las líneas celulares utilizadas más frecuentemente
son McCoy o mono verde Butfalo. Ambas tienen una sensibilidad parecida, pero
las segundas son más fáciles de mantener y más resistentes a las sustancias
citotóxicas, habiéndose observado que en las mismas se forma un número más
elevado de inclusiones y de mayor tamaño (Krech, 1989). La adición de ciclo-
heximida (0,5 pl-1,5 pl/ml) al medio de cultivo aumenta la sensibilidad. Las célu-
las crecen en monocapa en la superficie de cubreobjetos situados en el interior
de sheil vials, o en placas de 24 pocilios, o en la superficie de placas de cul-
tivo de poliestireno de 48 o de 96 pocilios. Para incrementar la recuperación de
C. trachomatis, los especímenes son sonicados o agitados en un mezclador vér-
tex antes de ser inoculados, para liberar los cuerpos elementales de las células
infectadas, y los shell vials inoculados o las placas de cultivo son centrifugados.
Tras 48-72 horas de incubación, las monocapas de células son fijadas y segui-
damente teñidas con anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína. Si
se utiliza un sistema de cultivo de 96 pocilios, se recomienda resembrar los espe-
címenes que son negativos a las 48 horas para incrementar la eficiencia del pro-
ceso de detección; sin embargo, la detección no aumenta significativamente
cuando se utiliza una estrategia semejante en el caso de emplear contenedores
o placas de 24 pocilios (Schacter. 1987; Zimmerman, 1992).
1075
Métodos de detección directa no basados en el cultivo
Fluorescencia directa con anticuerpos. La prueba de detección median-
te fluorescencia directa con anticuerpos (DFA). que fue uno de los primeros
métodos no basados en el cultivo desarrollados para la detección de clamidias,
permite la visualización directa de los cuerpos elementales de C. trachomatis
en frotis de los especímenes clínicos. El tiempo total necesario para la ejecu-
ción del procedimiento oscila entre 30 y 60 minutos. Es el único método que
permite determinar directamente la calidad del espécimen Las muestras que
contienen células columnares o metaplásicas escamosas son adecuadas,
mientras que aquellos especímenes en los que existen pocas células colum-
nares, o tienen una excesiva cantidad de mucus, o en los que hay una exce-
siva cantidad de células escamosas, no son aceptables. Sin embargo, la inter-
pretación de los resultados de la observación de los frotis es subjetiva, y la
fatiga del analista puede representar un problema en aquellas situaciones en
las que hay que procesar un gran volumen de muestras.
diferentes firmas comerciales. Los anticuerpos dirigidos frente a la MOMP
especifica de especie de C. trachomatis parecen ser los que presentan una
mayor especificidad, y producen una fluorescencia más intensa que la que se
observa con anticuerpos dirigidos frente al LPS de las clamidias (Cíes. 1988).
por lo que son los que se utilizan más frecuentemente (Woods, 1994). Oca-
sionalmente, incluso los anticuerpos específicos de especie pueden teñir
otras bacterias distintas a C. trachomatis. posiblemente debido a una adsor-
ción inespecifica de las inmunoglobulinas o a una reactividad cruzada. La tin-
ción de bacterias distintas de C. trachomatis es particularmente frecuente en
el caso de especímenes rectales; en consecuencia, el cultivo es el método
preferido en este supuesto, aunque existen algunos reactivos para DFA apro-
bados para la evaluación de muestras rectales. También se ha desculo la
existencia de reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales entre miem-
bros de la familia Chlamydiaceae y Bartonella.
La sensibilidad de la técnica DFA varia entre el 50% hasta casi el 100% en
comparación con el cultivo como método estándar, dependiendo de la prevalen-
cía de la infección en la población que eslá siendo objeto de evaluación y del
número de cuerpos elementales necesarios para obtener un resultado positivo
(Bames, 1989). En general, la sensibilidad es más elevada, con valores de corte
más bajos para los cuerpos elementales y en poblaciones con una alta preva-
lencia de la enfermedad. La especificidad del DFA suele ser superior al 95%.
Enzimoinmunoensayos. Los enzimoinmunoensayos (EIA) detectan el
LPS de las clamidias utilizando como sonda anticuerpos mono o policlonales
etiquetados con una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto
coloreado. Tanto los sistemas de fase sólida, que utilizan plástico o microesferas
recubiertas con el anticuerpo, como los sistemas de membrana están disponi-
bles comercialmente. El tiempo total de procesamiento oscila entre 15 y 30 minu-
tos para los sistemas de membrana, y entre tres y cuatro horas para los sis-
temas de fase sólida. Las ventajas de los EIA son la objetiva interpretación de
los resultados y la facilidad de uso para procesar un gran número de muestras.
Al igual que en el caso de la DFA. la sensibilidad de los EIA varia (entre
cerca del 70% hasta el 100%) en comparación con el cultivo como método
estándar, y tiende a ser más elevada en poblaciones con una alta prevalencia
de la enfermedad, como es el caso de aquellas personas que acuden a una
clínica para enfermedades de transmisión sexual (Bames. 1989: Clarke, 1993:
Ehret, 1993; Kluytmans. 1993: Mills. 1992; Warren, 1993). La especificidad del
EIA es del 95% o incluso superior. Las causas que explican los falsos positivos
son la presencia de una infección bacteriana del tracto urinario (Demaio, 1991)
o la contaminación del espécimen con moco cervical o secreciones vaginales.
Este último problema puede reducirse mejorando la técnica de recogida de las
muestras (eliminando el moco cervical y obteniendo una verdadera muestra
endocervical). asi como utilizando anticuerpos bloqueantes (Mills. 1992).
Hibridación de ácidos nucleicos. Eslá comercialmente disponible una
sonda de ADN marcada con éster de acridina, complementaria del ARN ribo-
somal de C. trachomatis. que permite la detección directa de este microorga-
nismo en especímenes urogenitales y conjuntivales. El método requiere el
empleo de un baño de agua y de un medidor de luminiscencia. El tiempo total
de procesamiento requerido está entre dos y tres horas. La sensibilidad de la
prueba comparada con la del cultivo como método de referencia varia enlre
las muestras endocervicales y los especímenes recogidos con hisopos ure-
 1076 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
trates en el hombre (del 76% al 97%) (Blanding, 1993: Clarke, 1993; Warren,
1993; iwen, 1991; Kluytmans, 1994, 1991). La especificidad de la sonda es
del 97% o superior, y puede ser mejorada aún más mediante un ensayo de
competición (Woods. 1996).
Amplificación de ácidos nucleicos. Existen diferentes métodos para la
detección directa de C. trachomatis en especímenes endocervicales y uretra-
les tomados con hisopo, y en muestras de orina tanto de hombre como de
mujer, basados en la amplificación de ácidos nucleicos, que están disponibles
comercialmente en la actualidad. El tiempo total de procesado oscila entre
cuatro y cinco horas. Los datos de estudios comparativos entre el método de
amplificación de ácidos nucleicos y el cultivo indican que el primero es alta-
mente específico y más sensible que el segundo (Vincelette, 1999: Goessens,
1997; Ferrero, 1998: Wylie. 1998; Mahony, 1998; Toye. 1998; Carroll, 1998;
Puolakkainen, 1998). Dado el precio considerable del método basado en la
amplificación de ácidos nucleicos, el director de cada laboratorio debe deter-
minar si los beneficios compensan la inversión en su población de pacientes.
Verificación de las pruebas no basadas en el cultivo
Los expertos del Centro para la Prevención y Control de las Enfermedades
(CDC) recomiendan que los resultados positivos resultantes de las técnicas
de rastreo (DFA, EIA, sondas) deben confirmarse con una prueba comple-
mentaria si un resultado falsamente positivo pudiera tener consecuencias
médicas, sociales o psicológicas adversas (CDC, 1993). En poblaciones
donde la prevalencia de la infección es baja, la confirmación puede ser algo
habitual, pero debe tener carácter selectivo en poblaciones con elevada pre-
valencia. La confirmación mediante cultivo es un procedimiento óptimo, pero
requiere un segundo espécimen recogido bien durante la primera visita o en
una segunda sesión. Los test EIA con anticuerpos bloqueantes, los ensayos
de competición con sondas o la monitorización del medio de transporte con
un test DFA pueden ser métodos de verificación alternativos.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas tienen muy poca utilidad para el diagnóstico de las
infecciones por clamidias por dos razones. En primer lugar, los anticuerpos frente
a C. trachomatis persisten durante bastante tiempo después de que la infección
remita, por lo que un resultado serológico positivo no tiene por qué relacionarse
necesariamente con un proceso infeccioso activo. Por otro lado, muchas prue-
bas serológicas no son específicos para C. trachomatis. ya que estos métodos
detectan anticuerpos frente a determinantes antigénicos específicos de género.
Las excepciones a esta norma están representadas por el diagnóstico del LGV
y de la neumonitis causada por C. trachomatis en niños. Debido a que el LGV
tiene un largo periodo de latencia y a que el diagnóstico sufre, a menudo,
retrasos, los anticuerpos están generalmente presentes cuando se toma la
muestra de suero correspondiente a la fase aguda de la enfermedad, por lo que,
a menudo, no es posible detectar un incremento de cuatro veces en el título de
anticuerpos entre las muestras de suero tomadas en la fase aguda y en la de
convalecencia. Por tanto, un titulo único o estable de 1:64 o superior de fijación
del complemento apoya un diagnóstico presuntivo de LGV. Para el diagnóstico
de la neumonitis por C. trachomatis en niños, la detección de inmunoglobulinas
M (IgM) especificas medíante microinmunofluorescencia puede ser el método de
elección (un título de 1:32 o superior es diagnóstico).
Chlamydophila psittaci
C. psittaci puede crecer en cultivos celulares, aunque su manipulación sólo
es recomendable en centros especialmente equipados y con personal
experto, porque este organismo es particularmente virulento y se ha asociado
frecuentemente a infecciones adquiridas en laboratorio. La infección por C
psittaci se diagnostica usualmente por métodos serológicos. preferentemente
comparando las muestras de suero obtenidas en las fases aguda y de con-
valecencia, respectivamente. Un incremento de cuatro veces (o superior) en
el título de anticuerpos, entre ambas muestras en un paciente con síntomas
de psitacosis. apoya un diagnóstico positivo. Un único título de 1:32 o supe-
rior en un individuo con una patología cuyos síntomas sean compatibles
representa una evidencia presuntiva de psitacosis. Los anticuerpos se detec-
tan normalmente hacia el final de la segunda semana de la enfermedad, aun-
que un tratamiento anticipado con antibióticos puede retrasar su aparición
durante varias semanas. Incrementos falsamente positivos en el titulo de anti-
cuerpos se detectan raramente en individuos afectados de legionelosis.
Chlamydophila pneumoniae
El diagnóstico de la infección causada por C. pneumoniae se basa funda-
mentalmente en los test de tipo serológico (Grayston, 1990). El test de microin-
munofluorescencia frente al antígeno TWAR es específico para C. pneumoniae.
Las IgM aparecen unas tres semanas después del comienzo de la enferme-
dad primaria, generalmente comienzan a disminuir entre los dos a seis meses
siguientes hasta un nivel en el que no pueden ser detectados, y pueden no
reaparecer aunque haya una reinfección. Las inmunoglobulinas G se detec-
tan entre seis y ocho semanas después del inicio de la infección primaria, per-
manecen de por vida, y su título puede incrementarse una o dos semanas
después de que se haya producido una reinfección. Los resultados de los test
serológicos indicativos de una infección aguda son: un incremento de 4 veces
o superior del titulo de IgG entre dos muestras de suero tomadas en la lase
aguda y de convalencia de la enfermedad respectivamente, un único título de
1:512 o superior o un titulo de IgM de 1:16 o superior. C. pneumoniae puede
ser aislada en cultivos de tejidos, aunque crece peor que C. trachomatis
(Roblin, 1992).
Tratamiento
Las tetraciclinas son el tratamiento de elección para las infecciones causa-
das por clamidias. Para las infecciones genitales por C. trachomatis. otros
agentes antimicrobianos eficaces son la eritromicina, la acitromicina, el sulfi-
soxazol y el ofloxacino. Las infecciones oculares por C. trachomatis requieren
un tratamiento sistémico con tetraciclina (en adultos) o con eritromicina o sul-
fisoxazol (en neonatos); la terapia tópica suprime los síntomas pero no eli-
mina al microorganismo. Los macrólidos son una alternativa aceptable para el
tratamiento de las infecciones causadas por C. pneumoniae. Las sulfonami-
des son ineficaces frente a C. psittaci y C. pneumoniae.
INFECCIONES POR RICKETTSIAS
El concepto de rickettsia se desarrolló, históricamente, al mismo tiempo
que se definía la naturaleza molecular y física de los virus (Weiss, 1988). En
contraste con los agentes virales que afectan al hombre, que también nece-
sitan células eucarióticas hospedadoras para su multiplicación, las rickettsías
son bacterias con una pared celular típicamente gramnegatíva y su creci-
miento es inhibido por determinados antibióticos. Las rickettsías se diferen-
cian, además, de otras bacterias que también son parásitos intracelulares
obligados por su ecología y modo de transmisión mediante insectos artrópo-
dos que actúan como vectores. El esquema taxonómico tradicional de las ric-
kettsías basado en algunas de esas características fenotípicas. como son su
multiplicación intracelular y su transmisión vía insectos artrópodos, necesita
una modificación importante a la luz de los últimos conocimientos derivados
de los estudios de comparación de secuencias génicas. Los géneros que con-
tienen especies patógenas para el ser humano son Rickettsia. Ehrlichia.
Coxiella y Bartonella (originalmente Rochalimaea) (Weiss, 1984). Basándose
en las características genéticas y fenotípicas. el agente etiológico del tifus
scrub o tifus de las malezas, Orientia (originalmente Rickettsia) tsutsugamushi
ha sido incluido en un nuevo género independiente (Tamura, 1995). A pesar
de su tradicional relación con la "rickettsiología" y la transmisión por artrópo-
dos, el género Bartonella (originalmente Rochalimaea) incluye organismos
que pueden crecer en medios carentes de células y que no pertenecen al
orden Rickettsiales (Brenner, 1993). Además, los miembros de los géneros
Rickettsia. Orientia, Ehrlichia y Bartonella están más relacionados entre sí
que con las especies del género Coxiella. Agrupadas por géneros, en este
capítulo se describen las siguientes enfermedades: Rickettsia, fiebre macu-
losa de las Montañas Rocosas, fiebre botonosa, fiebre de la picadura de la
garrapata africana, ricketlsiosis vesicular, tifus murino; Orientia, lifus scrub o
tifus de las malezas; Ehrlichia, "ehrlichiosis" monocitica humana causada por
£ chaffeensis y las infecciones granulocíticas originadas por £ phagocyto-
phila y £ ewingii; Coxiella, fiebre Q; y Bartonella, enfermedad por arañazo de
gato, angiomatosis bacilar y peliosis, fiebre de las trincheras y bartonellosis
sudamericana. Las enfermedades causadas por cada género constituyen
entidades clínicas coherentes y agrupadas y, en conjunto, las enfermedades
causadas por rickettsías plantean problemas similares en lo que respecta a su
diagnóstico, con aproximaciones técnicas semejantes para su solución.
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS 1077

Infecciones causadas por organismos
del género Rickettsia
Estructura y función
Las rickettsias de los grupos de la liebre maculosa y del tifus son bacterias
genéticamente relacionadas que tienen una delgada morfología bacilar (0.3 a
0,5 x 1 a 2 urn) y una pared celular típica de gramnegativas que posee lipopo-
lisacárido con determinantes antigénicos que diferencian los dos grupos. Todas
las especies del género Rickettsia viven libres en el citosol de la célula hospe-
dadora y se multiplican por bipartición Las rickettsias se adhieren a la célula
hospedadora a través de una adhesina de naturaleza proteica, penetran segui-
damente mediante fagocitosis inducida y salen por último del fagosoma hasta el
citosol (Li, 1992, 1998: Walker, 1984). Todos estos eventos tienen lugar en
pocos minutos y están asociados con una actividad fosfolipásica A , aparente-
? 5%, incluso entre niños y adultos jóvenes inmunocompelentes y sin patología
mente de origen rickettsial. Las rickettsias del grupo de la fiebre maculosa se
desplazan en el interior de las células infectadas y durante el proceso de libera-
ción estimulan la polimerización de la actina F de la célula hospedadora en un
polo de la misma (Heinzen, 1993). Aquellas rickettsias que poseen esta capaci-
dad (p. ej.. R. rickettsii) salen más rápidamente de las células hospedadoras y
se diseminan con mayor facilidad que aquellas especies que no la tienen (p. ej..
R. prowazekii). que se dividen inlracelularmente para dar lugar a un gran
número de microorganismos hasta que la célula huésped estalla, liberando a las
bacterias formadas en su interior. De acuerdo con los datos actuales de secuen-
cias de ADN. las especies del género Rickettsia que son patógenas del hombre
han evolucionado en tres genogrupos (Tabla 49-3) (Roux. 1995.1997; Stolhard.
1995). El grupo del tifus incluye las especies R. prowazekii y R. typhi. En el
grupo de la fiebre maculosa se encuentran las especies R. rickettsii. R. conorii.
R. ¡aponica, R. atricae. R. honei. R sibinca y R. slovaca. Una subdivisión recien-
temente identificada incluye a R. akari. R. australis y R tefe. Rickettsia akan y
R. australis fueron consideradas Iradicionalmente como miembros alejados de
las otras especies del grupo de la liebre maculosa. con las que comparten los
antígenos de naturaleza lipopolisacaridica.
Fiebre maculosa de las Montañas Rocosas
La más grave de todas las rickettsiosis. la liebre maculosa de las Montañas
Rocosas (RMSF). tiene una tasa de mortalidad importante, habitualmenle del
previa (Dalton. 1995a: Paddock. 1999). En la naturaleza. Rickettsia rickettsii
habita normalmente en las garrapatas: Dermacentor vanabilis. la garrapata
americana del perro, en los dos tercios del este de EE.UU. y California: Der-
macentor andersoni, la garrapata de la madera de las Montañas Rocosas, en el
este de EE.UU.; Rhipicephalus sanguineus. la garrapata del perro marrón, en
México: y Amblyomma cajennense. en América del Sur Estas garrapatas con-
servan a R. nckettsii en su intenor mientras mudan de una fase a otra (larva,
ninfa y adulto) y transováricamente de generación en generación. Menos de un
1 por 1.000 de garrapatas son portadoras de células virulentas de R. rickettsii,

Tabla 49-3 Infecciones causadas por Rickettsia. Ehrlichia, Coxiella y Bartonella

A g e n t e etiológico Enfermedad Distribución geográfica Transmisión

Fiebres maculosas
R. rickettsii Fiebre maculosa de las Montanas Rocosas América del Norte. Central y del Sut Mordedura de garrapata
R. conorii Fiebre botonosa Sur de Europa. África. Rusia, Georgia. Mordedura de garrapata
Oriente Medio, subcontinente indio
R. atricae Fiebre africana de las garrapatas Sur y este de África Mordedura de qarrapata
R. sibirica Tifus de las garrapatas del norte de Asia Rusia, China. Mongolia, Pakistán Mordedura de garrapata
R. japónica Fiebre manchada oriental Japón Mordedura de garrapaia (presumiblemente)
R. honei Fiebre manchada de la isla de Flinders Australia, sudeste asiático Mordedura de garrapata (presumiblemente)
Tifus
R prowazekii Tilus epidémico Distribución mundial (polencialmente) Heces de piojo infectado
en décadas recientes en África. en erosiones cutáneas
América del Sur. Cenlroaménca, México. Asia
R prowazekii Enfermedad de Bnll-Zinsser Distribución mundial; en cualquier lugar Reactivación de una infección latente
donde residan personas que hayan
padecido en el pasado tifus epidémico
R rowazekn Tifus de las ardillas voladoras Estados Unidos Heces de pulgas o piojos de la ardilla
infectados (presumiblemente)
R typhi Tifus murino Distribución mundial en zonas tropicales
y subtropicales
Otras fiebres rickettsiales
R akan Rickeltsiosis vesicular Estados Unidos. Ucrania. Croacia, Corea Mordedura de acaro
R australis Tifus de la garrapata de Queensle Este de Australia Mordedura de garrapa!;
R telis Tifus de la pulga del galo Estados Unidos Mordedura o heces de |
(presumiblemente)
Tilus scrub
Orienlia tsutsugamushi Tilus setub (tifus de las malezas) Sudeste asiatico Japón China Sri Lanka, Mordedura de acaro
India, Rusia asiática. Tadyikistán
indonesia, oeste del Pacifico,
norte de Australia
Ehrlichiosis
E. chatfeensis Ehrlichiosis monocitica humana Estados Unidos, Europa. África, Tailandia Mordedura de garrapata
E phagocytophila Ehrlichiosis granulocitica humana Estados Unidos, Europa Mordedura de qarrapata
E ewmgu Ehrlichiosis humana por Ehrliclva cwingii Estados Unidos Mi i (presumiblemente)
Ricketlsiosis sennetsu Japón. Malasia Dec

Fiebre Q Distribución mundial Material seco procedente de animales

infectados y. posiblemente, ingestión
de alimentos de origen animal
o mordedura de garrapata
Barlonellosis
ß bacillilormis Oeste de America i Picadura de mosquito
B henselae Enfermedad del arañazo de galo, Distribución mundi; Arañazo o mordedura de galo
angiomatosis bacilar y peliosis
B. clarridgeirae Enfermedad del arañazo de gato Distribución mundial (probablemente) Arañazo o mordedura de galo
(semejante) (presumiblemente)
B quintana Fiebre de las trincheras Europa y América del Norte Heces mlectadas del piojo Pediculus
 1078 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
que parecen ser medianamente patogénicas para las garrapatas. Nuevas líneas
de garrapatas se infectan al alimentarse de roedores enfermos, reponiendo la
población de bacterias mantenidas transováricamente en las garrapatas.
Las infecciones tienen lugar cuando y donde una persona se encuentra con
una garrapata infectada por R. r/círeífs//(Helmick, 1984). Aunque en los últimos
años se han detectado casos de RMSF en prácticamente todos los estados de
la unión, con excepción de Hawaii, Alaska y Vermont. la mayor incidencia se
ha registrado en los estados del Atlántico sur. desde Maryland a Georgia, y los
estados centrales del sur. Oklahoma, Missouri, Arkansas y Tennessee. La ma-
yor parte de casos aparecen al final de la primavera y en verano, aunque, par-
ticularmente en las latitudes más sureñas, pueden darse casos incluso en
invierno. La mayor incidencia se detecta entre niños y otras personas que
están expuestas a las picaduras de las ganapatas durante actividades al aire
libre. La relación entre casos y mortalidades es más elevada entre afroameri-
canos, varones y personas mayores de 30 años. Casos fulminantes de RMSF
(muerte al quinto día de la enfermedad) tienen lugar asociados con una hemo-
lisis moderada, por ejemplo, en hombres afroamericanos con una deficiencia
en la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Walker, 1983).
Las rickettsías son inyectadas a través de la dermis del paciente, mediante las
secreciones de las glándulas salivares de la garrapata infectada, entre 6 y 10
horas después de que la garrapata se haya alimentado, y se diseminan por todo
el cuerpo por medio del torrente circulatorio, El endotelio vascular es el blanco
de la invasión intracelular, con un cierto grado de invasión de las células muscu-
lares de los vasos sanguíneos adyacentes. El endotelio infectado es dañado por
la producción de moléculas reactivas derivadas del oxígeno y, posiblemente, por
la actividad de la fosfolipasa A. (Silverman, 1992.1997). El daño en el endotelio
¿ en el acaro Liponyssoides sanguineus, un ectoparásito del ratón doméstico.
se manifiesta en un incremento de la permeabilidad vascular, edema, hipovole-
mia e hipotensión. Las consecuencias del daño vascular a nivel del sistema
nervioso central (SNC) y los pulmones, y que ponen en peligro la vida del
paciente, son la menmgoencefalitis rickettsiósica y el edema pulmonar no car-
diogénico. En los primeros estadios de la enfermedad, las lesiones muestran la
presencia de rickettsias en las células endoteliales. sin trombos o respuesta celu-
lar alguna. En estadios más avanzados, el infiltrado linfohistocítico perivascular
característico se manifiesta como una neumonía intersticial, miocarditis intersti-
cial, nodulos guales perivasculares en el cerebro y lesiones vasculares similares
en la dermis, tracto gastrointestinal, hígado, músculos esqueléticos y ríñones.
Las lesiones extensas pueden estar acompañadas por hemonagias focales,
pero rara vez por microinfartos, excepto en la sustancia blanca del cerebro.
La fase clínica de la enfermedad comienza habitualmente con fiebre, dolor de
cabeza y mialgias entre 2 y 14 días después de la mordedura de la garrapata
(Kaplowitz, 1981). Durante los tres primeros días de la enfermedad son fre-
cuentes las náuseas, vómitos, dolor y ablandamiento abdominal y diarrea. La
erupción cutánea que, generalmente, comienza entre el tercer y quinto día se
inicia típicamente con la aparición de máculas alrededor de las muñecas y tobi-
llos, y más tarde en brazos, piernas y tronco. Las lesiones se vuelven maculo-
papulares, y en la mitad de los casos aparece una petequia central en muchas
de las máculas papulares. La afectación característica de las palmas de las
manos y las plantas de los píes se detecta sólo en la mitad de los afectados
como una manifestación tardía. El fallo renal es una característica de los casos
graves de RMSF. La afectación del sistema nervioso central es notoria; entre el
8% y el 10% de los afectados sufren ataques y coma como preludio a un des-
enlace fatal. En el 50% de los casos existe trombocitopenia, pero la coagulación
intravascular diseminada (DIC) es muy poco frecuente (Elghetany, 1999).
Fiebre botonosa y otras fiebres maculosas
Rickettsia conorii ha sido aislada en el sur de Europa; norte, este y sur de
África; Israel; la India, Pakistán, Rusia, Georgia y Ucrania. La ecología de R.
conoriiy la epidemiología de la fiebre botonosa están íntimamente ligadas a las
garrapatas, especialmente Rhipicephalus sanguineus. que alberga a la rickett-
sia transováricamente y transmite la infección al hombre cuando se alimenta
(Walker, 1991). Se han diagnosticado casos importados en viajeros que regre-
san a EE.UU. y a países del norte de Europa desde África y países de la cuenca
mediterránea. La tasa de mortalidad entre los pacientes hospitalizados oscila
entre el 1,4% y el 5,6%, especialmente en pacientes que tienen alguna otra
enfermedad subyacente. Una enfermedad más suave causada por R. aíricae
aparece con bastante frecuencia en viajeros que regresan del sur de África. La
especie R. sibirica ha sido aislada en Rusia, China. Mongolia y Pakistán. Ric-
kettsia japónica se ha descrito solamente en Japón, mientras que las infeccio-
nes en humanos causadas por R. australis y R. honeise han detectado exclu-
sivamente en Australia, Después de un periodo de incubación medio de siete
días, estas enfermedades comienzan con fiebre, dolor de cabeza y mialgias.
Frecuentemente, se puede descubrir una escara tras un examen cuidadoso de
la piel en esa fase de la enfermedad. En la patología de estas fiebres macula-
res está perfectamente descrito que esta escara o botón negro conesponde al
punto donde se produjo la inoculación de la rickettsia. como consecuencia de la
mordedura de la garrapata (Walker, 1988a). La infección del endotelio y el daño
causado por R. conorii en la escara produce necrosis dérmica y epidérmica y
edema perivascular, Entre las defensas del hospedador que llevan a cabo la
destrucción de las rickettsias intracelulares se incluyen los linfocitos T y los
macrófagos, que se infiltran alrededor de los vasos sanguíneos de la dermis
infectados (Herrero-Herrero, 1987). La activación de las células endoteliales por
la acción de atocinas induce una actividad que destruye intracelularmente las
rickettsias, aunque la eliminación final de los microorganismos está mediada por
los linfocitos T citotóxicos. La infección diseminada del endotelio se traduce en
la aparición de una erupción maculopapular. meningoencefalitis y lesiones vas-
culares en pulmones, riñones, tracto gastrointestinal y corazón (Walker, 1985).
Existe una correlación entre el aumento moderado de la concentración de trans-
aminasas hepáticas y la aparición de necrosis hepatocelular multifocal y lesio-
nes semejantes a granulomas (Walker, 1986).
Rickettsiosis vesicular
Rickettsia akan se mantiene en la naturaleza por transmisión transovárica
Mus musculus. Este microorganismo se ha aislado solamente en EE.UU.,
Croacia, Ucrania y Corea, aunque ello pueda indicar simplemente que los
estudios en relación con la distribución de esta especie de rickettsia no son
muy amplios.
Tras un periodo de incubación de aproximadamente 10 días, aparece una
pápula en el lugar donde se produjo la picadura del acaro que evoluciona hasta
convertirse en una escara con un tamaño entre 1 cm y 2,5 cm. La enfermedad
comienza con escalofríos, fiebre, malestar general, fuerte dolor de cabeza y
mialgia. La erupción, que aparece entre dos y seis días más tarde, es maculo-
papular inicialmente. más tarde papular, y en los casos típicos se vuelve pus-
tular y finalmente vesicular. Algunos pacientes también experimentan náuseas,
vómitos, faringitis, fotofobia, esplenomegalia y rigidez en la nuca.
El examen histopatológico de la escara revela una necrosis coagulativa de la
epidermis, daños en los vasos sanguíneos subyancentes y un infiltrado linfocí-
tico perivascular en el que los macrófagos parecen ser las células atacadas prin-
cipalmente (Brettman, 1981; Kass, 1994; Walker, 1999). La linfadenopatia regio-
nal y la erupción cutánea son consecuencia, posiblemente, de la diseminación
del microorganismo por el sistema linfático y circulatorio, respectivamente,
Tifus murino
La infección endémica producida por R. typhi, transmitida por la picadura de
la pulga, el tifus murino, es en la actualidad la enfermedad más importante den-
tro del grupo del tifus en EE.UU.. causando una gran morbilidad en todas las
regiones templadas del mundo (Azad, 1990). Históricamente, las epidemias de
infecciones por R. prowazekii transmitidas por piojos han tenido una gran
influencia en el desenlace de muchas campañas militares, y han constituido un
grave azote entre las poblaciones víctimas de güeñas, hambrunas y desastres
1
naturales (Patterson, 1993; Zinsser, 1935). Rickettsia prowazekii continúa pro-
vocando infecciones en áreas empobrecidas y deprimidas del mundo y reapa-
rece en situaciones como las que provocan la guerra en Burundi y las condi-
ciones sociales, políticas y económicas actuales en la extinta Unión Soviética.
El recrudecimiento de las infecciones latentes por R. prowazekii puede tener
lugar años más tarde de la infección primaria en inmigrantes procedentes de
áreas afectadas por el tifus. En EE.UU. se ha detectado una transmisión endé-
mica de R. prowazekii a partir de un reservorio infeccioso natural constituido por
las ardillas voladoras y sus ectoparásitos (McDade, 1980).
El tifus murino se da particularmente en zonas costeras tropicales y sub-
tropicales donde abundan las ratas (Rattus rattus) y las pulgas. Las pulgas
absorben las rickettsias de la sangre de las ratas infectadas, manteniendo la
infección durante todo su período de vida normal. La transmisión transovárica
solamente tiene lugar a bajos niveles; por tanto, la transmisión horizontal
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
entre ratas es un tactor clave para el mantenimiento de R. typhi en la natura-
leza. Otros ciclos mamífero-artrópodo se encargan del mantenimiento de la
rickettsia y pueden ser responsables de la transmisión de la infección a los
seres humanos (p. ej., la pulga del gato. Ctenocephalides tefe, y la zarigüeya
en Texas y California) (Schriefer, 1994b).
Se cree que el ser humano es infectado, habitualmente, por inoculación intra-
dérmica de heces contaminadas a través de la piel erosionada por el rascado.
Sin embargo, la inhalación de aerosoles que contengan heces pulverizadas de
las pulgas o la propia mordedura de la pulga pueden ser también responsables
de la transmisión en algunos casos Después de un período de incubación de
entre una y dos semanas, la enfermedad comienza con fiebre acompañada en
algunos casos por una fuerte jaqueca, escalofríos, mialgias y náusea. En el 80%
de los pacientes de piel blanca aparece, entre el quinto y sexto día. un exantema
macular o maculopapular, que es particularmente evidente en el torso, porcen-
taje que baja hasta el 20% en personas con la piel fuertemente pigmentada. Una
baja proporción de pacientes tienen tos y presentan infiltrados pulmonares. Los
individuos fuertemente afectados pueden sufrir coma, ataques y otros síntomas
neurológicos. Aproximadamente un 10% de los pacientes hospitalizados deben
ser ingresados en la unidad de cuidados intensivos, y entre un 1% y un 2% de
los afectados por el tifus murino fallecen (Dumler, 1991).
Las lesiones patológicas del tifus murino incluyen inflamación endotelial e
infiltración linfohistocistica perivascular que implican a los vasos sanguíneos
de la dermis, SNC. pulmones, corazón, tracto gastrointestinal y ríñones (Wal-
ker, 1989). Las consecuencias más serias son la menmgoencefalomielitis y la
lesión alveolar difusa.
Diagnóstico de laboratorio
A diferencia de la mayor parte de enfermedades infecciosas cuyo diagnóstico
debe hacerse durante la fase aguda de las mismas, que es cuando deben
tomarse decisiones terapéuticas criticas, las infecciones causadas por rickett-
sias se diagnostican con mucha precisión, basándose en las sospechas clíni-
cas y epidemiológicas, y se tratan de forma empírica sobre la base del diag-
nóstico presuntivo (Kaplowitz. 1981). El análisis serológico. que muchas veces
se pretende llevar a cabo de forma equivocada en los estadios iniciales de la
enfermedad, sólo confirma en la mayor parte de los casos el diagnóstico inicial,
poniendo de manifiesto un incremento de cuatro veces o superior en el título de
anticuerpos, pero ya en la fase de convalecencia. Incluso cuando se utilizan los
métodos serológicos más sensibles, menos del 20% de los pacientes poseen
anticuerpos específicos frente a antigenos rickettsiales, detectables en suero,
cuando acuden por primera vez a la consulta médica en busca de atención.
Otras aproximaciones diagnósticas utilizadas en ese momento incluyen la
visualización de las rickettsias por métodos inmunohistológicos en las lesiones
cutáneas, la identificación inmunocitológica de las rickettsias en células endo-
teliales desprendidas y circulantes, la detección de ADN rickettsial en muestras
de sangre y tejidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(Furuya, 1995; Schriefer, 1994a; Sexton, 1994; Williams, 1994). y el cultivo de
las rickettsias presentes en las muestras de sangre y tejidos, aunque la mayor
parte de estas técnicas no están disponibles en muchos laboratorios clínicos.
Las rickettsias fueron puestas de manifiesto por primera vez por Wolbach en
muestras de tejidos de pacientes afectados por la RMSF y por el tifus transmi-
tido por piojos, utilizando el método de tinción de Giemsa. durante e inmedia-
tamente después de la primera guerra mundial. Este método, que en esencia
ya es un arte perdido, requiere mucha atención y cuidado en los detalles rela-
tivos a la fijación y teñido de las rickettsias, y en la actualidad no se realiza de
forma exitosa en los labóratenos histológicos actuales. Una modificación del
método de Brown-Hopps tiñe una pequeña proporción de microorganismos,
que aparecen como bacilos delgados entre las células endoteliales. Una apro-
ximación más sensible y específica para visualizar las rickettsias es la inmu-
nohistología. bien por inmunofluorescencia o bien por tinción inmunoenzimá-
tica. utilizando como sondas anticuerpos específicos frente los agentes
infecciosos del grupo de la fiebre maculosa o del grupo del tifus (Dumler, 1990;
Kaplowitz. 1983: Walker, 1989,1997b. 1999). La tinción mediante inmunofluo-
rescencia de muestras de biopsias de piel de pacientes con RMSF tiene una
sensibilidad del 70% y una especificidad del 100%. Los pacientes con fiebre
botonosa, tifus murino y rickettsiosis vesicular han sido diagnosticados tam-
bién mediante la delección mmunohistológica de las rickettsias en las lesiones
de los exantemas y las escaras Mediante un anticuerpo monoclonal Irente a
1079
un epítopo presente en el lipopolisacándo de la pared celular especifico del
grupo de la fiebre maculosa se puede detectar la presencia de R. rickettsii.
R. conorii. R. akari, R japónica. R. australis. R. atricae. R. honei y R. sibinca
en muestras de tejidos fijadas con formol e incluidas en parafina. mientras que
otro anticuerpo monoclonal específico frente al lipopohsacárido de los miem-
bros del grupo del tilus se ha utilizado de lorma similar para la detección de
R. prowazekii y R. typhi'(Walker. 1997b). En el momento actual, no están dis-
ponibles comercialmente los reactivos para el diagnóstico inmunohistoquimico
de las rickettsiosis, aunque es posible que en el futuro se desarrollen sistemas
comerciales para la detección de grupos específicos de rickettsias, utilizando
los anticuerpos monoclonales generados en los laboratorios de investigación.
Una aproximación muy particular para el diagnóstico es la detección inmu-
nocitológica de R. conorii en células endoteliales desprendidas que circulan
por el torrente circulatorio del paciente. Estas células son capturadas a partir
de las muestras de sangre por medio de microesferas magnéticas recubiertas
por un anticuerpo monoclonal frente a componentes de la superficie de las
células endoteliales humanas (La Scola. 1996a). En enfermos de fiebre boto-
nosa, este procedimiento tiene una sensibilidad del 58% cuando se utiliza para
el examen de muestras únicas de sangre, y puede emplearse en los pacientes
antes de la aparición del exantema, que debe manifestarse para poder selec-
cionar las zonas donde han de tomarse las muestras de piel por biopsia que
permitan llevar a cabo el diagnóstico por técnicas inmunohistológicas.
El "estándar oro" en el diagnóstico serológico de las rickettsiosis es el
método de la inmunofluorescencia indirecta (IFA) (Kaplan, 1986). El test indi-
recto con anticuerpos acoplados a peroxidasa ofrece unos resultados pareci-
dos. En EE.UU.. para las infecciones producidas por rickettsias de los grupos
de la fiebre maculosa y del tifus, títulos de 1:64 o superiores en el test IFA se
consideran indicadores de diagnóstico positivo cuando se da una situación
clínica y epidemiológica compatible En paises donde existe una alta preva-
lencia de individuos con anticuerpos frente a estas rickettsias, debido hipoté-
ticamente a una estimulación por especies no patógenas de rickettsias o a
infecciones subclinicas o no diagnosticadas, son necesarios títulos más ele-
vados para poder establecer el diagnóstico. En cualquier caso, un incremento
de cuatro veces en el titulo de anticuerpos en un test IFA hasta un valor, al
menos, de 1:64 tiene valor diagnóstico. La sensibilidad del test IFA en el caso
de la RMSF oscila entre el 94% y el 100%, mientras que la especificidad es
del 100%. Con unos valores de corte en el titulo de 1:128. para las IgG. y de
1:32, para las IgM, el test indirecto de la mmunoperoxidasa rinde valores
semejantes y tiene la ventaja de que sólo se necesita un microscopio óptico
convencional, en lugar de un microscopio con iluminación ultravioleta.
Otros test serológicos disponibles comercialmente son la aglutinación con
látex y el enzimoinmunoensayo en fase sólida (Kelly. 1995). Ambos métodos
ofrecen información útil para el diagnóstico, requieren un equipo menos caro
para su ejecución, aunque no se consideran, generalmente, tan fiables como
el método IFA. Ciertamente, con estas técnicas se obtienen resultados mucho
más fiables que los que se consiguen con la prueba de Weil-Felix, que mide
la aglutinación de las cepas OX-19 y OX-2 de Proteus vulgaris (Kaplan, 1986).
Este test de Weil-Felix, poco sensible e inespecífico, no debería utilizarse
excepto en los casos de países en desarrollo en los que no es posible utilizar
otro método diagnóstico.
Tratamiento
Las rickettsiosis de los grupos de la liebre maculosa y del tifus se tratan de
forma eficaz con deoxiciclina. tetraciclina o cloranfenicol (Raoult. 1991). Las
fluoroquinolonas son aclivas frente a las rickettsias in vitro: pata el tratamiento
de la liebre botonosa se han utilizado, con éxito, ciprolloxacino. olloxacino y
pefloxacino, aunque estas quinolonas no han sido evaluadas todavía para el
tratamiento de la RMSF.
Tifus scrub (tifus de las malezas) causado
por Orientia tsutsugamushi
La pared celular propia de una bacteria gramnegativa de Orientia (original-
mente Rickettsia) tsutsugamushi difiere de la que presentan las otras especies
de rikettsias pertenecientes a los grupos de la fiebre maculosa y del tifus: en
este contexto, la membrana extema presenta la lámina externa más gruesa y
la interna más delgada, distintas proteínas mayoritanas, y carece de lipopoli
 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1080
sacárido y peptidoglucano (Jamura. 1995). La rickettsia productora del tifus
scrub crece en el citoplasma de la célula huésped y sale de la misma mediante
un proceso que implica la formación de una pequeña evaginación de la mem-
brana plasmática que engloba a la rickettsia en tránsito hacia el medio exoce-
lular. Orientia tsutsugamushi se mantiene transováricamente en acaras del
género Leptotrombidium (Traub, 1978). Los huevos infectados eclosionan para
liberar las larvas, la única fase que se alimenta en el hospedador animal.
Las ratas se infectan después de que las larvas que albergan las rickettsias
(chiggers) se alimenten de sus fluidos corporales, aunque las larvas que están
alimentándose y se infectan con las rickettsias no trasmiten la infección a su
descendencia. Por tanto, los humanos y las ratas son sólo huéspedes acci-
dentales, no esenciales y terminales de la rickettsia que causa el tifus scrub.
Esta enfermedad se da en el área comprendida dentro del triángulo delimitado
por Japón. Pakistán y el norte de Australia. La infección se contrae en zonas
con vegetación densa, donde una gran población de ratas alberga a su vez
una gran población de larvas que contienen las rickettsias.
La lesión patológica básica es el daño vascular con inflamación linfohisto-
cítica perivascular. que se manifiesta en la zona de la piel donde se produjo
la inoculación de la rickettsia y en el cerebro, pulmones, corazón, tracto gas-
trointestinal y ríñones.
Después de un período de incubación entre 6 y 21 días, la enfermedad
comienza con fiebre, dolor de cabeza y. en algunos pacientes, mialgia, los y sín-
tomas gastrointestinales (Watt. 1999). En la mitad de los pacientes occidenta-
les aparece una escara, normalmente antes del comienzo de la fiebre, que rara
vez aparece en los pacientes indígenas. Igualmente, en la mitad de los occi-
dentales afectados con infección primaria aparece un exantema macular o
maculopapular, entre dos y nueve días después del comienzo de la enferme-
dad. Los pacientes gravemente afectados pueden manifestar hipotensión,
meningoencefalitis, fallo renal agudo y procesos hemorrágicos, A menos que se
administre un tratamiento antimicrobiano adecuado, un 7% de los casos son
fatales. El tifus scrub puede también afectar a los excursionistas y otros viaje-
ros expuestos a las larvas en las zonas en las que la infección tiene carácter
endémico. Para el diagnóstico del tifus scrub en zonas endémicas, un título de
1:400 o superior en un ensayo de IFA tiene una especificidad del 96% y una
sensibilidad del 48%. Un incremento de cuatro veces en el título de anticuerpos
específicos hasta un valor de 1:200 o superior implica una especificidad del
98% y una sensibilidad del 54%. También están disponibles para el diagnóstico
el test indirecto de la inmunoperoxidasa, un inmunoensayo en fase sólida y un
test de aglutinación de la cepa OX-K de Proteus mirabilis. y parece ser prome-
tedor un ensayo con anticuerpos dirigidos frente a la proteína superficial mayo-
ritaria de 56 kDa, obtenida mediante técnicas de ADN recombinante (Kim, 1993:
Weddle, 1995). El tratamiento con un antibiótico del grupo de las tetraciclinas,
como la deoxiciclina, o con cloranlenicol es eficaz, excepto entre algunos casos
registrados en la parte norte de Tailandia (Watt, 1996).
Infecciones causadas por organismos
del género Ehrlichia
Estructura y función
Los especies del género Ehrlichia son bacterias gramnegativas de pequeño
tamaño (0,5 um). de morfología cocobacilar, parásitos intracelulares obligados
que viven en el interior de la vacuola citoplasmática de los glóbulos blancos
sanguíneos (Weiss, 1984). La microcolonia intravacuolar de bacterias semeja a
una mora cuando se observa bajo tinción por el método de Wright-Giemsa,
razón por la que a esta formación se le da el nombre de mórula (del latín, mora).
Conocidas y estudiadas desde hace tiempo como agentes causales de enfer-
medades veterinarias, las especies del género Ehrlichia han emergido última-
mente como patógenos humanos. Primariamente, las causas que han llevado a
esta nueva situación han sido su reciente detección en humanos, su rápida
caracterización con las herramientas moleculares analíticas actualmente dispo-
nibles y el incremento de las poblaciones y la distribución geográfica de las espe-
cies de garrapatas que tienen como hospedador a los ciervos. La taxonomía de
estos organismos está pendiente de revisión debido a los nuevos datos genéti-
cos que se han ido acumulando en los últimos años. Los patógenos animales
como Cowdria ruminantiumy Anaplasma margínale están incluidos dentro de los
géneros a los que pertenecen los agentes causales de ehrtichiosis en humanos
encontrados en EE.UU. La denominación del género Anaplasna data de 1910,
lo que sugiere que pueden producirse ciertos cambios en la nomenclatura de
estos microorganismos. Un agente causante de ehrtichiosis granulocitotrópica
en humanos, identificado mediante PCR y secuenciación del gen que codifica el
ARNr 16S, es una coespecie de E. phagocytophilay E. equi. existiendo para esta
última un precedente histórico (Chen, 1994), Otro agente que infecta a los gra-
nulocilos humanos, denominado Ehrlichia eivingii. presenta una gran semejanza
con E. chaífeensis (Anderson, 1992).
Ehrlichiosis monocitotrópica humana
Ehrlichia chaffeensis es transmitida por garrapatas, principalmente por la
especie Amblyomma americanum. la garrapata Lone Star (estrella solitaria,
nombre que se le da al estado de Texas, en EE.UU.), pero también por Derma-
centor variabilis e Ixodes paciíicus (Anderson, 1992a: Ewing, 1995; Kramer,
1999). Los casos detectados tienen carácter rural y estacional predominante-
mente, ya que el 68% de los mismos aparecen entre mayo y julio (Fishbein,
1994). Los ciervos son un reservorio del microorganismo bien conocido, aunque
los perros infectados también pueden ser reservónos potenciales. Las garrapa-
tas resultan infectadas mientras se alimentan en el estado de larva o de ninfa,
portando las ehrlichias mientras experimentan la muda entre las diletenles
fases de su ciclo, transmitiendo la infección durante una posterior alimentación
con la sangre del animal hospedador. La ehrlichiosis monocitotrópica humana
(HME) ha sido detectada en 47 estados de la Unión: la mayor parte de los casos
han aparecido dentro de la zona de dispersión de A. americanum en los esta-
dos del tercio sudeste de EE.UU., delimitado por una linea trazada desde
Nueva Jersey a Texas. El número de casos detectados es particularmente ele-
vado en Oklahoma, Missouri, Arkansas, Texas, Virginia. Tennessee y Georgia,
Desde que en 1987 se detectara el primer caso de ehrlichiosis en EE.UU.,
más de 700 pacientes con infección por E. chaffeensis confirmada en el labora-
torio han sido documentados en el CDC de Atlanta y más de 1.500 casos en un
laboratorio comercial (Fishbein, 1994). Aproximadamente entre un 2% y un 3%
de los casos han resultado fatales, aunque este porcentaje podría haber sido
mucho más elevado si no se hubiera aplicado un tratamiento antibiótico eficaz
en muchos pacientes (Fichtenbaum, 1994; Fishbein, 1994). La gravedad de la
enfermedad se refleja en el hecho de que el 62% de los pacientes son ingresa-
dos. Aunque los casos graves aparecen, a menudo, entre personas ancianas,
los niños también son susceptibles a la enfermedad (Schultz, 1997). La duración
media de la enfermedad en una extensa serie de casos estudiados por el CDC.
incluyendo aquellos en los que se administró tratamiento, fue de 23 días. Los sig-
nos y síntomas corresponden a los de una enfermedad sistémica que no tiene
características clínicas distintivas para el diagnóstico: fiebre (97% de los casos),
cefalea (81%), mialgia (68%). anorexia (66%), náuseas (48%), vómitos (37%).
exantema (6% al inicio de la enfermedad. 25% durante la primera semana y un
36% en conjunto), tos (26%), faringitis (26%), diarrea (25%). linfadenopatías
(25%), dolor abdominal (22%) y obnubilación (20%). Entre las complicaciones
graves se incluyen el síndrome de distrés respiratorio del adulto, la coagulación
intravascular diseminada y la insuficiencia renal. Los datos analíticos clínicos
muestran leucopenia (60%). trombocitopenia (68%) y valores elevados de
transaminasas hepáticas (86%). La afectación del sistema nervioso central viene
indicada por ciertos síntomas como ataques y coma, y se confirma por una pleo-
citosis en el líquido cefalorraquídeo (LCR), por la presencia de E, chaffeensis y
por un incremento de la concentración proteica en el LCR. y por la existencia de
lesiones cerebrales que se ponen de manifiesto mediante autopsia (Dunn, 1992;
Ratnasamy, 1996; Walker, 1997a). En los pacientes ¡nmunocomprometidos,
incluyendo los enfermos de sida, la ehrlichiosis monocitotrópica humana puede
ser una infección abrumadora, con un crecimiento masivo de las ehrlichias y un
desenlace fatal (Paddock, 1993; Walker, 1997a). También existe documentación
sobre infecciones suaves. Ehrlichia chaffeensis produce una infección persis-
tente en sus hospedadores naturales y al menos ha sido documentado un caso
semejante en humanos (Dumler, 1993b).
Tras la entrada del microorganismo mediante la picadura de la garrapata.
E. chaffeensis se disemina por el organismo a través de los sistemas linfático
y circulatorio. Las mórulas del microorganismo han sido detectadas en el inte-
rior de los monocitos y los macrófagos de la médula ósea, sangre periférica
(aunque raramente), sinusoides hepáticos, bazo, ganglios linfáticos, menin-
ges, riñon y epicardio (Dumler. 1993a; Walker. 1997a). El examen de la
médula ósea pone frecuentemente de manifiesto la existencia de granulomas,
hiperplasia mieloide y megacariocitosis. Otras lesiones detectadas han sido
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
infiltrados linfohistociticos perivasculares en el riñon, meninges, cerebro y
corazón; neumonitis mononuclear intersticial; focos de muerte celular seme-
jante a la apoptosis en el hígado, ganglios linfáticos y bazo; hiperplasia reti-
culoendotelial difusa; eritrofagocitosis; y colestasis.
Infección por Ehrlichia ewingii en el hombre
Inicialmente identificada en 1971 como un patógeno del perro. E eiv/ngHtam-
bién es transmitida por la garrapata A. americanum (Anziani, 1990: Ewing,
1971). Esta especie comparte antígenos comunes con E. chaffeensis. aunque
infecta principalmente a los neutrófilos. En el informe sobre el descubrimiento
de esta bacteria como patógeno humano, tres de los cuatro pacientes estudia-
dos eran inmunocomprometidos, lo que sugiere que los individuos inmunocom-
petentes pueden ser relativamente resistentes a la enfermedad (Buller, 1999).
Ehrlichiosis granulocitotrópica humana causada
por Ehrlichia phagocytophila
En EE.UU. se han documentado más de 600 casos de ehrlichiosis granulo-
citotrópica humana (HGE). detectados principalmente en ios estados de la parte
norte del medio oeste (Wisconsin y Minnesota) y los estados del nordeste
(Nueva York, Connecticut, Rhode Island y New Jersey), aunque también se han
confirmado casos de infecciones autóctonas hacia el sur, a lo largo de la costa
este, así como en California y en Europa (Aguero-Rosenfeld, 1996; Bakken,
1996; Horowitz. 1998; Petrovec. 1997). La infección es transmitida por las
garrapatas Ixodes scapulahs. I. pacificus e /. ricinus. siendo el ratón de patas
blancas (Peromyscus leucopus) y otros pequeños mamíferos el reservorío de la
bacteria en EE.UU., mientras que el ciervo rojo, ovejas, cabras y el ganado en
general tienen ese papel en Europa (Hodzic, 1998). La patología viene pobre-
mente definida por la observación en sangre periférica y diversos órganos de
neutrófilos con mórulas en su interior, de infiltrados de macrófagos espumosos
en órganos del sistema reticuloendotelial. de infiltrados linfohistociticos vascu-
lares periféricos y de apoptosis hepatocelular focalizada (Walker, 1997a). La
mortalidad está asociada frecuentemente con infecciones secundarias oportu-
nistas provocadas por hongos y virus (Hardalo, 1995).
Las manifestaciones de la ehrlichiosis granulocitotrópica humana van des-
de formas asintomáticas hasta casos graves, y muchos de los pacientes diag-
nosticados necesitan ser hospitalizados (Bakken, 1996). La infección resulta
mortal en menos del 1% de los casos, y es muy probable que algunas infec-
ciones tengan un curso subclínico. La enfermedad comienza con escalofríos,
fiebre, dolor de cabeza y mialgia. En la mayor parte de los casos aparece
trombocitopenia, y leucopenia en cerca de la mitad de los afectados. El dato
que indica la existencia de daño hepatocelular es la detección de niveles ele-
vados de enzimas hepáticas, y los pacientes gravemente enfermos pueden
sufrir un choque séptico con afectación multiorgánica.
Diagnóstico de laboratorio
El aislamiento de las ehrlichias a partir de sangre humana en cultivos celu-
lares sin antibióticos, una herramienta utilizada en la investigación, se ha
logrado más a menudo con E. phagocytophila (en células HL-60) que con £
chaffeensis (en células DH-82), sólo una vez con E canis (en una persona
asintomática). y aún no ha sido logrado (o al menos descrito en la bibliografía)
con E ewingii(Childs, 1999: Dawson, 1991; Goodman, 1996; Pérez, 1996). La
amplificación del ADN de las ehrlichias por PCR, empleando cebadores espe-
cíficos de especie, es un método eficaz para el diagnóstico de todas las ehrli-
chiosis humanas, aunque no está disponible para su empleo de forma general
(Anderson, 1992b; Buller, 1999; Chen, 1994; Comer, 1999; Everett, 1994). La
sensibilidad del método de PCR oscila entre el 79% y el 100% para el diag-
nóstico de la ehrlichiosis monocitotrópica, y entre un 48% y un 86% en el caso
de la ehrlichiosis granulocitotrópica causada por E phagocytophila (Anderson,
1992b; Everett, 1994). En fases más avanzadas de la enfermedad, debido al
menor número de microorganismos en sangre o al tratamiento con tetraciclina,
disminuye la sensibilidad del método de detección de ehrlichias basado en la
PCR. Aunque sea un método laborioso, la visualización de mórulas en los neu-
trófilos de sangre periférica es una buena alternativa para el diagnóstico de la
ehrlichiosis humana, ya que puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio.
Esta técnica tiene una mayor sensibilidad (entre el 30% y el 80%) para el diag-
nóstico de las infecciones causadas por E phagocytophila que para el de aque-
llas en el que la responsable es E chaffeensis (menos del 10%). Es importante
1081
eliminar cualquier interpretación que signifique un resultado falsamente positivo
debida a la presencia de granulaciones tóxicas, cuerpos de Dóhle. plaquetas
superpuestas o partículas contaminantes. La detección inmunohistoquimica de
E chaffeensis en muestras de tejidos se ha utilizado exclusivamente como téc-
nica de investigación (Dumler, 1993a; Yu, 1993).
El diagnóstico serológico es el procedimiento más habitual para la detección
de la ehrlichiosis humana mediante IFA, empleando E chaffeensis propagada en
cultivos celulares y antígenos de E. phagocytophila (Nicholson, 1997: Olano.
1999: Walls. 1999). Este método es muy sensible para detectar seroconversión
hasta un título de 1:64 o superior entre dos y cuatro semanas después del inicio
de la enfermedad. El resultado esperado en una muestra de suero correspon-
diente a la fase aguda de la enfermedad es la ausencia de anticuerpos. Por
lanío, el tratamiento debe iniciarse empíricamente en base a factores clínicos y
epidemiológicos y no quedar pendiente de la confirmación diagnóstica de labo-
ratorio. Existen opiniones variables respecto a cuál debe ser el título de anti-
cuerpos presente en una única muestra de suero que varían entre valores de
1:64 y 1:256 para E chaffeensis. Aproximadamente en un 20% de pacientes
afectados por HME y HGE respectivamente se detecta reactividad cruzada entre
E phagocytophila y E chaffeensis. En consecuencia, en aquellas zonas geo-
gráficas donde existe una superposición de ambos tipos de infecciones (HME y
HGE), o bien hay una posibilidad evidente de quedar expuesto a la infección
como consecuencia de un viaje, es esencial determinar el titulo de anticuerpos
frente a los dos microorganismos. Una diferencia de cuatro veces en el titulo es
el criterio utilizado para distinguir entre ambos agentes infecciosos. Aquellos
casos en los que sólo se detecta una diferencia de dos veces o menor se diag-
nostican como ehrlichiosis de etiología indeterminada.
Poder diferenciar a E chaffeensis de E ewingii según criterios serológicos
es más problemático, porque esta última especie aún no ha podido ser culti-
vada. La inmunotranslerencia (Western blot) es. actualmente, una técnica de
investigación útil para distinguir las infecciones causadas por E chaffeensis.
mediante la detección de una familia de proteínas de 120 kDa y 28 kDa espe-
cificas, y las provocadas por E phagocytophila, que muestra un patrón de
especies proteicas mayoritarias entre 42 kDa y 49 kDa (Asanovich. 1997:
Chen, 1997a, 1997b; Zhi, 1997). Los ensayos serológicos basados en estos
antígenos obtenidos mediante técnicas de ADN recombinante parecen ser
prometedores y podrian ser desarrollados en un futuro próximo (Yu, 1999).
Tratamiento
La doxiciclina es muy eficaz para el tratamiento de las ehrlichiosis huma-
nas (Bakken, 1996; Fishbein, 1994). El cloranfenicol también parece acortar
la duración de la ehrlichiosis monocitotrópica humana (Fishbein, 1994), aun-
que los estudios llevados a cabo m vitro con cultivos celulares revelan que
tanto E. chaffeensis como E. phagocytophila son resistentes a este antibió-
tico, así como a ciertos antimicrobianos de prescripción frecuente como los
p-lactámicos. macrólidos, aminoglucósidos y sullamidas (Brouqui, 1992:
Klein, 1997). Ehrlichia phagocytophila es sensible a la rifampicina y a la rifa-
butina cuando se encuentra creciendo en cultivos celulares.
Infecciones causadas por Coxiella burnetii
Estructura y función
Coxiella burnetii se encuentra bastante alejada desde el punto de vista
genético del resto de rickettsias patógenas, y es el único microorganismo inte-
grado en el grupo -/de las Proteobacterias. Estas bacterias gramnegativas tie-
nen un aspecto variable que va desde una morfología bacilar hasta una cocá-
cea, y mediante microscopía electrónica se han identificado dos lormas
distintas: una representada por células largas (entre 0,5 pm y 1,2 pm) y otra
por células densas de pequeño tamaño (0.5 pm), que podrian indicar la exis-
tencia de un ciclo de desarrollo.
Se ha puesto un gran énfasis en los fenómenos asociados con el cultivo de
C. burnetii en el laboratorio, como es la pérdida de la capacidad para sintetizar
completamente el lipopolísacárido de la pared celular, tras un periodo prolon-
gado de pases sucesivos en cultivos celulares o huevos embrionados. El cam-
bio consistente en la síntesis de una molécula truncada de lipopolisacárido en
lugar de la molécula completa del mismo, y que es análogo a la interconversión
entre los fenotipos liso y rugoso que se da en la familia Enterobacteriaceae, se
ha denominado como variación de fase, de fase I a fase II. La fase I se encuen-
 1082 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Ira en la naturaleza y en los anímales y personas infectadas, mientras que la
lase II aparece tan sólo en condiciones de laboratorio.
Coxiella burnetii penetra en las células blanco, los macrófagos, por un pro-
ceso de fagocitosis pasiva y está fuertemente adaptada a las condiciones
existentes en el interior del fagolisosoma (p, ej„ la bacteria sintetiza superó-
xido dismutasa y fosfatasa acida), donde tiene lugar la mulliplicación de la
bacteria por fisión binaria.
Fiebre Q
El nombre de fiebre O deriva del desconocimiento de su etiología cuando el
síndrome clínico-epidemiológico fue descrito inicialmente como liebre interro-
gante. La ecología de C. burnetii incluye infecciones silenciosas en animales:
muchas especies de garrapatas, ungulados (especialmente ovejas, vacas y
cabras), otros mamíferos (incluyendo gatos y conejos salvajes), peces, pájaros y
marsupiales (Mame. 1988.1997). Los seres humanos se infectan principalmente
por la inhalación de aerosoles que tienen su ongen en restos de los partos del
ganado doméstjco. aunque también por la ingestión de leche contaminada no
pasteurizada (Fishbein, 1992). Muchas de las infecciones humanas tienen carác-
ter de enfermedad ocupacional: se da entre empleados de mataderos, granjeros
y veterinarios. Por el contrario, los casos urbanos no relacionados con una pro-
fesión de riesgo son, sin lugar a dudas, muy poco frecuentes en algunos de los
grupos de población donde han sido evaluados, como sucede por ejemplo entre
los pacientes inmunocomprometidos en Francia (Brouqui, 1993).
La mayor parte de las infecciones humanas son asintomáticas (Mame. 1990).
La enfermedad aguda se manifiesta, a menudo, como una afección febril mdife-
renciada y autolimitada, o como una neumonía, hepatitis o meningoencefalitis
(Drancourt. 1991; Duponl, 1992). Los pacientes individuales con mialgias. ano-
rexia y dolor de cabeza raramente son investigados con objeto de diagnosticar-
les una fiebre Q, aun cuando estos síntomas son la presentación clinica más clá-
sica de esta inlección, que representa, a su vez. un porcentaje significativo entre
los pacientes que manifiestan dichos síntomas en algunos grupos de población.
Las manifestaciones de la forma neumónica de la fiebre Q son variables: la tos
puede ser no productiva o estar ausente, y la neumonía puede ser grave y pro-
gresar rápidamente o ser detectada radiológicamente, visualizando la presen-
cia de múltiples infiltrados radiológicos redondeados o segmentarios, con
ausencia de síntomas pulmonares. La forma hepática de la fiebre Q puede tener
una presentación clinica semejante a la de la hepatitis viral aguda o la manifes-
tación patológica de una hepatitis granulomatosa determinada mediante biopsia.
La fiebre Q crónica está considerada como un sinónimo de endocarditis pro-
ducida por C. burnetii. pero también aparece menos frecuentemente como con-
secuencia de la infección de un aneurisma o de prótesis vasculares, o de osteo-
mielitis(Brouqui, 1993; Marrie. 1990). La forma de endocarditis crónica de la fiebre
Q implica, generalmente, a una válvula aórtica o mitral previamente dañada, pro-
duciendo una enfermedad no febril que puede manifestarse con fallo cardiaco,
bepatoesplenomegalia. ruidos cardiacos cambiantes y pérdida de peso. Las
manifestaciones de la enfermedad asociadas a inmunocomplejos circulantes
incluyen un exantema purpúrico asociado a vasculitis o glomerulonefritis.
La patología de la fiebre Q aguda incluye neumonía bronquiolo-alveolar
intersticial mixta con células inflamatorias mononucleares e inflamación gra-
nulomatosa del hígado y la médula ósea (Walker, 1988b). Los granulomas
asociados a la fiebre Q presentan, a menudo, una vacuola central transpa-
rente rodeada por un anillo de fibrina y por macrófagos epitelioides. De todos
modos, estos granulomas no son lesiones con valor patognomónico ni tam-
poco el único tipo de granulomas que se detectan en el higado y la médula
ósea de los pacienles afectados por fiebre Q. Las válvulas cardíacas alecta-
das en la endocarditis asociada a la fiebre Q muestran una inflamación sub-
aguda y crónica, con una gran cantidad de macrófagos espumosos que tie-
nen el citoplasma repleto de células de C. burnetii.
Diagnóstico de laboratorio
El diagnóstico de laboratorio de la fiebre Q se lleva a cabo, en la mayor parte
de los casos, mediante la detección de anticuerpos frente a C. burnetii (Fournier,
1996. 1998). Los métodos serológicos utilizan antigenos característicos de
ambas fases (fase I y fase II) y. a menudo, evalúan la producción de anticuerpos
específicos de clase. Los métodos del enzimommunoensayo y el IFA son alta-
mente específicos y mas sensibles que los basados en la fijación del comple-
mento. En la fiebre Q aguda, los anticuerpos frente a los antigenos de la fase II
aparecen muy pronto tras la infección, mientras que los anticuerpos frente a la
fase I pueden detectarse unas dos semanas después del inicio de la enferme-
dad. En general, la fiebre Q aguda se asocia con títulos elevados de anticuerpos
frente a los antigenos de la fase II y bajos frente a los de la fase I. Mediante el
test de IFA, un título de IgG y de IgM frente a antigenos de la fase II de 1:200 o
superior y de 1:50 o superior, respectivamente, tiene una sensibilidad del 58% y
una especificidad del 92% para el diagnóstico de la fiebre Q aguda. En la forma
crónica de la enfermedad, se detecta un título más elevado de anticuerpos frente
a la fase I (de 1:800 o supenor mediante el test de IFA) mientras que el titulo de
anticuerpos frente a la fase II es. generalmente, igual o inferior al de la fase I. Fre-
cuentemente es posible detectar una respuesta de IgA frente a antígenos de la
fase I en pacientes aquejados de fiebre Q crónica. Un título de 1:128 o superior
de anticuerpos frente a antigenos de fase detectados mediante fijación de com-
plemento se considera también que tiene valor diagnóstico de fiebre Q crónica,
si bien algunos pacientes presentan títulos inferiores. Debido a la reactividad
cruzada existente entre Bartonella henselae y B. quintana con C. burnetii. no
debe llevarse a cabo el diagnostico serológico de la endocarditis causada por
Bartonella hasta que no se haya determinado el titulo de anticuerpos frente a
C. burnetii (LaScola. 1996b), que, en el caso de la endocarditis asociada a la fie-
bre Q, es sustancialmente más elevado que el detectado frente a Bartonella.
Otros métodos empleados para el diagnóstico de la endocarditis asociada a
la fiebre Q crónica son la tinción inmunohistológica, la microscopía electrónica,
y la detección de C burnetii mediante PCR, aunque todos ellos implican la uti-
lización de técnicas que son más propias de la investigación básica. Coxiella
burnetii puede ser recuperada a partir de la sangre o de las válvulas cardiacas
mediante cultivo in vttro utilizando un sistema de cultivo de células HEL en shell
vial, facilitado por centrifugación. Este procedimiento puede detectar e identifi-
car la presencia de coxiellas en unos siete días, pero debe emplearse sola-
mente en instalaciones con medidas de bioseguridad de nivel 3.
Tratamiento
La doxiclma es eficaz para acortar la duración de la fiebre O aguda cuando
se administra durante los tres primeros días después del comienzo de la enfer-
medad (Levy, 1991). Las fluoroquinolonas representan una medicación alter-
nativa para aquellos pacientes que no pueden ser tratados con tetraciclinas. El
tratamiento de la endocarditis asociada a la forma crónica de la enfermedad
implica la administración durante liempo prolongado de doxicíclina y una qui-
nolona simultáneamente, aunque a menudo esta pauta no es capaz de elimi-
nar la infección (Marrie. 1997). El éxito del tratamiento viene indicado por una
lenta caída en el título de IgG frente a antígenos de la fase I hasta un valor por
debajo de 1:200, momento en el que puede considerarse la posibilidad de sus-
pender el tratamiento. La sustitución de las válvulas cardíacas afectadas se
lleva a cabo, frecuentemente, por razones de tipo hemodinamico.
Infecciones causadas por organismos del género
Bartonella (Rochalimaea)
Estructura y función
Los organismos originalmente clasificados dentro del género Rochalimaea han
sido reclasificados como un género nuevo, Bartonella. mientras que la familia Bar-
tonellaceae ha sido suprimida del orden Rickettsiales (Birtles. 1996; Brenner.
1993). Las especies patógenas del hombre. S. quintana (el agente etiológico de
la fiebre de las trincheras, una de las pnncipales enfermedades transmitidas por
piojos durante la primera guerra mundial), B. henselae (el agente causal de la
enfermedad por arañazo de gato), B. elizabethae (asociada con endocarditis
infectiva) y B. bacilliíormis (una bacteria transmitida por los mosquitos que pro-
voca una forma febnl de anemia hemolítica aguda y una lesión cutánea crónica
denominada verruga peruana en América del Sur), han podido ser cultivadas en
medios artificiales enriquecidos con sangre en presencia de un 5% de CO-, Estos
bacilos gramnegativos. parásitos intracelulares facultativos, no producen ácidos
de los carbohidratos y. generalmente, se localizan en el interior de los entrocilos
del animal mamífero que constituye su hospedador natural. Entre las numerosas
nuevas especies descritas del género Bartonella, B. clarridgeiae podría ser un
segundo agente etiológico de la enfermedad por arañazo de gato (Kordick, 1997),
Enfermedad por arañazo de gato, angiomatosis bacilar
y peliosis bacilar
Bartonella henselae es transmitida al ser humano por los arañazos o morde-
duras de mascotas infectadas que están bacteriémicas durante muchos meses
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
aunque aparentemente parezcan sanas (Bergmans, 1997; Chomel, 1995; Heller,
1997; Tapperò, 1993). La bacteria se transmite entre gatos a través de sus pul-
gas (Chomel. 1996; Higgins. 1996). La naturaleza de la enfermedad está deter-
minada, en gran medida, por el propio hospedador. En individuos inmunocom-
petentes, alrededor del 80% son jóvenes menores de 21 años que presentan
una pápula o pústula cutánea en el punto donde se produjo la inoculación del
microorganismo, con una linfadenopatia regional limitada. Menos del 2% de los
pacientes sufren complicaciones en el hígado, bazo, pulmones, huesos, sistema
nervioso central, retina, conjuntiva o piel como consecuencia de la diseminación
del microorganismo por la sangre (Listón. 1996). Desde un punto de vista histo-
patólogico, las lesiones de la enfermedad por arañazo de gato consisten en gra-
nulomas que rodean a microabcesos estrellados. En pacientes profundamente
inmunodeprimidos, la infección por B. henselae cursa con fiebre y bacteriemia o
con lesiones cutáneas o viscerales angioproliferativas. Estas últimas se caracte-
rizan por ser proliferaciones vasculares lobulares de células endoteliales rechon-
chas con racimos de pequeños capilares que rodean a los capilares ectáticos
separados por un estroma edematoso, mucilaginoso o fibrótico que contiene
cúmulos de neutrófilos y de restos de los mismos, así como microcolonias gra-
nulares de bartonellas. Cuando se forman en la piel, estas lesiones reciben el
nombre de angiomatosis bacilar, mientras que cuando aparecen en el hígado y
el bazo se denominan peliosis hepática o esplénica. La infección también puede
diseminarse a otras localizaciones. Las lesiones angioproliferantes provocadas
por B. henselae y B. quintana en pacientes inmunodeprimidos son indistinguibles
entre si y bastante parecidas a las de la verruga peruana causada por 8. bacilli-
formis (Koehler, 1997). Bartonella henselae, B. quintana y 8. elizabethae han
sido descritas como agentes responsables de endocarditis infecciosa en huma-
nos, al igual que B. vinsoniien perros (Drancourt, 1995).
Fiebre de las trincheras y angiomatosis bacilar
Bartonella quintana produce una bacteriemia prolongada en pacientes con-
valecientes, que constituyen, aparentemente, su reservono. Durante la pri-
mera guerra mundial, se estableció que la infección se transmitía de persona
a persona mediante la picadura del piojo {Pediculus humanus corporis) en las
trincheras de la primera linea del frente (Bruce. 1921), no habiéndose identi-
ficado otras fuentes o mecanismos para la transmisión de la infección.
A partir de las heces del piojo cargadas con B. quintana, el microorganismo
penetra por las erosiones de la piel que el propio individuo se produce al rascarse
tras la picadura, y aproximadamente ocho días más tarde comienzan a aparecer
los síntomas de la enfermedad, que se manifiesta con un nivel de gravedad
variable. Los síntomas incluyen fiebre, que generalmente desaparece en menos
de una semana, jaqueca, mialgias, dolor pretibial y la aparición de una erupción
macular evanescente. Las recaídas se producen a menudo con intervalos de
cuatro a cinco días. La bacteriemia en el ser humano afectado persiste durante
semanas, meses o incluso más tiempo, siendo la fuente a partir de la cual los
piojos se infectan, incluso aun cuando la persona se sienta relativamente salu-
dable. En la actualidad se detectan casos de la enfermedad entre los grupos de
alcohólicos y vagabundos en ciudades amencanas y europeas (Spach, 1995).
Fiebre de Oroya y verruga peruana
La bartonellosis sudamericana, que se manifiesta como una enfermedad
aguda, denominada liebre de Oroya, o en forma de una lesión cutánea crónica
llamada verruga peruana, se transmite por la picadura del mosquito Lutzomyia.
Los portadores humanos asintomáticos a largo plazo son el reservorio de la bac-
teria responsable, B. bacillilormis. Tras un período de incubación de unas tres
semanas aproximadamente, la liebre de Oroya comienza de una forma insidiosa
con anorexia, dolor de cabeza, malestar y febrícula, o bien de manera brusca
con escalofríos, fiebre elevada y delirios. Las bartonellas invaden los glóbulos
rojos sanguíneos, provocando cambios en los mismos que se traducen en eri-
trofagocitosis y anemia. La verruga peruana, caracterizada por la aparición de
nodulos duros, con una coloración que va de rojo a púrpura, que surgen en gru-
pos durante un período de entre uno y dos meses y persisten durante meses e
incluso años, es un cuadro que se manifiesta tras la liebre de Oroya, o puede
aparecer sin que existan síntomas previos de ningún tipo (Arias-Stella. 1986).
Diagnóstico de laboratorio
El hemocultivo por el procedimiento de lisis-centrifugación y el sistema
Bactec para hemocultivo han sido utilizados para la recuperación de 8. hen-
selae y B. quintana a partir de los pacientes (Brenner. 1997). El crecimiento
1083
óptimo se obtiene en medios de cultivo enriquecidos con sangre de conejo,
en agar chocolate o en agar con extracto de levadura y carbón activo. Las
colonias tardan entre 9 y 15 días, y en ocasiones incluso más tiempo, en apa-
recer y ser detectadas. Las especies del género Bartonella son bacterias
gramnegativas de morfología bacilar, con una longitud entre 1 u.m y 3 u.m y
un diámetro entre 0,2 u.m y 0,5 u.m. Bartonella henselae da negativas las
pruebas de la oxidasa, catalasa y ureasa y no utiliza los carbohidratos. La
identificación definitiva requiere un análisis de la composición de ácidos gra-
sos, secuenciación de ADN o hibridación con sondas específicas, técnicas
que se utilizan por lo general en los laboratorios de referencia (Scott, 1996).
La PCR representa un método atractivo para el diagnóstico molecular. Barto-
nella bacillilormis puede ser cultivada y aislada a partir de muestras de san-
gre o de las lesiones cutáneas en agar infusión de cerebro y corazón, conte-
niendo un 0,4% de agar y un 5% de sangre humana, de caballo o de cone|0.
Originalmente, el diagnóstico de la enfermedad por arañazo de gato se
basaba en una combinación de datos clínicos, epidemiológicos y patológicos.
Los estudios morfológicos, incluyendo la tinción de Warthin Starry, han sido utili-
zados como datos adicionales para el diagnóstico de la angiomatosis bacilar y la
enfermedad por arañazo de gato. La fiebre de Oroya puede diagnosticarse
mediante la visualización de las bartonellas en el interior de los eritrocitos, que
aparecen como formas cocáceas o bacilares, ocasionalmente con morfologías
curvadas o en anillo, en muestras de sangre periférica cuidadosamente teñidas
mediante el método de Giemsa. para evitar la aparición de artefactos que pudie-
sen conducir a una interpretación errónea de lo observado. El diagnóstico de las
infecciones causadas por 8. henselae y 8. quintana se lleva a cabo habitual-
mente mediante la demostración de la existencia de anticuerpos específicos
mediante inmunofluorescencia indirecta o enzimoinmunoensayo (Dalton,
1995b). El diagnóstico serológico de la endocarditis por bartonellas debe con-
templar también la determinación del título de anticuerpos frente a C. burnetii,
que puede incrementar el título de anticuerpos que reaccionan cruzadamente
con Bartonella (Maurin, 1997). El título frente a la fase I de C. burnetii es mucho
más elevado que el de anticuerpos anti-8artone//a en la endocarditis asociada a
la forma crónica de la fiebre Q.
Tratamiento
Por lo general, la enfermedad por arañazo de gato es autolimitada, aunque
parece responder favorablemente al tratamiento con acitromicina. Los fármacos
de elección para el tratamiento de la angiomatosis bacilar, peliosis por Bartone-
lla, bacteriemia o endocarditis son eritromicina, acitromicina o doxiciclina (Gue-
rra, 1993). Eventualmente pueden producirse recaídas que necesitan un nuevo
tratamiento o incluso una terapia de mantenimiento a largo plazo. Para el trata-
miento de la fiebre de Oroya es preferible el cloranlenicol, debido a la efectividad
de este antibiótico frente a la sobreinfección por salmonellas. cuya aparición está
claramente reconocida. El tratamiento puede producir una reacción semejante a
la de Jarisch-Herxheimer. que cursa con fiebre y otros síntomas sistémicos. La
verruga peruana se trata con rifampina por vía oral. En el tratamiento de la fie-
bre de las trincheras se han utilizado con éxito tetraciclina y cloranfenicol.
INFECCIONES POR MICOPLASMAS
La capacidad de los micoplasmas para causar enfermedades en el hombre
fue puesta de manifiesto en 1962. cuando un organismo de este tipo (seguida-
mente denominado Mycoplasma pneumoniae) fue identificado como el agente
etiológico de la enfermedad denominada neumonía atípica primaria (Chanock,
1962). Los micoplasmas son los microorganismos más pequeños conocidos
con capacidad para vivir como formas libres. Son bacterias pleomórficas, con
forma esférica, de pera o filamentosa, con un diámetro entre 0,2 u,m y 0,8 p.m.
La mayor parte de especies son anaerobias facultativas y se dividen por esci-
sión binaria. Los micoplasmas constituyen un grupo único entre las bacterias
porque carecen de pared celular. Son incapaces de sintetizar los constituyentes
de la pared celular y necesitan que en el medio exista colesterol (y otros este-
roles relacionados) para poder llevar a cabo la síntesis de membranas. Los
micoplasmas también carecen de las rutas enzimáticas necesarias para reali-
zar la síntesis de purinas y pirimidinas, por lo que necesitan medios de cultivo
complejos (como el caldo infusión de corazón de vacuno, enriquecido con suero
de caballo, extracto de levadura y ácidos nucleicos) para poder crecer in vitro.
En este capítulo se tratarán las especies potencialmente patógenas, Myco-
plasma pneumoniae y los micoplasmas genitales {Mycoplasma hominis y Ure-
 1084 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
aplasma urealyticum). Las otras especies de micoplasmas forman parle de la
microbiota normal de los tractos respiratorio y genitourinario en el ser humano.
Mycoplasma pneumoniae
Epidemiología
Mycoplasma pneumoniae tiene una distribución mundial. Las epidemias pro-
vocadas por esta bacteria se dan en grupos de población cerrados, como niños
en escuelas, familias, reclutas militares, típicamente a intervalos de tiempo enlre
cuatro y ocho años, especialmente al final del verano y comienzo del otoño. En
los años de los períodos interepidémicos, los casos aparecen a lo largo de todo
el año y por lo general la infección se extiende lentamente, siendo necesario
para el contagio que exista un contacto directo con una persona enferma. Sin
embargo, durante las epidemias la infección puede diseminarse rápidamente, y
la detección de brotes puntuales que no parecen estar asociados a una exposi-
ción cercana y prolongada al microorganismo sugiere que M. pneumoniae puede
transmitirse a través de partículas de pequeño tamaño presentes en aerosoles.
La tasa de infección con M. pneumoniae es elevada en niños en edad escolar y
adultos jóvenes, y la enfermedad aparece con mayor frecuencia en personas
con edades comprendidas entre los 5 y los 20 años, especialmente en aquellas
que se encuentran en la franja entre los 15 y los 19 años. La infección por M.
pneumoniae es frecuente en niños con menos de 5 años, aunque por lo gene-
ral es asintomática o produce tan sólo una enfermedad suave con conza y silbi-
dos respiratorios pero sin fiebre o neumonía (Femald. 1975).
Patogenia y patología
Mycoplasma pneumoniae es un parásito superficial que coloniza el epitelio
de la mucosa del tracto respiratorio. Su capacidad para adherirse a las célu-
las de la mucosa respiratoria, escapar a la fagocitosis y modular la respuesta
del sistema inmune es fundamental para que se desencadene la enfermedad.
Su movilidad por deslizamiento puede permitirle penetrar a través de las
secreciones respiratorias, y su forma filamentosa y flexible, que posee un
orgánulo de adherencia terminal, facilita su localización en huecos y plega-
mientos de la membrana plasmálica de las células hospedadoras y entre las
microvellosidades y los cilios de las mismas, donde queda protegido de la
acción de las células fagocíticas. La adhesión de M. pneumoniae a las célu-
las hospedadoras está mediada por la proteína P1, que mteracciona con glu-
coproteinas que contienen ácido neuramínico. presentes en la superficie de
la membrana celular (Chandler. 1982; Geary, 1987). El peróxido de hidrógeno
y el ion superóxido producido por M. pneumoniae puede causar daño en las
células de la mucosa, provocando la detención del movimiento de los cilios y
el desprendimiento de las células superficiales (Almagor, 1984)
Algunos factores relacionados con el hospedador también parecen estar
implicados en la patogenia de la enfermedad producida por M. pneumoniae.
La aparentemente elevada prevalencia de la infección por esta bacteria en
niños y jóvenes, el carácter suave de la enfermedad en individuos pertenecien-
tes a estos grupos y la aparición de una forma más grave de la afección en per-
sonas con edades más avanzadas sugiere que la enfermedad grave podría ser
consecuencia de la respuesta inmune del hospedador a la reinfección por el
microorganismo; sin embargo, se desconoce la naturaleza del mecanismo
específico responsable del daño celular en este caso Además, se sospecha
que los síntomas exlrapulmonares (que se comentarán más adelante) están
mediados por una respuesta inmune, ya que M. pneumoniae se aisla con muy
baja frecuencia a partir de muestras no respiratorias. La interacción de M.
pneumoniae con el determinante antigénico I de los glóbulos rojos humanos,
que contiene los restos de 2.3-sialil-poli-/V-acetilgalactosamina necesarios
para el reconocimiento, puede causar una alteración en dicho antigeno I,
transformándolo en antígeno extraño que estimule la producción de aglutini-
nas frías. Otros anticuerpos autoinmunes que se forman durante la infección
por M. pneumoniae (anticuerpos frente a pulmón, cerebro, músculo liso y Im-
focitos) pueden tener un origen semejante.
La primera linea de defensa durante la infección primaria por M. pneumo-
niae es la activación del complemento por la vía alternativa y la fagocitosis de
las bacterias a nivel de la superficie de las mucosas. Determinados compo-
nentes galactosilados y glucosilados presentes en la superficie de la mem-
brana celular del microorganismo parecen tener la capacidad de inducir la
producción de anticuerpos, de los que los más impodantes son las IgA. que
se encuentran predominantemente en las secreciones propias de la mucosa.
Los antígenos intracelulares de M. pneumoniae que quedan expuestos como
consecuencia de la fagocitosis y subsiguiente degradación de las bacterias
fagocitadas estimulan la respuesta mediada por linfocitos T. que a su vez
determina, aparentemente, la gravedad de la enfermedad
Existe poca información sobre la patología de la enfermedad causada por
M. pneumoniae, ya que la mayor parte de infecciones son autolimítadas. y
muy raramente se obtienen muestras de tejidos por biopsia para su examen.
En los casos látales se pueden observar zonas de consolidación parcheadas
en los pulmones. El examen histológico de los focos de tejido afectado revela
la existencia de bronquitis, bronquiolilis y neumonitis intersticial y alveolar con
acúmulos peribronquioiares de linfocitos y células plasmáticas, acompañados
por macrófagos y neutrófilos en el caso de que exista necrosis celular.
Manifestaciones clínicas
La manifestación más común de la enfermedad causada por M. pneumoniae
es la Iraqueobronquitis. La neumonía, que aparece aproximadamente en un ter-
cio de personas infectadas, comienza de forma gradual entre dos y tres sema-
nas después de la exposición al microorganismo, con fiebre, malestar, dolor de
cabeza, faringitis y una tos seca persistente no productiva (Baum. 2000). Es fre-
cuente una sinusitis clínicamente inaparente, y también puede aparecer mirin-
gitis. Las radiografías de tórax muestran una bronconeumonía unilateral en el
lóbulo inferior del pulmón y, ocasionalmente, infiltrados dilusos bilaterales. El
recuento de leucocitos en sangre periférica es normal inicialmente. para aumen-
tar a medida que la enfermedad avanza. En aproximadamente un 15% de los
afectados, aparece una erupción cutánea maculopapular y. con menor frecuen-
cia, vesicular, unos pocos días después del comienzo de la enfermedad. Sin tra-
tamiento antimicrobiano la fiebre desaparece entre los 2 y 14 dias. pero el
malestar general, la tos y las anomalías radioscopias persisten entre dos y seis
semanas. En un bajo porcentaje de niños y adultos, la neumonía es lo sufi-
cientemente grave como para requerir hospitalización: en estos pacientes pue-
den aparecer abscesos pulmonares, derrames pleurales, infecciones bactena-
nas secundarias, bronquiectasias o recaídas clínicas. Las manifestaciones
extrapulmonares son poco frecuentes e incluyen anemia hemolítica clínica-
mente aparente, asociada típicamente con títulos muy elevados de aglutminas
frías: eritema multiforme, eritema nodoso y urticaria; encefalitis, meningoence-
falitis, mono o polineuritis y meningitis: miocarditis y pericarditis, y artralgias y.
raramente, artritis (Baum. 2000; Cassel. 1981: Ponka. 1979)
Micoplasmas genitales
Epidemiología
En los niños, la colonización con micoplasmas genitales liene lugar en el
momento del nacimiento cuando el feto pasa por el canal del parto infectado
y. por lo general, persiste un poco menos de dos años. Ureaplasma urealyti-
cum y Mycoplasma hominis pueden ser aislados del tracto genital de hasta un
30% de las niñas (con menor frecuencia a partir del tracto genital de niños), y
también pueden aislarse a partir de nariz y garganta de un 15% de niños y
niñas (Klein. 1969). En un estudio se encontró que el 20% de las niñas pre-
púberes estaban colonizadas con ureaplasmas y un 6% con M. hominis. aun-
que en niños prepúberes los micoplasmas genitales fueran aislados muy rara-
mente (Hammerschlag. 1978). La colonización con micoplasmas genitales
después de la pubertad es consecuencia del contacto sexual. Alrededor del
60% de mujeres aparentemente sanas, sexualmente activas, son portadoras
de U. urealyticum en su vagina, mientras que un 20% lo son de M. hominis.
Manifestaciones clínicas
Ureaplasma urealyticum es responsable de algunos casos de uretritis no
gonocócica; ha sido asociado con fiebres posparto, corioamnionitis y naci-
mientos con peso bajo, aunque no se ha probado que exista una relación cau-
sal en este último caso: y también es raramente responsable de casos de ure-
trocistitís crónica en individuos inmunodepnmidos (Taylor-Robinson. 1980.
1985: Casell. 1986). Mycoplasma hominis es uno de los agentes causales de
fiebre posparto y postaborto; y también es la causa, aunque con muy poca
frecuencia, de casos de bacteriemia. artritis, peritonitis, meningitis, osteomie-
litis e infecciones de las heridas, principalmente en personas inmunocompro-
metidas, aunque también en otras que no manifiestan, aparentemente, defi-
ciencia inmunológica subyacente alguna (Taylor-Robinson, 1980: DeGirolami.
1982: McMahon. 1990).
 CAPÍTULO 49 • INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
Diagnóstico de laboratorio
Mycoplasma pneumoniae
Las muestras recomendadas para llevar a cabo el diagnóstico de la infec-
ción causada por M. pneumoniae son exudados de garganta tomados con
hisopo y suero, aunque también son aceptables el Huido del lavado broncoal-
veolar, esputo y biopsias de tejido pulmonar. Un test serológico no específico
que puede proporcionar información útil es la detección de aglutinmas frías,
que son anticuerpos del tipo IgM (rente al antígeno I de los eritrocitos huma-
nos. Estas aglutinmas aparecen al final de la primera o comienzos de la
segunda semana de la enfermedad, al menos en la mitad de las personas
infectadas, aunque su presencia no es diagnóstico de infección por M. pneu-
moniae. El diagnóstico definitivo se basa en la delección del microorganismo,
o de IgM específicas en suero, o en la observación de un incremento de cua-
tro veces en el título de IgG entre muestras de suero tomadas en la fase
aguda y de convalecencia de la enfermedad.
Para aislar M. pneumoniae. se inocula un sistema bifásico de cultivo que
se incuba a 35°C-37"C hasta un máximo de tres semanas en el interior de un
contenedor sellado, en una estufa normal. Los cultivos se examinan al micros-
copio (x40) una o dos veces por semana para detectar en los mismos la pre-
sencia de las típicas colonias que recuerdan a un "huevo frito" (presentan una
zona central densa, rodeada de un área menos compacta), embebidas en la
matriz del agar del medio de cultivo. Tales colonias, típicas de M. pneumo-
niae. deben ser analizadas para comprobar su carácter hemolitico {M. pneu-
moniae es |J-hemolítico) según el siguiente procedimiento: se prepara un agar
al 1% en solución salina al 0.85% que se mantiene fundido a la temperatura
de 50 C. mezclándose a continuación con sangre de oveja o de cobaya para
obtener una concentración final de eritrocitos del 5%; seguidamente se depo-
sita un volumen de la mezcla final resultante sobre la superficie del medio de
cultivo donde aparecieron las colonias, para obtener, tras la solidificación del
agar, una delgada capa que cubra las mismas; el cultivo es reincubado
durante 24 horas, examinándose seguidamente para detectar los halos de
hemolisis completa alrededor de las colonias.
Debido a que el aislamiento de M. pneumoniae puede requerir vanas
semanas, los test rápidos resultan más útiles para el diagnóstico. Por ejem-
plo, la detección de IgM específicas en una única muestra de suero es indi-
cativa de infección aguda. Si lo que se determina son IgG, entonces deben
analizarse muestras de suero tomadas durante la lase aguda y de convale-
cencia de la enfermedad, para observar un incremento de cuatro veces o
superior en el titulo de anticuerpos específicos.
Micoplasmas genitales
Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis pueden recuperarse a par-
tir del material obtenido a partir de la vagina, uretra o endocérvix con un
hisopo, o bien de muestras de orina, sangre, material de abscesos, secrecio-
nes prostéticas, semen o biopsias de tejidos.
Se pueden utilizar varios sistemas de cultivo para llevar a cabo el aislamiento
de los micoplasmas genitales (Clyde. 1984; Yajko. 1984; Wood. 1985: Phillips.
1986). Tradicionalmente. se han utilizado procedimientos separados para cada
especie (caldo U y agar U para U. urealyticum y caldo H y agar H para M. homi-
nis). debido a que el pH óptimo de crecimiento de los dos microorganismos
es diferente (pH entre 5,5 y 6.5 para U. urealyticum y entre 6 y 8 para M. homi-
nis). Sin embargo, en la actualidad existen sistemas únicos de cultivo que per-
miten detectar con gran eficacia ambas bacterias (Yajko, 1984; Wood. 1985:
Phillips, 1986). Los cultivos en medio líquido se incuban en aerobiosis en
tubos sellados. Los cultivos en medios sólidos se incuban en anaerobiosis o
en una atmósfera que contenga entre el 5% y el 7% de C0 . y son examina-
; Campbel LAKuoCC, Grayston JT Characterization of the new Cnlamydia agent. TWAR. as a unique orga-
dos diariamente con el microscopio. M. hominis también crece en agar san-
gre de ove|a. donde forma colonias visibles, no hemolíticas. y en la mayor
parte de medios líquidos para hemocultivo. aunque en éstos no produce evi-
dencia visible y detectable de su crecimiento.
Las colonias de M. hominis. con un diámetro entre 200 pm y 300 pm y la
típica forma de "huevo frito", aparecen tras cinco días, o incluso menos, de incu-
bación. En un medio liquido que contenga rojo de fenol como indicador de pH
y un 0.1% de arginina, M. hominis transforma la arginina en amoniaco, provo-
cando un cambio de color en el medio, que pasa de rojo a amarillo. Las placas
de agar U son examinadas diariamente durante cuatro días, y en el cuarto día
1085
se tiñen con una o dos gotas de una solución de CaCI.-urea depositadas direc-
tamente sobre la superficie del medio. Las colonias de U. urealyticum tienen un
diámetro de 15 pm-16 pm y se tiñen de un color marrón oscuro en unos 5 minu-
tos al entrar en contacto con la solución anterior. En caldo U. U. urealyticum pro-
voca un cambio en el pH del medio, haciendo que el color del mismo varíe de
amarillo a rojo. En ese momento debe sembrarse por estria con el asa de pla-
tino una muestra del cultivo en medio líquido en una placa con medio sólido,
para llevar a cabo el aislamiento del microorganismo.
Tratamiento
La terapia antimicrobiana no está recomendada en el caso de faringitis o
traqueobronquitis causada por iVf. pneumoniae. Una tetraciclma o un macró-
lido son antibióticos adecuados para el tratamiento de la neumonía inducida
por M. pneumoniae. aunque la terapia no alecta, aparentemente, a la trans-
misión del microorganismo. Las tetraciclinas son eficaces frente a M. hominis
y la mayor parte de cepas de U. urealyticum. Alrededor de un 10% de urea-
plasmas son, sin embargo, resistentes a la tetraciclina: las infecciones cau-
sadas por cepas resistentes responden bien, por lo general, a la entromicma
(Taylor-Robinson. 1986) o alguno de los nuevos antimicrobianos de los gru-
pos de los macrólidos o las quinolonas.
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 C A P Í T U L O 50

Bacteriología médica

• Barbara S. Reiner, Ph.D.

• Gail L. Woods, M.D.

PROCESADO DE LA MUESTRAS 1088 Bacilos grampositivos

Tinción de Gram Bacterias gramnegativas
Técnicas de cultivo Bacterias anaerobias

BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA 1091

BIBLIOGRAFÍA 1118
Cocos grampositivos

Es posible recuperar una amplia variedad de especies bacterianas a partir te estériles, se puede utilizar una citocentrifuga para concentrar los microorga-
de los diferentes tipos de especímenes clínicos. Para poder valorar correcta- nismos presentes en el espécimen de 10 a 100 veces (Peterson, 1988), Una vez
mente la importancia desde el punto de vista clínico de estos organismos, es realizada la extensión se deja que seque al aire, se fija mediante tratamiento con
esencial tener un perfecto conocimiento de la microbiota bacteriana que exis- etanol. o por medio de calentamiento suave, y se tiñe seguidamente con los
te normalmente en las diferentes localizaciones anatómicas de donde pueden reactivos de la tinción de Gram (cristal vicíela, solución de yodo lugol], alcohol y
proceder las muestras clínicas que van a ser analizadas. En la Tabla 50-1 se safranma). Dependiendo de la estructura de la pared celular característica de
muestra un listado de todos aquellos microorganismos que pueden encon- cada categoría, las bacterias grampositivas resistirán la acción decolorante del
trarse en diversos lugares y superficies del cuerpo humano sano. En algunos metanol y conservarán el color púrpura del cristal violeta, mientras que las gram-
casos, el número de organismos existentes puede ser extremadamente ele- negativas quedarán decoloradas y se teñirán de rojo con la safranina.
6 v
vado: por ejemplo. 10 organismos/cnv en la piel. 10 organismos/ml en las Una vez realizada la tinción, las extensiones se observan con un objetivo
secreciones orales y 10'' organismos'g en el contenido intestinal (colon). En de bajo aumento para detectar estructuras grandes, como larvas de nemato-
consecuencia, es muy importante que la muestra obtenida tenga una conta- dos, espirales de Curschmann. granulos y partículas, microcolonias bacteria-
minación mínima con microorganismos perteneciente a la microbiota normal. nas y células o formas fúngícas. A continuación, se emplea el objetivo de
Este objetivo es difícil de lograr, pero puede conseguirse si se utilizan los pro- inmersión en aceite para determinar el tipo de bacterias presentes. Debido a
cedimientos técnicos apropiados. Dichos procedimientos, junto con las técni- que es necesario que exista una concentración de 10* de microorganismos
cas de procesamiento utilizadas para incrementar la eficiencia en la recupe- por mi en la muestra, para que pueda observarse al menos 1 bacteria por
ración de microorganismos patógenos, se presentan en el Capítulo 57. Este cada campo microscópico cuando se utiliza el objetivo de inmersión (x 1.000),
capítulo comienza con una breve descripción de los métodos de laboratorio el frotis debe examinarse meticulosa y exhaustivamente para poder detectar
utilizados para el procesamiento de la muestra, orientado hacia el cultivo bac- aquellos microorganismos que estén en bajo número en el espécimen.
teriano, seguida de un análisis mucho mas detallado sobre las especies bac- Debe determinarse el tamaño, la forma y el tipo de tinción de Gram de las bac-
terianas consideradas generalmente como patógenas del hombre. terias observadas y dar una desenpción lo más detalada posible de la observa-
ción realizada; por ejemplo, indicar en el informe que se ha deteclado la presen-
cia de cocos grampositivos en parejas, que se parecen a Streptococcus
PROCESADO DE LA MUESTRAS
pneumoniae (Lámina 50-1), resulta de mucha más ayuda que indicar simple-
mente que se han observado cocos grampositivos formando cadenas. Debe
Tinción de Gram indicarse y cuantificarse también la presencia de leucocitos o hematíes, asi
Es difícil encontrar argumentos en contra del hecho de que el examen como cualquier posible bacteria intracelular que pudiera observarse.
directo de un espécimen clínico bajo tinción de Gram representa uno de los
métodos con mayor valor y utilidad entre los empleados en el laboratorio de
Técnicas de cultivo
microbiología. Los resultados de la tinción de Gram proporcionan rápidamen-
te una información valiosa que puede ser utilizada no sólo por el clínico para La selección de los medios de cultivo se realiza teniendo en cuenta que hay
elegir la terapia antimicrobiana apropiada, sino también por el técnico de labo- que proporcionar las condiciones óptimas de crecimiento a los patógenos que
ratorio, para valorar la calidad de la muestra y la profundidad con la que debe pueden encontrarse comúnmente en una determinada localización o en un
abordarse la caracterización de algunos de los microorganismos aislados en espécimen concreto. Hay que prestar una atención especial a los requeri-
cultivo. En general, se concede una mayor atención a aquellos organismos mientos nutricionales de las bacterias asociadas con un determinado proceso
que eslán presentes en número elevado en especímenes que contienen infeccioso, asi como a la necesidad de tener que aislar ciertas bacterias pató-
abundantes células blancas sanguíneas (CBS) que a los que se encuentran genas que se encuentran formando una población mixta con otros microor-
en bajo número en muestras en las que las CBS están ausentes. ganismos de la microbiota autóctona o comensal. Por tanto, puede ser nece-
Para preparar una extensión (frotis) sobre la que realizar la tinción, debe sario incluir medios selectivos y diferenciales junto con los medios de
repartirse una alícuota de la parte más purulenta o sanguinolenta de la muestra enriquecimiento estándar.
sobre la superficie de un portaobjetos limpio, de tal forma que la extensión pre- El agar sangre es un buen medio de cultivo general en el que pueden cre-
sente áreas de diferente espesor. En el caso de fluidos organices originariamen- cer una gran diversidad de bacterias y permite, además, poner de manifiesto
 CAPÍTULO 50 BACTERIOLOGÍA MÉDICA 1089
Tabla 50-1 M i c r o o r g a n i s m o s q u e l o r m a n parte de la microbiota n o r m a l de las p e r s o n a s sanas
Localización a n a t ó m i c a Microorganismos detectados Frecuencia relativa de aislamiento

Piel Staphylococcus aureus ++

Staphylococcus apidermidis ++++
Eslreplococos del grupo vindans +
Especies del género Corynebacterium ++++
Propionibacterium acnes ++++
Malassezia lurlur ++++
Especies del género Candida +
Boca y orolaringe Staphylococcus aureus +
Staphylococcus epidermidis +++
Streptococcus pneumoniae ++
Estreptococos del grupo viridans ++++
Especies del género Enterococcus +
Especies del género Lactobacillus ++
Especies del género Actinomyces +
Especies del genero Peptostreptococcus +
Especies del género Neisseria ++
Haemophilus influenzae +
Especies del género Haemophilus +
Especies del género Bacteroides ii
Especies del género Porphyromonas ++
Especies del género Prevotella ++
Especies del género Fusobacterium' ++++
Especies del género Veilionella ++++
Especies del género Treponema +++
Especies del género Candida ++
Nariz Staphylococcus aureus ++
Staphylococcus epidermidis ++++
Streptococcus pneumoniae +
Estreptococos del grupo viridans ++
Especies del género Neisseria +
Especies del género Haemophilus +
Oido externo Staphylococcus epidermidis ++++
Especies del genera Pseudomonas +
Enterobacteriaceae +
Conjuntiva Staphylococcus aureus +
Staphylococcus epidermidis ++++
Especies del género Haemophilus
Esófago y estómago Bacterias supervivientes del tracto respiratorio superior y de los alimentos
Intestino delgado Especies del género Enterococcus ++
Especies del género Lactobacillus +++
Especies del género Clostridium ++
Enterobacteriaceae ++
Bacteroidaceae +++
Especies del género Mycobacterium ++
Intestino grueso' Staphylococcus aureus +
Staphylococcus epidermidis +
Estreptococos del grupo B +
Estreptococos del grupo viridans ++
Especies del género Enterococcus ++
Especies del género Lactobacillus +++
Especies del género Clostridium ++++
Especies del género Actinomyces +
Especies del género Peptostreptococcus ++++
Especies del género Pseudomonas +
Otros no lermentadores +
Enterobacteriaceae ++++
Bacteroidaceae ++++
Especies del género Treponema +
Especies del género Mycobacterium +
Especies del género Candida +
Vagina Especies del genero Mycoplasma +/-
Ureaplasma urealyticum +/-
Staphylococcus epidermidis +
Estreptococos del grupo B +
Estreptococos del grupo viridans +
Especies del género Enterococcus +
Especies del género Lactobacillus ++++
Especies del género Clostridium ++
Especies del género Actinomyces

(La tabla continua en la pag. siguiente)

 1090 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

c
Tabla 50-1 M i c r o o r g a n i s m o s q u e f o r m a n parte de la microbiota normal de las p e r s o n a s s a n a s (Continuación)
Localización a n a t ó m i c a Microorganismos detectados Frecuencia relativa de aislamiento

Vagina (cont.) Especies del género Bifidobacterium +

Propionibacterium acnes +
Especies del género Peptostreptococcus +
Especies del género Neisseria */-
Especies del género Acinetobactcr +
Enterobactenaceae +
Gardnerella vaginalis +
Bacteroidaceae +
Especies del género Candida ++
Genitales externos y extremo Microbiota cutánea (véase más arriba)
distal de la uretra Especies del género Mycoplasma
Ureaplasma urealyticum +/-
Especies del género Enterococcus +
Especies del género Peptoslreplococcus +
Enterobacteriaceae +/-
Baderoidaceae +
Especies del género Mycobacterium' ++
"Menos prevalento en individuos desdentados.
'El 95% o mas de los microorganismos son anaerobios obligados. Los protozoos pueden estar présenles en personas que viven en paises subdesarroliados
'Muy frecuente on ol esmegma de varones no circuncidados
•+-C+ = casi siempre presente: +++ • usualmente presente +• = presente con Irecuencia: + = présenle ocasionalmente: +/- = presente con muy poca frecuencia.
Adaptada de Tramonl EC General or nonspecilic host delense mechanisms En Mandell GL. Douglas RG Jr Bennett JE (eds) Principles and Praclice ol Inlectious
Diseases 3' ed Nueva York. Churchill Livingstone. 1990. pag 33. con permiso.

la actividad hemolítica de los microorganismos sobre los hematíes presentes
en el mismo. Es posible crear medios selectivos para bacterias grampositivas
como el agar CNA, añadiendo sustancias como colistina y ácido nalidixico. o
el agar PEA. que contiene alcohol feniletílico. en donde el crecimiento de los
bacilos gramnegativos queda inhibido. El calentamiento de la sangre durante
la preparación del medio para obtener agar chocolate y la incorporación de
suplementos vitamínicos conducen a la creación de un medio enriquecido que
contiene hemina (factor X) y NAD (nicotinamida-adenina-dinucleótido; factor
V) disponibles, sustancias cuya presencia es necesaria para poder llevar a
cabo el aislamiento de especies del género Haemophilus y otras bacterias
delicadas. Los bacilos gramnegativos pueden separarse de los grampositivos
utilizando sustancias como la bilis y diversos colorantes que están presentes
en ciertos medios como el agar MacConkey. en el que es posible, además,
distinguir bacterias lermentadoras y no termentadoras de la lactosa en fun-
ción del color de las colonias que forman las mismas en dicho medio. En con-
secuencia, el agar MacConkey tiene carácter selectivo y diferencial. En la

Tabla 50-2 Medios de cultivo r e c o m e n d a d o s para el aislamiento de m i c r o o r g a n i s m o s a partir de diferentes tipos de e s p e c í m e n e s

M e d i o s para bacterias aerobias y Medios para bacterias
Espécimen a n a e r o b i a s facultativas anaerobias*
THIO AS MAC ASC Otros BBA LKV

Fluidos
Cefalorraquídeo X • X
Abdominal X X • • X
Pleural • • • • X
Sinovial • •

Heridas
Hisopo • X
Aspirado X X X
Biopsia de tejido • • X X X
Vías respiratorias
Garganta X" ASS
Esputo X • X
Lavados bronquiales X X X
Vias genitourinarias
Cérvix. vagina X MTM
Otero, fondo de saco X X • X X X
Próstata • i •

Uretra MTM
Orina
Micción (toma limpia) X •

Aspirado suprapUbico • < •:

Heces X X EH GN Campy

'Solo para muestras obtenidas a partir de una fuente apropiada y enviadas al laboratorio en un recipiente para anaerobios
• El caldo tioglicolalo (THIO) está recomendado sólo para el fluido cerebroespinal procedente de una desviación ventncular y el liquido de diálisis pentoneal ambu-
latoria continuada.
++Se puede utilizar agar AS, pero es preferible emplear el agar ASS.
THIO = caldo lioglucolato: AS = agar sangre MAC = agai MacConkey ASC - agar sangre chocolate; HE = agar entérico Hektoen; GN = calcio de enriquecimiento:
BBA = agar Brucella con sangre LKV = agar sangre lacado con vancomicina y canamicma; ASS = agar selectivo para estreptococos: MTM = medio de ThayerMar
tin modificado; Campy = medio selectivo para Campylobacter.
Adaptada de Washington JA II (ed ) Laboralory Proceduies m Clinical Microbiology. 2" ed. Nueva York. Springer-Verlag, 1985. pp 95-123. con permiso.
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA 1091

incubación en su interior que mantienen la temperatura adecuada. Cada uno

Tabla 50-3 Duración d e la incubación d e los cultivos bacterianos
de los diferentes sistemas de incubación para anaerobios tiene sus ventajas e
Tipo de incubación antes de inconvenientes pero, en general, todos tienen una eficacia semejante para el
Tipo de espécimen considerar el cultivo negativo (días)
aislamiento de bacterias anaerobias de interés clínico
Sangre 5-7 Los cultivos bacterianos deben examinarse sistemáticamente tras un perí-
Fluidos 2-4 odo de incubación entre 18 y 24 horas. La excepción a esta norma son los
Abscesos, heridas 2 cultivos en anaerobiosis que se examinan a las 48 horas para permitir que las
Tejidos 2-4'
bacterias anaeróbicas que son de crecimiento más lento produzcan colonias
Vias respiratorias
Garganta 2 que puedan ser detectadas a simple vista. En la Tabla 50-3 se muestran los
Esputo 1 tiempos de incubación recomendados para los diferentes tipos de cultivos. En
Lavado bronquial 2' general, los medios sólidos se incuban durante 48 horas, mientras que para
Vías genitourinarias los medios líquidos la incubación puede prolongarse entre 24 y 48 horas más.
Cérvix, vagina 2
Útero, tondo de saco 2-4' Hay que elaborar un informe preliminar tras examinar por primera vez el
Próstata 2 cultivo, que se va actualizando a medida que se va disponiendo de nueva
Uretra 2 información adicional. Algunos resultados (p. ej., observación positiva de
Orina : microorganismos bajo tinción de Gram en muestras de sangre o líquido cefa-
Material fecal 1-3' lorraquídeo [LCR]. aislamiento de un microorganismo cuya detección implica
Anaerobios 4-7
que hay que tomar medidas efectivas para controlar la infección) son remiti-
Brucella 21-30
Actmomyces 14-21 dos al centro sanitario inmediatamente después de ser obtenidos. Los infor-
mes finales se redactan una vez que se han completado todas las determi-
'Las placas con medios solidos se eliminan después de 48 horas; los tubos
con medios líquidos se conservan durante 4 días naciones analíticas a partir del microorganismo aislado en cultivo.
"Los cultivos iniciales y tos subcultivos en caldo enriquecido se examinan Iras
18 a 24 horas de incubación para detectar colonias lactosa negativas, si estas
no están presentes, los cultivos se consideran negativos para especies de Saí- BACTERIAS DE IMPORTANCIA MEDICA
monella y de Shigella Las placas para el aislamiento de Campylobacter deben
incubarse durante 72 horas.
Cocos grampositivos
Staphylococcus
Tabla 50-2 se muestra una guía para seleccionar los medios de cultivo que
Características. Los estafilococos son bacterias de morfología esférica,
deben utilizarse para el aislamiento de bacterias a partir de diferentes tipos de
catalasa positivas, que en los frotis teñidos aparecen en grupos que semejan
muestras clínicas.
racimos de uvas (Lámina 50-2) Crecen bien en cualquier medio de cultivo
Los cultivos bacterianos se incuban generalmente a 35 C y se inspeccionan
que contenga peptona en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas.
inicialmente tras ser incubados entre 18 y 24 horas. La presencia de una con-
pueden producir hemolisis en agar con sangre de diferentes especies anima-
centración del 5% al 10% de C0 estimula el crecimiento, y puede ser incluso
?
les y formar pigmentos de color amarillo o anaranjado cuando crecen en
esencial para que se produzca el mismo, en el caso de bacterias como Neis-
medios sólidos. El crecimiento de los estafilococos se observa fácilmente en
seria gonorrhoeae. Haemophilus influenzae y S. pneumoniae, por lo que esta
placas de agar sangre o en diferentes tipos de medios nutritivos líquidos. Un
premisa en las condiciones de incubación debe cumplirse siempre que sea
medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus aureus contiene entre
factible. Las excepciones a esta recomendación están representadas por
un 7.5% y un 10% de NaCI y manitol.
aquellos cultivos crecidos en medios diferenciales y selectivos (p. ej.. el agar
XLD [xilosa-lisina-desoxicolato] o agar entérico Hektoen [EH]). en los que el Las pruebas que permiten distinguir los estafilococos de los micrococos (que
hecho que permite distinguir entre distintos tipos de colonias es un cambio en generalmente son considerados como no patógenos) se recogen en la Tabla
el pH, que puede verse afectado por la presencia de C0 . 50-4 (Kloos. 1999). S. aureus se distingue de otras especies del género por su
2

capacidad para producir coagulasa, enzima que es capaz de coagular el plas-

Para la recuperación de bacterias anaerobias, los medios de cultivo deben
ma sanguíneo. Se han identificado dos formas antigénicamente distintas de la
colocarse, una vez inoculados, en un ambiente anaeróbico lo más rápida-
coagulasa producida por la bactena: una de las formas que se encuentra liga-
mente posible. Hay disponibles varios tipos de sistemas para el cultivo de
da a la pared celular, recibe el nombre de factor de agregación y se detecta
anaerobios. Uno de ellos es la jarra de anaerobios, en la que se añade un
mediante la prueba de la coagulasa en portaobjetos, mientras que la otra es la
pequeño volumen de agua en el interior de un sobre que contiene unos com-
forma libre o no ligada y se detecla mediante la prueba de la coagulasa en tubo.
puestos químicos que generan C0 y H al entrar en contacto con el agua. El
2 ?

O. que queda en el interior de la jarra en el momento de ser cerrada es con- Manifestaciones clínicas y patogenia. S. aureus puede encontrarse for-
vertido en agua al combinarse con el H, por la acción catalítica del metal pala- mando parte de la flora autóctona de la piel, ojos, vías respiratorias superiores,
dio que se encuentra recubriendo unas lentejas de aluminio, que se hallan en tracto gastrointestinal, uretra y. con menor frecuencia, vagina En consecuencia,
el interior de un receptáculo adosado a la cara interna de la tapa de la jarra. la infección puede tener un origen endógeno o exógeno. Los factores que jue-
Una modificación de este sistema consiste en una bolsa de plástico transpa- gan un papel importante en el desarrollo de infecciones por S. aureus son las
rente, diseñada para albergar una sola placa de agar nutritivo, que contiene hendas y discontinuidades en la superficie de la piel y mucosas, la presencia de
su propio generador de K, y catalizador de paladio individuales.
Otra posibilidad para el cultivo en condiciones anaeróbicas está represen- Tabla 50-4 P r u e b a s para diferenciar los estafilococos d e los
tada por la cámara de anaerobios, que consiste en una cabina grande de plás- micrococos
tico transparente, cerrada herméticamente, y en cuyo interior se introduce una
Prueba Estafilococos Micrococos
mezcla gaseosa carente de oxígeno, compuesta por nitrógeno, hidrógeno y
dióxido de carbono. Todo el material que ha de ser manipulado (muestras, pla- Crecimiento en anaerobiosis
cas, tubos) se introduce o se extrae de la cámara a través de un cierre de inter- en medio con glucosa +
cambio gaseoso. La atmóslera anaeróbica se mantiene en el interior de la Susceptibilidad a la lisostafina S -
R
cámara gracias al hidrógeno de la mezcla gaseosa y a la acción catalítica de Producción de ácidos en
las partículas de paladio. Todas las manipulaciones en el interior de la cámara aerobiosis a partir de glicerol +
se realizan a través de unos guantes de neopreno que están sellados a la Oxidasa modificada para la
detección de citocromo c +
pared frontal de la cámara o. en el caso de los sistemas "sin guantes'. a tra-
Susceptibilidad a la bacitracina R S
vés de orificios en donde están acopladas unas mangas de material plástico
que se ciñen ajustadamente a los antebrazos. Las cámaras poseen estulas de
 1092 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
7. Otras, p. ej.. abscesos viscerales
imraabdominales: bazo, hígado,
páncreas
Figura 50-1. Secuencia patogénica de la infección por Staphylococcus aureus. (De Cohen JO [ed.]: The Staphylococci. Copyright © 1972. reproducida por John Wiley &
Sons. Inc.)
cuerpos extraños e implantes, una enfermedad vinca previa, haber sido some-
tido con anterioridad a una terapia antimicrobiana y padecer enfermedades
subyacentes con defectos en la inmunidad celular o humoral.
Las infecciones causadas por S. aureus pueden afectar a una gran varie-
dad de órganos y sistemas (Fig. 50-1). Entre las más comunes están aquellas
que afectan a la piel y sus discontinuidades, tales como el impétigo. la folicu-
litis, la mastitis y las infecciones de heridas quirúrgicas S. aureus es una de
las causas principales de bacteriemia en pacientes hospitalizados y puede
provocar endocarditis, particularmente en personas que padecen valvulopatí-
as del lado izquierdo y en consumidores de drogas por vía intravenosa. Esta
bacteria también es la principal responsable de abscesos epidurales y de fle-
bitis supurativa intracraneal, y puede recuperarse a partir de abscesos cere-
brales que aparecen tras un traumatismo. La meningitis causada por S.
aureus es poco frecuente y generalmente aparece como consecuencia de un
traumatismo cefálico o un procedimiento neuroquirúrgico.
S. aureus es responsable de muchos casos de osteomielitis, es la causa
más común de artritis séptica en niños prepúberes y ocasionalmente provoca
artritis séptica en adultos. En las zonas tropicales puede causar abscesos
profundos espontáneos en los músculos que afectan, predominantemente, a
personas desnutridas que padecen una infección parasitaria concomitante
(Chiedozi, 1979). Asimismo, S. aureus es una causa frecuente de neumonía
comunitaria, generalmente asociada a la aspiración de bacterias endógenas
de la nasofaringe. Entre los factores que predisponen se encuentran la infec-
ción por el virus del sarampión o de la influenza A, la fibrosis quistica y un
estado de mmunodeficiencia. Sin embargo, la neumonía por S. aureus en la
población general es poco frecuente. Por último, entre las intecciones en el
tracto urinario causadas por esta bacteria se encuentran la pielonefritis y los
abscesos parenquimatosos y perirrenales.
Diversos factores juegan un papel relevante en la virulencia de S. aureus.
Si está presente, la cápsula tiene propiedades antilagocitanas. Los peptido-
glucanos de la pared celular tienen actividad endotóxica y estimulan la libera-
ción de atocinas por los macrófagos, la activación del complemento y la agre-
gación de las plaquetas. La proteína A. una sustancia inmunológicamenle
activa que se encuentra formando parte de la estructura de la pared celular,
tiene propiedades antilagocitarias que dependen de su capacidad para inter-
accionar con el fragmento Fe de la molécula de las mmunoglobulmas (lg) G.
Otras proteínas de superficie denominadas componentes de la superficie
microbiana son capaces de reconocer ciertas moléculas adhesivas de la matriz
extracelular (MSCRAMM) y pueden jugar un papel importante en la capacidad
de los estafilococos para colonizar los tejidos del hospedador.
S. aureus produce numerosas toxinas. La exotoxma TSST-1 es responsa-
ble del síndrome del shock tóxico y las enterotoxinas (de la A a la E) causan
intoxicaciones alimentarías. Las toxinas exfoliantes, las toxinas epidermoliti-
cas A y B, causan el enrojecimiento y desprendimiento de la piel que se
observan en el denominado síndrome de la piel escaldada. También producen
varias enzimas hidroliticas (proteasa. lipasa y hialuronidasa) que destruyen
los tejidos del hospedador, lo que probablemente facilita la diseminación de la
bacteria y el avance de la infección.
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Las enfermedades directamente relacionadas con la actividad de toxinas pro-
ducidas por S. aureus son el síndrome de la piel escaldada, las intoxicaciones
alimentarias y el síndrome del shock tóxico. El síndrome de la piel escaldada se
da en bebés y en niños muy pequeños infectados por una cepa de S, aureus pro-
ductora de toxinas exfoliativas. La enfermedad comienza de forma brusca con
eritema cutáneo, que en dos o tres días es seguido por la acumulación de líqui-
do por debajo de la piel que provoca su separación, por lo que cualquier fricción
leve puede hacer que se desprendan grandes colgajos o capas de la piel, dejan-
do áreas en carne viva que eventualmente pueden cicatrizar completamente. La
intoxicación alimentana estafilococo que cursa con nauseas, vómitos, retortijo-
nes abdominales y diarrea aparece entre una y seis horas después de haber
ingerido alimentos contaminados con la enterotoxina estafilocócica preformada.
El síndrome del shock tóxico es una enfermedad multisislémica que afecta
a aquellos individuos que no tienen anticuerpos contra la TSST-1 y han sido
colonizados por cepas de S. aureus productoras de la toxina TSST-1 o. mas
raramente, de enterotoxinas B o C. La enfermedad es más frecuente en muje-
res de entre 15 y 25 años que utilizan tampones durante la menstruación,
aunque también puede darse en otras personas, sin que exista asociación
alguna con la regla, como es el caso de mujeres durante el período posparto,
individuos que tienen una herida quirúrgica o algún otro tipo de infección focal,
o personas que han sufrido una intervención quirúrgica en la nariz o senos
nasales. El síndrome del shock tóxico comienza de forma súbita con fiebre,
mialgias, vómitos y diarrea: a estos síntomas les sigue hipotensión, shock
hipovolémico y una erupción cutánea eritematosa que afecta, sobre todo, a
las palmas de las manos y a las plantas de los pies y que termina por produ-
cir una descamación de la piel al cabo de una a dos semanas. El diagnóstico
es clínico, no siendo necesario llevar a cabo el aislamiento de S. aureus para
confirmarlo. Por lo general la persona afectada se recupera totalmente, aun-
que puede experimentar episodios repetidos.
Las infecciones causadas por las especies coagulasa negativas de Staphy-
lococcus tienen lugar como consecuencia de la implantación de válvulas car-
diacas, prótesis articulares y desviaciones ventriculares. S. epidermidis es la
especie que está implicada con mayor frecuencia en este tipo de infecciones.
S. saprophyticus es un importante agente causal de bacteriuria, particular-
mente en mujeres jóvenes sexualmente activas.
Diagnóstico de laboratorio. La observación microscópica de cocos típi-
camente redondeados, grampositivos y que se agrupan formando racimos en
los frotis realizados a partir de muestras tomadas de lesiones cerradas o no
drenadas, o del líquido de un hemocultivo positivo, es indicativa de la exis-
tencia de una infección estafilocócica.
S. aureus produce coagulasa. una enzima que liga el fibrinógeno del plasma
sanguíneo, provoca que las bacterias aglutinen o que el plasma coagule; prácti-
camente ninguna otra especie del género Staphylococcus presenta esta enzima.
Alrededor del 95% de aislamientos de S. aureus se identifican mediante la prue-
ba de la coagulasa en portaobjetos, que detecta la enzima ligada a la pared celu- deben considerarse como resistentes a estos antibióticos, asi como al imipenem.
lar bacteriana (factor de coagulación), y prácticamente todas las cepas se carac-
terizan mediante la prueba en tubo, que detecta la coagulasa extracelular.
La prueba en portaobjetos se lleva a cabo mezclando una emulsión densa
de microorganismos con plasma sanguíneo en la supedicie de un portaobje-
tos de vidrio. La prueba es positiva si se observa aglutinación en un plazo no
superior a 30 segundos. S. lugdenensis y S. schleileri son las otras dos espe-
cies que pueden dar positiva la prueba de la coagulasa con esta técnica.
Para realizar la prueba en tubo, se transfieren varias colonias a un tubo con
plasma que se ncuba a 35 C durante 4 horas, observándose seguidamente
la formación del coágulo. Si éste no se ha formado al cabo del tiempo indica-
do, el tubo se reincuba a temperatura ambiente y se vuelve a examinar tras
un período total de 20 horas. La prueba debe examinarse después de cuatro
horas, ya que la mayor parte de aislados de S. aureus coagulan el plasma en
este intervalo de tiempo y porque algunas cepas producen una actividad fibri-
nohtica que puede disolver el coágulo, pudiendo dar una reacción falsamen-
te negativa si la prueba se lee a las 20 horas solamente. S. intermedius y S.
hytcus también dan positiva la prueba de la coagulasa con el método en tubo,
aunque estas especies son patógenos animales y muy raramente se encuen-
tran presentes en especímenes humanos.
Hay disponibles algunos ensayos comerciales de aglutinación en látex que
petmiten llevar a cabo una identificación rápida de S aureus. Estos ensayos
detectan la existencia de proteina A y del lactor de coagulación, y algunos
1093
también el polisacárido capsular, lo que aumenta la capacidad para detectar
las cepas de S aureus resistentes a meticilma (oxacílina). S. saprophyticus y
S. sciuri son las otras dos especies del genero que pueden dar positiva la
prueba de aglutinación en látex.
Se han identificado muchas especies coagulasa negativas de estafiloco-
cos; sin embargo, con la excepción de S. saprophyticus. que es una especie
resistente a la novobiocina. la identificación de estos aislamientos hasta el
nivel de especie no es de utilidad práctica ni está clínicamente recomendada.
Si es necesario, puede intentarse llevar a cabo dicha identificación utilizando
métodos comerciales que tienen una fiabilidad que oscila entre el 70% y más
del 90%. Alternativamente, los aislados pueden enviarse a un laboratorio de
referencia con capacidad para realizar ensayos bioquímicos estándar. Con
una finalidad epidemiológica, para localizar el origen de una infección o into-
xicación alimentaria, los estafilococos pueden identificarse a nivel de cepa en
base a diferentes parámetros, como la susceptibilidad a diferentes bacle-
riófagos. los perfiles plasmídicos y de ácidos grasos celulares, los patrones elec-
troforéticos de enzimas multilocus o el tipado cromosómico molecular
(electroforesis en campo pulsado y en campo pulsado reverso). Por lo gene-
ral, estas pruebas sólo pueden llevarse a cabo en los laboratorios de referencia.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Casi todos los estafilococos son
resistentes a la penicilina. Dado que esta resistencia es debida a una |i-lac-
lamasa inducibie. cuya síntesis esta codificada por un plásmido. la sensibili-
dad a la penicilina debe confirmarse tras un periodo de inducción en un medio
que contenga un agente |i-lactámico.
La resistencia a las penicilinas resistentes a penicilmasas (meticilina, oxacíli-
na. nafeilina) se detecta en un 70% a 80% de estafilococos coagulasa negativos
y hasta en un 40% de cepas de S. aureus. La resistencia a este grupo de agen-
tes antimicrobianos depende del gen mecA. que codifica la síntesis de una pro-
teína que liga penicilina anormal, la PBP2a. Típicamente, la resistencia es hete-
rogénea, lo que significa que sólo unas pocas células (1 de cada W a 10")
expresan la resistencia. Debido a este hecho, nay que seguir un protocolo espe-
cífico para garantizar la detección: para el método de difusión en placa debe uti-
lizarse un disco impregnado con 1 itg de oxacílina; para el método de microdilu-
cíón debe utilizarse caldo de Mueller-Hinton con cationes y un 2% de NaCI; tanto
las placas de agar como las de microtitulación deben incubarse durante 24 horas
=
a 35 C. Para determinar la resistencia a la oxacílina. se inoculan en vanos pun-
tos con un hisopo de algodón placas de agar Mueller-Hinton que contengan un
4% de NaCI y 6 itg/ml de oxacílina, que se incuban seguidamente durante
24 horas. Se han desarrollado algunos procedimientos para detectar rápidamen-
te la resistencia a la oxacílina Entre éstos se encuentran la ampliación de áci-
dos nucleicos y la hibridación con sondas especificas para el gen mecA. un en-
sayo de aglutinación en látex para la PBP2a y un ensayo de fluorescencia para
las bacterias crecidas en presencia de oxacílina. Aunque los estafilococos resis-
tentes a la oxacílina pueden parecer susceptibles a las cefalosporinas, también
La resistencia a la vancomicina ha sido detectada sólo muy raramente en los
estafilococos. Las pocas cepas resistentes aisladas tenían concentraciones
mínimas inhibitorias (CMI) en el rango intermedio (de 8 ng'ml a 16 iig/ml). Los
Tabla 50-5 Clasificación d e e s t r e p t o c o c o s y enterococos
Hemolisis Grupo de Lancefield Especies
U A S. pyogenes
B S. agalactiae
C S dysagalactiae
subesp equisimilus
D Enterococcus spp
Vanantes de colonias pequeñas Grupo anginosus
de los grupos A. C. F.
G o inclasificables
«oy D Enterococcus spp
D S bovis
Variantes de colonias pequeñas Grupo anginosus
de los grupos A. C. F.
G o inclasificables
Ninguno S pneumoniae
Ninguno Estreptococos v
 1094 SECCIÓN V! • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
organismos con unos valores de CMI elevados para la vancomícina deben
enviarse a un laboratorio de referencia para su confirmación, y los casos con-
firmados deben notificarse al Cenrer lor Disease Control and Prevention (CDC).
Streptococcus y Enterococcus
Características. Los estreptococos son cocos catalasa negativos, grampo-
sitivos. esféricos, ovoideos o lanceolados, dispuestos a menudo formando pare-
jas o cadenas. Son anaerobios facultativos. Algunas cepas necesitan CO;, para
su aislamiento inicial, pero pueden perder este requerimiento al ser subcultiva-
das posteriormente. Los estreptococos pueden ser clasificados en categorías
muy amplias en función del tipo de hemolisis que producen en agar sangre
(Tabla 50-5). Aquellas cepas que lisan totalmente los hematíes alrededor de las
colonias que forman en el medio se denominan |5-hemolíticos, y pueden ser
clasificadas subsiguientemente en algunos de los grupos de Lancefield, aten-
diendo a los componentes (carbohidratos y proteínas) antigénicamente reacti-
vos presentes en su superficie celular. Los miembros más importantes de este
grupo son Streptococcus pyogenes (grupo A) y Streptococcus agalactiae (gru-
po B). Aquellas especies que causan una hemolisis parcial (produciendo un
halo verdoso alrededor de la colonia) reciben la denominación de «-herrtolíti-
cas. Un miembro importante de este grupo es S. pneumoniae. Los estreptoco-
cos que no lisan los hematíes son los y-hemolíticos. Dentro de este grupo la
especie más destacable es S. bovis. Algunas cepas de S. agalactiae también
pueden ser y-hemolíticas. La mayor parte de las especies a- y y-hemolíticas
son denominadas globalmente estreptococos del grupo "vindans", que incluye
S. mutans. S. sanguis, S. mitis. S. salivariusy S. anginosus. El grupo de estrep-
tococos previamente denominados como variantes nutricionales (dependientes
de piridoxal, vitamina B o tiol) ha sido incluido ahora en el género Abiotrophia.
6
Los enterococos, previamente designados como estreptococos del grupo D
debido a que los ácidos teicoicos de su pared celular reaccionaban con anti-
sueros frente a las cepas típicas del grupo D, son lo suficientemente diferen-
tes de los otros miembros del género Streptococcus como para ser incluidos
dentro de un género independiente. Estos microorganismos son cocos gram-
positivos, anaerobios facultativos, que se presentan aislados, en parejas, o
formando cortas cadenas. La mayor parte de enterococos son a- y y-hemoli-
ticos. aunque algunas cepas pueden exhibir |5-hemólisis en agar sangre.
Otros géneros de cocos grampositivos. catalasa negativos, que pueden
aislarse a partir de especímenes clínicos son Leuconostoc. Pediococcus.
Stomatococcus, Aerococcus y Lactococcus spp. Se considera que la virulen-
cia potencial de estos microorganismos es baja y, por lo general, sólo son
patógenos en hospedadores inmunocomprometidos.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Una de las manifestaciones clíni-
cas más comúnmente asociada a los estreptococos del grupo A es la faringitis.
La faringitis puede venir acompañada por la escarlatina, que se manifiesta en for-
ma de un exantema puntiforme sobre un eritema difuso que por lo general apa-
rece ¡nicialmente en el cuello o parte superior del pecho, posteriormente adquie-
re carácter generalizado y finalmente acaba con descamación de la piel. Entre
las infecciones de la piel causadas por los estreptococos del grupo A se incluyen
celulitis, erisipela y pioderma. La fiebre reumática aguda, que se caracteriza por
manifestaciones como carditis, poliartritis, eritema marginado, corea y nodulos
subcutáneos, puede aparecer entre una y cinco semanas después de haber
sufrido una faringitis causada por un estreptococo del grupo A. La glomerulone-
fritis aguda puede desarrollarse entre 10 días y tres semanas después de pade-
cer faringitis o pioderma provocada por estreptococos del grupo A.
A finales de los ochenta comenzaron a detectarse, cada vez con mayor fre-
cuencia, una serie de síndromes clínicos graves causados por estreptococos del
grupo A, entre los que cabe destacar la fascitis necrotizante, la miositis, la escar-
latina maligna, la bacteriemia y el síndrome del shock tóxico. Estos síndromes
han sido asociados con porcentajes de morbilidad y mortalidad del 30% o inclu-
so superiores. Las causas de este incremento no están claramente determina-
das, aunque pudieran estar relacionadas con cambios en la prevalencia de
microorganismos con «potencial de virulencia» incrementado (Kaplan. 1996).
Asociados a las células de S. pyogenes existen una gran cantidad de com-
ponentes estructurales y enzimáticos que actúan como factores de virulencia.
Uno de los más importantes es la proteína M de la pared celular, que tiene acti-
vidad antifagocitaria. Los anticuerpos generados frente a este antígeno confie-
ren inmunidad específica de tipo permanente: sin embargo, debido a que exis-
ten más de 60 tipos antigénicamente diferentes de la proteina M, es posible
sufrir una infección por un estreptococo del grupo A que posea una proteina M
frente a la cual no haya generado anticuerpos específicos el hospedador afec-
tado. Otro componente importante de la pared celular es el ácido lipoteicoi-
co, que actúa como mediador en la adhesión de las bacterias a las células
del epitelio respiratorio. S. pyogenes sintetiza también alrededor de unos 20
productos extracelulares, que incluyen enzimas (estreptolisinas, hialuroni-
dasa, estreptocinasa, desoxirribonucleasas [ADNsasj y nicotinamina-adenío-
dinucleotidasa ¡NADasaj) y toxinas eritrogenéticas. La estreptolisina O es una
enzima oxígeno-lábil con carácter antigénico que produce hemolisis en agar
sangre en la zona subyacente a la superficie del medio de cultivo; la estrepto-
lisina S es una enzima estable frente al oxigeno, no inmunogenia, y que pro-
duce hemolisis en la superficie del agar sangre. Ninguna de las dos estreptoli-
sinas parece tener un papel en la patogenia de las infecciones en el hombre.
La estreptocinasa desarrolla una actividad fibrinolitica transformando el plas-
minógeno en plasmina, mientras que la hialuronidasa puede favorecer la dise-
minación del microorganismo a través del tejido conectivo. El papel de la ADN-
sa y la NADasa en la patogenia es desconocido. Las toxinas pirógenas
(eritrogénicas), de las que se conocen tres serotipos (A,B, y C), son produci-
das por cepas de S. pyogenes que contienen un bacteriófago lisogenizado. Su
carácter pirógeno es debido a su acción directa a nivel del hipotálamo.
La patogenia de la fiebre reumática aguda no está bien comprendida toda-
vía. Ciertos tipos antígénicos de la proteina M pueden tener carácter reuma-
tógeno. La presencia de complejos de inmunoglobulinas y el componente C3
del complemento a lo largo del sarcolema de las miofibrillas cardíacas en indi-
viduos aquejados de miocarditis reumática sugiere que la enfermedad es con-
secuencia de la formación de anticuerpos frente al antígeno M de la pared
celular de los estreptococos, que tienen reactividad cruzada con componen-
tes de los tejidos del corazón. En este contexto, se ha identificado un antige-
no de S. pyogenes que comparte epítopos comunes con la proteina M, aun-
que es antigénicamente distinto de ésta, y que exhibe reactividad cruzada con
moléculas de los tejidos cardíacos (Barnett, 1990). El daño renal en la glo-
merulonefritis aguda está causado por el depósito de inmunocomplejos (for-
mados por antígenos estreptocócicos y anticuerpos del hospedador frente a
los mismos) circulantes en los glomérulos renales y por la subsiguiente acti-
vación del complemento. También pueden estar implicados procesos de
inmunidad celular frente a una membrana basal del glomérulo alterada, así
como la activación del complemento por la via alternativa.
Las infecciones más frecuentes causadas por los estreptococos del grupo B
son la sepsis neonatal, la neumonía y la meningitis. La colonización del tracto
genital materno se asocia con la colonización del recién nacido y el riesgo de
enfermedad neonatal, con infecciones que aparecen tempranamente (en los
días inmediatamente siguientes al parto) y un poco más tardíamente (después
de la primera semana de edad). Con objeto de reducir la incidencia de las infec-
ciones neonatales, el CDC de Atlanta ha publicado una guia específica que per-
mite la identificación precoz y el tratamiento preventivo de mujeres colonizadas
por estreptococos del grupo B, asi como la identificación y tratamiento de neo-
natos con riesgo de desarrollar enfermedad (Schuchat, 1996). Las infecciones
por estreptococos del grupo B en adultos incluyen la endometritis de posparto,
infecciones de las vías urinarias, bacteriemia, infecciones de la piel y tejidos blan-
dos, neumonía, endocarditis, meningitis, artritis y osteomielitis.
Los estreptococos de los grupos C y G son semejantes a S. pyogenes en
el sentido de que pueden causar un amplio abanico de infecciones, incluyen-
do bacteriemia, endocarditis, meningitis, artritis e infecciones de la piel y las
vías respiratorias. La faringitis causada por estos estreptococos es similar a
la que provocan las bacterias del grupo A, excepto por que no acarrea secue-
las no supurativas del tipo de las fiebres reumáticas.
S. pneumoniae causa neumonía, meningitis (especialmente en niños peque-
ños y ancianos), bacteriemia espontánea (en personas que carecen del bazo),
otitis, sinusitis y peritonitis espontánea. Esta bacteria forma parte de la microbio-
ta normal que se encuentra en las vías respiratorias superiores del 25% al 50%
de niños en edad preescolar, y en cerca del 20% de adultos, individuos a los que
se denomina portadores (Hendley, 1975). La diseminación del microorganismo
se ve favorecida por las infecciones del tracto respiratorio superior y por la masi-
ficación en los entornos humanos. La neumonía puede desarrollarse cuando las
defensas inmunitarias del huésped están debilitadas. La mayor parte de los
casos tienen un origen endógeno y son consecuencia de la aspiración de secre-
ciones orales que contienen microbiota normal, incluyendo a S. pneumoniae. La
 1095

Figura 50-2. Esquema para la identificación presuntiva de las especies |i-hemoliticas del género Streptococcus (+ = resultado positivo: - = resultado negativo; S = suscepti-
bilidad; R = resistencia). (Reproducida de Woods GL, Gutiérrez Y: Diagnostic pathology ol infectious diseases. Filadelfia. Lea & Febiger. 1993. con permiso dei editor.)

transmisión de persona a persona durante las epidemias tiene lugar por inhala-
ción de gotitas de humedad en aerosoles. El pnncipal (actor de virulencia en S.
pneumoniae es el carácter fuertemente antifagocitario del polisacando capsular,
por lo que aquellas cepas que poseen una gruesa cápsula mucosa, como es el
caso de las células del tipo 3, son particularmente virulentas. En la actualidad
hay disponibles vacunas diseñadas para ofrecer protección frente a la infección
por neumococos pertenecientes a los grupos predominantes atendiendo al antí-
geno capsular de los mismos. Asimismo, se dispone de una vacuna para ser
administrada en bebés y niños que ofrece protección frente a la enfermedad
invasiva por neumococo.
La endocarditis bacteriana es la infección más común causada por los
estreptococos del grupo viridans; otras patologías incluyen abscesos en el
cerebro o en el hígado, bactenemia y caries dental. La bacteriemia por S. bows
ha sido asociada con procesos tumorales en el tracto gastrointestinal.
Los enterococos no son muy patógenos; sin embargo, estos microorganis-
mos son una causa muy frecuente de infecciones de las vías urinarias en per-
sonas hospitalizadas. También pueden provocar endocarditis, bacteriemia e
infecciones de las heridas.
Diagnóstico de laboratorio. Los estreptococos crecen bien en agar sangre
o agar chocolate, aunque el agar sangre es preferible, ya que permite determi-
nar las caracteristicas hemolíticas del microorganismo. Cuando se siembra a
partir de muestras anorrectales de mujeres embarazadas tomadas con hisopo,
con objeto de aislar específicamente estreptococos del grupo B, las muestras
deben ser inoculadas inicialmente en un medio liquido selectivo, como el caldo
LIM (caldo de enriquecimiento para S. agalactiae basado en el medio de Todd-
Hewitt modificado), para llevar a cabo un enriquecimiento de estos microorga-
nismos (Schuchat, 1996). Las pruebas que deben utilizarse en el laboratono de
microbiología clínica para identificar presuntivamente las especies (3-hemolíticas

Figura 50-3. Esquema para la identificación presuntiva de las especies u-nemoliticas y -/-hemoliticas de los géneros Streptococcus y Enterococcus (+ = resultado positivo;
- = resultado negativo). (Reproducida de Woods GL. Gutiérrez Y Diagnostic pathology of infectious diseases. Filadelfia. Lea & Febiger. 1993. con permiso del editor.)
 1096 SECCIÓN VI MICROBIOLOGÍA MÉDICA

del género Streptococcus se muestran en la Figura 50-2. Más del 99°c de aisla- nias a-hemolilicas, que son mucosas y planas con una depresión central,
mientos de estreptococos del grupo A son susceptibles a la bacitracina. aunque sugieren la presencia de S. pneumoniae, por lo que debe ensayarse la suscepti-
un porcentaje muy pequeño de cepas del grupo B y entre un 10% y un 20% de bilidad de los microorganismos presentes en las mismas al clorhidrato de etilhi-
aislamientos de los grupos C y G también son sensibles a esta sustancia. Por droxicupreína, compuesto al que comunmente se denomina optoquina (disco
tanto, los resultados de la prueba de la susceptibilidad a la bacitracina sólo per- P); S. pneumoniae es sensible a la optoquina, mientras que otros estreptococos
miten llevar a cabo una identificación presuntiva. Un aislamiento puede ser iden- (/-hemolíticos son resistentes Los presuntos aislamientos de S. pneumoniae
tificado tentativamente como un estreptococo del grupo A en base a la prueba de realizados a parlir de localizaciones estériles del cuerpo pueden ser identifica-
la hidrólisis de la t-pirrolidonil-[i-naftilamída (lest PYR: PYRasa) (Wellstood, dos más rápidamente por medio de ensayos de aglutinación en látex que detec-
1987). Todas las cepas del grupo A y más del 99% de aislamientos de Entero- tan el polisacando capsular, o mediante sondas quimioluminiscentes de ADN
coecus dan positiva esta prueba. La identificación de un estreptococo del grupo En el caso de las colonias (/.-hemoliticas que no corresponden a S. pneu-
A se confirma mediante serotipado con un ensayo de aglutinación en látex, o por moniae. asi como de las y-hemoliticas. debe realizarse la prueba de la hidró-
hibridación con sondas de ácidos nucleicos especificas. lisis del L-pirroltdonil-Li-naftilamida (prueba de la PYRasa); los enterococos
Los estreptococos del grupo A pueden detectarse directamente en las mues- son PYRasa positivos mientras que los estreptococos del grupo vindans dan
tras tomadas directamente de la garganta con un hisopo utilizando métodos negativa esta prueba. Además, todos los enterococos pueden crecer en pre-
comerciales diseñados para proporcionar resultados rápidamente. Estos métodos sencia de una concentración del 6,5% de NaCI, mientras que los estreptoco-
son muy específicos, pero dada su baja sensibilidad, que, según diversos estu- cos viridans son incapaces de hacerlo en esas condiciones. Los enterococos
dios, varía entre el 31% y el 95% (Carroll, 1996: Wegner. 1992), un resultado hidrolizan la esculina en presencia de bilis (lo que provoca un ennegreci-
negativo obtenido con los mismos debe ser reconfirmado mediante cultivo. Las miento del medio asociado al crecimiento bacteriano), aunque hasta un 10%
pruebas serológicas encaminadas a detectar anticuerpos frente a la estreptoJisi- de cepas de estreptococos vindans también son esculina positivos Para lle-
na O y la AONsa B en muestras de suero obtenidas durante las fases aguda y de var a cabo la identificación de los enterococos a nivel de especie son nece-
convalecencia se emplean fundamentalmente para diagnosticar fiebres reumáti- sarias pruebas bioquímicas adicionales (Facklam, 1989a). La mayor parte de
cas o glomerulonefritis aguda tras una infección por estreptococos del grupo A. los aislamientos clínicos corresponden a E. laecalis.
Una cepa que sea |5-hemcJitica e hidrolice el hipuralo o dé una reacción posi- Los estreptococos «-hemolíticos resistentes a la optoquina. y que dan
tiva en la prueba del AMP cíclico (cAMP) puede identificarse presuntivamente negativa la prueba de la PYRasa. y los estreptococos PYRasa negativos,
como un estreptococo del grupo B. Un aislamiento con estas características, incapaces de crecer en presencia de un 6.5% de NaCI, se clasifican como
obtenido a partir de una muestra procedente de una localización anatómica habi- estreptococos no hemolíticos (viridans). Dentro del grupo viridans. la identifi-
tualmente estéril, debe identificarse mediante serotipado (utilizando aglutinación cación de las especies individuales se lleva a cabo mediante pruebas bioquí-
en látex o coaglutinación) o con una sonda quimioluminiscente de ADN. Las son- micas convencionales (Coykendall, 1989). También hay disponibles sistemas
das de ADN también pueden ser empleadas para identificar estreptococos del comerciales para la identificación de estos microorganismos.
grupo B crecidos en medio LIM u otros caldos de cultivo selectivos. Los aisla- Es importante llevar a cabo la diferenciación entre los enterococos que han
mientos de estreptococos |t-hemolíticos de los grupos C, D, F y G pueden ser adquirido resistencia a la vancomicina y las especies de los géneros Leuconos-
identificados mediante serotipado con ensayos de aglutinación en látex. toc y Pediococcus intrínsecamente resistentes a este antibiótico. Las carac-
Hay disponibles pruebas de aglutinación en látex para la detección directa terísticas que son de utilidad para cumplir este objetivo se muestran en la
de estreptococos del grupo B (asi como de S. pneumoniae. algunos serotipos de Tabla 50-6 (revisado por Facklam, 1989b).
Neissena meningitidis. Escherichia cotí y Haemophilus influenzae serotjpo b) en Las especies del género Abiotrophia no crecen en ausencia de piridoxal. A
muestras de LCR. suero y orina. Sin embargo, la Food and Drug Administration menudo se identifican inicialmente por el tenómeno del satelitismo, ya que for-
(FDA) ha publicado un informe alertando sobre la posibilidad de obtener resulta- man colonias alrededor de otra de S. aureus. Las características diferencia-
dos tanto lalsos positivos como falsos negativos cuando se utilizan este tipo de les de las especies A. defectiva y A. adiacens han sido descritas por otros
pruebas para detectar la presencia de estreptococos del grupo B en muestras de autores (Ruoff. 1990).
onna (FDA. 1997). Además, los datos de algunos estudios indican que la sensi- Sensibilidad a los antimicrobianos. Los antibiogramas de los estreptoco-
bilidad de estos ensayos en el caso de estreptococos del grupo B, S. pneu- cos de los grupos A, B. C y G son predecibles. ya que todos estos microorga-
moniae. N. meningitidis. E. coliy H. influenzae es menor o igual que la que posee nismos son sensibles a la penicilina: por tanto, los ensayos habituales para
la tinción de Gram, excepto en los casos de meningitis en los que ya ha comen- determinar la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos son mnecesanos sal-
zado a aplicarse el tratamiento con antibióticos. Asimismo, otros estudios han vo que no pueda utilizarse la penicilina en el caso de personas alérgicas a este
mostrado que los resultados de estas pruebas tienen poca influencia en el pro- antibiótico. Debido a que las cepas de S. pneumoniae con un grado medio (CMI
ceso global de atención y cuidado del paciente (Bhisitkul. 1997; Granoff. 1986; 2
entre 0.1 y 1.0 mgl) o elevado (CMI >2 mg/l) de resistencia a la penicilina están
Maxson. 1994; Perkins. 1995). Por estas razones, y porque las pruebas para la diseminadas por todo el mundo, los aislamientos de esta especie deben anali-
detección rápida de antígenos bacterianos son mucho más caras y requieren zarse para determinar su susceptibilidad al antibiótico utilizando el método de
más tiempo y esfuerzo que la tinción de Gram, muchos laboratorios han pres- difusión en medio sólido con discos que contengan 1 pg de oxacilina. Aquellos
cindido de su uso o lo han limitado de forma estricta. aislamientos que no muestren susceptibilidad por este método deben ser reeva-
Las pruebas utilizadas para la identificación presuntiva de los estreptococos luados utilizando la técnica de la macrodilución o de la microdilución en caldo,
«- y y-hemolíticos y los enterococos se muestran en la Figura 50-3. Las colo- utilizando medio de Mueller-Hinlon enriquecido con sangre de caballo lisada. o

CAPÍTUIO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
medíante la prueba E para determinar su CMI para la penicilina. Asimismo, pue-
den aparecer resistencias trente a las cefatosporinas de tercera generación; en
consecuencia, también debe determinarse la susceptibilidad de los aislamientos
frente a estos agentes antimicrobianos.
Los ensayos de susceptibilidad deben realizarse con las cepas de estrep-
tococos no hemoliticos (viridans) aisladas de localizaciones estériles del cuer-
po, debido a que en estos casos puede existir resistencia a la penicilina. Las
especies del género Enterococcus también deben ser analizadas para identi-
ficar, en principio, resistencia elevada a penicilina o ampicilina. estreptomici-
na y gentamicina. y resistencia a la vancomicina (Tenover. 1993).
Bacilos grampositivos
Corynebacterium y Arcanobacterium
Características. Las corinebacterias o bacilos "difteroides". como son a
veces denominados, aparecen en las extensiones teñidas por el método de
Gram como bacilos grampositivos. ligeramente curvados, con los lados no
paralelos y. en ocasiones, con los extremos engrosados, lo que confiere una
apariencia de maza (Lámina 50-3). Estas bacterias son catalasa positivas.
Existen 46 especies dentro del género Corynebacterium. La mayor parte de
las mismas raramente son patógenas para el hombre; las excepciones más
notables son Corynebacterium diphteriae y las especies o variedades estre-
chamente relacionadas con ella, como son C. ulcerans y C. pseudotuberculo-
sis. Las especies de interés clínico dentro del género Arcanobacterium son A
haemolyticum. A. pyogenes y A. bemardiae. Al microscopio bajo tinción de
Gram, estos microorganismos también aparecen como bacilos grampositivos
con forma irregular. Las arcanobactenas se diferencian de las corinebacterias
por que dan negativa la prueba de la catalasa.
Manifestaciones clínicas y patogenia. En el lugar de la infección inicial a
nivel de las amígdalas y la orofaringe. C. diphteriae se multiplica sobre las célu-
las epiteliales y produce una exotoxina que provoca necrosis celular local e
inllamación subsiguiente. Las lesiones exudativas coalescen. formando unas
seudomembranas adherentes de color gris-negruzco. La toxina, que es produci-
da solamente por las cepas de C. diphteriae infectadas por un fago lisogénico
que contiene el gen que codifica para la toxina, es absorbida y pasa al torrente
circulatorio, mediante el que se disemina sistémicamente, produciendo cambios
degenerativos en el corazón, sistema nervioso y ríñones. La molécula de la toxi-
na está formada por dos subunidades: el fragmento A, que contiene el sitio enzi-
máticamente activo, y el fragmento B. en donde se encuentra el dominio que
determina la unión a las células del huésped. La toxina diftérica se une a las célu-
las a través de la subunidad B. sufre un proceso de escisión y el fragmento A
penetra en el intenor de la célula mediante un mecanismo totalmente descono-
cido. Una vez en el citoplasma, la subunidad A bloquea la síntesis proteica, cata-
lizando la inactivación de la actividad translocadora del ARN de transferencia,
impidiendo la interacción de este último con el ARN mensajero y deteniendo la
incorporación de nuevos residuos de aminoácidos a la cadena polipeptidica en
crecimiento. La toxina puede alectar a cualquier célula del organismo, pero las
que resultan dañadas más gravemente son las del corazón, nñón y tejido ner-
vioso. El propio microorganismo y la toxina que sintetiza producen un exudado
seroso y un infiltrado celular en la mucosa de la faringe, lo que conduce a la for-
mación de unas seudomembranas de color grisáceo. Aunque se considera que
producción de toxina y patogenicidad son términos sinónimos, las seudomem-
branas también pueden formarse en personas infectadas por cepas no toxigeni-
cas. La extensión de las seudomembranas por arriba hacia la nasofaringe y por
debajo hacia la laringe puede ser tan masiva como para producir una obstruc-
Tabla 50-7 Características diferenciales d e a l g u n a s e s p e c i e s del g é n e r o C o r y n e b a c t e r i u m y bacterias relacionadas
C. C.
Prueba
diphteriae ulcerans pseudotuberculosis
Catalasa + +
Hemolisis + +
Gelatinasa
V
+ +
Ureasa + +
Reducción de los nitratos
Fermentación de la sacarosa
V
+ = positivo: - = negativo: v = variable.
1097
ción respiratoria. Aunque pueden producirse infecciones de otras partes del
organismo por C. diphteriae. las más frecuentemente observadas en EE.UU.son
las de la piel. La vía de transmisión de C. diphteriae es por inhalación de gotitas
de humedad expulsadas de las vías respiralonas supenores o por contacto con
un loco de infección cutánea.
Debido a que el resto de corinebacterias forman parte de la microbiota normal
presente en la piel y las mucosas, es difícil establecer su papel etiológico. El sig-
nificado clínico de la detección de una de estas bacterias aumenta si el organis-
mo observado en frotis teñidos por el método de Gram aparece acompañado por
leucocitos, si el aislamiento ha tenido lugar a partir de una localización estenl o
si ha sido recuperado a partir de muestras múltiples. Corynebactenum jeikeium
se ha asociado de forma clara con infecciones que aparecen tras el implante de
prótesis (p. ej., válvulas cardíacas. LCR y articulaciones), se ha identificado
como responsable de cuadros de endocarditis bacteriana subaguda y ha estado
implicado en una gran variedad de infecciones oportunistas. Corynebacterium
ureolyticum se ha relacionado con infecciones de las vías urinarias, asi como con
bacteriemia. endocarditis e infecciones de las hendas.
Arcanobacterium haemolyticum ha sido asociado con procesos de laringi-
tis y con infecciones de las heridas y tejidos blandos, mientras que otras espe-
cies como A. pyogenes y A. bemardiae son responsables de la formación de
abscesos.
Diagnóstico de laboratorio. Debido a que la difteria es, en la actualidad,
una enfermedad relativamente rara en EE.UU., el diagnóstico clínico puede ser
pasado por alto y el laboratono de análisis puede errar a la hora de reconocer los
cultivos. Siempre debe proporcionarse al laboratorio un diagnóstico tentativo, de
tal forma que los especímenes sospechosos puedan ser manipulados correcta-
mente. Las connebactenas crecen en agar sangre sin mayor problema; sin
embargo, el agar sangre cistina-telurito (CT) es el medio de cultivo pretendo para
el aislamiento e identificación del microorganismo. En el medio CT, las colonias
que forma C. diphteriae tras 48 horas de incubación son de color gris o negro.
Las colonias pueden ser tanto grandes como pequeñas y planas convexas. Los
medios de Lóffler (con suero coagulado) o de Pai (con huevo coagulado!, que
son más deficientes desde el punto de vista nutnctónal. son apropiados para cul-
tivar microorganismos que exhiban morfologías características al microscopio:
apariencia pleomórfíca, agrupación en empalizada (los bacilos se disponen ado-
sados lateralmente unos con otros) y presencia de granulos metacromáticos.
La clasificación de las corinebacterias, o bacilos difteroides. de la piel y la
boca es difícil y confusa. Las características diferenciales de algunas especies
se muestran en la Tabla 50-7. Existen sistemas comerciales disponibles para
la identificación de este grupo de microorganismos. Los aislamientos sospe-
chosos de ser C. diphtenae deben ser analizados para establecer su capaci-
dad de producir la exotoxina. La síntesis de la misma puede ser detectada in
vitro mediante la prueba de inmunodifusión de Elek, que consiste en sembrar
sobre una tira de papel de filtro impregnada en antitoxina y embebida en la
masa del agar del medio de cultivo una única estría en perpendicular del micro-
organismo que va a ser estudiado, observando al cabo del tiempo de incuba-
ción la aparición de lineas de precipitado que se forman con un ángulo de 45
grados en relación con la lira de papel y la estría del crecimiento microbiano.
Se han descrito muchas modificaciones de este método, todas las cuales han
conducido a la obtención de resultados erróneos, como puede ser la no apari-
ción de lineas de precipitado con cepas genuinamente toxigénicas o la lorma-
ción de bandas de precipitación mespecíficas con microorganismos no pro-
ductores de exotoxina. Varios lactores, como son la concentración del suero
antitoxina, la cantidad de inoculo, el tipo de suero de enriquecimiento utilizado
en el medio y el tiempo de incubación, pueden afectar el resultado de esla
C. C. Arcanobacterium A rcanobacterium
jeikeium haemolyticum pyogenes
+ +
+
- -
v -
v - V V
 1098 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
prueba. Se han descrito métodos alternativos basados en la PCR que pueden
ser de utilidad para detectar el gen que codifica la síntesis de la exotoxina.
Las especies de Arcanobacterium son catalasa negativas y (i-hemolíticas
en agar sangre. Las colonias que se forman después de una incubación de
48 horas son de pequeño tamaño. Las mismas pruebas bioquímicas que se
utilizan para la identificación de las corinebacterias pueden utilizarse también
en el caso de las arcanobacterias. La especie A. haemolyticum produce fos-
folipasa D, enzima que es responsable de una reacción inversa del cAMP
cuando esta bacteria se incuba simultáneamente con otra especie bacteriana,
Staphylococcus aureus, en agar sangre. A. haemolyticum inhibe la hemolisis
alrededor de la estría de crecimiento de S. aureus, produciendo una zona con
lorma triangular en la que no se detecta hemolisis.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el suero antitoxina sigue
siendo el único método específico para el tratamiento de la difteria, también
se administran antibióticos a los pacientes que manifiestan la enfermedad y
los portadores asintomáticos de cepas toxigénicas. C. diphteriae es sensible
a la penicilina, la eritromicina y la clindamicina. Debido a su elevada eficacia
y a que es bien tolerada, la eritromicina es el antibiótico que se utiliza con
mayor frecuencia en este contexto; sin embargo, la penicilina-benzatina tam-
bién puede ser de utilidad en aquellos casos en los que se espera que el
paciente coopere en la pauta de administración del antibiótico.
La sensibilidad a los anlimícrobianos de otras especies de corinebacterias o
bacilos difteroides es bastante menos predecible. Por ejemplo. C. jeikeium es,
usualmente. resistente a las penicilinas y cefalosporinas, sensible pero con
mucha variabilidad a la mayoría de los restantes antibióticos y sensible casi de
manera uniforme a la vancomicina. El tratamiento de las infecciones causadas
por estos microorganismos se ve complicado, a menudo, por unas defensas del
huésped disminuidas y por la presencia de prótesis implantadas. Las arcano-
bacterias son sensibles a (5-lactámicos, rifampicina. tetraciclina y macrólidos.
Prevención. La prevención de la difteria se basa casi exclusivamente en
programas de inmunización activa y pasiva, con administración suplementa-
ria de antibióticos para eliminar el estado de portador de cepas toxigénicas
durante las epidemias.
Listeria
Características. Las especies del género Listeria son bacilos grampositi-
vos, no ramificados y no esponjados. El crecimiento óptimo de L. monocyto-
genes, la única especie del género patógena del hombre, tiene lugar entre 30"C
y 37°C; sin embargo, esta bacteria puede crecer a 4°C. Las colonias que apa-
recen a las 24 horas son pequeñas y muestran una estrecha zona de hemolisis
[i alrededor en agar sangre. A temperatura ambiente este microorganismo exhi-
be una movilidad a saltos característica que raramente se observa a 35°C. Esta
motilidad dependiente de la temperatura también se aprecia en los medios
semisólidos, en los que el crecimiento bacteriano se distribuye en un área cuyo
perímetro semeja a un paraguas en la parte superior del tubo.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Listeria monocytogenes se
encuenlra en el suelo, polvo, agua, pasto, aguas residuales y leche entera sin
pasteurizar. La transmisión del microorganismo a través de alimentos como
las ensaladas de col, cebolla y zanahoria, leche pasteurizada y quesos fres-
cos ha sido la causa de las diversas grandes epidemias que han tenido lugar
en Norte América y Europa (Fleming, 1985; Linnan, 1988). De acuerdo con los
datos emanados del control microbiológico de los alimentos, L. monocytoge-
nes ha sido detectada en el 2% al 3% de productos lácteos, en un 20% de
Tabla 50-8 Características diferenciáis d e Listeria monocytogenes
y Erysipelothrix rhusiopatiae
Prueba L. monocyogenes E. rhusiopathiae
B-hemólisis + -
Crecimiento a 4°C + -
Catalasa + -
Movilidad + Características. Erysipelothrix rhusiopathiae es un bacilo grampositivo,
Hidrólisis de la esculina + -
Utilización del gluconate + tiene una distribución mundial. Las bacterias presentes en las colonias lisas
Voges-Proskauer + son bacilos de pequeño tamaño, rectos o ligeramente curvados, mientras que
Producción de H-.S en agar TSI + en las colonias rugosas los microorganismos son bacilos largos y filamentosos.
quesos tiernos o frescos y de carnes elaboradas, en un 30% de diversos
vegetales (repollos, rábanos) y hasta en un 50% de carne cruda y aves de
corral (Broome. 1993). Entre un 2% y un 20% de animales y personas pue-
den ser portadores transitorios.
Es muy posible que alteraciones en el sistema inmunológico del huésped
determinen el establecimiento de la enfermedad, ya que la mayor parte de indi-
viduos aquejados de listeriosis son inmunodeprímidos. Los macrófagos y los lin-
focitos T representan los principales mecanismos de defensa del hospedado!
frente a la infección por L monocytogenes. La virulencia de este microorganis-
mo está relacionada con la producción de listeriolisina O, una proteína de 52 kDa
que liene actividad hemolítica y citotóxica, que es excretada en condiciones de
pH ácido y baja concentración de hierro, como las que existen en el interior del
fagolisosoma. Se cree que la proteína se une de forma irreversible al colesterol
de la membrana del lisosoma. provocando su rotura y permitiendo la multiplica-
ción bacteriana incontrolada en el citoplasma de la célula fagocítica.
Las manifestaciones clínicas de la listeriosis son diferentes según se trate
de mujeres embarazadas, neonatos y personas inmunodeprimidas, que cons-
tituyen los principales grupos de riesgo. Durante el embarazo, generalmente
en el primer trimestre del mismo, la listeriosis cursa con unos síntomas seme-
jantes a los de la gripe. La bacteriemia concomitante en la mujer afectada es
responsable de la inlección del feto. La infección puede progresar hasta una
amnionitis que provoca un parto prematuro o un aborto séptico en el plazo de
tres a siete días. La infección en la madre es autolimitada porque la fuente de
la misma desaparece con la expulsión del feto infectado y del resto del con-
tenido uterino. La listeriosis neonatal puede tener un comienzo temprano o
tardío. En el primer caso, la enfermedad, que se puede manifestar en el mis-
mo momento del nacimiento o unos pocos días después, es consecuencia de
la infección en el interior del útero. El recién nacido presenta una temperatu-
ra inestable, alteraciones hemodinámícas y problemas respiratorios; también
son característicos de la enfermedad los granulomas, que aparecen amplia-
mente diseminados, afectando sobre todo a la placenta, el tramo posterior de
la faringe y la piel, aunque eventualmenle pueden no estar presentes. La
enfermedad de inicio tardío, que afecta a los niños nacidos a término de
madres con embarazos normales, debe tener su origen en una infección con-
traída posparto, aunque en la mayor parte de los casos la fuente de la misma
es desconocida. En este caso, los síntomas clínicos típicos de una meningi-
tis aparecen tras el nacimiento en un rango de tiempo muy amplio que va des-
de días hasta varias semanas después.
La listeriosis en los adultos aparece generalmente en individuos inmuno-
deprimidos, aunque en la tercera parte de casos no se ha identificado o aso-
ciado un factor de riesgo con la infección. La mitad aproximadamente de
estas infecciones cursan como una meningitis; otras formas de listeriosis que
afectan al SNC son la cerebritis y los abscesos en el troncoencéfalo y el cor-
dón espinal. La bacteriemia primaria o las infecciones focales en localizacio-
nes diferentes al SNC son muy poco frecuentes.
Diagnóstico de laboratorio. Las colonias son pequeñas, de color gris azu-
lado, y rodeadas de una zona o halo estrecho de hemolisis |5 en agar sangre. La
prueba que permite diferenciar a L monocytogenes de los estreptococos del gru-
po B. que pueden formar colonias con una apariencia semejante, es la catalasa,
que es positiva en la primera y negativa en los segundos. L monocytogenes es
móvil a temperatura ambiente y forma ácidos a partir de glucosa, trehalosa y
salicina. Otras características de esta bacteria se indican en la Tabla 50-8.
Sensibilidad a los antimicrobianos. L. monocytogenes es sensible,
usualmente, a la penicilina, ampicilina, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina
y gentamicina. Recientemente, se han identificado plásmidos que confieren
resistencia a cloranfenicol, macrólidos y tetraciclinas en varias cepas de ori-
gen clínico. Para el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria
se ha utilizado con éxito la ampicilina sola o en combinación con un amino-
glucósido. En los pacientes que tienen alergia a la penicilina puede utilizarse
como alternativa terapéutica el Irímetoprim-sulfametoxazol.
Erysipelothrix
catalasa positivo, inmóvil, anaerobio facultativo, que no forma esporas y que
 CAPÍTUIO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Manifestaciones clínicas y patogenia. £ rhusiopathiae se transmite de
los animales al ser humano mediante heridas en la piel causadas por objetos
contaminados o al entrar en contacto con sangre, carne, visceras o heces de
animales infectados. £. rhusiopathiae se encuentra ampliamente distribuido
en la naturaleza en los animales tanto salvajes como domésticos, pájaros,
peces, materia orgánica en descomposición, y causa infección en cerdos,
ovejas, conejos, ganado, pájaros y aves de corral. Entre las personas con
nesgo de contraer infecciones por esta bacteria se encuentran los carniceros,
empleados de mataderos, pescadores y manipuladores de pescado, personal
de granjas avícolas y veterinarios. La forma más común de la enfermedad eri-
sipeloide es una infección cutánea local que cursa con dolor, hinchazón y una
erupción en la piel, consistente en una zona de color violáceo ligeramente ele-
vada y de progresión lenta, que aparece alrededor del punto en donde tuvo
lugar la inoculación del microorganismo. La hinchazón y el eritema migran
periféricamente y la lesión involuciona sin producir descamación de la piel. La
enfermedad sislémica es rara, aunque existen informes sobre casos de sep-
ticemia y endocarditis causadas por E. rhusiopathiae. También son muy poco
frecuentes los casos de artritis y abscesos cerebrales.
Diagnóstico de laboratorio. La biopsia o los aspirados de tejidos de las
lesiones erisipeloides son los mejores tipos de especímenes para el cultivo. Los
microorganismos están localizados profundamente en la capa subcutánea del
borde externo de la lesión; por tanto, el material recogido de la superficie de la
piel con un hisopo no es de utilidad para intentar el aislamiento. E. rhusiopathiae
crece en agar sangre o agar chocolate, pero puede necesitar hasta siete dias
de incubación para desarrollarse. Los medios convencionales para hemocultivo
son adecuados para el aislamiento de la bacteria a partir de sangre.
E. rhusiopathiae es oxidasa y catalasa negativo y produce, típicamente.
H,S en agar TSI (agar triple azúcar-hierro). Es inmóvil, no reduce los nitratos
a nitritos y fermenta la glucosa y la lactosa. Un rasgo muy característico de
esta bacteria es el aspecto de su movilidad en un medio con gelatina, inocu-
lado en picadura e incubado a 22 O que semeja a un «desatascador de tube-
rías». £ rhusiopathiae se distingue fácilmente de las especies del género Lis-
teña (véase Tabla 50-8).
Sensibilidad a los antimicrobianos. £ rhusiopathiae es sensible a las
penicilinas, cefalosporinas, imipenem. eritromicina, clindamicina, cloranfeni-
col. tetraciclinas y fluoroquinolonas. pero resistente a las sulfonamidas, ami-
noglucósidos y vancomicina.
Gardnerella
Características. Gardnerella vaginalls es una bacteria Gram variable y
pleomórfica. ya que puede aparecer en forma de bacilos delgados o coco-
bacilos. Es inmóvil y catalasa negativa. El crecimiento se observa mejor tras
48 horas de incubación en una atmósfera enriquecida con un 5% de CO .
Las colonias son pequeñas y producen hemolisis (} en agar con sangre de
conejo o sangre humana.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Este microorganismo se ha aso-
ciado con la vaginosis bacteriana, aunque probablemente no sea el único
agente etiológico de esta enfermedad. Ha sido aislado a partir de la sangre de
pacientes con fiebre posparto y también puede causar infecciones en los
recién nacidos. G. vaginalls forma parte de la microbiota del recto y el ano en
adultos sanos de ambos sexos, así como en niños, y de la microbiota endó-
gena de la vagina en mujeres en edad fértil.
Diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de la vaginosis bacteriana no
requiere cultivo, sino que se lleva a cabo mediante examen directo de las
secreciones vaginales para detectar la presencia de las células clave, que son
células epiteliales con el borde recubierto de bacterias, la existencia de baci-
los pequeños y cocobacilos gramnegativos, la ausencia de lactobacilos (baci-
los grampositivos delgados), un valor de pH superior a 4,5 y un olor a aminas
(a pescado) que aparece cuando se añade una solución a la secreción de
KOH al 10%. Cuando se observa en cultivo. G. vaginalls puede ser identifica-
do presuntivamente en base a la hemolisis que produce en agar de dos capas
con sangre humana y Tween tras 48 horas de incubación.
Sensibilidad a los antimicrobianos. No existe una recomendación
expresa sobre la realización de pruebas de susceptibilidad de G. vaginalls a
los antimicrobianos. por lo que no existe un protocolo específico para llevar a
cabo este análisis. El metronidazol es la sustancia de elección para el trata-
miento de la vaginosis bacteriana. Las infecciones sistémicas causadas por
1099
este microorganismo pueden tratarse con ampicilina, porque no se ha encon-
trado que tenga capacidad de producir [Mactamasa.
Bacillus
Características. Las especies del género Bacillus son bactenas aerobias
estrictas o anaerobias facultativas, de morfología bacilar, formadoras de esporas,
catalasa positivas y grampositjvas. Con la única excepción de Bacillus anthraos.
todas las especies son móviles por medio de flagelos laterales o pentncos. Algu-
nas cepas se tiñen como gramnegativas y, debido al carácter variable de la prue-
ba de la oxidasa, pueden contundirse con bacilos gramnegativos. La caracterís-
tica diagnóstica más fiable es la capacidad que tienen las especies del género
para formar endosporas, proceso que tiene lugar de manera óptima en condi-
ciones aeróbicas entre 25' C y 30 C en una gran variedad de medios de cultivo.
En las extensiones teñidas por el método de Gram, las esporas aparecen como
zonas o huecos no teñidos en el interior de las células. Las endosporas pueden
teñirse por vanos procedimientos específicos.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Entre las numerosas especies
del género Bacillus. B. anthracls es la única que es fuertemente patógena de
forma consistente. Deben extremarse las precauciones a la hora de manipu-
lar muestras y materiales en los que se sospeche la existencia de este micro-
organismo. Las manipulaciones deben ser realizadas en cabinas de biosegu-
ridad por personal inmunizado y protegido con guantes, ropas apropiadas y
máscaras; las superficies de trabajo deben desinfectarse con hipoclorito o con
fenol (ambos al 5%); al finalizar, todos los materiales y equipos utilizados
deben ser descontaminados.
Existen tres formas clínicas de la enfermedad que produce B anthraos. el
ántrax: cutáneo, pulmonar e intestinal. En su forma cutánea, el ántrax se carac-
tenza por la aparición de una lesión macular rojiza de pequeño tamaño que evo-
luciona hasta formar una vesícula que termina por necrosarse. formando una
escara negra. Junto con estos síntomas, también puede haber linfadenopatia
regional y septicemia. Sin tratamiento, la mortalidad en esta forma de la enfer-
medad está alrededor del 20%. La inhalación de las esporas de B. anihracis pue-
de producir bronconeumonia aguda, mediastinitis y septicemia («enfermedad de
los esquiladores»). La mortalidad en los casos diagnosticados de esta variedad
del ántrax está próxima al 100%. La forma intestinal aparece como consecuen-
cia de la ingestión de alimentos contaminados y cursa con náuseas, vómitos y
diarrea. En algunos casos aparecen hemorragias intestinales, seguidas de pos-
tración, shock y muerte. En las tres formas del ántrax puede haber septicemia,
que puede conducir a una meningitis purulenta de pronóstico fatal
Un factor de virulencia determinante de la capacidad patogénica del micro-
organismo es la presencia de una cápsula formada por un polipéptido neo en
ácido glutámico que inhibe la fagocitosis: los anticuerpos especílicos frente al
antígeno capsular no tienen efecto protector contra la enfermedad. La bacte-
ria produce, además, una compleja toxina formada por tres componentes
(factor edematoso, antígeno protector y factor letal) que es la responsable de
los síntomas del ántrax.
Los seres humanos se infectan al entrar en contacto con animales infectados
o sus cadáveres o al ingerir o inhalar subproductos derivados de los mismos. El
ganado vacuno, ovejas, caballos y cabras son los animales que se infectan más
frecuentemente y constituyen una fuente inmediata de formas vegetativas de la
bacteria que esporulan y perpetúan la contaminación en el ambiente.
Otras especies del género pueden causar también enfermedad, aunque
habitualmente sean formas saprofitas. En este contexto, Bacillus cereus se ha
asociado con infecciones del oído, neumonía, infecciones de heridas oculares
postraumáticas, septicemia y endocarditis. Los pacientes con neumonía y
septicemia están afectados, frecuentemente, por algún proceso de inmuno-
supresión. Esta especie puede ocasionar bacteriemia asociada con el uso de
drogas por vía intravenosa o de dispositivos mtravasculares contaminados.
Existen dos formas de gastroenteritis relacionadas con las especies del
género Bacillus. La intoxicación alimentaria causada por Bacillus puede pro-
ducirse entre una y seis horas después de la ingestión de alimentos contami-
nados con B. cereus que contienen preformada una toxina termoestable que
el microorganismo ha sintetizado in situ. Los síntomas principales de esta
intoxicación alimentaria son náuseas, vómitos, retortijones y, ocasionalmente,
diarrea. Clásicamente, esta forma de gastroenteritis es el resultado de la ela-
boración, en gran cantidad, de alimentos que no necesitan ser recalentados
antes de servirse. La cepa de fi. cereus tipo 1 crece particularmente bien en
 1100 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
arroz írílo y es más resistente al calor que otros tipos, por lo que esta forma
de gastroenteritis se manifiesta con mucha frecuencia asociada al consumo
de arroz frito en los restaurantes chinos. La segunda forma de gastroenteritis
causada por fl. cereus es consecuencia de la contaminación de platos de
carne y vegetales y cursa con retortijones y diarrea que aparecen entre 8 y
16 horas después de la ingestión del alimento contaminado. En este caso los
síntomas están causados por una enterotoxina termolábil.
Diagnóstico de laboratorio. En los casos en los que se sospeche la
existencia de la forma cutánea del ántrax, debe recogerse el líquido de las
vesículas, asi como material del borde de la escara, con un hisopo para rea-
lizar extensiones para la observación al microscopio y para el cultivo. Si hay
sospecha de ántrax pulmonar, hay que obtener muestras de esputo para los
frotis y el cultivo. En el caso de la forma intestinal hay que llevar a cabo un
coprocullivo. En el caso de que pueda tratarse de una meningitis deben rea-
lizarse observaciones microscópicas y cultivos a partir del LCR. En la fase
septicémica deben realizarse hemocultivos.
La detección de bacilos grampositivos grandes y con los bordes rectos
(aspecto denominado boxear) en los frotis realizados a partir de cualquiera de
los especímenes indicados en el párrafo anterior tiene valor diagnóstico. La
microscopía de fluorescencia, disponible en algunos laboratorios de análisis y
en el CDC. permite llevar a cabo un diagnóstico presuntivo rápido.
Las especies de Bacillus crecen bien en agar con sangre de oveja. Las
colonias de 8. anthracis son habitualmente planas, con bordes irregulares
(forma que se denomina "cabeza de Medusa"), blancuzcas con la superficie
áspera (aspecto de cristal esmerilado) y, usualmente. no hemolíticas. Cuando
se tocan con el asa de inoculación, las colonias son pegajosas y se levantan
como la clara de huevo batida. B. cereus y otras especies del género también
forman colonias con forma de cabeza de Medusa. El bacilo del ántrax es
inmóvil, tanto por la prueba de la gota pendiente como en medio semisólido,
mientras que las restantes especies son móviles. La determinación de la
movilidad por la técnica de la gota pendiente es una prueba útil para diferen-
ciar B anthracis de 8. cereus, pero debe hacerse con cultivos jóvenes de
ambos microorganismos. El resto de pruebas bioquímicas y características
adicionales que pueden utilizarse para identificar los aislamientos a nivel de
especie han sido recopiladas por Logan y Turnbull (Logan, 1999).
Las pruebas de virulencia se llevan a cabo inyectando subcutánea o mtrape-
ritonealmente en ratones una suspensión ligeramente turbia de las bacterias,
que se prepara resuspendiendo en solución salina las colonias crecidas en
medio sólido. No debe utilizarse un cultivo en medio líquido para los ensayos de
virulencia debido a los productos toxigénicos que otras especies de Bacillus pue-
den formar en caldo nutritivo. La muerte del ratón tiene lugar entre 24 y 72 horas
después de la inyección, y es posible detectar los microorganismos en frotis
realizados a partir de muestras de sangre del corazón, hígado y bazo.
No es posible llevar a cabo de modo fiable el diagnóstico de la gastroente-
ritis causada por 8. cereus mediante coprocultívo. porque este microorganis-
mo puede formar parte de la microbiota autóctona del intestino. Por tanto, el
diagnóstico depende del cultivo cuantitativo realizado a partir del alimento
sospechoso de estar contaminado. La presencia de un número igual o supe-
5
rior a 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo en el alimento
sospechoso constituye una evidencia presuntiva de contaminación alimenta-
ria por 8. cereus (Logan, 1999).
Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el agente causal es sensi-
ble a varios agentes antimicrobianos. la terapia con antibióticos del ántrax se
centra en el uso de la penicilina sola o en combinación con estreptomicina.
Ambos antibióticos son muy activos frente a 8. anthracis. aunque algunas
cepas producen una |5-lactamasa.
La susceptibilidad de otras especies de Bacillus a las penicilinas y cefalos-
porínas es extremadamente variable. Sin embargo, la mayor parte de espe-
cies son inhibidas por tetraciclinas, aminoglucósidos y cloranlenicol a bajas
concentraciones.
Prevención. La prevención del ántrax en el hombre depende del control
de los animales infectados. La rápida detección de los animales enfermos, su
aislamiento y tratamiento, y la incineración de los cadáveres son procedi-
mientos indicados cuando se detectan brotes epidémicos esporádicos. En las
áreas enzoóticas se utiliza la vacunación con preparados de esporas no
encapsuladas. Aquellas personas que por su profesión puedan tener riesgo
de quedar expuestas también deben inmunizarse.
La enfermedad diarreica aguda producida por 8. cereus se puede prevenir
mediante la cocción correcta y la refrigeración de los alimentos preparados en
grandes cantidades, para prevenir la proliferación de las formas vegetativas
de las bacterias y la formación de la enterotoxina.
Nocardia
Características. En los frotis de muestras clínicas teñidos por el método
de Gram. las especies de Nocardia aparecen como bacilos grampositivos lar-
gos y delgados, formando rosarios de células o ramificados (Lámina 50-4). La
característica más destacable de las nocardias es que son parcialmente áci-
do-alcohol resistentes: las células se tiñen positivamente con una modifica-
ción de la tinción de ácido-alcohol resistencia (Zielh-Neelsen o Kmyoun), lo
que diferencia a estas bacterias de las del género Actinomyces. que pueden
tener una apariencia semejante cuando se observan bajo tinción de Gram. La
ácido-alcohol resistencia parcial puede ser difícil de demostrar y puede visua-
lizarse mejor si se hace crecer al microorganismo en el medio de Middlebro-
ok 7H10 o en leche tornasolada. La mayor parte de las infecciones están cau-
sadas por Nocardia asteroides, seguida por N. brasiliensis y con mucha
menor frecuencia por N. olitidis caviarum.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las nocardias se encuentran en
el suelo y en la materia orgánica, tienen distribución mundial y causan enfer-
medades en animales y peces. La infección en humanos es ligeramente
superior en el hombre que en la mujer. La infección se contrae usualmente por
inhalación del microorganismo, aunque también puede tener lugar por conta-
minación de las heridas con tierra, o cuando las bacterias penetran en el orga-
nismo a través del tubo digestivo cuando un material contaminado entra en
contacto con una zona ulcerada de la mucosa digestiva.
En los pulmones, las nocardias son fagociladas por los macrólagos alveo-
lares, multiplicándose en el interior de los mismos, lo que desencadena una
respuesta inflamatoria mixta (neutrófilos, linfocitos y macrófagos) que even-
tualmente da como resultado la formación de abscesos y. ocasionalmente, de
granulomas. Los estudios realizados in vitro sobre los mecanismos de defen-
sa del hospedador frente a las nocardias sugieren la implicación de los neu-
trófilos, los macrólagos activados y las células T citotóxicas. Aunque los neu-
trófilos son incapaces de destruir las especies virulentas de Nocardia. inhiben
su crecimiento, deteniendo el avance de la infección hasta que los macrófa-
gos están totalmente activados Si la infección no queda limitada al pulmón,
los microorganismos pueden extenderse por crecimiento hasta otros tejidos
adyacentes, produciendo empiema, afectación de la pared costal y senos
drenantes, o diseminarse hemalógenamente formando abscesos, especial-
mente en el cerebro, tejidos subcutáneos y ríñones. El principal factor rela-
cionado con el hospedador, y que implica un riesgo elevado de contraer
nocardiosis. es una disfunción en la inmunidad celular, aunque muchas per-
sonas infectadas por Nocardia spp. no tienen problema reconocido alguno en
su inmunidad celular y humoral (Wilson. 1989)
La enfermedad pulmonar es la manifestación más frecuente de la nocardio-
sis y se caracteriza por una serie de síntomas como fiebre, anorexia, pérdida
de peso, tos, disnea y dolor pleural. La infección en la piel y el tejido subcutá-
neo puede dar lugar a pioderma, celulilis, formación de abscesos (uno o múl-
tiples), una afección linfocutánea semejante a la esporotricosis y aparición
de nodulos. En América Central y del Sur. la infección primaria de la piel con
N. brasiliensis puede producir un actmomicetoma (una masa granulomatosa
indurada y localizada con conductos fistulosos por los que mana pus y los
denominados granulos de 'azufre"), generalmente en las extremidades inferio-
res. La enfermedad diseminada casi siempre está causada por N. asteroides.
en la mayor parte de los casos tiene su origen en el pulmón, y se manifiesta típi-
camente en forma de abscesos múltiples que afectan al sistema nervioso cen-
tral. La piel es la segunda localización más común del cuerpo para la disemi-
nación de las bacterias, seguida por el nñón, el hígado y los ganglios linfáticos
Diagnóstico de laboratorio. Las especies del género Nocardia crecen
aeróbicamente en la mayor parte de medios no selectivos como agar con san-
gre de oveja y agar chocolate, agar Sabouraud-dextrosa sin cloranfenicol o
medio Middlebrook. Estas bacterias también pueden ser cultivadas en el medio
BCYE (medio tamponado que contiene sangre, carbón vegetal, y extracto de
levadura), utilizado para el aislamiento de Legionella spp. Es importante indi-
car que las especies de Nocardia no siempre sobreviven a los procesos de
descontaminación de las muestras que se aplican en los protocolos para el
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
aislamiento de micobacterias. La incubación en una atmósfera que contenga
un 10% de CO¡ favorece el crecimiento de estos microorganismos. Las espe-
cies de Nocardia pueden crecer en 48 horas, aunque normalmente las colonias
tardan en aparecer entre 5 y 20 días, y pueden presentar aspecto cerúleo, una
superficie muy irregular o un aspecto rugoso aterciopelado, generalmente pig-
mentadas con tonalidades que van del amarillo al anaranjado. La observación
de formas filamentosas que se tiñen exclusivamente con un método modifi-
cado de tinción de ácido-alcohol resistencia distingue a las especies de
Nocardia de las micobacterias. Las nocardias se diferencian de la mayor par-
te de los actinomicetos aeróbicos comprobando la resistencia a la lísozima
(las especies de Nocardia son resistentes, mientras que las de los géneros
Streptomyces. Rhodococcus. Gordona y Aclinomadura son sensibles a la
enzima). Las especies de Nocardia se distinguen atendiendo a su capacidad
para hidrolizar caseína, hipoxantina, tirosina y xantina.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Las sulfonamidas son usualmente
los agentes antimícrobianos de elección: sin embargo, la terapia antimicro-
biana óptima depende de la especie de Nocardia presente, del patrón de
resistencia o sensibilidad de la cepa en particular y del tipo de infección. Otros
agentes antimícrobianos de utilidad potencial son el trimetoprim-sulfametoxa-
zol. la amicacina y el imipenem.
Otros actinomicetos aerobios
Otros géneros del grupo de los actinomicetos que incluyen especies de
interés clínico para el hombre son Rhodococcus. Gordona. Tsukamurella.
Actinomadura y Streptomyces. Otro miembro de este grupo, Trophyrema
whippelii. es un microorganismo no cultivable que es el agente causal de la
enfermedad de Whípple.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Los miembros de este grupo de
microorganismos son ubicuos y se encuentran ampliamente distribuidos en la
naturaleza, habiendo sido aislados del suelo, aguas dulces y marinas y mate-
ria orgánica.
Rhodococcus equies la única especie del género Rhodococcus patógena
para el hombre. Es un patógeno oportunista que afecta a individuos con un
grado de inmunodepresión profundo, en los que causa una neumonía granu-
lomatosa de progresión lenta. El microorganismo puede aislarse a partir de la
sangre de los pacientes infectados. La infección se adquiere probablemente
por vía respiratoria, posiblemente como consecuencia de la exposición a ani-
males mlectados. La capacidad del microorganismo para sobrevivir en el inte-
rior de los macrófagos y, en último término, causar su destrucción parece ser
la responsable de su poder patógeno. Las infecciones causadas por las espe-
cies de los géneros Gordona y Tsukamurella son muy poco frecuentes. Las
especies de Tsukamurella son patógenas solamente cuando concurren cier-
tas condiciones clínicas (p. ej.. inmunosupresión, presencia de cuerpos extra-
ños o infecciones crónicas activas, como tuberculosis). Las especies del
noi
género Actinomadura son una causa frecuente de micetomas actinomicóticos.
la mayor parte de los cuales aparecen en países tropicales y subtropicales,
donde caminar descalzo incrementa las posibilidades de exposición a los mi-
croorganismos a través de pequeñas heridas punzantes en la planta de los
pies. Tradicionalmente se ha considerado que las especies del genero Strep-
tomyces tienen una escasa relevancia clínica: sin embargo, una de las espe-
cies, S. somaliensis, ha sido identificada como un agente causal de miceto-
mas actinomicóticos. Las restantes especies del género tienen importancia
médica sólo muy ocasionalmente.
Diagnóstico de laboratorio. Los actinomicetos aeróbicos son de creci-
miento lento y pueden necesitar entre dos y tres semanas de incubación para
formar colonias. Estos microorganismos crecen en la mayor parte de medios
no selectivos utilizados para aislar bacterias, micobacterias y hongos. Las
especies de Rhodococcus crecen como cocobacilos dispuestos en zigzag. En
los medios líquidos se observan formas filamentosas con ramificaciones rudi-
mentarias. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas y presentan pig-
mentos de color marrón claro, coral, anaranjado y rosa intenso, que aparecen
tras varios días de incubación. Las colonias de R. equi son de color rosa o
amarillo pálidos, o coral, y pueden tener una textura viscosa. Las especies del
género Gordona forman colonias lisas y mucosas que se adhieren al medio o
secas y elevadas. Los pigmentos que producen tienen colores que van del
beige al salmón Las especies del género Tsukamurella son levemente acido-
alcohol resistentes cuando se tiñen mediante una modificación del método de
Kinyoun. Aparecen como bacilos largos que se fragmentan en tres trozos y no
forman hitas aéreas. Las colonias son circulares, con los bordes enteros o
rizados. Pueden tener una textura seca o mucosa con pigmentos de color
blanco a anaranjado. Las colonias rugosas aparecen tras siete días de incu-
bación. Las especies del género Actinomadura forman colonias con aparien-
cia cerebriforme, cerúleas, duras, membranosas, con pigmentos de color
blanco, amarillo, rosa o rojo. Las colonias del género Streptomyces son
secas, con una textura que tiene una apariencia de tiza o terrea, con aspecto
amontonado o plegado, con pigmentos de color blanco-grisáceo a amarillo y
con un olor que recuerda al de los sótanos con humedad. Producen una
amplia variedad de pigmentos que dan color tanto a las hilas como al sustra-
to donde crecen éstas. Algunas especies no forman hitas aéreas.
Bacterias gramnegativas
Enterobacteriaceae
Características. Las enterobactenas son bacilos gramnegativos. aerobios o
anaerobios facultativos, no formadores de esporas, inmóviles o móviles por fla-
gelos perítricos, oxidasa negativos, que producen ácidos por vía fermentativa a
partir de la glucosa y reducen los nitratos a nitritos. Los géneros incluidos en este
grupo son los siguientes: Budvicia. Buttiauxella. Cedecea. Qtrobacter. Edwar-

Tabla 50-9 Medios selectivo y diferenciales para enterobacterias

Color de las colonias

A g e n t e bacteriostático Carbohidrato
Medio Indicador Categoría"
para g r a m p o s i t i v o s fermentable
Fermentador No termentador

Eosma-azul de metileno Eosina Y Lactosa' Eosina Y Rojas o negras incoloras S, D

(EMB) Azul de metileno Azul de metileno con brillo
MacConkey Cristal viólela Lactosa Rojo neutro Rojas incoloras S, D
Sales biliares
Xilosa-lisina- Sales biliares Xilosa Rojo lenol Amarillas Rojas S. D
desoxicolato (XLD) Lactosa
Sacarosa
Hektoen entérico (HE) Sales biliares Salicina Azul de Amarillo- Verdes, azul S, D
Lactosa bromotimol anaranjadas verdosas
Sacarosa
Salmonella-shigella (SS) Sales biliares Lactosa Rojo neutro Rojas Incoloras S
Sulfilo de bismuto (BS) Verde brillante Glucosa Sulfito de bismuto # n S
Tiosullato-citrato-saies Sales biliares, Sacarosa Azul Ge timol Amarillas Incoloras S. D
biliares-sacarosa (TCBS)'' pH 8 6 Azul de bromotimol
' D = diferencial, S = selectivo
Fórmula de Levine.
# Las saínemelas que producen H,S forman colonias negras
:
v
Utilizado para el aislamiento de especies del género Vibrio
 1102 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
siella. Enterobacter. Escherichia. Ewingella. Hafnia. Klebsiella, Kluyvera. Lecler-
cla, Leminorella. Moellerella. Morganella. Obesumbactenum, Pragia, Panloea.
Pholorhabdus, Proleus. Providencia. Rahnella. Salmonella. Serralia. Shigella.
Tatumella. Trabulsiella. Xenorhabdus. Yersinia y Yokenella. Solamente unos
pocos de estos géneros serán objeto de análisis en este capítulo.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las bacterias de la familia Ente-
robactenaceae se encuentran presentes en las plantas, el suelo, las aguas y
el intestino del hombre y de los animales. Se han asociado con una gran diver-
sidad de infecciones clínicas que incluyen abscesos, neumonía, meningitis,
septicemia e infecciones de las vías urinarias. Los microorganismos que están
implicados con mayor frecuencia en las infecciones en el hombre son Esche-
richia coii y varias especies incluidas en los géneros Klebsiella, Proteus, Ente-
robacter. Salmonella, Shigella, Serralia. Citrobacter y Providencia. Las espe-
cies E. coli. Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae son las que se
encuentran con una mayor frecuencia en las vías urinarias. K. pneumoniae es
el responsable que con mayor frecuencia se encuentra asociado a las neumo-
nías causadas por bacilos gramnegativos pertenecientes a la familia Entero-
bacteriaceae. Las especies causantes de bacteriemias son E. coli. K pneu-
moniae y P. mirabilis. Los miembros pertenecientes a los géneros que exhiben
una acusada resistencia a los antibióticos, como Citrobacter, Enterobacter y
Serratia, son los responsables más probables de las infecciones nosocomiales
atribuidas a esta familia. Las enterobacterias asociadas con procesos diarrei-
cos son diversas especies incluidas en los géneros Shigella. Salmonella. Yer-
sinia y las cepas enterohemorrágicas, enteropatógenas. enterotoxigénicas.
enteromvasivas y enteroadherentes de la especie E coli. Las especies del
género Shigella se aislan muy raramente de una localización que no sea el
tracto gastrointestinal, mientras que las del género Salmonella se aislan con
mayor frecuencia de otras fuentes como sangre y orina.
Las endoloxinas, que están presentes como componentes estructurales de
la membrana externa de la pared celular de las enterobacterias. asi como en
otros bacilos gramnegativos. son responsables en gran medida de la morbilidad
y mortalidad asociadas a las infecciones causadas por estas bacterias. Las
endotoxinas están formadas por una parte lipidica y otra polisacarídica. con un
componente minoritario de naturaleza proteica. Estos componentes de la célu-
la bacteriana pueden producir fiebre, escalofríos, hipotensión, granulocitosis.
trombocitopenia. coagulación intravascular diseminada y activación del comple-
mento por las dos vías, clásica y alternativa. El shock endotóxico es el resulta-
do de una septicemia por bacterias gramnegativas, donde la endotoxina reac-
ciona con los macrófagos, leucocitos, plaquetas, complemento y otras proteínas
del suero para incrementar los niveles séricos de ciertas proteínas proteoliticas
y de sustancias vasoactivas. con la consiguiente estasis sanguínea, incremen-
to de la vasoconstricción periférica y disminución del gasto cardiaco. Debe que-
dar claro que los efectos letales de las endotoxinas dependen de la activación
y respuesta de los macrófagos. y que la producción de caqueetma por los
macrófagos activados desempeña un papel fundamental en la manifestación
del shock profundo y en las múltiples lesiones orgánicas (Tracny, 1988).
Otros factores patogénicos de las enterobacterias incluyen el antigeno K1.
que está presente en un elevado porcentaje de cepas de E. coli que causan
meningitis neonatal; la cápsula de K. pneumoniae. que. al igual que la de los
neumococos, inhibe la fagocitosis; el antigeno Vi de Salmonella typhi, que pue-
de interferir con los procesos que causan la muerte intracelular de este orga-
nismo: y diversos tipos de antígenos superficiales como las umbrías, que par-
ticipan en la adherencia de los microorganismos a las superficies mucosas.
Los factores determinados por plásmidos parecen desempeñar un papel
importante en las propiedades invasivas de Salmonella. Shigella y las cepas
enteroinvasivas de £ coli. Además, las enlerotoxmas termolábiles (TL) y ter-
moestables (TE) de E. coli están codificadas por plásmidos. Las toxinas TL
estimulan a la enzima adenilato ciclasa en las células de la mucosa del intes-
tino delgado, que, a su vez. activa el cAMP, lo que provoca una salida de líqui-
dos y electrólitos desde las células a la luz intestinal, produciendo diarrea
acuosa. Por el contrario, las toxinas TE parecen activar la guanilato ciclasa.
Diagnóstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos a
partir de muestras contaminadas se facilita en gran medida con el empleo de
medios selectivos y diferenciales (Tabla 50-9). El agar EMB (con eosina y azul
de metileno) y el agar MacConkey pueden ser utilizados de forma indistinta
como medios mínimamente selectivos y diferenciales para la selección y dife-
renciación inicial de los bacilos gramnegativos termentadores y no termenta-
dores de la lactosa. Los medios XLD y HE son medios diferenciales con un
carácter selectivo más acusado, y son especialmente útiles para recuperar
especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras con un elevado grado
de contaminación bacteriana, como son las heces. El agar bismuto-sulfito
(BS) es un medio fuertemente selectivo de gran utilidad para la detección de
salmonelas durante los brotes endémicos o epidémicos de las infecciones
causadas por estas bacterias. Las especies del género Salmonella producen
H;S y se reconocen fácilmente por que las colonias que forman en los medios
XLD, HE y BS presentan el centro de color negro. Los medios de enriqueci-
miento como el caldo selenito F o el caldo GN (para gramnegativos) son reco-
mendables cuando se pretende detectar las especies de los géneros Salmo-
nella o Shigella que están en bajo número en muestras de heces. El agar CIN
(cefsulodina-irgasán-novobiocina) incubado a temperatura ambiente es selec-
tivo y diferencial para la recuperación de Y enterocohtica. Las colonias de
esta bacteria en agar CIN tienen una apariencia que se denomina "en ojo de
toro", con el centro rojo y los bordes transparentes. El agar MacConkey con
sorbitol como azúcar fermentable permite diferenciar la cepa 0157:H7 de E
coli asociada a síndrome hemolítico urémico, porque a diferencia de oirás
cepas de E. coli. ésta es incapaz de fermentar el sorbitol.
Algunas enterobactenas pueden ser identificadas presuntivamente mediante
la determinación de unas pocas pruebas bioquímicas y características de las
colonias que forman. Por ejemplo, las especies de Proteus exhiben una movili-
dad en enjambre cuando crecen en agar sangre, las de Klebsiella forman colo-
nias mucoides voluminosas, las de Serralia pueden sintetizar un pigmento rojo,
las de Salmonella pueden producir H,,S y E. coli es indol positiva. La identifica-
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 50-10 Caraceristicas diferenciales d e las e s p e c i e s d e enterobacterias aisladas m á s f r e c u e n t e m e n t e e n e l laboratorio d e
microbiología clínica (Continuación)
ción deliniliva requiere pruebas bioquímicas adicionales. Se han descrito innu-
merables esquemas de identificación basados en la realización de pruebas bio-
químicas convencionales para la identificación de los miembros de la familia
Enterobacteriaceae. En la Tabla 50-10 se indican las caracleristicas diferencia-
les de las enterobacterias mas comúnmente aisladas en los laboratorios de
microbiología clínica. Hay disponibles diferentes sistemas comerciales para la
identificación de la inmensa mayoría de enterobacterias que ofrecen una gran
sencillez de uso y precisión. En algunos casos, la identificación puede llevarse a
cabo en unas pocas horas y con una elevada fiabilidad mediante estos métodos.
Los sistemas semiautomatizados pueden combinar la realización de las pruebas
de identificación con las de sensibilidad a los antimicrobianos en un único dispo-
sitivo. En general, todos estos sistemas tienen un grado de precisión muy ele-
vado y permiten obtener resultados comparables.
La clasificación de las enterobacterias ha experimentado una profunda revi-
sión en los últimos años como resultado de los estudios realizados con técni-
cas de hibridación de ácidos nucleicos. Debido a que la agrupación fenotipica
basada en pruebas bioquímicas no está siempre de acuerdo con el parentes-
co genético, se ha eliminado la categoría de tribu (p. ej., Klebsielleae, Proteae)
para agrupar a las especies dentro de la familia.
Históncamente, el género Salmonella se ha divido en la siguientes especies:
S. typhi. S. paratyphi A y B, S. choleraesuis. S. typhimurium y S. enleritidis. Debi-
do a que todas estas especies están muy relacionadas genéticamente, actual-
mente sólo se reconocen dos especies, S. entérica y S. bongori. cada una de las
cuales incluye múltiples serotipos. Casi todos los serotipos conocidos están
incluidos en la especie S. entérica (Brenner, 2000). El serotipado se basa en la
reactividad inmunológica de los antígenos somáticos "O" termoestables, que son
fundamentalmente de naturaleza lipopolisacaridica. y los antígenos flagelares
"H", que son termolábiles y de composición proteica. El serotipo typhi de Salmo-
nella también sintetiza un antígeno capsular denominado Vi. que es de naturale-
za polisacarídica y termolábil. En la práctica, la mayor parte de laboratorios clíni-
cos identifican los aislamientos como "especie de Salmonella" basándose en las
pruebas bioquímicas, utilizando seguidamente los sueros específicos de grupo
para asignar el microorganismo aislado a un serogrupo específico. La identifica-
ción a nivel de serotipo sólo se lleva a cabo en los laboratorios de referencia. Los
aislamientos que se componan como Shigella desde el punto de vista bioquími-
co también se clasifican atendiendo a la reactividad inmunológica de sus antige-
nos "O" al igual que las cepas de E coli identificadas como causas potenciales
de diarrea, síndrome hemolitico urémico o púrpura trombocitopenica. Hay dis-
ponibles sistemas comerciales que permiten la identificación de £ co//0157:H7
y la detección de algunos tipos de toxinas en los cultivos o en muestras de
heces; sin embargo, la realización de estas pruebas es llevada a cabo, general-
mente, por los laboratorios de referencia.
Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de las entero-
bacterias a diversos agentes antimicrobianos es muy variable debido tanto a
factores intrínsecos como a mecanismos de resistencia adquiridos. La resis-
tencia intrínseca es el resultado de rasgos genéticos que han aparecido evo-
1103
lutivamente antes de que los antibióticos comenzaran a utilizarse terapéuti-
camente. Un ejemplo de esto es la resistencia a la penicilina observada en
especies de los géneros Citrobacter. Klebsiella. Enterobacter y Serratia. Algu-
nas de ellas son intrínsecamente resistentes también a las cefalosponnas de
primera generación. La resistencia adquirida es el resultado de la exposición
a los agentes antimicrobianos. Ejemplos de la misma son las cefalosporina-
sas de tipo I producidas por Citrobacter treundh y Enterobacter cloacae. que
confieren resistencia a ceftacidima, y las |5-lactamasas de amplio espectro
sintetizadas por K. pneumoniae o £ col!, que son responsables de la resis-
tencia a las cefalosporinas de tercera generación.
Debido a que el patrón de resistencia de las enterobacterias es impredecí-
ble, las pruebas de sensibilidad deben realizarse, como regla general, si se
considera administrar una terapia antimicrobiana. En caso contrario, como
pueden ser las infecciones intestinales sin complicaciones causadas por sal-
monelas, en las que un tratamiento con antibióticos contribuye realmente a
prolongar el estado de portador en el individuo afectado, no es necesario lle-
var a cabo las pruebas de sensibilidad.
Vibrio
Características. Las especies del género Vibrio son bacilos gramnegati-
vos cortos, rectos o curvados, anaerobios facultativos, oxidasa positivos,
generalmente móviles por flagelos polares, capaces de fermentar los carbo-
hidratos y de reducir los nitratos a nitritos. Algunas de las especies tienen
importancia clínica (Tabla 50-11).
Manifestaciones clínicas y patogenia. Entre las especies del género.
Vibrio vulniticus causa la patología más grave. Las infecciones de las heridas
y la septicemia debidas a esta bacteria son. a menudo, mortales. La enfer-
medad está asociada con el consumo de ostras crudas o con heridas produ-
cidas al manipular ostras. En los casos graves casi siempre existe una afec-
ción hepática subyacente. Una función hepática disminuida provoca un
aumento en la concentración de hierro utilizable por el microorganismo, lo que
facilita su crecimiento,
Las cepas 01 de Vibrio cholerae productoras de toxina colérica son respon-
sables de las epidemias de cólera, enfermedad que se caracteriza por una masi-
va pérdida de líquidos a nivel del intestino y que provoca deshidratación en el
paciente. La toxina colérica ejerce su acción uniéndose a la enzima adenilato
ciclasa de las células del epitelio de la mucosa del intestino delgado causando
su activación, lo que trae como consecuencia una hipersecreción de agua y elec-
trólitos (Kaper, 1995). Las cepas no-01 de V. cholerae causan una gastroenteri-
tis autolimitada y no provocan epidemias de la enfermedad. Prácticamente nin-
guna de las cepas no-01 de V. cholerae produce toxina colérica, aunque sí que
sintetizan dos tipos de hemolismas y una enterotoxina termoestable.
Las especies V mimicus y V. parahaemolyticus causan gastroenteritis pri-
mariamente. La patogenicidad en el caso de V. parahaemolyticus parece
estar relacionada más con el carácter invasivo de esta especie que con la pro-
ducción de enterotoxinas. Más del 95% de cepas de V. parahaemolyticus ais-
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
ladas de pacientes con gastroenteritis producen una hemohsina exocelular
que es letal para el ratón cuando se le inyecta en dosis elevadas, lo que se
conoce con el nombre de fenómeno de Kanagawa. Esta bacteria halófila está
ampliamente distribuida en las aguas marinas, contaminando a pescados y
mariscos. Los brotes de diarrea aguda tras la ingestión de pescado crudo han
sido particularmente frecuentes en Japón, pero también se han producido en
EE.UU. y otros países.
Diagnóstico de laboratorio. Aunque antiguamente la preocupación sólo
afectaba a los viajeros de EE.UU. que iban a áreas endémicas, recientemen-
te se han detectado casos de enfermedad causada por V. cholerae en este
pais asociados a la ingestión de mariscos contaminados procedentes de la
costa del golfo de México. Además, se han descrito casos de gastroenteritis
por V. parahaemolyticus y otras especies halófilas del género Vibrio presen-
tes en mariscos contaminados en muchas regiones del país, especialmente
en zonas costeras. Por consiguiente, es importante que los laboratorios clíni-
cos tengan la capacidad para realizar coprocultivos para el aislamiento de
especies de Vibrio cuando esté indicado, en función del historial (viajes reali-
zados, alimentos consumidos) de la persona sobre la que existe la sospecha
de que esté sufriendo infecciones de este tipo.
Con la excepción de V. cholerae y V mimicus, el crecimiento de los vibrios
requiere que los medios de cultivo contengan NaCI. La mayor parte de medios
de cultivo sólidos y líquidos utilizados habitualmente para el cultivo de bacte-
rias contienen sodio suficiente, por lo que no es necesario utilizar medios
especíales en esos casos. Los medios selectivos que contienen sacarosa,
como el agar con tiosulfato, citralo y sales biliares (agar TCBS). son de gran
utilidad para el cultivo de Vibrio spp. a partir de muestras de heces. Algunas
especies (V. cholerae y V. alginolyticus) son capaces de fermentar la sacaro-
sa y forman colonias de color amarillo en ese medio. Puede utilizarse un
medio de enriquecimiento como el agua de peptona alcalina antes de realizar
la inoculación en medio sólido selectivo, con objeto de aumentar las posibili-
dades de recuperación de las especies de Vibrio a partir de muestras de
heces. Los miembros del género pueden diferenciarse entre ellos y de otros
bacilos intestinales gramnegativos según las características bioquímicas que
se muestran en la Tabla 50-11. En el caso de los vibrios halófilos puede ser
necesario utilizar medios que contengan entre un 1% y un 3% de NaCI para
llevar a cabo las pruebas pertinentes. Si se inoculan placas con agar TSI
(agar triple azúcar-hierro) y agar LIA (agar lisina-hierro) con finalidad analíti-
ca, las reacciones observadas deben ser pendiente ácida/fondo ácido sin gas
(A/A) o con formación de H S, y pendiente alcalina/fondo alcalino (K/K), res-
?
pectivamente. No todos los sistemas comerciales existentes para la identifi-
cación de bacterias gramnegativas son seguros para llevar a cabo la identifi-
cación de las especies del género Vibrio, y sólo deben utilizarse cuando se ha
comprobado previamente su Habilidad
Sensibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos pueden realizarse mediante el método de difusión en disco,
utilizando agar Mueller-Hinton. El National Committee tor Clinical Laboratory
Standards (NCCLS) ha establecido los patrones de referencia para interpretar
los resultados de las pruebas de sensibilidad de V. cholerae frente a la ampi-
cilina. la tetraciclina, el trimetoprim-sulfametoxazol. el cloranlenicol y las sullo-
namidas (NCCLS. 2000a). No existen patrones de referencia para las otras
especies del género.
Aeromonas
Características. Las especies de este género son bacterias gramnegati-
vas de morfología bacilar, oxidasa y catalasa positivas, y anaerobias faculta-
tivas. Generalmente son móviles por medio de flagelos polares, aunque algu-
nas especies son inmóviles. Producen ácidos a partir de los carbohidratos,
tanto por via oxidativa como fermentativa, y reducen los nitratos a nitritos.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Aeromonas se
encuentran presentes en hábitats acuáticos principalmente. Se han aislado a
partir del agua potable, agua de ríos, suelo y varios tipos de alimentos, y sólo
raramente de ambientes marinos. Estos microorganismos se han asociado
con infecciones intestinales y extraintestinales. Aunque no existe una eviden-
cia definitiva que demuestre el papel de las Aeromonas en las infecciones
gastrointestinales, la presencia de especies de Aeromonas en muestras de
heces se asocia más con un proceso diarreico que con un estado de portador
asintomático. La diarrea se asocia con la capacidad que tienen algunas cepas
1105
para producir una enterotoxina. También se ha descnto una hemolisina y un
factor citopático.
Las especies de Aeromonas también causan infecciones de heridas trau-
máticas, diarrea o septicemia en pacientes inmunocomprometidos (Janda,
1991.1994).
Diagnóstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos. ter-
mentadores y oxidasa positivos, sugiere fuertemente la posibilidad de que se
trate de una especie de Aeromonas. Estos microorganismos crecen fácilmente
en los medios de cultivo convencionales, lormando colonias que recuerdan a
las que producen las especies del género Pseudomonas. con un color verdoso
semejante al del vidrio triturado y un olor afrulado. La mayor parte de especies
son [i-hemoliticas cuando crecen en agar sangre. El aislamiento de aeromonas
a partir de muestras de heces se facilita si se utiliza agar sangre con ampicilina
o medio CIN (agar cefsulodina-irgasán-novobiocina).
Sensibilidad a los antimicrobíanos. Las Aeromonas son sensibles a las
quinolonas. las cefalosporinas de tercera generación, los aminoglucósidos, el
cloranfenicol y las tetraciclinas, aunque producen una |Wactamasa que es res-
ponsable de la resistencia a las penicilinas y las cefalosponnas de primera
generación. Se ha comprobado que las Aeromonas albergan plásmidos R tan-
to de enterobacterias como de Pseudomonas spp. Los sistemas comerciales
rápidos para las pruebas de sensibilidad pueden no ser liables para este grupo
de bacterias, por lo que se recomienda el método de difusión en disco.
Plesiomonas
Características. Plesiomonas shigelloses, la única especie comprendi-
da dentro del género Plesiomonas. es un bacilo gramnegativo, anaerobio
facultativo, oxidasa y catalasa positivo, que fermenta la glucosa. Las últimas
evidencias obtenidas mediante técnicas de genética molecular indican que el
género Plesiomonas está estrechamente relacionado con el género Proteus
de la familia Enterobacteriaceae.
Manifestaciones clínicas y patogenia. P shigelloses se encuentra en
ambientes acuáticos, con una distribución geográfica limitada por la temperatu-
ra mínima de crecimiento de la bacteria, que es 8 C. El microorganismo puede
aislarse a partir de aguas dulces y de estuario en países tropicales, y provoca
gastroenteritis, a menudo tras la ingestión de mansco crudo. Las heces diarrei-
cas contienen, frecuentemente, leucocitos polimorionucleares y hematíes, aun-
que los individuos infectados también pueden padecer una enfermedad similar
al cólera. La gastroententis puede aparecer en casos esporádicos o en forma de
epidemias. Las formas extraintestinales de la infección por P shigelloides inclu-
yen meningitis, septicemia, celulitis, artritis y endoftalmitis.
Se sabe relativamente poco sobre los factores de virulencia asociados a
esta especie bacteriana. P shigelloides parece tener carácter invasivo, y algu-
nas investigaciones sugieren la existencia de una actividad enterotoxigémca
(Brenden, 1988).
Diagnóstico de laboratorio. P. shigelloides puede aislarse en diversos
medios de cultivo no selectivos y selectivos para enterobacterias, incluyendo el
agar HE. La producción de ácidos a partir de la lactosa tiene carácter variable,
aunque por lo general esta bacteria aparece como no termentadora de la lacto-
sa cuando crece en medios selectivos para bactenas entéricas. Entre otras
caracteristicas bioquímicas se pueden citar las siguientes; es indcJ positiva, redu-
ce los nitratos a nitritos, produce catalasa, da positiva la prueba del rojo de meti-
lo y fermenta la glucosa, la maltosa y la trehalosa (Brenden, 1988).
Sensibilidad a los antimicrobianos. P. shigelloides es sensible a una gran
variedad de antibióticos, incluidos aminoglucósidos, trimetoprim-sulfametoxazol.
cloranfenicol. tetraciclinas y quinolonas. La sensibilidad a las penicilinas es varia-
ble debido a la producción de una |i-lactamasa similar a la de Aeromonas spp
Campylobacter
Características. Los miembros del género Campylobacter son bacterias
gramnegativas de pequeño tamaño (0.5 pm -8 pm de largo por 0.2 iim-0,5 pm
de ancho), curvadas (en forma de coma o de letra S). móviles y no formadoras
de esporas, con un crecimiento óptimo en una atmósfera que contenga entre un
5% y un 10% de oxigeno solamente, razón por la que estas bactenas se consi-
deran microaerófilas. Campylobacter je/uni es la causa más común de enteritis
bacteriana en los EE.UU. Otras especies del género asociadas con esta pato-
logía son C. coli. C. tari y C upsaliensis. C. letus subespecie fetus causa trom-
boflebitis séptica, artritis, peritonitis, abscesos y pericarditis (Penner, 1988),
especialmente en personas con enfermedades crónicas subyacentes.
 1106 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Manifestaciones clínicas y patogenia. C. jejuni se encuentra distribuido
por todo el mundo, formando parte de la microbiota del tubo digestivo de ani-
males salvajes y domésticos (ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, perros,
gatos y aves de corral, como pavos y pollos). Es la causa más común de ente-
ritis bacteriana en EE.UU.. con una incidencia estimada de 1.000 casos por
cada 100.000 individuos. La incidencia de la infección es similar en el Remo
Unido y en otros países desarrollados, mientras que en los países subdesa-
rrollados es incluso más elevada. Las infecciones tienen lugar, generalmente,
durante el verano y el otoño y normalmente son consecuencia de la ingestión
de alimentos mal cocinados, en especial carne de pollo y otras aves de corral.
También se han asociado algunos brotes de enteritis por C. jejuni al consumo
de leche y a fallos en los sistemas municipales de potabilización de aguas. La
infección puede ser desde asintomática hasta muy grave. Las heces diarreicas
pueden indistintamente contener o no sangre y leucocitos. Los síntomas pue-
den durar hasta una semana y generalmente son autolimitados. También pue-
den producirse infecciones extramtestmales como bacteriemia. artritis reactiva,
infecciones de las vías urinarias y meningitis. C. ¡ejuni también está reconoci-
do como la causa antecedente del síndrome de Guillain-Barré. La capacidad
patogénica de esta bacteria no está totalmente esclarecida: parece que pri-
mero coloniza la mucosa intestinal y luego es capaz de atravesar la superficie
epitelial para alcanzar los tejidos subyacentes.
El habitat principal de C. telus subesp. lelus es el intestino de ovejas y
ganado vacuno, aunque también puede encontrarse en el tracto genital de
estos animales, en sus placentas, en el contenido gástrico de los fetos abor-
tados y, con menor frecuencia, en otros animales y en aves. Los mecanismos
de transmisión al hombre no están plenamente caracterizados. El contacto
directo con animales infectados es una posible causa de contagio, aunque
menos de un tercio de individuos infectados tienen un historial de riesgo a la
exposición por razones profesionales o ambientales. Los alimentos y las
aguas contaminadas pueden ser un vehículo para la infección en humanos,
aunque también ésta puede producirse a partir de una fuente endógena.
Diagnóstico de laboratorio. Una única muestra de heces es apropiada,
generalmente, para detectar patógenos intestinales, incluyendo las especies
de Campylobacter. El examen de la muestra en busca de leucocitos fecales
no está recomendado porque sólo aparecen en menos de un 25% de los
casos. Está disponible un enzimoinmunoensayo (EIA) para la detección de
antígenos de C. jejuni y C. coli directamente en las muestras de heces.
Pueden utilizarse diferente medios para el aislamiento selectivo de las espe-
cies de Campylobacter. como agar carbón vegetal-cefoperazona-desoxicolato,
medio selectivo con carbón vegetal, medio semisólido sin sangre (para movili-
dad), medio de Skirrow y agar Campylobacter con un 5% de sangre de oveja y
cinco antimicrobianos (cefalotina, tnmetoprim. vancomicina. polimixina B y anfo-
tericma B). La mayor parte de especies necesitan una atmósfera de incubación
microaerófila (5% de 0 , 10% de CO, y 85% de N,). que puede conseguirse
2
mediante sistemas generadores de gases disponibles comercialmente, La canti-
dad de oxígeno existente en una jarra con vela es demasiado baja para permitir
el crecimiento de Campylobacter spp.. por lo que no debe utilizarse. La incuba-
ción de los medios a 42' C incrementa la selectividad para C. jejuni.
Si se sospecha la presencia de Campylobacter spp. en un hemocultivo
basándose en el historial clínico o en la apariencia del microorganismo obser-
vado bajo tinción de Gram. el caldo debe ser subcultivado en un agar sangre
no selectivo, que se incubará a 37 C en una atmósfera microaerofilica.
En general, las colonias de Campylobacter spp. son de color gris, planas,
irregulares y extensas, que pueden convertirse en redondas, convexas y relu-
cientes a medida que la humedad del medio va disminuyendo. La observación
de la morfología típica bajo tinción de Gram y una prueba positiva de la oxi-
dasa a partir de una colonia crecida en un medio selectivo a 42'C son evi-
dencias suficientes para identificar a un aislamiento como una especie de
Campylobacter. C. jejuni es capaz de hidrolizar el hipurato y es sensible al áci-
do nalidíxico y resistente a la cefalotina. C. coli no hidrolíza el hipurato. Las
cepas de C. fetus subesp. ietus son resistentes al ácido nalidíxico, son inca-
paces de hidrolizar el hipurato y no crecen generalmente a 42°C.
Sensibilidad a los antimicrobianos. C jejuni tiene una sensibilidad
variable a los agentes antimicrobianos. La mayor parte de especies no son
sensibles a las penicilinas y las cefalosporinas. En el caso de infección intes-
tinal, la eritromicina es el antibiótico de elección, con las quinolonas como
opción alternativa, aunque se han detectado resistencias frente a ambos
agentes. No existen hasta el momento métodos estandarizados para llevar a
cabo las pruebas de sensibilidad en este grupo de microorganismos.
Helicobacter
Características. Las especies del género Helicobacter son bacilos gramne-
gativos curvados o en espiral, no esporulados. que miden entre 0,3 um-1.0 iim
de ancho y 1.5 Lim-10 iim de largo. Son móviles por medio de múltiples fla-
gelos localizados en ambos polos de la bacteria o de un único flagelo mono-
polar, microaerofílicas y tienen metabolismo respiratorio.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Helicobaterse
encuentran en el Irado gastrointestinal de los mamíferos y las aves. La trans-
misión entre hospedadores es por vía oral u oro-fecal. Helicobacterpylori está
considerado como una de las especies "gástricas" del género. Esta bacteria
vive dentro de la capa mucosa del estómago adyacente al epitelio o inmedia-
tamente por debajo de la misma. También se encuentra transitoriamente en el
duodeno, en la saliva y en las heces.
La infección por H. pylon puede provocar los síntomas de una gastritis agu-
da. La mayor parte de pacientes infectados desarrollan una gastritis cróni-
ca activa que puede conducir a una dispepsia no ulcerosa o a una úlcera duo-
denal. Esta especie se ha asociado con el 90% de los casos de úlcera
duodenal y con la práctica totalidad de los de úlcera gástrica. La infección
por H. pylori también se ha relacionado con el carcinoma y el lintoma gás-
tricos (Murray, 1993: Parsonnet, 1991,1994). La prevalencia de la gastritis
asociada a la infección por H. pylon aumenta con la edad, lo que sugiere
que el microorganismo se adquiere a medida que la gente envejece,
Las especies "intestinales" del género, tales como Helicobacter (antigua-
mente Campylobacter) cmaedi y H. lenelliae. han sido implicadas en casos de
gastroenteritis. Estos microorganismos invaden raramente el torrente circula-
torio, pudiendo ser aislados entonces mediante hemocultivo.
Diagnóstico de laboratorio. Los métodos no basados en el cultivo bacte-
riano se han utilizado clásicamente para el diagnóstico de las infecciones cau-
sadas por H. pylori. Uno de estos métodos se basa en la detección de urea en
el aliento. Esta técnica no invasiva detecta la actividad uteásica de H. pylori
M l3
midiendo el CO etiquetado con C o C que se desprende en el aire expelido
?
por el paciente al que se le ha administrado previamente urea marcada radiacti-
vamente. Los métodos serológicos también se utilizan ampliamente en los
pacientes sintomáticos para detectar anticuerpos frente a H. pylon. En algunos
casos pueden obtenerse por biopsia muestras de tejido afectado que se exami-
nan histológicamente mediante tinción con hematoxilina y eosina o por la técni-
ca de Gíemsa. para detectar la presencia de bacterias con la morfología típica
de H. pylon. Debido a que el microorganismo hidrolíza la urea muy rápidamente,
una alícuota de la biopsia de tejido gástrico debe incubarse directamente en cal-
do urea o en placas con agar urea, para detectar la hidrólisis de la urea entre 1
y 24 horas después. Desde hace poco tiempo, se encuentra disponible en el
mercado un enzimoinmunoensayo para la detección de antígenos de H. pylon en
heces, que augura ser una alternativa muy prometedora para el diagnóslico no
invasivo de las infecciones causadas por esta bacteria.
Para el cultivo, las muestras de tejidos deben mantenerse a 4 C y ser pro-
cesadas antes de que transcurran dos horas tras su recolección. Como
medios de transporte pueden utilizarse diferentes alternativas, como el caldo
Brucella con un 20% de glicerol, el medio Albemí con cisteína y un 20% de gli-
cerol. solución salina isotómca con un 4% de glucosa y el medio de transpor-
te de Stuart. Las muestras procesadas deben inocularse en alguno de los
medios apropiados, entre los que se encuentran el caldo infusión de cerebro
y corazón, agar Brucella. agar Columbia y medio de Skirrow enriquecido con
sangre o suero de caballo, o con sangre de oveja. Se recomienda que los
medios contengan vancomicina, anfolencina y cefsulodina como agentes
selectivos, Una vez inoculados, los medios deben incubarse en una atmósfe-
ra microaerofilica (5%-10% de CO.„ 80%-90% de N y 5%-10% de 0 ). con
2 ?
humedad elevada, a 35 C. durante 5-7 días. La presencia de H (5%-8%) en
la atmósfera de incubación favorece el crecimiento de H. pylon.
Por lo general, en los medios antenormente mencionados. H. pylori óa lugar
a colonias pequeñas, de color gris y translúcidas, formadas por bacilos espirales
gramnegatívos. cuando se observan en extensiones teñidas por el método de
Gram, y que dan positivas las pruebas de la oxídasa, la catalasa y la ureasa.
Generalmente no se lleva a cabo el aislamiento de las especies intestinales
de Helicobacter a partir de heces. Las diferentes especies del género pueden
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
crecer y delectarse en los sistemas automatizados para hemocultivo que se
emplean en muchos laboratorios, aunque en este caso puede ser necesano
prolongar el período de incubación más allá de los cinco días estándar.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Para el tratamiento de las infec-
ciones causadas por H. pylori se utilizan regímenes de administración combi-
nada de antibióticos, que incluyen, usualmente. dos antibióticos (metronida-
zol. clantromicina, tetraciclina o amoxicilina) y un medicamento antiácido. Se
ha descrito la existencia de cepas que son resistentes al metronidazol y a la
claritromicina. Para realizar las pruebas de sensibilidad, el NCCLS recomien-
da el método de dilución en agar, empleando agar Mueller-Hinton enriqueci-
do con un 5% de sangre de oveja (NCCLS, 2000b).
Pseudomonas
Características. El género Pseudomonas ha experimentado una profun-
da revisión y en la actualidad muchas de las especies que habían sido ini-
cialmenle clasificadas dentro de este género han sido reclasificadas dentro de
los géneros Burkholderia. Slenolrophomonas, Comamonas, Shewanella.
Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas. Acidovorax y Brevundimonas.
Entre las especies que permanecen dentro del género Pseudomonas. P. aeru-
gmosa es la que tiene mayor importancia como patógeno del hombre.
Las pseudomonas son bacilos gramnegativos. aerobios estrictos, catalasa
y oxidasa positivos. Su metabolismo es estrictamente respiratorio (oxidativo),
nunca fermentativo, utilizando el oxígeno como el aceplor final de electrones.
Algunas especies son móviles por medio de flagelos polares.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies del género Pseu-
domonas se encuentran distribuidas en ambientes húmedos. Algunos de los
habitat más inusuales en donde se pueden encontrar estas bacterias incluyen
los productos cosméticos, el agua de las piscinas y jacuzzis. y la parte inte-
rior de la suela de las zapatillas. En este último caso, esta es la fuente a par-
tir de la que pueden infectarse con P. aeruginosa pequeñas heridas punzan-
tes en la planta de los pies. La especie del género responsable de la mayor
morbilidad y mortalidad hoy en día es P. aeruginosa. Aunque otras especies
del género se aislan a menudo a partir de especímenes clínicos, sólo están
implicadas ocasionalmente en infecciones en el hombre.
P. aeruginosa es ubicua en el ambiente hospitalario, encontrándose pre-
sente en casi cualquier lugar en el que haya humedad, incluyendo equipos
médicos, soluciones desinfectantes y jabones. Se encuentra muy raramente
lormando parte de la microbiota normal en las personas sanas, pero en los
individuos hospitalizados la lasa de colonización se incrementa de forma pro-
porcional a la duración del período de hospitalización. P. aeruginosa puede
producir infecciones graves en pacientes con quemaduras, que tienen heridas
traumáticas o quirúrgicas, que han sufrido manipulaciones en sus vías urina-
rias, que tienen enfermedades en los sistemas hematopoyético. reticuloendo-
telial y linfático, y en todos aquellos que tienen problemas en sus defensas
inmunológicas de tipo humoral o celular. Las infecciones pulmonares causadas
por estos microorganismos aparecen primariamente en pacientes con fibrosis
quistica La tasa de mortalidad más elevada se da en individuos con leucope-
nia grave (<1.000 leucocitos neutrófilos polimorfonucleares [PMN] por mnr).
P. aeruginosa sintetiza un polisacárido mucoso, una endotoxina y varias
proteasas que inactivan los componentes del complemento, lo que conlleva
una cierta inhibición de la opsonización y de la respuesta inflamatoria, contri-
buyendo a la invasividad del microorganismo. La exotoxina A causa daño
celular, favorece la invasión de los tejidos y es tóxica para los macrófagos.
Diagnóstico de laboratorio. A menudo es posible sospechar la presen-
cia de P. aeruginosa en los cultivos por el olor a uvas y a humedad (o a torti-
lla de maíz) de los mismos, el aspecto rugoso o de polvo de cristal de sus
colonias y la presencia de pigmentos o de un brillo metálico en las mismas.
Su identificación se puede llevar a cabo fácilmente determinando la prueba de
la oxidasa (P. aeruginosa es oxidasa positiva), una reacción pendiente alcali-
na/fondo neutro en agar TSI, la capacidad para crecer a 42"C y la formación
de brillo metálico y/o de pigmento en la pendiente de los tubos con agar TSI
o agar P para Pseudomonas. Otras características que pueden determinarse
adicionalmente se indican en la Tabla 50-12. Las pruebas de utilización de los
carbohidratos deben realizarse en el medio basal para la delerminación del me-
tabolismo óxido-fermentativo (O-F), que contiene una cantidad mínima de pep-
tona (fuente de nitrógeno) y una concentración relativamente elevada de carbo-
hidrato, y que permite la detección de las cantidades muy pequeñas de ácidos
1107
que producen las bacterias de este grupo. Las reacciones se detectan usual-
mente al cabo de 48 horas, aunque en algunos casos puede ser necesario
prolongar la incubación hasta siete días.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Como regla general, las pruebas
de sensibilidad deben realizarse con todos los aislamientos de P. aeruginosa
con significado clínico. Esto es especialmente importante en el caso de cepas
hospitalarias, que pueden ser resistentes frente a uno o incluso todos los
agentes antimicrobianos que se utilizan para tratar las infecciones Entre
éstos se incluyen los aminoglucósidos, las carboxi- y ureidopenicilinas, la cel-
tacidima o cefepima y las quinolonas.
Burkholderia y Stenotrophomonas
Características. Las pseudomonas fueron inicialmente divididas en cinco
grupos en función de los datos de homología de sus ácidos ribonucleicos
(ARN). Estudios taxonómicos recientes han dado como resultado una recla-
sificación de los microorganismos incluidos en cuatro de esos cinco grupos en
varios géneros nuevos: Burkholderia, Slenolrophomonas. Ralstonia, Brevun-
dimonas. Comamonas y Acidovorax.
Todas estas bacterias son grampositivas, tienen morfología bacilar, no for-
man esporas, son aerobias estrictas y, con la excepción de Burkholderia
mallei. son móviles mediante flagelos polares. Son catalasa positivas y la
mayor parte de especies son también oxidasa positivas. En agar MacConkey
estas bacterias no fermentan la lactosa.
Importancia clínica y patogenia. Estos microorganismos se encuentran
en las aguas, el suelo y las plantas. Debido a su predilección por los ambien-
tes en donde existe humedad, algunos de ellos pueden encontrarse en entor-
nos hospitalarios y tienen la capacidad potencial para producir infecciones
nosocomiales.
Dos especies patógenas de importancia dentro del género Burkholderia
son Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia. B. pseudomallei
infecta por inhalación o a través de heridas o abrasiones en la piel, causando
la enfermedad denominada melioidosis. La infección puede ser asintomática.
hacerse crónica o provocar una sepsis fulminante. La melioidosis tiene una
mayor prevalencia en el sudeste asiático y en Australia, aunque también se
dan casos en otros ambientes tropicales y subtropicales.
Burkholderia cepacia. un patógeno nosocomial que se encuentra en equipos
contaminados, medicinas y desinfectantes, puede causar bacteriemia. infeccio-
nes de las vías urinarias, artritis séptica e infecciones respiratorias. También es
un patógeno importante en los pacientes con fibrosis quistica o con enfermedad
granulomatosa crónica. Los enfermos de fibrosis quistica con infección crónica
por este microorganismo tienen una tasa de supervivencia más baja.
Stenotrophomonas maltophilia es un patógeno nosocomial importante. Los
factores de riesgo que incrementan las posibilidades de colonización o de
infección por este microorganismo son la respiración asistida, la terapia con
antibióticos de amplio espectro, la cateterización y el estado de neutropenia.
Las especies de los géneros Ralstonia. Brevundimonas. Comamonas y Aci-
dovorax se aislan con muy poca frecuencia a partir de las muestras clínicas.
Diagnóstico de laboratorio. Las especies de estos géneros crecen bien
en los medios de cultivo estándar, como agar sangre y agar chocolate. El ais-
lamiento de B. cepacia a partir de especímenes contaminados, como el espu-
to, puede facilitarse utilizando medios selectivos, como agar PC (Pseudomo-
nas cepacia). agar base para metabolismo óxido-fermentativo, con polimixina
B. bacitracina y lactosa (agar OFBL). y agar selectivo para B. cepacia (agar
BCSA) Son necesarias una amplia variedad de pruebas bioquímicas para
poder distinguir cada una de estas especies. Una prueba bioquímica impor-
tante para diferenciar a S. maltophilia es la prueba de la oxidasa, que es
negativa para esta especie.
Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de estos microor-
ganismos a los agentes antimicrobianos varia considerablemente. B. cepacia
es muy resistente a un gran número de antimicrobianos, aunque normalmen-
te es sensible a la piperacilina, azlocilina. cefoperaxona. ceftacidima, cloran-
fenicol y trimetoprim-sulfametoxazol. Las cepas aisladas a partir de pacientes
con fibrosis quistica que han recibido sesiones de tratamiento con antibióticos
repetidas son probablemente resistentes a los antibióticos empleados.
S. maltophilia es intrínsecamente resistente a muchos antibióticos El tri-
metoprim-sulfametoxazol es el antibiótico de elección, aunque las infecciones
graves pueden necesitar un tratamiento combinado con diferentes agentes
Tabla 50-12 Características diferenciales de las p s e u d o m o n a d á c e a s aisladas de muestras clínicas
 CAPITULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
antimicrobianos. No existen métodos estándar para la realización be las prue-
bas de sensibilidad para este microorganismo, por lo que es difícil obtener
resultados precisos y reprodúceles.
Acinetobacíer
Características. Los microorganismos de este género son gramnegativos,
tienen morfología bacilar, a veces casi cocácea, y son inmóviles, oxidasa nega-
tivos y aerobios estrictos. En los frotis teñidos por el método de Gram apare-
cen a menudo dispuestos en parejas y pueden ser difíciles de decolorar.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies del género Acine-
tobacter se encuentran habitualmente en el suelo y en las aguas, y con
mucha menor frecuencia en la piel y mucosas de las personas sanas. Es
escasa la información sobre los factores de virulencia asociados a este grupo
de microorganismos, aunque parecen producir endotoxina en pequeñas can-
tidades. Aunque son usualmente no patógenas, estas bacterias han sido aso-
ciadas, cada vez con una mayor frecuencia, con septicemia, neumonía, bac-
teriuria e infección de las heridas en el entorno hospitalario.
Diagnóstico de laboratorio. Las especies de Acinetobacter pueden distin-
guirse fácilmente de otras bacterias del grupo de las pseudomonas en base a su
inmovilidad, su incapacidad para reducir los nitratos y dar negativa la reacción de
la oxidasa. Puede ser difícil llevar a cabo la diferenciación de las especies que
oxidan la glucosa: estos aislamientos se agrupan dentro del denominado com-
plejo A calcoacelicus-baumannii(Gerner-Smidt, 1991) La mayor parte de aisla-
mientos glucosa-negativos y no hemolíticos corresponden a la especie A. Iwotfi.
mientras que los hemolíticos se identifican como A haemolyticus.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Las especies de este género son
resistentes a la mayor parte de los antibióticos |i-lactámicos y ammoglucósi-
dos existentes. La resistencia a los aminoglucósidos está determinada por
acetil-. adenil- y fosfotransferasas codificadas por plásmidos Las especies de
Acinetobacter son sensibles a doxiciclma. trimetoprim-sulfametoxazol. quino-
lonas, ureidopenicilinas, imipenem, ampicilina-sulbactam y ceftacidima. Las
pruebas de sensibilidad deben llevarse a cabo con todos los aislamientos que
tengan interés clínico.
Actinobacillus
Características. Actinobacillus actinomycetemcomitans es una bacteria
gramnegativa, no formadora de esporas y con morfología cocobacilar (bacilos
cortos). Crece tanto en condiciones aerobias como anaerobias. La presencia
de C0 (entre un 5% y un 10%) en la atmósfera de incubación favorece su
?
crecimiento. Las colonias aparecen lentamente en agar sangre y son de
pequeño tamaño.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Estas bacterias se encuentran
en la mucosa de las vías respiratorias y del tracto genitourinario de los ani-
males y el hombre. Generalmente sólo causan infecciones en individuos
inmunodeprimidos o cuando penetran accidentalmente en un tejido sano a
través de una herida traumática. A. actinomycetemcomitans tiene un bajo
poder patógeno. Su nombre deriva del hecho de que se encuentra frecuente-
1109
mente asociada con las lesiones actinomicóticas. Sin embargo, en los últimos
años esta bacteria ha sido identificada, cada vez con mayor frecuencia, como
agente causal de endocarditis bacteriana subaguda. periodontitis y abscesos
cerebrales, habiéndose caracterizado dos factores de virulencia en la misma:
una leucotoxina y una colagenasa.
Diagnóstico de laboratorio. A. actinomycetemcomitans crece bien en
agar sangre y agar chocolate. Después de 24 a 72 horas de incubación, las
colonias tienen entre 1 mm y 3 mm de diámetro con el centro arrugado. El
microorganismo es catalasa, oxidasa y ureasa positivo. Deben realizarse
pruebas bioquímicas adicionales para diferenciarlo de otros bacilos gramne-
gativos delicados, de crecimiento lento (véase Tabla 50-13).
Sensibilidad a los antimicrobianos. Este microorganismo es resisten-
te a la penicilina, pero habitualmente es sensible a otros muchos antibióticos
como cefalosporinas, combinaciones de un [5-lactámico con un inhibidor de |i-
lactamasas, fluoroquinolonas y tetracichnas.
Eikenella
Características. Clasificados antiguamente como Bacteroides corrodens.
los "bacilos corrosivos" anaerobios facultativos se han integrado en la especie
Eikenella corrodens. que comprende microorganismos gramnegativos de morfo-
logía bacilar, oxidasa positivos, catalasa negativos, no fermentadores, cuyas
colonias pueden corroer el agar o hacer agujeros en el mismo. Su crecimiento
se ve favorecido por la presencia de CO¿ (5%-10%) en la atmósfera de incuba-
ción y generalmente requiere la presencia de factor X en el medio de cultivo.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Poco se sabe acerca de los facto-
res que contnbuyen a la virulencia del microorganismo, que tiene un bajo nivel
de patogenicidad en los animales. E. corrodens se encuentra principalmente en
la cavidad oral y se aisla con frecuencia de las vías respiratorias superiores.
También se ha recuperado a partir de abscesos y otros tipos de infecciones en
casi cualquier localización del cuerpo, puede invadir el torrente circulatorio y cau-
sar endocarditis. Los procesos infecciosos en los que está involucrado este
microorganismo son generalmente mixtos (en combinación con otras bacterias).
Diagnóstico de laboratorio. E. corrodens crece en agar sangre o chocola-
te, pero no en MacConkey. La característica más llamativa de los cultivos de esta
bacteria son las excavaciones que aparecen en el agar como consecuencia del
crecimiento de la misma, aunque la capacidad de lormar agujeros no es expre-
sada por todas las cepas. Las colonias tardan en aparecer (entre dos y cuatro
días) y por lo general son de pequeño tamaño (entre 0,5 mm y 1,0 mm de diá-
metro). Usualmente deben distinguirse de las que lorman otros bacilos gramne-
gativos delicados y de crecimiento lento (véase Tabla 50-13).
Sensibilidad a los antimicrobianos. E corrodens es sensible a las
penicilinas, quinolonas y tetraciclinas. tiene una sensibilidad variable frente
los aminoglucósidos y es resistente a la clindamicina y el metronidazol.
Legionella
Características. Las especies del género Legionella son bacterias gram-
negahvas de morfología bacilar, delgadas, no formadoras de esporas, que se
 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
mo
tiñen débilmente. Estas bacterias fueron identificadas por primera vez como
agentes causales de infecciones en el hombre durante una epidemia de neu-
monía que afectó a los miembros de la Legión Americana de Pennsylvania,
reunidos en 1976 en Filadelfia para celebrar el bicentenario de la asociación.
En la actualidad, el género incluye más de 20 especies y un cierto número de
especies a las que todavía no se ha asignado nombre. La mayoría de casos
clínicos se deben a la especie Legionella pneumophila, serogrupo 1.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Legionella se
encuentran en los entornos en los que existen niveles altos de humedad. La
capacidad de estos microorganismos para multiplicarse en el interior de pro-
tozoos es, muy probablemente, un factor muy importante para garantizar la
supervivencia de los mismas en el medio ambiente. La transmisión al ser
humano tiene lugar a través de la exposición a aguas contaminadas de orí-
genes diferentes (p. ej.. las que fluyen de grifos, duchas y fuentes públicas).
No se cree que exista transmisión de persona a persona o que la infección se
pueda adquirir durante las manipulaciones de laboratorio.
Las infecciones pueden ser subclínicas, no neumónicas, neumónicas o
extrapulmonares. Usualmente, la infección se manifiesta en forma de una
neumonía aguda fibrinopurulenta, con distribución lobular. Histológicamente,
se aprecia un infiltrado alveolar de neutrófilos y macrófagos acompañado por
fibrina y extravasación de hematíes. Las legionelas pueden encontrarse en el
interior de los macrófagos alveolares. L. pneumophila ha sido aislada también
mediante hemocultivo.
Diagnóstico de laboratorio. Las legionelas pueden aislarse en agar
BCYE enriquecido con factores de crecimiento, entre los que se encuentran
la L-cisteína, una sal férrica y el <y.-cetoglutarato. Este medio puede hacerse
selectivo para el aislamiento de los microorganismos a partir de muestras pro-
cedentes de localizaciones no estériles del cuerpo, añadiendo una mezcla de
cefamandol, polimixina B y anisomicina, o de polimixina B, anisomicina y van-
comicina (Edelstein, 1987). El agar chocolate también permite el crecimiento
de las legionelas. El tratamiento del esputo con una solución débilmente aci-
da (0.2 M HCI/KCI; pH 2,2) durante 4 minutos, o mediante calentamiento a
60'C durante 2 minutos, contribuye a reducir el número de otras bacterias
presentes en la muestra, aunque también puede provocar un descenso en el
número de legionelas.
Los medios inoculados deben incubarse durante cinco días en una atmós-
fera húmeda que contenga entre un 2% y un 5% de CCy Las colonias son
habilualmente iridiscentes y tienen una consistencia pegajosa. Aquellos aisla-
mientos que tengan la morfología típica al ser observados bajo tinción de
Gram deben ser subcultivados en agar sangre, donde no debe observarse
crecimiento alguno. Estas bacterias dan positivas las pruebas de la catalasa
y de la oxidasa, aunque en este último caso la reacción es débil, son gelati-
nasa positivas y, a menudo, móviles. La identificación de estos microorganis-
mos puede llevarse a cabo con gran precisión mediante pruebas serológicas.
utilizando anticuerpos específicos de tipo.
Las legionelas pueden detectarse o identificarse mediante inmunofluores-
cencia directa (DFA) en las muestras o a parlir de las colonias aparecidas en
los medios de cultivo. La sensibilidad del examen mediante DFA oscila entre
el 25% y el 75%, pero es considerablemente superior cuando se lleva a cabo
sobre muestras de tejido pulmonar obtenidas mediante biopsia. Se ha detec-
tado reactividad cruzada entre L. pneumophila y otras especies de Legione-
lla, así como con algunas cepas de Bordetella pertussis. Pseudomonas lluo-
rescens y Bacteroides tragilis. No se conocen los valores de sensibilidad de
la técnica DFA para la detección de otras especies del género en muestras de
esputo (Edelstein, 1987).
También existe una prueba para la detección de antígenos de L pneumo-
phila del serogrupo 1 en orina que tiene una sensibilidad del 80% al 90%, aun-
que hay que indicar que la antigenuria puede persistir durante muchos meses
tras la infección (Edelstein, 1987).
También puede llevarse a cabo el diagnóstico de la legionelosis serológica-
mente, detectando un incremento de cuatro veces o superior en el título de anti-
cuerpos al menos hasta un valor de 1:128. Un único título de anticuerpos de
1:256 es una prueba presuntiva de una infección antigua. No se conoce la sen-
sibilidad del diagnóstico serológico de la enfermedad causada por especies dife-
rentes a L. pneumophila del serogrupo 1; en cualquier caso, la especificidad de
las pruebas en estos supuestos es menor que la detectada en el caso de la
infección causada por L. pneumophila del serogrupo 1 (Edelstein, 1987).
Sensibilidad a los antimicrobianos. Los resultados de las pruebas de
sensibilidad no se correlacionan necesariamente con la respuesta clínica al
tratamiento; por tanto, no es necesario llevar a cabo dichas pruebas. La tera-
pia se realiza, generalmente, mediante la administración de eritromicina y
rifampicina. Otros agentes que también han sido utilizados son el trimetoprim-
sulfametoxazol, las quinolonas, la claritromicina y la azitromicína.
Neisseria y Moraxella
Características. Estos géneros incluyen bacterias gramnegativas, aerobias,
catalasa y oxidasa positivas e inmóviles, que presentan lorma cocácea, apare-
ciendo a menudo los cocos asociados en parejas con los lados adyacentes apla-
nados, lo que da una apariencia de un riñon o de granos de calé (Lámina 50-5).
Estos microorganismos son algo delicados, y en algunos casos necesitan que
los medios de cultivo sean enriquecidos con sangre, suero, colesterol o ácido
oleico para contrarrestar el efecto de algunas sustancias inhibidoras del creci-
miento bacteriano que pueden estar presentes en los medios, como son los áci-
dos grasos. Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis deben incubarse rápida-
mente en una atmósfera que contenga CO, para que puedan ser aisladas: sin
embargo, este requerimiento depende de la cepa de que se trate, varía con la
fase de la curva de crecimiento en la que se encuentre el microorganismo y des-
aparece a menudo con el posterior subcultivo. N. meningitidis y la mayoría de
cepas de N. gonorrhoeae no son inhibidas por diferentes agentes antimicrobia-
nos, tales como vancomicina o lincomicina, colistina y nistatina, característica
particularmente útil para el aislamiento selectivo de estas especies a partir de
muestras donde existan otras bacterias. Algunos aislamientos de N. gonorrhoe-
ae (en especial las cepas AUH, que necesitan arginina, uracilo e hipoxantina)
son sensibles a la vancomicina.
La posición taxonómica de Moraxella catarrhalis es objeto de estudio en la
actualidad, habiéndose formulado la propuesta de que sea trasladada a su
propio género. Branhamella. En la actualidad ambos nombres están en uso.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Aunque se ha descrito que otras
especies del género Neisseria, distintas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae,
pueden causar infecciones oportunistas en huéspedes inmunocomprometi-
dos, por lo general estas especies no son patógenas.
N. meningitidis puede colonizar las mucosas de las vías respiratorias superio-
res, un hecho que es seguido al cabo de unos 7 a 10 días por la formación de
anticuerpos bactericidas y hemaglutinantes. que no eliminan el estado de porta-
dor pero confieren inmunidad específica de grupo. En unos pocos casos, la
enfermedad aparece rápidamente tras la colonización en lorma de meningoco-
cemia y meningitis. El microorganismo también tiene tendencia a invadir las
membranas serosas y los tejidos de las articulaciones, lo que conduce al des-
arrollo de pleuritis, pericarditis y artritis. Entre un 5% y un 15% de individuos
sanos son portadores de Ai. meningitidis en su nasofaringe, porcentaje que pue-
de ser más alto en grupos cerrados, como los soldados en los cuarteles. No ha
podido establecerse una correlación directa entre porcentaje de portadores e
incidencia de la enfermedad, con la única posible excepción de grupos familia-
res grandes o de hogares en los que ha habido un caso infantil durante epide-
mias de la enfermedad. También se han aislado meningococos a partir de mues-
tras genitales, y aunque su significado clínico es desconocido en estos casos,
pueden ser fácilmente identificados de forma incorrecta como gonococos salvo
que se hagan las pruebas adecuadas para poder diferenciar las dos especies.
El factor de virulencia más importante de N. meningitidis es un complejo
endotoxina-polisacárido que en animales de experimentación activa la casca-
da de la coagulación, provocando el depósito de fibrina en los capilares (coa-
gulación intravascular diseminada), hemorragias en las glándulas suprarre-
nales y en otros órganos y alterando la resistencia vascular periférica, lo que
conduce al shock y a la muerte.
Las manifestaciones clínicas y la patogenia de las infecciones gonocócicas
difieren un poco de las observadas en el caso de la infección por N. meningitidis.
Los tipos patogénicos (1 y 2) de N. gonorrhoeae se adhieren a distintos tipos de
células humanas por medio de "pili", apéndices muy delgados distintos de los fla-
gelos que no son producidos por las células de los tipos no patógenos (3 y 4).
Estos "pili" que son antigénicamente heterogéneos, uno de los principales facto-
res de virulencia en N. gonorrhoeae, pueden inhibir la fagocitosis e inducir la for-
mación de anticuerpos específicos de cepa. Otros posibles factores de virulen-
cia en N. gonorrhoeae están menos claramente definidos. Tanto N. gonorrhoeae
como N. meningitidis producen una proteasa para IgA que puede jugar un papel
' La mayor parte de cepas sensibles a la vancomicina no crecen en agar Thayer-Martin
1
Puede aparecer una reacción débilmente positiva en las pruebas rápidas para determinar la utilización de carbohidratos
1
Biovar perllava. -». biovar flava. -.
' Algunas cepas son positivas y otras negativas
• = >90% de cepas positivas: - = >90% de cepas negativas: D = variable
 1112 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
importante en la patogenia, ya que las IgA son la clase de anticuerpo que pre-
domina en las secreciones de las membranas mucosas.
Moraxella catarrhalis puede encontrarse en la orofaringe de niños y adultos
sanos. Es una bacteria encapsulada que también posee ''pili" que se prolongan
más allá de la membrana externa de la pared celular y que desempeñan el
papel de adhesinas. Las infecciones que causa con mayor frecuencia son bron-
quitis, otitis, sinusitis y neumonía (especialmente en el caso de personas con
una enfermedad pulmonar crónica subyacente) (Catlin, 1990). M. catarrhalis
también causa, aunque con mucha menor frecuencia, bacteriemia, endocardi-
tis, meningitis, infecciones urogenitales y oflalmia neonatorum.
Diagnóstico de laboratorio. Los aspectos más importantes en el diag-
nóstico de laboratorio de las infecciones causadas por N. meningitidis y N. go-
norrhoeae son la elección del espécimen clínico adecuado y su recogida y trans-
porte hasta el laboratorio en condiciones apropiadas (véase Cap. 57). Las cepas
patógenas del género Neisseria son sensibles a la desecación y las temperatu-
ras extremas, por lo que las muestras deben cultivarse rápidamente para incre-
mentar las posibilidades de recuperación. Son bacterias mesófilas y crecen mal.
si es que lo hacen, a temperatura ambiente. Muchas de ellas necesitan ser incu-
badas con prontitud en una atmósfera con C0 (2%-8%) para su aislamiento ini-
2
cial. Los medios basados en el agar chocolate son adecuados para su cultivo y
deben contener una mezcla de diferentes antibióticos (p. ej., vancomicina o lin-
comicina. y colistina. nistatina o anisomicina y trimetoprim) si el aislamiento ha
de llevarse a cabo a partir de muestras contaminadas con microbiota autóctona.
Los gonococos sensibles a vancomicina deben ser cultivados en un medio que
contenga lincomicma; sin embargo, teniendo en cuenta el efecto sinérgico entre
la lincomicina y el trimetoprim, este último debe suprimirse en los medios que
contengan la primera. Lo ideal es llevar a cabo la inoculación directa en la mis-
ma cabecera de la cama del enfermo e incubar las placas inmediatamente a
35°C en una atmósfera con CO,. Si alguno de estos cultivos tiene que ser envia-
do a un laboratorio de referencia para su análisis, ha de incubarse primero duran-
te la noche para asegurar el crecimiento de los microorganismos.
Un aislamiento obtenido a partir de un espécimen urogenital, que forme
colonias con aspecto típico en un medio selectivo, puede ser identificado pre-
suntivamente como N. gonorrhoeae en base a los resultados de la observación
microscópica bajo tinción de Gram y de las pruebas de la oxidasa y la catala-
sa. La observación al microscopio de los frotis preparados a partir de las colo-
nias sospechosas, teñidos por el método de Gram, debe revelar la presencia
de diplococos gramnegativos con la morfología característica, aunque los
microorganismos también pueden aparecer formando tetradas, especialmente
en los cultivos jóvenes. Todas las especies del género Neisseria son oxidasa
positivas y todas, con la excepción de fV. elongata. son catalasa positivas.
Debido a que es posible recuperar otras especies del género, al margen de N.
gonorrhoeae, a partir de tracto genitourinario, es de la mayor importancia rea-
lizar pruebas confirmatorias de la identificación, preferiblemente mediante más
de un procedimiento, en especial en el caso de muestras extragenitales o
cuando exista la sospecha de un caso de abuso sexual.
La confirmación de N. gonorrhoeae y la identificación de otras especies del
género Neisseria y de M. catarrhalis se basa en sus características bioquími-
cas y de crecimiento (Tabla 50-14) (Knapp, 1988). El método de identificación
estándar es la detección de la formación de ácidos a partir de azúcares en un
medio base (agar cisteína-tripticasa de soja; medio CTA) y otras pruebas bio-
químicas convencionales. Sin embargo, dados los inconvenientes de los
métodos tradicionales, hoy en día se utilizan en muchos laboratorios sistemas
de identilicación más rápidos. También hay disponibles procedimientos para
la detección directa de N. gonorrhoeae y N. meningitidis en las muestras clí-
nicas. En principio, el tipado de los aislamientos de ambas especies se lleva
a cabo en estudios con un propósito epidemiológico.
En el método estándar de identificación, se analiza la producción de ácido a
partir de glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa en medio CTA, comparando los
resultados frente a los de un tubo control con medio de cultivo sin carbohidrato.
Una vez inoculados, los tubos se incuban a 35°C-37"C en ambiente aeróbico
y se examinan a intervalos de 24 horas hasta que los resultados sean inter-
pretables, o al cabo de 72 horas. Los resultados esperables para las especies de
Neisseria y para M. catarrhalis se muestran en la Tabla 50-14. Sin embargo,
de manera ocasional, un aislamiento de N. meningitidis puede producir reaccio-
nes anómalas; glucosa y maltosa negativas y ausencia de actividad sacarolítica.
Si de todos modos en estos casos existe la fuerte sospecha de que pueda tra-
tarse de N. meningitidis, debe confirmarse la identificación mediante un ensayo
de aglutinación en portaobjetos, utilizando una mezcla de anticuerpos polivalen-
tes frente a los diferentes serogrupos o anticuerpos individuales para cada uno
de ellos. Además de las pruebas convencionales de degradación de carbohi-
dratos, debe determinarse también la reducción de los nitratos a nitritos y la pro-
ducción de ADNsa. Esta última es particularmente útil para la identificación de
M. catarrhalis. que es ADNsa positivo, mientras que las especies de Neisseria
dan negativa esta prueba. Los inconvenientes de los métodos convencionales
son la necesidad de tener que emplear inóculos densos de cullivos puros, los
largos tiempos de espera y la incapacidad de algunas especies delicadas de
N. gonorrhoeae para crecer en el medio base utilizado.
Algunos sistemas comerciales pueden detectar la formación de ácido a
partir de los carbohidratos en un tiempo muy corto (entre una y cuatro horas)
(Knapp, 1988). El inoculo debe prepararse a partir de un cultivo puro del
aislamiento, por lo que la identificación puede realizarse generalmente a
las 24 horas de haber llevado a cabo el aislamiento. Las reacciones acidas
en el caso de algunas cepas de N. gonorrhoeae y, en menor proporción, de
N. meningitidis pueden ser difíciles de interpretar o aberrantes en el caso de
algunos de los sistemas existentes, por lo que las cepas de N. gonorrhoeae que
son débilmente productoras de ácidos a partir de la glucosa pueden aparecer
como glucosa negativas. Algunas cepas de N. cinérea, especie que no pro-
duce ácido a partir de la glucosa, pueden aparecer como glucosa positivas en
algunos de métodos comerciales.
Las pruebas sobre sustratos para enzimas permiten una identificación rápi-
da (entre una y cuatro horas) solamente para aquellos aislamientos de diploco-
cos gramnegativos, oxidasa positivos, obtenidos en un medio de cultivo selec-
tivo (Kellogg, 1995; Knapp. 1988). Estas pruebas son de utilidad para distinguir
las cepas maltosa negativas de N. meningitidis de N. gonorrhoeae, aunque los
cambios de color pueden ser sutiles y si, en consecuencia, son interpretados de
forma errónea pueden provocar que los aislamientos de N. meningitidis y otras
especies de Neisseria sean clasificados incorrectamente como N. gonorrhoeae.
Además, las cepas de Neisseria cinérea y de Kingella denitrificans que crecen
en los medios selectivos para el gonococo pueden ser identificadas equivoca-
damente como N. gonorrhoeae si no se realizan pruebas adicionales de confir-
mación de identidad. Los sistemas comerciales que combinan las pruebas con
sustratos enzimáticos con los métodos convencionales modificados proporcio-
nan una alternativa rápida y precisa para la identilicación de las especies de los
géneros Neisseria y Haemophilus (Janda, 1987).
Los métodos inmunológicos para N. gonorrhoeae (coaglutinación y tinción
con anticuerpos fluorescentes) se ulilizan para la identificación de las colonias
aparecidas en los medios de aislamiento primarios. La inmunofluorescencia con
anticuerpos monoclonales tiene una gran sensibilidad y especificidad en el caso
de N. gonorrhoeae, pero puede dar lugar a falsos positivos con otras especies
de Neisseria y con Kingella denitrificans. habiéndose detectado también unión
inespecífica a través del fragmento Fe de la molécula de las IgG con otras bac-
terias (Beebe, 1993; Dillon, 1988; Kellogg, 1995). Por tanto, se sugiere que estos
reactivos sean utilizados solamente para identificar microorganismos gramnega-
tivos, oxidasa positivos, aislados en medios selectivos para gonococos.
Puede emplearse también una sonda quimioluminiscente de ácidos nuclei-
cos específica para N. gonorrhoeae, para la confirmación de un aislamiento
obtenido por cultivo o para la detección directa de la bacteria en las muestras
de exudados de la uretra o de la endocérvix, recogidos con un hisopo (Hale,
1993; Limberger. 1992). Asimismo, hay disponibles ensayos, basados en la
amplificación de ácidos nucleicos para ser utilizados con las muestras de exu-
dados uretrales y endocervicales, que parecen tener una sensibilidad mayor
que las técnicas de hibridación con sondas de ácidos nucleicos o de cultivo
microbiológico (Carrol, 1998; Kehl, 1998).
Los ensayos de aglutinación en látex están disponibles para la detección
directa de antígenos de N. meningitidis en LCR, suero y orina. Como ya se
comentó previamente (véase el apartado de Streptococcus dentro de este
capítulo), la sensibilidad de estas técnicas parece ser menor o como mucho
igual que la de la tinción de Gram; además, los resultados de estas pruebas
parecen tener un efecto mínimo en lo que respecta a la atención que recibe
el paciente (Bhisitkul. 1997: Granoff, 1986: Maxson, 1994; Perkins. 1995). Por
tanto, muchos laboratorios han dejado de ofertar estas técnicas.
Sensibilidad a los antimícrobianos. Algunos aislamientos raros de
N. meningitidis son resistentes a la penicilina; por tanto, deben realizarse
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA 1113

Tabla 50-15 Características diferenciales de las especies del g é n e r o Haemophilus de importancia clínica
Especies Requiere factor X Requiere factor V Hemolisis Catalasa Crecimiento favorecido por el CO,

H. influenzae + + i
H haemolylicus i + + +
H ducreyi +
H parainfluenzae + D D
H. par aphrophilus + +
H. aphrophilus +

Para ver el significado de los símbolos utilizados, consúltese la Tabla 50-10

Adaptada de Campos J Haemophilus En Murray PR. Baron E Pfaller M. y col (eds 1 Manual of Clinical Microbiology. 7' ed Washington, DC. American Society for
Microbiology. 1999. p 608. reproducida con permiso del editor.

pruebas para detectar actividad |i-lactamásica en estos casos (Saez-Nieto,
1992; Woods, 1994). Otros agentes antimicrobianos eficaces son las cefalos-
porinas de amplio espectro y el cloranfenicol. Para el tratamiento profiláctico
del posible contagio dentro de los grupos familiares, pueden utilizarse la
nfampicina, la minociclina y las fluoroquinolonas.
Debido a que la resistencia de N. gonorrhoeae a la penicilina y la tetraciclí-
na está muy extendida (Fox. 1997). las recomendaciones actuales para el tra-
tamiento contemplan la administración de cefalosporinas de amplio espectro
o de las nuevas fluoroquinolonas. Aunque no parece existir resistencia frente
a las cefalosporinas, si se han descrito casos de resistencia a las fluoroqui-
nolonas. En consecuencia, deben realizarse pruebas de sensibilidad si los
síntomas persisten tras el tratamiento. La producción de |Mactamasa puede
detectarse con nitrocefina. una cefalosporina cromogénica. Para determinar
la susceptibilidad de N. gonorrhoeae a las cefalosporinas, las quinolonas y
otros agentes antimicrobianos, puede emplearse el método de difusión en dis-
co, con agar GC enriquecido con un 1°o de suplemento de crecimiento
Casi todas las cepas de M catarrhalis producen |5-lactamasa, cuya presen-
cia puede ponerse de manifiesto con nitrocefina. Los aislamientos son, por lo
general, sensibles a cefalosporinas, trimetoprim-sulfametoxazol y a combina-
ciones que incluyan un antibiótico |J-lactámíco y un inhibidor de |i-lactamasas.
Prevención. Las vacunas de polisacáridos contra los serogrupos A, C. Y
y W135 de N. meningitidis han sido autorizadas en los EE.UU.. y su adminis-
tración está recomendada en caso de militares, de personas que viven en áreas
epidémicas de los países en vías de desarrollo y de individuos cuyo bazo no
es luncional o que carecen de dicho órgano. La profilaxis con antibióticos
debe limitarse a los casos de contados familiares y a aquellos que hayan
podido estar en contacto con las secreciones orales de los enfermos. La
nfampicina es el antibiótico de elección habitual en estos casos.
La utilización de antibióticos antes de estar expuesto al contado con el
microorganismo no está recomendada por los riesgos potenciales de sensibi-
lización y aparición de cepas resistentes. La única excepción a esta regla es la
aplicación de solución de nitrato de plata o de pomada de entromicina en los
ojos de los recién nacidos para prevenir la oftalmía gonococica o por clamidias.
Haemophilus
Características. Las especies de este género son bacilos y cocobacilos
gramnegativos de pequeño tamaño, pleomórticos, anaerobios facultativos,
oxidasa positivos y con requerimientos de hemina u otras porfirinas (factor X) para de Wood. Las propiedades hemoliticas de las especies de Haemophilus
y/o nicotinamina-adenina-dinucleótidos o trinucleótidos (factor V).
Manifestaciones clínicas y patogenia. La mayor parte de especies de
Haemophilus son habitantes habituales de las vías respiratorias superiores.
Algunas de ellas pueden encontrarse también en los tractos gastrointestinal y
genitourinano. La diseminación de persona a persona se produce por inhalación bacteriana subaguda.
de gotícuias de humedad liberadas con la respiración. Las infecciones causadas
por Haemophilus spp. van desde conjuntivitis y otitis media hasta meningitis y
endocarditis. Las especies consideradas como patógenos humanos habituales
son H. influenzae, H. parainfluenzae, H. ducreyi y H. aphrophilus.
El principal factor de virulencia de H. influenzae es el polisacárido capsular, del basal GC enriquecido con hemoglobina (1%), suero bovino fetal (5%-10%), Iso-
cual exislen seis tipos antigénicamente distintos (serotipos del a al f). Las cepas
que carecen de cápsula se denominan como no tipables. H. influenzae no pro-
duce endotoxína. y esta especie es rápidamente fagocitada y destruida por los
macrófagos. a menos que existan deficiencias en el funcionamiento de los anti-
cuerpos de los fagocitos o del sistema complemento. Tampoco se sabe mucho (NCCLS. 2000a) recomienda levar a cabo pruebas de susceptibilidad frente
sobre el papel de los anticuerpos en la inmunidad frente a las infecciones cau- a ampicilina, cloranfenicol. cefalosporinas de tercera generación y merope-
sadas por esta bacteria. Los anticuerpos van apareciendo con la edad, presumi-
blemente como consecuencia de una infección natural con H. iníluenzae o con
otras bacterias que compartan homología antigénica con aquélla, por lo que la
mayor parte de individuos mayores de 15 años poseen anticuerpos. Se desco-
noce cuáles de estos anticuerpos son protectores y a qué nivel actúan.
Desde la introducción de la vacuna frente a H. intluenzae serotipo b a
mediados de la década de los 80, ha habido un brusco descenso en la inci-
dencia de las infecciones invasivas causadas por este microorganismo, tales
como la meningitis y la epíglotitis (CDC, 1994).
Las cepas no tipables de H. influenzae están más frecuentemente asocia-
das con la otitis aguda media o con las exacerbaciones agudas de la bron-
quitis crónica. H. parainfluenzae es usualmente una especie comensal de las
vías respiratorias superiores, aunque puede provocar enfermedades graves
como endocarditis. H. aphrophilus. otra especie comensal del tracto respira-
torio superior, también puede producir endocarditis, asi como abscesos cere-
brales, neumonía, meningitis y bacteriuria. H. ducreyi es el agente responsa-
ble de la enfermedad lamada chancroide (o chancro blando)
Diagnóstico de laboratorio. Para el aislamiento de Haemophilus spp. es
necesaria la presencia de los factores X y/o V en el medio de cultivo. El primero
de ellos es aportado al medio por los hematíes usados por efecto del calenta-
miento (p. ej., en el agar chocolate), aunque también puede ser proporcionado
por glóbulos rojos intactos humanos, de cabalo o de conejo. El factor V es apor-
tado generalmente por el extracto de levadura que se añade al medio o por una
suspensión de estafilococos, que se siembra en una única estria sobre la super-
ficie del medio y alrededor de la cual crecen las colonias de las cepas depen-
dientes de factor V (fenómeno denominado satelitismo). Las caraderisticas dife-
renciales de las especies de este grupo se muestran en la Tabla 50-15.
Los requerimientos de factor X y V se establecen determinando la capaci-
dad de la cepa en cuestión para crecer o no en medios de cultivos que con-
tengan dichos (adores. Una alternativa para establecer la dependencia del
factor X es la prueba de la porfirina propuesta por Kilian (1974) y que deter-
mina la capacidad de las especies dependientes para utilizar el ácido ¿>-ami-
nolevulínico en la síntesis de porfobilmogeno y porfirinas. La formación de
portobilmógeno se puede detectar añadiendo reactivo de Kovac al medio y
observando el desarrollo de una coloración roja en la fase acuosa Alternati-
vamente, se puede demostrar la formación de porfirinas en la mezcla en reac-
ción por la fluorescencia rojiza que aparece cuando se ilumina con una lám-
pueden determinarse en agar sangre de conejo o de caballo.
A menudo debe diferenciarse a H. aphrophilus de otras especies como
Actinobacillus actinomycetemcomitans. Cardiobacterium hominis y Eikenella
corrodens (Tabla 50-15), todas las cuales se han asociado con endocarditis
El cultivo de H. ducreyi a partir de lesiones chancroides ha sido problemático.
Un Irotis del material obtenido de la lesión teñido por el método de Gram puede
ser de ayuda si la observación revela la presencia de bacilos gramnegativos por
parejas o en filas ("bandadas de peces"). La muestra puede inocularse en medio
VitaleX (1%; BBL Microbiology Systems) y vancomicina (3 tig/ml) o en agar Mue-
ller-Hínton con sangre de caballo (5%), solución de enriquecimiento con cofac-
lores, vitaminas y aminoácidos (1%) y vancomicina (3 LigVml).
Sensibilidad a los antimicrobianos. En la actualidad, el NCCLS
 1114 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
nem en el caso de H. influenzae aislado a parlir de muestras de sangre o de
LCR. Se ha observado resistencia a ampicilina y cloranfenicol, así como fren-
te a trimetoprim-sulfametoxazol. tetraciclina y rifampicina, aunque con una
menor frecuencia en estos casos. La resistencia a las penicilinas está gene-
ralmente determinada por la capacidad para producir |5-lactamasas: sin
embargo, algunos aislamientos raros son resistentes debido a alteraciones en
la permeabilidad de la membrana extema o en la afinidad de las proteínas que
ligan penicilina (PBP). Las pruebas de sensibilidad para H. influenzae han de
realizarse con un medio de cultivo especial (Haemophilus Test Medium).
Bordetella
Características. Las especies del género Bordetella son bacterias muy
pequeñas de morfología cocobacilar, aerobias estrictas, no fermentadoras,
que necesitan ácido nicotinico, cisteina y generalmente metionina, pero no
hemina (factor X) o coenzima I (factor V), para su crecimiento. Durante el mis-
mo se produce un exceso de ácidos grasos que resultan inhibidores para un
mayor crecimiento microbiano, razón por la que es preciso añadir sangre, car-
bón vegetal, almidón o resinas de intercambio iónico al medio para que adsor-
ban selectivamente y eliminen dichos ácidos grasos. Tras subcultivos repeti-
dos en medios artificiales tiene lugar un fenómeno de variación de fase de
cepas lisas virulentas a rugosas avirulentas.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Bordetella
se encuentran en las vías respiratorias de los animales de sangre caliente.
S. bronchiseptica afecta primariamente a los perros (tos de la caseta del
perro), y a algunos otros animales, y puede causar, aunque raramente, una
enfermedad parecida a la tos ferina en huéspedes humanos inmunocompro-
metidos. 8. parapertussis, especie que infecta tanto al hombre como a los
corderos, es un patógeno humano poco común. La infección por este micro-
organismo puede ser asintomática o provocar una enfermedad semejante a
la tos ferina o. con mayor frecuencia, bronquitis. 8. pertussis, el agente cau-
sal de la tos ferina, sólo provoca enfermedad en el hombre.
8. pertussis. B. parapertussis y 8. bronchiseptica producen varios factores de
virulencia. Entre ellos se encuentran una adenilato cíclasa que ejerce el papel de
toxina (TAC), ya que inhibe diversas funciones celulares al provocar un aumen-
to de los niveles intracelulares de adenosina 3', 5'-fosfato en las células afecta-
das. La citotoxina traqueal (CTT) causa la detención del movimiento de los cilios
y la muerte celular. En la adhesión de las bacterias a los tejidos están implicadas
una hemaglulinina filamentosa (HAF). la pertactina y las fimbrias. 8. pertussis
produce, con carácter exclusivo, toxina diftérica (TD). que actúa inhibiendo los
factores responsables de la transducción de señal a nivel intracelular, catalizan-
do la transferencia de ADP a las proteínas G celulares.
Se cree que durante la infección por 8. pertussis el microorganismo se fija
inicialmente al epitelio ciliado de las vías respiratorias y a las células efecto-
ras del sistema inmune, por medio de diferentes moléculas y estructuras que
actúan como adhesinas (fimbrias, HAF, TD y pertactina). La TD y la TAC tra-
bajan juntas para inhibir la respuesta del sistema inmune del hospedador,
mientras que la CTT daña el epitelio respiratorio. Como resultado se produce
una respuesta inflamatoria y necrosis celular, leucocitosis y linfocitosis, acu-
mulación de secreciones, tos y, finalmente, bronconeumonia, episodios de
hipoxia y encefalopatía.
8. pertussis posee un antígeno protector que al combinarse con el anti-
cuerpo específico frente al mismo anula el carácter infectivo de la bacteria.
Parece, sin embargo, que para lograr la erradicación del microorganismo son
necesarias tanto la inmunidad humoral como la celular.
Diagnóstico de laboratorio. La tasa de aislamiento de B. pertussis a partir
de los pacientes disminuye con la duración de la enlermedad. El espécimen más
adecuado es el material recogido de la nasofannge con un hisopo: en cualquier
caso, los aspirados nasofaríngeos obtenidos mediante un catéter blando de
goma también han permitido lograr, en las manos de algunos analistas, buenos
porcentajes de aislamiento. También pueden utilizarse para el cultivo muestras
obtenidas por métodos más agresivos, como es el caso del líquido de lavado
broncoalveolar. En general, el material recogido con hisopo o los aspirados
deben inocularse en un medio apropiado, como el agar Regan-Lowe, directa-
mente en la cabecera de la cama del enfermo. En el caso de que sea necesario
su envío al laboratorio de referencia, los medios inoculados deben incubarse
durante al menos 24 horas antes de ser transportados, con objeto de permitir un
cierto nivel de crecimiento inicial del microorganismo.
El examen directo de los frotis teñidos con anticuerpos mono o policlonales
frente a 8. pertussis. conjugados con fluoresceina. puede permitir un diagnósti-
co rápido. Debido a que la inmunofluorescencia (DFA) tiene un bajo grado de
sensibilidad, debe realizarse en paralelo el aislamiento y la identificación del
microorganismo mediante cultivo. También pueden aparecer resultados falsa-
mente positivos con la técnica DFA, especialmente cuando se utilizan anticuer-
pos policlonales. Los cultivos deben incubarse en una atmósfera con un nivel
;
elevado de humedad, pero sin CO , a 35'C. 8. pertussis es una bacteria de cre-
?
cimiento lento y las colonias que forma pueden tardar entre tres y cuatro días en
ser apreciables a simple vista. La incubación debe prolongarse hasta los 7-12
días antes de que los cultivos se descarten como negativos.
Las colonias de 8. pertussis son pequeñas, redondas y brillantes y pueden
tener el aspecto de gotas de mercurio. Los microorganismos presentes en una
colonia con la morfología típica y que tengan el aspecto característico bajo tin-
ción de Gram deben subcullivarse en agar sangre, para verificar su incapacidad
de crecer en dicho medio. La identificación presuntiva de 8. pertussis se lleva a
cabo determinando el carácter catalasa y oxidasa positivo y ureasa negativo del
aislamiento en cuestión. 8. parapertussis crece más rápidamente que 8. pertus-
sis. y además es capaz de hacerlo en agar sangre e incluso en agar MacCon-
key. Esta especie da negativa la prueba de la oxidasa negativa y positivas la
catalasa y ureasa. 8. bronchiseptica crece bien tanto en agar sangre como en
MacConkey, es bioquímicamente la más activa de las tres especies, da positiva
las tres pruebas (catalasa, ureasa y oxidasa) y es capaz de reducir los nitratos.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Los agentes antimicrobianos no des-
empeñan, probablemente, ningún papel en el tratamiento de la tos ferina, pero
negativizan los cultivos nasofaríngeos en uno o dos días, lo que ayuda a impe-
dir la aparición de complicaciones en los enfermos, así como la diseminación de
la infección a individuos no inmunizados. En cualquier caso, no está indicada la
realización de las pruebas de sensibilidad en el caso de 8. pertussis. La eritro-
micina es el antibiótico de elección tanto para el tratamiento como para la profi-
laxis; alternativamente, también se puede utilizar trimetoprim-sulfametoxazol.
Brucella
Características. Las brúcelas son cocobacilos pequeños (0.5 um-0.7 pm
de ancho por 0.6 pm-1,5 pm de largo), gramnegativos, que en las extensio-
nes teñidas aparecen individualmente, en parejas o formando cadenas cortas.
Estas bacterias son inmóviles, aerobias estrictas, catalasa positivas y, casi
siempre oxidasa positivas. Su crecimiento se ve favorecido por la presencia
de CO¿ (5%-10%) en la atmósfera de incubación, y necesitan medios de cul-
tivo complejos que contengan sangre o suero. Entre las especies conocidas,
son patógenas para el hombre 8. melitensis. B. abortus. B. suis y B. canis.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Brucella son
parásitos intracelulares capaces de infectar a una gran variedad de especies
animales (incluyendo al hombre); han sido encontradas también en algunos
insectos y garrapatas. Son patógenos importantes para el hombre y los anima-
les. Los huéspedes preferidos son las cabras y las ovejas para 8. melitensis.
el ganado ovino para 8. abortus los cerdos para 8. suis y los perros para
8. canis, aunque cada una de estas bacterias puede infectar ocasionalmente
a otras especies animales. El hombre se infecta por inhalación, al entrar en
contacto directo con material infectado, incluyendo cadáveres de animales,
membranas fetales, exudados vaginales, fetos, piel o membranas mucosas, o
por ingestión de leche no pasteurizada procedente de animales infectados o de
productos lácteos derivados de aquélla. En los EE.UU. se declaran unos 100
casos de brucelosis al año. Un factor de riesgo muy común es el consumo de
queso importado hecho a base de leche de cabra sin pasteurizar.
A menudo se produce una linfadenopatia local con diseminación y locali-
zación secundaria del microorganismo en sistema reticuloendotelial, con for-
mación de granulomas en el higado, bazo, huesos, sistema genitourinario,
pulmones y tejidos blandos. Es posible observar a las bacterias en el interior
de las células fagociticas. Con frecuencia, los signos y síntomas son variables
e inespecílicos, con escalofríos, fiebre, sudoración y anorexia. Una caracte-
rística de la fiebre es que aparece durante el día (fiebre ondulante).
Diagnóstico de laboratorio. Las brúcelas se recuperan con mayor fre-
cuencia a partir de sangre y médula ósea y con menor de muestras proceden-
tes del bazo y de abscesos hepáticos. Estas bacterias crecen en medios están-
dar de laboratorio, incluyendo el agar Brucella, sangre, chocolate y tripticasa de
soja. Algunas cepas pueden crecer en agar MacConkey. En general, estas bac-
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
terias crecen en los medios utilizados para los hemocultivos. Muchos autores
recomiendan incubar los hemocultivos durante 21 días, llevando a cabo subcul-
trvos a ciegas tanto al principio como al final del periodo de incubación. Sin
embargo, ya no es preciso seguir estas recomendaciones con los nuevos siste-
mas automatizados para hemocultivo. algunos de los cuales han permitido la
recuperación de Brucella spp. en cinco días o incluso menos, sin necesidad de
realizar subcultivos a ciegas (Bannatyne, 1997: Yagupsky, 1997).
Los medios sólidos deben incubarse en una atmósfera que contenga entre un
5% y un 10% de CO . Las brúcelas crecen lentamente, e incluso tras 48 horas
?
de incubación las colonias son difíciles de ver. Los microorganismos pueden ser
identificados presuntivamente como especies del género Brucella en base a su
aspecto característico bajo tinción de Gram y a unos resultados positivos para
las pruebas de la catalasa. oxidasa y ureasa. La actividad ureásica se manifies-
ta rápidamente (alrededor de 15 minutos) en el caso de B. suis y más lentamente
(entre 2 y 24 horas) en el de B melitens'is y B. abortus. Debido a que la bruce-
losis puede adquirirse en el laboratono. el personal del mismo debe ser adverti-
do si se sospecha la presencia de Brucella spp. en el espécimen, debiendo rea-
lizarse todas las manipulaciones en una cabina de biosegundad.
La identificación a nivel de especie implica la realización de pruebas adi-
cionales, como son los requerimientos adicionales de CO „ la producción de
; dón. La transmisión al ser humano tiene lugar por la picadura de garrapatas,
H S, la hidrólisis de la urea, la sensibilidad a algunos colóranles y la sensibi-
? por inoculación directa a través de la piel o de la conjuntiva por contacto con
lidad a determinados lagos. La mayor parte de laboratorios hospitalarios soli-
citan a los departamentos estatales de salud o a los laboratorios de referen-
cia la realización de estas pruebas complementarias.
También es posible llevar a cabo el diagnóstico de la brucelosis mediante
técnicas serológicas. Un título mínimo de 1:160 en la prueba estándar de
aglutinación en tubo hace sospechar un diagnóstico positivo. Sin embargo, la
evidencia de una brucelosis reciente sólo puede ser aceptada cuando se
detecta un incremento de cuatro veces o superior en el título de anticuerpos
específicos durante el primer o segundo mes de la enfermedad. En los pacien-
tes con titulo elevados (1:640) de anticuerpos puede manifestarse un fenómeno
de zona que inhiba la reacción de aglutinación, por lo que todas las muestras de
suero de los pacientes en los que se sospeche la existencia de la enfermedad
deben diluirse hasta un valor de 1:1.280 al menos. A veces se detecta una reac-
tividad cruzada con Francisella lularensls y con Vibrio cholerae. incluyendo a las
personas que han recibido la vacuna contra el cólera.
Sensibilidad a los anlimicrobianos. El tratamiento consiste en la admi-
nistración de combinaciones de antibióticos como tetraciclma. aminoglucósi-
dos, nfampicina y trimetoprim-sulfametoxazol durante períodos prolongados.
Aunque en ocasiones el tratamiento antimicrobiano falla, ello no es debido a
fenómenos de resistencia, por lo que no es necesario llevar a cabo pruebas
de sensibilidad para los aislamientos recuperados de los enfermos.
Pasteurella
Características. Las especies del género Pasteurella son bacterias gram-
negativas con morfologías muy variadas que van desde cocobacilos pequeños
hasta bacilos largos y filamentosos, anaerobias facultativas, catalasa y oxidasa
positivas e inmóviles. De las ocho especies conocidas con capacidad para
infectar al hombre (P multocida. P. bettyae. P. cams. P. dagmatis. P. stomatis.
P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes). P. multocida es el patógeno
humano más importante. Las especies de Pasteurella son lenolípicamente muy
semejantes a las del género Actinobacillus. habiendo demostrado los estudios
de hibridación ADN-ADN y la comparación de los rARN de 16S que las especies
P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes están más relacionadas con el
género Actinobacillus que con el genero Pasteurella.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Pasteurella. espe-
cialmente P. multocida. se encuentran formando parte de la microbiota comen-
sal de las vías respiratorias superiores de mamíferos y aves de corral, aislándo-
se frecuentemente de las heridas causadas por mordeduras o arañazos de
animales. Las mordeduras de gatos resultan infectadas con mayor frecuencia
que las de perros. Las infecciones localizadas pueden hacerse sistémicas.
habiéndose registrado casos de septicemia, osteomielitis y meningitis. Estas
bactenas se han asociado con infecciones de las vías respiratorias, incluyendo
sinusitis, abscesos periamigdalares. neumonía, empiema. bronquitis y bron-
quiectasias. generalmente en pacientes con afecciones pulmonares crónicas.
Diagnóstico de laboratorio. Las pasteurelas crecen bien en agar sangre
y sólo muy raramente son capaces de crecer en medios de cu.tivos selectivos
1115
para bacterias gramnegativas. como son el agar EMB o MacConkey El
hallazgo de un bacilo gramnegativo que sólo crece en agar sangre, que es
oxidasa e indol positivo, y que da negativa la prueba del ONPG. constituye
una sólida evidencia presuntiva del aislamiento de P. multocida. la especie
que se aisla con mayor frecuencia.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Raramente se observa resistencia
a los agentes antimicrobianos en los aislamientos de origen humano. Las pas-
teurelas son generalmente susceptibles a la penicilina y la tetraciclina. La
penicilina es el antibiótico de elección.
Francisella
Características. Francisella tularensis es una bacteria gramnegativa muy
pequeña, aerobia estricta, que exhibe diferentes morfologías (desde cocos
hasta bacilos pleomórficos) y que necesita cístina o cisteina para poder cre-
cer. Cuando se tiñe con colorantes derivados de la anilina muestra una tinción
bipolar débil.
Manifestaciones clínicas y patogenia. F. tularensis se encuentra en
animales tanto salvajes como domésticos, pájaros, artrópodos, agua, barro y
heces. El reservono principal de esta bacteria es el conejo de cola de algo-
un animal infectado, por inhalación o por ingestión de carne contaminada
poco cocida o de agua contaminada. La enfermedad se manifiesta de varías
formas, como son la ulceroglandular, glandular, oculoglandular. orofaríngea.
intestinal, neumónica y tifoidea. Cada año se detectan entre 100 y 200 casos
aproximadamente de tularemia en los EE.UU.
La tularemia se manifiesta de varias formas tras un período de incubación
que oscila entre 1 y 10 días. Algunos síntomas como cefalea, fiebre, escalo-
fríos, vómitos y mialgias se presentan característicamente al principio. En la
forma ulceroglandular aparecen linfadenitis y linfadenopatias en la zona de
drenaje de la lesión primaria. La lesión es papular inicialmente y más tarde
ulcerativa. La forma oculoglandular de la enfermedad se caracteriza por la
inflamación de la conjuntiva y, generalmente, por la aparición de una pápula
en el párpado inferior, con linfadenitis de los ganglios preauriculares, paroti-
deos, submaxilares y cervicales anteriores. La forma intestinal de la tularemia
se caracteriza por la presencia de lesiones ulcerosas en la boca, garganta y
tracto gastrointestinal superior.
La virulencia parece estar relacionada con la morfología lisa de las colonias.
El subcultivo repetido conlleva una transición de la morfología colonial lisa a otra
rugosa, concomitantemente con una pérdida de la virulencia. Las cepas fuerte-
mente virulentas para el hombre presentan actividad citrulin-ureidasa y fermen-
tan el glicerol, estando asociadas con la enfermedad en conejos transmitida por
las garrapatas. No se ha detectado la producción de toxinas en esta bacteria.
Puede sospecharse la existencia de tularemia en cualquiera que haya esta-
do en un área donde la enfermedad tiene carácter endémico, haya entrado en
contacto con animales silvestres o ganado, tenga un historial de picaduras por
garrapatas, haya estado implicado en labores agrarias, haya bebido agua
contaminada o haya estado expuesto a cultivos bacterianos o a animales de
laboratorio infectados. Los tramperos, cazadores, trabajadores de la industria
peletera y alimentaria, los agricultores y el personal de laboratorio están en
situación de alto riesgo para contraer la enfermedad. Debido a sus manifes-
taciones tan diversas, la tularemia puede confundirse fácilmente con muchas
otras enfermedades como la brucelosis, el ántrax, la esporotricosis. las fie-
bres tifoideas, la tuberculosis, la histoplasmosis y la sífilis.
Diagnóstico de laboratorio. El tipo de muestra adecuado para el examen
incluye los líquidos o legrados recogidos a partir de la lesión primaría, los aspi-
rados de ganglios linfáticos regionales aumentados de tamaño, el esputo, los
lavados faríngeos y los aspirados gástricos. El aislamiento de la bacteria es difí-
cil porque tiene requerimientos nutricionales especiales y crece lentamente, lo
que permite que otros microorganismos de crecimiento más rápido que puedan
estar presentes en el espécimen enmascaren o dificulten su desarrollo. Los cul-
tivos pueden realizarse en agar con glucosa y cisteina. enriquecido con un 5%
de sangre de conejo desfibnnada, en agar chocolate con IsoVitaleX o en agar
BCYE. Algunas cepas pueden crecer incluso en agar sangre estándar o en agar
tripticasa de soja. Si la muestra clínica está contaminada por otros microorga-
nismos (incluidos los hongos), debe añadirse al medio antibióticos, como penici-
lina, polimixina B y cicloheximida, para inhibir el crecimiento de éstos. Se debe
 1116 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
tener un cuidado especial con la manipulación del material infectado para evitar
la formación de aerosoles o el contacto directo con la piel Los clínicos deben
informar siempre al personal del laboratorio si sospechan de la existencia de
F. tularensis en las muestras con objeto de que se adopten las medidas de segu-
ridad apropiadas para evitar una exposición accidental al microorganismo.
Los cultivos se incuban a 35"C en una atmósfera que puede contener o no
CO,. Las colonias aparecen generalmente entre 2 y 4 días, y tienen un color
que va de azul-grisáceo a blanco, son redondas, lisas y ligeramente mucosas.
En un medio que contenga sangre, puede apreciarse una zona estrecha de
(/-hemolisis alrededor de las colonias. Debido a que el trabajo con este micro-
organismo en el laboratorio es peligroso, cualquier aislamiento sospechoso
debe enviarse a un laboratorio de referencia, como el CDC de Allanta, para
su confirmación mediante una prueba de aglutinación en portaobjetos o de
mmunofluorescencia directa.
El diagnóstico de la tularemia también puede establecerse por técnicas
serológicas. Un título de 1:40 en una reacción de aglutinación en ausencia de
una infección previa tiene valor diagnóstico, y puede aumentar durante las
tres primeras semanas hasta alcanzar un valor de 1:640 o incluso superior.
Las aglutininas frente a Brucella spp. también aumentan de forma inespecífi-
ca. pero su titulo nunca alcanza valores tan altos.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Para F. tularensis la estreptomicina
es bactericida, mientras que las tetraciclinas y el cloranfenicol son bactenostá-
ticos. Puesto que no son infrecuentes las recidivas después de un tratamiento
con estos dos últimos, el antibiótico de elección es la estreptomicina.
Calymmatobacterium
Características. C. granulomatis es un bacilo pleomórtico gramnegativo.
inmóvil y capsulado que puede cultivarse en el saco vitelino de los huevos o
en medios de cultivo artificiales que contengan yema de huevo fresca. Esta
bacteria posee determinantes de virulencia semejantes a los que exhiben las
especies de Klebsiella, lo que ha inducido a algunos expertos a clasificarla
dentro de la familia Enterobacteriaceae.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Esta bacteria no provoca enfer-
medades en los animales. En el hombre causa el granuloma inguinal, que se
caracteriza por la aparición de lesiones ulcerogranulomatosas en la piel y las
mucosas del área genital e inguinal.
Diagnóstico de laboratorio. Un fragmento de tejido extraído del borde de
una lesión ulcerosa se apneta y restnega sobre un portaobjetos de vidrio para
obtener un frotis que se tjñe por el método de Giemsa o de Wnght. La detección
de bacilos pequeños, pleomórficos, rectos o curvados, con los extremos redon-
deados, y granulos polares característicos en el interior de las células mononu-
cleares es la manera más efectiva para llevar a cabo el diagnóstico.
Sensibilidad a los antímícrobianos. Los antibióticos eficaces frente a
C. granulomatis son las tetraciclinas. la eritromicina, la ampicilina y el cloran-
fenicol. La bacteria puede desarrollar resistencia a la estreptomicina.
Streptobacillus
Características. Streptobacillus moniliformis es una bactena gramnegativa
de morfología bacilar, anaerobia facultativa, inmóvil y no capsulada, que apare-
ce frecuentemente formando cadenas o largos filamentos, y que a menudo pre-
senta una serie de engrasamientos ovales o alargados que confieren al conjun-
to un aspecto de rosario. La morfología varia con el tiempo, ya que en los cultivos
jóvenes los microorganismos presentan un aspecto filamentoso bastante unifor-
me, mientras que a medida que el cultivo envejece aumenta la tendencia a la
fragmentación para dar lugar a lormas cocobacilares irregulares. Esta bacteria
forma colonias L en agar. que tienen un aspecto que recuerda a un "huevo frito" genicidad de la mayoría de los microorganismos anaerobios En el caso de
y pueden estabilizarse si se añade penicilina al medio de cultivo.
Manifestaciones clínicas y patogenia. S monililormis forma parte de
la microbiota autóctona del tracto respiratorio superior de los roedores silves-
tres y de laboratorio. La enfermedad que produce en el hombre (fiebre de la
mordedura de la rala o enfermedad de Haverhill) es consecuencia de la mor-
dedura de roedores, de la ingestión de alimentos contaminados o de lesiones
traumáticas. En un período de tiempo de unas tres semanas pueden apare-
cer una serie de manifestaciones clínicas como linfoangitis local y linfadeni-
tis, seguidas por fiebre, escalofríos, malestar general y. más tarde, por un
exantema morbidíforme generalizado, maculopapular o petequial Algunos
pacientes desarrollan poliartritis migratoria También se han descrito casos de
endocarditis. El examen histopatológico es mespecifico y revela la existencia
de una reacción inflamatoria crónica.
Diagnóstico de laboratorio. Esla bactena crece en agar con infusión de
corazón enriquecido con suero de caballo inactivado por calor y extracto de le-
vadura. Una vez inoculados, los medios deben incubarse a 35'C en una
atmósfera húmeda que contenga un 10% de CCy
Las colonias que aparecen en medio liquido tienen aspecto de bolas espon-
josas, mientras que las que se forman en agar son pequeñas y ligeramente trans-
lúcidas u opacas. Los variantes en lase L pueden aparecer eventualmente en los
medios solidos. Debido a que es una bactena relativamente con poca actividad
fisiológica, la identificación de S. monilitormis es compleía. Las pruebas bioquí-
micas deben realizarse utilizando como medio base caldo o agar con infusión de
corazón enriquecido con suero de caballo y extracto de levadura.
Sensibilidad a los antimicrobianos. S monililormis es sensible a la
penicilina. También pueden utilizarse los aminoglucósidos o la tetraciclina
para tratar las lormas L.
Prevención y control. Puesto que entre un 10% y un 65% de las ratas
están infectadas por el microorganismo, el control de estos animales y las pre-
cauciones para evitar sus mordeduras representan las únicas estrategias efi-
caces para el control y prevención de la enlermedad.
Bacterias anaerobias
Es importante recalcar que las bacterias anaerobias representan el compo-
nente principal de la microbiota autóctona de la piel y de las membranas muco-
sas (véase Tabla 50-1). Por tanto, el aislamiento e identificación de estos micro-
organismos dependen en gran medida de la correcta selección y recogida de las
muestras, asi como del transporte de éstas hasta el laboratorio en condiciones
adecuadas. Las infecciones por anaerobios son con frecuencia polimicrobianas,
ya que en las mismas pueden estar implicadas, simultáneamente, vanas espe-
cies de bacterias anaerobias, o bien de anaerobias con anaerobias facultativas.
En consecuencia, la primera tarea a la hora de examinar un cultivo incubado en
condiciones de anaerobiosis es poder diferenciar los microorganismos anaero-
bios estrictos de los facultativos, ya que todos ellos habrán crecido en esas con-
diciones. El analista experto puede reconocer las especies anaeróbicas que se
aislan con mayor frecuencia, en base a las características morfológicas de las
colonias y de los microorganismos observados bajo tinción, y llevar a cabo una
identificación presuntiva mediante unas pocas pruebas adicionales. La identili-
cación definitiva se basa en la realización de pruebas bioquímicas adicionales,
en la determinación de características genéticas y fisiológicas y en ensayos de
patogenicidad y neutralización de toxinas.
El grado de identificación de los microorganismos anaerobios varia de
acuerdo con el equipo disponible y la experiencia, el interés del personal de labo-
ratorio y del equipo médico y la utilidad clínica de la información disponible del
laboratorio.
Definiciones y características. Una bacteria anaerobia necesita una
atmóslera con una baja tensión de oxigeno para poder crecer, y es incapaz de
desarrollarse en la superficie de un medio sólido en una atmósfera ambiental
normal enriquecida con un 10% de CO.. Un anaerobio facultativo es capaz de
crecer en ambas situaciones. El término microaerótilo. que no tiene una defini-
ción estncta. se aplica a ciertas bactenas. normalmente las especies de los
géneros Campylobactery Streptococcus, que sólo se desarrollan en una atmós-
fera con un bajo contenido en oxígeno y una concentración de dióxido de car-
bono aumentada.
Patogenia y factores de virulencia. Excepto en el caso de los closlri-
dios, se sabe poco sobre los factores que determinan la virulencia y la pato-
los miembros de la familia Bacteroidaceae se han identificado diferentes acti-
vidades biológicas (endotoxina, proteasas. hepannasa) que podrian jugar un
papel en este contexto. El polisacárido capsular de Bacteroides Iragilis favo-
rece la formación de abscesos. Por otro lado, las especies del género Ctos-
tridium producen exotoxinas muy potentes que incluyen factores letales y
necrotizantes. hemolisinas. lecitinasas, gelatinasas y hialuronidasas.
Mientras que las infecciones e intoxicaciones por clostridios pueden lener un
ongen tanto exógeno como endógeno, las causadas por otros microorganismos
anaerobios se originan endógenamente, a partir de la propia microbiota anae-
robia normal presente en una membrana mucosa contigua, cuya integridad ha
sido dañada por una intervención quirúrgica, traumatismos, utilización de ms-
 CAPÍTULO 50 • BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Irumental medico o por un lumor. Para que se inicie el proceso infeccioso cau-
sado por anaerobios es esencial que el potencial de oxidorreducción disminuya
en el te|ido afectado, lo que puede ser consecuencia de la interrupción del apor-
te sanguíneo o de la multiplicación de otras bactenas en la zona.
Sin lugar a dudas, las infecciones e intoxicaciones por clostridios son de la
mayor importancia, aunque recientemente se ha reconocido el papel que jue-
gan otros microorganismos anaerobios como agentes causales de celulitis y
mionecrosis. La mayoría de aislamientos de Clostridium pertringens efectua-
dos en el entorno hospitalario son consecuencia de simples contaminaciones
de heridas. En estos casos, las bacterias se multiplican en los restos celula-
res, en un hematoma o en tejido necrótico sin que se observe sintomatología
clínica alguna. La celulitis anaerobia es una patología que produce necrosis
en los tejidos blandos. Su inicio es gradual, pero puede extenderse rápida-
mente. Aunque se forma gas. la infección no afecta al tejido muscular. Ade-
más de clostndios, o en su lugar, en la celulitis anaerobia pueden estar impli-
cados también cocos anaerobios y bacilos gramnegativos anaerobios.
En contraste con la celulitis anaerobia, la gangrena gaseosa o mionecrosis
clostridial es un proceso invasivo agudo y de rápida progresión que provoca
grandes alteraciones en el músculo. Es de la mayor trascendencia el distin-
guir entre celulitis anaerobia y gangrena gaseosa para evitar la realización de
intervenciones terapéuticas quirúrgicas agresivas y mutilantes, innecesarias
en el primer caso.
Los clostridios histotóxicos asociados con la gangrena gaseosa incluyen
C. perlnngens. C. novyi. C. septicum, C. histolyticum. C. sporogenes y C. bifer-
mentans. Mientras que C. pertringens es la especie que está implicada con
mayor frecuencia como agente causal de gangrena gaseosa, la prevalencia
de las otras variedades en el proceso varía ampliamente.
El tétanos y el botulismo son intoxicaciones más que infecciones, debido a
que las manifestaciones clínicas de ambas enfermedades están relacionadas
con la elaboración de potentes neurotoxinas por parte de los microorganis-
mos implicados en las mismas. El botulismo está relacionado muy a menudo
con la ingestión de alimentos elaborados en casa que han sido preparados o
envasados inadecuadamente; de todos modos, también se han detectado
brotes esporádicos de la enfermedad asociados con la ingestión de alimentos
preparados comercialmente o con la infección de heridas por el microorga-
nismo (C botulinum). El período de incubación del botulismo es corto; los sín-
tomas y signos clínicos aparecen entre 18 y 36 horas después de la ingestión
del alimento contaminado. De los siete tipos de toxina botulínica conocidos, el
tipo A es el más común, seguido por los tipos B, E y F en los casos de intoxi-
cación alimentaria en EE.UU. La toxina es absorbida a nivel del tubo digesti-
vo, y más raramente a partir de la herida infectada, fijándose en último térmi-
no a las terminales nerviosas motoras, impidiendo la liberación de acetilcolina
y la transmisión del impulso nervioso.
El tétanos se presenta típicamente en personas no inmunizadas dentro de
las dos primeras semanas siguientes al momento de haber sufrido heridas,
pinchazos o abrasiones de origen traumático, aunque también se han descri-
to casos tras intervenciones quirúrgicas y dentales, después de un parto o un
aborto, o en situaciones de estasis y úlceras de decúbito. La toxina, denomi-
nada tetanoespasmina, es transportada hasta los gangliósidos en el SNC por
medio de los torrentes linfático y circulatorio, y por migración a través de los
espacios penneurales de los nervios periféricos.
Clostridium difficile es la causa principal de diarrea de origen nosocomial y el
responsable primario de la colitis seudomembranosa. También provoca, aunque
mucho más raramente, abscesos, infecciones de las hendas, osteomielitis,
pleuritis, peritonitis, septicemia e intecciones de las vias urinarias. El porcenta-
je de portadores de C. difficile (y de las toxinas que produce) es elevado (50%
o más) en neonatos, aunque los casos de enfermedad son raros (Bartlett,
1997). La colonización, con o sin producción de toxina, puede mantenerse
durante varios meses, pero cuando la microbiota intestinal adulta se ha esta-
blecido entre los 6 y 12 meses de edad, los porcentajes de colonización caen
drásticamente y sólo un 3% de los adultos sanos se encuentran colonizados
por el microorganismo. Las personas hospitalizadas que están recibiendo tra-
tamiento con antibióticos y resultan infectadas por C. difficile adquieren casi
siempre el microorganismo tras una exposición directa o indirecta con algún
reservorio humano o inanimado del mismo. Aunque las penicilinas y las cefa-
losporinas son los antibióticos que aparecen asociados más frecuentemente
con esta situación, cualquier antibiótico puede, en potencia, desencadenar la
1117
patología asociada con C. difficile. Raramente la enfermedad aparece sin que
haya existido un tratamiento previo con antibióticos, aunque se han descrito
casos asociados con tratamientos con agentes antineoplásícos que poseen
también actividad antimicrobiana. La colitis seudomembranosa es una enfer-
medad mediada por la acción de toxinas y en la que no parece existir invasión
de la mucosa intestinal por el microorganismo. C. difficile produce dos toxinas
diferentes. La toxina A, una toxina débilmente citopática, es responsable de la
actividad enterotóxica de la bacteria. La toxina B. una potente cilotoxina. pare-
ce jugar un papel poco relevante en la enfermedad humana, aunque a partir de
pacientes sintomáticos se han aislado cepas de C. difficile incapaces de sinte-
tizar toxina A, pero que producen toxina B (Johnson, 1998).
Como ya se ha mencionado previamente, otras bacterias anaerobias, parti-
cularmente los cocos anaerobios y los bacilos gramnegativos. se han asocia-
do con la celulitis anaerobia además o en lugar de las especies histotoxicas
de Clostridium. Estas bacterias forman parte de la microbiota autóctona de las
membranas mucosas de la cavidad oral y de los tractos gastrointestinal y geni-
tourinario. Como tales se encuentran en neumonías por aspiración, abscesos
pulmonares, empiemas, abscesos e infecciones intraabdominales, abscesos
pélvicos y cerebrales y bacteriemias. Las infecciones intraabdominales por
anaerobios suelen aparecer como consecuencia de intervenciones quirúrgicas
en abdomen y colon y se asocian con el grupo de Bacteroides fragilis. Las
bacteriemias por anaerobios, clínicamente significativas, también son cau-
sadas frecuentemente por esta bacteria.
Diagnóstico de laboratorio. La identificación de las bacterias anaero-
bias hasta el nivel de especie puede ser una tarea bastante compleja; sin
embargo, el grado hasta el que debe caracterizarse un aislamiento de un
microorganismo anaerobio varia ampliamente y puede limitarse a obtener tan
sólo aquella información básica que sea de utilidad clínica. Por ejemplo, la
microbiota mixta presente en una lesión como una úlcera de decúbito, una fís-
tula perirrectal o un absceso intrabdominal puede caracterizarse simplemen-
te como microbiota fecal mixta, sin necesidad de tener que identificar a cada
uno de sus integrantes individuales. La identificación de un aislamiento hasta
el nivel de especie puede circunscribirse exclusivamente a aquellos microor-
ganismos que se obtienen en cultivo puro a partir de muestras y fluidos orgá-
nicos procedentes de localizaciones del cuerpo habitualmente estériles, y
puede llevarse a cabo con bastante facilidad mediante diversos sistemas
comerciales de pruebas bioquímicas o utilizando la cromatografía de gas-
liquido. Hay que entender que el valor clínico de cualquier informe sobre la
detección de bacterias anaerobias está directamente relacionado con la rapi-
dez con la que dicho informe es remitido desde el laboratorio. Aquellos proto-
colos de identificación que necesitan una o dos semanas para completarse
tienen, por lo general, un interés académico o básico solamente.
Debido a la rapidez con la que progresan y a su considerable morbilidad y
mortalidad, el diagnóstico inicial y tratamiento de las enfermedades causadas
por las especies de Clostridium deben basarse en las manifestaciones y sínto-
mas clínicos. En algunos pacientes de tétanos no es posible detectar la existen-
cia de una herida primaria. Cuando existe una herida, raramente se observan
microorganismos con la morfología típica de C. tetanien frotis teñidos, aun cuan-
do la bacteria pueda recuperarse por cultivo. Además, debido a que este micro-
organismo está ampliamente distribuido en la naturaleza, su aislamiento a partir
de una herida no implica necesariamente un diagnóstico positivo de tétanos. La
confirmación del botulismo en el laboratorio requiere la detección de la toxina en
el suero, las heridas, el contenido gástrico, las heces o el alimento sospechoso
de haber causado la enfermedad. Los métodos para llevar a cabo la extracción
de la toxina, así como las pruebas de neutralización en ratones, son técnica-
mente complejos: por tanto, es aconsejable que los especímenes apropiados
sean enviados al CDCde Atlanta para su examen y análisis. En este caso debe
hacerse una consulta telefónica previa para asegurarse de que las muestras han
sido obtenidas y transportadas correctamente y que las autoridades sanitarias
pertinentes han sido alertadas.
En los casos en los que existe sospecha de una celulitis anaerobia o una gan-
grena gaseosa, el laboratorio puede ser una ayuda valiosa para el diagnóstico
mediante el examen microscópico de las muestras de exudados o tejidos. El
hallazgo de bacilos grampositivos grandes, en número elevado, con la típica
morfología "boxear" (Lámina 50-6), permite una confirmación presuntiva del diag-
nostico. Los frotis teñidos pueden proporcionar también el diagnóstico de una
miositis estreptocócica anaerobia. También deben realizarse cultivos a partir de
 1118 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
muestras de exudados, tejidos y sangre. Una vez más, el grado de identifica-
ción varía considerablemente entre los distintos laboratorios: de todas formas,
C. perfríngens puede identificarse fácilmente por su morfología bajo tinción de
Gram. por la formación de una zona doble de hemolisis en agar sangre y por dar
una reacción de Nagler positiva en agar con yema de huevo. El diagnóstico de
laboratorio de la diarrea causada por C. difficile puede llevarse a cabo fácilmen-
te, detectando la presencia de toxina directamente en la muestra de heces
mediante enzimoinmunoensayo o bien por una prueba en cultivo de células.
Alternativamente, puede comprobarse la capacidad del microorganismo aislado
a partir de las heces para producir toxina.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de sensibilidad en el
caso de las bacterias anaerobias son generalmente innecesarias. La realización
de estas pruebas está indicada en aquellas situaciones clínicas en las que las
decisiones respecto a la selección de los agentes antimicrobianos son críticas
debido a: 1) fracaso de los regímenes terapéuticos habituales y persistencia de
la infección; 2) el papel clave de los agentes antimicrobianos para determinar la
evolución de la infección; 3) la dificultad para tomar decisiones terapéuticas
basadas en lo anterior. Los tipos de infecciones en las que deben realizarse
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos para los microorganismos aisla-
dos en cada una de ellas son los abscesos cerebrales, endocarditis, osteomie-
litis, infecciones de las articulaciones, inlecciones de dispositivos protéticos o
injertos vasculares y bacteriemia resistente o recurrente (NCCLS, 1997), Las
pruebas en estas circunstancias deben incluir a algunos miembros del grupo de
B. fragilis, otras especies de Bacteroides. algunas fusobacterias. C. períringens
y C. ramosum. Algunos agentes como el metronidazol, el cloranfenicol, el imi-
penem, la ampicilina-sulbactam y ticarcílina-clavulánico son casi siempre efica-
ces frente a las bacterias anaerobias, por lo que no es necesario comprobar su
actividad con fines clínicos. Por tanto, los estudios de sensibilidad deben limi-
tarse a otros agentes alternativos cuya eficacia es impredecible, como la peni-
cilina, una penicilina de amplio espectro con actividad frente a pseudomonas.
clindamicina. cefoxitina, cefotelán, y las cefalosporinas de tercera generación.
Aunque el método de dilución en agar ha sido recomendado como método de
referencia, las pruebas en el laboratorio clínico se llevan generalmente a cabo
mediante microdilucíón o el método E-test.
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 CAPÍTULO 51

Pruebas de sensibilidad in vitro

BiSr m a los antimicrobianos
Michael B. Smith, M.D.
Gail L. Woods, M.D.

DEFINICIONES 1119 ANÁLISIS DE ANTIMICROBIANOS 1127

INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS Indicaciones

DE SENSIBILIDAD 1120 Recogida de muestras
SELECCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS 1120
Métodos
MÉTODOS 1123
Interpretación
Método de dilución BIBLIOGRAFÍA 1129
Método de difusión en disco
E-test
Consideraciones técnicas
Sistemas de análisis
PRUEBAS BACTERICIDAS 1125

Concentración mínima bactericida o letal

Estudios de la tasa de muertes
Estudios bactericidas del suero

La selección de un antimicrobiano depende de numerosos factores, entre
los que se incluyen el lugar de la infección: diversos factores del huésped,
como el estado de los mecanismos de defensa inmunológica, el estado de la
función renal y/o hepática y la historia de reacciones alérgicas: las caracte-
rísticas de absorción del antimicrobiano y su vía de excreción: las propieda-
des farmacocinéticas y la posologia del antimicrobiano: la experiencia perso-
nal con respecto al antimicrobiano; la sensibilidad local y los patrones de
resistencia; los costes de adquisición y la administración del antimicrobiano y
la sensibilidad del microorganismo (rente al antimicrobiano. A pesar de que la
selección del tratamiento inicial para una infección se efectúa a menudo de
una manera empírica, la disponibilidad de pruebas de sensibilidad contribuye
de modo adecuado al ajuste de la dosis inicial administrada o bien a la modi-
ficación del tratamiento existente por las siguientes razones: 1) el microorga-
nismo infectante es resistente al antimicrobiano que se está administrando.
2) la dosis del antimicrobiano administrada inicialmente puede ser modificada
y 3) el antimicrobiano puede ser reemplazado por otro igualmente eficaz pero
de más bajo coste.
DEFINICIONES
Existen diversas categorías de pruebas utilizadas para determinar la activi-
dad antimicrobiana. La primera categoría está representada por la prueba de
dilución y la prueba de difusión con disco, que valoran la actividad inhibidora
de un antimicrobiano frente a un microorganismo determinado. En la segun-
da categoría se encuentran las pruebas que determinan la actividad letal de
un antimicrobiano (bactericida o fungicida) frente a un determinado microor-
ganismo. Una tercera categoría de pruebas se refiere a la determinación de
la actividad (5-lactamasa en un determinado microorganismo, como elemento
pronóstico de su sensibilidad frente a algunos antibióticos |5-lactámicos. En la
cuarta categoría se encuentran las pruebas para determinar directa o indirec-
tamente la cantidad de antimicrobiano en un líquido biológico, habitualmente
el suero. En esta categoría se incluyen las pruebas bactericidas séricas y los
estudios específicos de antimicrobíanos.
Las bacterias suelen describirse como sensibles, de sensibilidad interme-
dia o resistentes a los antimicrobianos. Las definiciones de estas categorías
interpretativas han sido proporcionadas por los procedimientos recomenda-
dos para las pruebas de difusión con disco y de dilución, publicadas por el
National Committee for Clinical Laboratory Standards {NCCLS M2-A6.1997;
NCCLS M7-A4.1997). La sensibilidad implica que la infección producida por
un microorganismo puede tratarse adecuadamente con la dosis del anlimi-
crobiano recomendado para este tipo de infección y de microorganismo infec-
tante, excepto en aquellos casos en los que esté contraindicado por otras
razones. Una sensibilidad intermedia supone que la infección debida a un
microorganismo puede ser tratada mediante concentraciones alcanzables de
determinados antimicrobianos cuando se administran éstos en dosis más
altas o cuando las infecciones se encuentran en regiones del organismo don-
de se concentran los antimicrobianos (p. ej.. la orina). La categoría interme-
dia proporciona una "zona tampón" para impedir que se produzcan discre-
pancias importantes en la interpretación debidas a pequeños factores
técnicos no controlados. La resistencia supone que la infección producida por
un microorganismo no responderá o responderá de forma inadecuada al anti-
microbíano. Hay que tener en cuenta que la actividad antimicrobiana m vivo
depende de muchos factores, entre los que se incluyen la dosis, la vía de
administración, los sistemas defensivos del huésped, el volumen de distribu-
ción del antimicrobiano. las características de absorción y de excreción del
antimicrobiano, la existencia de una insuficiencia renal o hepática establecida
o en desarrollo y las reacciones adversas al anlimicrobiano. Por consiguien-
 1120 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGIA MEDICA
te, las categorías de interpretación sólo proporcionan estimaciones de la acti-
vidad antimicrobiana in vivo.
INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
Las indicaciones para la realización de las pruebas de sensibilidad varían
en función del microorganismo. Por ejemplo, el estudio de sensibilidad está
indicado en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento
rápido, clínicamente significativas y con una sensibilidad imprevisible a los
antimicrobianos de elección. En general, la prueba de sensibilidad no es
necesaria cuando se sabe que el microorganismo es sensible al antímicro-
biano de primera elección. En EE.UU., esto sucede con los aislamientos de
Streplococcus pyogenes. que hasta la fecha son universalmente sensibles a
la penicilina. Sin embargo, si el paciente es alérgico al antimicrobiano de elec-
ción, es razonable que se estudie su sensibilidad a antimicrobianos alternati-
vos, como la eritromicina en el caso del S. pyogenes. El estudio de aisla-
mientos que de modo característico son considerados "contaminantes" o
"flora normal" es caro, conlleva mucho tiempo y puede dar lugar a una admi-
nistración innecesaria de antimicrobíanos (Bates, 1991); por ello no se reco-
mienda. De forma ocasional, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos,
estos "contaminantes" son verdaderos patógenos, siendo importante que el
clínico comunique estas circunstancias especiales al personal del laboratorio
para que se estudien apropiadamente. Otras situaciones en las que los estu-
dios de sensibilidad son útiles son los estudios epidemiológicos y las evalua-
ciones de nuevos antimicrobíanos.
Debido a los patrones variables de sensibilidad de las bacterias anaero-
bias, el Working Group on Anaerobio Anlimicrobial Susceptibility Teslmg ol Ihe
NCCLS ha recomendado que se estudie la sensibilidad de las bacterias anae-
robias aisladas de los siguientes tipos de infecciones: abscesos cerebrales,
endocarditis, osteomielitis, infecciones articulares, infecciones de prótesis
implantadas e injertos vasculares y en las bacteriemias refractarias o
recurrentes (NCCLS M11-A4, 1997). También deben estudiarse especies re-
sistentes o especialmente virulentas, como Bacleroidesde\ grupo Iragilis, Pre-
votelialPorphyromonas sp.. algunas especies de fusobacterias y clostridios.
Bilophilia wadsworthia y Bacteroides del grupo gracilis (NCCLS M11-A4.
1997). Por otra parte, el estudio de sensibilidad de las bacterias anaerobias
debe realizarse periódicamente para monitorizar los patrones de sensibilidad
en diversos centros y hospitales de EE.UU. y demás países, también para
determinar la sensibilidad a nuevos antimicrobianos.
Las indicaciones para el estudio de sensibilidad de Mycobacterium tuber-
culosis han cambiado debido al resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU. y
a la aparición de cepas multirresistentes. Actualmente se recomienda que los
aislamientos iniciales de lodos los pacientes sean valorados y que el estudio
se repita si la muestra de esputo continúa presentando un cultivo positivo tras
tres meses de terapia (Tenover, 1993a). No existen pautas sólidas respecto al
estudio de sensibilidad de micobacterias atípicas.
Durante los últimos años se ha incrementado la prevalencia de las infec-
ciones fúngicas sistémicas. sobre todo en inmunodeprimidos, y se han des-
arrollado nuevos antifúngicos. Por otra parte, se ha descrito la resistencia
de ciertos hongos a la terapia tradicional (como Candida lusilanae, resis-
tente a la anfotencma B): debido a un aumento en la utilización de los azo-
les. especialmente el fluconazol. han aparecido levaduras resistentes a
estos antimicrobianos (sobre todo especies de Candida). Como resultado
se ha incrementado el interés en el estudio de sensibilidad de los antifúngi-
cos. Se creó el NCCLS Subcommitlee on Antiíungal Susceplibility Testing
para evaluar la necesidad de una selección de paulas en la terapia antifún-
gica que ayude al laboratorio. Reuniendo datos se estableció una necesi-
dad, ante la cual el subcomité desarrolló un método de referencia de macro-
dilución en caldo y una adaptación de microdilución para el estudio de
levaduras (especies de Candida y Cryplococcus neoiormans) que producen
infecciones sistémicas (NCCLS M27-A, 1997). De modo similar, para eva-
luar la sensibilidad a los antifúngicos se ha desarrollado un procedimiento
de macrodilución en caldo y una adaptación de microdilución utilizando
conidias o esporangiosporas de hongos filamentosos, como especies de
Aspergillus. especies de Fusarium. especies de Rhizopus. Pseudoallesche-
ña boydií y la forma micelar de Sporothrix schenckii (NCCLS M38-P. 1998).
A pesar de que se han descrito procedimientos para la valoración de la anfo-
tericina B. la flucitosma y los azoles. no se han establecido los puntos de
corte. Tampoco se ha establecido la utilidad clinica del estudio de la sensi-
bilidad de levaduras y hongos filamentosos.
SELECCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS
La selección de anlimicrobianos para estudios de sensibilidad (Tabla 51-
1) se ha complicado debido a la ampliación de su espectro de actividad y
del número de compuestos dentro de las clases de antimicrobíanos del
mismo espectro. |unto a las nuevas clases de antimicrobíanos (NCCLS
M100-S9. 1999). El estudio de todos los compuestos disponibles no es
necesario ni práctico. El proceso de selección comienza en el Pharmacy
and Therapeulics Commitlee. que selecciona los antimicrobíanos para la
guia de fármacos de uso hospitalario. El objetivo será coordinar los antimi-
crobianos de la guía que deben estudiarse o informarse. Esta coordinación
tiene hoy en día una gran importancia por diversas razones. En primer
lugar, la mayoría de los laboratorios utilizan paneles de microdilución pre-
parados comercialmente para el estudio de la sensibilidad antibacteriana.
Los fabricantes ofrecen una diversidad de paneles que se diseñan para
corresponderse tanto como sea posible con los antibacterianos de las
guías hospitalarias A pesar de la variedad de paneles disponibles, existe
con frecuencia disparidad entre los antimicrobianos de los paneles y los de la
guía hospitalaria, por lo que el laboratorio debe enfrentarse la tarea de estu-
diar más de un panel para un microorganismo determinado o pagar un precio
suplementario para disponer de un panel, de acuerdo con las especifica-
ciones del hospital. Sin embargo, en muchos casos se estudian más anti-
microbianos de los disponibles en la guía del hospital, por lo que el labora-
torio debe suprimir los resultados de los antimicrobíanos que no se
encuentran en ésta. En segundo lugar, generalmente no es necesario infor-
mar los resultados de los estudios de sensibilidad de muchos compuestos
que presentan el mismo espectro (p. ej., cefotaxima, ceftizoxima y ceftria-
xona), incluso aunque exista más de uno en la guia. En tercer lugar, exis-
te con frecuencia un retraso entre la aprobación del agente para su utiliza-
ción clínica y su incorporación en el producto comercializado de la prueba
de sensibilidad, debido a que los fabricantes de sistemas de pruebas de
sensibilidad antimicrobiana preparados comercialmente deben presentar
los datos a la Food and Drug Adminislration (FDA). validando la exactitud
de sus equipos frente a cualquier antímicrobiano aprobado recientemente.
En consecuencia, puede ser aprobado un nuevo antimicrobiano para la
guia del hospital antes de que el laboratorio tenga capacidad para estudiar
su actividad in vilro.
En las normas del NCCLS para el estudio de la sensibilidad por dilución
y difusión en disco se enumeran antimicrobianos que deben considerarse
para la valoración frente a enterobacterias, Pseudomonas. estafilococos,
enterococos, estreptococos no enterococos y Haemophilus (NCCLS M2-
A6, 1997; NCCLS M7-A4, 1997): sin embargo, el número de compuestos
enumerados en la agrupación primaria (grupo A) y en la agrupación secun-
daria (grupos B y C), que deben considerarse para las pruebas, sobrepasa
a menudo el número de los que deben estudiarse en un laboratorio deter-
minado. Los documentos del NCCLS enumeran la piperacilina. la mezloci-
lina y la ticarcilína en las agrupaciones primarias que deben estudiarse
frente a Pseudomonas. Puesto que se recomienda que las penicilinas acti-
vas frente a Pseudomonas no deben utilizarse individualmente (Gribóle.
1983) y dado que ningún estudio clínico de pacientes con enfermedades
graves (p. ej„ neutropenia febril) ha demostrado diferencias significativas
en los resultados entre regímenes terapéuticos combinados de diversas
penicilinas más un aminoglucósido, las diferencias en los grados de activi-
dad in vilro de las penicilinas activas frente a Pseudomonas no son clíni-
camente importantes y la selección de una penicilina activa frente a Pseu-
domonas para la guia (y, por tanto, para el estudio de la sensibilidad in
vilro) puede basarse en la lista de las indicaciones aprobadas para la utili-
zación de un compuesto del mismo espectro y sus costes de adquisición y
administración, relativos a cualquier otro miembro de la misma clase de
espectro. El ácido clavulánico incrementa el espectro de la ticarcilína fren-
te a enterobacterias y estafilococos productores de (Mactamasa mediada
 CAPÍTULO 51 • PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN varío A LOS ANTIMICROBÍANOS
por plásmidos. pero poco añade a la actividad antipseudomonas de la ticar-
cilína; no obstante, existen pocas diferencias entre las actividades antip-
seudomonas de la piperacilina y de la ticarcilína (con o sin ácido clavuláni-
co) con respecto a la concentración mínima inhibitoria (CMI) recomendada
por el NCCLS para definir la sensibilidad de Pseudomonas, es decir, menor
o igual a 64 ug/ml (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Una posi-
ble consideración es que a pesar de que los costes de adquisición por gra-
mo de ticarcilina-clavulánico pueden ser más elevados que los de una
penicilina antipseudomonas. los costes de la administración de ticarcilina-
1121
clavulánico más un aminoglucósido pueden ser menores que los de una
penicilina antipseudomonas más un aminoglucósido más oxacilina. Asi
pues, los costes de la administración pueden pesar significativamente más
que los costes de adquisición de un agente antibacteriano determinado. La
farmacocinética de cualquier antimicrobiano afecta de manera evidente los
costes de la administración, ya que un antímicrobiano con una vida media
prolongada puede administrarse en un régimen de dosificación menos fre-
cuente que otro antimicrobiano del mismo espectro antibactenano de acti-
vidad pero con una vida medía mas corta.
 1122 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Aunque en general existe consenso para estudiar la sensibilidad de
estafilococos y estreptococos a penicilina, de enterococos y enterobacte-
rias a ampicilina y de los estafilococos a oxacilina. hay menos acuerdo en
lo que se refiere a las cefalosporinas que deben estudiarse frente a las
bacterias gramposítivas y gramnegafivas. La cefalotina puede utilizarse
como representante de las cefalosporinas de primera generación, inclu-
yendo la cefazolina; sin embargo, se recomienda que la cefazolina no se
utilice como representante de clase para la cefalotina y otras cefalospori-
nas de primera generación, debido a la inaceptable tasa de falsas sensibi-
lidades para otras cefalosporinas, en especial por lo que se refiere a
Eschetichia coli (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Por tanto, la
cefazolina sólo debe estudiarse si es la clase representativa de la guia.
Existe bastante controversia respecto a la necesidad de estudiar las cefa-
losporinas de segunda generación y, en caso de hacerlo, cuáles deben
ensayarse frente a las enterobacterias. El cefotetán. la cefoxitina y el cefa-
mandol. el cefonicid o la cefuroxima se enumeran como antimicrobianos
primarios que hay que considerar para las pruebas en las instituciones en
las que existe resistencia endémica o epidémica frente a antimicrobianos
primarios (es decir, cefazolina o cefalotina) estudiados en la misma clase.
Una vez más, la selección depende de la existencia en la guía y de las indi-
caciones que han sido especificadas por el Pharmacy and Therapeutics
Commillee en cuanto a su utilización. Por ejemplo, el cefotetán o la cefoxi-
tina pueden estar disponibles en el hospital para el tratamiento de infec-
ciones por bacterias anaerobias y, en este caso, puede ser útil estudiarlas
frente a cualquier enterobacteria que pueda estar presente en una infec-
ción mixta aerobía-anaerobía. Por otra parte, es posible que en el hospital
se disponga de una o más cefalosporinas de segunda generación única-
mente como profilaxis perioperatoria; en este caso, tal vez sea innecesario
estudiarlas de forma sistemática.
La selección de cefalosporinas de tercera generación para estudiar su
sensibilidad no sólo se basa en las cefalosporinas que se encuentren en la
guía, sino también en la equivalencia de actividad in vitro. Por ejemplo,
entre cefoperazona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona y ceftazidima exis-
ten sólo pequeñas variaciones de actividad con respecto a las enterobacte-
rias. Por consiguiente, incluso en el caso de que en la guía existan más de
uno de estos compuestos, es posible estudiar sólo uno como representan-
te de los demás frente a las enterobacterias. La única excepción posible a
esta norma se refiere a las |5-lactamasas de espectro ampliado (ESBL) de
Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias. Estas |$-lactamasas media-
das por plásmidos onginan resistencia a las cefalosporinas, aunque no a
cefamicinas ni a imipenem (CTX-1 o TEM-3), o bien presentan actividad
preferencial frente a la ceftazidima (CAZ-1 o TEM-5 y CAZ o TEM-6) (Jar-
lier, 1988; Sirot. 1988; Sougakoff, 1988). La resistencia cruzada entre cefa-
losporinas de tercera generación se observa también en mulantes gramne-
gativos desreprimidos de (J-lactamasa de clase I, dado que el inoculo se ha
ajustado aproximadamente a 5 x 10" unidades formadoras de colonias
(UFC)/ml y la prueba se incuba durante un mínimo de 6 horas (Washington,
1988).
En muchos casos, en la guia del hospital se encontrará bien cefoperazona
o bien ceftazidima para el tratamiento de Pseudomonas. Por tanto, la princi-
pal cuestión reside en sí ambos antimicrobianos deben ser estudiados en el
laboratorio frente a las enterobacterias. con el fin de fomentar la limitación del
uso de cualquiera de ambos en el tratamiento de las infecciones por Pseudo-
monas y reducir el riesgo de la aparición de resistencia. La aparición de |i-lac-
tamasas mediadas por plásmidos con actividad preferencial frente a ceftazi-
dima, así como las |i-lactamasas mediadas por plásmidos preexistentes con
actividad frente a cefoperazona entre las enterobacterias, conducirá a una
política de limitación de las pruebas de sensibilidad de cefoperazona o cefta-
zidima frente a Pseudomonas.
Los laboratorios deberían considerar el estudio de sensibilidad de todos
los aislamientos de enterococos (rente a vancomicina, dada la aparición de
cepas resistentes (Livornese. 1992; HICPAC, 1995). No obstante, no todos
los sistemas automáticos detectan con fiabilidad la resistencia de los ente-
rococos frente a vancomicina: si se emplea uno de estos sistemas menos
fiables, se recomienda la inclusión de un método alternativo (difusión en dis-
co, estudio en agar o E-test) para asegurar unos resultados exactos (Sahm,
1991; Tenover, 1993b; Woods, 1993; Kohner, 1997; Endtz, 1998). Se deben
realizar estudios de resistencia elevada a gentamicina y a estreptomicina en
todos los aislamientos de enterococos procedentes de zonas estériles del
organismo, y debe informarse al clínico (quizás a través de un comentario
adjunto a los resultados de las pruebas de sensibilidad) de que está indi-
cada la terapia de combinación entre penicilina o ampicilina más un amino-
glucósido en las infecciones graves por enterococos. como la endocarditis.
Como sucede con la vancomicina, no todos los sistemas automáticos detec-
tan con habilidad la resistencia elevada a los aminoglucósidos. pudiendo ser
necesario investigar un método alternativo que se conozca que proporciona
resultados exactos (Wiley, 1992). El NCCLS aconseja estudiar la produc-
ción de [i-lactamasa en los enterococos aislados de sangre y liquido cefa-
lorraquídeo (LCR). Los antimicrobianos a considerar en el estudio de los
aislamientos urinarios de enterococos son ciprofloxacína (o bien levofloxa-
cina o norfloxacina), nitrofurantoína y tetracichna. Los resultados de las
pruebas de sensibilidad de los enterococos frente a cefalosporinas. amino-
glucósidos (excepto los estudios de resistencia elevada), clindamicma y Iri-
metoprim-sulfametoxazol pueden despistar y no deben informarse.
El estudiar o no e informar de la actividad del aztreonam. la ciprofloxacína
y el imipenem de forma periódica habitualmente reflejará su presencia en la
guía del hospital y, en caso de encontrarse, cualquier restricción en su uso (p.
ej., sólo mediante consulta de enfermedad infecciosa).
En cuanto a Haemophilus influenzae, el grupo primario de antimicrobia-
nos que hay que considerar en las pruebas de sensibilidad de los aisla-
mientos de sangre y LCR está formado por ampicilina. una cefalosporina de
tercera generación (cefotaxima. ceftazidima. ceftizoxima o ceftriaxona) y
cloranfenicol. Si la muestra procede de una infección localizada, que no
supone un riesgo para la vida, los antimicrobíanos a considerar incluyen
ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol. amoxicilina-clavulánico (o ampicili-
na-sulbactam), cefaclor y tetraciclina. Los resultados de las pruebas de
sensibilidad frente a ampicilina predicen la actividad de la amoxicihna. La
resistencia a ampicilina puede delectarse en la mayoría de casos por el
estudio de la producción de |5-lactamasa; sin embargo, existen cepas |5-lac-
tamasa negativas con resistencia cromosómica a ampicilina (BLNAR) (Men-
delman, 1984). Por tanto, si la prueba de la |3-lactamasa es negativa, la sen-
sibilidad a ampicilina puede confirmarse mediante la prueba de dilución o
difusión en disco si la incidencia de BLNAR es alta en la región del servicio
de análisis.
Debe estudiarse la resistencia a penicilina de todos los aislamientos de
Streptococcus pneumoniae procedentes de zonas estériles del organismo.
Si se realiza mediante la prueba del disco de oxacilina, los aislamientos
con un diámetro de halo menor o igual a 19 mm deben evaluarse adicio-
nalmente por un método de dilución para distinguir las cepas resistentes de
las de sensibilidad intermedia. La consideración de otros antimicrobianos
en el estudio de aislamientos procedentes de zonas estériles del organis-
mo varía en función del método de prueba utilizado. En pacientes con
infecciones que suponen un riesgo para la vida, como meningitis o bacte-
ríemias, el NCCLS recomienda el estudio de penicilina, cefotaxima, ceftria-
xona. meropenem y vancomicina. Se han proporcionado normas interpre-
tativas sobre métodos de dilución para estos antimicrobianos: sin embargo,
sobre métodos de difusión en disco sólo existen normas interpretativas
para penicilina y vancomicina; por tanto, los métodos de difusión en disco
sólo pueden utilizarse para estos dos últimos antimicrobíanos (NCCLS
M100-S9,1999). Los antimicrobíanos que hay que considerar en el estudio
de aislamientos procedentes de infecciones que no representan una ame-
naza para la vida incluyen penicilina (mediante la prueba del disco de oxa-
cilina), eritromicina y trimetoprim-sullametoxazol.
Con respecto a los estreptococos del grupo viridans. se debe analizar la
sensibilidad frente a penicilina de cualquier aislamiento implicado en endo-
carditis bacteriana o, con menor frecuencia, en meningitis (Goldfarb. 1984;
Oumn. 1988). Está justificado el estudio de sensibilidad de los estreptococos
del grupo viridans frente a las cefalosponnas consideradas para la terapia, ya
que pueden presentar resistencia relativa a las cefalosporinas de tercera
generación (Wilcox. 1993). La vancomicina es la alternativa recomendada a
los fármacos p-lactámicos, aunque no es necesario su estudio sistemático,
dado que no se ha informado de resistencia a vancomicina en este grupo de
microorganismos. Sin embargo, la valoración de la sensibilidad a vancomici-
na es útil para propósitos de identificación, pues la resistencia indicaría que el
 CAPÍTULO 51 • PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBÍANOS
microorganismo no es un estreptococo del grupo viridans, sino más proba-
blemente un miembro de los géneros intrínsicamente resistentes a vancomi-
cina. como Leuconosloc o Pediococcus.
Las pruebas habituales de sensibilidad de los aislamientos de Neissena
gonorrhoeae no son necesarias. El estudio de la producción de |l-lactamasa
en todos los aislamientos lúe importante en el pasado, pero no es muy reco-
mendado, dado que ni la penicilina ni la ampicilina están incluidas en los regí-
menes terapéuticos recomendados para las infecciones gonocócicas por el
Centers for Disease Control and Prevention (CDC. 1993). Sin embargo, la
determinación de la resistencia a penicilina puede ser útil para propósitos epi-
demiológicos. La prueba de la |i-lactamasa detecta la mayoría de aislamien-
tos resistentes a penicilina, aunque no determina algunas cepas con resis-
tencia cromosómica; por ello, la sensibilidad a penicilina de los aislamientos
IWactamasa negativos se debe confirmar mediante una prueba adicional,
como el método de difusión en disco.
Se ha incrementado la resistencia de las bacterias anaerobias a los anti-
microbíanos. Ejemplos de esto incluyen, entre otros, el aumento de resis-
tencia de Bacteroides spp. frente a clíndamicina y a (Mactámicos. Las bac-
terias anaerobias todavía muestran un alto porcentaje de sensibilidad a
metronidazol, cloranfenicol, imipenem. ampicilina-sulbactam y ticarcilina-
clavulánico; no obstante, la decisión de estudiar una bacteria anaerobia
frente a un determinado antimicrobiano debe hacerse en función de la espe-
cie bacteriana y de la situación clínica (NCCLS M11-A4.1997). No existe un
acuerdo sobre la eficacia clínica de cieñas cefalosporinas nuevas ni sobre
la posibilidad de evaluar in vitro la respuesta clínica (NCCLS M11-A4,1997).
La prueba de la |J-lactamasa (cefalosporina cromogénica) se ha empleado
para predecir la resistencia a penicilina y ampicilina. sin embargo, la resis-
tencia frente a |i-lactámicos de algunas especies no está mediada por [i-
lactamasas. lo cual limita su utilidad para anaerobios. Los estudios con el
propósito de establecer los patrones de sensibilidad local deben limitarse a
los antimicrobianos de la guía.
Los antituberculosos primarios que se deben estudiar en los aislamientos
de Mycobacterium tuberculosis son isoniacida. rifampicina. etambutol y pira-
zmamida. Si se sospecha la resistencia a uno o más de estos fármacos,
deben realizarse pruebas adicionales de sensibilidad frente a antimicrobia-
nos, incluyendo estreptomicina, etionamida, canamicina. capreomicina, rifa-
butina, ofloxacina y cicloserina (Tenover, 1993a). Se recomienda el estudio
de resistencia a macrólidos de los aislamientos clínicamente signilicativos de
Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), sobre todo si el paciente ha reci-
bido previamente terapia con macrólidos para una infección por MAI o no se
conoce su terapia previa (Wallace, 1997). En cuanto a las levaduras, las nor-
mas del NCCLS incluyen información sobre el estudio de ciertos antifúngi-
cos. aunque sólo se dispone de puntos de corte interpretativos en las prue-
bas de sensibilidad de especies de Candida frente a fluconazol y flucitosma
(NCCLS M27-A, 1997).
MÉTODOS
Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana pueden clasificarse de acuerdo
al resultado final que hay que determinar. El resultado final de la mayoría de
pruebas realizadas en el laboratorio clínico es la inhibición. Existen indicacio-
nes limitadas para la determinación de actividad bactericida in vitro. La activi-
dad inhibitoria normalmente se determina mediante una técnica de dilución o
de difusión en disco.
Método de dilución
En la prueba de dilución, el microorganismo es inoculado en una serie de
tubos o pocilios que contienen una serie de concentraciones que suelen
comenzar con una potencia de 2 (p. ej., 128 ug/ml) y disminuye en una base
log., (p. ej., 64. 32. 16. 8, 4) hasta la concentración más baja estudiada. La
concentración más baja que inhibe el crecimiento visible se denomina con-
centración mínima inhibitoria o CMI. Por conveniencia y economía, se ha
hecho cada vez más frecuente limitar los intervalos de las concentraciones de
cada antimicrobiano estudiado a aquellas concentraciones que comprenden
las equivalentes a las categorías sensible y resistente En algunos casos, las
1123
placas de microdilución preparadas comercialmente sólo contienen una única
concentración de antimicrobiano, que se utiliza para distinguir entre las cate-
gorías sensible y resistente. La mayoría de las cepas de referencia utilizadas
para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad son muy sensibles a
los antimicrobianos adecuados, por lo que la limitación de las concentracio-
nes de los antimicrobianos plantea problemas extraordinarios en el control de
calidad. En otras palabras, los intervalos aceptables de CMI para una cepa
determinada de referencia frente a un antimicrobiano determinado pueden
estar varias log de diluciones por debajo de la concentración más baja pre-
¿
sente para ese antimicrobiano del sistema de la prueba de sensibilidad. Este
problema aumenta la responsabilidad del fabricante en el control de calidad
del sistema de la prueba de sensibilidad.
Método de difusión en disco
En la prueba de difusión en disco, cuya utilización eslá en gran parte limi-
tada a bacterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rápido,
se aplica un disco de papel que contiene una cantidad especificada (no con-
centración) del antimicrobiano en una superficie de agar que ha sido recien-
temente inoculada con un microorganismo El antimicrobiano difunde en el
medio a partir del disco, originando un halo de inhibición hasta el punto en
el cual una concentración crítica del antimicrobiano inhibe el crecimiento del
microorganismo en un tiempo determinado (habitualmente de 18 a 24
horas). Se mide el diámetro del halo de inhibición y se relaciona de manera
inversa con la CMI (es decir, cuanto más grande es el diámetro del halo de
inhibición, más baja es la CMI y viceversa). En condiciones ideales, la rela-
ción entre las dos pruebas puede ser expresada mediante una línea de
regresión: los equivalentes de sensibilidad y resistencia del diámetro del
halo para un antimicrobiano determinado pueden extrapolarse a partir de
sus intercesiones en la línea de regresión con las correspondientes CMI uti-
lizadas para definir la sensibilidad y la resistencia.
E-test
El E-test es un método de dilución basado en la difusión de un gradiente
continuo de concentración de un antimicrobiano a partir de una tira de plásti-
co en un medio de agar. La tira de plástico, que tiene una concentración pre-
definida de fármaco seco y estabilizado en una cara y una escala de CMI
interpretativa en la otra, se coloca en la superficie del medio de agar inocula-
do con el microorganismo a estudiar. La placa se incuba según la atmósfera
y el tiempo requeridos por el microorganismo en cuestión. Tras la incubación,
se forma una elipse de inhibición del crecimiento alrededor de la tira: la CMI
se lee en el punto de la escala donde la elipse cruza la tira Dado el coste de
estas tiras, puede no ser práctica la selección del E-test como método pnma-
no para el estudio de sensibilidad. Sin embargo, el E-lest es una alternativa
valiosa para el estudio de sensibilidad de bacterias de difícil crecimiento,
como S. pneumoniae o Haemophilus influenzae, también de algunos antimi-
crobianos clave frente a anaerobios (Jorgensen. 1994; Sanchez. 1992).
Consideraciones técnicas
Se lleven a cabo pruebas de dilución o de difusión, la estandarización de la
técnica y el medio utilizado en ésta son de máxima importancia para obtener
resultados exactos y reproducibles. En EE.UU., las organizaciones profesio-
nales, la industria y el gobierno han trabajado de forma consensuada dentro
del NCCLS con el fin de elaborar una serie de documentos que describen pro-
cedimientos estandarizados para estudiar la sensibilidad de bacterias aero-
bias y anaerobias facultativas (NCCLS M2-A6. 1997; NCCLS M7-A4,1997),
bacterias anaerobias (NCCLS M11-A4,1997). micobacterias (NCCLS M24-T,
1995) y hongos (NCCLS M27-A, 1997), Estas técnicas deben estar disponi-
bles en los laboratorios clínicos de referencia y proporcionar los detalles téc-
nicos concernientes a la realización de las pruebas de sensibilidad. El Sub-
committee on Antimicrobial Susceptibility Testing revisa y modifica las tablas
de los documentos cada año y los textos de los documentos cada tres años.
Por tanto, los laboratorios deben asegurarse de que están empleando las
tablas y los textos más actuales y de que las revisiones se incorporen a la
práctica de laboratorio.
 1124 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Medio
Una variable importante de los estudios de sensibilidad es la composición
del medio. En la actualidad, el NCCLS recomienda el medio Mueller-Hinton
para el estudio de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, ya que pre-
senta una buena reproducibilidad entre distintos lotes: tiene una concentra-
ción baja de inhibidores de sulfonamida, trimetoprim y tetraciclina y permite el
crecimiento de la mayoría de patógenos bacterianos que no son de difícil creci-
miento. Algunas bacterias, sobre todo estreptococos, no crecen bien en
medios de Mueller-Hinton no suplementados, un problema que se supera
mediante la suplementación con sangre desfibrinada de cordero, caballo u
otro animal a una concentración final del 5% (v/V).
Varios componentes o suplementos del medio Mueller-Hinton pueden
afectar a los resultados de la prueba de sensibilidad. En los métodos de
dilución y de difusión en disco, las variaciones en la concentración de catio-
nes divalentes, sobre todo calcio y magnesio, afectan a los resultados del
estudio de Pseudomonas aerugmosa frente a aminoglucósidos y colistína, así
como de otras bacterias frente a tetraciclina. Una concentración catiónica ele-
vada causa falsas resistencias, mientras que un contenido catiónico bajo pre-
senta el efecto contrario (Barry. 1987, 1992: NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS
M7-A4,1997). El pH del medio debe estar entre 7,2 y 7,4. Un pH por debajo
de este intervalo origina la pérdida de potencia de fármacos como los amino-
glucósidos y los macrólidos, mientras que otros (p, ej., las penicilinas) apa-
rentan tener una mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se produce el
efecto contrario.
En los métodos de dilución en caldo, se recomienda el suplemento del
caldo Mueller-Hinton con NaCI al 2% para mejorar la detección de estafilo-
cocos resistentes a oxacilina (NCCLS M7-A3. 1993b). La detección de
resistencia heterogénea en la que menos del 0,01% de las bacterias expre-
san el rasgo de resistencia se incrementa con la adición de sal al medio. Un
método alternativo para la detección de resistencia a oxacilina de los esta-
filococos consiste en la utilización de agar Mueller-Hinton suplementado
con NaCI al 4% y la incorporación de 6 ug de oxacilina por mililitro (Cham-
bers. 1988).
Otras cuestiones referentes a los medios están relacionadas con las prue-
bas de sensibilidad de H. influenzae. para el cual se recomienda el medio
para pruebas con Haemophilus (HTM) (NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4,
1997), y las pruebas de N. gonorrhoeae. para el que se recomienda una base
de agar GC. El medio Mueller-Hinton. tan desprovisto de timidina como sea
posible, es importante para la determinación exacta de la sensibilidad bacte-
riana a trimetoprim/sulfametoxazol. Algunas especies pueden utilizar la timina
o timidina del medio para evitar el mecanismo de acción del trimetoprim y las
sulfonamidas, dando lugar a falsas resistencias. Se puede incorporar al medio
timidina tosforilasa o sangre lisada de caballo para mejorar la fiabilidad del
estudio de trimetoprim y sulfametoxazol. Con un medio libre de timidina se
obtienen resultados exactos de las pruebas de sensibilidad con microorga-
nismos distintos de los enterococos. Para anaerobios, la dilución en agar
empleando agar Brucelia suplementado con sangre lacada y vitamina K
(método Wadsworth) es el método de referencia (NCCLS. M11-A4,1997). Se
ha seleccionado la sangre Brucelia en lugar del agar Wilkins-Chalgren em-
pleado en el pasado, debido a su capacidad superior para permitir el creci-
miento de anaerobios de dilícil crecimiento. Para el estudio de sensibilidad de
anaerobios, no se recomiendan ni el método de difusión disco-placa ni los
métodos de elución disco-caldo, ya que presentan una pobre correlación con
el método de dilución en agar de referencia. El método de microdilución utili-
zando caldo de Schaedler, Brucelia, West-Wilkins, inlusíón cerebro-corazón o
un caldo con la misma formulación que el agar Wilkins-Chalgren, pero sin
agar. es más práctico para su empleo en el laboratorio clínico que el método
de referencia (NCCLS, M11-A4.1997). También puede utilizarse el E-test.
Existen otros factores relacionados con el medio que influyen sobre la difu-
sión en disco. Por ejemplo, el grosor del agar debe ser de 4 mm. Si el agar es
demasiado ancho puede originar falsas resistencias, mientras que si no lo es
bástanle pueden aparecer falsos resultados sensibles. Las concentraciones
de ciertos cationes divalentes pueden afectar los resultados de las pruebas de
sensibilidad, como el magnesio y el calcio en el estudio de Pseudomonas
aeruginosa frente a tetraciclina y aminoglucósidos. Cuando el agar Mueller-
Hinton se suplementa con sangre, los diámetros de halo para oxacilina y meti-
cilina pueden ser de 2 mm a 3 mm inferiores a los obtenidos sin el suple-
mento. La sangre de cordero puede causar diámetros de halo imprecisos alre-
dedor de los discos de trimetoprim y sulfonamida o una película de creci-
miento dentro del halo de inhibición.
Inoculo
Las variaciones del tamaño del inoculo son responsables de las mayores
variaciones diarias en los resultados de las pruebas de sensibilidad. La utili-
zación del inoculo adecuado es especialmente importante en la delección
exacta de resistencia a penicilina y oxacilina en los estafilococos, asi como a
penicilinas de amplío espectro y cefalosporinas en mulantes gramnegativos
con (Vlactamasa de clase I desreprimida (p. ej., Enlerobacter, Cilrobacter.
Pseudomonas). El NCCLS recomienda una suspensión 0,5 de McFarland
(18 2x10* UFC/ml) para la dilusión disco-placa y la dilución de una sus-
S
pensión 0,5 de McFarland hasta una concentración linal de 5 x 10 UFC/ml
para la dilución en caldo (NCCLS M2-A6.1997: NCCLS M7-A4,1997). En los
laboratorios que utilizan sistemas de microdilución se observa a menudo una
elevada tasa (del 20% al 40%) de sensibilidad de Enterobacter cloacae a
ampicilina. Esta observación siempre se debe al empleo de una cantidad
demasiado pequeña de inoculo. En consecuencia, es necesario que los usua-
rios de sistemas de microdilución incluyan entre sus métodos de control de
calidad la cuantificación de su inoculo de una manera regular. La sensibilidad
de Enterobacter cloacae a la ampicilina no debe ser en general superior al
5%. Un segundo factor relacionado con el inoculo es el método de prepara-
ción. Para muchas bacterias no es importante, pero para estafilococos (con el
fin de garantizar la detección de resistencia a oxacilina) y para bacterias de
difícil crecimiento, como S. pneumoniae, H. influenzae y N. gonorrhoeae, el
inoculo debe prepararse a partir del crecimiento durante una noche (18 a 20
horas) en un medio de agar (Chambers. 1988; NCCLS M2-A6,1997; NCCLS
M7-A4,1997).
Incubación
Las condiciones de incubación también afectan a los resultados de la
prueba de sensibilidad. Las recomendaciones generales son la incubación
durante una noche (16 a 20 horas) en atmósfera aerobia a 35C: no obs-
tante, existen excepciones. Los aislamientos de S. pneumoniae. H. influen-
zae y N. gonorrhoeae requieren incubación en atmósfera con un 5%-7% de
C0 , además S. pneumoniae y N. gonorrhoeae deben incubarse hasta 20-
2
24 horas más. Los estafilococos y enterococos también deben incubarse
durante 24 horas para garantizar la detección de resistencia a oxacilina y
vancomicina, respectivamente. Los anaerobios y levaduras requieren 48
horas de incubación, aunque se recomiendan 72 horas para los aislamien-
tos de Cryptococcus neoformans. Para más detalles sobre métodos de sen-
sibilidad se recomienda consultar los documentos adecuados del NCCLS.
Sistemas de análisis
De acuerdo con los resultados de los recientes programas de competencia
del College of American Pathologists, la mayoría de los laboratorios de este
país utilizan en la actualidad sistemas de microdilución. Una razón para pasar
de la tecnología de difusión a la de dilución es la mayor eficacia de la inocu-
lación replicada en sistemas combinados de identificación y pruebas de sen-
sibilidad y a la gestión de datos mediante paquetes de software característi-
cos de estos sistemas. Otras razones son a menudo inconsistentes y se
basan en la falsa idea de que las CMI son más exactas y constituyen los datos
que los médicos desean conocer. Dado que los resultados de las pruebas de
dilución y difusión se correlacionan notablemente desde un punto de vista
estadístico y puesto que la mayoría de los médicos que no son especialistas
en enfermedades infecciosas tienen dificultades para interpretar las CMI, se
requiere que los laboratorios informen de categorías interpretativas junto a las
CMI; la elección entre las pruebas de difusión y las de dilución se realiza por
motivos puramente económicos en casi todos los casos.
Hoy en día, se dispone de numerosos sistemas comercializados entre los
que se puede escoger. Antes de llevar a cabo la elección, el director del
laboratorio debe considerar si las ventajas de la inoculación replicada y los
sistemas de gestión de datos superan los costes añadidos de estos equi-
pos, cuando se comparan con la simplicidad, la conveniencia y la economía
 CAPÍTUIO 51 • PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBÍANOS
proporcionada por la prueba de difusión en disco. Existe entre el personal de
laboratono una desafortunada tendencia a considerar la prueba de dilusión en
disco anticuada y demasiado poco sofisticada para la práctica actual. Esta
prueba todavía desempeña su papel de forma exacta y adecuada, ademas de
ser económica Los resultados obtenidos son comprensibles para el médico y
suficientes en casi todas las situaciones donde se aplica un tratamiento anti-
microbiano. La difusión en disco también proporciona flexibilidad, ya que se
pueden estudiar prácticamente todos los antimicrobianos simplemente selec-
cionando el disco adecuado.
La selección de un sistema mecanizado o semiautomatizado debe basar-
se en numerosas consideraciones. Entre éstas se encuentran el número de
muestras, la experiencia técnica, la necesidad de gestión de los datos, la uti-
lización de un sistema común de identificación bacteriana y de pruebas de
sensibilidad, la compatibilidad con los sistemas de información del laborato-
rio, los costes de adquisición o de arrendamiento del equipo, el coste de los
suministros y reactivos fungióles, el coste de los contratos de servicios y la
disponibilidad de espacio. En el sistema VITEK (bioMérieux, Hazelwood. MO).
los antimicrobíanos se encuentran en pocilios dentro de una placa de plásti-
co. Este sistema consta de un módulo llenador/sellador, un lector/incubador,
un módulo informático, una terminal de datos y una impresora. Las placas se
incuban en el módulo lector/incubador y los pocilios se monitorizan por den-
sidad óptica. Los resultados se obtienen en cuatro horas: sin embargo, el
tiempo medio de incubación para las pruebas de sensibilidad es aproximada-
mente de siete horas. Este tiempo de incubación es suficiente para propor-
cionar una detección exacta de mutantes desreprimidos para |i-lactamasas
de clase I, estafilococos productores de penicilinasa y estafilococos resisten-
tes a oxacilina. Existen ciertos sistemas de microdilución en los que los anti-
microbíanos se proporcionan en estado congelado o liofilizado La selección
entre estos sistemas no sólo se basa en la disponibilidad de espacio de con-
gelación para el almacenamiento de las placas, sino también en la disponibi-
lidad del tiempo que requiere cada sistema. La selección también puede
basarse en la disponibilidad y la sofisticación de los sistemas de gestión de
datos. En algunos casos, los resultados finales se leen de modo visual y se
introducen manualmente con propósitos de informe y almacenamiento (p. ej.,
Pasco. Becton-Dickmson Diagnostic Systems. Sparks. MD). En otros casos,
los resultados son leídos por el sistema fotométricamente (p. ej„ MícroScan
WalkAway, Dade Behring. Inc; Aris. Trek Diagnostic Systems. Westlake. OH).
Tanto el sistema MícroScan como el Ans poseen capacidad para estudiar la
sensibilidad aproximadamente a las 5 horas de incubación o bien tras 18
horas de incubación De los sistemas disponibles actualmente, VITEK,
MícroScan WalkAway y Aris ofrecen capacidades "walkaway".
Debido a la escasez actual de londos para el equipamiento, cada vez más
laboratorios utilizan sistemas de alquiler de equipos financiados a través del
consumo de reactivos. Con el obieto de mantener el equipo y el software, sue-
le ser necesario disponer de un contrato de servicio, cuyo coste básico es
aproximadamente el 10% del valor de adquisición del equipo.
Los fabricantes de sistemas fomentan la rapidez de las pruebas de sen-
sibilidad, proporcionando las CMI en tres o cinco horas Sin embargo, estos
sistemas no detectan con fiabilidad los estafilococos resistentes a penicili-
na o a meticilina. tampoco los bacilos gramnegativos desreprimidos para
li-lactamasas de clase I, y parecen necesitar un mínimo de 6 horas para la
detección de su resistencia a la mayoría de los antibióticos |i-laclámicos
(Lampe. 1979; Washington, 1988) Incluso en el caso de que las pruebas
sean exactas, ¿supone alguna ventaja el hecho de que sean más rápidas?
En un estudio no aleatorizado. Matsen (1985) ha descrito los resultados
tanto de un sistema rápido de 3 a 5 horas como de una prueba de difusión
en disco, preguntando posteriormente a los clínicos hasta qué punto el
hecho de recibir antes el resultado influía en su elección del tratamiento
antimicrobiano, En el 31,7% de los casos los médicos indicaron que,
basándose en el resultado rápido, iniciaban el tratamiento con un antibióti-
co distinto del que habrían utilizado en otras circunstancias; en otro 17%
los médicos señalaron que "probablemente" habria influido. La mayoría de
pacientes que participaron en el estudio tenían bactenuna. En un estudio
prospectivo aleatorizado de 794 pacientes de cirugía general, Vmcent
(1985) proporcionó resultados rápidos para la milad de los pacientes y
resultados convencionales para la otra mitad. Observó que el tratamiento
antimicrobiano se modificó en el 14.5% de ios casos en el grupo de pacien-
1125
tes para quienes se obtuvieron resultados rápidos y en el 8,8% de los
casos en el grupo de pacientes para quienes se obtuvieron resultados con-
vencionales (p <0,001); no obstante, no hubo diferencias estadísticamente
significativas entre ambos grupos con respecto a la duración de la estan-
cia de los pacientes en el hospital.
Doem y cois. (1994) evaluaron el impacto clínico de pruebas rápidas de
identificación bacteriana y de sensibilidad frente a antimicrobíanos en pa-
cientes hospitalizados en un centro médico de cuidados terciarios. Los tiem-
pos medios de información de los resultados de identificación y sensibilidad
fueron, respectivamente, de 9.6 y 11.3 horas en el grupo de pruebas rápidas
y de 19.6 y 25,9 horas en el grupo convencional (p <0,0005) No hubo dife-
rencias significativas entre los dos grupos con respecto a los descriptores
demográficos, con excepción del tiempo de información de los resultados
Los tiempos medios de hospitalización fueron los mismos para ambos gru-
pos, aunque la tasa de mortalidad fue inferior en el grupo de pruebas rápi-
das (8.8% frente a 15.3%). Por otra parte, en los pacientes del grupo de
pruebas rápidas hubo significativamente menos estudios de laboratorio,
menos estudios de imagen, menos días de intubación y menos días de per-
manencia en una unidad de cuidados intensivos: el tiempo transcurrido pre-
vio a la modificación del tratamiento antimicrobiano fue más corto y el coste
global de hospitalización de los pacientes fue significativamente más bajo. En
un estudio similar. Barenfanger (1999) no encontró diferencias de mortalidad
entre grupos donde estuvieron disponibles resultados rápidos de las oruebas
de sensibilidad, cuando se compararon con pacientes a quienes se informa-
ron los resultados de modo ordinario (diferencia media de 5,2 horas). No
obstante, ellos observaron una disminución significativa en el tiempo de
permanencia hospitalaria (diferencia media de 2,0 días, p - 0.0006) y en el
coste total de la estancia en el hospital (diferencia media de 2.395 dólares.
p = 0,04) en los pacientes donde estuvieron disponibles resultados rápidos
de las prueóas de sensibilidad.
PRUEBAS BACTERICIDAS
Existen tres categorias principales de pruebas bactericidas: 1) determina-
ción de la concentración mínima requerida para que un antimicrobiano des-
truya un microorganismo, conocida como concentración mínima bactericida o
letal (CMB o CML): 2) determinación de la tasa de muertes (tasa de muertes-
tiempo o curva de letalidad) y 3) determinación de la dilución más alta del sue-
ro del paciente requerida para destruir un microorganismo, conocida como
titulo bactericida o letal del suero (TBS o TLS). La utilización de cualquiera de
estas categorias de pruebas depende de cuestiones relacionadas con las
indicaciones, métodos e interpretación.
Concentración mínima bactericida o letal
Con respecto a la CMB o CML, existe un acuerdo general en que esta
determinación debe formar parte de la investigación inicial de un nuevo anti-
mícrobiano. No obstante, la unanimidad es menor en lo que se refiere a la
posibilidad de que la prueba esté indicada para aislamientos de estreptoco-
cos en pacientes con endocarditis, de estafilococos en pacientes con endo-
carditis u osteomielitis y de enterobacterias o Pseudomonas en pacientes
con meningitis. La controversia se suscita en parte por las variables biológi-
cas y técnicas que afectan a los resultados de las determinaciones de la
CMB (NCCLS M26-A. 1999). Para determinar la CMB o CML se inocula el
antimicrobiano en caldo, diluido de forma seriada (en una base logj con una
suspensión estandarizada del microorganismo en estudio, según lo descrito
para la determinación de la CMI. Tras su incubación a 35 C durante 24
horas, los tubos con caldo que no muestran crecimiento visible son subculti-
vados en un medio de agar libre de antibióticos. La CMB o CML se define
como la menor concentración del antimicrobiano que es bactericida o letal
para al menos el 99.9% del inoculo original. Entre las variables biológicas de
la prueba se encuentran: 1) el fenómeno de persistencia, en el que un
pequeño número de bacterias "persistentes" (habitualmenle <0,1%) del
inoculo bacteriano sobreviven a la exposición del antibiótico, pero siguen
siendo sensibles si se vuelven a estudiar frente al antibiótico, habítualmente
un antimicrobiano activo frente a la pared celular: 2) el efecto paradójico, en
 1126 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
el cual la proporción de supervivientes se incrementa con la concentración
de antibiótico, de nuevo con mayor frecuencia en los antibióticos activos
frente a la pared celular y 3) tolerancia, un lenómeno mucho menos com-
prendido. Se piensa que tanto la "persistencia" como el efecto paradójico
están relacionados con el enlentecimiento de la tasa de crecimiento de las
bacterias por el antibiótico, lo que da lugar a una disminución del efecto de
destrucción (NCCLS M26-A, 1999). Definidos estrictamente, los microorga-
nismos tolerantes son aquellos en los que la viabilidad se pierde lentamente
y aquellos en los que la respuesta bacteriostática-bacteriolitica frente a los
antibióticos se modifica en la dirección de la bacteriostasia (Handwerger,
1985). Sin embargo, la tolerancia se ha definido también como una propor-
ción CMB/CMI mayor o igual a 32, a pesar de los numerosos problemas téc-
nicos que influyen en los resultados de la CMB y de las variaciones metodo-
lógicas en la determinación de las CMB (Sherris, 1986). Como ha señalado
Sherris (1986). la CMB se define como la concentración menor de antibióti-
co que produce una supervivencia <0,1% en la zona de menor exactitud de
la curva de letalidad (es decir, de 18 a 24 horas). El número de supervivien-
tes tras una noche de incubación con un antibiótico activo frente a la pared
celular es invariablemente mayor si el inoculo se encuentra en la fase esta-
cionaria en lugar de en la fase logarítmica (Handwerger, 1985; Sherris,
1986). El problema técnico más frecuente que origina una mayor proporción
de bacterias en la fase estacionaria es la utilización de cultivos que han esta-
do creciendo más de ocho horas (NCCLS M26-A. 1999). Otros problemas
técnicos adicionales incluyen la supervivencia de las bacterias en el con-
densado por encima del menisco del caldo que contiene el antibiótico, el
volumen del subcullivo, el efecto remanente de antibiótico en los subcultivos
y la reproducibilidad de la prueba. Asumiendo que sea posible conseguir el
control de estos problemas técnicos, la determinación de un resultado defi-
nitivo (CMB) puede basarse en los criterios de rechazo publicados por Pear-
son (1980). La tolerancia se define por una tasa de muertes retrasada, por lo
que el método más fiable para su detección consiste en un estudio simplifi-
cado de las muertes de los microorganismos en función del tiempo, compa-
rando la cantidad de bacterias que permanecen viables tras cinco o seis
horas de incubación en presencia de una concentración de antibiótico de
cuatro a ocho veces su CMI, con la cantidad presente en las lecturas a las
dos horas o en el tiempo cero (Handwerger, 1985; Sherris. 1986).
Considerando todos los problemas biológicos y técnicos asociados con las
pruebas bactericidas y la definición de tolerancia, no es sorprendente que la
interprelación de los esludios clínicos publicados sobre infecciones causadas
por microorganismos supuestamente "tolerantes" esté llena de dificultades,
en especial respecto a los estafilococos, para los que las variables técnicas
tienen consecuencias importantes (Handwerger, 1985). Por estos motivos,
nuestra norma consiste en no determinar la CMB de los antibióticos activos
frente a la pared celular para estafilococos.
Existen datos procedentes de estudios de endocarditis producidas por
estreptococos del grupo viridans en animales de experimentación que sugie-
ren que la penicilina puede ser menos eficaz frente a la infección por cepas
tolerantes que frente a la debida a cepas no tolerantes (Handwerger, 1985;
Wilson, 1985): sin embargo, apenas existe información sobre el significado
clínico de estas cepas (Wilson, 1985). Handwerger y Tomasz (1985) postu-
laron que las bacterias no tolerantes podrían manifestar una respuesta feno-
típicamente tolerante en una lesión endocárdica a causa de su elevada den-
sidad, su disminuida actividad metabólica y su lenta velocidad de crecimiento
en las vegetaciones. Dado que algunas cepas de estreptococos del grupo
viridans son resistentes a penicilina (CMI >4 pg/ml). sin duda es necesario
determinar la CMI de los aislamientos de estreptococos del grupo viridans de
pacientes con endocarditis u otras infecciones que suponen un riesgo para
la vida. Puesto que los pacientes con endocarditis causada por estreptoco-
cos del grupo viridans tolerantes pueden presentar un riesgo mayor de reci-
divas y requerir de 4 a 6 semanas de tratamiento con penicilina y un amino-
glucósido (Wilson, 1985), tal vez sea aconsejable determinar la CMB de
dichas cepas.
Estudios de la tasa de muertes
La determinación de la tasa de muertes de un antibiótico es el mejor
método para detectar no sólo la tolerancia, sino también la sinergia o anta-
gonismo entre dos o más antibióticos. Además, la actividad bactericida,
más que la baclerioslática, parece ser un requisito para el tratamiento de
la meningitis bacteriana (Sande. 1981). En la meningitis por bacilos gram-
negativos (de etiología distinta a H. influenzae). las CMB de las cefalospo-
rinas pueden tener poca correlación con el resultado, en contraste con los
resultados de los estudios de 6 horas de la tasa de muerte-tiempo (Eng,
1987). Por tanto, cuando se necesita un tratamiento bactericida para la
curación, los estudios de muerte-tiempo de los antimicrobianos, ya sea en
administración única o en combinación, podrían tener mayor valor predicti-
vo de los resultados que las CMB (Bayer. 1985: Drake, 1985; Eng, 1987).
Los resultados de los estudios de combinación mediante el método muer-
te-tiempo también se correlacionan mejor con los resultados de los estu-
dios de combinación en modelos de infección con animales de experimen-
tación que los resultados de estos estudios obtenidos mediante el método
del tablero (Bayer, 1985), quizás, una vez más, debido a que los resulta-
dos definitivos del método del tablero se determinan a las 18-24 horas, que
representa la fase menos exacta de la curva de letalidad (Sherris, 1986).
En los estudios de la tasa de muertes se realizan cultivos cuantitativos en
diversos intervalos (p. ej., 0, 4. 8, 12 y 24 horas) tras la inoculación del
medio que contiene el antibiótico. La actividad bactericida se delme como
el 99,9% de muertes del inoculo final, determinado mediante la observa-
ción de una disminución >3-log de UFC/ml en la curva de muerte-tiempo
10
trazada (NCCLS M26-A, 1999). Cuando se estudia una combinación de
antimicrobianos, la sinergia suele definirse como una reducción >2-log,<, de
UFC/ml entre la combinación y su constituyente más activo cuando se uti-
liza individualmente, suponiendo que al menos uno de los constituyentes
no afecte a la curva de crecimiento del microorganismo estudiado. En el
caso de enterococos, este requisito no supone dificultades, porque las con-
centraciones de penicilinas o aminoglucósidos alcanzables desde un pun-
to de vista clínico no son bactericidas; sin embargo, puede suponer un pro-
blema en el estudio de otros microorganismos que pueden ser sensibles a
cada uno de los antimicrobianos empleados en combinación. En este últi-
mo caso, la sinergia sólo es definible cuando existe una reducción >2-log,
de UFC/ml entre la combinación de ambos, presentes en concentraciones
que representan una cuarta parte de sus respectivas CMB. en compara-
ción con el constituyente individual más activo en una concentración de la
mitad de su CMB (Hallander. 1982). Como ocurre con las determinaciones
de CMB. el efecto remanente de los antimicrobianos en los subcultivos
cuantitativos es problemático y requiere inactivar cualquier antimicrobiano
presente o diluir las muestras para el subcultivo lo suficiente para eliminar,
si es posible, los efectos remanentes del fármaco. Siempre que se produz-
ca un efecto remanente, especialmente en concentraciones de la prueba
mayores o iguales a 16 veces la CMI, puede corroborarse marcando una
alícuota de 10 pl a 100 pl de una dilución de un subcultivo a través de una
superficie de agar, permitiendo un tiempo de absorción de 20 minutos, mar-
cando posteriormente toda la superficie de agar con el microorganismo de
estudio y observando la inhibición del crecimiento en el sitio de la marca
inicial tras su incubación durante 24 horas (NCCLS M26-A, 1999). Otro
problema en la interpretación de los estudios cinéticos de letalidad es la
aparición de recrecimiento entre las 6 u 8 horas y las 24 horas de incuba-
ción de la prueba. En estos casos, conviene determinar si se ha producido
inactivación antimicrobiana o si la prolongada incubación ha seleccionado
una subpoblación resistente. Mediante la determinación de la CMI a las 0
y a las 24 horas Irente a una cepa de relerencia de la American Type Cul-
ture Collection (ATCC), se puede deducir la inactivación del antibiótico si la
CMI es marcadamente superior a las 0 que a las 24 horas (NCCLS M26-A.
1999).
Estudios bactericidas del suero
El principal objetivo de la prueba bactericida del suero consiste en deter-
minar la actividad de uno o más antimicrobianos presentes en el suero frente
a un microorganismo que ha sido aislado del paciente. Empleando distintas
modificaciones, se puede determinar la actividad bactericida relativa a la CMB
(título bactericida del suero), la tasa de muertes en un determinado tiempo
(tasa bactericida del suero) o la magnitud de la actividad bactericida y su
duración (NCCLS M21-A, 1999). En la práctica, los títulos bactericidas del
 CAPÍTULO 5 1 • PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBÍANOS
suero cuando la concenlración de antibiótico es máxima (pico) y cuando es
mínima (valle) son los que se determinan más fácilmente. Esto se lleva a
cabo obteniendo una muestra de suero del paciente durante los niveles pre-
vistos de pico y/o valle de los antimicrobíanos que está recibiendo el enfer-
mo. Con posterioridad, la muestra de suero se diluye en caldo, en una mez-
cla de sueros humanos o en una mezcla de caldo y sueros humanos
suplementados con cationes (cuando se estudian aminoglucósidos o fluoro-
qumolonas frente a Pseudomonas aerugmosa). Se añade luego una sus-
pensión estandarizada del microorganismo al suero diluido senadamente y
se incuban los tubos durante una noche a 35 C. El titulo inhibitorio del sue-
ro es la dilución más alta del suero que inhibe de manera visible el creci-
miento del microorganismo. Se pueden realizar subcullivos de los tubos que
contienen diluciones de suero sin crecimiento visible, con el fin de determi-
nar la dilución más alta de suero que ha sido bactericida para el microorga-
nismo estudiado.
A pesar de que existe una fuerte controversia acerca del valor clínico de la
prueba bactericida del suero, es evidente que todas las cuestiones técnicas
implicadas en las pruebas bactericidas también afectan a esta prueba. Ade-
más, la prueba bactericida sérica implica dos variables adicionales: 1) el tiem-
po de recogida de la sangre y 2) el tipo de diluyente (es decir, caldo, suero o
una combinación de ambos). Es difícil establecer una correlación entre los
títulos bactericidas específicos y los resultados del tratamiento antimicrobia-
no, dadas las variaciones en el método y las variables técnicas que afectan a
dichas pruebas.
ANÁLISIS DE ANTIMICROBIANOS
El nivel de antimicrobiano en el suero u otros líquidos biológicos se puede
determinar directamente mediante bioanálisis, inmunoanálisis o análisis cro-
matográfico. Al contrario del titulo bactericida sérico, los análisis proporcionan
una determinación de la concentración de cada antimicrobiano que el pacien-
te está recibiendo.
Indicaciones
La determinación de la concentración de antimicrobiano está indicada
cuando el agente a administrar posee un estrecho margen terapéutico
(Tabla 51-2) y cuando determinados factores subyacentes del huésped alte-
ran la farmacocinética del antimicrobiano. Los antimicrobianos con un estre-
cho margen terapéutico incluyen aminoglucósidos, vancomicina. cloranleni-
col y flucitosina. Con estos antimicrobíanos existe un estrecho cociente
tóxico/terapéutico. Debido a sus amplios márgenes terapéuticos, no se
requiere el análisis de penicilinas y cefalosporinas, excepto: 1) cuando su
vía de administración o la enfermedad subyacente pueden producir niveles
séricos que difieran notablemente del intervalo habitual o 2) cuando la infec-
ción se encuentre en un espacio o líquido donde la penetración del antími-
crobiano sea variable o dudosa.
Los análisis de antimicrobíanos están indicados en pacientes con trata-
miento antimicrobiano prolongado (más de 5 días), en enfermos que no res-
ponden al tratamiento y en pacientes que desarrollan signos o síntomas de
toxicidad, como por ejemplo ototoxicidad o nefrotoxicidad durante la adminis-
tración de aminoglucósidos. La determinación de antimicrobíanos está indica-
da especialmente en pacientes con deterioro o cambios rápidos de la función
renal y en pacientes sometidos a diálisis. Otras indicaciones adicionales de
los análisis de antimicrobíanos comprenden pacientes ancianos: pacientes
con fibrosis quística, quemaduras, neumonía por gramnegativos. obesidad y
con expansión del volumen del liquido extracelular; asi como pacientes que
no cumplen las dosis prescritas por vía oral. Es importante comprender que
los análisis de antimicrobianos con márgenes terapéuticos estrechos no sólo
son necesarios para confirmar que estos antimicrobianos no se encuentran
en concentraciones potencialmente tóxicas, sino también para comprobar que
se hallan dentro del intervalo terapéutico. Por ejemplo, se ha observado que
existe un efecto dosis-respuesta graduado entre un cociente creciente con-
centración máxima del pico/CMI de aminoglucósidos y la respuesta clínica
(Moore, 1987).
1127
Recogida de muestras
Debido a la corta vida media de la mayoría de los antimicrobíanos, la
recogida de la muestra es esencial para una monitorízacion terapéutica
adecuada. El suero es la muestra más apropiada para el análisis; sin
embargo, el plasma es también satisfactorio en la mayoría de casos. Si se
utiliza plasma para la determinación de aminoglucósidos. debe anticoagu-
larse con ácido elilendiaminotetraacétíco (EDTA). ya que la heparina inacti-
va los aminoglucósidos. Los análisis de antimicrobíanos en orina rara vez
están indicados, excepto con finalidades de investigación. Aunque para el
análisis se prefiere la venopunción, se puede obtener sangre a partir de un
catéter mtravascular. después de haber dejado fluir ésta y desechar la
muestra sanguínea inicial. En general, para determinar la concenlración
sanguínea máxima, las muestras deben recogerse a los 30 minutos de
haber completado la perfusión intravenosa, a los 60 minutos Iras una dosis
intramuscular y a los 60-120 minutos tras una dosis oral. Los niveles máxi-
mos varían de acuerdo con el antimicrobiano administrado, la vía de admi-
nistración, la velocidad de administración, las características de absorción y
el estado clínico del paciente. Los niveles mimmos de antimicrobiano son
indicadores más sensibles de la disminución de su aclaramiento y de su
acumulación hasta niveles potencialmente tóxicos. Por consiguiente, a
menudo se recomienda que los aminoglucósidos se monitoricen tanto en
niveles previos al pico como en niveles previos al valle, en el primer caso
para establecer que se está consiguiendo un nivel terapéutico y en el
segundo para comprobar que no se produce acumulación a causa de una
disminución del aclaramiento.
Sólo se garantiza una recogida exacta de la muestra cuando la misma
persona que administra el antibiótico es la que extrae la muestra. De otra
forma puede existir una considerable disparidad entre los tiempos regis-
trados y reales de la administración del antimicrobiano. Asi pues, sí la san-
gre se recoge mediante un equipo de flebotomía que confia en el tiempo
registrado de administración del antimicrobiano, los niveles determinados
y posteriormente informados pueden interpretarse de forma incorrecta.
Bajo estas condiciones de escaso control de la recogida de muestras, es
posible recibir informes en los que el supuesto nivel minimo sea más ele-
vado que el nivel máximo. En el peor de los casos, un supuesto pico pue-
de parecer insuficiente para propósitos terapéuticos, incrementándose de
forma inadecuada la dosis de un antimicrobiano con estrecho margen
terapéutico, dando lugar a toxicidad provocada por niveles excesivos del
antimicrobiano.
Las muestras deben estudiarse inmediatamente o almacenarse a £-20 C
durante un periodo máximo de 2 días. Algunas amino o ureidopenicilinas
inactivan los aminoglucósidos durante un almacenamiento prolongado, por
lo que debe añadirse |}-lactamasa al suero si se mantienen almacenadas
durante largo tiempo. La interacción entre penicilinas y aminoglucósidos dis-
minuye en el almacenamiento a -70X.
Métodos
Históricamente, los análisis microbiológicos constituían los métodos más
utilizados y representaban la mejor opción para la determinación sistemática
de las concentraciones de antimicrobianos en los líquidos biológicos. Con la
introducción de la gentamicina alrededor de la década de los setenta, se
desarrollaron una serie de procedimientos de análisis que no dependían de
una dosis-respuesta microbiológíca in vilro. Estos métodos proporcionan una
exactitud y especificidad mayores que las que habían sido posibles con las
pruebas microbiológicas.
Los análisis microbiológicos se basan en una comparación de la res-
puesta de un microorganismo sensible a una concentración desconocida
de antibiótico, con la respuesta de este microorganismo bajo condiciones
idénticas de análisis con concentraciones conocidas del antimicrobiano. La
prueba suele basarse en técnicas de difusión en agar, en las que el agar
se siembra con una suspensión estandarizada del microorganismo a estu-
diar; en esta suspensión, los líquidos contienen concentraciones descono-
cidas de antibióticos y los patrones contienen concentraciones conocidas
de antibióticos, repartidas en pocilios o en discos de papel en blanco. Des-
pués, las placas se incuban durante una noche y se realiza una curva de
 CAPÍTULO 51 • PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS
dosis-respuesta, determinando el diámetro del halo de inhibición corres-
pondiente a cada concentración conocida del antibiótico utilizado en los
patrones. Debe entenderse que el ensayo microbiológico mide los efectos
de todos y cada uno de los antimicrobianos que pueden encontrarse pre-
sentes en el líquido biológico en estudio. Por tanto, si el paciente está reci-
biendo otros antimicrobianos además del que es ob|eto de la prueba, el diá-
metro del halo de inhibición reflejará los efectos combinados de todos los
antimicrobianos presentes. En algunos casos, es posible determinar la con-
centración de un antimicrobiano en presencia de otro mediante la selección
adecuada de un microorganismo de prueba sensible al antimicrobiano a
determinar y resistente al que potencialmente interfiere con el antimicrobia-
no. En otros casos, es posible suplementar el medio de la prueba con sus-
tancias que pueden neutralizar los efectos del antimicrobiano que interfiere.
Por ejemplo, en el estudio de antibióticos |i-lactámicos. se pueden añadir
cationes o polianetolsullonato sódico al medio de ensayo con el fin de neu-
tralizar la actividad de los aminoglucósidos. En otras ocasiones simplemen-
te no es posible determinar la concentración de un antimicrobiano en pre-
sencia de otro. Pese a estas limitaciones, las pruebas microbiológicas
siguen siendo el "método de referencia" frente al cual se evalúan los análi-
sis no microbiológicos; el motivo estriba en que la prueba microbiológica
determina la actividad antimicrobiana total de un antimicrobiano, mientras
que el análisis no microbiológico determina sólo un componente de un anti-
microbiano estructuralmente complejo. Anhalt (1985) y Edberg (1986) pro-
porcionaron descripciones detalladas de las pruebas microbiológicas.
La cromatografía liquida, proceso para separar una mezcla compleja de
sustancias y basado en la distribución diferencial de éstas entre una fase
líquida móvil y una fase sólida estacionaria, ha demostrado ser una técnica
sensible y específica para medir casi todos los antimicrobianos de muestras
clínicas. La técnica conlleva la extracción del antimicrobiano a partir de la
muestra o una precipitación de proteínas seguida de cromatografía del líqui-
do extraído o libre de proteínas en una columna de fase inversa (Anhalt,
1985). Anhalt (1985) publicó detalles respecto a los análisis mediante cro-
matografía líquida. Los factores que afectan a la utilización actual de la cro-
matografía líquida son la disponibilidad de equipamiento para el análisis de
fármacos distintos de los antibióticos, la falta de disponibilidad de equipos
de reactivos para determinados antimicrobianos, el pequeño volumen de
pruebas para algunos antimicrobianos y la necesidad de cuantificar los
metabolitos e isómeros de los antimicrobianos. Los análisis mediante cro-
matografía líquida tienen la ventaia sobre otros métodos de poder mezclar
un patrón con la muestra antes de la prueba, proporcionando un patrón
interno. Las ventajas de la cromatografía liquida incluyen su versatilidad, el
coste relativamente bajo del reactivo, el coste moderado del equipo y la no
necesidad de derivación, la capacidad para manejar peticiones "estadísti-
cas" y un consumo de tiempo mínimo. Las desventajas de la cromatografía
liquida son el tamaño de la muestra relativamente voluminoso (500 pl), la
necesidad de muestras pretratamiento, la necesidad de una diversidad de
detectores, la extracción constante de muestras y el tiempo de entrena-
miento requerido para el procesamiento exacto de las muestras. Los méto-
dos de cromatografía líquida para el estudio de antimicrobianos se han sus-
tituido en los laboratorios clínicos por los de inmunoanálisis.
El radiommunoanálisis (RÍA) fue uno de los primeros inmunoanálisis dispo-
nibles para el estudio de aminoglucósidos. Los RÍA requerían sólo un peque-
ño volumen de muestra y podían manejar peticiones "estadísticas", eran
especialmente capaces de realizar múltiples análisis por lote, proporcionaron
automatización y eran sensibles y específicos. Las desventajas del RÍA con-
sistían en la fecha de caducidad limitada de los reactivos radiactivos, los pro-
blemas de tratar con malerial radiactivo, el coste elevado de equipo y reacti-
vos y la falta de versatilidad para el estudio de otros agentes antimicrobianos.
En consecuencia, los RÍA han sido sustituidos casi por completo por inmuno-
análisis no isotópicos, entre los que se incluyen la polarización, los sustratos
marcados, la multiplicación enzimática y el fluoroanálisis de polarización
(Edberg, 1986). La ventaja de estos inmunoanálisis homogéneos es el peque-
ño volumen de muestra requerido (aproximadamente 50 pl), no necesitar
preparación de las muestras, el coste moderado del equipo, un tiempo de
adiestramiento mínimo, la capacidad de los sistemas para manejar peticiones
estadísticas y la disponibilidad de automatización. Sus desventajas incluyen
el hecho de que a menudo sólo existe una fuente de reactivo y que éstos sue-
1129
len ser caros. No obstante, dada su comodidad y el poco tiempo que consu-
men, estos sistemas de inmunoanálisis son bastante utilizados. Edberg
(1986) publicó una descripción detallada de los inmunoanálisis.
Se han realizado una serie de estudios sobre aspectos técnicos y de exac-
titud de las pruebas microbiológicas, los radioinmunoanálisis, los inmunoaná-
lisis no isotópicos y la cromatografía líquida de alta resolución. En general, los
coeficientes de variación son comparables (del 7% al 9%). Las sensibilidades
suelen ser también comparables (de 0.1 ugvml a 1 po/ml). La correlación de
resultados entre los métodos es alta Los resultados de los inmunoanálisis no
isotópicos y de la cromatografía líquida de alta resolución pueden estar dis-
ponibles en 1 hora, mientras que en 3 a 4 horas se dispone de los resultados
de los RIA. Aunque la mayoría de las pruebas microbiológicas requieren una
noche de incubación, se dispone de una serie de análisis microbiológicos
rápidos (de 4 a 6 horas) para aminoglucósidos y vancomicina.
Interpretación
La interpretación de los resultados de análisis de antimicrobianos requiere
conocimientos acerca de las dosis de antimicrobiano administrado, el interva-
lo de tiempo entre la administración de las dosis y la recogida de la muestra de
sangre, la sensibilidad del microorganismo infectante, la tolerabihdad de los
niveles séricos alcanzables de antibiótico, el volumen de distnbucion y la via
de eliminación del antibiótico, las características de absorción de éste y la
experiencia clínica en el tratamiento de infecciones similares. Considerados
estos requisitos, en la Tabla 51-2 se han enumerado los factores que afectan
la monitorización de los antimicrobianos con estrechos márgenes terapéuticos
(Anhalt, 1989).
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 C A P Í T U L O
Infecciones por espiroquetas
• Michael Smith, M.D.
• Randall T. Hayden, M.D.
• David H. Persing, M.D., Ph.D.
• Gail L. Woods, M.D.
TREPONEMA 1131
Treponema pallidum
Pinta
Diagnóstico de laboratorio de las treponematosis
Tratamiento de las treponematosis
GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS
CRÓNICA 1135
LEPTOSPIROSIS 1135
Las espiroquetas son bacterias finas con forma espiral que presentan una
o más vueltas de hélice completas en el soma bacteriano. Son gramnegati-
vas. pero sólo pueden visualizarse en preparaciones en fresco, mediante
microscopía óptica de campo oscuro o contraste de fases, o por medio de tin-
ciones por impregnación argéntica en secciones de muestras de tejidos. Unos
orgánulos semejantes a los flagelos, denominados fibrillas periplásmicas o
filamentos axiales, que surgen cerca de los polos de la bacteria, son respon-
sables del movimiento característico de estos microorganismos, semejante al
desplazamiento de un sacacorchos. Si bien existe un gran número de espe-
cies comensales, no patógenas, las especies de los géneros Treponema y
Borrelia, así como Leptospira interrogans, y Spirillum minor causan enferme-
dades en el ser humano. Por otro lado, se han asociado algunas especies de
los géneros Serpulina y Brachyspira con síndromes gastrointestinales, aun-
que no está universalmente aceptado que exista una relación inequívoca
entre estas bacterias y la enfermedad.
TREPONEMA
El género Treponema incluye dos especies que causan enfermedad en el
hombre. La especie Treponema pallidum está subdivídida en tres subespecies.
cada una de las cuales es el agente etiológico de una entidad clínica diferente:
las subespecies pallidum, pertenuey endemicum causan, respectivamente, si-
filis venérea, frambesia y sífilis endémica (bejel). La enfermedad denominada
pinta está provocada por la otra especie patógena. T. carateum.
Treponema pallidum
Sífilis
Descripción. T. pallidum subesp. pallidum, el agente etiológico de la sífi-
lis venérea, es una espiroqueta muy delgada (0.2 um) y larga (de 6 itm a
20 um) que presenta entre 10 y 13 vueltas de hélice completas. Esta espi-
roqueta tiene la movilidad de sacacorchos característica, con una flexión
ondulante de la parle central del cuerpo de la bacteria, y es rápidamente
inactivada por el calor, el frío, la desecación, los desinfectantes y los cam-
bios en la presión osmótica del medio exocelular.
Epidemiología. El hombre es el único hospedador natural de T. pallidum
subesp. pallidum. La transmisión se produce al entrar en contacto directo con
lesiones infecciosas, principalmente a través de una relación sexual. La pro-
babilidad de que una persona infectada le transmita la enfermedad a su pare-
52
FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA 1136
ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS 1136
ESPIROQUETOSIS INTESTINAL 1136
DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES
POR BORRELIAS 1137
Enfermedad de Lyme
Fiebre recurrente
BIBLIOGRAFÍA 1141
ja es aproximadamente de un 30% a un 50% (Larsen, 1995: Tramont, 1995).
Aunque con una frecuencia mucho menor, la infección puede transmitirse sin
que exista contacto sexual con una lesión infecciosa, mediante una transfu-
sión de sangre fresca (o de hemoderivados de la misma) procedente de una
persona infectada (los microorganismos pueden sobrevivir de 24 a 48 horas,
e incluso más, en las condiciones de almacenamiento que existen en los ban-
cos de sangre), por una punción accidental con una aguja infectada o duran-
te la manipulación de los especímenes de laboratorio.
La incidencia de la sífilis venérea en EE.UU. descendió drásticamente con
el advenimiento de la penicilina tras la segunda guerra mundial, y permane-
ció estable hasta 1980. momento en el que la prevalencia de la enfermedad
aumentó, debido probablemente a la asociación entre el incremento en el uso
de drogas y la promiscuidad sexual en determinados grupos de la población.
Esta asociación ha tenido el desafortunado efecto adicional de provocar un
incremento en la prevalencia de la sífilis congénita en los recién nacidos
(CDC. 1989).
Patogenia y patología. T. pallidum subesp. pallidum es capaz de penetrar
por las membranas mucosas intactas o acceder a los tejidos a través de abra-
siones o excoriaciones de la piel, tras lo cual se multiplica en el mismo punto en
donde tuvo lugar la inoculación, teniendo lugar, a continuación, la diseminación
del microorganismo por los sistemas circulatorio y linfático de la persona infec-
tada. En los animales de laboratorio se ha logrado producir la infección con una
dosis infectante tan baja como cuatro espiroquetas (Cumberland, 1949). Las
lesiones clínicas aparecen cuando se alcanza localmente una masa crítica de
microorganismos (aproximadamente 10' espiroquetas): por tanto, el período de
incubación está directamente relacionado con el tamaño del inoculo inicial y
varia entre tres días y tres meses (Magnuson, 1956),
La respuesta inmune del hospedador frente a T. pallidum subesp. pallidum
está influida por la propia estructura de la bacteria. La membrana externa de
la envoltura celular bacteriana es una bicapa lipídica en la que existen pocos
antigenos proteicos expuestos. Los antígenos más importantes en el contexto
de la respuesta inmune del hospedador parecen ser los proteolipidos que se
encuentran por debajo de la superficie celular del microorganismo (Chamber-
lain, 1989; Cox, 1992). Además, la bacteria parece ser capaz de recubrirse con
proteínas del huésped. El resultado final es retrasar la respuesta inmune de
tipo humoral, reduciendo la eficacia de la misma, debido a que las espiroque-
tas se localizan fuera de los vasos sanguíneos cuando se están produciendo
los anticuerpos. Es más. se ha demostrado en modelos animales que hay una
escasa estimulación de la respuesta inmune celular en el caso de la sífilis, a
pesar de la ineficaz respuesta de tipo humoral (Fitzgerald, 1992).
 1132 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Esta respuesta inmune retardada y atenuada permite a 7! pallidum subesp.
pallidum diseminarse y producir una infección crónica. El curso de la sífilis pue-
de dividirse en tres fases predecibles. La fase primaria, con el desarrollo del
chancro, se manifiesta por término medio a las tres semanas, aunque no todos
los pacientes desarrollan una lesión primaria (el chancro). En algunos casos,
debido a su carácter indoloro, la lesión desaparece sin el que paciente llegue
a darse cuenta. La cicatrización completa del chancro entre dos y ocho sema-
nas después da paso a la fase secundaria, que se manifiesta por término
medio unas seis semanas (con un rango de entre 2 y 12 semanas) después
de la inoculación. Esta fase se caracteriza por una extensa diseminación de la
bacteria por el torrente circulatorio, con afectación mucocutánea y a nivel de
órganos y la aparición de síntomas constitucionales. La lase secundaria se
resuelve y la infección entra, seguidamente, en un período de latericia duran-
te el cual el paciente no muestra síntoma alguno de la infección. Los cuatro pri-
meros años de esta fase se denominan período de latencia temprano, y es
durante este tiempo cuando tienen lugar las recaídas, principalmente dentro
del pnmer año Esta fase es seguida por el período de latencia tardío, durante
el cual no se producen recaídas. En algún momento entre los 10 y 25 años
después de la fase primaria, un tercio de los pacientes no tratados desarrolla
la lase terciaria de la enfermedad, en la que tienen lugar graves manifestacio-
nes clínicas a nivel de los sistemas cardiovascular y nervioso central (SNC).
Sea cual sea el órgano afectado o la fase en la que se encuentra la enfer-
medad, la característica histológica distintiva de la sífilis es la endoarterilis
oblilerativa, una proliferación endotelial y fibroblástica concéntrica con un infil-
trado asociado de células mononucleares rico en células plasmáticas. La
endoarterítis es consecuencia de la unión de las espiroquetas a las células
endoteliales a través de moléculas de fibronectina que se han pegado a la
superficie de las bacterias (Thomas. 1986). Los treponemas pueden visuali-
zarse en las muestras de tejidos mediante técnicas de tinción por impregna-
ción argéntica. A medida que la enfermedad progresa disminuye la intensidad
de los infiltrados de células plasmáticas y la concentración de treponemas.
Manifestaciones clínicas. La sífilis es una infección crónica con múltiples
manifestaciones relacionadas, pnmariamente, con la fase en la que se encuen-
tra la enfermedad. El chancro primario aparece característicamente ulcerado,
con los bordes elevados y duros, la base lisa, destacando la ausencia de exu-
dado y dolor en el mismo. Aunque habitualmente es único, pueden aparecer múl-
tiples chancros hasta en un tercio de los individuos infectados. Los pacientes con
infección previa pueden presentar lesiones atipicas, como una pápula pequeña,
e incluso pueden no desarrollar lesión alguna. En algunos pacientes puede apre-
ciarse la existencia de linfadenopatía regional, con ganglios linfáticos moderada-
mente aumentados de tamaño, de consistencia gomosa y no supurativos.
La diseminación tiene lugar en la fase secundana, y los pacientes presentan
los signos y síntomas de una enfermedad sistémica. Más del 90% de los mis-
mos desarrollan una erupción que aparece inicialmente en el tronco y las extre-
midades (aunque cualquier parte del cuerpo puede verse alectada) en forma de las fases primaria y secundaria de la sífilis. Algunos expertos indican que exis-
máculas de pequeño tamaño que evolucionan hasta convertirse en pápulas, y
en algunos pacientes en pústulas, durante un periodo de varias semanas. El
aspecto de la erupción en la palma de la mano y la planta del pie es caracte-
rístico, y el agrandamiento y la coalescencia de las pápulas da lugar a las pla-
cas blanquecinas del condiloma lata. Aproximadamente el mismo número
(90%) de pacientes manifiesta una linfadenopatia generalizada, y un 75% pue-
de padecer fiebre, malestar, anorexia, artralgia, faringitis y pérdida de peso. En
un tercio de los casos pueden observarse placas mucosas. Alrededor de un
40% de pacientes manifiestan síntomas de afectación del SNC. aunque tan
sólo entre un 1% y un 2% desarrollan una meningitis aguda aséptica (Lukehart.
1988). El resto tiene dolor de cabeza y meningismo. uveitis. pérdida neuro-
sensonal de la audición y afectación de los nervios craneales.
La destrucción de los tejidos en la sífilis terciaria se hace evidente entre los 10
y los 25 años después de la infección primaria. La sífilis cardiovascular aparece
como consecuencia del debilitamiento de la túnica media, que produce un aneu-
risma en la aorta ascendente con insuficiencia de las válvulas aórticas y estre-
chamiento de la luz de las arterias coronaras. Los gomas sifilíticas (es decir, áre-
as de necrosis granulomatosa). cuyo tamaño puede variar desde dimensiones
microscópicas hasta tumores de gran tamaño, afectan frecuentemente a la piel
al sistema esquelético y a los tejidos mucocutáneos. aunque pueden aparecer
en cualquier órgano. Tanto la sífilis cardiovascular como las gomas son mucho
menos frecuentes tras el advenimiento del tratamiento con antibióticos. Por el
contrario, debido a que los antibióticos se administran en dosis insuficientes para
atravesar la barrera hematoencefálica y alcanzar concentraciones bactericidas,
la neurosifilis todavía aparece con cierta frecuencia (Mohr, 1976; Green. 1980)
De esta forma de sífilis se han definido dos variantes, meningovascular o paren-
quimatosa, aunque es común que exista una solapación entre ambas.
La sífilis meningovascular aparece entre los 5 y 10 años siguientes a la
infección inicial y se manifiesta clinicamente en forma de ataques, derrames
cerebrales y afasia. La causa principal son los microinfartos múltiples debidos
a la endoarterítis característica a nivel del SNC. La neurosifilis parenquimato-
sa, que aparece entre los 15 y 30 años después de la primera infección, es un
proceso degenerativo con pérdida de neuronas y segmentos mielmizados
(desmielmización segmentaria) que provoca manifestaciones neurólogos y
psiquiátricas complejas, incluyendo paresia generalizada y tabes dorsal. Algu-
nos pacientes no muestran signos o síntomas clínicos, pero un análisis de su
líquido celalorraquideo (LCR) revela anomalías tales como pleocitosis. incre-
mento en la concentración de proteína y presencia de anticuerpos frente a T.
pallidum. siendo posible que la prueba VDRL (Venereal Disease Research
Laboratory) dé positiva, lo que indica la existencia de infección a nivel del SNC.
Esta forma se ha denominado "neurosífilis asintomática" (Tramont. 1995).
También existen dos formas clínicas de la sífilis congénita: una forma tem-
prana o infantil y otra tardía, que se maniliesta tras un período de latencia que
oscila entre 5 y 30 años. Aunque la idea tradicional de que la infección del feto
sólo tiene lugar durante el segundo trimestre de gestación ha dejado de ser
aceptada, la sífilis congénita causa con mayor frecuencia abortos en las eta-
pas iniciales del embarazo que en las fases tardías del mismo (Blanc. 1981:
Harter, 1976). La inflamación del cordón umbilical (lunisilis necrotizante) es
característica de la sífilis congénita. En la forma infantil, son características
una erupción difusa con desprendimiento de la piel y osteocondntis y perios-
titis: sin embargo, los recién nacidos afectados también pueden ser asinto-
mátícos (Ikeda, 1990; Dorfman, 1990). Asimismo, se ha observado fibrosis
difusa en el hígado (hepar lobalum) y el pulmón (neumonía alba) Tras un
periodo de latencia. la lorma tardía se presenta en la niñez o en la edad adul-
ta con una amplia variedad de signos o síntomas, aunque es clásica la tríada
formada por la queratitis intersticial, los dientes de Hutchinson (dientes en
tonel) y la parálisis del octavo par de nervios craneales (sordera). También se
observa con frecuencia periostitis, arqueamiento de las tibias (tibia en sable)
y deformidad de la nariz, que adquiere un aspecto de silla de montar
La sífilis y la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
aparecen frecuentemente en el mismo paciente, puesto que ambas enferme-
dades comparten factores de riesgo comunes. Los estudios efectuados sobre
esta asociación no han revelado diferencias en la fase de presentación clínica
entre los pacientes con sífilis y sida concomitantes y aquellos que no están
afectados por el VIH (Hutchinson. 1991; Gourevitch, 1993) Existe controver-
sia sobre el hecho de si el sida concomitante puede afectar el curso clínico de
te una tendencia a que aparezca una erupción más grave y atipica, a que los
síntomas constitucionales sean más intensos y, en general, a que la enferme-
dad siga un curso más maligno en los pacientes con sida (Tramont. 1995) Sin
embargo, otros autores han encontrado pocas diferencias en estas dos fases
de la enfermedad entre los pacientes afectados y no afectados por el VIH (Hut-
chinson, 1991: Musher, 1990). Sobre lo que no existe duda alguna, en cual-
quier caso, es sobre el hecho de que los pacientes con sida enfermos también
de sífilis tienen una mayor predisposición a desarrollar neurosililis, y a des-
arrollarla de manera más rápida que los sifilíticos que no están afectados por
el sida (Tramont. 1995; Musher, 1990: Johns. 1987) En este caso, se ha pues-
to de manifiesto que existe una relación con el tratamiento con penicilina a
unas concentraciones insuficientes para atravesar la barrera hematica y acce-
der al lugar de la infección, el SNC (Berry, 1987). Además, en los pacientes con
sida hay una elevada incidencia de afectación ocular, siendo la uveitis anterior
la manifestación más común de la infección (Tramont, 1995).
Pian
El pian (también denominado frambesia, parangi, paru. buba o bouba) es una
enfermedad crónica causada por T. pallidum subesp. pertenue. Esta enferme-
dad, que ha afligido desde antiguo a las personas que viven en zonas tropica-
les, tiene una prevalencia significativa en áreas rurales de paises tropicales con
lluvias intensas. Tras un descenso alrededor de 1950 debido a las grandes
 CAPÍTULO 52 • INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
campañas emprendidas para el control de las treponematosis. la incidencia de
la frambesia ha vuelto a aumentar en algunas zonas (Engelkens, 1991).
La frambesia se contrae durante la niñez, antes de los 15 años, por contac-
to directo, a través de desgarros en la piel que permiten la entrada de los tre-
ponemas. Las lesiones iniciales aparecen, generalmente, unas tres semanas
después de la inoculación, por término medio. Pueden aparecer pápulas en
número variable (entre una y varias), con mayor frecuencia en las extremida-
des inferiores, que seguidamente se ulceran o evolucionan hasta convertirse
en lesiones papilomatosas. En estas lesiones existen numerosos treponemas,
Es normal que estas lesiones se resuelvan espontáneamente; sin embargo,
también son frecuentes las recaídas que eslán precedidas por malestar, fiebre
y una linfadenopatía generalizada seguida de lesiones diseminadas en la piel.
Muchos pacientes entran en un periodo de latencia durante el que no hay sig-
nos o síntomas clínicos evidentes. En la mayor parte de ellos, la enfermedad
no da manifestaciones de ningún tipo; sin embargo, un 10°-ó de los afectados
desarrolla frambesia tardía, en la que son patentes las lesiones destructivas e
irreversibles en los huesos, cartílagos, tejidos blandos y piel (Engelkens.
1991). También se han descrito lesiones cardiovasculares y en el SNC seme-
jantes a las que se observan en los casos de sífilis (Román, 1986).
Sífilis endémica
La sífilis endémica (bejel) es una enfermedad crónica no venérea, conse-
cuencia de la infección por T. pallidum subesp. endemicum. La enfermedad
es antigua y, aunque ya no está tan extendida como lo estuvo en un momen-
to, todavía se dan casos en zonas con clima cálido y seco de Oriente Medio
y África. La prevalencia de la enfermedad ha experimentado un aumento en
la región africana del Sahel (Engelkens, 1991).
La enfermedad se transmite por contado directo con lesiones activas,
dedos contaminados y utensilios de comida y bebida. Las condiciones de
hacinamiento e higiene escasa son típicas entre las personas afectadas. La
infección primaría tiene lugar en niños con edades comprendidas entre los 2
y los 15 años, aunque la enfermedad también puede darse en los individuos
adultos de la misma familia, y también los adultos que no han sufrido la enfer-
medad durante la niñez pueden ser infectados por sus niños.
El tamaño del inoculo (dosis infectante) es pequeño y las lesiones primarias
de la sífilis endémica temprana, que aparecen principalmente en la mucosa oro-
faríngea, son, a menudo, inaparentes. Frecuentemente, las manifestaciones clí-
nicas iniciales de la enfermedad aparecen en una segunda fase y consisten en
la aparición de placas mucosas, condiloma lata, estomatitis angular, linfadeno-
patía generalizada y osteoperiostitis dolorosa. Estos síntomas son seguidos por
un periodo de latencia de duración variable. La fase tardía se caraderiza por la
destrucción de tejidos en la piel, huesos y cartílagos, de manera preferente en la
nariz y el paladar, con afectación de la laringe en algunas ocasiones.
Pinta
La pinta (carate, mal de pinto, azul) es causada por T. carateum. La enfer-
medad es endémica en zonas rurales de áreas tropicales de América Central
y del Sur y ha reaparecido, recientemente, en México y Colombia, dos países
en los que había sido erradicada desde 1950 (Engelkens, 1991). Los indivi-
duos afectados primariamente son los niños con edades por debajo de los
cinco años. Se cree que la inoculación tiene lugar por contacto no venéreo
con la piel o mucosas. Es difícil caracterizar la patogenia de la enfermedad,
ya que, a diferencia de otras treponematosis que afectan al hombre, no hay
modelos animales disponibles y el treponema responsable no puede ser cul-
tivado de forma continua.
Como sucede en el caso de otras infecciones por treponemas, también
existen en la pinta fases temprana y tardía, aunque en esta enfermedad es
frecuente que exista un solapamiento entre ellas. Unos dos meses después
de la inoculación, aparece una pápula primaria o placa en el lugar por donde
penetró el microorganismo, que puede ir acompañada o no por una Imlade-
nopatia localizada Esta lesión pnmaria se resuelve y, unos meses o años
más tarde, aparecen las lesiones secundarias diseminadas, o "pintides", que
persisten durante largos periodos o bien se resuelven para volver a reapare-
cer. En la pinta tardía, las lesiones, que pueden permanecer de por vida,
muestran hipopigmentación, atrofia de la piel, e hiperqueratosis. La piel pare-
ce ser el único órgano afectado por esta enfermedad.
1133
Diagnóstico de laboratorio de las treponematosis
Debido a que los agentes etiológicos de las treponematosis humanas no
pueden aislarse por las técnicas habituales de cultivo microbiológico. su detec-
ción se lleva a cabo mediante visualización directa de los microorganismos en
los especímenes procedentes de las lesiones o de forma indirecta por méto-
dos inmunológicos. Cada fase de las treponematosis requiere una modalidad
particular de prueba. En las fases tempranas, cuando las lesiones están pre-
sentes, se utiliza la microscopía directamente. En las fases tardías, se emple-
an las técnicas serológicas. Para el escrutinio preliminar se utilizan pruebas no
específicas basadas en la detección de anticuerpos no treponémicos, mientras
que la confirmación del diagnóstico se lleva a cabo con métodos que detedan
anticuerpos treponémicos específicos. Es importante tener presente que nin-
guna de estas pruebas de laboratorio comúnmente utilizadas es capaz de dis-
tinguir entre especies que están intimamente relacionadas y las subespecies
de los Ireponemas patógenos, por lo que la diferenciación debe establecerse
basándose en las evidencias clínicas y epidemiológicas.
Microscopía de campo oscuro. Cuando es posible obtener una muestra
directamente de las lesiones, como sucede en las fases pnmaria y secundaria
de la sífilis, asi como en la fase temprana de la sífilis congémta (chancros, pla-
cas mucosas, condiloma lata), la lesión debe limpiarse primero con agua esté-
ril (sin jabón o antisépticos) y a continuación debe realizarse sobre la misma una
suave abrasión. Seguidamente se aplica presión en la base de la lesión para
oblener un exudado seroso que se acumula en ésta. Una gota de ese exudado
se coloca en un portaobjetos y se deposita encima un cubreobjetos. La mues-
tra debe examinarse inmediatamente, puesto que la visualización de la movili-
dad característica de los treponemas es un requisito necesano para la identifi-
cación definitiva. Debido a su extrema delgadez, los treponemas no pueden
observarse mediante la microscopía óptica convencional. Es necesario utilizar
la microscopía de campo oscuro, que emplea un condensador que hace que los
rayos de luz incidan sobre los Ireponemas en ángulo oblicuo, provocando que
la luz salga reflejada de éstos, con lo que las bacterias aparecen como objetos
brillantes sobre un fondo oscuro. El examen en campo oscuro puede arrojar
resultados positivos incluso muchas semanas antes de que una prueba de lipo
serológico sea positiva, y tiene una sensibilidad del 80% para el diagnóstico de
la sífilis (Larsen. 1995). Debido a que puede haber una posible confusión con
los treponemas comensales que existen en la boca, la observación en campo
oscuro no está recomendada en el caso de muestras que se obtengan a partir
de lesiones orales. Ademas, existen tres especies de Treponema. son habitan-
tes normales de la región genital (T. phagedensis. T. refríngeos y T. mmutum).
que potencialmente pueden confundirse con I pallidum en un examen con mi-
croscopía de campo oscuro. Una limpieza cuidadosa de la zona es importante
para reducir las posibilidades de que se produzca esta confusión
Microscopía de fluorescencia. Los anticuerpos específicos frente a T.
pallidum marcados con FITC (isotiocianato de fluoresceína) pueden utilizarse
para la detección directa de treponemas en las muestras obtenidas de las
lesiones, y evitan la necesidad de tener que observar la movilidad de las bac-
terias. La prueba puede realizarse sobre extensiones secas y lijadas de flui-
dos lisulares realizadas en un portaobjetos (fluorescencia directa con anti-
cuerpos [DFA-TP]) o sobre secciones de muestras de tejidos incluidas en
parafina (fluorescencia directa con anticuerpos sobre tejidos [DFAT-TPJ).
Existen anticuerpos monoclonales disponibles comerciaimente, que pueden
utilizarse en estas pruebas en lugar de los anticuerpos policlonales proce-
dentes de conejos y seres humanos sifilíticos adsorbidos sobre la cepa Rei-
ler de T. pallidum. que han sido empleados hasta ahora y son menos especí-
ficos. Cuando se utilizan para examinar exudados y fluidos procedentes de
lesiones frescas, ambas técnicas (DFA-TP y DFAT-TP) tienen una sensibili-
dad de casi el 100%, comparadas con la tinción de impregnación argéntica de
Stiener para la sífilis congémta (Larsen, 1995). Debido a que estas pruebas
son especificas para los treponemas patógenos, deben utilizarse para el exa-
men de muestras obtenidas a partir de lesiones en la boca.
Métodos serológicos no treponémicos. Los ensayos no treponémicos
detedan la presencia de anticuerpos que se generan frente a material de natu-
raleza lipoproteica liberado por las células dañadas y la cardiolipina de los tre-
ponemas (es decir, anticuerpos producidos como consecuencia de la respuesta
del sistema inmune del huésped frente a lípidos tanto de él mismo como de las
espiroquetas), y en consecuencia no son específicos de Treponema. De forma
 1134 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
colectiva, estas pruebas se conocen con el nombre de pruebas reagínicas. aun-
que el término reagina, aplicado al diagnóstico serológico de la sífilis, parece
poco afortunado, ya que se puede confundir con los anticuerpos de la clase E
(IgE), que también reciben el nombre de reaginas. Entre estas pruebas se
encuentran el método VDRL (prueba de la reagina en portaobjetos), RPR (prue-
ba rápida de la reagina en plasma con tarjeta circular), USR (prueba de la reagi-
na en suero sin calentar) y TRUST (prueba de la reagina en suero sin calentar
con roio de toluidina). Todos estos métodos utilizan un antigeno fosfolipídico (car-
diolipina) reforzado con lecitina y colesterol en partículas coloidales. En todos los
casos, la aglutinación de esas partículas se considera resultado positivo. Pues-
to que la aglutinación es el criterio utilizado para determinar la positividad de las
pruebas, es prelerible utilizar en todas ellas suero en lugar de plasma; en el caso
del método VDRL. el suero debe ser tratado con calor para eliminar reacciones
inespecífícas. Para las pruebas RPR y USR. no es necesario someter a la mues-
tra a calentamiento si se añade a la misma cloruro de colina. En el caso de las
pruebas VDRL y USR. la reacción de aglutinación debe visualizarse microscópi-
camente (xlOO aumentos), mientras que la presencia de carbón y de cobrante
en los métodos RPR y TRUST, respectivamente, hacen que la reacción sea
macroscópicamente visible.
Los anticuerpos detectados mediante todas estas pruebas aparecen gene-
ralmente enlre la primera y cuarta semanas después de la formación del
chancro primario. Por tanto, el momento en el que la muestra es tomada en
la lase primaria puede afectar a la sensibilidad del método. El titulo aumenta,
se mantiene elevado durante el primer año. y luego comienza a disminuir. Las
pruebas se negativizan espontáneamente en el 25% de los pacientes. Pue-
den darse resultados tanto falsos negativos como falsos positivos. Los falsos
negativos son consecuencia de un título elevado de anticuerpos en el suero
(debido al fenómeno de zona) y se dan especialmente en el caso de la sífilis
secundaria. Este problema puede solucionarse llevando a cabo una dilución
de la muestra antes de realizar el ensayo. Los resultados falsos positivos pue-
den darse ocasionalmente en pacientes alectados por ciertas enfermedades
agudas como la hepatitis, ciertas infecciones víricas y en mujeres embaraza-
das o con carácter crónico en el caso de individuos aquejados por enferme-
dades del tejido conectivo (Larsen 1995).
Las pruebas positivas se titulan repitiéndolas con diluciones dobles senadas
de la muestra. Los títulos se utilizan para determinar la eficacia del tratamiento.
Un descenso de cuatro veces en el titulo de anticuerpos al cabo de 12 meses en
el caso de la sífilis temprana, así como una disminución de cuatro veces a los
seis meses y de ocho a los 12 en la sífilis tardía, es evidencia de que el trata-
miento es adecuado (Romanowski, 1991). Aquellos pacientes tratados durante
la fase temprana de la enfermedad tienen más posibilidades de revertir a nega-
tivo que los que son tratados en la sífilis tardía (Brown, 1985; Rumara. 1980).
El rastreo de ciertos grupos de población para la detección de sífilis implica
el empleo de muestras o procedimientos particulares. Por ejemplo, en el caso
de la sífilis congenita, el suero de la madre es un espécimen mejor que la san-
gre del cordón umbilical o del propio neonato, muestras que han sido utiliza-
das en el pasado (USPHS, 1968). Otro ejemplo lo encontramos en el diag-
nóstico de la neurosífilis. que requiere resultados positivos tanto con las
pruebas que detectan anticuerpos treponémicos específicos como con el
método VDRL. a partir del liquido cefalorraquídeo. El test VDRL es muy espe-
cífico, aunque poco sensible, para el diagnóstico de la neurosífilis. Puede dar
resultados negativos en un 22% a un 69% de pacientes con neurosífilis activa,
y su sensibilidad en el caso de neurosífilis inactiva puede ser tan baja como un
10% (Schmidt, 1980; MacLean, 1996). A pesar de esto, ninguno de los restan-
tes métodos de tipo no treponémicos tienen utilidad para llevar a cabo la detec-
ción de esta complicación tardía de la sífilis y, por otro lado, las pruebas tre-
ponémicas adolecen de pérdida de sensibilidad, y dan falsos positivos debido
al paso de anticuerpos a través de la barrera hemática en el cerebro.
Se han descrito resultados aberrantes obtenidos con varias técnicas de tipo
no treponémico en el caso de pacientes sifilíticos coinfectados con el VIH.
incluyendo retrasos en la seroconversion: sin embargo, no es frecuente que en
pacientes de sida se observe seronegatividad frente a la sífilis, en el caso de
coinfección (Flores, 1995). La lasa de resultados falsamente positivos aumen-
ta ligeramente en el caso de pacientes con sida (un 4% frente al 1% en indivi-
duos sin sida); sin embargo, al menos un estudio ha asociado el incremento en
la tasa de resultados positivos con la adicción a las drogas por vía intraveno-
sa, más que con la propia infección por el VIH (Larsen. 1995; Flores. 1995:
Hernández-Aguado, 1998). Los falsos negativos también aparecen en los
pacientes con sida que tienen sífilis concomitante, debido a la respuesta exa-
cerbada de anticuerpos no treponémicos que se produce en algunos sujetos,
con el consiguiente efecto de zona (Gourevitch, 1993). Además, el título de
anticuerpos no treponémicos no disminuye en algunos pacientes de sida con
sífilis a pesar del tratamiento, aunque algunos autores piensan que esto está
más relacionado con la fase de la enfermedad en la que se inició el tratamien-
to que con la infección por el VIH, puesto que un comportamiento parecido se
ha observado también en enfermos sin sida (Larsen. 1995).
Métodos serológicos treponémicos. Estos métodos detectan la pre-
sencia de anticuerpos frente a antígenos treponémicos y se utilizan para ratifi-
car los resultados positivos obtenidos mediante las pruebas de tipo no trepo-
némico, o para confirmar la infección en el supuesto de un resultado negativo
con estas últimas en las fases tardía o de latencia de la enfermedad, lo que
puede suceder en un 30% de pacientes con sífilis terciaria (Larsen, 1995). El
test de absorción con anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS). una
de las dos técnicas estándar treponémicas especificas, es una prueba de
inmunofluorescencia indirecta. Se lleva a cabo con suero del paciente calen-
tado y absorbido sobre antigenos de la cepa Reiter no patógena para eliminar
los anticuerpos que produzcan reactividad cruzada, que se deposita sobre un
portaobjetos sobre el que previamente se han fijado células de la cepa Nichols
de T. pallidum subesp. pallidum, añadiéndose linalmente anticuerpos trente a
inmunoglobulinas humanas marcados con isotiocianato de fluoresceina
(FITC). La observación de treponemas visibles bajo microscopía de fluores-
cencia indica la existencia de anticuerpos frente a los treponemas patógenos
en el suero del paciente. El segundo método, que es preferido en muchos labo-
ratorios debido a su relativa sencillez de ejecución, es el de la microhemoa-
glulinación con Treponema pallidum (MHA-TP). En este caso, el suero absor-
bido se mezcla con eritrocitos de oveja sensibilizados con 7! pallidum (cepa
Nichols), mediante sonicación en una placa de microtitulación. Si el suero con-
tiene anticuerpos se observará la aglutinación de los glóbulos rojos. En gene-
ral, ambos procedimientos (FTA-ABS y MHA-TP) son equivalentes excepto en
la lase pnmana de la sífilis, en la que la prueba FTA-ABS muestra una mayor
sensibilidad (Augenbraun. 1998: Han, 1980). En la Tabla 52-1 se muestran los
valores de sensibilidad y especificidad de las diferentes técnicas de tipo no tre-
ponémico y treponémico (Larsen, 1995).
Los anticuerpos treponémicos específicos aparecen durante la sífilis prima-
ria y pueden seguir detectándose durante toda la vida del individuo con inde-
pendencia del tratamiento, aunque hay excepciones. Los pacientes con sida
muestran una mayor tendencia a convertirse en seronegativos tras la terapia
antimicrobiana (Haas, 1990). La prueba FTA-ABS es la primera en dar resul-
tados positivos, seguida por la MHA-TP y. linalmente. por los métodos no tre-
ponémicos, un poco después. Los métodos treponémicos no se utilizan para
el escrutinio en el entorno clínico, puesto que aproximadamente un 1% de la
población puede dar resultados lalsamente positivos con los mismos. Los fal-
sos positivos con la técnica FTA-ABS se detectan entre los ancianos, las per-
sonas con enfermedades del tejido conectivo y en individuos intectados con
bacterias relacionadas con los treponemas, como las especies del género
Borrelia (Larsen, 1995). La frecuencia de falsos positivos con el método MHA-
Tabla 52-1 Sensibilidad d e los m é t o d o s serológicos para
el diagnóstico de la sífilis en las diferentes fases
de la e n f e r m e d a d '
Fase de la sífilis
Prueba Primaria Secundaria Latente Tardía
VDRI 78(74-87) 100 95 (88-100) 71(37-94)
RPR 86(77-100) 100 98(95-100) 73
FTA-ABS 84(70-100) 100 100 96
MHA-TP 76(69-90) 100 97(97-100) 94
* Valores de sensibilidad expiesados como porcentajes. Los números entro pa-
réntesis representan los rangos de los valores de sensibilidad en los esludios
llevados a cabo en el Center loi Diseasc Control and Prevention
VORI = Vcncreal Disease Research Laboralory. RPR = prueba rápida de la rea-
gina; FTA-ABS = test de absorción con anticuerpos treponémicos lluorescenles;
MHA-TP • ensayo de microhemoaglutinacion para anticuerpos frente a Trepone-
ma pallidum.
Datos lomados de Larson SA, y cois Laboralory diagnosis and inrerpreíalion
ol tests lor syphilis Clin Microbio! Rev 1995; 8:1
 CAPÍTULO 52 • INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
TP es menor que la que se encuentra cuando se emplea la inmunofluores-
cencia indirecta (FTA-ABS) (Larsen, 1995).
Los ensayos de inmunoadsorción acoplados a enzimas (ELISA), que utilizan
antigenos treponémicos específicos, han comenzado a estar disponibles para su
empleo en los labóratenos clínicos. Ofrecen las ventajas de tener un formato que
facilita la manipulación de un gran numero de muestras y una interpretación obje-
tiva de los resultados. La sensibilidad y la especificidad de los métodos comer-
ciales actualmente disponibles son comparables a las técnicas FTA-ABS y MHA-
TP (Norgard, 1993: Lefevre. 1990). Estos métodos han sido utilizados para el
escrutinio en situaciones especificas, como las de los donantes de sangre, y, jun-
to con los métodos de tipo no treponémico, en los laboratorios que procesan un
gran volumen de muestras en áreas donde existe población con una alta preva-
lencia (Aberle-Grasse. 1999: Reisner, 1997). Los enzimommunoensayos (EIA)
que utilizan antigenos no treponémicos y los procedimientos específicos para la
detección de IgM también están disponibles para el rastreo y el diagnóstico de la
sífilis congénita, respectivamente (Hcoper. 1994: Stoll. 1993).
Los métodos moleculares, como la transferencia o Western btot (WB) y la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). están disponibles en algunos
laboratorios de referencia. El WB está recomendado para el diagnóstico de la
sífilis congénita (Larsen, 1995). El uso de la PCR ha sido apoyado en el caso
del diagnóstico de la neurosílilis, en especial en los pacientes con sida, aun-
que los esludios realizados no han demostrado que existan ventajas sustan-
ciales sobre los métodos utilizados habitualmenle (Marra, 1995).
Tratamiento de las treponematosis
Las subespecies de T. pallidum y 7! carateum son uniformemente suscep-
tibles a la penicilina y otros antibióticos [i-lactámicos. El tratamiento de la sífi-
lis primaria, secundaria y de la sífilis latente temprana consiste en una única
inyección intramuscular de penicilina G-benzatina. La frambesia, la pinta y la
sífilis endémica se tratan con el mismo antibiótico, aunque con una dosis más
baja (Engelkens, 1991). Los contactos en el ámbito familiar con pacientes
afectados por estas tres últimas enfermedades se tratan de igual forma. En el
caso de personas alérgicas a la penicilina, se puede utilizar doxiciclina o tetra-
cilina. Los macrólidos ya no están recomendados para el tratamiento, puesto
que se ha observado que su eficacia es inferior al 90% (Schroeler, 1972).
Para la sífilis latente tardía o sífilis de duración desconocida se administran
dosis múltiples de penicilina G-benzatina. En el caso de la frambesia, la pin-
ta o la sífilis endémica, la fase en la que se encuentra la enfermedad no afec-
ta al tratamiento (Engelkens. 1991). Para el tratamiento de la neurosílihs y la
sífilis congénita se administran por via intravenosa dosis elevadas de penici-
lina G en solución acuosa. El CDC de Atlanta no recomienda cambio alguno
en las pautas de tratamiento establecidas en los pacientes con sida y sífilis
concomitantes: sin embargo, otros autores sugieren que estos pacientes
deberían ser tratados con dosis elevadas de penicilina, incluso para el trata-
miento de la sífilis en fase primaria, dada la propensión que tienen los mismos
para desarrollar neurosífilis (Tramonl. 1995; Musher, 1991).
GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRÓNICA
Descripción. Un cierto número de espiroquetas no caracterizadas (espiro-
quetas relacionadas con patología oral [PROS]) y algunas especies del género
Treponema (entre ellas, como más comunes. T denticola y T. socranskr) han
sido aisladas cada vez con mayor frecuencia y en número elevado de las encí-
as de los pacientes con gingivitis ulcerativa y periodontitis crónica, en compa-
ración con lo que se observa en el caso de individuos con las encías sanas
(Riviere, 1991,1995,1996).
Patogenia. No ha podido establecerse una relación causa-efecto definitiva
entre las espiroquetas y estas enfermedades; sin embargo, su presencia en
número significativo solamente en el tejido enfermo sugiere que estas bacterias
pueden jugar un papel como agentes responsables de la gingivitis/periodontitis
Además, las PROS han mostrado reactividad cruzada con anticuerpos mono-
clonales frente a T. pallidum y. al igual que esta especie, tienen la capacidad de
invadir las encias y el tejido de la pared peritoneal en ratones in vitro (Riviere,
1991,1996). Otras espiroquetas orales no poseen estas características
Diagnóstico. Del mismo modo que las especies comensales del género
Treponema que se encuentran en la zona genital, las especies orales de este
1135
género pueden cultivarse utilizando un medio especifico para el aislamiento
de las mismas que contenga antibióticos y condiciones de incubación de
anaerobiosis estricta (Smibert. 1993) Las PROS no han podido cultivarse m
vilro. La detección se lleva a cabo con anticuerpos monoclonales contra T.
pallidum. frente a los cuales estas bacterias exhiben reactividad cruzada.
LEPTOSPIROSIS
Descripción. El género Leptospira incluye 11 genoespecies. siete de las
cuales son patógenas, y más de 250 serovares (Gravekamp, 1993; de Caba-
llero. 1994). Anteriormente, el género estaba formado por tres especies: L,
interrogans (patógena), con 23 serogrupos y más de 200 serotipos, L. bitlexa
y L. parva (ambas no patógenas). Las leptospiras son espiroquetas con las
vueltas de hélice muy apretadas y con los extremos curvados, que tienen un
grosor de 0.1 jim y entre 6 um y 20 um de longitud y que exhiben movilidad
giratoria. Pueden sobrevivir en aguas dulces con pH alcalino, pero mueren en
aguas saladas o con pH ácido y como consecuencia de la desecación.
Epidemiología. La leptospirosis es una zoonosis con dislnbución mundial.
Algunos serotipos se encuentran preferentemente en determinadas zonas geo-
gráficas. Muchos roedores, asi como otros animales tanto salvajes como domés-
ticos, son portadores de estos microorganismos: en cualquier caso, las ratas son
el reservorio más frecuente, representando una importante fuente de infección
para el hombre. La forma más frecuente de infección es por contacto con agua
contaminada con orina, lo que permite la entrada del microorganismo a través de
heridas en la piel o directamente por las membranas mucosas. Algunas perso-
nas tienen un mayor nesgo de infección debido a su profesión (mineros, granje-
ros y agricultores, veterinarios, trabajadores de piscifactorías, empleados de
plantas de depuración de aguas residuales) o a la práctica de ciertas actividades
de recreo (por acampar en zonas próximas a cursos de agua infectados o por
bañarse en los mismos). En EE.UU. se declaran entre 40 y 120 casos al año,
aunque muy probablemente el número sea superior (Farr. 1995).
Patología y patogenia. Tras penetrar en el torrente circulatorio, las bac-
terias se diseminan por localizaciones muy diversas del cuerpo, incluyendo el
SNC y los ojos. Como consecuencia de las lesiones en el endotelio de los teji-
dos infectados se produce isquemia local y hemorragias. También pueden
observarse daños hepatocelulares y en los túbulos renales. El hígado puede
tener un color amarillo-verdoso característico, aunque los cambios histológi-
cos detectados son inespecificos. incluyendo degeneración (redondeamiento
o "balonización"). cuerpos de inclusión acidólilos. regeneración y colestasis.
pudiendo encontrarse las leptospiras en aproximadamente un 25% de los
casos (Dooley, 1976). El riñon muestra nefritis crónica intersticial, necrosis de
los túbulos proximales y cilindros granulares o hialinos, con leptospiras mtra-
tubulares en un 65% de los casos (Arean, 1962). También se han observado
casos de miocarditis, meningitis/encefalitis y miositis (Arean, 1962). Los
mecanismos responsables de los daños endoteliales. hepáticos y renales son
desconocidos, aunque podrían tener una base inmunológica.
Clínica. Típicamente, la infección por leptospiras se manifiesta como una
enfermedad suave parecida a la gripe (forma anictérica); una minoría de afec-
tados sufre una forma más grave de la enfermedad con ictericia, que tiene una
tasa de mortalidad del 5% al 10% (forma ictérica o enfermedad de Weil). La lep-
tospirosis es una enfermedad bifásica, que comienza tras un periodo de incu-
bación variable (entre 2 y 20 días), con la aparición brusca de escalofríos, fie-
bre, dolor de cabeza, mialgias, dolor en la espalda y el abdomen, anorexia.
nauseas y vómitos. Durante esta fase, denominada fase bacteriémica, tiene
lugar una extensa diseminación de la bacteria por el cuerpo. La fase bacterié-
mica dura entre cuatro y siete días y es seguida por un corto periodo (varios
días) durante el que los síntomas remiten, tras el que viene la fase de respues-
ta inmunológica caracterizada por la aparición de anticuerpos frente al microor-
ganismo, meningitis, uveítis, sarpullido y daño hepático y renal. La erupción pre-
tibial se ha asociado con la infección por el serovar autumnalis (fiebre de Fort
Bragg). En muchos casos, la fase inmunológica es suave y dura entre uno y tres
días solamente. Alrededor de la mitad de los pacientes muestran síntomas clí-
nicos de meningitis y pleocitosis en el líquido cefalonaquídeo durante la segun-
da semana de la enfermedad. En el pequeño porcentaje de pacientes con
enfermedad de Weil, las dos fases se fusionan, teniendo los afectados fiebre
elevada persistente, ictericia y hemorragias, a lo que sigue fallo renal oligúrico,
shock y miocarditis. (Arean. 1962; Edwards. 1960).
 1136 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Diagnóstico de laboratorio. Las leptospiras pueden aislarse a partir de
LCR. sangre y tejidos al principio de la fase bacteriémica (primeros 10 días), y
de la orina durante la fase inmunológica (segunda semana y hasta los 30 dias).
Para el cultivo es necesario un medio semisólido (medio de Fletcher o medio de
Ellmghausen, McCullough, Johnson, Harris [EMJH]). que se incuba en la oscu-
ridad a 25°C-30"C entre cuatro y seis semanas. La orina debe ser alcalinizada
si no va a ser procesada inmediatamente. Las leptospiras crecen entre 1 cm y
3 cm por debajo de la superficie del medio, y pueden producir una zona de cre-
cimiento en forma de disco lineal. Las muestras recogidas con periodicidad
semanal de esa localización de los medios de cultivo deben examinarse
mediante microscopía de campo oscuro para detectar las leptospiras con su
movimiento giratorio y los extremos curvados.
Los anticuerpos aglutinantes aparecen durante la primera semana de la
enfermedad, alcanzan un máximo entre la tercera y cuarta semana y pue-
den persistir durante años. Los anticuerpos pueden detectarse por medio
de aglutinación en tubo, microaglutinación en portaobjetos, hemoaglutina-
ción o enzimoinmunoensayo (EIA), con antigenos bacterianos. La técnica
de la microaglutinación utiliza bacterias vivas como suspensión antigénica,
empleándose fundamentalmente en la investigación básica. La PCR se ha
usado para detectar el ADN de las leptospiras en pacientes infectados
(Vinetz, 1996). Recientemente se ha utilizado con éxito un test de EIA
modificado (en forma de bastoncillo que se sumerge en la muestra de sue-
ro) que detecta anticuerpos específicos frente a Leptospira en situaciones
en las que existe una infraestructura de laboratorio minima (Yersin, 1999:
Gussenhoven, 1997).
Tratamiento. La torma grave de la enfermedad necesita tratamiento por
vía intravenosa con penicilina G o ampicilina en solución acuosa, mientras
que la forma menos grave puede tratarse por vía oral con ampicilina. amoxi-
cilma o doxicilina. La profilaxis con doxicilina suministra protección a las per-
sonas que se encuentran en ambientes en los que hay riesgo elevado de
exposición a las bacterias (Farr, 1995). La vacunación de los animales
domésticos y mascotas ha reducido el riesgo de infección a partir de estos
animales en los individuos pertenecientes a los grupos de riesgo, como vete-
rinarios y granjeros. De todas lormas, el riesgo no se elimina totalmente, ya
que se han detectado casos de infección en animales inmunizados a partir de
los que se ha transmitido la intección a humanos (Feign. 1973).
FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA
Descripción. Spihllum minus es una bacteria gramnegativa, con las
vueltas de espira muy juntas, que tienen un grosor de 0,5 um y entre 2 pm
y 5 pm de longitud, y que posee penachos de flagelos bipolares.
Epidemiología. La infección por S. minus en el hombre causa una fiebre
recurrente denominada sodoku. muchos de cuyos casos se han descnlo en
Japón, aunque también se han detectado en otras partes del mundo, con una
distribución muy amplia. Esta bacteria forma parte de la microbiota del tracto res-
piratorio de las ratas y se transmite por una mordedura. La ingestión no parece
ser una causa de infección en el ser humano La enfermedad es muy rara en
EE.UU. Las personas que trabajan en los laboratonos de investigación son uno
de los grupos de riesgo para contraer la infección (Anderson. 1983).
Patogenia y patología. La patogenia de S. minus es poco conocida La
diseminación de las bacterias tiene lugar muy poco tiempo después de la ino-
culación. Las pocas autopsias realizadas de los casos mortales han descrito
necrosis epitelial y un infiltrado mononuclear en la dermis en el lugar de la mor-
dedura original, un infiltrado mononuclear perivascular en la dermis en la zona
de la erupción cutánea, hiperplasia de los ganglios linfáticos y necrosis en el
hígado, bazo, riñon, miocardio y meninges (Washburn. 1995).
Clínica. La herida de la mordedura cicatriza micialmente. pero entre una
y cuatro semanas más tarde aparece una lesión indurada, que puede ulce-
rarse eventualmente, en el mismo lugar. El paciente sufre períodos febriles
recurrentes separados por fases no febriles que duran entre tres y siete días.
La fiebre puede estar acompañada de mialgia. dolor de cabeza y vómitos. La
mitad de los pacientes tienen una erupción macular que puede formar gran-
des placas (Taber, 1979). Los síntomas desaparecen, generalmente, en un
tiempo que oscila entre tres y ocho semanas, aunque pueden producirse
recaídas y complicaciones como endocarditis, meningitis, micocarditis y
nefritis (Washburn. 1995). La mortalidad antes del advenimiento de los anti-
bióticos oscilaba entre el 6% y el 10% (Washburn, 1995).
Diagnóstico de laboratorio. S minus sólo puede cultivarse en animales
(ratones o cobayas) mediante inoculación intraperitoneal de los mismos. La pre-
sencia de los microorganismos puede ponerse de manifiesto mediante tinción
de extensiones de los exudados procedentes de las lesiones o los ganglios lin-
fáticos, por el método de Wright-Giemsa o mediante observación en fresco bajo
microscopía de campo oscuro. No existen métodos serológicos para el diag-
nóstico, aunque hasta un 50% de los pacientes pueden dar un falso positivo con
los métodos no treponémicos para el diagnóstico de la sífilis (Taber. 1979).
Tratamiento. La penicilina G en solución acuosa, administrada por vía
intravenosa, es el antibiótico de elección. La tetraciclina es la alternativa en el
caso de pacientes con alergia a la penicilina.
ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS
Descripción. Anaerobiospihllum succiniciproducens es una bacteria
gramnegativa, espiriforme, que tiene un grosor de entre 0,6 pm y 0,8 pm y
entre 4 pm y 8 um de longitud. Exhibe una movilidad semejante a la de un
sacacorchos al penetrar en el tapón y posee flagelos multitricos en ambos
polos del soma bacteriano.
Epidemiología. Esta bacteria anaerobia puede lormar parte de la micro-
biota comensal normal de gatos y perros sanos, habiéndose sugerido (aun-
que no se ha podido demostrar de forma definitiva) una asociación entre la
enfermedad en humanos y el contacto con estas mascotas (Goddard, 1998;
Malnick, 1990). A. succiniciproducens se ha asociado con una enfermedad
diarreica en pacientes normales y con septicemia en individuos con una enfer-
medad de base que predisponga. Se piensa que el microorganismo penetra
en el torrente circulatorio a partir del tracto gastrointestinal de estas personas
(Tee. 1998; McNeil. 1987). La incidencia de la infección es ba|a. aunque se ha
ido incrementando en los últimos años, debido probablemente a la mejora de
las técnicas de detección mediante cultivo (Goddard, 1998).
Clínica. Los pacientes con gastroenteritis sufren dolor abdominal, vómitos,
y diarrea durante un tiempo que oscila entre tres y siete días; aquellos que no
tienen enlermedad subyacente alguna se recuperan sin mayor problema
(Malnick. 1990). Los casos de septicemia se dan entre individuos con patolo-
gías subyacentes, tales como alcoholismo, ateroesclerosis. tumores, diabetes
mellitus y gingivitis (Goddard, 1998). Hasta un tercio de los afectados por la
septicemia fallecen.
Diagnóstico de laboratorio. A. succiniciproducens crece bien en los sis-
temas automatizados para hemocultivo (Tee, 1998). Tras el subcultivo en agar
chocolate o agar sangre aparecen las colonias al cabo de 2-3 días, que tienen
un aspecto húmedo y miden entre 1 mm y 2 mm de diámetro. Algunas carac-
terísticas bioquímicas de utilidad para la identificación son la ausencia de cata-
lasa, indol y oxidasa, la producción de ácido succinico y ácido acético a partir
de la glucosa (puesta de manifiesto mediante cromatografía de gas-liquido) y
la ausencia de crecimiento a 25'C o 42"C. Existe un medio selectivo para esta
bacteria desarrollado por Malnick y sus colaboradores (Malnick, 1990).
Tratamiento. Debido a la naturaleza poco común de esta infección, aún
no se ha establecido una terapia óptima para el tratamiento de la septicemia.
In vilro. la mayor parte de los aislamientos estudiados son sensibles a la car-
benicilina, cefoxitina. cloranfenicol y metronidazol y resistentes a la vancomi-
cina y clindamicina; sin embargo, los ensayos han tenido carácter limitado y
no han sido estandarizados (Sales, 1982; McNeil, 1987).
ESPIROQUETOSIS INTESTINAL
Descripción. Se han encontrado dos especies de espiroquetas en el
colon de los seres humanos: Serpulma pilosicoliy Brachyspira aalborgi. Estos
microorganismos son gramnegativos, con unas dimensiones que oscilan
entre 0,2 pm y 0.4 pm (diámetro) y 4 pm y 8 pm (longitud). Cerca de cada
polo de las bacterias, en posición subterminal. hay entre 4 y 6 flagelos.
Epidemiología y clínica. S. pilosicoli provoca la espiroquetosis intestinal
porcina, una enlermedad de tipo diarreico que aleda a los cerdos jóvenes, y
también se han recuperado cepas relacionadas con esta especie a partir de
 CAPÍTULO 52 • INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
perros y otros animales (Trott, 1996). No se sabe si los animales actúan como
reservónos en el caso de la infección en humanos. 8. aalborgi está peor
caracterizada. El género contiene esta única especie, que fue denominada
tras su aislamiento del colon de un paciente humano (Hovmd-Hougen. 1982).
La asociación de las espiroquetas intestinales con la infección no está total-
mente establecida, ya que las bacterias han sido identificadas en individuos
tanto sintomáticos como asintomáticos. Parece que existe una mayor preva-
lencia en varones homosexuales que en otros grupos de población (Teglb-
jaerg, 1990). Los síntomas atribuidos a la espiroquetosis intestinal son dia-
rrea, dolor abdominal y sangrado y descargas rectales (Teglb|aerg, 1990).
Además. S. pilosicolise ha aislado de la sangre de pacientes críticos, aunque
el significado de este hallazgo no está claro (Trott, 1997).
Patología y patogenia. Las espiroquetas se pueden observar fácilmente
en los especímenes obtenidos mediante biopsia, ya que torman una franja de
color azul oscuro en la superficie de las células epiteliales del colon, sin afec-
tar a las células en copa o globosas. Los métodos de impregnación argéntica
también permiten una perfecta vísualización de los microorganismos. Las
células epiteliales aparecen normales y no se detecta un incremento de la
inflamación en la lámina propia. La microscopía electrónica revela que las
bacterias se adhieren a la superficie del extremo superior de las células epi-
teliales del colon, quedando orientadas perpendicularmente hacia el lumen
intestinal (Teglbjaerg, 1990). Se ha demostrado la invasión de los macrófagos
epiteliales y de la mucosa en individuos tanto sintomáticos como asintomáti-
cos (Teglbjaerg, 1990). No se ha establecido la patogenia.
Diagnóstico de laboratorio. Las espiroquetas pueden detectarse en las
heces mediante microscopía de campo oscuro y cultivarse a partir de las mues-
tras de heces o de tejidos (obtenidas por biopsia) en agar tripticasa de soja
con un 5%-10% de sangre de caballo o de ternero. La adición de espectino-
micina y polimixina B confieren carácter selectivo al medio (Teglbjaerg, 1990).
En los medios incubados anaeróbicamente las colonias son puntiformes y
débilmente [{-hemoliticas, y aparecen en un período de tiempo que va desde
los tres días hasta las cuatro semanas, dependiendo de la cepa.
Tratamiento. Aunque se han publicado los datos relativos a la sensibilidad
a los antimicrobianos para la especie tipo de S. pilosicoli, no se han descrito
ensayos estandarizados para un número elevado de aislamientos (Trott,
1996). Los pacientes con síntomas de padecer espiroquetosis intestinal res-
ponden al tratamiento con metronidazol (Teglbjaerg, 1990).
DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES
POR BORRELIAS
Las especies del género Borrelia son bacterias helicoidales, microaerófilas,
con unas dimensiones que oscilan entre 0,2 um y 0,5 um (diámetro) y 5 um
y 25 um (longitud), y que presentan entre 4 y 30 vueltas de hélice. Poseen
una envoltura externa o membrana que rodea el cilindro protoplásmico en
espiral, formado por la capa de peptidoglucano y la membrana plasmática que
engloba al contenido citoplasmático de la célula. Entre 7 y 22 filamentos axia-
les (flagelos periplásmicos) son responsables de la movilidad de estas bacte-
rias. Estos microorganismos se multiplican por escisión binaria y necesitan
ácidos grasos de cadena larga para poder crecer. En esta sección se descri-
be a Borrelia burgdorferi, el agente etiológico de la enfermedad de Lyme, asi
como otras especies de Borrelia relacionadas con la fiebre recurrente.
Enfermedad de Lyme
La enfermedad de Lyme es una enfermedad inflamatoria multisistémica que
se transmite por las garrapatas y que puede aparecer a cualquier edad en
ambos sexos (Steere, 1997,1989). Su manifestación clínica más distintiva es
una lesión expansiva de la piel, el eritema migrans (EM), que puede ser segui-
do, semanas o meses más tarde, por la aparición de problemas neurológicos,
cardíacos o en las articulaciones. Las lesiones del tipo EM lueron ya descritas
en Europa en 1910 por Arvid Afzelius (Afzelius, 1910). que asoció su aparición
con la mordedura de la garrapata Ixodes reduvius. La mordedura de esta
garrapata (o la de la especie relacionada, /. ricinus) fue asociada más tarde con
la meningopolineuritis transmitida por garrapatas (síndrome de Garin-Bujadoux
y Bannwarth). Sin embargo, no fue hasta mediados de la década de los 70
cuando Steere y sus colaboradores identificaron la enfermedad como una enti-
1137
dad clínica diferente, localizando su origen en una garrapata intimamente
emparentada, /. dammini, que ahora se denomina /. scapularis (Steere, 1978).
En 1982, Burgdorfer y sus colaboradores aislaron la espiroqueta que lleva
su nombre (Borrelia burgdorferi) a partir de Ixodes dammini. recogida en Shel-
ter Island (estado de Nueva York), asociándola con la enfermedad de Lyme
en base a las evidencias de tipo inmunológico (Burgdorfer. 1986: Steere.
1983). En el periodo siguiente, este microorganismo fue aislado a partir de
sangre (Steere, 1983: Benach, 1983: Berger, 1994; Nadelman, 1990), piel
(Berger, 1992), liquido sinovial (Schmidli. 1998), iris (Preac-Mursic, 1993),
miocardio (Stanek, 1990) y LCR (Steere. 1983; Schmidli. 1998» de pacientes
detectándose respuesta inmune mediada por anticuerpos tanto del tipo igM
como IgG. Hoy día. la enfermedad de Lyme esla reconocida como la infección
transmitida por vector más frecuente en EE.UU.. siendo detectados más de
16.000 casos de la misma en el año 1996 (CDC, 1997).
Epidemiología y patogenia
El agente causal de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi. ha sido
caracterizado minuciosamente y subdividido desde el punto de vista filogenético
en diferentes genoespecies. Actualmente, tres de estas especies están asocia-
das a la enfermedad de Lyme: 8. burgdorferi en sentido estncto (de distnbución
mundial). 8. gariniiy B. atzelii (ambas asociadas con la infección en el continen-
te euroasiático). Cada una de estas especies se ha relacionado, asimismo, con
determinadas manifestaciones clínicas de la enfermedad de Lyme (véase al final
de esta sección bajo el epígrafe Manifestaciones clínicas), aunque no está claro
si estas diferencias se deben a las propias espiroquetas o a otros factores (Ber-
glund. 1995; Postic. 1996; van Dam. 1993) La presencia de 8. burgdorfenen
América del Norte está documentada, al menos en los últimos 100 años, median-
te la técnica de la PCR aplicada al estudio de especímenes de museo de garra-
patas del género Ixodes y de ratones de pala blanca (Persing. 1990: Marshall.
1994), Algunos estudios que han puesto de manifiesto la heterogeneidad gené-
tica de los aislamientos de 8. burgdorfenen EE.UU. (Mathiesen. 1997), apuntan
también hacia la presencia de este microorganismo en la zona desde muy anti-
guo. Se han aislado espiroquetas identificadas como 8. burgdorferi a partir de
roedores y garrapatas en muchas áreas no endémicas de EE.UU. Estos aisla-
mientos muestran, a menudo, un nivel sustancial de heterogeneidad genética, y
algunos de ellos parecen ser genoespecies únicas de 8. burgdorferi sensu lato.
El ciclo enzoótico vital de Borrelia va en paralelo con el ciclo vital del insec-
to vector, que son los miembros del compleio Ixodes ricinus. Las garrapatas
adquieren las espiroquetas típicamente durante la fase larvaria de desarrollo,
mientras se alimentan de un animal infectado que actúa como reservorio de
la bacteria. Las espiroquetas se encuentran en el intestino medio de la garra-
pata y son transmitidas a través de la saliva de ésta mientras se alimenta en
las sucesivas fases de desarrollo, estando implicada la lase de ninfa en la
mayor parte de casos de transmisión a humanos a partir de las garrapatas.
En el este, medio oeste y sur de EE.UU.. 8. burgdorferi es transmitida al hom-
bre principalmente por la mordedura de la garrapata del ciervo, que es res-
ponsable de la mayor parte de los casos que se detectan entre mayo y agos-
to. Ixodes paciticus es el insecto vector a lo largo de la costa oeste de EE.UU.
(Dennis, 1998). Otras garrapatas pertenecientes al complejo /. ricinus son las
que transmiten la bacteria en Europa, mientras que en China /. persulcatus es
la garrapata que está implicada en el proceso (Anderson, 1993). Además de
la transmisión por la mordedura de la garrapata, las espiroquetas adquiridas
durante el embarazo pueden atravesar la placenta causando, aparentemen-
te, infección congénita (MacDonald, 1989).
En la naturaleza, la infección por 8. burgdorferi se mantiene por transmisión
honzontal desde las ninfas infectadas de la garrapata hasta el vertebrado hos-
pedador. Aunque el reservorio animal primario de 8 burgdorfen en Norteaméri-
ca es el ratón de patas blancas, Peromyscus leucopus, muchos otros mamíferos
y pájaros pueden albergar, y en consecuencia transmitir estas espiroquetas
mediante una garrapata vector (Anderson, 1993: Gern, 1998) Diferentes anima-
les, incluyendo varias especies de pájaros, mamíferos y reptiles, pueden actuar
como huéspedes para las especies de Ixodes. Muchas de estas especies aní-
males no son competentes para servir como reservorio de las espiroquetas del
género Borrelia: sin embargo, un aumento en la población de aquéllas puede
ocasionar, subsiguientemente, un aumento en la prevalencia de las garrapatas,
lo que indirectamente puede ocasionar un incremento en la incidencia en la
transmisión de la enfermedad. Se cree que este último escenario explicaría, al
 1138 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
menos en parle, el aumento de casos registrados de la enfermedad de Lyme en
el nordeste de EE.UU., donde el ciervo de cola blanca parece ser el huésped pri-
mario de /. scapularis.
Durante los últimos años se han hecho avances significativos en el conoci-
miento del ciclo de transmisión de la espiroqueta, que ha sido reconocida
como un importante problema de salud pública. Aunque muchos aspectos de
la enlermedad son todavía confusos, se han puesto de manifiesto aspectos
clave sobre su patogenicidad. Tal como se ha descrito en recientes revisiones
(Sigal, 1997a, 1997; Hu, 1997b; García-Moneo, 1997), la patogenia de la en-
fermedad de Lyme podría estar relacionada tanto con los efectos directos
causados por el microorganismo como con efectos indirectos derivados de la
respuesta del sistema inmunitario del hospedador. Las bacterias son inocula-
das en la dermis por la mordedura de la garrapata y se diseminan hematóge-
namente a continuación, uniéndose a diferentes tipos de células a través de
distintas clases de receptores de la superficie celular. Aunque todavía quedan
muchos aspectos por elucidar, parece que durante la fase inicial de la infección
existe tanto una respuesta ineficaz de los fagocitos como una respuesta inmu-
noblástica en la que están implicados componentes humorales y celulares
(Hu, 1997). La liberación de citocinas durante esta respuesta puede ser res-
ponsable, al menos en parte, de algunas de las manifestaciones clínicas de la
forma aguda de la enlermedad de Lyme. También es posible que se activen
respuestas autoinmunes que podrían dar lugar a la forma crónica de la enfer-
medad, que es menos frecuente y no responde al tratamiento con antibióticos.
Manifestaciones clínicas
El primer y más fácilmente reconocible síntoma de la enfermedad de Lyme
es el eritema migrans (EM), que se manifiesta en un porcentaje elevado (entre
el 63% y el 90%) de los individuos afectados, entre dos días y cuatro sema-
nas después de la mordedura de la garrapata (Nadelman, 1995; Gerber,
1996). En el lugar de la mordedura aparece una mácula o pápula rojiza, indo-
lora, que se extiende en círculo, dando lugar a una típica lesión plana con un
diámetro que puede oscilar entre 3 y 70 cm (el tamaño medio es de 15 cm).
con el borde de color rojo brillante y la parte central más clara. El aspecto de
la lesión puede, sin embargo, variar; un eritema confluente o con aspecto de
una diana suele ser bastante frecuente, y también pueden aparecer vesículas
en el centro, así como necrosis. La diseminación hematógena del microorga-
nismo tiene lugar muy pronto, produciendo fiebre, cansancio, dolor de cabeza,
rigidez en el cuello, malestar, dolor musculoesquelético migratorio, lesiones
del tipo EM secundarias y linfadenopatía generalizada, entre otros síntomas
(Nadelman, 1996; Steere, 1997,1987; Berger, 1997).
Sin tratamiento, las lesiones en la piel desaparecen en tres o cuatro semanas nóstica que rodea a la enfermedad de Lyme es debida a que los síntomas son
(con un rango de tiempo que puede ir desde un día hasta 14 meses), aunque
pueden aparecer subsiguientemente daños en uno o en varios sistemas princi-
pales de órganos. En el 10% al 20% de pacientes no tratados en EE.UU., pue-
de producirse una afectación neurológica aguda (Nadelman, 1998), que normal-
mente se manifiesta dentro de las primeras cuatro a seis semanas del comienzo utilizaron primariamente en pacientes procedentes de áreas fuertemente endé-
de la enfermedad. La parálisis de Bell (séptimo nervio) es la manifestación neu-
rológica más común; otras manifestaciones que también pueden producirse son
las neuropatías periféricas, la meningitis linfocítica o la meningoencefalitis (Ber- conocimiento del público sobre la enfermedad, ha conducido a un notable incre-
ger, 1997; Halpenn. 1998). La encefalomielilis se observa mucho menos fre-
cuentemente, pero puede tener graves secuelas (Halpenn. 1998). La mayor par-
te de personas con manifestaciones de tipo neurológico muestran pleocitosis
3
linfocítica (alrededor de 100 células por mm) y una elevada concentración de
proteínas en el LCR (Tumani, 1995; Pohl, 1987). Hasta en un 8% de los casos
puede haber afectación cardiaca aguda (Steere, 1989), que se manifiesta en
forma de diversos grados de bloqueo atriovenlricular, miocarditis o pericarditis.
También se ha observado una manifestación cutánea adicional de la enferme-
dad, el linfociloma por borrelia, pero sólo en pacientes en Europa.
La fase crónica de la enfermedad de Lyme comienza a partir del momento
en que aparece la respuesta inmunológica en el huésped y comienza a dis-
minuir el número de espiroquetas. Los pacientes pueden entrar en una fase
de latencia; algunos de ellos pueden tener, más tarde, manifestaciones der-
matológicas, reumáticas, cardiacas o neurológicas, mientras que otros pue-
den permanecer asintomáticos. Alrededor de la mitad de personas que no
reciben tratamiento en EE.UU. pueden experimentar episodios de artritis
durante dos o más años, y en el 10% de los casos la artritis se vuelve cróni-
ca (Steere, 1987); en muchos casos, la artritis parece responder al trata-
miento con antibióticos (Steere, 1987,1995). Las manifestaciones neurológi-
cas crónicas como la encefalopatía, la polineuropatía o la leucoencefalitis
pueden aparecer al cabo de meses o incluso años después de la infección ini-
cial (Logigian, 1990). La acrodermatitis crónica atrófica (ACÁ), una lesión
cutánea atrófica que contiene espiroquetas de B. burgdorteri (Steere. 1989),
ha sido detectada en pacientes al cabo de 10 años después del inicio de la
enfermedad. Al igual que el linfocitoma por borrelia anteriormente comentado,
la ACÁ parece afectar exclusivamente a pacientes europeos (Asbrink, 1986).
Varios autores han indicado la existencia de diferencias geográficas en lo
que respecta al espectro clínico típico de la borreliosis de Lyme (Nadelman,
1998). En concreto, los síntomas sistémicos agudos, así como la evidencia tar-
día de artritis, se observan con mayor frecuencia en los casos de Norteaméri-
ca. Los síntomas neurológicos y las lesiones cutáneas tardías descritas en el
párrafo precedente se detectan más frecuentemente en pacientes europeos.
Estas diferencias en las manifestaciones clínicas se han correlacionado con
las diferentes especies de Borrelia que tienen prevalencia en los continentes
de América del Norte y Eurasia (van Dam. 1993; Balmelli, 1995). Sin embargo,
la localización anatómica de la mordedura de la garrapata puede tener también
consecuencias en la afectación de órganos específicos; así, por ejemplo, la
mordedura en zonas alrededor de la cabeza y del cuello se asocia frecuente-
mente con enfermedad a nivel del SNC (Berglund, 1995).
Una complicación adicional del cuadro clínico está representada por los
recientes informes sobre coinfección en los pacientes con borreliosis de Lyme
por los agentes etiológicos de la ehriichíosis granulocílica humana y la babe-
siosis (Telford, 1996: Tang, 1997: Krause, 1996: Nadelman, 1997). Estas enfer-
medades comparten el mismo vector, y la coinfección de los pacientes en zonas
donde las tres son endémicas puede dar lugar tanto a manifestaciones clínicas
atípicas como a una enfermedad potencialmente más grave. El conocimiento
de una posible reinfección es necesario a la hora de establecer el protocolo de
laboratorio más apropiado, así como para el establecimiento de un tratamiento
antimicrobiano eficaz en tales casos.
Diagnóstico de laboratorio
Métodos serológicos. Los avances en el diagnóstico de laboratorio de la
enfermedad de Lyme han retrasado la percepción del público sobre la gravedad
y prevalencia de esta enfermedad. Utilizados inicialmente para confirmar tan
sólo una opinión clínica, el aumento en la utilización, cada vez más generaliza-
da, de los métodos disponibles comercíalmente para las pruebas serológicas de
la enfermedad de Lyme ha conducido, cuando menos, a una situación de con-
fusión en el diagnóstico (Luger, 1990). La mayor parte de la incertidumbre diag-
inespecíficos y, al margen de la lesión característica de la piel, el eritema
migrans (que aparece en muchos, pero no en todos, de los pacientes con la
enfermedad de Lyme), hay muy pocas otras características con valor patogno-
mónico. En la década de 1980, las técnicas serológicas para B. burgdorteri se
micas del noreste de EE.UU. Sin embargo, la proliferación de técnicas seroló-
gicas disponibles en el mercado, junto con un aumento en la sensibilidad y
mento en la frecuencia de utilización de estos ensayos. En muchos casos, las
técnicas de diagnóstico serológico se aplican como consecuencia de que deter-
minados pacientes con ciertos síntomas, como cansancio inespecífíco y moles-
tias de tipo neurológico y/o reumatológico, exigen un diagnóstico concreto de
sus dolencias. Dado que esos síntomas pueden ser debidos a causas muy
diversas, la prevalencia global de la enlermedad de Lyme en este grupo de per-
sonas es, a menudo, menor que la tasa de falsos positivos que producen estos
ensayos, lo que conduce a un número absoluto más elevado de resultados fal-
sos positivos en relación con los verdaderos positivos lAmerican Collage ol
Physicians, 1997; Tugwell, 1997). Por otro lado, muchos de los métodos dispo-
nibles en la actualidad no son capaces de detectar la respuesta humoral muy
temprana frente a B. burgdorteri (Agüero-Rosenfeld. 1993: Dressler, 1993); por
lo tanto, el diagnóstico de un paciente sin eritema migrans sospechoso de pade-
cer enfermedad de Lyme en una fase muy temprana puede llegar a ser difícil.
Como sucede con muchos métodos serológicos para el diagnóstico de
infecciones bacterianas, los resultados falsos positivos para anticuerpos fren-
te a 8. burgdorteri pueden deberse a anticuerpos frente a otras bacterias, tales
como las espiroquetas que se encuentran formando parte de la microbiota ñor-
 CAPÍTULO 52 • INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
mal de la boca, así como Treponema pallidum y Leptospira. que exhiben reac-
tividad cruzada. Además, los pacientes con trastornos del tejido conectivo,
como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y espondiloartrítis pue-
den dar también un resultado serológico falsamente positivo (Saulsbury, 1990;
Magnarelli, 1990; Lovece, 1991; Fawcett, 1992). Los falsos negalivos pueden
presentarse al principio de la infección, antes de que se produzcan anticuer-
pos en cantidades detectables (que pueden tardar hasta dos meses en apare-
cer), o en pacientes con inmunosupresión. A pesar de estas limitaciones, es un
error asumir que las pruebas de tipo serológico existentes para el diagnóstico
de la enfermedad de Lyme sean completamente irrelevantes. Si los pacientes
que están siendo analizados son seleccionados cuidadosamente en función de
los síntomas que presentan (siempre que sean compatibles con la enfermedad
de Lyme), y se tienen en cuenta aspectos y consideraciones de índole epide-
miológica para realizar el diagnóstico, el valor predictívo positivo de los méto-
dos serológicos puede ser bastante aceptable, especialmente si los resultados
positivos de la serología se confirman mediante la técnica del Western blol
(WB; inmunotransferencia) (Tugwell. 1997).
Muchos de los problemas actuales en relación con las pruebas serológicas
para la enfermedad de Lyme se deben, probablemente, a las diferencias entre
laboratorios en lo que respecta a su capacidad para ejecutar estos ensayos con
precisión (Bakken. 1997.1992). Ello puede estar relacionado con diversos fac-
tores, incluyendo los tipos de preparaciones antigénicas empleadas como sus-
trato y las diferencias en los métodos utilizados para la preparación de antíge-
nos y otros procedimientos experimentales, así como en los criterios de
interpretación Actualmente, varias instituciones (Centers lor Disease Control
and Prevention, Association of State and Territorial Public Health Laboratory
Directors. United States Food and Drug Administration [FDAj) recomiendan que
se analicen las muestras de suero de pacientes con síntomas de la enfermedad
de Lyme medíante un procedimiento en dos pasos (CDC, 1995). Este procedi-
miento debería comprender en primer lugar un test de escrutinio sensible para
la detección de anticuerpos totales o específicos de clase frente a B. burgdor-
feri, lo que puede llevarse a cabo tanto por mmunofluorescencia (IFA) como por
enzimoinmunoensayo (EIA). Aquellas muestras dudosas o positivas en el ras-
treo inicial deben analizarse complementariamente mediante inmunotransfe-
rencia (WB). utilizando una cepa de B. burgdorferi con bajo número de pases
en laboratorio (p. ej.. la B31) que exprese cantidades adecuadas de proteínas
con valor diagnóstico (enumeradas en los párrafos siguientes). La inmuno-
transferencia debe llevarse a cabo tanto para IgG como para IgM a partir de
muestras de suero de los casos sospechosos que se presenten dentro de las
primeras cuatro semanas desde el inicio de la enfermedad. En el caso de
pacientes que se encuentren más allá de ese tiempo, sólo debe realizarse la
¡nmunotransferencia para IgG. puesto que el patrón de bandas reactivas frente
a IgM que se detecta después de las primeras cuatro semanas del comienzo de
la enfermedad es menos fiable. En el caso de pacientes con síntomas de la
enfermedad de Lyme en fase temprana y que han dado resultados negativos en
el análisis inicial, se recomienda realizar las pruebas serológicas a partir de una
muestra de suero tomada durante la fase de convalecencia, entre dos y cuatro
semanas después de obtenerse la primera muestra.
Los critenos utilizados para interpretar los patrones de inmunorreactividad
frente a IgM obtenidos mediante ¡nmunotransferencia (WB) son los propuestos
por Engstrom y sus colaboradores. En este contexto, un resultado positivo de
existencia de enfermedad de Lyme implica que al menos dos de las siguientes
bandas polipeptídicas, reactivas frente a las IgM del huésped, han de ser delec-
tadas: antígenos de 24 (OspC). 39 y 41 (flagelma) kilodaltons (kDa) (Engstrom,
1995). En el caso de los patrones de inmunorreactividad frente a IgG, los crite-
rios empleados para la interpretación han sido propuestos por Dressler y sus
colaboradores. En este caso, un transiendo es positivo cuando en el mismo se
detectan cinco de las siguientes bandas correspondientes a antigenos de 18.21
(OspC), 28.30.39,41 (flagelma), 45.58.66 y 93 kDa (Dressler, 1993).
La existencia de síntomas clínicos que sugieren una posible enfermedad de
Lyme en pacientes en los que no existe una respuesta humoral detectable
frente a B. burgdorferi (la denominada enfermedad de Lyme seronegativa)
representa una situación problemática. En algunos pacientes seronegativos
con síntomas crónicos es posible demostrar la presencia de una respuesta
blastogénica especifica por células T frente a B. burgdorferi. y este trastorno
ha sido atribuido a la erradicación incompleta de las espiroquetas por el trata-
miento antibiótico (Dattwyler, 1989). Sin embargo, en un estudio prospectivo
1139
con pacientes afectados por la borreliosis de Lyme, con historiales de un pron-
to tratamiento bien caracterizado, no se apreciaron diferencias en el estado
serológico a largo plazo entre los pacientes en los que se suponía que habían
sido tratados adecuadamente de sus síntomas tempranos y los que no (Plorer,
1993). Otros autores han observado que la seroconversion no se ve afectada
por la elección del antibiótico utilizado. La ausencia de seropositividad en estos
casos puede reflejar diferencias en la respuesta inmunológica de ios pacientes
individuales, puestas de relieve por la composición antigenica empleada en los
ensayos serológicos comúnmente utilizados (Agüero-Ftosenfeid. 1993; Ledue.
1996). La liberación y detección de anticuerpos específicos frente a B. burg-
dorferi a partir de inmunocomplejos obtenidos del suero de pacientes con
enfermedad de Lyme seronegativos demuestra que el secuestro de los anti-
cuerpos específicos en algunos pacientes infectados puede contribuir a la
ausencia de anticuerpos detectables frente a la bacteria (Schutzer, 1990).
Finalmente, la ausencia de una respuesta humoral específica frente a S. burg-
dorferi en algunos pacientes con aparente enfermedad de Lyme puede deber-
se a un diagnóstico equivocado de otras enfermedades (algunas de las cuales
también pueden ser transmitidas por las garrapatas) que tengan una forma de
presentación similar (Persing. 1995.1992: Bakken. 1994).
El diagnóstico serológico de la enfermedad de Lyme se ha complicado en
los últimos años debido a la introducción de la vacuna para la misma. Las
vacunas aprobadas en la actualidad, y las que se encuentran en lases avan-
zadas de desarrollo, se basan en la proteina A (OspA) de la membrana exter-
na de B. burgdorferi obtenida mediante técnicas de ADN recombinante Tras
la vacunación, el aumento en el titulo de anticuerpos frente a la OspA es res-
ponsable de la seropositívidad que se detecta mediante los métodos conven-
cionales basados en la técnica de ELISA (Zhang, 1997), Aunque la interpre-
tación de los resultados de la inmunotransferencia (WB) puede servir de
ayuda para distinguir entre infección verdadera y una respuesta inmunológica
inducida por la vacunación (Gauthier. 1999). la variabilidad de estos ensayos,
asi como su coste, son argumentos en contra de su utilización como métodos
de escrutinio o rastreo primarios (Zhang, 1997: Golightly, 1997). Esto signifi-
ca que los inmunoensayos de primera instancia recomendados habitualmen-
te para el rastreo de la enfermedad de Lyme deben de ser cambiados. Por
ejemplo, pueden reemplazarse con pruebas basadas en cepas de Borrelia
que carecen de la proteína OspA (Zhang, 1997) Alternativamente, se podrí-
an desarrollar enzimoínmunoensayos con proteínas recombinantes con el fin
de poder detectar las variaciones de las respuestas inmunológicas entre los
individuos vacunados y los que han sufrido una infección natural.
Cultivo de B. burgdorferi. La mejoras introducidas en los medios artificia-
les para el cultivo de B. burgdorferi ofrecen actualmente la posibilidad de detec-
tar directamente a este microorganismo. Ahora puede recomendarse el cultivo
en el medio Barber-Stoenner-Kelly (BSK) (Barbour. 1984) como método habitual
para el aislamiento a partir de muestras de piel de pacientes con lesiones cutá-
neas compatibles con el eritema migrans, ya que rinde una tasa de aislamiento
superior al 80% (Berger. 1992). Las lesiones cutáneas no tienen, a menudo, el
aspecto característico denominado "ojo de toro", ya que pueden ser alipicas o
encontrarse en las etapas iniciales de su evolución. Diversos estudios han mos-
trado que una mayoría significativa de pacientes en areas endémicas que pre-
sentan un eritema migrans definido dan positivo en los cultivos si la muestra es
obtenida antes de que haya comenzado a administrarse el tratamiento con anti-
bióticos (Berger, 1992). En la Clínica Mayo. B. burgdorlenna sido recuperada en
muchas ocasiones mediante cultivo a partir de las lesiones del eritema migrans.
asi como de un paciente estadounidense con acrodermatitis crónica atrofica
(ACÁ), que muy proóablemente se encontraba infectado hacía más de diez
años. Estas observaciones han sido confirmadas por otros autores (Asbrink.
1985). El hemocultivo o el cultivo a partir de LCR y líquido sinovial dan resulta-
dos positivos con menor frecuencia, aunque pueden ser ocasionalmente alter-
nativas útiles (Schmidíi. 1988; Karlsson. 1990: Wormser. 1998; Benach. 1983).
Reacción en cadena de la polimerasa. Las nuevas tecnologías diagnos-
ticas, como la PCR, tienen también utilidad para detectar directamente el ADN
específico de B. burgdorferi en las muestras clínicas. Algunos estudios han pues-
to de maniliesto que la PCR es la técnica más sensible y especifica para la
detección de B. burgdorferi en muestras de líquido sinovial de pacientes con
artritis de Lyme (Nocton. 1994). En un estudio retrospectivo ciego con cerca de
150 pacientes aquejados de artritis, la PCR tuvo una sensibilidad del 96% y una
especificidad del 100% en la detección de B. burgdorferi en pacientes no trata-
 1140 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
dos (Nocton, 1994). La mayor parte de enfermos que recibieron tratamiento anti-
biótico con las pautas recomendadas dieron resultados negativos con la técnica
de la PCR y sus síntomas desaparecieron, lo que sugiere que dicha técnica pue-
de tener utilidad para monitorízar la eficacia de la terapia y predecir el resultado
de la misma.
El estudio de las muestras de LCR obtenidas de pacientes con síntomas neu-
rológicos ha revelado que el comportamiento de la PCR en el diagnóstico de la
enfermedad de Lyme puede variar; la sensibilidad ha oscilado entre valores que
van casi desde el 0% hasta el 100%, dependiendo de la metodología y del
paciente seleccionado (Schmidt. 1997). Sin embargo, puesto que el cultivo a par-
tir del LCR casi siempre es negativo, un resultado positivo por PCR se conside-
ra, generalmente, un indicador bastante preciso de la existencia de una infección
activa (Luft, 1992). Además, teniendo en cuenta que puede haber una relación
inversa entre un resultado positivo mediante PCR y la producción intratecal de
anticuerpos (Keller, 1992), una prueba de PCR negativa junto con la ausencia
de esos anticuerpos puede ser de utilidad a la hora de excluir la posibilidad de
enfermedad de Lyme a nivel del SNC en la mayoría de los casos.
Otros estudios han demostrado que la PCR ofrece una sensibilidad superior
a la que posee la técnica de aislamiento por cultivo a partir de muestras de piel
obtenidas por biopsia (Schwartz, 1992; Brettschneider, 1998). Además, esta
técnica ha sido empleada para poner de manifiesto la presencia de material
genómico de 8. burgdorferi en la orina de algunos pacientes que presentaban
lesiones en la piel (Schmidt, 1996,1995). La detección del ADN de Borrelia en
muestras de sangre y plasma de pacientes con EM ha tenido menos éxito
(Wallach, 1993; Guy. 1991; Goodman, 1995).
Las pruebas moleculares pueden ser especialmente útiles para el diagnós-
tico de pacientes seronegativos y para supervisar la eficacia del tratamiento
con antibióticos (Schmidt, 1997). Se ha llevado a cabo la detección cuantita-
tiva en tiempo real de 8. burgdorferi en modelos animales, habiéndose esta-
blecido una correlación aparente entre la carga bacteriana y la sintomatología
clínica (Pahl, 1999). La PCR también ha sido utilizada para detectar y tipificar
las borrelias presentes en las garrapatas aisladas a partir de la piel humana
(Liebisch, 1998). En consecuencia, el uso de las técnicas moleculares pro-
mete no sólo aumentar nuestro conocimiento sobre la biología y epidemiolo-
gía de la borreliosis de Lyme, sino que parece ser simplemente una cuestión
de tiempo que estas técnicas ocupen un lugar en el diagnóstico ordinario, en
especial a partir de muestras de líquido sinovial de pacientes con artritis.
Tratamiento y prevención
La valoración de los regímenes terapéuticos utilizados para el tratamiento de
la enfermedad de Lyme ha dependido, en general, de los signos y síntomas clí-
nicos, así como de la información emanada de las técnicas de diagnóstico sero-
lógico, tanto para la definición de un caso como para evaluar la respuesta a la
terapia. La sensibilidad de los métodos serológicos ha mejorado con el tiempo,
aunque éstos continúan teniendo una baja especificidad. Confiar en los mismos
para el diagnóstico puede implicar la instauración de un tratamiento innecesa-
rio. Además, las técnicas serológicas no proporcionan un indicador fiable de la
respuesta a la terapia, ya que una reducción significativa en el titulo de anti-
cuerpos puede preceder por muchos meses a la eliminación de los microorga-
nismos. Como se ha indicado en los párrafos anteriores, los métodos de detec-
ción directa como la PCR pueden resultar útiles para determinar el resultado dei
tratamiento en enfermos con artritis y, posiblemente, en pacientes neurológicos
con la enfermedad de Lyme. En general, el empleo de estos métodos puede
reforzar los estudios sobre la terapia de la enfermedad, al permitir la identifica-
ción de la bacteria en aquellos sujetos que tienen infección activa, y proporcio-
nar una indicación del final de la terapia por su capacidad para valorar la erra-
dicación de los microorganismos.
Las terapias recomendadas para el tratamiento de la enfermedad de Lyme
incluyen la administración de doxiciclina o amoxicilina por vía oral, en los casos
tempranos y sin complicaciones, y ceftriasona intravenosa para las infecciones
más consolidadas con afectación sistémica. Otras terapias que también han
sido utilizadas son la eritromicina por vía oral (en el caso de mujeres embara-
zadas): formulaciones de acitromicina y cefalosponna oral para la enfermedad
temprana; y penicilina intravenosa, particularmente para la neuroborreliosis. La
evaluación inicial de la eficiencia del tratamiento con ceftriasona, utilizando
modelos animales de la enfermedad de Lyme, ha puesto de manifiesto la des-
aparición de 8. burgdorferi. tanto por cultivo como por PCR, de casi todos los
tejidos en una o dos semanas de tratamiento (Malawista, 1994). Ensayos más
recientes con seres humanos han corroborado estos resultados, evidenciando
una respuesta clínica efectiva en la gran mayoría de pacientes afectados tan-
to de la enfermedad de Lyme en fase temprana como de neuroborreliosis.
Aun cuando la mayor parte de pacientes con artritis de Lyme muestran
mejoría con el tratamiento antimicrobiano (Steere, 1995,1994), en algunos de
ellos los síntomas persisten. El aparente fracaso del tratamiento en estos
casos se piensa que es debido a varios factores. Por ejemplo, las espiroque-
tas pueden resistir la terapia debido a una pobre distribución del antimicro-
biano en el líquido sinovial. Otros pueden deberse a mecanismos de autoin-
munidad, sobre los que muchos autores opinan que pueden tener un papel en
el origen de la artritis de Lyme, particularmente de aquellos casos crónicos
resistentes al tratamiento (Hu, 1997).
Otra área de investigación se centra en la frecuencia de cotransmisión de
otras infecciones de tipo zoonótico junto con 8. burgdorferi en zonas endémicas.
Como se indicó anteriormente, el piroplasma Babesia microti y el agente de la
ehrlichiosis granulocítica humana son transmitidos al ser humano por la misma
garrapata (/. dammini) que actúa como vector en el caso la enlermedad de Lyme
causada por 8. burgdorferi. Aproximadamente entre un 10% y un 15% de
pacientes con enfermedad de Lyme de algunas del noreste de EE.UU. muestran
evidencias serológicas de haber estado expuestos a 8. microti. Los estudios pre-
liminares de seroprevalencia en pacientes de la parte superior del medio oeste
sugieren una exposición frecuente, tanto a las especies de Babesia como de
Ehriichia. entre aquellos que han mostrado seropositividad frente a 8. burgdor-
feri (Telford, 1996; Pancholi. 1995; Krause. 1996: Schwartz, 1997). Los estudios
en pacientes que manifiestan una fatiga persistente tras ser sometidos a un tra-
tamiento adecuado para la enfermedad de Lyme muestran que algunos de ellos
están de hecho coinfectados con 8. microti (Krause, 1996). El tratamiento de la
enfermedad de Lyme no tiene efecto sobre la infección subyacente por 8. mlcro-
tr. por tanto, síntomas como fatiga, mialgias, artralgias y similares que continúan
manifestándose bastante tiempo después de un tratamiento contra la enferme-
dad de Lyme pueden ser debidos a otras causas, que deberían ser tenidas en
cuenta en la evaluación clínica de los pacientes con tales síntomas. La infección
por 8. microti se diagnostica preferentemente por métodos serológicos y por
PCR, puesto que los frotis realizados a partir de sangre suelen dar resultado
negativo en los pacientes que tienen el bazo normal.
El riesgo de exposición a estas zoonosis puede reducirse evitando el con-
tacto con garrapatas, lo que se consigue utilizando camisas de manga larga
y pantalones largos, aplicando repelentes para insectos y controlando a las
garrapatas a continuación de una posible mordedura o exposición. Las garra-
patas adheridas deben ser inmediatamente retiradas y la zona de la morde-
dura ha de desinfectarse a fondo (Fish, 1995).
Los estudios iniciales no han apoyado el empleo profiláctico de antibióticos
para la prevención de la enfermedad de Lyme tras la mordedura de una garra-
pata (Shapiro, 1992; Warshafsky, 1996). La posibilidad de contraer la enfer-
medad de Lyme depende de la tasa de infección en las garrapatas (Shapiro,
1992) y del tiempo durante el cual el insecto está adherido a la piel (Piesman.
1987). Además, parece que el riesgo de reacciones adversas frente a los anti-
microbianos puede pesar más que los beneficios potenciales, debido a que es
muy bajo el número de casos de enfermedad de Lyme que pueden prevenir-
se de esta forma. Es concebible que el examen de las garrapatas pueda ser
de utilidad algún día para predecir el riesgo de infección por 8. burgdorferi y
otros agentes causantes de zoonosis. lo que permitiría, en consecuencia, un
tratamiento profiláctico más selectivo.
Recientemente se ha me|orado el potencial de prevención de la enlermedad
de Lyme con el lanzamiento de la primera vacuna aprobada por la FDA para su
empleo en seres humanos (CDC. 1999). Es una vacuna subunitaria, constitui-
da por la proteína OspAde 8. burgdorferi, obtenida por técnicas de recombina-
ción. La investigación sobre vacunas para el hombre se ha centrado en esta y
otras proteínas de la superficie extema, tales como OspB y OspC. El calenda-
rio para la vacuna actual contempla la administración de tres dosis, que tiene
una eficacia de entre el 60% y el 90% (Steere, 1998: Sigal. 1998). La duración
de la protección que confiere la vacuna aún no ha sido establecida, y tampoco
se conoce mucho sobre su seguridad o eficacia en niños menores de 15 años.
La vacuna es. generalmente, bien tolerada; aunque se han observado reaccio-
nes locales y sistémicas suaves, no existe evidencia de que pueda provocar
efectos a largo plazo, tales como afectación neurológica o musculoesquelética.
 CAPÍTULO 52 • INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
Esta vacuna está actualmente recomendada para aquellas personas que estén
expuestas con frecuencia o durante mucho tiempo a las garrapatas en zonas
donde la enfermedad de Lyme tiene carácter endémico (Hayes. 1998). Como
se mencionó antes, el empleo extendido de la vacuna puede tener un efecto
drástico sobre la utilidad de los métodos disponibles en la actualidad para el
diagnóstico serológico de la enfermedad de Lyme.
Fiebre recurrente
La fiebre recurrente es una enfermedad con distnbución mundial en zonas de
climas cálidos y templados, con la excepción de unas pocas zonas en el sud-
oeste asiático, como Nueva Zelanda y Australia (Burgdorfer, 1986). La enfer-
medad, causada por Borrelia recurrenlis, se transmite por el piojo del hombre.
Pediculus humanus. La enfermedad afecta predominantemente a las personas
que viven en condiciones higiénicas deficientes que provocan un aumento en el
número de piojos y favorecen la diseminación de los mismos. La enfermedad
ya no existe en EE.UU., pero sigue siendo endémica en los altiplanos del cen-
tro y este de África y en el sur de la Cordillera de los Andes.
La fiebre recurrente transmitida por garrapatas, una enfermedad con distribu-
ción mundial pero que se detecta muy esporádicamente, se transmite a los seres
humanos que penetran en el habitat de las garrapatas del género Ornithodoros.
representado por ambientes cálidos y húmedos como cuevas, madera en des-
composición, madrigueras de roedores y refugios de animales que se encuen-
tren en altitudes comprendidas entre 500 y 2.000 metros, aproximadamente. En
EE.UU., las especies 8. hermsii. B. luricataey B. parkeri son los patógenos más
comunes. Las garrapatas se infectan al alimentarse de los roedores con borre-
liosis o de otros animales de pequeño tamaño que actúan como reservorio natu-
ral de las espiroquetas.
Los seres humanos contraen la infección a través de la mordedura de la
garrapata o por contaminación de abrasiones de la piel con la hemolinfa de los
piojos aplastados (Dworkin, 1998). Tras entrar en la corriente sanguínea, los
microorganismos se multiplican, causando los síntomas y signos clínicos de la
fiebre recurrente Las bacterias quedan acantonadas en órganos internos
durante los periodos no febriles, en los que las espiroquetas circulantes son
destruidas por los fagocitos en presencia de anticuerpos específicos. Las reca-
ídas se producen cuando las bacterias acantonadas en los órganos y que han
experimentado cambios en su composición antigénica superficial son liberadas
de nuevo al tonente circulatorio (Barbour, 1990).
Las manifestaciones clínicas de la fiebre recurrente transmitida por los pió-
los o por las garrapatas son semejantes, aunque en el primer caso la enfer-
medad es generalmente más grave (Dworkin, 1998; Bryceson, 1970; Horton,
1985; Rahlenbeck, 1995; Southern, 1969). La enfermedad primaria comienza,
característicamente, tras un período de incubación de 4 a 18 días con fiebre,
rigidez, dolor de cabeza, mialgias. artralgias, letargo, fotofobia, tos y dolor
abdominal. Puede desarrollarse una hepatoesplenomegalia con ictericia,
especialmente en el caso de la enfermedad transmitida por piojos, pudiendo
existir afectación neurológica hasta en un 30% de los afectados en este
supuesto, valor que desciende hasta el 10% en los casos causados por la
mordedura de garrapatas. También se ha apreciado afectación respiratoria o
cardíaca, linfadenopatía. daños oculares y otitis media. Durante la infección
temprana puede producirse shock por hipotensión que puede ser mortal. Al
final de la fase febril primaria de la enfermedad aparece con mucha frecuen-
cia una erupción papular, macular o petequial en el tronco que dura uno o dos
días. La fase primaria termina de forma brusca al cabo de unos tres a seis
días. Por lo general las muertes se deben a arritmias cardíacas, hemorragias
cerebrales y fracaso hepático. Normalmente, el individuo sobrevive y los sín-
tomas reaparecen súbitamente entre 7 y 10 días después. En el caso de la
enfermedad transmitida por las garrapatas son características las recaídas
múltiples, cuya duración y sintomatología van disminuyendo a medida que se
suceden las mismas. En la enfermedad transmitida por piojos sólo se dan una
o dos recidivas.
El diagnóstico de la fiebre recurrente se lleva a cabo demoslrando la pre-
sencia de las espiroquetas en sangre periférica mediante microscopía de cam-
po oscuro. Alternativamente, se pueden realizar extensiones gruesas o finas
que se tiñen por los métodos de Giemsa o de Wright y se observan con micros-
copia de campo claro, o mediante microscopía de fluorescencia después de
teñir con naranja de acridína Estos métodos tienen una sensibilidad del 70%
1141
(Southern, 1969). Las técnicas serológicas están poco disponibles y tienen un
valor diagnóstico limitado debido a la variación antigénica que experimentan
estos microorganismos, así como a la reactividad cruzada con muchas otras
especies bacterianas, incluyendo 8. burgdorferi(Dworkin, 1998).
Los antibióticos de elección para el tratamiento de la fiebre recurrente son
la tetraciclma o la eritromicma. El tratamiento se complica a menudo por la
aparición de una reacción de Jarisch-Herxheimer, caracterizada por una sene
de síntomas como fiebre, escalofríos, leucopenia e hipotensión. No existe
vacuna contra la fiebre recurrente. La prevención se lleva a cabo evitando el
contacto con los artrópodos vectores y que los roedores aniden en los alber-
gues humanos, sobre todo en las áreas donde la fiebre recurrente transmiti-
da por garrapatas es endémica. Se deben utilizar insecticidas en las casas y
aplicar repelentes para insectos a la ropa de vestir. La mejor lorma de preve-
nir la enfermedad transmitida por piojos es mantener una higiene personal
adecuada y, cuando sea necesario, aplicar técnicas para despiojar.
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 C A P Í T U L O 53

Micobacterias

• Gail L. Woods, M.D.

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX 1144 Mycobacterium genavense

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium ulceraos
Mycobacterium bovis
MYCOBACTERIUM LEPRAE 1148
Mycobacterium africanum
PRUEBAS CUTÁNEAS 1149
MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS 1146
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO 1149
Mycobacterium avium-Mycobacterium
Muestras
intracellulare complex
Tinciones microbiológicas
Mycobacterium scrofulaceum
Métodos de cultivo
Mycobacterium kansasii
Test para la identificación de micobacterias
Mycobacterium fortuitum-Mycobacterium
chelonae-abscessus complex Test de sensibilidad

Mycobacterium xenopi 1154

TRATAMIENTO
Mycobacterium szulgai
PREVENCIÓN 1155
Mycobacterium malmoense
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium simiae
Mycobacterium avium complex
Mycobacterium marinum
Mycobacterium haemophilum BIBLIOGRAFÍA 1155

Las micobacterias son bacilos aerobios, inmóviles, ácido alcohol resisten-
tes, rectos o ligeramente curvos. Los organismos contienen en sus paredes
ácidos micólicos de alto peso molecular (con 60 a 80 carbonos) que durante
la pirólisis liberan cadenas rectas de ácidos saturados C- a C^ de cadena lar-
: sido aún cultivada in vitro, se comenta separadamente.
ga. La proporción de guanina-citosina en su ADN es de 62 mol a 70 mol%.
Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium bovis y Mycobacterium africa-
num son los patógenos humanos que componen el término Mycobacterium
tuberculosis complex (MTBC). Estos organismos, 'bacilos de la tuberculosis",
son los agentes etiológicos de la tuberculosis humana. Otras micobacterias
diferentes de la MTBC son las denominadas "atipicas". porque difieren de los
bacilos de la tuberculosis. Los términos "micobacterias no tuberculosas" y
otras micobacterias diferentes del bacilo de la tuberculosis" son preferidos
porque estos organismos no son atipicos. sino que simplemente tienen carac-
terísticas diferentes de Mycobacterium tuberculosis.
En 1957, Runyon propuso que las micobacterias no tuberculosas fueran divi-
didas en cuatro grupos según la pigmentación de las colonias y la velocidad de
crecimiento en un medio sólido (Tabla 53-1) (Runyon, 1959). Este sistema de
clasificación tiene, no obstante, limitaciones Por ejemplo, Mycobacterium kan-
sasii es un fotocromógeno. pero en alguna ocasión es no lotocromógeno o
escotocromógeno. Mientras que miembros de Mycobacterium avium intrace-
Ilutare complex (MAC) son no fotocromógenos en el esquema de Runyon, pero
algunos aisladamente producen colonias débilmente pigmentadas, pudiendo
causar errónea clasificación como escotocromógena. Mycobacterium szulgai
es escotocromógena a 37 C y fotocromógena a 25 C. Más aún, cuando se usa
un medio liquido para cultivo de micobacterias como está recomendado (véa-
se más adelante), la tasa de crecimiento como factor de la clasificación usado
por Runyon no es válida. Aquí se usa una clasificación de utHidad clínica de las
micobacterias no tuberculosas basada en su patogenicidad en humanos ipo-
tencialmente patógenos y raramente patógenos) (Woods, 1993). Mycobacte-
rium leprae, que es única entre las micobacterias por su cualidad de no haber
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX
Mycobacteríum tuberculosis
Hoy día la tuberculosis es un problema global. Se estima que en todo el
mundo existen entre 8 y 10 millones de nuevos casos de tuberculosis al año
y de 2 a 3 millones de muertes son a causa de esta enfermedad cada año. En
gran parte del mundo, la tuberculosis es el origen infeccioso más frecuente de
muerte, siendo directamente responsable de aproximadamente el 7% de
todas las muertes y del 26% de todas las muertes prevenibles en todo el mun-
do (Murray. 1990; Snider. 1994).
En EE.UU.. la tuberculosis estaba a la cabeza de la causa de muerte al
comienzo del siglo XX. La mortalidad decreció micialmente por el esfuerzo de
la sanidad pública de alojar a los pacientes con tuberculosis en sanatorios
para mejorar las nutrición y ventilación, y posteriormente gracias a los fárma-
cos antituberculosos. Entre 1953 (cuando la tuberculosis empezó a registrar-
se en una base nacional) y 1984 la incidencia fue cayendo regularmente en
torno a un 5%-6% cada año (Rieder. 1989). La proporción de descenso se fre-
nó drásticamente entre 1984 y 1985, y después esta tendencia se invirtió.
Desde 1985 a 1992 el número de casos de tuberculosis referidos a los cen-
tros para la prevención y control de enfermedades (CDC) incrementó en apro-
ximadamente un 20%. es decir, se refirieron cerca de 51.000 casos más de
 CAPÍTULO 53
Tabla 53-1 Clasificación d e R u n y o n d e las micobacterias
no t u b e r c u l o s a s
Clasificación D e s c r i p c i ó n de colonias
Folocromógena No pigmentadas a menos que sean
expuestas a la luz (óptimamente
durante su crecimiento temprano y con
buena ventilación de la superficie)
Escotocromógena Pigmentadas cuando crecen en la
oscuridad y a la luz
No folocromógena No pigmentadas cuando crecen en
la oscuridad y a la luz
De rápido crecimiento Crecimiento en medio sólido en siete días
o menos
los esperables (CDC. 1993). En las áreas metropolitanas, el mayor incremen-
to se dio en la ciudad de Nueva York. Los factores contribuyentes a este exce-
sivo número de casos incluyen la extensión epidémica del virus de la inmuno-
deficiencia humana (VIH), un deterioro en una infraestructura de los cuidados
de salud y un incremento en el número de casos de personas sin hogar, tra-
bajadores emigrantes, inmigrantes y pacientes que requerían cuidados cróni-
cos, como en los centros disciplinarios y sanatorios (Ellner. 1993). Desde
1992, la incidencia de la tuberculosis declinó cada año (CDC. 1998).
Además del resurgimiento de la tuberculosis en los EE.UU., otro aconteci-
miento reciente es la aparición de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB),
definida como la enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis que
es resistente a 2 o más antimicobacterianos de primera linea utilizados en
los EE.UU. para tratar tuberculosis (véase más adelante, en Tratamiento).
Desde 1988, el CDC investigo 7 epidemias de MDR-TB que afectaron a cer-
ca 200 personas (predominantemente personas infectadas por el VIH) en
hospitales y centros penitenciarios en Nueva York y Florida (Jacob. 1994).
Sólo cuatro de estas epidemias fueron notificadas desde 1976 a 1987 y las
personas afectadas eran personas sin infección por VIH. La mortalidad en
las recientes epidemias tue alta (del 72% al 89%), con rápida evolución
desde el diagnóstico hasta la muerte (con una media de 1 a 4 meses).
También se produjo la transmisión de MDR-TB a trabajadores de salud o
guardias de las cárceles y al menos 9 desarrollaron enfermedad activa y 5
murieron.
M. fuberculosis se transmite principalmente por vía respiratoria al inhalar
residuos secos en pequeñas gotitas infectadas (de 1 pm a 10 um de diáme-
tro), pero también por inoculación directa a través de la piel lesionada, lo que
es más posible que se produzca cuando los patólogos u otros trabajadores
del laboratorio manejen muestras infectadas. El foco de infección más impor-
tante son las personas con tuberculosis pulmonar cavilada sin diagnosticar
(con esputo positivo). Las dosis mínimas infectivas en humanos permanecen
desconocidas, pero existen datos que sugieren que la infección puede produ-
cirse tras inhalar tan sólo unos pocos organismos viables (Haas. 1994). El
riesgo de padecer enfermedad pulmonar activa es bajo tras una exposición
aislada, pero el riesgo aumenta bajo situaciones de estrés o en ambiente de
conlinamiento, donde puede darse una repetida exposición al organismo. La
mayoría de las personas que se inlectan con M. tuberculosis no llega a des-
arrollar la enfermedad activa. El riesgo de desarrollarla en personas inmuno-
competentes es del 5% al 10%. Para personas infectadas por VIH, este ries-
go asciende a 7%-10% al año.
Las estructuras especificas, antígenos y mecanismos responsables de
la virulencia de M. tuberculosis son aún desconocidos, pero el factor cor-
dal y las sulfatidas han sido asociadas con la capacidad de las cepas viru-
lentas de producir la enfermedad. In vitro. el factor cordal es el responsa-
ble del aspecto morfológico con el que M. tuberculosis aparece en la célula,
como un manojo de cuerdas serpenteantes puestas en paralelo. Este patrón
de crecimiento se correlaciona con la presencia de trihalosa 6,6 -dimicola-
to en el bacilo. Cuando este glucolipido se inyecta en ratones, inhibe la mi-
gración de neutrofilos y favorece la formación de granulomas y estimula la
protección contra infecciones virales. Su papel específico en la patogenia
de la tuberculosis humana permanece, no obstante, desconocido. Las sul-
fatidas son unos glucolípidos situados periféricamente que inhiben la fu-
• MlCOBACTERIAS 1145
sión de lisosomas con fagosomas que contienen bacilos dentro del macró-
fago, favoreciendo posiblemente la supervivencia del organismo dentro de
la célula.
La respuesta usual del huésped a la infección por M. tuberculosis es la ac-
tivación de la inmunidad celular. Durante la infección primaria (inicial) los ba-
cilos inhalados viajan a los espacios alveolares, donde son ingeridos por los
macrófagos locales. Dichos macrófagos son incapaces de matar a las mico-
bacterias, que se multiplican dentro de la célula durante los siguientes días
tras la infección. Los macrófagos infectados con las micobacterias emigran a
los ganglios linfáticos regionales y presentan los antigenos sensibilizantes
a las células inmunocompetent.es. o bien pasan a la linfa o al torrente san-
guíneo regresando a los pulmones (principalmente a las zonas apicales) y
j
órganos a distancia, como son los ganglios linfáticos, los ríñones, la epífisis
de los huesos largos, los cuerpos vertebrales y las meninges, donde los ba-
cilos continúan multiplicándose hasta que se adquiere la respuesta inmune
celular.
Las células T inmunocompetentes migran desde los ganglios linfáticos lo-
cales al punto de infección en el pulmón. Alli liberan atocinas quimiotáctícas.
inhibidores de la migración y atocinas mitogenéticas que estimulan el reclu-
tamiento de monocitos y linfocitos sanguíneos, la división ce macrófagos y
de los linfocitos y la activación de los macrófagos. Los macrófagos archiva-
dos tienen una marcada actividad microbicida, produciendo atocinas como
la mterleucina-1 (IL-1), el interferón-y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral
(TNF) que estimulan o regulan otros componentes del sistema inmune, pro-
piedades que ayudan en el control de la infección. Las citocinas y enzimas líti-
cas liberadas por los macrófagos también contribuyen a la destrucción tisular
local concomitante. Con el paso del tiempo, la población de células T activa-
da va declinando y es reemplazada por células T de memoria que protegen
contra las reinfección por M. tuberculosis y dan cierta protección cruzada con-
tra infección por otras micobacterias. A pesar de frenar nuevas multiplicacio-
nes de micobacterias en el foco primario y en los metastásicos gracias a la
actividad de los macrófagos y de los linfocitos T de memoria, un foco de infec-
ción permanece en el pulmón indefinidamente (más frecuente en los vértices
donde la presión de oxígeno es alta) y menos frecuente en los focos a dis-
tancia. Por tanto, la capacidad de reactivación de la enfermedad de ese foco
latente existe durante períodos de mmunosupresión.
El foco primario de infección pulmonar, llamado lesión de Gohn. suele ser
subpleural en la pade inferior de los lóbulos superiores o en la parte supe-
rior de los lóbulos inferiores, correspondiendo a áreas de pulmón que reci-
ben la mayor parte del flujo del aire inspirado. Las lesiones (tubérculos) son
bien delimitadas, siendo áreas de consolidación blanco-grisáceo, de 1 cm a
2 cm de diámetro con centro necrótico. Una apariencia similar a los tubér-
culos lueron típicamente encontrados en los nodulos linfáticos regionales,
los cuales, junto con la lesión pulmonar primaria, se denominan complejo de
Gohn. Microscópicamente los tubérculos están formados por granulomas
caseosos y no caseosos bien de limitados: los organismos pueden ser vis-
tos en cortes teñidos con tinción ácido resistente. Con el tiempo esas lesio-
nes son reemplazadas por fibrosis hialina y ocasionalmente se calcifican.
Las lesiones de la tuberculosis miliar son pequeñas áreas de consolidación
(de 1 mm a varios milimetros de diámetro) de color blanco amarillentas sin ca-
seum que recuerdan a los tubérculos. La capacidad de formar un granuloma
está en función de la inmunocompetencia de los huéspedes. Las personas
infectadas con VIH, por ejemplo, pueden tener gran necrosis sin formar gra-
nulomas con algunos neutrofilos. microabscesos y numerosos bacilos ácido
resistentes (BAAR).
En EE.UU., la tuberculosis activa afecta al pulmón en el 85% de los casos.
Las manifestaciones clínicas pueden variar. La presentación clínica puede ser
insidiosa, con unos síntomas constitucionales progresivos de meses de evo-
lución, cuadro catarral con tos productiva frecuentemente atribuible a un mal
resfriado o bronquitis persistente, neumonía o cuadro seudogripal. liebre alta,
dolores y tos. También puede aparecer esputo hemoptoico y dolor pleurítico.
También puede localizarse extrapulmonarmente, pero lo más común es que
afecte a múltiples órganos con o sin infección pulmonar concomitante. La tu-
berculosis multiorgánica, antiguamente una enfermedad de niños y jóvenes,
predomina actualmente entre los más ancianos e individuos inmunocompro-
metidos, especialmente aquellos infectados con VIH y M. tuberculosis (Chais-
son, 1987; Kim. 1990).
 1146 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Mycobacterium bovis Mycobacterium avium-Mycobacterium

Mycobacterium bovis puede ser transmilido a los humanos desde el gana-
do vacuno, bebiendo leche cruda contaminada o por exposición respiratoria
al ganado infectado o a sus cadáveres. También puede ser transmitido de per-
sona a persona por via respiratoria, de humanos a ganado por exposición a
la orina de personas con infección del tracto urinario y de ganado a ganado
probablemente por secreciones bronquiales. M. bovis también puede trans-
mitirse a ganado desde los animales salvajes, por ejemplo, el tejón en Suiza
y Gran Bretaña (Grange. 1987).
Entre 1900 y 1930. M. bovis lúe el responsable del 6% al 30% de los ca-
sos de tuberculosis en EE.UU. y en el Reino Unido (Grange, 1987: Karlson,
1970), La tasa de tuberculosis humana causada por M. bovis descendió
debido a la pasteurización de la leche y a los programas de inspección de
ganado. Desde 1950, M. bovis ha producido menos del 1 % de los casos de
tuberculosis humana en Norteamérica. La mayoría de las infecciones son
extrapulmonares. afectando a los ganglios linfáticos cervicales y mesen-
léricos, el intestino, los huesos y los riñones. Infrecuentemente, la infección
fue consecuencia de la instilación intravesical del bacilo de Calmette-Gué-
nn (BCG) para tratamiento del carcinoma superficial de vejiga (Kristjans-
son. 1993)
Mycobacterium africanum
Mycobacterium africanum. el bacilo del tubérculo "africano", fue el que pri- b a con mayor frecuencia en ancianos de raza blanca que padecían enfer-
mero se aisló en personas del oeste de África (Castets, 1968). Aunque ha sido
aislado principalmente en individuos de África, la prevalencia de la infección
con M. africanum a lo largo del planeta es difícil de determinar, porque puede
no ser correctamente identificado en muchos laboratorios. Los mecanismos
de transmisión y las manifestaciones clínicas de la enfermedad producida por
M. africanum son las mismas que las producidas por M. tuberculosis.
MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS
En general poco se sabe acerca de los antígenos responsables de la viru-
lencia de las micobacterias no tuberculosas: sin embargo, tales antígenos
son. presumiblemente, los responsables de la persistencia de los organis-
mos dentro del sistema mielomonocítico del huésped. La respuesta inmune
a la infección con estas micobacterias es también torpemente entendida. Los
patógenos potenciales se revisan en las siguientes secciones. Las micobac-
terias raramente patogénicas y las infecciones con las que han sido asociadas
se recogen en la Tabla 53-2 (Weinberger, 1992; Weitzman, 1981; Neely, 1989; lo que sugiere que raramente producen enfermedad diseminada en estos
DeChairo. 1973; Edwards, 1978; Cianciulli. 1974; Blacklock, 1983: Tsuka-
mura, 1975,1983: Casimir. 1982; Wallace. 1988: Smilh, 2000; Davison, 1988;
Butler. 1994: Chiodini. 1989).
intracellular complex
Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellular tienen similares ca-
racterísticas de crecimiento y de comportamiento bioquímico que frecuente-
mente hacen difícil su diferenciación en el laboratorio de microbiología, por lo
que el aislamiento de ambas especies se informa como MAC. El MAC con-
tiene 28 serotipos. identificados por seroaglutinación según los antígenos lo-
calizados en la superficie celular o bien por cromatografía.
Antes de la epidemia del síndrome de mmunodeficiencia adquirida huma-
na (sida), el MAC era la segunda micobactena más frecuentemente aislada
en EE.UU. tras M. tuberculosis. Entonces, el porcentaje de MAC aislado in-
crementó, igualando e incluso sobrepasando el número de M. tuberculosis
aislados en muchas partes del pais.
Los bacilos MAC están presentes en cualquier sitio del ambiente. Se han
aislado en el agua, el suelo, el alimento, el polvo doméstico y en múltiples ani-
males, pero la fuente ambiental especifica responsable de la infección al ser
humano permanece aún desconocida (Inderlied. 1993). La puerta de entrada
más probable es el tracto de gastrointestinal, pero la transmisión por vía res-
piratoria también es posible. Desde las zonas de colonización, los organismos
pasan a la sangre e infectan muchos órganos, especialmente aquellos del sis-
tema mielomonocítico.
Durante muchos años la enfermedad pulmonar causada por MAC se da-
medades pulmonares crónicas o en gastrectomizados. pero en los pasados
10-15 años ha legado a ser común en personas sin tactores predisponen-
tes, especialmente mujeres ancianas (Prince, 1989; Dhillon. 2000). La enfer-
medad diseminada por MAC se da de un modo casi exclusivo en mmunosu-
primidos. especialmente en personas con sida avanzado. En EE.UU.. el
MAC fue la causa más común de infección bacteriana sistémica en pacien-
tes con sida a finales de los años 80 y en los inicios de los 90 (Horsburg,
1991). La incidencia de tales casos, sin embargo, descendió desde la exis-
tenci a de la terapia antirretroviral (CDC.1999). El principal factor de riesgo
para la enfermedad diseminada MAC en pacientes con sida es el grado de
inmunosupresión, indicado por el recuento de linfocitos CD4+; tanto es así,
que la enfermedad es infrecuente en individuos con linfocitos CD4* por enci-
ma de 50.
En EE.UU.. los serotipos 4 y 8 de M. avium son los más frecuentemente
aislados en la sangre de personas con sida. Los serotipos de M. intracellula-
re son un pequeño porcentaje de los MAC aislados en personas con sida y se
aislan preferentemente en los esputos y con menos frecuencia en la sangre,
individuos (Yacrus, 1990; Guthertz, 1989).
Las manifestaciones de la enfermedad producida por MAC dependen del
sitio y la extensión de la infección. La infección pulmonar puede ser asinlo-

Tabla 53-2 Micobacterias raramente p a t o g é n i c a s e infecciones a s o c i a d a s

Mycobacterium spp. Infecciones asociadas Comentarios

M. gordonae Meningitis en pacientes con shunt, e n f e r m e d a d h e p a t o r e n a l , Aislada en el suelo y en el agua ( b a c i l o del

peritonitis, endocarditis sobre válvula protésica, grifo") y contaminante habitual del laboratorio
infección cutánea, enfermedad diseminada, enfermedad
pulmonar (?)
M thermoresistible Infección pulmonar, infección cutánea Aislada de suelo
9
M terrae-triviale complex Artritis séptica, osteomielitis, enfermedad diseminada ( ) M. terrae = bacilo del rábano
M asiaticiim Enfermedad pulmonar
M nonchromogenicum Enfermedad pulmonar
M tlavescens Enfermedad pulmonar
M shimoidei Enfermedad pulmonar
M smegmalis Enfermedad pulmonar
M neoaurum Bacteriemia en inmunosuprimidos con catéter intravascular
M chelatum Enfermedad diseminada en pacientes con sida Enfermedad similar a la del MAC diseminado
M paratuberculosis Enfermedad de Crohn (?)

Sióa síndrome de inmunodeficiencia adquirida; MAC: Mycobacterium avium complex.

 CAPÍTULO 53
mática o imitar a la tuberculosis. La enfermedad diseminada en personas sin
sida se manifiesta con liebre, pérdida de peso, dolor de huesos, adenopa-
tías. hepatoesplenomegalia y lesiones cutáneas. En aquellos con sida es más
común la fiebre persistente, perdida de peso y diarreas. También se puede
dar anorexia, debilidad, adenopatías o esplenomegalia (Inderlied, 1993). Los
hallazgos del laboratorio son anemia y elevación de la loslatasa alcalina.
Las adenopatias cervicales causadas por MAC suelen afectar a los niños,
aunque también pueden darse en adultos. Otras manifestaciones de la in-
fección por MAC son sinovitis, enfermedad del tracto genitourinario, lesio-
nes cutáneas, infección de los tejidos profundos de la mano, osteomielitis,
meningitis, ulceración del colon y peritonitis (Inderlied, 1993; Wolinsky. 1979;
Woods, 1987).
Los hallazgos histológico de las lesiones por MAC son variados. Granulo-
mas caseosos con bacilos ácido resistentes indistinguibles de la tuberculosis,
fibrosis pulmonar con neumonía organizada, vasculitis granulomatosa necro-
tizante similar a la granulomatosis de Wegener y especialmente en personas
con sida, pueden verse agregados de macrófagos espumosos que contienen
bacilos ácido resistentes en su interior.
Mycobacterium scrofulaceum
Mycobacterium scrofulaceum fue el primer causante conocido de ade-
nopatías cervicales en niños (Prissick, 1956). Desde el punto de vista anti-
génico es similar al MAC. y debido a su ocasional identificación como MAC
mediante test bioquímicos, y viceversa. M. scrofulaceum se clasifica junto
con el MAC como Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum com-
plex.
M. scrofulaceum se ha aislado en la leche cruda y en otros productos
de consumo habitual, como ostras y agua. Se ha hallado también en el
suelo. Habitualmente produce adenopatias cervicales en niños de 1 a 5 años,
penetrando presumiblemente en el cuerpo a través de pequeñas heridas
cutáneas o a través de la mucosa de la cavidad oral. La enfermedad sue-
le ser unilateral, afectando a ganglios linfáticos altos del cuello o del ángu-
lo de la mandíbula. Los niños infectados generalmente están con buen es-
tado general, sin fiebre, y tienen mínimos dolores o molestias. Con la
progresión, estos nodulos se reblandecen y se abren, pudiendo posterior-
mente cicatrizarse, librosarse y calcificarse. Las manifestaciones extra-
ganglionares de la infección por M. scrofulaceum incluyen afectación pul-
monar, enfermedad diseminada y. más raramente, conjuntivitis, osteomielitis,
meningitis y hepatitis granulomatosa. Las lesiones por M. scrofulaceum
son histológicamente indistinguibles de las producidas por M. tubercu-
losis.
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium kansasii. inicialmenle descrito como el "bacilo amarillo", re-
presentaba el 3% de las micobacterias aisladas en EE.UU. en 1979 y 1980;
las mayores cifras fueron descritas en Calilornia, Texas, Louisiana, Illinois y
Florida (Buhler, 1953; Goods. 1982). El reservorio natural de M. kansasii es
desconocido, pero se ha aislado partir de muestras de agua. La enfermedad
pulmonar es más frecuente en varones entre 50 y 60 años que habitan en
zonas urbanas y entre ciertos grupos laborales (mineros, soldadores, marine-
ros y pintores) y entre individuos con neumoconiosis y enfermedad pulmonar
obstructiva crónica. La enfermedad diseminada suele afectar a personas con
la alteración de la inmunidad celular.
Las manifestaciones más frecuentes de la enfermedad producida por M.
kansasii son lesiones crónicas pulmonares cavitadas que suelen afectar a
los lóbulos superiores. Las manifestaciones extrapulmonares incluyen ade-
nopatías cervicales en niños, enfermedades cutáneas, afectación músculo
esquelética (síndrome del túnel del carpo, sinovitis, artritis, lendinitis, fascitis
u osteomielitis), enfermedad diseminada, enfermedad aislada del tracto geni-
tourinario y peritonitis.
Los hallazgos histológicos de las lesiones producidas por M. kansasii son
variables e incluyen granulomas caseosos y no caseosos y lesiones cutá-
neas, necrosis o locos de inflamación aguda y crónica sin formación de gra-
nulomas. Los bacilos ácido resistentes son frecuentes en los pulmones y en
los ganglios linfáticos, pero menos en el resto de tejidos.
• MICOBACTERIAS 1147
Mycobacterium fortuitum-Mycobacterium
chelonae-abscesus complex
Los miembros del grupo Mycobacterium fortuitum han sido aislados en el
suelo, agua y polvo, y los de Mycobacterium chelonae-abscesus en el suelo,
agua y aguas residuales. La mayoría de las personas infectadas con estos
organismos han sufrido un daño penetrante (traumatismo o cirugía) con posi-
ble contaminación por tierra o agua. El comienzo de la infección con M. che-
lonae se ha asociado con la administración de la vacuna de la difteria-pertu-
sis-tétanos-polio, inyecciones de histamina. administración de lidocaina con
un inyector a presión, en hemodializadores contaminados y en el reemplazo
de válvulas porcinas contaminadas (Wallace, 1983).
La lesión cutánea principal causada por M. tortuitum o por M. chelonae-
abscesus se manifiesta por celulitis local, abscesos o nodulos mínimamente
dolorosos. Típicamente las lesiones se desarrollan entre tres semanas y doce
meses (con mayor frecuencia entre 4 y 6 semanas) tras el daño penetrante
en personas con el sistema inmune intacto. La osteomielitis es una complica-
ción ocasional, especialmente tras heridas punzantes en los pies. Las infec-
ciones posquirúrgicas se han caracterizado por heridas que no cicatrizaban o
por dehiscencia de heridas cicatrizadas con drenaje seroso y con minimos
síntomas sistémicos. Generalmente se desarrolla entre tres semanas y tres
meses tras la intervención, especialmente tras esternotomia media, cirugía de
aumento mamario o tras la inserción de catéteres percutáneos. La enferme-
dad diseminada que suele producirse en inmunodeprimidos (especialmente
secundaria a terapia con corticoides) se manifiesta con abscesos cutáneos
recurrentes y de los tejidos blandos. La principal fuente de infección sigue sin
ser evidente. Es infrecuente una enfermedad pulmonar crónica similar a la
producida por M. kansasii o por el MAC. a excepción de la cavilación. La
endocarditis sobre una válvula protésica suele producirse tras cuatro a doce
semanas después de la cirugía. Raramente el M. fortuitum o el M. chelonae-
abscesus produce queratitis y ulceración de la córnea postraumática o ade-
nopatías cervicales.
Las lesiones producidas por M. fortuitum o por M. chelonae-abscesus, se
caracterizan histológicamente por necrosis con una mínima caseificación y un
infiltrado mixto inflamatorio compuesto por neutrofilos y granulomas de cuer-
po extraño o de células de Langhans. Pueden verse de modo ocasional
macrófagos cargados de lipidos. Se pueden encontrar grupos de bacilos áci-
do resistentes dentro de agregados de neutrofilos en menos de un tercio de
los casos. En el tejido pulmonar son frecuentes los macrófagos espumosos,
con un patrón similar a la neumonía lipoidea
Mycobacterium xenopi
Mycobacterium xenopi se aisló por primera vez en un sapo en 1957 y
fue reconocido como patógeno humano en 1965 (Costrinia, 1981). Se ha
cultivado a partir de aguas residuales cálidas y trias, calderas de hospita-
les y tanques de almacenamiento y otras fuentes ambientales. En Gran
Bretaña. M. xenopi se encuentra más frecuentemente en zonas costeras
que en las del interior y los pájaros son un posible reservorio natural. La
mayoría de las infecciones pulmonares causadas рог M. xenopi se han
descrito en Europa y Gran Bretaña. Por el contrario, esta micobacteria es
poco frecuente en EE.UU. La enfermedad se da sólo en adultos y más fre-
cuentemente en varones que en mujeres La mayoría de las personas
padecen enfermedad pulmonar preexistente u otro factor predisponente,
como neoplasias extrapulmonares malignas, alcoholismo, diabetes melli-
tus o terapias inmunosupresoras. La enfermedad pulmonar puede ser cró-
nica, subaguda o aguda. Los síntomas son indistinguibles de los asociados
a la patología causada por M. kansasii. La infección local extrapulmonar
(osteomielitis, artritis, adenopatías) y la enfermedad diseminada son infre-
cuentes, aunque se han descrito en pacientes con sida (Tecson-Tumang.
1984).
Mycobacterium szulgai
Mycobacterium szulgai es un patógeno humano infrecuente localizado en
cualquier parte del mundo, pero su reservorio natural es aún desconocido. La
manifestación más frecuente de la infección es la enfermedad pulmonar eró-
 1148 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
ruca, siendo esto más frecuente en varones de mediana edad. La afectación
extrapulmonar es infrecuente, habiéndose descrito una bursitis de olecranon
asociada a traumatismos de repetición o tras inyecciones de corticoïdes, afec-
tación cutánea extensa en personas en tratamientos con corticoides. osteo-
mielitis, tenosinovitis con síndrome de túnel del carpo, adenopatias cervicales
y enfermedad diseminada (Woods, 1987).
Mycobacterium malmoense
Mycobacterium malmoense se describió como una nueva especie en 1977,
aunque su reservorio natural es aún desconocido (Schroder. 1977). La mayo-
ría de las infecciones humanas se han descrito en Inglaterra. Gales y Suiza,
mientras que en EE.UU. es infrecuente. La enfermedad pulmonar crónica es
la manifestación más común de la infección por M. malmoense. afectando
típicamente a hombres de mediana edad con neumoconiosis. También se han
descrito adenopatias cervicales en niños y enfermedad diseminada en
pacientes con sida (Henriques, 1993).
Mycobacterium simiae
Mycobacterium simiae se aisló por primera vez en los monos de la India en
1965 (Karassova, 1965). Se encuentra en los monos y se ha aislado también
en las aguas residuales de hospitales. Es un patógeno humano anecdótico,
aunque se ha asociado con patología pulmonar crónica y enfermedad dise-
minada.
Mycobacterium marinum
Mycobacterium marinum se reconoció como patógeno humano en 1951
(Norden, 1951). La infección humana suele adquirirse a través de la piel
dañada en contacto con aguas no cloradas contaminadas, tanto dulces como
saladas, aunque también puede transmitirse a través de vía traumática sin
contacto con agua o bien por contacto con agua sin traumatismo preceden-
te. Aparece una lesión única papulonodular a las 2-3 semanas tras la ino-
culación, siendo más frecuente en codo, rodilla, pie o dedos del pie o de la
mano, y suele evolucionar a lesión verrugosa o ulcerada. Ocasionalmente se
forma un absceso en el punto de inoculación y múltiples nodulos secunda-
rios pueden aparecer y progresar centralmente a través de los linfáticos,
simulando una esporotricosis (véase Cap. 54). Las lesiones cutáneas en
inmunodeprimidos pueden ser diseminadas. Las manifestaciones extracutá-
neas son infrecuentes: destacan: smovitis. osteomielitis y lesiones oculares
y laríngeas (Woods. 1987).
La histología de las lesiones cutáneas varia según el estadio de la infec-
ción. En fases tempranas existe un agregado de neutrófilos rodeado por his-
tiocitos. Más tarde se ven linfocitos. histíocilos y células de Langhs con focos
de necrosis fibnnoide. En las lesiones de más de seis meses de evolución se
pueden encontrar linfocitos en la dermis. Las tinciones para bacilos ácido
resistentes suelen ser negativas, pero se pueden hallar los organismos en el
interior de los histiocitos.
Mycobacterium haemophilum
Mycobacterium haemophilum se describió por primera vez en 1978, pero
probablemente fue el bacilo ácido resistente incultivable que se reconoció en
úlceras cutáneas en 1972 y 1974 (Sompolinsky. 1978' Lomvardías. 1972:
Feldman, 1974). Esta es la única de las micobacterias que requiere hemo-
globina o hemina para su crecimiento. Las infecciones humanas por M. hae-
mophilum son raras y suelen verse en personas con una inmunosupresión
subyacente, como inmunosupresión tras trasplantes o sida, pero se han des-
crito algunos casos de adenopatias en niños sanos (CDC. 1991). La enfer-
medad se manifiesta más frecuentemente como múltiples nodulos cutáneos,
úlceras o edemas acompañados de dolor que suelen afectar a las extremida-
des, pudiendo llegar a formar abscesos y fistulas abiertas que drenan un
material purulento. Desde el punto de vista microscópico, se ven focos de
necrosis sin caseificación rodeados por un infiltrado inflamatorio polimorfo con
aparición ocasional de células de Langhans en la dermis profunda. Se pue-
den ver los bacilos ácido resistentes de un modo aislado o bien formando pe-
queños grupos dentro de las células.
Mycobacterium genavense
Mycobacterium genavense es una nueva especie propuesta de mico-
bactena que se ha obtenido en cultivos de sangre por primera vez y tam-
bién en bazo o médula ósea de pacientes con sida (Coyle. 1992; Wald, 1992).
Casi todos los pacientes tuvieron fiebre y malestar general, y algunos inclu-
so síntomas abdominales. Algunos de los pacientes fueron coinfectados
con otro patógeno, como el MAC. por lo que ha sido difícil determinar el pa-
pel de M. genavense en la patología. Desde el punto de vista histológico,
las lesiones están formadas por agregados de macrófagos espumosos lle-
nos de bacilos ácido resistentes (al igual que el MAC diseminado) (Mas-
chek. 1994).
Mycobacterium ulcerans
Mycobacterium ulcerans es endémico de las áreas de Zaire. Uganda.
Nigeria, Ghana. Camerún, Malasia, Nueva Guinea, Guyana. México y
Australia, quedando localizado entre los 25 grados de latitud norte y los 38
grados de latitud sur. Los niños de entre cinco y ocho años son los más
frecuentemente afectados, aunque en un estudio de Australia la media de
edad de personas afectadas fue de aproximadamente treinta años y un
tercio de personas fueron mayores de 40 años (Wolinsky, 1979). En las
zonas endémicas, la enfermedad es ligeramente más común en varones.
El reservorio de M. ulcerans y la vía habitual de transmisión a los huma-
nos permanece aún desconocida.
Otros nombres con los que se conoce a la enfermedad son la ulcera de
Bairnsdale. por el área de Australia, donde lúe reconocida por primera vez. y
úlcera o enfermedad de Buruh. debido al área de Uganda que refiere la mayor
parte de los casos. La enfermedad debuta como uno o. más raramente, múl-
tiples forúnculos indoloros o nodulos subcutáneos en un área expuesta, como
las piernas, donde posiblemente existió un traumatismo previo. Tras vanas
semanas, los nodulos se ulceran y pueden surgir nodulos y úlceras satélites.
Típicamente, los ganglios linfáticos suelen respetarse y los individuos afecta-
dos permanecen afebnles y sin síntomas sistémicos. salvo que se sobrem-
fecten las lesiones por bacterias.
MYCOBACTERIUM LEPRAE
Mycobacterium leprae es el causante de la lepra (también lamada enfer-
medad de Hansen). Aunque no pertenece a las MTBC. y por tanto puede con-
siderarse una "micobacteria no tuberculosa", se estudia aparte, ya que es la
única micobacteria que no se ha podido cultivar por el momento. Los anima-
les útiles como modelos de infección son el ratón de pie almohadillado y el
armadillo de nueve bandas.
M. leprae se ha localizado en casi la totalidad del mundo en algún momento
de la historia. Se estima que entre 10 y 15 millones de personas en todo el
mundo padece lepra, y aproximadamente el 62% está en Asia y el 34% en
África (Binford. 1982). Cerca de 6.000 personas en EE.UU. padecen lepra, la
mayoría inmigrantes, y en algunos de los casos afecta a individuos de los
estados de las costas del golfo de California y Hawai (Neill. 1985).
La lepra afecta predominantemente a humanos, pero también es una
infección natural de los armadillos salvajes en Lousiana y Texas, y se han
descrito casos esporádicos en unos monos (Hastmgs. 1988). El mecanismo
de transmisión es desconocido, pero se acepta la teoría de la transmisión de
persona a persona a través de la aerosolización del organismo a partir de la
nariz de la persona con lepra activa (véase más adelante) que contacta con
la mucosa nasal de otro individuo. La transmisión también puede producirse
a través de piel sana o por heridas penetrantes, como las producidas por espi-
nas o picaduras de artrópodos. La leche de mujeres lactantes con la enfer-
medad lepromatosa contiene bacilos que pueden transmitirse a los niños, y
también es posible una transmisión transplacentaria. También se han descri-
to casos de lepra en humanos que han tenido contacto con armadillos (Lump-
kin, 1983). Además, el hallazgo de una enfermedad similar a la lepra en arma-
dillos y el hecho de la aparición de casos esporádicos de lepra en personas
sin contacto con afectados sugiere la existencia de fuentes de M. leprae até-
tenles a la humana (Blake. 1987).
 CAPITULO 53 • MICOBACTERIAS
La mayoría de las personas resisten de un modo efectivo la infección por
M. leprae. La resistencia depende de una correcta inmunidad celular con-
tra los antigenos de M. leprae. como sucede en la lepra tuberculoide. En
personas en las que falla esa respuesta celular inmune específica a dichos
antígenos, los bacilos se multiplican dentro de los macrófagos. pudiendo
producir una rápida lepra lepromatosa diseminada. Los defectos de la
inmunidad celular que pueden afectar a los linfocitos T o su interacción con
los macrótagos son la causa que facilita la enfermedad.
Las lesiones de lepra se desarrollan tras un período de incubación de 2 a
5 años, variando la presentación según la respuesta inmune del huésped. La
lepra siempre afecta a los nervios periféricos, casi siempre a la piel y fre-
cuentemente a las mucosas. Los tres signos cardinales de la enfermedad son
lesiones cutáneas, áreas cutáneas de anestesia y una afectación de los ner-
vios periféricos.
El sistema desarrollado por Ridey y Jopling (presentado más adelante) se
usa frecuentemente para clasificar el espectro clínico e histológico de las for-
mas de lepra (Ridley, 1964). La lepra indeterminada, en las etapas tempra-
nas, se caracteriza por una o más máculas hipopigmentadas en la piel con
ligera pérdida de sensibilidad. En cerca del 75% de los casos la patología se
cura espontáneamente, mientras que en el resto progresa frecuentemente
tras un periodo largo.
Los tipos extremos de lepra lepromatosa, la forma diseminada anérgica
de la enfermedad y la tuberculoide o forma localizada, son formas clínica-
mente estables La lepra lepromatosa se caracteriza por distintas lesiones
cutáneas que van desde una afectación cutánea generalizada hasta unos
nodulos difusos y de distribución simétrica (llamados lepromas) repletos
de organismos. Las lesiones afectan generalmente a las partes más frías de
la superficie corporal, como el tercio anterior del ojo. la mucosa nasal y los
troncos de los nervios periféricos superficiales. En la enlermedad avanza-
da las lesiones se acompañan de pérdidas sensitivas debido a la afecta-
ción de las fibras nerviosas dérmicas. Desde el punto de vista microscópi-
co, las lesiones muestran histiocitos espumosos que contienen muchos
bacilos ácido resistentes, ausencia o escaso número de linfocitos, mínima
inflamación inlraneural y múltiples bacilos ácido resistentes en los nervios,
perineuro, pared vascular y músculos. En la lepra tuberculoide se desarro-
llan una o varias máculas o placas anestésicas bien definidas, a veces
acompañadas por un engrasamiento del nervio periférico cerca de la lesión
cutánea.
Desde el punto de vista histológico, las lesiones muestran granulomas
no caseosos en los nervios y en la dermis que afectan a las capas básales
de la epidermis, mientras que. si los hubiese, los bacilos ácido resistentes
estarían en bajo número. La lepra bimorfa es una condición clínica inesta-
ble que comparte características de ambas formas extremas. Puede des-
arrollar características más cercanas a la tuberculoide, que denominaría-
mos progresión, o bien acercarse a la lepromatosa, denominándose entonces
regresión.
PRUEBAS CUTÁNEAS
Las pruebas cutáneas de la tuberculosis son de utilidad para identificar a
personas infectadas con el MTBC. pero no diferencian enfermedad activa
de infección. Las personas infectadas con MTBC desarrollan una reacción de
hipersensíbilidad a las proteínas de los bacilos, en lo que toma su base el
test cutáneo con un derivado proteico purificado (PPD). El método preferido
de test cutáneo es el test de Mantoux. que se lleva a cabo mediante la
inyección intracutánea de 0,1 mi de PPD-S de fuerza intermedia (5 unida-
des de tuberculina). La reacción se interpreta a las 48-72 horas midiendo el
diámetro de induración en milímetros (Huebner. 1993). Una induración de
5 mm o mayor se considera como positivo en personas con VIH, en aque-
llos con reciente contacto íntimo con personas con tuberculosis contagiosa
y en aquellos con hallazgos radiológicos de lesiones residuales tuberculo-
sas. Un resultado de 10 mm o mayor, es positivo en aquellos que no cum-
plen esos criterios pero que tienen otros factores de riesgo para tuberculo-
sis. Se incluyen en este grupo los extranjeros de países con alta prevalencia
de tuberculosis (como África, Asia o América latina), los adictos a drogas por
vía parenteral, poblaciones médicamente desatendidas o en declive, como
1149
las minorías étnicas o raciales, residencias de cuidados crónicos y personas
que tienen condiciones médicas asociadas a riesgo de tuberculosis (p. ej.,
silicosis, gastrectomizados. puentes yeyuno-ileales. personas por debajo
del 10% de su peso ideal, insuficiencia renal crónica, diabetes mellitus. tra-
tamiento con altas dosis de corticoides u otros fármacos inmunosupresores
y neoplasias). Una reacción de 15 mm o mayor se considera positivo en el
resto de las personas.
Pueden existir falsos positivos en la reacción de PPD por infección con
micobacterias no tuberculosas. Los falsos negativos se pueden deber a una
mala técnica o a una mala conservación del derivado. Si se administra apro-
piadamente, los falsos negativos son raros en personas relativamente sanas,
pero pueden producirse en aproximadamente el 20% de los individuos con
tuberculosis conocida cuando se les realizó por primera vez. La mayoria de
estos falsos negativos son debidos a una enfermedad y se convierten en posi-
tivos tras dos o tres semanas de tratamiento. Los factores causantes de un
estado generalizado de anergia, como malnutnoón proteica, infección viral
concomitante, sarcoidosis, neoplasias (como el linfoma). terapia con corticoi-
des o ¡nmunosupresión e infección por VIH pueden ser responsables de un
falso test negativo.
El test de Mantoux suele permanecer positivo tanto tiempo como per-
sista el acantonamiento del bacilo en un loco quiescente. No obstante, la
reacción puede ir disminuyendo con el paso de los años, lo que ocurre con
mayor frecuencia en aquellos que sobrepasan los 55 años. En estos indi-
viduos la reacción puede ser estimulada (o llegar a positivizarse) si se repi-
te el test a la semana de realizarlo, reacción que se denomina efecto
booster.
Los compuestos preparados para test cutáneos para micobacterias no
tuberculosas incluyen el PPD-A (Mycobacterium avium). PPD-B (Mycobacte-
rium intracellulare). PPD-F (Mycobacterium fortuitum). PPD-G {Mycobacte-
rium scrofulaceum) y PPD-Y {Mycobacterium kansasii). En EE.UU. estos
compuestos se podian conseguir en el CDC, pero se interrumpió su adminis-
tración, ya que esos antígenos no estaban estandarizados y las reacciones
cutáneas eran de dificil interpretación.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
Muestras
Las muestras recomendadas para el diagnóstico de infección por micobac-
terias se recogen en la Tabla 53-3. Las muestras tomadas de sitios contami-
nados como esputo, otras secreciones respiratorias, secreciones gástricas,
orina y las heces se deben descontaminar antes de su inoculación en el
medio para prevenir un sobrecrecimiento de la llora normal que enmascare la
presencia de las micobacterias. La concentración de las muestras tras su des-
contaminación aumenta la sensibilidad de las extensiones y cultivos. Las
muestras tomadas de zonas de cuerpo normalmente estériles no precisan
descontaminación previa al cultivo, como la sangre, el líquido cefalorraquídeo,
el líquido pleural o peritoneal y los tejidos.
El procesamiento e inoculación de las muestras para su cultivo deberí-
an realizarse en una cabina biológica de segundad. El procesamiento con
A/-acetil-L-ciste¡na (NALC)-hidróxido sódico (Fig. 53-1) es el método más
comúnmente utilizado en el laboratorio clínico para licuar, descontaminar y
concentrar muestras para la detección de micobacterias. Las muestras con-
taminadas deberían ser refrigeradas si no se pudiesen procesar inmediata-
mente. Antes de proceder al paso comentado en la Figura 53-1. se necesi-
ta un manejo adicional para algunas muestras. Las muestras de lavado
gástrico se deberían procesar inmediatamente, pero si no se puede evitar
una demora, se debería añadir hidróxido sódico al 10% hasta que el pH de
la muestra (medido con papel de pH) sea neutro. Si se recogen más de 10 mi
de secreciones gástricas, habría que centrifugar la muestra de 3.000 g a
3.600 g durante 20 a 30 minutos, desechándose el sobrenadante y progre-
sando el sedimento como se indica en la Figura 53-1. Para las heces. 1 ó 2
g de muestra sólida o bien 5 mi de muestra liquida se colocan en un tubo de
50 mi y se añade agua estéril destilada hasta alcanzar un volumen de 10 mi.
La suspensión se agita en un mezclador, se filtra a través de una gasa y se
procesa como se indica. Las muestras de orina se dividen en dos a cuatro
 1150 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 53-3 Enfermedades causadas por micobacterias y muestras para el diagnóstico

Enfermedad Especie de Mycobacterium' Muestras
Pulmonar tuberculosis, kansasu. MAC, xenopi. szuigai, Esputo (a primera hora de la mañana, tos profunda.
malmoense. simiae durante tres días seguidos). BAL, contenido
gastrico, tejido pulmonar, líquido pleural
Diseminada tuberculosis. MAC Sangre, médula osea, tejidos afectados
Adenopatias tuberculosis. MAC, scrolulaceum Aspirado o biopsia de las adenopatias
Piel, tejidos blandos ulceraos, lortuitum-chelonae. marinum, haemophilum. Aspirado o biopsias de la lesión (se deberían
leprae desechar los tapones) extensión de las
secreciones nasales y corles cutáneos, biopsia
de la lesión
Músculo esquelético tuberculosis, lortuitum-chelonae, marinum Líquido y vaina sinovial, hueso
Sistema nervioso tuberculosis, leprae LCR. le|ido cerebral, biopsia de nervios periféricos
Genitourinario tuberculosis Orina (a primera hora de la mañana durante tres días
consecutivos), tejidos afectados (riñon, endometrio.
trompa de Falopio, próstata, vesículas seminales,
epididimo)
Gastrointestinal tuberculosis. MAC Tejido, heces
Peritonitis tuberculosis Biopsia penloneal. líquido ascitico
Hepatitis tuberculosis. MAC Hígado
Pericarditis tuberculosis Pericardio, liquido pencárdico
• Las especies enumeradas son patógenos potenciales
MAC Mycobacterium avium complex: BAL lavado broncoalveolar: LCR: liquido cefalorraquídeo
Modilicada de Woods GL: Mycobacteria En Woods GL. Gutierrez Y (eds.): Diagnostic Pathology of Infections Diseases. Filadellia. Lea 8 Febiger. 1993. p 378. con
autorización.

tubos de 50 mi y se centrifugan a 3.000 g-3.500 g durante 30 minutos. Se Tinciones microbiológicas

decanta el sobrenadante dejando unos 2 mi de sedimento en cada tubo. Los
tubos se mezclan con un mezclador y los sedimentos se combinan, y si fue- En extensiones teñidas con la tinción de Gram la mayoría de las micobac-
se necesario se añade agua destilada hasta un volumen de 10 mi y enton- terias aparecen como unos bacilos grampositivos escasamente teñidos, pero
ces se descontamina como se muestra en la Figura 53-1. a veces los bacilos no captan el violeta y aparecen como "gram neutro" o
como "gram fantasma" (Lámina 53-1). Imágenes similares de fantasmas pue-
den encontrarse en los macrófagos obtenidos con las tinciones de Wnght o
Papanicolau. En general, para mejorar la eficiencia, todas las muestras (me-
nos la sangre) recogidas de personas con sospecha de infección por mico-
bacterias se deberían examinar microscópicamente. Sin embargo, muchos
Poner 10 mi (máximo) de esputo, orina u otros Huidos laboratorios no preparan extensiones de muestras en las que los bacilos áci-
en un luho do centrifugado estéril de plástico de 50 mi do resistentes raramente sean vistos, tales como líquido cefalorraquídeo, ori-
na y médula ósea. Para preparar la extensión se extienden dos o tres gotas
I del sedimento concentrado de un modo uniforme en un portaobjetos y se fija
Añadir el mismo volumen de NALt-2".. NaOll (preparado cada día) a 80 C durante 15 minutos o bien de una a dos horas a 65 C-70 C en un cale-
y tapar herméticamente factor eléctrico.
Hay dos tipos de tinción que detectan los bacilos ácido resistentes: car-
l bol-fucsina (la clásica tinción de Ziehl-Neelsen. que requiere calefacc en. y
Me/clar en el mezclador durante 15 a 30 segundos la tinción de Kinyoun) y las tinciones fluorocromas preferidas (auramina-ro-
damina y auramina-O), que son más sensibles. Las extensiones teñidas
con la tinción de carbol-fucsina se examinan con un aumento de 800x a
LOOOx (con aceite de inversión). Las extensiones teñidas con tinción fluo-
Dejar reposar la me/ela a temperatura ambiente durante 15 mininos rocroma se examinan con aumentos más bajos (250x y 400x) que permi-
(45 minutos para muestra! fecales)
ten visualizar más campos en menos tiempo. Las células de M. lortuitum-
chelonae complex se tiñen escasamente con la tinción lluorocroma y
l
pueden pasar desapercibidas, por lo que cuando se sospechasen (p. ej.. en
Añadir 3(1 mi de lampón fosfato (pll ft.X): tapar los tubos y mc/clar infecciones de heridas quirúrgicas) las extensiones que resulten negativas
sería conveniente teñirlas con carbol-fucsina. Los resultados se comunican
i tras ver 100 campos y debería ser incluido un informe indicando si la exten-
sión se preparó directamente de la muestra o tras descontaminación y con-
Centrifugar a 3.000-3.600 x % durante 15 minutos centración. Las directrices para informar los resultados de las tinciones de
(o 2.500 x g . I . I I . I I I I , - 20 mininos)
muestras para bacilos ácido resistentes se muestran en la Tabla 53-4 (Kent.
. 1985).

Decantar el sobrenadante; resuspender el sedimento

En las extensiones teñidas con carbol-fucsina, los bacilos ácido resistentes
en 1.5 ml-2 mi de agua estéril o lampón aparecen como unas varas ligeramente curvas de color púrpura-rojo (de 1 um
a 10 jtm de largo y de 0,2 um-0,6 um de ancho) que frecuentemente son de for-
i 1 ma arrosariadas y con bandas (Lámina 53-2), pero también pueden tener for-
Preparar extensión para leñir Inocular en medio de cultivo ma de coco o filamentosas. En general, el aspecto del bacilo ácido resistente
no facilita la identificación de las especies, pero sin embargo las células de
Figura 53-1. Protocolo para la descontaminación mediante el uso de hidróxido só- cieñas especies tienen características útiles para el diagnóstico. Por ejemplo,
dico rV-acelil-L-cisleina al 2%. y concentración de muestras para la determinación las células de M. kansasu Irecuenlemente aparecen como un bacilo rayado
de micobacterias por extensión y cultivo. (Lámina 53-3) más largo que M. tuberculosis y similar a un cayado. Las célu-
 CAPÍTULO 53 • MICOBACTERIAS 1151

Tabla 53-4 Directrices para informar las e x t e n s i o n e s dos son más sensibles que los sólidos y aportan una más rápida delección
para bacilos ácido resistentes del crecimiento micobacteriano (Stager. 1991. Anargyros, 1990; Abe. 1992).
Los sistemas líquidos actualmente disponibles sobre el sistema radiométrico
N." de B A A R c o n N." de B A A R c o n
carbol-fucsina (1.000x) f l u o r o c r o m o (450x) Informe
son BACTEC 460TB (BD Biosciences). SEPTI-CHECK AFB (BD Bioscien-
ces), tubos indicadores de crecimiento de micobacterias BBL (MGIT: BD Bio-
0 0 No se ven BAAR
sciences), el sistema de cultivo ESP II (sistemas de diagnóstico Trek) y el
1-2 en 70 campos Dudoso, repetir
1-2 en 300 campos (un barrido y medio) BacT/Alert MB (Organon Teknika). El CDC también recomienda que los sis-
(3 barridos) lemas de cultivos usados detecten el crecimiento de micobacterias dentro de
2-18 en 50 11
1-9 en 100 campos
campos (un barrido) una media de 14 días.
1-9 en 10 campos 4-36 en 10 campos 2+ La composición de los medios sólidos habitualmente utilizados se describe
1 -9 por campo 4-36 por campo 3+
>9 por campo >36 por campo 4+ en la Tabla 53-5. Estos medios están disponibles en tubos de tapón de rosca
1
y botellas de prescripción de 29,57 cm, el medio de base de agar también
BAAR bacilos acido resistentes; Bamdo revision de loda la extension está disponible en las placas de Petri. Las botellas de prescripción se prefie-
Modilicada de Kent PT. Kubica GP Public Health Mycobacteriology A Guide
for the Level III Laboratory Atlanta, Department ol Health and Human Servi ren a los tubos con tapón de rosca por razones de seguridad y porque prove-
ces. 1985 con auto'i-raciön en una mayor superficie para el crecimiento de las micobacterias. Las mues-
tras cutáneas deberían inocularse en un medio de huevo o de agar, y para
asegurar la obtención de M. haemophilum (véase arriba) también debería
depositarse en un medio de agar chocolate, agar-sangre de oveja de Colom-
las de MAC suelen ser pleomórficas, ocasionalmente cocobacilares y se liñen bia al 5%, agar Mueller-Hinton con suplemento de Fildes o Lowenstem-Jen-
con el ácido peryódico de Schiff (PAS). Las células de M. marínum son típi- sen con citralo amonio férrico al 2%. Todos los cultivos deberían ser incuba-
camente más largas y más anchas que las de M. tuberculosis y suelen mos- dos a 37'C en una atmósfera con el 5%-10% de CO„ y los medios de tubo
:
trar rayas. Las células de M. leprae se tiñen más débilmente que la mayoría deberían incubarse en una posición inclinada con los tapones flojos durante
de las otras micobacterias. al menos una semana para asegurar una correcta distribución del inoculo
La especificidad de las tinciones para bacilos ácido resistentes es del sobre la superficie. Para muestras cutáneas, se debe hacer un segundo gru-
99% o mayor, y la sensibilidad es aproximadamente del 25%-75% (Murray, po de cultivos inoculando e incubándolos a 30C. ya que ciertas micobacte-
1980: Rickman. 1980; Strumpf. 1979). Los falsos positivos (tinción positiva rias crecen mejor a temperaturas más bajas (M. marinum. M. haemophilum.
con cultivo negativo) pueden deberse a microorganismos no viables, como M. chelonae. M. ulcerans). Todos los cultivos deben ser examinados sema-
puede pasar en pacientes que están tomando el tratamiento antituberculo- nalmente al menos durante seis semanas.
so, a una prolongada descontaminación que destruya tanto a las bacterias
contaminantes como a las micobacterias o bien a una contaminación duran- La mayor ventaja de los cultivos convencionales es que permiten la visua-
te el proceso de teñido. Los factores que influyen en la sensibilidad de los lización de la morfología y la pigmentación de las colonias, lo que es útil para
resultados son: 1) población de pacientes (las personas con lesiones cavi- el diagnóstico, especialmente para diferenciar las colonias de M. tuberculo-
tadas tienen más probabilidad de que tengan un esputo positivo que las que sis de aquellas micobacterias no tuberculosas. El aspecto y las característi-
no las tienen). 2) tipo de muestras (las respiratorias es más probable que cas de crecimiento de las colonias de las micobacterias habitualmente halla-
sean positivas que otras muestras), 3) el número de muestras examinadas, das se recogen en la Tabla 53-6. Las desventajas de los medios sólidos son
4) el número de bacilos ácido resistentes presentes en las muestras (son el prolongado tiempo de crecimiento de las micobacterias (las colonias no
necesarios de 5.000 a 10.000 microorganismos/ml de muestra para un re- son visibles generalmente en un medio sólido antes de 3-4 semanas) y su
sultado positivo), 5) las especies presentes (las muestras con M. tuberculo- baja sensibilidad. La inoculación en discos de agar Middlebrook, examinán-
sis o M. kansasii pueden ser más positivas que las que contienen otras dose con el microscopio, permite una más rápida detección de colonias, pero
micobacterias), 6) la experiencia del observador. 7) la tinción usada. Las tin- su proceso es muy laborioso, no estando disponible en muchos laboratorios
ciones fluorocromas son más sensibles y fáciles de leer que las tinciones clínicos (Welch, 1993).
con carbol-fucsina y se recomiendan por los expertos del CDC (Tenover, El sistema radiométrico semiautomatizado BACTEC TB460 utiliza un
1993). Para poder detectar el resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU. el medio líquido (uno para sangre [13 A.) y otro para el resto de muestras [12 B])
CDC también sugiere que. para las muestras respiratorias, los resultados de que contiene un sustrato de ácido palmitico marcado con C, Cada muestra
las tinciones sean informados dentro de las 24 primeras horas de la recep- es inoculada en un vial y se le añade una mezcla de antibióticos, excepto a
ción de la muestra, lo que significa tener que procesar las muestras todos la de sangre. Se incuban a medio ambiente a 37 C durante 5-6 semanas.
los días de la semana. Para asegurarse el aislamiento de M. genavense. los cultivos de sangre
(especialmente los que provienen de pacientes con sida) deben incubarse de
8 a 10 semanas. La multiplicación de los bacilos en un medio líquido y el uso
Métodos de cultivo l4
de sustrato marcado libera CO al espacio que queda encima del medio.
s

Para un óptimo aislamiento de las micobacterias a partir de las muestras Las botellas son manualmente cargadas en el BACTEC TB460, que mide la
clínicas, los expertos del CDC recomiendan la inoculación de las mismas a cantidad de '"CO, y calcula el índice de crecimiento (Gl). Un Gl mayor de 10
un medio líquido y otro sólido (Tenover. 1993). En general, los medios líqui- sugiere que hay micobacterias, y cuando el Gl alcanza entre 50 y 100 se

Tabla 53-5 M e d i o s habitualmente utilizados para el aislamiento de micobacterias

Medio Componentes Agente(s) inhibidores

Lowenstein-Jensen Huevos coagulados, sales, glicerol. harina de patata 0.025 g/dl verde malaquita
Middlebrook 7H10 Sales, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, 0.0025 g/dl verde malaquita
glicerol, dextrosa
Midrllobrook 7H11 Sales, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, 0.0025 g/dl verde malaquita
glicerol, hidroxilato de caseína al 0,1%
Selectivo 7H11 Sales, vitaminas, cofactores. ácido oleico, albúmina, catalasa. 0.0025 g/dl verde malaquita
(medio de Mitchison) glicerol, dextrosa e hidroxilato de caseína 50 pg/ml carbenicilma
10 (ig/ml anfoteriema B
200 unidades/ml polimixma B
20 pg/ml trimetroprim-laclato
^ _ j
 1152 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 53-6 Morfología de las colonias y características del crecimiento de las diferentes micobacterias halladas en el laboratorio clínico

Especie d e Colonias Tasa de crecimento

Mycobacterium Morfología Pigmentación (semanas)' Coméntanos

M. tuberculosis Rugosa N (amarillento) 4-6

M. bovis Rugosa, fina o Iransparente N (incoloro) 4-6
M. avium complex Lisa pequeña, fina, Iransparente o larga, opaca, N 4-6 El crecimiento requiere
abovedada ±rugosa 8 semanas algunas colonias
se vuelven levemente
pigmentadas con la
incubación prolongada
M. scrotulaceum Lisa, globulosa S 4-6 El pigmento varia de amarillo
claro a naranja oscuro
M. kansasu Rugosa, cristales de p-caroteno P 4-6 Raras veces son N o S
M. lortuitum-chelonae Lisa o rugosa II £1
M xenopí Lisa, extensiones filamentosas ("nido de pájaros) s 4-6 Crece a 42T
M. szulgai Lisa o rugosa S a 37°C. P a 2S°C 4-6
M. malmoense Lisa Incoloros 2-3
M. simiae Lisa P" 4-6
M. marmum Arrugada, brillante, lisa, hemiesfénca (raro) P 2-3 Crecimiento óptimo a 31-33°C
rugosa, seca
M haemophilum Rugosa. ±lisa N 4-6 Crecimiento óptimo a 20-32°C
M gordonae Lisa S 4-6
M Ihermoresislible Lisa o rugosa P <1 Crecimiento óptimo a 37-45°C,
El pigmento es amarillo-naranja,
llegando hasta marrón
M terrae-triviale Lisa (M. terrae) o rugosa (M. triviale) N 4-6
M nonchromogenicum Rugosidad intermedia N 4-6
M flavescens Lisa S 2-3
M smegmatis Rugosa. ±lisa N (amarillento) <1

• Promedio en un medio sólido

" La producción de pigmento suele requerir una exposición prolongada a la luz
N: no lotocromógena, S escolocromógena; P: fotocromOgena (véase Tabla 53-1); ±: ciertas especies tienen ocasionalmente la morfología indicada.

hace una extensión del medio para teñir bacilos ácido resistentes. Los viales
que contienen bacilos ácido resistentes se subcultivan a su vez en un medio
sólido y se hacen test directos para su identificación (se comenta en la
siguiente sección). Para cultivos positivos para micobacterias en sangre de
pacientes con sida, se debería hacer un subcultivo en agar Middlebrook
7H11 que contenga micobactm J, para obtener M. genavense si los subculti-
vos iniciales del medio liquido son negativos, o bien, si el medio liquido es
positivo, se deberían mandar al laboratorio de referencia para hacer los test
oportunos.
El SEPTI-CHEK AFB es un medio de cultivo bifásico para micobacterias
que consiste en un medio líquido y un medio agar en un canal cerrado, simi-
lar al cultivo bifásico de sangre descrito en el Capitulo 57. El medio se inocu-
la con la mueslra, el canal se sujeta a la parte superior de la botella y el sis-
tema se invierte para permitir que el liquido Huya por el medio del agar. El
sistema se incuba de 6 a 8 semanas de 35 C a 37 C con un 5% a 7% de CO .
y a intervalos regulares el líquido se subcultiva en el medio sólido por el canal
al invertir el sistema. La sensibilidad de este sistema es similar al de BACTEC
TB460 (Abe. 1992; D'Amato, 1991: Isenberg. 1991). El tiempo de detección
de crecimiento es, sin embargo, más largo que en el BACTEC TB460, aun-
que más rápido que en un medio sólido convencional.
El BBL-MGIT consiste en 4 mi de caldo 7H9 modificado y un indicador fluo-
rescente metido en silicona en la óase de un tubo de vidrio de 16 x 100 mm.
Los tubos se inoculan con la muestra, se añade una mezcla de antibióticos,
para frenar el crecimiento de las óacterias contaminantes, y un enriquecedor
del crecimiento de micobacterias, y los tubos se tapan y se incuban a 37C
durante más de ocho semanas. Para detectar el crecimiento de las micobac-
terias, los tubos se colocan encima de un transiluminador de rayos ultravio-
letas de 365 nm o enfrente de una lámpara de Wood. La aparición de una
fuerte fluorescencia en el sensor (un brillo de color naranja en la base del
tubo) indica crecimiento De modo alternativo, los tubos se pueden incuban
en el instrumento totalmente automatizado BACTEC 960. que monitoriza de
un modo continuo la florescencia y las señales de aquellos que son positivos.
El MGIT es lan sensible como el BACTEC 460 para la detección de mico-
bacterias, pero el tiempo medio de crecimiento es algunos días mayor con el
MGIT (Hanna. 1999; Pfyffer, 1997; Cornfield, 1997).
Además del BACTEC MGIT 960, hay otros tres sistemas totalmente auto-
matizados de monitorización continua disponibles para el cultivo y detección
de micobacterias: el sistema BACTEC 900MB (BD Biosciences) (Zanetti,
1 9 9 7 : Pfyffer, 1997), el sistema BacT/MB (Organon Teknika) (Brunello. 1999:
Rohner. 1997) y el sistema de cultivo ESP II (sistemas de diagnóstico Trek)
(Tholken.1997. Woods.1997). Con cada sistema, las botellas se cultivan en el
respectivo instrumento, donde se monitorizan los cambios de producción y
consumo de diferentes gases, lo que indica el crecimiento de micobacterias u
otros microorganismos. En general, estos sistemas son comparables al BAC-
TEC 460TB y tienen las ventajas de ser totalmente automatizados y menos
laboriosos.
Test para ia identificación de micobacterias
La identificación de micobacterias se ha basado tradicionalmente en la
tasa de crecimiento en medios sólidos, la morfología de la colonia, la pig-
mentación de la colonia con y sin luz y los resultados de los test bioquímicos.
Los protocolos de identificación de micobacterias mediante estos factores en
el laboratorio de microbiología se ilustran en las Figuras 53-2 a 53-3. Los lest
bioquímicos específicos se describen con detalle en otros apartados (Kent.
1985). Aunque la mayoría de las especies se pueden identificar de este modo,
los resultados no suelen estar disponibles hasta vanas semanas o meses tras
el crecimiento de colonias en un medio sólido. Se recomiendan métodos más
rápidos de identificación que permitan la identificación de MTBC antes de 21
días tras la recogida de las muestras (Tenover, 1993).
Actualmente el método de diagnóstico de tuberculosis pulmonar más rápi-
do es el uso de amplificación de ácidos nucleicos para la detección directa de
M tuberculosis en muestras clínicas (Dalovisi, 1996: Ichiyama. 1996. Wobe-
ser. 1996). En la actualidad, dos de estos test (test directo de Mycobacterium
tuberculosis amplificado [GEN-PROBE Inc.) y test de Mycobacterium tuber-
culosis AMPLICOR [sistemas diagnósticos Roche Inc.]) están disponibles en
 CAPITULO 53 • MICOBACTERIAS 1153

Figura 53-2. Árbol de decisión para la identificación de micobacterias no fotocromógenas. Obsérvese que aunque Mycobactenum simiae sue-
le ser fotocromógeno. este hecho es inestable y puede resultar aparente únicamente tras la exposición a la luz durante un periodo largo. Al-
gunas de las cepas de Mycobacterium bovis dan un positivo en la reacción con niacina. (De Woods GL. Gutiérrez Y: Diagnostic Pathology o!
Infections Diseases. Filadelfia, Lea & Febiger. 1993, con autorización.)

todo el mundo y hay otro más que está en estudio (BDProbeTec ET System,
BD Biosciences). El test amplicor está aceptado por la Food and Drug
Administration para el análisis de muestras respiratorias BAAR positivas. El
test Gen-Probe es aceptado para su uso con muestras respiratorias positi-
vas y negativas para bacilos ácido resistentes. Datos recientes sugieren
que los test podían ser de utilidad en muestras negativas para bacilos áci-
do resistentes en pacientes con alto riesgo de tuberculosis (p. ej., personas
inlectadas con VIH y para personas encarceladas en centros penitencia-
rios), lo que permitiría un diagnóstico precoz y un rápido inicio del trata-
miento (Gamboa, 1998; Bergmann, 1999). Los test aparecen para poder
comparar las muestras de otros focos diferentes del respiratorio y. más aún.
pueden ser útiles para el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar (Pfyffer.
1996; Gamboa. 1997).
El test BACTEC TB NAP (para-nitro-<x-acetil-am¡no-|l-hidroxipropiofenonai
diferencia a los MTBC de las micobacterias no tuberculosas en tan sólo cua-
tro o cinco días tras haber detectado bacilos ácido resistentes en un vial BAC-
TEC 12B (Gross, 1985). Una cantidad de caldo del vial 12B que sea positivo
se inyecta en dos botellas del medio 12B. una con NAP y otra sin NAP. Un
incremento en el Gl en la botella sin NAP y sin producirse un incremento en
la que lo contiene indica que se ha aislado un MTBC y que esas especies son
susceptibles al NAP y, por tanto, inhibidos por el. Sin embargo, este test no
diferencia las especies de MTBC.
La prueba del ADN quimioluminiscente permite idenlificar algunas especies
de micobacterias en tan sólo una o dos horas tras el crecimiento (tanto en
medio liquido como en sólido) (Evans. 1992: Lebrun. 1992; Goto. 1992; Reis-
ner, 1994). Las pruebas comerciales especificas para MTBC, MAC, M. avium.

M. s c r o / u l a c e i i n i M. x e n o p i

vi. marínum
Figura 53-3. Árbol de decisión para la identificación de micobacterias fotocromó-
genas. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: La-
boratory Procedures in Clinical Microbiology, 2.'' edición. Nueva York. Springer-
Verlag, 1985. con autorización. )
Figura 53-4. Árbol de decisión para la identificación de las micobacterias esco-
tocromógenas habituales. Obsérvese que Mycobactenum szulgai es fotocromó-
geno a 25' C y escotocromógeno a 35 C y que Mycobacterium xenopi crece bien
:
a 42C. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]:
Laboratory Procedures in Clinical Microbiology. 2.- edición. Nueva York. Sprin-
ger-Verlag. 1985. con autorización.)
 1154 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
M. chelonae V/. chelonae
subespecie abscessus subespecie borstelense
Figura 53-5. Árbol de decisión para la identificación de micobacterias con un rapi
do crecimiento con importancia clínica. Los asteriscos indican que se necesitan
tesi bioquímicos adicionales para su diferenciación. (De Robert GD: Mycobacteria
and Nocardia En Washington JA II [ed.]: Labotatory Procedures in Clinical Micro-
1
biology. 2. ed. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorización.)
M. intracellulare. M. gordonaey M. kansasii están actualmente disponibles.
Estos estudios requieren un equipamiento mínimo (p. ej.. luminómetro, es-
tufa, etc.). Las desventajas de las pruebas incluyen errores en la identifi-
cación de un pequeño porcentaje de los MAC aislados (3%-5%) y resulta-
dos talsos positivos con la prueba de MTBC (Butler, 1994; Lebrun, 1992;
Bull, 1992).
La cromatogralía con gas líquido, la cromatografía con líquidos de alto ren-
dimiento y la cromatografía de capa fina permiten identificar colonias de mico-
bacterias en un medio sólido en 2-4 horas. Estas técnicas, dado que son com-
plejas y requieren un equipamiento caro, suelen realizarse preferentemente
en laboratorios de referencia o de investigación.
Rara vez puede resultar imposible identificar una micobacteria por los
métodos previos. Un ejemplo es M. genavense. cuya identificación requiere la
determinación de las regiones hipervariables de los genes ARN ribosomales
16S. Estas pruebas altamente sofisticadas sólo se llevan a cabo en laborato-
rios de referencia o de investigación.
Test de sensibilidad
Actualmente se ha desarrollado una normativa estandarizada de sensibili-
dades de micobacterias únicamente para M. tuberculosis aislado. El estudio
puede realizarse con colonias aisladas o en los viales positivos BACTEC 12B
(test indirecto) o de muestras de esputo con baciloscopia positiva (test direc-
to). Tradicionalmente el método de proporción, un test modificado de dilución
de agar. se ha utilizado para evaluar la sensibilidad de M. tuberculosis al tra-
tamiento. Con este método los gérmenes aislados que muestren alguna resis-
tencia mayor del 1% se consideran resistentes a esa concentración de fár-
maco. Los resultados están disponibles en un minimo de 21 días. El sistema
BACTEC TB460 también puede ser utilizado para estudiar la sensibilidad de
las MTBC. estando disponibles los resultados en 5-7 días. Una descripción
más detallada de estos procedimientos se puede encontrar en otros textos
(Hawkins, 1991). Acerca de la posibilidad de la multirresistencia de M. tuber-
culosis, expertos del CDC recomiendan que se informe del resultado de la
sensibilidad en menos de 28 días tras la recepción de las muestras, un plazo
que en la actualidad sólo puede ser logrado por el BACTEC TB (Tenover,
1993).
También se puede estudiar la sensibilidad de las micobacterias no tubercu-
losas que tengan importancia clínica (Wallace. 1997): sin embargo, para algu-
nas especies puede existir cierta correlación entre los test de sensibilidad y la
respuesta clínica al tratamiento. Además, no hay métodos de referencia estan-
darizados para estudio de sensibilidad de algunos de esos organismos. Los
métodos usados son el método de proporción, ensayos radiométncos y micro-
dilución del caldo de cultivo. Para M. lortuitum-chelonae complex aislado se
recomienda hacer la microdilución y test con amicacina. celoxitma. ciprotloxa-
cino, clarilromicina, doxiciclina, imipenem (sólo para M. lortuitum). sulfameto-
xazol y tobramicína (sólo para M. chelonae) (Woods, 1999). La dilución del cal-
do (tanto macrodilución como microdilución) debería ser usada únicamente
para estudiar la sensibilidad de M. aviuma los macrólidos (clarilromicina yo
acitromicina) (Inderlied. 1997: Wallace. 1997).
TRATAMIENTO
Los aislamientos iniciales de Mycobacterium tuberculosis en todos los pa-
cientes con tuberculosis deberían obligar a estudiar la sensibilidad a los tuber-
culostáticos de primera línea como isoniacida. rifampicina, piracinamida y
elambutol. La sensibilidad deberia repetirse si el paciente continuase con
esputo positivo tras tres meses de tratamiento (Tenover, 1993). Si el bacilo
aislado es resistente sólo a rifampicina o a dos o más agentes de primera
línea, también se debería evaluar la sensibilidad a los fármacos de segunda
línea (estreptomicina, etionamída, kanamicína. capreomicina. ofloxacino y n-
fabutina). El régimen quimioterapéutico actualmente recomendado para el tra-
tamiento de tuberculosis (Tabla 53-7) se debe iniciar antes de los resultados
de sensibilidad, pero se debe alterar en función de los resultados si se demos-
trasen resistencias. La medicación se deberia administrar mediante observa-
ción directa. Los regímenes habitualmente empleados para el tratamiento de
 CAPÍTULO 53 • MICOBACTERIAS
la infección por micobacterias se recogen en la Tabla 53-7 (Inderlied. 1993;
Wolinsky. 1979; Wallace, 1983, 1994, 1997; Horowictz, 1994). Para muchas
micobacterias no tuberculosas la duración óptima del tratamiento se des-
conoce, pero los intervalos indicados en la Tabla 53-7 han sido exitosos en
algunos casos.
PREVENCIÓN
Mycobacterium tuberculosis
Se describen cuatro estrategias generales para el control de la tubercu-
losis (CDC. 1988). La más importante es la identiticación precoz y el ade-
cuado tratamiento de personas con la infección tuberculosa. Esta medida
hace que las personas infectadas dejen de ser contagiosas en pocas sema-
nas y eventualmenle logra su curación. La segunda estrategia consiste en
identificar y tratar a los individuos con tuberculosis no contagiosa: enferme-
dad extrapulmonar. enfermedad pulmonar primaria en niños, enfermedad
pulmonar sin confirmación bacteriológica e infección por M. tuberculosis sin
enfermedad (p. ej„ asintomáticos con test cutáneo positivo y radiografía de
tórax normal).
La tercera estrategia consiste en la creación de un ambiente de segun-
dad en las situaciones en las que existe un alto riesgo de transmisión: salas
de autopsias, habitaciones para recogida de esputo inducido, áreas de espe-
ra de pacientes respiratorios, centros penitenciarios, algunos refugiados sin
hogar y los laboratorios de microbiología. Para llevar a cabo esto, se deben
documentar muchos asuntos (Segal-Maurer, 1994). Las habitaciones de los
pacientes infecciosos, o en las que las muestras infecciosas sean manejadas,
deben estar a presión negativa y el aire que pueda contaminarse con micro-
gotas infecciosas debe ser eliminado al exterior. Un sistema de ventilación de
un solo paso (mejor mediante la colocación de unas salidas supletorias de
aire en el techo y la entrada de aire cerca del suelo) es lo recomendable, con
un mínimo de 6 recambios de aire por hora (12 recambios por hora en cuar-
tos de autopsias). Deben seguirse estas precauciones universales cuando
se manejan todas las muestras, y tanto las muestras como los cultivos se
deben manipular en una cabina certificada de seguridad clase II. Además
debe emplearse un respirador de partículas que filtre partículas entre 1 pm-5
pm de diámetro y se debe entrenar al personal dentro de un programa respi-
ratorio. Las mascarillas quirúrgicas estándar no son adecuadas.
La cuarta estrategia consiste en la vacuna del BCG, una vacuna atenuada
derivada de una cepa de M. bovis de las francesas Calmette y Guérin. Su efi-
cacia en la prevención de la tuberculosis es controvertida, pero un reciente
metaanálisis de la bibliografía sugiere que reduce el riesgo de tuberculosis en
un 50% (Colditz. 1994). En EE.UU. la vacuna BCG se recomienda sólo en
niños con test cutáneo negativo y que pertenezcan a alguno de los siguientes
grupos (CDC. 1988): 1) aquellos en contacto íntimo y prolongado con perso-
nas tratadas sin éxito o reticentes al tratamiento, con tuberculosis pulmonar
contagiosa y que no se puede separar de la fuente de exposición y para los
que el tratamiento preventivo a largo plazo no es posible, 2) aquellos expues-
tos continuamente a personas con tuberculosis por cepas resistentes a iso-
niacida y rifampicina. 3) aquellos grupos con una tasa de infección superior al
1% por año. y para los que los programas habituales de vigilancia y trata-
miento han sido intentados pero no han sido viables. La vacuna BCG no se
recomienda en los trabajadores de salud de EE.UU. La recomendación actual
para la protección de los profesionales de la salud es una adecuada vigilan-
cia que incluye períodos sistemáticos con test cutáneos (al menos anualmen-
te, o más frecuentemente para los grupos de alto riesgo) y profilaxis con iso-
niacida para conversiones recientes del test de la tuberculina y para personas
con test cutáneo positivo y que estén en contacto intimo con tuberculosos o
que tengan patología médica como diabetes, insuficiencia renal o inmunosu-
presión patológica o terapéutica (CDC. 1988).
La vacuna BCG no debe emplearse en inmunosuprimidos y debe darse
con cuidado en aquellos con riesgo de infección por VIH. Se ha descrito
enfermedad diseminada por M. bovis en pacientes con sida y adenopatías por
M. bovis en niños infectados por VIH (CDC. 1985: Blanche, 1986). Sin embar-
go, la enfermedad diseminada por M. bovis no se ha descrito en pacientes
con VIH asintomático. En poblaciones donde el riesgo de tuberculosis es alto.
1155
la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda el uso de la vacuna
BCG en los niños infectados por VIH al nacimiento o al poco tiempo del naci-
miento. Está contraindicado su uso en niños con infección VIH asintomática o
en poblaciones donde el riesgo de tuberculosis es bap y en personas cono-
cidas o con sospecha de estar infectadas por VIH (WHO. 1987).
Mycobacterium avium complex
La enfermedad diseminada por MAC en pacientes con sida se asocia con
gran morbilidad y una disminución de la supervivencia (Horsburgh. 1991:
Nightingale, 1992). Más aún, lo más deseable seria la prevención de la enter-
medad. Dado que el MAC es ubicuo en el ambiente, la medida más razona-
ble para la prevención es la inmunoregulación o la quimioprofilaxis. Actual-
mente, el Servicio de Salud Pública de EE.UU. y la Sociedad Americana de
Enfermedades Infecciosas recomiendan claritromicina o acitromicina de pro-
filaxis en pacientes con sida con CD4- por debajo de 50 pl (CDC. 1997). La
rifabutina es la alternativa para la profilaxis de la enfermedad por M. avium
complex si ninguna de las previas fuese tolerable.
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 C A P Í T U L O 54

Enfermedades micóh'cas
Washington C. Winn, JR., M.D. M.B.A.
Fred W. Westenfeld, MT(ASCP)SM

NOMENCLATURA, TAXONOMÍA Y TÉCNICAS DE DERMATOFITOS 1181

IDENTIFICACIÓN 1159 Enfermedad clínica
Colonia de hongos Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Estructura de levaduras e hitas Especies de Microsporum
Pigmento de hifas Especies de Trichophyton
Epidermophyton floccosum
Estructuras reproductoras asexuales
Estructuras reproductoras sexuales MOHOS DEMATIACENOS 1185
Tasa de crecimiento Enfermedad clínica
Inhibición por cicloheximida CIGOMICETOS 1184
Temperatura óptima para el crecimiento Factores de nesgo y enfermedad clínica
Pruebas bioquímicas Patología de la infección por cigomicetos
Dimorfismo Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Pruebas inmunologías Especies de Rhizopus
Otros cigomicetos
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1166
MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS) 1186
Recogida de muestras
Factores de riesgo
Examen directo de muestras Enfermedad clínica
Aislamiento de hongos en cultivo Patología de la infección por hipomicetos
Seguridad en el laboratorio Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Técnicas para el estudio morfológico de Aspergillus fumigatus
aislamientos fúngicos Aspergillus ftavus
Test de sensibilidad de aislamientos fúngicos Aspergillus niger
Otras especies de Aspergillus
LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS 1171
Especies de Fusarium
Género Candida Pseudallescheria boydii/Scedosporium apiospermum
Género Cryptococcus Especies de Penicillium
Género Malassezia Otros mohos hialinos
Otras levaduras y patógenos semejantes INFECCIONEES CAUSADAS POR ALGAS
a levaduras y saprofitos ACLORÓFILAS 1190

HONGOS DIMÓRFICOS 1176 PNEUMOCYSTIS CARINII 1191

Histoplasma capsulatum Factores de riesgo
Blastomyces dermatitidis Enfermedad clínica
Coccidioides immitis Patogenia de las infecciones por Pneumocystis
Sporothrix schenckii Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Otros hongos dimórficos BIBLIOGRAFÍA 1192

La micologia médica se encuentra entre las diversas áreas de la microbio-
logia y enfermedades infecciosas que abarcan levaduras unicelulares y
mohos filamentosos, agentes que causan infecciones superficiales de la piel
y enfermedades sistémicas de localización profunda, patógenos históricos
establecidos y hongos saprofitos que han alcanzado el estatus de patógeno
por las enfermedades y tratamientos modernos. Para los patólogos que se
han formado en patología quirúrgica, la micologia médica debería ser una
adaptación natural. La identificación de hongos se logra en su mayoria por la
destreza humana en su observación mejor que con máquinas. El estudio
macroscópico de la muestra quirúrgica se detiene en la morfología de las
colonias de los hongos aislados en medio agar; mientras que en anatomía
patológica, el análisis definitivo del problema debe esperar hasta que se
observe al microscopio. La caracterización de la estructura molecular de las
células para el uso de anticuerpos monoclonales no se ha desarrollado
mucho en micología, pero se ha hecho una aproximación y el diagnóstico
molecular será indudablemente de una gran importancia en el futuro.
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS 1159

El objetivo de este capítulo es presentar los lundamentos de la micologia
médica, poniendo éntasis en los usos prácticos y los patógenos fúngicos que
encontramos regularmente en el laboratorio. Llamamos la atención al lector
de la existencia de algunos gérmenes potencialmente patógenos aislados con
menor frecuencia. Hay varios textos de referencia excelentes que sirven de
recurso para informarnos de hongos saprofitos no usuales que, cada vez
más, están implicados en pacientes inmunodeprimidos como agentes causa-
les (Kwon-Chung, 1992: Larone, 1995; Murray, 1999; Rippon, 1988; Sutton.
1998). Con el uso creciente de los protocolos inmunosupresores para tras-
plantes y quimioterapia de las enfermedades neoplásicas, todo hongo aisla-
do debe considerarse como patógeno potencial. Hay que recordar que la
infección invasiva puede producirse en personas que no están inmunodepn-
midas, o incluso en aquellos que no tienen la enfermedad manifiesta.
Los anatomopatólogos, micólogos médicos y los clínicos deben trabajar en
equipo para proporcionar al paciente los mejores cuidados (Walker. 1982). Se
produce una gran satisfacción en el equipo médico cuando se resuelve un
problema clínico con un gran esfuerzo conjunto, pero el que más se beneficia
de que exista una buena comunicación entre expertos es el paciente. El obje-
tivo de este capítulo está en el laboratorio de micologia. Chandler y Watts
(1987) han hecho un atlas de histopatologia de la infección fúngica que es
excelente y comprensible.
Las especies Prototheca son algas aclorófilas más que hongos. Se expli-
can en este capítulo porque las características de las algas y las enfermeda-
des que producen recuerdan más a los hongos que a cualquier otro agente
infeccioso. El Pneumocystis cannii tiene características de protozoos y hon-
gos. Aunque siempre se le ha englobado dentro de las enfermedades parasi-
tarias, los estudios moleculares sugieren una relación más cercana a los hon-
gos, por eso se le ha incluido en este capítulo.
NOMENCLATURA, TAXONOMÍA Y TÉCNICAS
DE IDENTIFICACIÓN
El primer obstáculo para los micólogos principiantes es la nomenclatura y
la taxonomía manual. Los miembros del remo de los hongos son células euca-
rióticas que se reproducen de un modo tanto sexual como asexual. Se clasi-
fican en función de la naturaleza de las estructuras reproductoras. Los es-
tados sexuales de muchos hongos son desconocidos: estos organismos,
conocidos como hongos imperfectos, se clasifican por sus estructuras repro-
ductivas asexuales. Estos estados asexuales son, por supuesto, sólo imper-
fectos para los taxonomistas, la mayoría de los micólogos y. sin dudarlo, los
hongos mismos son perfectamente felices con su estado incompleto. Una vez
que la fase sexual, llamada teleomorfa, de los hongos se conoce, se reclasi-
fica al organismo, aunque en la actualidad el nombre que antes se daba a la
lase asexual imperfecta, llamada anamorfa. aún se conserva Por eiemplo.
poca gente conoce Histoplasma capsulalum. Blaslomyces dermatitidisy Crip-
tococcus neoformans por sus respectivos nombres teleomórficos, A/ellomy-
ees capsulatus. Ajellomyces dermatitidis y Filobasidiella neoformans respecti-
vamente. Por el contrario, la fase sexual Pseudatlescheria boydii y su fase
asexual Scedosporium apiospermum sí que se reconocen en la práctica
común.
La mayor parle de la taxonomía de los hongos se debe a los detalles
estructurales, porque la clasificación y la identificación en el laboratono
dependen mucho de la morfología. En la Tabla 54-1 hay un resumen donde
se explican los términos más importantes. En este capitulo nosotros rechaza-
mos los complicados esquemas taxonómicos en favor de un concepto más
simple de los patógenos que se encuentran habitualmente en el laboratorio.
Para determinaciones prácticas, unas pocas características generales sirven
como base para identificar los hongos en el laboratorio (Tabla 54-2).
Como los micólogos están aprendiendo, día a día. más de hongos, la recla-
sificación de los organismos se produce de modo regular. McGinms (1999) ha
resumido algunos de los cambios en la taxonomía y nomenclatura de los hon-
gos importantes en el ámbito médico. La influencia de las técnicas molecula-
res sin duda irá creciendo de modo importante en la taxonomía de los hon-
gos, como también lo hará el diagnóstico en un futuro cercano.
Colonia de hongos
La característica más simple es la naturaleza de la colonia de hongos.
Las levaduras son organismos unicelulares que por lo general se reprodu-

Tabla 54-1 G l o s a r i o d e t é r m i n o s habituales e n micologia médica

Término Definición
Micelio aéreo Hila producida sobre la superficie del medio agar
Anamorla La forma asexual de un hongo
Ascoma La estructura que contiene un asco Hay muchos tipos de ascomas
Ascospora Espora sexual que contiene dentro un asco
Ascos Estructura con forma de saco que contiene esporas sexuales También puede estar desnudo o contenido dentro de
otra estructura
Clamidiospora Eslruclura superviviente
Cleistoiecio Ascoma completamente encerrado, compuesto de capas de hitas Las ascosporas se libran por ruptura
Columela Extensión de esporangioforas en la base del esporangio
Célula conidiogénica La célula que produce conidias
Conidiofora La estructura de la hifa especializada que lleva las conidias: es diferente de las células conidiogénicas
Conidias Estructura reproductiva asexual formada de cualquier modo que no implica división
Glabrosa Suave, referente a la morfología de las colonias
Hifa La unidad vegetativa de moho; posee paredes paralelas
Intercalaría Nacido dentro de una hifa
Macroconidias La más larga de los dos lipos de conidias producida por el mismo modo
Microconidias La más pequeña de los dos tipos de conidias producida por el mismo modo
Moho Hongo filamentoso que se reproduce sexual o asexualmente
Micelio Masa de hifas que adorna a un moho
Perilecio Ascoma cerrado con un poro en la parte superior, a través del cual las ascosporas son liberadas
Pseudohifas Serie de células levadunformes conectadas (blastoconidias) que recuerda a una hifa pero contiene áreas de estrechamiento
entre células adyacentes
Septo Pared transversal en la hila
Esporangioforas Estructura de la hifa especializada que transporta el esporangio
Esporangiosporas Espora asexual producida dentro de un esporangio
Esporangios Estructura con forma de saco en la que se desarrollan las esporangiosporas asexuales
Telemorfa La forma sexual de un hongo
Terminal Nacido en el final de una hifa
Micelio vegetativo Hifa que se ha producido en la superficie de un medio agar
Vesícula Célula alargada o hinchada, habitualmente en el final de una conidiofora o esporangiofora, pero puede hallarse dentro
de una hifa
Levadura Hongo de célula única que se reproduce por gemación o por fisión
 1160 SECCIÓN VI MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 54-2 Características d e utilidad para la identificación d e h o n g o s

Característica Ejemplos
Tipo de crecimiento microscópico Colonias de organismos unicelulares (levaduras)
Colonias de organismos filamentosos (mohos)
Morfología de la levadura Gemación
Gemación con pseudohifas
Levadura redonda con capsula
Levadura en gemación con collaretes
Morfología de estructuras filamentosas Hitas verdaderas: septadas
Hilas verdaderas no septadas o de septo escaso
Pseudohifas
Pigmento de la hifa No dematiaceno o hialino (ligero o moho pigmentado)
Dematiaceno (oscuro)
Morfología de las estructuras reproductivas asexuales Conidias
Esporas
Morfología de las estructuras reproductivas sexuales Ascos poras
(demostrable sólo excepcionalmente) Cleistotecío
Peritecio
Tasa de crecimiento Lento (más de 10 días)
Medio (de 5 a 10 días)
Rápido (menos de 4 días)
Inhibición por cicloheximida Muchos de los hongos saprofitos
Temperatura de crecimiento óptimo (ocasionalmente de De 25"C a 30'C
interés) De 35°C a 37°C
De 40°C a 42X
De 5CTC a 58°C
Pruebas químicas Asimilación
Fermentación
Degradación enzimálica (p. ej. ureasa)
Aumento de crecimiento
Feno-oxidasa (melanina)
Conversión de fase moho a levadura Sustiluida por mmunolusión o prueba de ADN en la mayoría de laboratorios
Detección inmunología de antigenos o anticuerpos Cryptococcus. Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces
Característica molecular del ADN Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces

cen de manera asexual por gemación para producir una célula hija. Como je se ejemplariza por el hongo dimórfico. que exhibe una forma de moho bajo
resultado, la masa de colonias de una levadura es una colección de orga- algunas condiciones y una forma diferente de moho en otras circunstancias.
nismos individuales distintos que, sin ser sorprendente, se parece a una Los hongos dimórficos más importantes son patógenos sislémicos que se
colonia de bacterias en la superficie agar. Las colonias de levaduras por lo comportan como mohos en el ambiente y en el medio agar a 25"C-30°C. Por
general son enteras (bordes regulares) y lisas. Cuando están amontonadas el contrario, en el tejido humano es una levadura o. en el caso del Cocci-
y apagadas, como es el caso de la Candida aibicans, las colonias pueden dioides immilis, una esférula. Cuando se cultiva a 37 C, la forma del tejido
parecer de estafilococos. Las levaduras producen catalasa, por eso el se reproduce. Aunque estos patógenos clásicos es lo que por lo general
microbiólogo imprudente que no haga una tinción de Gram o una prepara- entendemos por hongos dimórficos, otros agentes menos comunes también
ción en fresco podría confundir una colonia de levaduras con una de bacte- muestran dimorfismo. Por ejemplo, el Penicillium mametfei, un miembro dis-
rias y hacer un informe totalmente equivocado. Las levaduras encapsula- tinguido de ese género tan extendido, crece como un moho en un medio de
das. como el Criptococcus, pueden parecerse a bacterias encapsuladas. tal
como Klebsiella pneumoniae. aunque equivocarse al identificadas en este
caso es menos probable. Las pseudohifas de las levaduras por lo general
son visibles al microscopio como extensiones filamentosas en los bordes de
la colonia, y se conocen coloquialmente como "pies", como si la colonia fue-
ra un ciempiés (Fig. 54-1).
Al contrario que las levaduras, los mohos son hongos filamentosos y mul-
ticelulares. La naturaleza filamentosa del moho da a las colonias una apa-
riencia lanuda, de pelusa o aterciopelada, alguna vez puntual con un aspecto
granular o de polvo, que se produce por la formación de estructuras repro-
ductoras asexuales (Lámina 54-1). En otras ocasiones la colonia puede tener
una apariencia glabrosa (lisa).
La línea de diferenciación entre mohos y levaduras no está totalmente
definida. Algunas levaduras también desarrollan un componente filamentoso
que en algunos casos podría verse macroscópicamente. Ya se han mencio-
nado antes las extensiones filamentosas de las colonias de C. aibicans.
Otras levaduras desarrollan extensiones filamentosas desde la superficie de
la colonia, siendo semejante al crecimiento de pelo de la cabeza de un cien-
tífico loco. Las especies Trichosporon son levaduras que desarrollan exten-
siones filamentosas, mientras que la Exophiala ¡eanselmei es una levadura Figura 54-1. Extensiones filamentosas desde la periferia de las colonias de Can-
dematiacena que desarrolla un micelio según madura. Lo último en camufla- dida albicans que se conocen coloquialmente como pies
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Figura 54-2. Hilas con ramificaciones septadas de Aspergillus lumigatus. Las
ramas de las hilas tienen ángulos agudos. Esputo expectorado (tinción de Gram). cen pseudohifas. La unión de las levaduras individuales es aún evidente en esta
laboratorio a 25"C-30"C, pero en los tejidos humanos lo encontramos como
forma de levadura. Los cuerpos escleróticos que encontramos en los tejidos
de los pacientes con cromoblastomicosis son una forma vegetativa detenida
entre una forma moho/levadura de los hongos dematiacenos. que aparecen
como mohos cuando crecen en un medio sólido a temperatura ambiente. El
Cokeromyces recurvatus es un patógeno humano raro que tiene mortologia
de levadura en infecciones humanas in vitro a 37 C, pero crece como moho
a 25°C-30°C (McGough, 1990). La Malassezia fúrfures un ejemplo de dimor-
fismo reversible, que produce tanto células levaduras como hilas en las
lesiones cutáneas de la pitinasis versicolor. En el laboratorio es raro encon-
trar la forma de hifa. salvo que haya unas condiciones de cultivo especiales
(Marcon,1992).
Estructura de levaduras e hitas
La mortologia (o ausencia) de formas filamentosas es una característica
importante para la identificación de las levaduras y mohos. La estructura fila-
mentosa de los mohos se relaciona con una hifa. Un conjunto de hilas se
conoce como micelio. El micelio que crece en la superficie del agar o en el
agar se conoce como micelio vegetativo, mientras que las extensiones fila-
mentosas por encima de la colonia se llaman micelios aéreos. Las hifas ver-
daderas pueden tener paredes perpendiculares que contienen poros para la
comunicación a través de las hifas o paredes perpendiculares completas que
dividen a la hifa en múltiples células. Las hifas que tienen paredes perpendi-
Figura 54-3. Hifas anchas, no septadas, de un ogomiceto en tejido cerebral En la
hila hay una rama en ángulo recto. (Hematoxilina-eosina.)
1161
Figura 54-4. Cadenas de una levadura alargada de Candida albicans que produ-
preparación. Adviértase que las paredes celulares de estas pseudohifas no son
paralelas. (Tinción de Gram.)
culares están septadas (Fig. 54-2), mientras que aquellas sin paredes per-
pendiculares están sin septar (Fig. 54-3). Una vez más. la situación es una
sombra gris más que blanca y negra. Algunos hongos que tienen hifas septa-
das también tienen hifas especiales septadas o sin septar (conidioforas) que
tienen estructuras reproductivas asexuales. A la inversa, algunos hongos lla-
mados hongos no septados tienen en ocasiones paredes cruzadas, y quizá
debería llamárseles de septo escaso. Es importante, por tanto, evaluar el
micelio integramente.
La anchura de la hifa y el ángulo de las ramas son pistas importantes
para identificar la cepa. Entre dos de los mohos patógenos no invasivos
clásicos, los cigomicetos, como el Rhizopus spp., tienen hifas anchas con
forma de cinta y sus ramas en ángulos rectos (véase Fig. 54-3), mientras
que el Aspergillus spp. y la mayoría de los otros mohos hialinos tienen hifas
más estrechas y ramas en ángulos agudos (dicotómicamente) (véase Fig.
54-2). Además, el incremento en el uso de terapias inmunosupresivas y la
aparición de enfermedades inmunosupresivas, como el VIH, han aumenta-
do la frecuencia con que los hongos saprofíticos comunes producen enfer-
medades invasivas (Ftinaldi. 1991). Determinar a un hongo como Aspergi-
llus en función de la morfología de la hifa en una extensión o en una
muestra de tejido es en realidad sólo una afirmación de las rarezas a pno-
ri para este grupo de patógenos. Es mejor describir simplemente las carac-
terísticas de la hifa.
Cuando las levaduras se reproducen asexualmente por gemación, la
célula hija por lo general aparece al final de una célula levadura y con el
tiempo se extiende hasta formar una nueva célula levaduriforme Si una
serie de las células hijas no se separa enteramente de la célula original, se
produce una pseudohila. Las pseudohifas se distinguen de las hifas verda-
deras por la presencia de una estenosis en la unión de las células adya-
centes, por la localización uniforme del septo en un punto de la rama del
micelio y porque la talla de la célula hija llega a la de la madre o menos (Fig.
54-4). Por el contrario, las paredes de las hilas verdaderas son paralelas sin
estenosis (véase Fig. 54-2). C. albicans y algunas cadenas de Candida tro-
picalis pueden producir tanto hifas verdaderas como pseudohifas, depen-
diendo de las condiciones de crecimiento, y diferenciar la Candida del
Aspergillus en una muestra de tejido en ocasiones puede ser problemático.
Por el contrario, el Cryptococcus spp. produce sólo levaduras gemadas y en
raras ocasiones pseudohifas primitivas o rudimentarias, pero no forma ver-
daderas hifas.
Pigmento de hifas
Las hifas del hongo dematiaceno contienen un pigmento de melanina
que da coloración marrón a las hifas en las preparaciones microscópicas y
hace que las colonias de los hongos parezcan verde oscuro, marrón o
negro (Lámina 54-2). Los tintes que se utilizan para teñir las extensiones.
 1162 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

las preparaciones frescas o las secciones histológicas pueden oscurecer el

color parcialmente, lo cual puede demostrarse en preparaciones sin teñir.
La apariencia macroscópica de los hongos dematiacenos varía desde el
verde oscuro hasta el negro, pasando por gris. Estos hongos que carecen
de pigmento hifal oscuro se llaman comúnmente hialinos (claros o incolo-
ros). Algunas autoridades prefieren no utilizar este término, porque una
pigmentación clara puede producir colonias de colores. Además, las
estructuras reproductivas asexuales de algunos mohos hialinos pueden
tener pigmentos verdes, marrones o negros que dan color a la superficie
de la colonia una vez que se han formado las estructuras reproductoras, La
apariencia real de estos mohos, por lo general, puede comprenderse al
observar la parte de atrás de la colonia, que mantiene una coloración cla-
ra. Por el contrario, tanto la parte de delante (anverso) como la parte de
atrás (reverso) de las colonias de dematiacenos suelen mostrar el pigmen-
to oscuro. Aunque el C. neolormans no se considera un hongo dematiace-
no. el que esta levadura produzca melanina nos da una pista para identifi-
carlo. Las células de la levadura del C. neolormans no están pigmentadas,
pero podemos encontrar melanina en la levadura y en las hifas pigmenta- Figura 54-6. Levaduras en gemación y sin gemar de Candida albicans (tinción
das de los hongos dematiacenos por el método de tinción Fontana-Masson de Gram).
para pigmentar melanina (Ro, 1987). En ocasiones, el pigmento marrón no
lo encontramos en los hongos que consideramos dematiacenos. Es impor-
tante aclarar que, sin embargo, en ocasiones los hongos no dematiacenos
pueden teñirse con el tinte Fontana-Masson, por eso es muy importante morfología de la conidia, y ponen como ejemplo la diferencia entre hongos
considerar otras características diagnósticas, incluyendo la morfología de dematiacenos, como Drechslera spp. y Helmlnihosporlum spp., que no son
las hifas (Kimura. 1998). patógenos humanos, y Bipolaris spp., que en ocasiones es un patógeno
humano.
El principal mecanismo de reproducción asexual de las levaduras es la
gemación. El proceso comienza como una suavización de la pared celular de
Estructuras reproductoras asexuales
la célula madre, seguida por una expansión de la pared celular (reventón). Un
El primer punto para identificar los mohos es la caracterización de las tabique cierra el límite entre la célula hija y la madre (Fig. 54-6). Si no hay
estructuras reproductoras asexuales. En las levaduras, estas estructuras separación, el resultado, como se dijo anteriormente, es una pseudohifa. Esta
sirven como pistas auxiliares en la identificación. Las dos principales estruc- gemación clásica da como resultado una blastoconidia según Rippon, o una
turas asexuales son las esporas y las conidias. Las esporas de modo natu- blastoespora según Kwon-Chung y Bennet. Menos corriente es la división
ral pueden ser sexuales o asexuales, mientras que las conidias son siem- transversa que se produce en P. marneffei.
pre asexuales. Estrictamente hablando, las esporas asexuales siempre se Los trozos de micelio vegetativo que se diferencian en conidias se llaman
producen por división dentro de una estructura que abarca que se llama células conidíogénicas. Las hifas especializadas que sostienen las conidias
esporangio y las esporas se llaman esporangiosporas (Fig. 54-5). Las coni- se llaman conidioforas. que pueden ser tanto una célula conidiogémca que
dias, que son mucho más diversas, se forman por la diferenciación de la crece del micelio vegetativo como una hifa de soporte. En el caso del Asper-
punta o el lado de una hifa fértil, como la conidiolora. o por la diferenciación gillus spp. la conidiofora. que está sin septar. alarga la cola hasta formar
de la hifa misma. Desgraciadamente, el uso adecuado de los términos coni- una vesícula hinchada (Fig. 54-7). De esa vesícula, las células conidíogéni-
dia y espora en la bibliografía, es muy pobre, y la coherencia es peor. Los cas. que se llaman fiálídes. crecen para sujetar las cadenas de conidias.
términos espora y esporulación se usan como términos para reproducción Algunas especies de Aspergillus producen una fila de fiálídes, que se pro-
asexual, y el término espora se usa algunas veces cuando hubiera sido más duce en una hilera de células estériles, con las conidias que crecen de las
preciso usar conidia. Kwon-Chung y Bennet (1992) han señalado que el fiálídes distales. Los cigomicetos producen estructuras de soporte llamadas
modo en que se produce la esporulación puede ser tan importante como la esporangioforas, en las cuales los esporangios y las esporangiosporas se

Figura 54-5. Las esporangioforas de Rhizopus spp soportan esporangios, que Figura 54-7. Cabezas de Aspergillus lumigatus. Las conidioforas están aumenta-
contienen esporangiosporas. Los rizoides surgen de las hilas cercanas al origen das en el extremo formando una vesícula. Las fiálídes surgen de la mitad superior
de las esporangioforas (lactofenol algodón azul). (Fotografía cortesía del Centers de la vesícula, y las cadenas de conidias se colocan paralelas al eje longitudinal de
lor Disease Control and Prevention.) la conidiofora. (Lactofenol anilina azul.)
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Figura 54-8. Las porciones de los micelios de Coccidioides immitis se nan díte-
rendado en artroconidias. Por olro lado, las artroconidias con lorma de barril están largo de la superficie de la hitas (lactofenol anilina azul),
separadas por unas células vacias de pared fina (lactofenol anilina azul).
desarrollan en las colas (véase Fig. 54-5). Una extensión del ápex de la
esporangiospora en el esporangio se denomina columela.
La conidiogénesis lálica es un proceso en el que la conidia no se des-
arrolla hasta que se forma un tabique entre ésta y la célula madre. La coni-
dia se origina de toda la célula madre. Los patógenos humanos más impor-
tantes que tienen una conidiogénesis tálica son los dermatofitos y los
hongos dimórlicos C. immitis. Según progresa la conidiogénesis. la artroco-
nidia producida por Coccidioides se rompe fácilmente, liberando un gran
número de conidias en forma de barril que se diseminan fácilmente y que
termina con un alto grado de infectividad que demuestra este importante
patógeno humano (Fig. 54-8). La conidia tálica de los dermatofitos se divi-
de en dos tipos según el tamaño: macroconidias grandes, que tienen sep-
taciones (Fig. 54-9), y microconidias unicelulares, que son estructuras más
simples (Fig. 54-10).
El olro tipo de conidiogénesis es la blástica, en la que el protoplasma de
la célula conidiogénica se rompe dentro de la conidia. La forma más sim-
ple de la conidiogénesis blástica es el método de gemación, por el cual se
desarrollan muchas levaduras, incluida la Candida. Como con las conidias
tálicas, dividimos las blastoconidias en dos tipos, dependiendo de si toda
la pared se incluye en el proceso. Habría que hacer una división adicional
entre las especies en las que la pared celular externa no participe en la
conidiogénesis (enteroblástica). Las fiálides son células conidiogénicas
Figura 54-9. Múltiples macro conidias cortas, con forma de porra de Epider-
mophyton lloccosum. Alguna de las comdioforas están ramificadas, y las microco-
nidias están ausentes. (Lactofenol algodón azul.) (Fotografías cortesía del Centers
for Disease Control and Prevenlion.)
1163
Figura 54-10. Microconidias alargadas de Trichophyton tonsurans alineadas a lo
que tienen un collarete en los ápices, que se produce cuando la cola libe-
ra la primera conidia. El collarete puede ser una estructura con lorma de ter-
mo visible, como en la Phialophora spp., o una estructura invisible, como
en el Aspergillus spp. Por el contrario, los anélidos son células conidiogé-
nicas que se rompen para liberar un anillo de material celular en la base de
la conidia cuando se separa de la anélida. La formación de conidias
secuenciales en la base empuja a la célula mas vieja a la cola de la cade-
na, y así deja una sene de anillos o anelaciones en el ápex de la anélida.
registrando sucesos anteriores, como anillos en un árbol. Es difícil ver
algunos de estos pequeños detalles con la luz del microscopio.
La diferenciación de varias estructuras de conidias es la clave para la
adecuada identificación de las muestras aisladas. En algunos casos, las
características morfológicas se comprenden fácilmente. Como en la pato-
logia quirúrgica, reconocer el patrón es una herramienta importante para
identificar la mayoría de los patógenos saprofitos. Es importante apreciar
las características de la morfología de la totalidad de la preparación sin
localizar en estructuras aisladas o aberrantes, lo mismo que es importante
para el patólogo dedicarse al tejido patrón sin distraerse por células atípi-
cas ocasionales. Las estructuras conidiales en desarrollo del Aspergillus o
Paecilomyces. pot ejemplo, pueden parecerse a las estructuras del Penici-
llium. y el observador puede confundirse al pensar que hay dos mohos pre-
sentes. También hay que recordar la posibilidad de un cultivo mixto. Un
micólogo con grandes conocimientos debe usar un objetivo de bajo aumen-
to para la observación inicial. En todas las disciplinas morfológicas, sin
embargo, el hallazgo de detalles celulares con el bajo aumento obliga a un
análisis más detallado con mayor aumento. El excelente arte del diagnós-
tico micológico descansa en la apreciación y diferenciación de los detalles
celulares y. en algunos casos, la tarea requiere una experiencia conside-
rable. Algunas veces el aislado debe ser incitado a producir las estructuras
necesarias para el diagnóstico por la selección del medio adecuado (Tabla
54-3). En general, el medio enriquecido favorece la preparación del mice-
lio vegetativo, mientras que las estructuras reproductoras asexuales se
fomentan en el medio basal. El subcultivo en agar agua o agar patata es
una técnica usual para fomentar el desarrollo de las estructuras de las
conidias. El agar zumo V-8 se ha usado para el estudio de estructuras de
conidias en hongos dematiacenos y para el tomento de la formación de
ascosporas en Saccharomyces. El color de las colonias de Aspergillus se
estudia mejor en agar Czapek-Dox. mientras que el Trichophyton rubrum lo
fomentamos para producir un pigmento rojo en agar patata o agar cornea
con glucosa al 1%. Quizá lo último en un medio especial es agar de estiér-
col de pájaro filtrado, desarrollado por Staib y Blisse (1982) para estudio
del C. neolormans.
La experiencia también es importante para determinar si un subcultivo
se ha incubado el tiempo suficiente para que se formen las estructuras
diagnósticas. Las estructuras semejantes raices (rizoides) que se desarrollan
 1164 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 54-3 Medios suplementarios para la identificación para que aparezcan las colonias. El significado de las colonias de hongos
de hongos de crecimiento rápido, que aparecen después de una incubación prolonga-
da en el medio micológico. debe cuestionarse como posibles contaminan-
Medio Función tes. Sin embargo, hay excepciones para esta generalización. C. immilis,
Agar córnea con Tween 80 Visualizar la morfologia de la levadura que es un patógeno clásico, crece relativamente rápido y podría incluso
Medio de ascosporas. Desarrollo de las ascosporas recuperarse en las placas de agar en el laboralorio bacteriológico si la incu-
agar V-8 bación es grande. Aspergillus spp.. Scedosporium apiospermum, los cigo-
Agar dextrosa patata con Desarrollo del pigmento do micetos y muchas levaduras crecen rápido. Entre los dermatofilos, el por-
glucosa al 1% Trichophyton rubrum
Agar patata Desarrollo del pigmento de Trichophyton centaje de crecimiento es una característica importante y podría ayudarnos
rubrum: morfología del moho a identificarlos.
Agar C/apek-Dox Identificación de especies de
Aspergillus
Agares de Trichophyton Diferenciación de las especies de Inhibición por cicloheximida
Trichophyton
Agar de semilla de pájaro Demostrar la melanina en Cryptococcus La falta de inhibición por la cicloheximida también es una pista útil para
(negro) neolormans ver la presencia de patógenos, especialmente entre los hongos dimórficos
Infusión de corazón- Puede aumentar el aislamiento y dermatofitos. El agar micosel y micobiótico. que se utilizan normalmente
cerebro con sangre de hongos dimórficos como medio para aislar, contienen 0,04%-0,05% de cicloheximida. Un hon-
Agar urea Christensen Diferenciación de Trichophyton rubrum go que tiene un crecimiento lento en un medio que contiene cicloheximida
del Trichophyton mentagrophytes
debería alertar al micólogo de la posibilidad de que esté presente un hongo
Cullivo con diferentes Estudio de la estructura microscópica
agares y su origen dimóríico, o que, con una clínica compatible, se haya aislado un dermatofi-
to. Una vez más, hay excepciones importantes para esta regla. Los cigomi-
cetos y C. neolormans se inhiben completamente por la cicloheximida. Las
especies de Aspergillus y algunas especies de Candida se inhiben parcial o
a partir de la hifa de algunos cigomicetos son características diferenciadoras totalmente.
importantes, pero no pueden detectarse si se hace una observación precoz.
Debe admitirse que algunas de las técnicas para una diferenciación completa
son difíciles, o están incluso por debajo de lo que la mayoría de los laborato- Temperatura óptima para el crecimiento
rios alcanza. Por ejemplo, el patógeno dematiaceno Exophiala (Wangiella) der- El crecimiento a temperatura elevada es en ocasiones una herramienta
matitidis produce conidias blásticas con fiálides y anélidas. Sin embargo, no se diferencial para identificar los hongos (Kwon-Chung, 1992). La mayoria de los
reconoció la presencia de anélidas cuando lo miraron con un microscopio de hongos y levaduras crecen a 25°C-30°C. El patógeno más importante en el
luz óptica, y este organismo ha sido alguna vez clasificado como Phialophora género Cryptococcus es el C. neolormans, que es, y no por coincidencia, el
dermatitidis. El reconocer que las anélidas eran formadas por la muestra ais- único que crece bien a 37 C. Como crece rápido, con frecuencia tiene que ser
lada condujo a asignar un nuevo género, Wangiella dermatitidis, que contenía el primer patógeno en aislarse en las placas agar incubadas a 35"C-37"C en
fiálides y anélidas. Hay un desacuerdo entre si estas especies deberían estar el laboratorio bacteriológico. El Trichophyton verrucosum produce distintas
en el género Exophiala o Wangiella (McGinnis, 1999). cadenas de clamidosporas cuando se incuba a 37 C. El crecimiento del Cla-
A pesar de lodos los esfuerzos, algunas cepas no producen estructuras dosporium trichoides (bantianum) a 42°C-43°C es un modo fiable para dife-
reproductivas asexuales. En las colonias queda pelusa, y consiste sólo en renciar estas especies de otros miembros del género. Asimismo, muchas
hifas aéreas y vegetativas morfológicamente. Estas hifas se describen Exiophiala dermatitidis aisladas crecen a 40' C, mientras que el E. jeanselmei,
como hifas estériles o micelios estériles. con una morfología similar, no crece a temperaturas por encima de 37°C.
Determinar el rango de temperatura al que crecen es una medida útil para
diferenciar entre algunos miembros de los cigomicetos (Kwon-Chung, 1992).
Estructuras reproductoras sexuales
Las estructuras reproductoras sexuales en ocasiones son de valor en el
laboratorio de micología para identificar patógenos comunes y saprofitos. Se Pruebas bioquímicas
pueden producir una gran variedad de estructuras sexuales, pero la mayoría Las pruebas bioquímicas son las ideales para identificar las levaduras, y en
de ellas no suelen encontrarse. Las dos estructuras más frecuentemente ocasiones son útiles para identificar los mohos. La caracterización bioquími-
documentadas son ascis desnudos de Saccharomyces cerevisiae y el cleis- ca puede acompañarse por un estudio de fermentación o asimilación de
totecio de Pseudallescheria boydii (la fase sexual de Scedosporium apiosper-
mum). Aspergillus nidulans, o el grupo de Aspergillus glaucus. Los ascis des-
nudos del Saccharomyces recuerdan a células ovaladas de la levadura en las
que hay de una a cuatro ascosporas individuales haploides (Lámina 54-3). La
formación de ascosporas en Saccharomyces spp. puede fomentarse al incu-
barlo en cierto medio agar, como agar zumo V-8, pero este esfuerzo por lo
general no es necesario, porque con los sistemas comerciales de identifica-
ción de levaduras pueden identificarse bioquímicamente. Las ascosporas
pueden visualizarse en preparaciones frescas, pero se detectan de un modo
más fiable con un tinte resistente al ácido.
Un cleistotecio es un cuerpo sexual en forma de fruta en el que están las
ascosporas totalmente encerradas y sólo pueden liberarse por la ruptura
de la pared del cleistotecio (Fig. 54-11). La pared se compone de una o
varias capas de hifas especializadas. Un peritecio es similar a un cleisto-
tecio. pero tiene una abertura en el ápex de la estructura en forma de pera.

Tasa de crecimiento
La tasa de crecimiento de los hongos aislados proporciona una pista útil
para posibilidades diagnósticas. En general, los hongos patógenos dimór- Figura 54-11. Se pueden ver ascosporas dentro de un cleistotecio del grupo de
ficos y los dematiacenos crecen despacio, necesitando une. semana o más Aspergillus glaucus (lactofenol anilina azul).
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
patrones, de los cuales la asimilación de patrones se usa exclusivamente en
la mayoría de los laboratorios. La fermentación de los carbohidratos es el uso
anaeróbico de los carbohidratos con la producción de gas. Esta técnica es
válida para identificar las especies de Candida, pero no para las especies de
Cryplococcus. La asimilación, que por lo general es un método que se aplica
mucho, comprueba la capacidad de una muestra aislada para utilizar, como
única fuente de carbón necesario para crecer, un carbohidrato o un nitrato,
como la única fuente de nitrógeno. El método auxanográfico Wickerham utili-
za un medio basal en el que un nitrato o un carbohidrato determinado sirven
de nutrientes. El crecimiento de las levaduras es el punto final de un test posi-
tivo. Este método de referencia tan enrevesado no se explicará, porque en la
mayoria de los laboratorios se ha sustituido por uno de los cinco sistemas de
identificación comerciales: API 20C (BioMérieux. Hazelwood, MO), Sistemas
Vitek (BioMérieux. Hazelwood. MO), MicroScan (Baxter Sistemas de Salud.
Sacramento. CA). el Sistema UniYeastTek (Laboratorios Remel, Lenexa, KS)
y el RapID Yeast Plus System (Sistemas de Diagnósticos Novedosos, Nor-
cross, GA). Los cinco sistemas funcionan bien, según la bibliografía y los test
de inspección profesional del College ol American Pathologists (Buesching.
1979: Fenn, 1994: Riddle, 1994: ElZaatari. 1990). El API 20C se ha visto que
se puede comparar con los sistemas bioquímicos convencionales (Buesching.
1979). y ahora está considerado el de referencia entre los sistemas comer-
ciales. Una evaluación de unos datos recientes para el sistema Vitek mostró
una actuación idéntica para el API 20C (ElZaatari, 1990). El sistema Vitek tie-
ne un pequeño margen, según han juzgado unas empresas profesionales, y
será particularmente atractivo para laboratorios que usan esta metodología en
su sección bacteriológica. El sistema RapID lo identifica en aproximadamen-
te 4 horas (Kitch, 1996; Smith. 1999). Independientemente del sistema elegí-
do. es importante estudiar la mortologia de las levaduras.
Además de la fermentación y de los estudios de asimilación, hay un test
secundario por el cual se estimula el crecimiento de unos componentes quí-
micos para asi diferenciar ciertos Trichophyton spp. Incluir mositol y tiamina
en varias combinaciones de medio agar (agar Trichophyton) permite hacer
una valoración de las propiedades de estimulación del crecimiento. El punto
final del test, crecimiento relativo en comparación con un medio basal. es sub-
jetivo y se deben incluir tanto los controles positivos como los negativos.
Tradicionalmente. la identificación de la fenol oxidasa era un test diagnós-
tico importante. La fenol oxidasa en el C. neoformans oxida los componentes
difenólicos para producir un pigmento marrón. El sustrato original que se usa-
ba para identificar esta característica era ácido cafeico en células de semillas
negras (test Staib), aunque después se añadieron otros componentes, como
la L-dopa y L- dopamina. El test de la oxidación del fenol no es suficiente él
solo para identificar el C. neoformans, y con la introducción de sistemas de
identificación comerciales, que son eficientes, se ha disminuido su uso en los
laboratorios clínicos.
Por el contrario, el test de producción de ureasa en los criptococos es de
gran utilidad en el laboratorio clínico para diferenciar los Criptococcus de Can-
dida spp.. particularmente en muestras respiratorias. El C. neoformans es un
patógeno pulmonar sistémico. mientras que Candida spp. son habitantes fre-
cuentes de las vías aéreas altas, pero no es causa común de neumonías pri-
marias. La ureasa puede ser producida por otras especies no patógenas de
criptococos, por especies de Rhodotorula y por algunos aislamientos de Tri-
chosporon beigeliiy Candida krusei. La producción de ureasa puede compro-
barse por la inyección de levaduras aisladas en una preparación con agar
urea de Christensen o en caldo de urea. La alcalinización del medio después
de la producción de NH, por parte de los organismos que producen la rotura
de la urea se detecta al meter en el sistema un indicador de pH. Zimmer y
Roberts describieron un método rápido que proporciona resultados fiables y
útiles en 15 minutos para ir eliminando levaduras de un estudio más a fondo
(Zimmer, 1979) (Tabla 54-4). Hay que tener mucho cuidado para no incluir las
bacterias que rompen la urea en lo inyectado, como las de la especie Kleb-
siella. que encontramos ocasionalmente en muestras respiratorias. Las colo-
nias que tienen pseudohifas vistas macroscópicamente (pies) o que crecen
en un agar que tiene cicloheximina no necesitan analizarse, porque el cripto-
coco no produce pseudohifas in vitroy no crece con la cicloheximida.
Hay un lest de asimilación especial para el KN0 que es el que se utiliza
3 pos o para seleccionar patógenos fúngicos.
en primer lugar para diferenciar entre las especies de los géneros dematia-
cenos. Exophiala (Sutton. 1998).
1165
Tabla 54-4 Prueba rápida de la ureasa para el screening de las
levaduras aisladas de m u e s t r a s respiratorias
1 Colocar un tapón estéril en un caldo de ureasa. Apretar el tapón
contra el lado del contenedor del caldo de ureasa antes de
removerlo para eliminar el exceso de caldo El tapón debe
saturarse, no motarse.
2 Tocar ligeramente todas colonias aisladas que se van a estudiar
con el tapón saturado
i 3 Colocar el tapón saturado en un tubo estéril etiquetado
j 4 Colocar el tubo con el tapón en un baño de agua a 56°C durante
15 minutos
j 5 Retirarlo del baño de agua y examinar la existencia de pigmento
rosa, que indicarla que es positivo Se deben realizar
controles positivos (especies de Cryplococcus) y negativos
(Candida albicans) al mismo tiempo.
Los test bioquímicos tienen un papel auxiliar en la identificación de los
mohos dermatofíticos. La producción de ureasa dentro de los cuatro primeros
días ayuda a diferenciar el Trichophyton mentagrophytes (positivo para la ure-
asa) del 7! rubrum (ureasa negativo). El aislamiento debería ser subcultivado
en una preparación agar ureico de Christensen e incubarse a 25 C-30 C
durante al menos tres días. Una reacción positiva es una gran producción de
ureasa, que se evidencia por una alcalinización del medio.
Si los test bioquímicos son el corazón de los sistemas de identificación de
las levaduras, la confirmación de la identificación a través del análisis de la
mortologia de la levadura en un medio agar es el alma. Utilizar la observación
morfológica como comprobante puede evitar grandes errores que se comete-
rían si se confiara enteramente en los sistemas automatizados.
Dimorfismo
La demostración del dimorfismo es el acercamiento tradicional para identi-
ficar definitivamente un grupo de patógenos sistémaos. En la mayoría de los
laboratorios el aislamiento inicial es la fase moho, porque las placas, por lo
general, se incuban a 25°C-30°C. La conversión a fase tejido se acompaña
por una incubación a 37'C de un subcultivo. La transición de la morfología
moho a la de levadura puede producirse equivocadamente, y las formas de
hifa generalmente se mezclan con las células de levaduras. Algunos aisla-
mientos puede que nunca logren convertirse. Un medio rico, como agar infu-
sión cerebro-corazón con suplemento sanguíneo, tendría que ser incluido,
sobre todo cuando se trabaja con H. capsulatum. El agar infusión cerebro-
corazón o agar algodón están recomendados para la conversión del B der-
matitidis. Los medios para la conversión del C. immilis se han descrito, pero
por lo general no se utilizan. De modo similar, la inoculación en animales es
infrecuente que se utilice en laboratorios clínicos. La introducción del test
inmunológico para exoantigenos lúngicos en cultivo, o caracterización mole-
cular de ácidos nucleicos, ha simplificado considerablemente la tarea de la
identificación definitiva y ha eliminado la necesidad de mostrar ambas fases
en los hongos dimórficos. El test de exoantigenos para C. immitis. H. capsu-
latum y B. dermatitidis está disponible comercialmente. Los test de hibridación
de ácidos nucleicos para estos tres patógenos dimórficos y para C. neofor-
mans están comercializados por Gen-Probe, Inc (San Diego, CA). Estos test
han sustituido la fase de conversión en muchos laboratorios. El sistema Gen-
Probe se utiliza para detectar la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrho-
eae, o para la identificación de ciertos patógenos bacterianos, incluida la
micobactena. En los laboratorios que utilizan la tecnología Gen-Probe, el
acercamiento molecular podría proporcionar una alternativa atractiva a la
inmunodilusión para identificar los aislamientos. Si la fase de levadura del
patógeno se ha demostrado anteriormente o recientemente en extensiones
directas, o en el laboratorio de patología quirúrgica, la conversión de la fase
moho correspondiente en el laboratorio de micologia es superflua.
Pruebas inmunológicas
Las pruebas inmunológicas son válidas para detectar antígenos y anticuer-
Las pruebas serológicas clásicas han sido unos test de fijación del com-
plemento contra los principales patógenos dimórficos. H. capsulatum. B. der-
 1166 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
matitidis y C. immitis. Posteriormente se desarrollan test de inmunodifusión
contra varios antigenos del H. capsulatum. El acercamiento serológico fun-
ciona mejor para el diagnóstico y pronóstico de la coccidioidomicosis. Las
extensas reacciones cruzadas entre H. capsulatum y B. dermatitidts compro-
meten la efectividad de los test.
La detección de anticuerpos para Aspergillus spp. en el suero ayuda en
el diagnóstico de aspergillosis broncopulmonar alérgica, pero es de poca
utilidad en el diagnóstico de enfermedad invasiva (Kurup, 1991). Los anti-
cuerpos que más comúnmente precipitan se han detectado con la técnica
de inmunodifusión. pero también se utilizan métodos más modernos, como
el ensayo inmunosorbenle de la unión de enzimas (ELISA). Algunas auto-
ridades han cuestionado la confianza de los reactivos disponibles comer-
cialmente (Kwon-Chung, 1992).
La detección de antígenos fungicos es el desarrollo más reciente. La apli-
cación más importante con diferencia ha sido detectar el antigeno del cripto-
coco en el suero y en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Tenemos que consi-
derar este test como una herramienta de diagnóstico principal junto con el
cultivo, y ha sustituido al test de tinta china, que es menos sensible para el
examen directo del LCR. Los inmunoensayos para los antígenos de Aspergi-
llus han sido descritos pero no desarrollados comercialmente (Kurup, 1991).
Un radioinmunoensayo para los antigenos H. capsulatum en orina es posible
hacerte a través de un laboratorio de referencia (Laboratorio de Referencia
Histoplasma. Indianapolis, IN), y está bien considerado, particularmente en
pacientes con enfermedades sistémicas (Williams. 1994). Se detectó al antí-
geno en el 92°o de 108 pacientes con infección diseminada, pero sólo en el
39% de 70 pacientes con enfermedad autosuficiente.
Los test cutáneos se han usado para estudios epidemiológicos de algunas
infecciones, pero tienen una utilidad limitada para fines diagnósticos. En algu-
nos casos, como histoplasmosis, los test cutáneos podrían complicar el diag-
nóstico del laboratorio al provocar una respuesta de los anticuerpos (Camp-
bell, 1964). Por desgracia, ninguno de los test que existen para el diagnóstico
de la infección por Candida tienen suficiente sensibilidad y especificidad para
ser diagnósticamente útiles (de Repentigny. 1992).
Figura 54-12. Esquema de organización para los patógenos fungióos humanos importantes.
Un resumen practico de hongos médicamente importantes es el que se
representa en la Figura 54-12. Este esquema se presenta como un esquele-
to organizador en el cual un micólogo principiante puede acercarse al diag-
nóstico etiológico de las infecciones por hongos.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Recogida de muestras
La muestra correcta para llevar al laboratorio de micología depende de la
presentación clínica y del órgano del sistema afectado. En la Tabla 54-5
encontramos un resumen de las principales categorías de enfermedades pro-
ducidas por hongos y la muestra que se recomienda La nomenclatura de las
infecciones por hongos importantes se ha resumido en un cuadro (Odds.
1992).
Las levaduras, en particular Candida spp., pueden recuperarse en algu-
na ocasión de muestras recogidas con una torunda, sobre lodo de las
lesiones purulentas. Las torundas deben usarse para recoger lesiones ora-
les o vaginales sugestivas de candidiasis. y tienen que ser adecuadas para
recoger muestras en pacientes con otitis exlerna crónica, donde solemos
encontrar un gran número de conidias Aspergillus. Las torundas son. sin
embargo, las peores herramientas para recoger muestras en la mayoría de
las zonas de enfermedades infecciosas. Para el diagnóstico de inlecciones
fúngicas en las que el tejido responsable es con frecuencia granulomato-
so. son inútiles, e incluso pueden crear confusión y el médico interpretar un
resultado negativo como la ausencia de infección. Una política firme de
rechazar muestras de torundas debe acompañarse de esfuerzos educacio-
nales persistentes.
Las mejores muestras para el diagnóstico micológico son raspados, cure-
tajes, aspiraciones y biopsia de las lesiones. Los pelos infectados con algu-
nos hongos dermatofitos comunes (p. ej.. Microsporum canis) son fluores-
centes bajo una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lámpara de Wood).
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS 1167

Tabla 54-5 S í n d r o m e s clínicos m a y o r e s y p a t ó g e n o s habitualmente asociados"

Presentación clínica
G r u p o d e pacientes P a t ó g e n o probable Muestras
o sistema

Piel, pelo o uñas Todos los pacientes Dermatofilos Raspado cutáneo

Candida Pelo
Malassezia Urta
1 Trichosporon\ Recortes
\Scopulanopsis)
1 Fusarium]
Piel, dermis y tejido subcutáneo Todos los pacientes Coccidioides immilis Biopsia
Blastomyces dermatítidis
Sporolhrix schenckii
Pacientes con micetoma Pseudallescheria boydii Biopsia
Nocardia
Streptomyces
Actinomadura
Neumonía primaria Todos los pacientes Histopiasma capsulatum Esputo
Blastomyces dermatitídis Lavado bronquioalveolar
C neoformans Biopsia transbronquial
Biopsia pulmonar abierta
Inmunodeficientes Aspergillus
Cigomicetos
Pseudallescheria boydii
Pneumocystis carinii
Infección gastrointestinal Inmunodeficientes Candida Raspado
Aspergillus Curetaje
Cigomicetos Biopsias
Infección del tracto urinario Todos los pacientes Candida Orma
Endocarditis Todos los pacientes Candida (mohos y hongos dimórficos) Sangre
Meningitis Todos los pacientes Cryptococcus neoformans Líquido cefalorraquídeo
Candida
Encefalitis y absceso cerebral Inmunodeprimidos Cigomicetos Biopsia
Aspergillus
Nocardia asteroides
Ciadosponutn [Xylohypha] banltanum
Otros hongos
Osteomielitis Todos los pacientes Coccidioides immitis Biopsia
Blastomyces dermatitídis
Cryptococcus neoformans
Moho
Queratitis Todos los pacientes Aspergillus Raspado
Fusarium
Otitis externa Todos los pacientes Aspergillus (lumigatus y niger) Raspado
Tapón
Sinusitis Todos los pacientes Aspergillus (lumigatus y niger) Biopsia
Fusarium Curetaje
Mohos demaliacenos
Curvularia
Bipolaris
Quemaduras Aspergillus Biopsia
Cigomicetos
Fusarium
Pseudallescheria/Scedosporium
Vaginitis Candida Tapón secreciones aspiradas
Infección de catéteres intravenosos Candida Punta del catéter
Malassezia (recién nacidos) Sangre
Intección diseminada Todos los pacientes Histoplasma capsulatum Sangre
Blastomyces dermatitídis Biopsia
Coccidioides immitis
Pacientes inmunodepnmidos Candida Sangre
Cigomicetos
Aspergillus Biopsia
Fusarium
Pseudallescheria/Scedosporium
Cryptococcus neoformans
Potencialmente algunos hongos
" Pueden darse otias combinaciones y posibilidades
j | menos común
 1168 SECCIÓN VI
y pueden ser seleccionados específicamente para ser analizados. Las lesio-
nes cutáneas de los dermatofitos ("lombriz en anillo") se caracterizan por un
borde activo que avanza, con una cicatriz central, por eso los raspados tienen
que recogerse del borde de la lesión. Las muestras deben enviarse al labora-
torio en un contenedor seco y limpio. Los pelos, uñas y raspados de piel tie-
nen que guardarse en un sitio seco para evitar el crecimienlo bacteriano.
Algunos médicos, como dermatólogos y oftalmólogos, prefieren inocular las
muestras directamente en la superficie agar en el quirófano. Es importante
desarrollar un método para monitorizar el medio en lugares fuera del labora-
torio, porque las placas Petri con alguna muestra de agar seca aparecerán en
el laboratorio sin un sistema fiable.
Examen directo de muestras
Los raspados, curetajes y los pelos pueden examinarse directamente por
un microscopio de luz. Las aspiraciones de pus o fluidos también pueden
examinarse directamente; si el material es demasiado grueso para una
observación sencilla, puede ser extendido en portas de cristal. Las exten-
siones impresas y las preparaciones tienen que hacerse de muestras de
tejidos. Es útil preparar extensiones adicionales sin teñir, porque los análi-
sis después pueden mostrar agentes infecciosos que inicialmente no se
sospechaban.
Preparación en fresco. El método más sencillo para el examen directo
es la observación de una suspensión de la muestra en una solución salina
estéril bajo un cubreportas. Para muestras que contienen tejido de desbrida-
ción y células, como secreciones vaginales, uñas y raspados de piel, debe
usarse una solución de hidróxido de potasio (KOH) (Tabla 54-6).
Tinción de Gram. Este tinte microbiológico usado comúnmente es útil
particularmente para detectar levaduras. La mayoría de las levaduras, en
especial las de Candida spp.. líñen parcial o complelamente grampositivos;
puede apreciarse la presencia de bacterias contaminantes y puede valorarse
la naturaleza de cualquier célula inflamatoria. Las hitas de los mohos apare-
cen grampositivas o gramnegativas por este tinte, pero la tinción es menos
fiable que la de las células levaduriformes.
Tinte de Giemsa o Wright. Si se sospecha histoplasmosis, estos tintes
hematológicos son útiles para apreciar las células de las levaduras dentro de
los macrófagos.
Preparación con tinta china. Las cápsulas polisacáridas del C. neolor-
mans pueden demostrarse por una tinción negativa de partículas de tinta chi-
na (Tabla 54-7). Algunos micólogos prefieren nigrosina porque las partículas
son más homogéneas y es menos frecuente que artefacten. Cuando se exa-
mina con el microscopio de luz, la cápsula se queda en el exterior como un
espacio en blanco alrededor de la célula fúngica, con partículas de tinta que
salen despedidas del borde con un movimiento explorador (Fig. 54-13). Es
importante diferenciar las seudocápsulas producidas por focos imperfectos
alrededor del borde de los leucocitos o artefactos. Si se encuentran las célu-
las en gemación, nos aseguramos la especificidad del diagnóstico. Otros hon-
gos potencialmente encapsulados. como las especies de Rhodotoruia y otras
especies de criptococos. son patógenos tan infrecuentes que se puede elimi-
nar la posibilidad de considerarlos. En muestras clínicas, las cápsulas son por
lo general grandes, pero después de aislarlas en un medio agar, pueden
hacerse más pequeñas y pueden ser más difíciles de demostrar. Por desgra-
cia, algunas cadenas tienen una encapsulación pobre. La sensibilidad del test
de tinta china es aproximadamente del 50% en pacientes que no están infec-
Tabla 54-6 Preparación KOH
1. Colocar una gota de KOH (hidróxido potásico con o sin
calcoflúor) en un porta de cristal limpio.
2. Meter la muestra en la gota de KOH preparada en el porta.
3. Cubrirlo y calentar la mezcla de muestra/KOH pasando el porta a
través de una llama de un mechero de Bunsen varias veces.
No debe hervir.
4. Examinarlo con 10x y 40x. Las muestras excesivamente
tenaces pueden requerir un calentamiento adicional
5. También puede utilizarse el KOH como medio simple, sin calentar.
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
;
Tabla 54-7 Preparación de tir
1. Centrilugar la muestra de liquido durante un mínimo de diez
minutos.
2. Colocar una gota de tinta china en un porta de cristal limpio.
3. Mezclarlo con una gota del sedimento del centrifugado.
4 Buscar levaduras encapsuladas mediante el uso de un objetivo
de 40x.
¡ 5. Las colonias que crecen en agar pueden también mezclarse
directamente con tinta china en un porta para confirmar la
presencia de capsulas.
tados por VIH (Diamond, 1974), mientras que la detección directa del antíge-
no en el LCR o suero tiene una sensibilidad del 90%-100%. La detección de
polisacáridos criptococos por aglutinación de látex o por técnicas inmunoen-
sayos de enzimas ha sustituido a la observación de cápsulas de uso habitual.
La técnica de tinta china puede reservarse para usarla por la tarde y por la
noche, cuando el test de antigenos no está inmediatamente disponible, y para
examinar las cápsulas de colonias aisladas que sugieren C. neoíormans.
Parece que el test de tinta china tiene mayor sensibilidad en pacientes infec-
tados por VIH, quizá porque hay un gran número de células levaduras pre-
sentes (Chuck, 1989; Kovacs, 1985: Zuger. 1986).
Tintes histioquímícos. El método ácido periódico de Schiff tiñe la pared
de las células fúngicas y se utiliza en algunos laboratorios de micología. La
técnica de la plata metenamlna se usa por lo general en laboratorios de his-
tología para detectar hongos. Cuando este método se combina con eosina-
hematoxilina, puede estudiarse la morfología detallada tanto de los tejidos
como de los hongos (Swisher, 1982). Estas dos técnicas tíñen también las
bacterias, especialmente si el tiempo de tinción en el método de impregnación
con plata es prolongado. Estas herramientas se han reemplazado por el sim-
ple y más rápido tinte de calcoflúor blanco.
Calcoflúor blanco. Este componente es un blanqueador que se utiliza en
las industrias de papel y textiles se une a las paredes de las células fúngicas
y emite una fluorescencia blanca (Fig. 54-14) o verde manzana (dependiendo
de las combinaciones de filtros que se usen) cuando se expone a una luz
ultravioleta de longitud de onda corta (Tabla 54-8) (Hageage. 1984). Es nece-
sario un microscopio de fluorescencia, pero esta herramienta tan importante
para el diagnóstico también sirve para otras tareas, como para tinción con
auramina-0 de micobacterias y para inmunofluorescencia.
Recuperar los hongos de la sangre puede acompañarse por una inocula-
ción de medio de caldo, utilizando un sistema bifásico caldo-agar o por la téc-
nica de la lisis por centrifugación (Isolator, Wampole, Cranbury, NJ). El siste-
ma Isolator consiste en un tubo que contiene una solución que produce la lisis
de eritrocitos y leucocitos. Después de sacar la sangre por vacío del tubo, los
contenidos Uticos, incluido cualquier microbio, se centrifugan y se depositan
Figura 54-13. La cápsula de polisacáridos alrededor de la levadura en gemación
de Cryptococcus neoíormans se tiñe negativamente con partículas de tinta. Adviér-
tanse la redondez y uniformidad de las células levaduriformes (preparaciones con
tinta china).
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Figura 54-14. El calcoflúor blanco emite una fluorescencia blanca en las paredes
del hongo cuando se visualiza con microscopio de fluorescencia. Las hilas septa-
das y las ramificaciones de Aspergillus lumigalus se muestran de un modo óptimo
en la superficie de las placas agar. Un porcentaje alto de las funguemias cau-
sadas por levaduras pueden detectarse con uno de los sistemas de cultivo,
como BACTEC (Becton, Dickinson. Sparks. MD) o BacT-Alert (Organon Tek-
nika, Durham. NC). Las levaduras son organismos aeróbicos, por lo que
deben emplearse botes para cultivo de aerobios. Se ha sugerido que los
hemocultivos deben incluir de modo habitual dos frascos para aerobios por la
importancia de la Pseudomonas aeruginosa y la Candida spp.. ambos son
microbios aerobios, y que el frasco de los anaerobios sea inoculado sólo en
determinadas situaciones, tales como enfermedades abdominales, donde la
probabilidad de que existan patógenos bacterianos anaeróbicos es mayor
(Morris. 1993). (Véase Cap. 57 para una explicación más detallada.) El méto-
do mas sensible para detectar la funguemia es el sistema Isolator (Jones,
1990). que es también el más susceptible para contaminarse, bien por el
manejo del sistema durante el proceso, o bien por esporas que son transpor-
tadas por el aire y se colocan encima de las placas agar. Algunos informes
más recientes documentan una representación equivalente para recuperar las
levaduras entre sistemas de hemocultivos continuamente monitorizados, que
primero fueron destinados para recuperar las bacterias, y el sistema Isolator
de 10 mi (Wilson, 1993). En niños, un sistema de monitonzación continua se
comparó favorablemente con el tubo Isolator 1.5 mi (pediátrico) para recupe-
rar las levaduras de la sangre (Petti. 1996). Con esto es posible detectar las
causas más comunes de infecciones sistémicas por hongos, sin utilizar más
sangre o recursos de laboratorio que se requieren para detectar bacteriemia.
Los mohos dimórticos y hongos filamentosos, sin embargo, se recuperan
mejor con el sistema Isolator.
Aislamiento de hongos en cultivo
Selección del medio. Todas las muestras deberían ser inyectadas en
un medio elegido. El método tradicional es el agar dextrosa Sabouraud,
que tiene un pH entre 5,5 y 5,6 y fue elegido para aislar los hongos der-
matólicos. La modificación de Emmons del medio agar dextrosa Sabou-
raud contiene menos glucosa y un pH entre 6.8 y 7,0, y generalmente pro-
porciona un agar más útil. Algunas autoridades prefieren el agar que inhibe
los mohos o el agar dextrosa patata. Rinaldi (1982) ha descrito una modi-
Tabla 54-8 Tinción c o n calcoflúor blanco
1. Colocar la muestra en un porta de cristal limpio.
2. Mezclarlo con calcoflúor blanco.
3. Examinar la preparación mediante el uso de un microscopio de
fluorescencia
4 El calcollúor blanco se debe sustituir por lactofenol anilina
algodón azul cuando se estudia la morlologia microscópica
de los cultivos.
1169
ficación simplificada del agar dextrosa patata que utiliza una preparación
de copos de patata que se encuentra en las tiendas de comestibles Es
mucho más fácil de preparar que el método tradicional basado en patata y
funciona igual. Estos medios están disponibles comercialmente y nos dan
un balance razonable de, por una parte, la inhibición de bacterias contami-
nantes y, por la otra, de un estimulo de la morfología y color típico de las
colonias. El agar copos de patata tiene ventajas para los hongos mohos,
porque las estructuras reproductoras asexuales útiles para el diagnóstico
se desarrollan mejor en este agar que en el medio dextrosa Sabouraud. Si
la muestra es de una zona no estéril, o es probable que se contamine, es
importante inyectar en una placa selectiva y en una no selectiva a la vez.
Las placas selectivas que con más frecuencia se utilizan usan cicloheximi-
da para inhibir los hongos saprofitos y agentes antibacterianos (por lo
general cloranfenicol y gentamicina) para inhibir las bacterias. Para mues-
tras de tejidos, especialmente cuando los hongos dimórficos pudieran ser
los agentes etiológicos. debería añadirse antibiótico a un agar enriquecido,
como un agar infusión cerebro-corazón con sangre.
El medio agar puede echarse en tubos de tapa ancha o en placas Petn. Los
IUOOS proporcionan un margen oe segunaaa para prevenir la mreccion oei
personal y la contaminación de otros cultivos, pero los aislamientos son
mucho más difíciles de manipular, y es prácticamente imposible crear colo-
nias aisladas en situaciones donde esté presente una mezcla de hongos y
mohos en la muestra. Además, el factor extremadamente importante como es
el área de superficie se disminuye con los tubos. Los tubos deberían desta-
parse y dejarlos airear antes de incubarlos. Las placas Petri proporcionan una
sensibilidad mayor y una superficie mejor, pero deben cerrarse y manejarse
con cuidado. El agar que se echa en las placas debería doblar la profundidad
normal (de 7 mm a 8 mm está bien) para que éste se deseque durante perio-
dos de incubación largos. Las tapaderas deberían tener algo que permitiera
pasar el aire.
Inoculación e incubación. En algunas situaciones, sólo las colas que
crecen de la hifa son víales y el resfo de la hifa vegetativa está enferma.
Las muestras ordinarias en un homogenizador. al igual que se hace para el
cultivo de bacterias, es muy desorganizado, y los aislamientos viables
pueden perderse. Es mejor inyectar raspados o curetajes por encima y
dentro del agar en varios puntos de la superficie agar. Los tejidos deben
cortarse, después los fragmentos son inoculados de un modo similar.
Hemos tenido la experiencia de no observar crecimiento en las placas
cuando se agitaba el cepillo de las broncoscopias en el caldo, dejando caer
un trozo en el medio agar. mientras que vimos el crecimiento de A. tumi-
gatus en el cepillo original que se había dejado en el resto del Huido que
se transportaba. Ahora inyectamos estas muestras colocando la aguja o el
cepillo directamente encima de la superficie del agar principal aislado.
Las placas o tubos deberían incubarse en el aire a 25C-30 C. La incu-
bación o inoculación de muestras en una sala no es adecuada por la varia-
bilidad de la temperatura en el ambiente. Es necesario un controlador de la
temperatura de la incubación. No es necesario incubar placas paralelas o
tubos a 37"C para recuperar la fase de levadura de los hongos dimórficos.
porque los resultados nos proporcionan poco rendimiento. La mayoría de
los hongos crecen en un periodo de incubación de dos semanas: entre los
hongos que aislamos con más frecuencia, sólo los hongos dimórficos,
como Histoplasma capsulalum y Blaslomyces dermatitidis. son con fre-
cuencia detectados después de un periodo de incubación de 14 días
(Morris, 1996; Hove, 1997). Las recomendaciones de estos autores son
muy parecidas, podemos resumirlas en:
Tipo de muestra Tiempo de incubación
Dirigida a confirmar la infección por levadura 7 días
(p. ej, boca, garganta, vagina)
Orma 7-14 días
Tejidos y fluidos corporales estériles diferentes
de sangre 21 días
Respiratorias, médula Osea y muestras de sangre 28 días
Muestras donde se sospecha que hay
un moho dimórfico 28 dias
Resto de muestras 14 dias
 1170 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Las placas deben examinarse al menos dos veces durante la primera
semana, cuando puede aparecer el crecimiento rápido, y al menos semanal-
mente después.
Afortunadamente, es fácil conservar aislamientos fúngicos para futuros
estudios o como control de calidad. Los mohos sobreviven un máximo de
12 años después de almacenarlos en agua destilada a temperatura ambien-
te (Qiangqiang, 1998). El aislamiento de levaduras puede mantenerse por
congelación, como para las bacterias. Un método simple es cortar un
pequeño bloque de agar que contenga colonias de levaduras y después
colocar el bloque en un contenedor estéril y congelarlo a -20 C o menos.
Los cultivos no necesitan ninguna condición especial para congelarse.
Seguridad en el laboratorio
La inoculación de muestras y todas las manipulaciones de colonias de
mohos deben realizarse en una cabina de seguridad de flujo laminar. Tanto
el técnico como las placas de cultivo deben protegerse de la alta disemina-
ción de conidias fúngicas móviles. Un experimento simple en el que tapemos
un poco una placa que contenga una sola colonia de A. lumigatus en el labo-
ratorio convencerá al observador escéptico del problema cuando aparezcan
múltiples colonias de Aspergillus alrededor de la superficie de la placa. Para
disminuir la dispersión de las conidias, se ha sugerido que los subcultivos de
colonias que estén muy cargadas de conidias, como el Aspergillus. se reali-
cen inundando la placa con agua estéril, y después de esto, las conidias que
hemos sacado se aspiran y se colocan en la superficie de las placas agar
recientes (McGinnis, 1980). No es obligatorio hacer esta maniobra, pero se
debe tener gran cuidado para minimizar la manipulación de cultivos y la
exposición de las placas al aire libre, incluso en la cabina de seguridad.
Debería realizarse una atención y limpieza escrupulosas de las superficies,
tanto de la cabina de seguridad como de la incubación. Separar las cabinas
de seguridad para inoculación de muestras y estudio de mohos aislados
puede reducir la contaminación de las muestras.
El mayor riesgo para el personal del laboratorio viene del manejo de los
cultivos de mohos de los patógenos dimórficos. particularmente C. immitis.
Kwon-Chung y Bennet (1992) recomiendan inyectar en tubos sin rosca si se
sospecha este patógeno, pero en la mayor parle del país el diagnóstico no
se hace antes de aislar al patógeno. Podemos inundar la placa con un 4%
de solución de formaldehído (10% formalma) y dejar a temperatura ambien-
te varias horas o toda la noche antes del examen microscópico. Como esto
es obviamente irreversible, es mejor dejar otras colonias creciendo en pla-
cas y tubos de reserva.
Es importante saber que la fase tejido de patógenos dimórficos no es infec-
ciosa por vía aérea, por eso el riesgo biológico es poco o nulo al manejar
muestras de tejidos de pacientes con histoplasmosis o blaslomicosis. Una
excepción para esta regla seria C. immitis. que crece en su tase moho dentro
de una cavidad pulmonar conectada con el árbol bronquial. Además, hay lesio-
nes locales de Histoplasma o Blastomyces que han aparecido en zonas de
inoculaciones accidentales.
Técnicas para el estudio morfológico
de aislamientos fúngicos
Algunos de los estudios morfológicos necesarios para identificar los aisla-
mientos fúngicos pueden lograrse con colonias de las placas de aislamientos
originales, pero con frecuencia es necesario transferir porciones de colonias
a medios nuevos o diferentes (subcultivos) para identificar las estructuras
diagnósticas (véase Tabla 54-3). El agar cornea junto con Tween 80 para
analizar los aislamientos de levaduras y el agar copos de patata para mohos
son unas opciones excelentes. Estos medios pueden prepararse en el labo-
ratorio o comprarse en los comercios (Laboratorios Remel. Lenexa. KS;
BBL. Cockeysville. MD). La frecuencia de los subcultivos se reduce si utili-
zamos como medio principal los copos de patata.
Las pruebas bioquímicas son importantes para la información bioquími-
ca, especialmente si se ha utilizado un sistema de identificación comercial.
Un trabajador del laboratorio que coloca el aislamiento en un aparato y. sin
revisarlo, se cree el resultado está realizando una mala tarea. Cuando com-
probamos la información recibida de la máquina entre la morfología de las
colonias y la morfología microscópica, al igual que las condiciones clínicas
que conocemos, estamos haciendo un buen trabajo.
Morfología de las levaduras. El test del tubo germinal es un paso ini-
cial importante para identificar el aislamiento de levaduras. Los tubos ger-
minales son alargados, con extensiones en forma de dedo de una célula de
levadura; son el comienzo de una hifa verdadera (Fig. 54-15). Pueden dife-
renciarse de las pseudohifas por carecer de una constricción en la unión
del tubo germinal y la célula levadura y por las paredes celulares paralelas
en el tubo germinal. Los tubos germinales verdaderos son formados por C.
albicans y Candida stellatoidea bajo las condiciones recomendadas, per-
mitiendo una identificación temprana de las levaduras patógenas más
comunes e importantes. Candida tropicalis puede producir hifas verdade-
ras y tubos germinales bajo condiciones especiales, pero generalmente no
dentro del periodo de incubación abreviado que se dice en el test del tubo
germinal estándar. Es necesario limitar la incubación del test del tubo germi-
nal de dos a cuatro horas, porque si la incubación se prolonga, otras espe-
cies pueden empezar a formar estructuras que se parezcan al tubo germi-
nal (Dolan, 1971). En realidad, estos son los comienzos de una seudohifa.
y una observación cercana revelará la constricción entre el llamado tubo
germinal y la célula levadura La identificación puede confirmarse por la
documentación de clamidosporas. Las clamidosporas son estructuras que
tienen una pared gruesa, que. más que desempeñar un papel reproducti-
vo, sirve como reserva alimentaria (Fig. 54-16). Pueden estar terminales,
como en C. albicans. dentro de la hila (intercaladas), como en los dermato-
fitos. Hablando de manera estricta, no son esporas, pero la larga tradición
probablemente asegure que el nombre permanezca. Los tubos germinales
verdaderos y las clamidosporas se producen por C. albicans y C. stellatoi-
dea. una especie poco frecuente que muchos micólogos creen que es una
variante sucrosa negativa de C. albicans.
El test del tubo germinal tradicional incluye la inoculación de un tubo de
suero (Tabla 54-9). Se ha descrito un test para la formación del tubo ger-
minal en la superficie de una infusión agar de crema de arroz con Tween
80 y oxgall (Beheshti. 1975). Después de observar el aislamiento de los
tubos germinales a 37°C. se continúa la incubación para posterior estudio
de la morfología de las hifas y la formación de clamidosporas a 25 C-30 C.
De este modo, toda la información necesaria se puede recoger de una vez.
El agar cornea puede sustituirse, pero, a pesar del medio usado, las con-
diciones de incubación tienen que ser controladas cuidadosamente, y el
test monitorizado con controles para obtener buenos resultados. La típica
técnica de Dalmau para demostrar las clamidosporas en el agar cornea se
detalla en la Tabla 54-10 (McGinnis, 1980).
Morfología de los mohos. El método más simple para analizar los
mohos es la técnica de la cinta de celofán. Es importante que la cinta sea
Figura 54-15. Los tubos germinales se han extendido desde las células levadu-
riformes de Candida albicans. No hay estrechez en la unión de las células leva-
dunformes con el tubo germinal. Las paredes del tubo germinal son paralelas. El
suero humano fue incubado durante dos horas a 37 0
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Figura 54-16. Las clamidosporas producidas por Candida albicans son estructuras
de pared gruesa que habitualmenle aparecen en los extremos de las hitas. Las cla- puesto un método de referencia para los test de sensibilidad antimicrobiana
midosporas son considerablemente más alargadas que el diámetro de la hila (lac-
tofenol algodón azul).
clara. Las preparaciones deben cerrarse con esmalte de uñas para retardar
que se sequen, y es esencial examinar pronto la muestra. Si no se obser-
van las estructuras diagnósticas, se puede alargar la incubación y repetir el
proceso. El método tradicional para observar la morfología de los mohos es
separar el micelio con agujas y examinar la hita que hemos separado en
salino, calcollúor blanco o lactofenol, con o sin anilina azul. Se prefiere la
anilina azul mejor que el algodón azul, porque es menos tóxico.
En ocasiones es necesario realizar un cultivo para evitar que las estruc-
turas de las conidias se rompan fácilmente en su forma original. El acer-
camiento clásico incluye cortar cuadrados en un medio agar apropiado,
que se colocan en un plano inclinado que se sujeta con las varillas de cris-
tal en una placa Petri, donde añadimos agua estéril para mantener la
humedad Otra alternativa puede ser utilizar una placa agar que se comer-
cialice y que se haya diseñado para cultivos inclinados (Laboratorios
Renet, Lenexa. KS).
Si sospechamos que un aislamiento de mohos puede tener hongos dimórfi-
cos (p. ej.. crecimiento en un medio que contenga cicloheximida), no debería
realizarse el cultivo de este modo, y el test de la tira de celofán debe analizar- patógenos nosocomiales. En 1994, sólo los estafilococos, E coli. Klebsiella
se sólo después de puesta la preparación en una cabina de seguridad de flujo
laminar. El lactofenol azul anilina es fungicida, por lo que proteger la muestra
con esmalte de uñas antes de observarlo nos da mayor protección. También se
puede cubrir el cultivo con formalina al 10% (4% solución formaldehído) e incu-
bar a temperatura ambiente toda la noche antes de manipular el moho.
Test de sensibilidad de aislamientos fúngicos
Durante muchos años había muy pocos agentes antifúngicos quimioterápi-
cos que fueran útiles: la anfotericina B era el único agente efectivo contra la
mayoría de los patógenos sistémicos. Este potente agente antifúngico era con
frecuencia tóxico, pero por fortuna era rara la resistencia. El desarrollo de los
test de sensibilidad para los antibióticos m vilro fue interrumpido por dificulta-
des para estandarizar las condiciones de inoculación y crecimiento. ¿Cómo
Tabla 54-9 Test d e l t u b o g e r m i n a l - s u e r o
1. Colocar de un modo aséptico varias colonias de levaduras a un
tubo de test de 1? x 75 mm que contenga aproximadamente
0,5 mi de suero (humano feto de ternero, de oveja o conejo)
Q
2 Incubar el tubo a 37 C.
3. Después de 2 a 4 horas, colocar una gota de la mezcla en un
porta de cristal limpio.
4 Buscar tubos germinales mediante el uso de un objetivo de 40x.
1171
Tabla 54-10 Test d e la morfología d e las levaduras
Morfología de las levaduras en agar
1. Extender un inoculo de levadura en una sección de agai
córnea/Tween 80
2. Cubrir el área inoculada.
3. Incubarlo de 25°C a 30°C.
4. Observar la morfología microscópica a las 24-72 horas.
medir el inoculo de conidias de Aspergillus o de las cadenas de Candida blas-
toconidia en una seudohila? Los estudios de correlación entre los resultados
in vitro e in vivo son difíciles.
El desarrollo de muchos antifúngicos nuevos (Fromtlin. 1988) y el posterior
desarrollo de resistencia entre las levaduras patógenas han añadido nuevos
impulsos para el desarrollo y estandarización de los test para que se guíen los
laboratorios de la quimioterapia antilúngica (Terrell, 1992; Rex. 1993). El
Comité Nacional de Estándares para Laboratorios Clínicos (1992) ha pro-
de las levaduras patógenas usando caldo diluido o una variedad de microdi-
lución. Existen métodos más modernos para determinar concentraciones inhi-
bitorias mínimas de antibióticos para patógenos bacterianos, como el Etest
(AB Biodisk, Piscataway. NJ). que están siendo estudiados pero que requie-
ren más evaluaciones antes de que sean adoptados como un medio estándar
(Colombo, 1995; Sewell, 1994). Ahora es posible para los laboratorios que tie-
nen que hacer un número elevado de test para aislar levaduras realizar prue-
bas de sensibilidad. Si sólo tenemos que analizar aislamientos de manera
ocasional, lo mejor es enviarlo a un laboratorio de referencia.
El test de sensibilidad de mohos está peor estandarizado. Estos test se
realizan mejor en laboratorios de referencia.
LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS
Género Candida
Las especies de Candida son las levaduras patógenas más importantes.
Como la terapia inmunosupresiva ha llegado a ser muy común y los antibióti-
cos de amplio espectro, como las celalospormas de tercera generación, se
usan con mucha frecuencia, las levaduras ocupan un gran lugar entre los
spp. y los enterococos superaban a Candida como causa de infección san-
guínea en la universidad de Hermont.
Factores de riesgo
Las infecciones por Candida tienen una extensión y una gravedad limita-
das si el huésped es normal. La terapia antibiótica de amplio espectro tras-
torna el balance de la llora colonizante en las membranas mucosas de la
cavidad oral y del tracto gastrointestinal al eliminar la flora bacteriana pre-
dominante. En algunos lugares, como el aparato genital femenino, la causa
de una interrupción en el balance normal en la flora puede no ser obvia. En
zonas cutáneas, tales como las ingles y los pliegues inframamarios. una
humedad excesiva predispone a una infección por Candida.
La gravedad y la invasión de la enfermedad aumenta cuando el huésped
tiene menos defensas (Fraser, 1992). La diabetes, las enfermedades o tera-
pias inmunosupresivas y la neutropenia son factores de riesgo comunes.
Las infecciones sanguíneas, incluida la endocarditis fúngica, se fomentan
por inyección de drogas ilegales por via parenteral (Bisbe. 1992: Weems.
1992) y por usar vías intramusculares, como generalmente requieren los
pacientes hospitalizados (Curry. 1971).
Manifestaciones clínicas
El patógeno más común con diferencia en el género Candida es C. albi-
cans. La frecuencia con que se aislan otras especies varía en función de la
 1172 SECCIÓN VI • MICROBIOIOGÍA MÉDICA
institución. Candida (Torulopsis) glabrata. С parapsilosis у С tropicalis son
los siguientes patógenos más frecuentes (Pfaller, 1998) С Iropicalis se en­
cuentra en pacientes inmunodepnmidos que tienen enfermedad diseminada.
C. parapsilosis puede producir también enfermedad diseminada, particular-
mente cuando el paciente ha abusado de las drogas o ha tenido catéteres
intravenosos (Weems. 1992). C. glabrata (formalmente Torulopsis glabrata)
también causa funguemias (Harón. 1993; Marks. 1970). Se ha asociado con
infecciones del tracto urinario y vaginal (Kauffman, 1974; Sobel, 1986). C. kru-
se/'es una causante menos común de infección diseminada que se parece a
la producida por C. Iropicalis (Goldman, 1993). Continúan asociándose mu-
chas especies con las infecciones humanas, como C. zeylanoides (Leven-
son. 1991). demostrando una vez más que la capacidad de los hongos para
producir infecciones humanas es inexhaustible si las condiciones clínicas
son adecuadas.
La resistencia a los antibióticos imidazólicos (p. ej., cetoconazol. fluconazol
o ilraconazol) desafortunadamente está aumentando en los aislamientos de
especies de Candida. С glabrata y C. krusei en particular son intrínseca-
mente más resistentes a estos antifúngicos que C. albicans (Pfaller. 1988).
Candida lusitaniae. un patógeno aislado con poca frecuencia, es propensa a
desarrollar resistencia a la anfotericina in vivo (Blinkhorn. 1989; Hadfield,
1987). La frecuencia con que se aislan varias especies varia de una institu-
ción a otra.
La enfermedad cutánea como más frecuentemente se ve es como lesio-
nes erilematosas de la piel, algunas veces acompañadas de un exudado
blanco cremoso o escamas. La humedad es una precursora de la infección,
por ejemplo, eritema del pañal en niños o infección de los pliegues cutáne-
os (intertrigo) en adultos. Las zonas comunes son las ingles (en forma de
picor), entre los dedos de las manos y pies, debajo del pecho en las muje-
res y en las axilas. Los trabajadores que tienen que meter las manos en el
agua durante periodos de tiempo largos tienen un gran riesgo de infección
de la piel de las manos, uñas (onicomicosis) o paroniquia. También pode-
mos encontrar las lesiones en la piel de los muslos y nalgas, aunque son
zonas donde no es corriente la infección. Una enfermedad cutánea crónica
es una manifestación poco común de infección por Candida en pacientes
con una inmunidad celular defectuosa (Kirkpatrick. 1971).
La candidiasis oral por lo general se manifiesta como unas placas blan-
cas por encima de la mucosa oral entematosa. Los síntomas son mínimos,
pero puede haber una disfagia importante si la infección es grave. Es común
que aparezcan fisuras en las comisuras de la boca (queilitis angular) y esto
suele ser la primera manifestación. La candidiasis oral es una infección ini-
cial común en pacientes infectados por VIH (Gottlieb. 1981; Klein. 1984). La
candidiasis oral y la infección por Pneumocystis y eran las dos pistas inicia-
les para identificar la presencia del síndrome de inmunodeficiencia adquiri-
da (sida).
La candidiasis gastrointestinal se produce más comúnmente como esofa-
gilis (Haulk, 1991) y menos comúnmente como gastritis (Katzenstein. 1979).
Las erosiones del esófago distal y del estómago provocan un dolor retroes-
temal. que empeora al tragar. A veces, por endoscopia, vemos unas placas
blancas cubriendo la lesión. El diagnóstico diferencial incluye la infección por
el virus del herpes simple, y los des procesos pueden coexistir.
Las especies de Candida son flora frecuente del tracto gastrointestinal bajo
(Cohén, 1969), haciendo complicada la valoración del significado de las leva-
duras en las muestras de heces. Una infección invasiva verdadera del tracto
intestinal bajo es mucho menos común que la enfermedad del tracto alto, aun-
que el crecimiento de Candida spp. en las heces debe acompañarse de tra-
tamiento antibiótico. Se ha descrito enteritis por Candida, рею carece de
documentación histológica (Kane. 1976; Kozinn, 1962).
La vulvovaginitis afecta a las mujeres pospuberales. La diabetes, el trata-
miento antimicrobiano, los embarazos y la actividad sexual son condiciones
predisponentes. Una quemazón vaginal, picor, dispareunia y una secreción de
color crudo se asocian con una infección que puede ser aguda o crónica y difí-
cil de erradicar (Sobel, 1986).
La infección del tracto urinario es difícil de diagnosticar, porque es frecuen-
te que encontremos especies de Candida en la orina por una contaminación
vaginal o colonización de la vejiga en pacientes con catéteres intravasculares.
especialmente cuando se han administrado antibióticos por vía sistémica
(Goldberg, 1979). La infección grave del tracto urinario alto, incluida la necro-
sis de la papila renal, es una complicación seria de las infecciones del tracto
bajo, y se produce generalmente en pacientes que tienen una uropatía obs-
tructiva. Los cultivos no son útiles para valorar el significado de las especies
de Candida en el tracto urinario (Goldberg, 1979).
La candidiasis diseminada es una enfermedad nosocomial seria, sobre
todo en pacientes inmunodeprimidos que están neutropénicos (Fishman,
1972: Klein. 1979). Del 10% al 15% de las infecciones del torrente sanguíneo
las causan las levaduras. Las lesiones focales en cualquier órgano pueden
ser el resultado de una diseminación hematógena. Es raro que se produzca
endocarditis (Johnston, 1991) en pacientes que abusan de drogas (Bisbe,
1992: Weems, 1992). Desafortunadamente, muchos hemocultivos con fre-
cuencia son negativos en las candidiasis diseminadas (Jones, 1990). Es
importante retirar los catéteres infectados (Edwards. 1992). Muchos especia-
listas de enfermedades infecciosas recomiendan una terapia empírica para la
infección hongos si el tratamiento que hemos utilizado para los patógenos
bacterianos no ha funcionado, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos
con neutropenia (Pizzo. 1989: Walsh. 1999).
La mayoría de las infecciones pulmonares se presentan como parte de una
infección diseminada. La neumonía primaria por Candida puede producirse,
pero no es lo habitual (Harón, 1993; Ramírez, 1967). El valor predictivo para
la neumonía por levaduras identificadas o especies de Candida aisladas de
muestras respiratorias es muy bajo, porque pueden estar contaminadas con
secreciones del tracto respiratorio alto. Un acercamiento razonable de coste-
beneficio para las levaduras del tracto respiratorio es informar de su presen-
cia como formas levaduriformes después de eliminar la posibilidad de que sea
un criptococo con un rápido test de ureasa (Murray, 1977).
Las infecciones del sistema nervioso por Candida son poco corrientes
(Bayer. 1976; Parker, 1981), Pueden producirse como una parte de una infec-
ción diseminada o pueden resultar de una inoculación directa.
Patologenia de la infección por Candida
La reacción histológica a la infección por Candida es por lo general puru-
lenta, asemejándose a las lesiones de las infecciones bacterianas. Encontra-
mos generalmente abscesos. En ocasiones, la reacción a la infección por
Candida es granulomatosa. En tejidos, podemos encontrar levaduras geman-
do, pseudohilas e hitas verdaderas. El aforismo que tanto se repite de que las
pseudohifas en una superficie mucosa indican un infección invasiva deriva de
los estudios clínicos de enfermedad gastrointestinal (Kozinn, 1992). pero esta
teoría ya se ha rechazado en el momento actual (Odds, 1994). Cuando pre-
dominan las pseudohifas o las hilas verdaderas, hay que diferenciar las leva-
duras de los mohos patógenos invasivos, como el Aspergillus. La invasión
vascular no es común en infecciones por levaduras, como sucede con el
Aspergillus o los cigomicetos. Con frecuencia se muestran levaduras en las
partes teñidas con hematoxilina-eosina, pero también hay que utilizar la tin-
ción de Gram de tejidos, el tinte de metenamina plata y la técnica del ácido
periódico de Schiff.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Las muestras para cultivo deben tomarse de los órganos afectados y de
lesiones donde puedan visualizarse. Como se ha explicado antes, el siste-
ma Isolator es el método más sensible para detectar bacteriemia (Jones.
1990). pero los sistemas modernos de monitorización continua de hemocul-
tivos, que en principio se usaban principalmente para detectar la bacterie-
mia, detectan la mayoría de los aislamientos de levaduras clínicamente sig-
nificativos (Wilson, 1993; Petti, 1996). Las muestras de tejidos, raspados o
exudados de boca o vagina tienen que inocularse en un medio de aisla-
miento primario con y sin cicloheximida. Si en presencia de la ocloheximida
hay buen crecimiento, es una pista preliminar de la presencia de Candida
albicans, aunque C. guilliermondii. C. kefyr (formalmente pseudotropicalis)
y algunas cepas de C. iropicalis pueden encontrarse también en este
medio. La presencia de extensiones filamentosas de los bordes de la colo-
nia (pies) es una indicación macroscópica de que se están produciendo
pseudohifas (Fig. 54-1). C. glabrata (formalmente Torulopsis glabrata) y
Cryptococcus spp. in vitro no forman pseudohifas, y otras especies de Can-
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
dida. como C. lusilamae y C. guilliermondii, puede que no formen muchas
pseudohifas.
La extensión de la evaluación micológica depende del marco clínico y del
tipo de muestra. Los tractos urinario y respiratorio son dos sistemas orgáni-
cos impodantes donde aislar Candida frecuentemente, pero es difícil de
interpretar, como ya se ha explicado. La identificación completa de aisla-
mientos de estos sitios sólo debería terminarse después de consultarse con
el médico responsable. Aunque la práctica clínica normalmente no se alte-
ra por identificar especies de Candida aisladas, pensamos que los aisla-
mientos de sangre u otros tepdos y fluidos estériles deberían examinarse
enteros cuando las levaduras son el patógeno predominante o el único. Del
mismo modo, identificamos los aislamientos cuando se ha pedido analizar
los hongos en un marco donde se espera encontrar Candida, como vagini-
tis o muguet oral. La importancia puede ser útil para el epidemiólogo del
hospital para el estudio de las infecciones nosocomiales. Un grupo de inves-
tigadores ha sugerido que el porcentaje de recurrencia y cronicidad de la
vulvovaginitis son mayores cuando el patógeno es C. Iropicalis que cuando
es C. albicans (Horowitz, 1985), pero se necesitan más estudios. Cuando
aislamos una levadura en el laboratorio bacteriológico, o está presente en
una infección polimicrobiana, informamos de su presencia, y antes de hacer
más estudios pediremos una consulta. Es muy poco frecuente que tenga-
mos estas peticiones.
Tenemos que expedir un informe preliminar de C. albicans si el test del
tubo germinal es positivo (Fig. 54-15). Si hacemos el estudio de la morfo-
logía de las levaduras utilizando un agar córnea para confirmar la presen-
cia de clamidosporas. la identificación por lo general puede terminarse en
una sola placa de agar en 24-48 horas; en ocasiones, a las 72 horas para
que el cultivo se complete (Fig. 54-16). Si no se demuestra el tubo germi-
nal ni las clamidosporas. la identificación primaria o presuntiva de las espe-
cies de Candida puede hacerse si las pseudohifas están presentes o no
hay artroconidias. Una pequeña fracción de Candida aisladas no producen
pseudohifas. tubos germinales o clamidiosporas. Una identificación com-
pleta necesita un test de asimilación, pero las observaciones morfológicas
auxiliares son necesarias (Tabla 54-11). Algunos laboratorios usan los lest
de fermentación para ayudar a identificar las especies de Candida, pero no
se piden.
En el momento actual no se recomiendan los test ¡nmunológicos para diag-
nosticar candidiasis (de Repentigny. 1992). Continua la investigación de los
métodos para detectar antígenos. que podrían proporcionar un test útil y rápi-
do para la infección invasiva.
Género cryptococcus
El patógeno principal dentro de este género es el Cryptococcus neoíor-
mans. Existen dos variedades: C. neotormans variante neotormans y C.
neotormans variante gattii. La última variante se encuentra predominante-
mente en los trópicos y subtrópicos, y es raro aislarla en los laboratorios clí-
nicos en EE.UU. (Levitz, 1992). Ambas variantes tienen dos serotipos. pero
la determinación serológica sólo es de interés epidemiológico. El estado
sexual del C. neotormans es un basidiomiceto, Filobasidiella neotormans.
pero el teleomorto no se aisla en laboratorios clínicos. Otros criptococos y
Rhodotorula spp. en ocasiones se aislan en zonas no estériles, pero es raro
que estén implicados en enfermedades humanas, si se encontrasen alguna
vez (Horowitz, 1993; Kiehn, 1992; Sinnott, 1989). La fuente ambiental pri-
maria del C. neotormans son los excrementos de palomas o. menos común-
mente, de otras aves. El suelo contaminado también puede esconder los
hongos.
Factores de riesgo
El tratamiento inmunosupresor o la enfermedad es un factor de riesgo
para la criptococosis (Williams, 1976). Antes de que apareciera la infección
por VIH. del 30% al 50% de los pacientes con infección por Cryptococcus
eran inmunológicamente normales, medidos con parámetros adecuados.
Entre los factores de riesgo para los pacientes que no están infectados por
VIH se incluyen neoplasia, diabetes, terapia inmunosupresiva o enferme-
dades inmunológicas (Hajjeh, 1999). La criptococosis es una de las infec-
1173
ciones que definen el VIH que ha llegado a ser el factor de nesgo más
importante Es animoso que la incidencia de esta infección oportunista
parece disminuir entre pacientes con sida en algunas ciudades (Hajjeh.
1999).
Enfermedad clínica
Neumonía. La puerta de entrada de todas las infecciones criptocócicas es
el pulmón, aunque la enfermedad pulmonar sintomática puede no estar pre-
sente en el momento que se reconozca la enfermedad extrapulmonar (White.
1994). La neumonía criptocócica nuestra una amplia variedad de presenta-
ciones. Los pacientes inmunocompetentes pueden no mostrar síntomas, a
pesar de la presencia de los criptococos en el Irado respiratono bajo (Rand-
hawa, 1977). La neumonía puede ser lenta y prolongada, tardando mucho en
resolverse. La infección puede ser difusa o localizada, incluida la presencia de
lesiones nodulares que no suelen calcificar. La infección es más grave en
pacientes inmunocomprometídos. y con frecuencia se acompaña por otros
agentes infecciosos, en particular Pneumocystis cannii y citomegalovirus. La
enfermedad extrapulmonar puede aparecer semanas después de haber
encontrado una infección pulmonar (Kerkering, 19811
Infección cutánea. Las lesiones cutáneas por lo general son el resul-
tado de la diseminación hematógena desde el tracto respiratorio (Pema,
1994). Se presentan como pápulas simples o múltiples, que aumentan y se
ulceran, produciendo un pequeño exudado que contiene las levaduras.
Infección articular y ósea. Una vez más el foco primario de infección
es el tracto respiratorio, desde donde se disemina el cnptococo: lo más
común es a la columna vertebral (Behrman. 1990). Se producen lesiones
osteolíticas. Los abscesos llamados fríos en el tejido suave adyacente pro-
ducen un exudado fino que contiene gran número de criptococos. Con
menos frecuencia incluye los espacios articulares.
Infección del sistema nervioso central. Los focos más frecuentes y
peligrosos de infección criptocócica diseminada son las meninges y el pa-
rénquima cerebral (Chuck, 1989; Kovacs. 1985; Lewis. 1972; Zuger. 1986).
El comienzo de la enfermedad suele ser agudo, pero la presentación pue-
de ser insidiosa y la progresión lenta. Las cefaleas y cambios en el estado
mental y de personalidad con frecuencia dominan el cuadro clínico. La
meningitis basilar, afectación de los nervios craneales, y la invasión de la
parte de debajo del córtex. producen una hidrocefalia y disminuyen la agu-
deza visual. Si hay fiebre, es febrícula, y los signos típicos de irritación me-
níngea, como rigidez de nuca y los signos de Kernig y Brudzmski, están
ausentes.
Patología de la infección por Cryptococcus
La respuesta histológica depende del grado de encapsulación de la cade-
na infectada. Lo más común es que no haya respuesta inflamatoria o que sea
pequeña, correspondiendo al exudado fino visto clínicamente. Meior dicho,
las células del tejido normal están separadas por un gran número de cripto-
cocos encapsulados. Cuando examinamos el LCR, las únicas células pre-
sentes pueden ser las levaduras, que podían malinterpretarse como células
huéspedes mononucleares si por la clínica no sospechamos la infección. En
las tinciones de tinta china positivas encontramos cápsulas grandes. En los
tejidos seccionados es raro que encontremos pseudohifas cortas y rudimen-
tarias de C. neotormans (Freed, 1971). Las cadenas del C. neotormans
pobremente encapsuladas producen una respuesta granulomatosa inflamato-
ria, y las levaduras las encontramos predominantemente en el citoplasma de
los macrófagos (Farmer. 1973) Pueden confundirse con las células del Blas-
tomyces dermatitidis o incluso con espórulas inmaduras del C. immitis. Se
han descrito confusiones entre levaduras pequeñas criptocócicas con el H.
capsulatum, pero la diferenciación por lo general no es difícil (Gutiérrez,
1975). La dilerenciación en los Irozos de tejido puede terminarse al teñir los
mucopolisacáridos de criptococo con tintes de mucina, o al demostrar el pig-
mento de melanina con el tinte de Fontana-Masson. El tinte de melanina es
ventajoso cuando la cadena infectada tiene poco material capsular (Ro,
1987) Las combinaciones del tinte Fontana-Masson y varios tintes para
mucopolisacándos, como mucicarmma o azul alcián se han utilizado para
Tabla 54-11 Detalles auxiliares útiles para la Identificación de levaduras
Crecimiento con Tubos „ . ... _. .. Crecimiento
Organismo cicloheximida germinales Pseudohifas P.gmento ro,o Ureasa Artroconidias Clarmdosporas c o n | i p ¡ d o s Ascosporas Comentarios

Candida albicans
Candida tropicalis
Candida parapsilosis
Candida krusei
Candida kelyr
(pseudotropicalis)
Candida guilliermondii
Candida (Torulopsis)
glabrala
Candida lusitaniae
Cryptococcus neoformans
Especies de Rhodotorula
Malassezia fúrfur
Malassezia pachydermatis
Especies de Trichosporon
Geolrichum candidum
Saccharomyces cerevisiae
(): Reacción menos frecuente. EMB eosina azul de metiieno.
+ + + _ + _
-(+) - + Pseudohifas bien desarrolladas,
rara producción de tubos
germinales
+ - Pseudohifas en cepillo
- - + - •i - - - Colonia plana y seca
+ - + - - - Pseudohifas en "tronco en arroyo";
verde brillante en agar EMB
+ - + (-) - Las pseudohitas pueden
estar ausentes o en poco
número; colonia vitrea
_ - - - Levaduras pequeñas
(de 2uma5 pm)
- - + - — — — — Las pseudohilas pueden
estar en el escaso número
_ _ + - Capsula polisacárida presente,
células levaduriformes redondas
- - - + - - - - La cápsula polisacárida puede
- estar presente
_ _ _ _ — + - Levaduras pequeñas con lorma
de termo
_ _ - - Levaduras pequeñas con forma
de termo
+ H - + + (-> + -
+ No blastoconidias, artroconidias
germinales a partir del ángulo
de la célula
-(+) - - + Las pseudohilas pueden ser raras
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
avanzar, pero no suelen ser necesarios (Lazcano. 1993). Blastomyces der-
matitidis se tiñe muy poco con los linles de mucina en raras ocasiones. El Rhi-
nosporidium seeberies positivo para la mucina. no se ve en climas templados
y se diferencia fácilmente de los criptococos en cuanto a la morfología. Las
células que vemos en la cromoblastomicosis contienen melanina. pero se
diferencian en la morfología y no reaccionan con tintes de mucina. El tamaño
variable (3 pm-10 pm) y la naturaleza redonda de la levadura in vivo y son pis-
tas para identificarlas correctamente, a pesar del grado de encapsulación y
respuesta histológica.
Un complejo primario de granulomas en la periferia del pulmón y en nodu-
los linfáticos regionales, que recuerda a los que nos encontramos en tuber-
culosis e histoplasmosis. probablemente se produce con más frecuencia de la
que lo reconocemos (Salyer. 1974).
Identificación en el laboratorio y otras investigaciones
Los posibles criptococos siempre deben identificarse como especies para
determinar si el C. neotormans está o no presente. Las pistas para ver la pre-
sencia de este hongo son un buen crecimiento en placas de agar de sangre
incubados en el laboratorio bacteriológico a 35'C-37 C. las colonias tienen
apariencia mucoide (Lámina 54-4), apariencia redonda de las células de leva-
dura en las preparaciones en fresco o preparaciones teñidas y ausencia de
crecimiento en un medio que contiene cicloheximida (Tabla 54-11). Podemos
obtener una supuesta identificación de un modo rápido examinando una pre-
paración de tinta china para las cápsulas (Fig. 54-13) (Tabla 54-7) o realizan-
do un test rápido de ureasa (Tabla 54-4). o ambos. Las cápsulas pueden dise-
minarse incluso en cadenas fuertemente encapsuladas una vez que se han
aislado en medio agar. Hemos encontrado varios aislamientos de C. neotor-
mans del tracto respiratorio que eran no mucoides y que se parecían a Can-
dida spp. en la morfología de las colonias. El subcultivo de los aislamientos
puede restaurar la cápsula mucoide. La identificación definitiva se lleva a
cabo por un test bioquímico. La determinación de la actividad de la fenol oxi-
dasa puede incluirse, pero no es necesario si se utiliza uno de los sistemas
de identificación de levaduras que se comercializan.
El antígeno polisacárido del C. neotormans puede encontrarse en el LCR y
el suero: lo más común es por una aglutinación de látex. La sensibilidad del
test supera el 90%. pero los equipos comerciales varían considerablemente
en sensibilidad y especificidad. El factor reumatoide puede dar falsos positi-
vos (Dolan. 1972). y deben incluirse controles para la antiglobulina en los test
(Bennett. 1971). Las infecciones grupo DF-2 (Capnocytophaga canimorsus).
los bacilos gramnegativos no fermentativos (Westerink, 1987) y T. beigehi
pueden causar falsos positivos, pero éstas son infecciones poco comunes.
Otras causas ocasionales de falsos positivos son poco comprensibles. La fre-
cuencia de resultados erróneos puede disminuir tratando las muestras de
suero con pronasa (Hamilton, 1991; Stockman, 1982). Los falsos positivos
parece que son menos comunes en pacientes infectados por VIH. quizá por-
que hay presente un gran número de organismos (Berlín, 1989). La titulación
de los resultados positivos se ha hecho de modo adicional para valorar el pro-
nóstico y como una base para seguir los efectos del tratamiento. Un gran
número de antigenos y la persistencia del antigeno siguiendo tratamiento son
pequeños signos de pronóstico en pacientes que no están infectados por VIH
(Diamond, 1974). Por el contrario, no se ha demostrado que estos paráme-
tros sean útiles de manera uniforme en pacientes con VIH, que en la actuali-
dad son el grupo de mayor nesgo (Chuck. 1989; Kovacs, 1985; Zuger. 1986).
La medida del antígeno en el suero parece ser el test más sensible en pacien-
tes inlectados por VIH, más que el análisis de LCR. Tanto el suero como el
LCR deben analizarse para una buena sensibilidad. En algunos informes, ais-
lar el C. neotormans de un sitio de fuera del SNC se ha asociado con un pro-
nóstico pobre en pacientes infectados con VIH. Un test negativo para la tinta
china en el LCR es un signo de buen pronóstico en pacientes no VIH, pero no
tiene la misma implicación en pacientes con sida.
Género Malassezia
Las dos especies más importantes dentro del género Malassezia son M. fur-
tury M. pachydermatis (Marcon, 1992). M. fúrfures con diferencia el patógeno
humano más común. M. pachydermatis, micialmente aislado de un rinoceron-
1175
te indio, se ha encontrado en muchos animales, especialmente en las orejas
de los perros, y en ocasiones de los humanos. El nombre formal del M. turtur
es Pityrosporum ovale o P. omiculare. dependiendo de la morfología de la
levadura.
Factores de riesgo
M. fúrfur se encuentra en la piel de más del 90% de los individuos
(Roberls. 1969b. 1969c), y la enfermedad cutánea se produce en huéspedes
normales. Puede haber un aumento de sensibilidad a la enfermedad en
pacientes que suden mucho (Roberls, 1969a) o en pacientes que tienen un
nivel de corticoesteroides elevado debido al tratamiento (Boardman, 1962) o
una producción endógena, como en la enfermedad de Cushing (Cañizares.
1959). La infección sistémica se produce principalmente en neonatos y se
asocia con una hiperalimentación intravenosa con soluciones lipidicas
(Powell. 1986). Aunque M. fúrfur no suele estar presente en la piel de los
neonatos sanos, se ha encontrado la levadura en la piel del 37% de los niños
que estuvieron en la unidad de cuidados intensivos (Powell, 1987). Los fac-
tores de nesgo para la infección por M. pachydermatis en humanos son simi-
lares (Mickelsen, 1988).
Enfermedad clínica
Pitiriasis (tina) versicolor. Esta infección común de la epidermis termi-
na en una hiperpigmentación o hipopigmentación de la piel, sobre todo en el
tronco y parte alta de los brazos (Powell. 1986). Las máculas marrones es la
presentación más común, pero las lesiones despigmentadas son más obvias
en personas de piel oscura, y pueden utilizarse sustancias para acentuarlas
en individuos de piel clara. Los efectos de la enfermedad son puramente cos-
méticos, pero pueden ser considerablemente problemáticos. Las lesiones
hipopigmentadas deben diferenciarse del vitíligo. El tratamiento consiste en
una aplicación tópica de cremas fungicidas o enjuagues.
Infección sistémica. La infección sistémica se produce en casi todos los
niños que han recibido infusiones intravasculares de lípidos. Aunque las solu-
ciones lipidicas por sí solas no apoyan el crecimiento de las levaduras, las
soluciones lipidicas diluidas apoyan el crecimiento de M. fúrfur abasteciendo
la cadena larga de ácidos grasos que también se encuentran en la piel, y
deben abastecerse en laboratorio para aislarlas (Powell, 1986). Los niños
infectados por lo general están asintomálicos. pero la fiebre, la leucocitosis y
la trombocitopenia pueden estar presentes. La neumonía es la manilestación
sistémica más importante de la enfermedad, probablemente a causa de una
embolia de catéteres intravenosos infectados. El tratamiento es quitar el caté-
ter infectado.
Patología de la infección por Malassezia fúrfur
El diagnóstico de pitiriasis versicolor por lo general se hace clínicamente o
demostrando levaduras o formas cortas de hifas (parecidas a los espagueti)
en preparaciones de KOH de raspados de piel. Añadir calcoflúor blanco u
otros tintes fúngicos aumenta la detección porque las células fúngicas son
pequeñas y es difícil verlas cuando no están teñidas (Fig. 54-17). Cuando se
hace la biopsia puede verse hiperqueratosis. acantosis y unos infiltrados dér-
micos mononucleares. Se sabe poco de la patología de la infección sistémica
de M. luriur, porque es raro hacer biopsias y la infección letal no es común.
En casos extremos, las lesiones se han descrito en muchos órganos, inclui-
dos pulmón, hígado y riñon (Shek, 1989). También se observaron vasculitis.
endocarditis, infartos sépticos e inflamación granulomatosa.
Identificación del laboratorio y otras investigaciones
En enfermedades cutáneas es raro que se pida un cultivo para M. luriur,
y la observación directa de las levaduras en preparados de KOH por lo
general se hace en el despacho del médico. Esta levadura debería verse
en cultivos de sangre y en la punta de catéteres intravenosos en neonatos.
Antes de inocularla, se añade una gota estéril de aceite de oliva a la super-
ficie de un medio agar válido, como el agar Sabouraud dextrosa o el agar
 1176 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

sangre de oveja. En nuestro laboratorio utilizamos aceite de cacahuete,

que también funciona bien. Dentro de los dos o tres primeros días, las colo-
nias aparecen en marrón claro y por lo general tienen una apariencia muy
seca en el aceite subyacente (Lámina 54-5). Una pista inicial es la taita de
crecimiento por la presencia de un aceite. Debería haber suficiente lipido
en la sangre o en la punta de catéter, sin embargo, para mantener el cre-
cimiento inicial en las placas que no contienen aceite. M. pachydermatis no
es dependiente de la cadena larga de ácidos grasos para crecer.
La identificación del aislamiento puede confirmarse por un examen
microscópico de las células de levadura, que miden de 3 pm a 7 pm. El pro-
ceso de gemación en la Malassezia es inusual, porque se produce como
un proceso enteroblástico con la formación de fíálides. La gemación tiene
una amplia base y los collaretes de las fiálides podrían observarse con el
microscopio de luz como un anillo oscuro distinto que separa la célula
madre de la hija (Fig. 54-18).

Figura 54-18. Células levadurilormes en gemación de Malassezia luriur que dan la

Otras levaduras y patógenos semejantes a levaduras
clásica forma de termo.
y saprofitos

7! beigelii produce una infección del pelo conocida como piedra blanca y
puede producir infección sistémica (Hoy. 1986: Ogata, 1990). El Blastoschi-
zomyces capitatus (formalmente Trichosporon capitalum) ha causado casos
raros de infección diseminada semejante a la candidiasis (Liu, 1990). Un hongo
morfológicamente similar, Geotrichum candidum, es también una causa rara de
enfermedad pulmonar o diseminada (Fishbach, 1973; Jagirdar. 1981). Geotri-
chum y Trichosporon producen colonias lisas y parecidas a las levaduras que
después desarrollan micelios aéreos, como un pelo que nace de una cabeza
calva (Lámina 54-6). Ambas especies producen artroconidias que rompen las
células disyuntoras vistas en el C. immitis (Fig. 54-19). Saccharomyces cerevi-
siae (Clemons. 1994; Sobel. 1993), especies de Rhodotorula (Píen. 1980) y las
especies de Hansenuta son levaduras saprofíticas que en raras ocasiones pue-
den producir infección. Encontrar levaduras en los tejidos o aislarlas en múlti-
ples muestras, incluso de zonas estériles, es necesario para informar del papel
de las levaduras en un proceso infeccioso. Saccharomyces cerevisiae es la
levadura de los panaderos y a lo mejor es más conocida por los estudiantes de
micología por sus efectos saludables en malta y lúpulos.
HONGOS DIMÓRFICOS
Los hongos dimórficos son los organismos patógenos más importantes
encontrados en un laboratorio de micología clínica. En EE.UU.. los patógenos
más importantes son H. capsulatum. Blastomyces dermatitidis. C. immitis y
Sporothrix schenckii. El Sporothrix se distribuye a través de lodo el mundo.
Los oíros organismos se encuentran predominantemente en América del Nor-
te, donde tienen distintas distribuciones geográficas (Fig. 54-20). La enferme-
dad epidérmica es más común con Histoplasma y Coccidioides y menos
común con Sporothrix y Blastomyces. La fase de tejido de Coccidioides es la
esférula. El otro género produce una fase levadura in vivo y puede también
crecer como una levadura si se incuba a 37'C m vitro.
Histoplasma capsulatum
Factores de riesgo
El principal tactor de riesgo para adquirir la infección es vivir en una de las
regiones endémicas de EE.UU.. en una zona que se localice en el curso de
los ríos Ohio y Missíssíppi. así como en los valles de las montañas Appala-
chian. En algunas zonas, más del 90% de la población tiene un resultado
positivo en los test de piel de histoplasmina. El crecimiento de H. capsulatum
se estimula por el pájaro guano, aunque los hongos no crecen en los mismos
pájaros. Una típica historia de una histoplamosis aguda está representada por
el paciente que ha limpiado recientemente un gallinero.
Las enfermedades epidémicas se han producido después de hurgar en
los nidos de los pájaros durante proyectos de construcción (Tosh. 1966). De

Figura 54-17. Raspado cutáneo de una lesión de tina versicolor. Son característi-
cas las formas levadurilormes e hifas cortas de la Malassezia íuriur. Estas formas Figura 54-19. Las artroconidias y la especie Trichosporon no están separadas por
se han descrito como "espagueti y albóndigas" (método PAS). células disyuntoras (lactofenol algodón azul).
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Coccidioidomicosis
Figura 54-20. Distribución geográfica de las infecciones fúngicas dimórficas en
Estados Unidos. Se ilustran las áreas de mayor endemicidad (sombra oscura) y las
de menor endemicidad (sombra clara). Pueden producirse casos esporádicos en
otras áreas fuera de las endémicas. La histoplasmosis y la blastomicosis se extien-
den en el sur de Canadá, mientras que la coccidiomicosis se da en Centroamérica
y Sudaménca.
modo irónico, el comienzo de una histoplasmosis se produjo en el 40% de
los estudiantes y facultativos que participaron en un día de limpieza en el
colegio (Brodsky. 1973). La histoplasmosis pulmonar crónica es una enfer-
medad particular con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La
infección diseminada normalmente se asocia con deficiencias inmunológi-
cas, especialmente del sistema inmune celular. La infección por VIH se ha
convertido en el factor de riesgo más importante para la diseminación de la
enfermedad (Johnson, 1988).
Enfermedad clínica
Infección pulmonar aguda. La mayoría de los individuos inmunocom-
petentes desarrollan una infección asintomática o subclínica acompañada de
una respuesta inmunológica (Goodwin. 1973,1978). Los pacientes sintomáti-
cos desarrollan un síndrome parecido a la gripe que puede acompañarse de
dolor pleurítico o retroesternal. Los pacientes más gravemente afectados
pueden estar enfermos durante varias semanas, pero por lo general se re-
1177
suelve completamente. Si ha habido una inflamación granulomatosa local, la
calcificación del foco puede deiar una lesión nodular perfectamente definida
que puede verse en la radiografía de tórax. Las lesiones cutáneas del erite-
ma nodoso y del eritema multiforme pueden acompañarse de una infección
pulmonar aguda (Medeiros. 1966).
Pericarditis y mediastinitis. La inflamación granulomatosa del pericar-
dio y la mediastinitis se han atribuido al H. capsulatum. con más frecuencia en
terreno serológico (Loyd, 1988; Schowengerdt. 1969). La inflamación crónica
puede terminar en fibrosis y pericarditis constrictiva. Es raro ver levaduras en
las lesiones y es raro encontrarlas en el cultivo.
H i s t o p l a s m o s i s crónica pulmonar. Esta enfermedad debilitante se
produce principalmente en pacientes con enfermedad pulmonar obstructi-
va crónica. La mayoría de ellos suelen ser hombres de mediana edad
(Goodwin, 1995). Puede calcificarse y producirse una cavitación. El diag-
nóstico diferencial incluye tuberculosis pulmonar crónica y neoplasia pul-
monar.
H i s t o p l a s m o s i s d i s e m i n a d a . La diseminación de las levaduras a tra-
vés del sistema reticuloendotelial puede ser como una parte de una histo-
plasmosis pulmonar aguda, terminando en granulomas cicatrizados que
con frecuencia se calcifican, especialmente en el bazo (Johnson. 1988;
Kauffman, 1978; Nightingale, 1990; Reddy, 1970). La enfermedad disemi-
nada clínicamente se produce en dos clases de pacientes. El primer grupo
son individuos en edades extremas que no tienen una condición inmuno-
supresiva reconocida, pero pueden tener el sistema inmune que no está
completamente desarrollado, o que ha disminuido por la edad de un modo
que no se entiende. El segundo grupo son pacientes con una enfermedad
o tratamiento inmunosupresivo que está reconocido. Antes de 1980, las
enfermedades eran predominantes en neoplasias hematológicas; en la
actualidad, la infección por VIH es el factor de nesgo más importante
(Johnson, 1988; Wheat, 1990). El avance de la enfermedad puede ser
rápido o insidioso.
La infección del sistema reticuloendotelial puede terminar en linfadeno-
patia, hepatoesplenomegalia o trombocitopenia. La destrucción de la corte-
za suprarrenal por el proceso granolumatoso puede ser suficientemente
extensa como para causar una insuficiencia hormonal. La infección del SNC
puede manifestarse como meningitis crónica, granulomas intracerebrales o
ambos. La infección endovascular incluye la endocarditis con unas vegeta-
ciones grandes y voluminosas. Puede afectarse cualquier parte del tracto
gastrointestinal, y macroscópicamente las lesiones ulceradas pueden suge-
rir una neoplasia. La afectación de la piel es menos común que con otros
hongos dimórficos (Studdard, 1976). En pacientes infectados con VIH. los
síntomas de la histoplasmosis diseminada pueden parecerse a esos produ-
cidos por el virus, incluyendo fiebre, linfadenopatia, anemia, leucopenia.
trombocitopenia, pérdida de peso y fatiga.
Las lesiones cutáneas solitarias son raras; pueden seguir a la introducción
directa de hongos.
Patología de histoplasmosis
Como un patógeno facultativo intracelular, H. capsulatum se asocia par-
ticularmente con macrófagos. Las lesiones patológicas consisten en reco-
gidas de macrófagos infectados, granulomas no caseosos o granulomas
caseosos. Las lesiones histopatológicas son muy parecidas a esas que se
producen por Mycobacterium tuberculosis, y debería pensarse en estos
dos patógenos a la vez. Las levaduras intracelulares por lo general se
muestran bien por una tinción de hematoxilína-eosina (Fig. 54-21). Las
técnicas de ácido periódico de Schilf y de plata metenamina son más fre-
cuentes, y el tinte de plata es necesario para demostrar las células de leva-
duras en granulomas cicatrizados. Estas levaduras, que presumiblemente
no son viables más tiempo, pueden alargarse y retorcerse. El diagnóstico
diferencial de las formas de levaduras es con formas pequeñas de B. der-
matitidis. En el marco clínico adecuado, debemos considerar P. marnettei
y las especies de Leishmania o Candida spp., en especial C. glabrata La
talla mayor de las células de levadura de Candida (distinta de C. glabrata)
o la presentación clínica por lo general sugiere el diagnóstico adecuado.
 1178 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

nologías o moleculares. El agar de sangre cisteína glucosa o el agar infu-

Figura 54-21. Células levaduriformes de Histoplasma capsulalum dentro de los ma-
crófagos. Los núcleos son únicos. Las células están separadas de las demás por un
espacio que es un artefacto de la fijación con formalina. Los hongos se consi-
deraron originalmente como unos protozoos tisulares, y el espacio claro se con-
sideró como una cápsula (tinción de nematoxilma-eosina).
Las levaduras de H. capsulatum en granulomas caseosos son lo suficien-
temente distintas para proporcionar un diagnóstico posible, pero tienen que
diferenciarse de las presentaciones granulomatosas inusuales del Pneu-
mocystis carinii.
sión de cerebro-corazón con sangre de oveja se incuban a 37 C. Si se ha
demostrado la fase levadura en muestras de tejidos, la conversión del moho
in vitro es académica.
El diagnóstico serológico de la histoplasmosis tiene un papel secundario
en el diagnóstico y no debe sustituir los intentos para cultivar los hongos
(Walter, 1969). La fijación del complemento y las técnicas de inmunodilusión
es lo que se utiliza más frecuentemente. La sensibilidad del serodiagnóslico
no es mayor del 50% al 85% en enfermedad pulmonar crónica, y desafortu-
nadamente es mucho menor cuando la enfermedad diseminada se produce
en pacientes inmunocomprometidos. Una seroconversión retardada y unas
reacciones cruzadas numerosas además comprometen este acercamiento
diagnóstico (Terry. 1978). Cuando se trabaja en un área endémica, la obser-
vación de uno de nosotros (WW) de que aumentaba la fijación del comple-
mento al B. dermatltidis era indicación de que el paciente probablemente
tuviera toxoplasmosis.
El test cutáneo de histoplasmina ha sido muy úlil para estudios epidemio-
lógicos, pero no debería usarse nunca para diagnóstico. La alta frecuencia de
test positivos en zonas endémicas no sólo entorpece la interpretación, sino
que el test cutáneo puede producir seroconversión, confundiendo además el
tema (Campbell. 1964).
Se ha desarrollado un radiommunoensayo urinario para el anligeno del His-
toplasma y está disponible desde un laboratorio de referencia sencillo (Labo-
ratorio de Referencia del Histoplasma. Indianápolis. IN). Como ya se comen-
tó anteriormente, este test parece ser de gran uso en el diagnóstico en
pacientes con enfermedad diseminada (Williams. 1994).
Blastomyces dermatltidis
Factores de riesgo

Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones La mayoría de los casos de blastomicosis son esporádicos, y no suele
encontrarse una fuente ambiental Se producen pequeñas epidemias y se ha
Cualquier consideración de este patógeno fúngico principal debe llevarse llevado a cabo el aislamiento de hongos del suelo en las zonas de brote
hasta el final. La forma de levadura en el tejido puede demostrarse histológi- (Klein. 1986). No hay factores de riesgo específicos reconocidos para la blas-
camente o en preparaciones de secreciones respiratorias, fluidos, sangre tomicosis. aunque se ha descrito una infección grave y diseminada en pacien-
periférica, médula ósea o tejidos impresos. Tienen que usarse preparaciones tes infectados por VIH (Harding, 1991). La blastomicosis pulmonar primaria se
frescas y calcoflúor blanco, pero la morfología del tejido y las células levadu- ha descrito en un trabajador de laboratorio que ha estado expuesto en la fase
riformes se ven mejor con la tinción de Giemsa, porque se pueden valorar los moho (Baum, 1970).
detalles de la morfología nuclear.
La medida de las células es de 3 pm a 5 pm. tienen un núcleo sencillo y un
Enfermedad clínica
brote con un cuello estrecho.
Si se sospecha una infección diseminada, en particular en pacientes infec- La puerta de entrada es a través del tracto respiratorio, donde la infección
tados VIH, deben realizarse hemocullivos para Histoplasma. La técnica Isola- puede ser asintomática. transitoria (Sarosi. 1974; Witorsch, 1968) o avanzar
tor parece ser la más sensible para recuperar la fase levadura de la sangre
(Paya, 1987).
Si se sospecha H. capsulatum, debería inyectarse un agar enriquecido tal
como un agar de infusión cerebro-corazón con suplemento de sangre de ove-
ja. Las placas tienen que incubarse a 30"C; la incubación del primer aisla-
miento en placas a 37'C no es necesaria.
Las colonias de H. capsulatum que se aislan a 25°C-30°C son vellosas y
varían de color blanco a marrón (Lámina 54-7). Algunas cadenas crecen
más despacio y necesitan varias semanas para desarrollar las colonias. Las
formas de diagnóstico asexual incluyen microconidias y macroconidias. Las
microconidias. que se producen primero, son muy parecidas a las estructu-
ras producidas por B. dermatltidis. Las macroconidias más características
han incrementado la aspereza de los salientes de la periferia de la conidia,
una configuración parecida a un tubérculo (Fig. 54-22). Las macroconidias
de una saprofita. Sepedonium. deben diferenciarse del Histoplasma. La
apariencia macroscópica de las colonias, el porcentaje de crecimiento, el
crecimiento del H. capsulatum en un medio que contenga cicloheximida, la
presencia de formas de levadura en los tejidos y la historia clínica general-
mente son suficientes para diferenciar hongos. La configuración final de la
identificación se realiza cuando se produce la conversión de la fase moho a
la fase levadura a 37 C. para el test del exoantigeno. o por la hibridación de
Figura 54-22. Las macroconidias luberculadas de Histoplasma capsulatum son
ácidos nucleicos La conversión a fase levadura algunas veces es excesi-
características. También suelen estar presentes las microconidias en las comdiolo-
vamente difícil y se ha cambiado en muchos laboratorios per técnicas inmu- ras cortas (lactofenol algodón azul).
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÒTICAS 1179
insidiosamente. La blastomicosis pulmonar crónica con febrícula, pérdida
de peso infiltrados pulmonares localizados puede sugerir enfermedad neo-
plasia, para la que tienen que llevarse a cabo estudios diagnósticos, inclui-
do lavado alveolar. PAAF del pulmón o una biopsia pulmonar. La disemina-
ción de las levaduras desde el pulmón casi siempre termina en una
infección cutánea u ósea El SNC y el sistema genitourinario es menos fre-
cuente que se incluyan. Las lesiones cutáneas son con frecuencia hipertró-
ficas, fúngicas o ulcerativas, y pueden ser localmente destructivas. Las
lesiones pueden confundirse con células escamosas del carcinoma de piel.
También hay un compromiso secundario de la piel por encima de las lesio-
nes óseas.

Patología de la blastomicosis

La respuesta histológica característica de B. úermatittdis es una mezcla

de inflamación aguda, incluidos microabscesos. inflamación granulomatosa.
En lesiones cutáneas, es característico una hiperplasia seudoepitehomato- Figura 54-23. Las células levadurilormes en gemación de Blastomyces dermatiti-
sa de la epidermis por encima de la inflamación. Las células de las levadu- dis tienen una pared gruesa y una base ancha entre las células madre y la hija.
ras las encontramos más frecuentemente en los microabcesos o dentro de Cuando se utilizan tinciones nucleares como la hematoxilina-eosma. se pueden
las células gigantes mullinucleadas. Podemos encontrarlas frecuentemente demostrar múltiples núcleos en los células levadurilormes (lactofenol algodón
con el tinte hematoxilina-eosina, pero el ácido periódico de Schiff o la mete- azul).
namina plata deben emplearse si no encontramos los hongos en las seccio-
nes realizadas. Las células levaduriformes de pared gruesa miden de 8 pm a
15 pm y mantienen la base ancha durante el proceso de gemación. Una
separación, debida a un artefacto, del citoplasma de la pared celular en pre- ejemplo clásico de coccidioidomicosis epidémica se produjo en un grupo de
paraciones fijadas con lormalma puede dar la apariencia errónea de una estudiantes de arqueología en una cueva en el norte de California. Al menos
pared doble. 61 estudiantes lueron infectados por artroconidias en el suelo de la zona de
Pueden verse núcleos múltiples en algunas células de levaduras con la la excavación, y el 77% de los individuos estaban sintomáticos (Werner,
tinción hematoxilina-eosina. Se deben distinguir las células de levaduras 1972). En EE.UU., los hongos se concentran en el suroeste. Se ha llamado
no geminadas de las de C. neolormans y de las esférulas en desarrollo de fiebre del valle o liebre del valle de San Joaquín. La incidencia de la cocci-
C. immitis. Las tinciones de mucina pueden teñir la pared celular de Blas- dioidomicosis ha aumentado considerablemente en California durante el
tomyces ligeramente de manera ocasional, pero la diferenciación con respec- comienzo de los 90 (Pappagianís. 1994). Una de las posibles explicaciones
to a C. neoformans debería ser posible empleando criterios morfológicos. de este aumento es la sequía prolongada seguida de periodos de lluvia, la
construcción de nuevos edificios y el aumento del número de individuos
susceptibles a esta infección (Pappagianís. 1994)
Identificación de laboratorio y otras investigaciones Sin embargo, los pacientes con coccidioidomicosis pueden encontrase
por todo el país, por la frecuencia de viaje y la alta mfectividad de la artro-
La demostración directa de las células de levadura puede llevarse a comdia para los individuos que entran en áreas endémicas (Pappagianís,
cabo en secciones de tejido o preparaciones en fresco o fluidos aspirados 1993). Se han descrito casos en los que la infección se ha originado por
y muestras de tejidos (Fig. 54-23). La tinción con calcoflúor blanco aumen- material importado del suroeste de EE.UU. En una ocasión recuperamos el
ta la detección de levaduras. El crecimiento es algo más rápido que el del C. immitis de un perro que había nacido en Arizona y después se había lle-
Hlstoptasma, de aspecto desde blanco velloso a colonias de color que con vado a Vermont La inlección de laboratorio es un riesgo serio, y este pató-
frecuencia no pueden distinguirse de H. capsulatum. y por lo general apa- geno debería tratarse con gran respeto. Se han descrito ejemplos ocasio-
recen dentro de la primera o segunda semana. Las microconidias se pare- nales en los que el desarrollo de la lase moho in vitro ha producido después
cen a las del H. capsulatum (Fig. 54-24), pero no se forman macroconidias. infección.
Un hongo saprofítico, Chrysosporium, se parece al Blastomyces, pero no
desarrolla una fase levadura y no crece en un medio que contenga ciclo-
heximida. La conversión a la fase de levadura puede producirse en un
n
medio ordinario incubado a 37 C, pero para este propósito se han utiliza-
do específicamente agar de sangre glucosa cisleina o agar de semilla de
algodón. Una vez más. demostrar la forma levadura en los tejidos sirve
como un sustituto razonable para la demostración del dimorfismo en el
laboratorio. El test del exoantígeno y la hibridación de ácidos nucleicos,
son los métodos preferidos para confirmar los aislamientos en muchos
laboratorios.
El test de fijación del complemento es el test serológico más comúnmente
utilizado para el diagnóstico de blastomicosis. Como se ha mencionado con
la histoplasmosis, este test tiene limitaciones considerables y sólo debería
usarse adjunto al cultivo de hongos.

Coccidioides immitis

Factores de riesgo

Residir en una zona endémica es el principal factor de riesgo para des-

arrollar la infección, porque la artroconidia de la fase moho se disemina Figura 54-24. Conidias características en una conidiofora de Blastomyces derma-
fácilmente por el aire (Ampel. 1989: Pappagianis. 1993: Stevens. 1995). Un titidis (lactofenol algodón azul).
 1180 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Hay sugerencias de que los factores genéticos influyen en la frecuencia
de la diseminación y de la gravedad de la infección, pero la naturaleza de la
asociación no se conoce completamente. La infección diseminada es más
común en individuos filipinos y de raza negra que en los de raza blanca. Los
asiáticos, americanos nativos y mexicanos pueden tener también mayor
riesgo. Las mujeres adultas desarrollan un eritema nodoso más común-
mente que los hombres, en respuesta a una infección primaria de Coca-
dioides, pero la infección diseminada se produce con más frecuencia en
hombres adultos que en mujeres. La infección inmunosupresiva o la enfer-
medad es un factor de riesgo importante para la infección diseminada. Los
pacientes infectados con VIH tienen un riesgo particular para infección
diseminada (Bronnimann, 1987: Fish, 1990; Galgani, 1990).
Enfermedad clínica
La coccidioidomicosis primaria es con frecuencia asintomálica, como se
indica por la alta prevalencia de resultados positivos de los test cutáneos para
los antígenos fúngicos en zonas endémicas. La enfermedad sintomática, por
lo general, se manifiesta como fiebre con tos o dolor torácico, o ambos, y
podría imitar clínicamente a una neumonía bacteriana (López, 1993). El erite-
ma nodoso y el eritema multiforme, que pueden acompañar a la infección pri-
maria, son signos de buen pronóstico. Los nodulos pulmonares solitarios pue-
den persistir como consecuencia de la infección pulmonar primaria.
La infección diseminada afecta más frecuentemente a la piel, al sistema
esquelético y a las meninges. Las lesiones cutáneas incluyen pápulas, úlce-
ras, senos drenantes y abscesos subcutáneos. La artritis, por lo general,
resulta del compromiso de huesos adyacentes. La meningitis puede ser agu-
da, pera es más común que sea lenta y crónica.
Patología de la coccidioidomicosis
La respuesta del tejido a C. ¡mmitis es granulomatosa, con o sin caseifica-
ción. Las esférulas desarrolladas es típico encontrarlas en macrófagos y célu-
las gigantes multinucleadas. Las endoesporas dentro de las esférulas miden
de 2 pm a 5 um. Las esférulas miden de 10 pm a 80 um, y las esférulas des-
arrolladas tienen un gran rango de tallas. El diagnóstico diferencial de las
esférulas desarrolladas primariamente incluye formas no gemadas de B. der-
matitidis o C. neolormans. Las esférulas deben diferenciarse de las formas
fúngícas en adiaspíromicosis y rinosporidiosis; ambas son infecciones muy
poco comunes en EE.UU.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Como con otros hongos dimórficos, la posibilidad de esta infección debe
seguirse hasta el final. Las esférulas pueden demostrarse en los esputos
Figura 54-25. Dos esférulas de Coccidioides immilis en la muestra de esputo Prepa-
ración sin teñir (fotografía cortesía de Centers for Disease Control and Prevention)
Figura 54-26. Las colonias blancas y vellosas lijadas con tormalina del Coccidioi-
des immitis pueden tener áreas de coloración gris (agar Sabouraud con ciclohexi-
mida incubada a 30°C).
o. más comúnmente, en lavados broncoalveolares (Fig. 54-25), pero la
sensibilidad de los métodos citológicos es sólo aproximadamente del 50%
(DiTomasso, 1994). Se utilizan las preparaciones frescas y el tinte calco-
flúor blanco. La digestión con 10%-30% de KOH puede ser necesaria para
eliminar elementos que sobran de tejido. Si está presente la enfermedad
cavitaria, las hifas pueden estar presentes en las muestras clínicas. Al con-
trario que otros patógenos dimórficos, existe la posibilidad de comunica-
ción de la artroconidia directamente de la muestra.
C. immitis crece relativamente rápido (en menos de una semana) y pue-
de incluso aparecer en las placas agar sangre en el laboratorio bacterioló-
gico. La infección de los trabajadores del laboratorio es la preocupación
principal, por eso los cultivos inoculados deben manejarse con gran cuida-
do en una cabina de seguridad de flujo laminar. Las sugerencias del mane-
jo de estas muestras se explicó antes. Todo el trabajo debe llevarse a cabo
en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar. Si se han inoculado
placas de Petri, deben taparse con cuidado para evitar que la tapadera se
salga accidentalmente. Las colonias de C. immitis son extremadamente
variables en la apariencia, variando desde aterciopeladas o algodonosas a
granulosas o polvo (Fig. 54-26). La morfología de la colonia puede cambiar
según la colonia y el desarrollo de la artroconidia. La mayoría de los aisla-
mientos son blancos, pero puede observarse una gran variedad de colores,
y puede producirse un pigmento difuso por algunas cadenas. Los cultivos
con frecuencia se convierten en más grises con el tiempo. En particular,
debe considerarse la posibilidad de que este riesgo biológico pudiera haber
sido aislado, cuando en un medio que contenga clicloheximida encontre-
mos un hongo de rápido crecimiento. Si se sospecha C. immitis, algunos
micólogos prefieren esterilizar el cultivo antes de examinar las colonias, lle-
vando el contenedor con formalina al 10%, seguido por una incubación
durante toda la noche.
Las artroconidias en forma de barril con células de unión vacías son distin-
tivas (Fig. 54-8). pero deben diferenciarse de otros organismos que producen
artroconidias, como Trichosporon (véase Fig. 54-19), Geotrichum y algunos
miembros de la familia Gymnoascaceae, por el test del exoanlígeno o por la
hibridación de ácidos nucleicos,
Al contrario que la histoplasmosis y la blastomicosis. el análisis serológico
con el test de fijación del complemento es útil para valorar la extensión y el
pronóstico de la coccidioidomicosis (Pappagianis, 1990). Se han utilizado
varias técnicas serológicas, de las cuales se ha estudiado de un modo más
extenso la lijación del complemento. Los anticuerpos se detectan aproxima-
damente en 2 a 6 semanas después de la infección. La cuantificación de títu-
lo es indicador de la enfermedad diseminada y un título creciente es poco
esperanzados al contrario que la situación normal, en la que la aparición de
anticuerpos refleja el control de la infección. El test de piel no confunde el
diagnóstico por producir una seroconversión, como en la histoplasmosis, pero
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
la alta prevalencia de una positividad del test cutáneo disminuye la utilidad del
test. Los pacientes con enfermedad diseminada pueden mostrar anergia al
antigeno del test cutáneo.
Sporothrix schenckii
Factores de riesgo
S. schenckii se encuentra normalmente en la vegetación alrededor de
todo el mundo, aunque no parece que sea un patógeno de plantas. Las
epidemias se han causado por una exposición a productos de plantas,
como el musgo sphagnum utilizado en jardinería (D'Alessio, 1965; Grotte,
1981). Los patógenos lúngicos de plantas y ambientales en ocasiones cru-
zan los caminos. Asi como H. capsulatum estuvo implicado en el día de la
limpieza de tierra, el S. schenckii causó infecciones en el día de la cele-
bración de Arbor (Cote. 1988). Hubo una epidemia inusual entre miembros
de un colegio de fraternidad en Florida, que estaban haciendo un muro con
ladrillos empaquetados en paja contaminada mientras bebían gran canti-
dad de cerveza (Sanders, 1971). El único factor predisponente que se ha
identificado con frecuencia es el consumo de alcohol. También se ha infor-
mado de la transmisión del S. schenckii de gatos infectados a humanos
(Reed, 1993).
Se ha observado infección diseminada en pacientes inmunodeprimidos
(Lynch. 1970). La puerta de entrada por lo general es una entrada traumática
por la que los hongos pasan a través de la piel, como ocurrió con los estu-
diantes, que tenian las manos dañadas por coger ladrillos contaminados. El
estereotipo de paciente con riesgo de esporotncosis es un jardinero de rosas
alcohólico.
Enfermedad clínica
La lorma clínica que sin duda predomina de esporotricosis es la cutánea
o linfocutánea. Una pápula en la puerta de entrada puede ulcerarse. La
rapidez del patógeno a través de los linfáticos regionales puede terminar
en una serie de lesiones que avanzan en el miembro afectado. La esporo-
tricosis sistémica. que no es común, podría ser por la inhalación de espo-
ras en el tracto respiratorio bajo (Pluss, 1986). El sistema esquelético, que
incluye huesos (Lynch. 1970) y articulaciones (Crout. 1977), es el más
afectado.
Patogenia de la esporotricosis
Las respuestas histológicas al Sporothrix y Blastomyces son similares
(Lurie. 1963). La inflamación granulomatosa puede acompañarse de peque-
ñas colecciones de neutrófilos polimorfonucleares. En la piel, es común la
hiperplasia seudoepiteliomatosa. Las células levaduras del S. schenckii son
pleomórficas. redondas o alargadas, y se han comparado con cigarros, pero
rara vez se ven en el tejido. Una reacción del tejido al hongo puede termi-
nar en radiar material eosinófilo de un grosor mayor de 10 pm alrededor de
la célula levadura; este fenómeno se conoce como Esplendor Hoepph. Des-
afortunadamente, esta reacción tan distintiva del tejido no puede verse y no
es específica para la esporotricosis. El diagnóstico diferencial de las lesio-
nes culáneas es, en primer lugar, una infección micobacteriana, especial-
mente Mycobacterium marinum (granuloma de las piscinas), en EE.UU., y
una leishmaniosis cutánea en los trópicos.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
La muestra preferida es una aspiración, un curetaje o una biopsia de la
lesión cutánea. S. schenckii crece bien en un medio de aislamiento primario
incubado a 25C-30 C. Es resistente a la cicloheximida. Las colonias, que
pueden ser lisas o húmedas (glabrosas), al principio son por lo general de
color banco (Lámina 54-8), y pueden volverse más oscuras con el tiempo. El
S. schenckii. produce dos tipos de conidias: conidias hialinas de pared lina,
que se organizan como una roseta alrededor del ápex de la conidiofora. y las
П81
conidias de pared ancha, oscuras, que son las responsables del color oscu-
ro que vemos macroscópicamente, que están sujetas directamente a las
hifas (Sutton, 1998). Las microconidias de pared fina nacen de las conidio-
foras que crecen de los ángulos rectos de las hifas; pueden organizarse alre-
dedor de una vesícula expandida en la punta de la conidiofora formando una
estructura que ha sido denominada racimo (Fig. 54-27). Las especies de
Acremonium producen estructuras similares, que raramente se han descrito
como una causa de enfermedad humana, y también son producidas por un
saprofito que rara vez es aislado. Ophiosloma stenoceras. Estos mohos se
diferencian del Sporothrix por la ausencia de crecimiento en un medio agar
con cicloheximida y por la ausencia de fase levadura. La conversion de la
fase moho a levadura se finaliza por la incubación del aislamiento a 37 С en
un medio rico, como el agar de infusión cerebro-corazón o el agar sangre
glucosa cisteína.
Los test cutáneos y ensayos serológicos para el diagnóstico de la esporo-
tricosis han sido descritos pero aún no están disponibles.
Otros hongos dimórficos
El H. capsulatum variante duboissi causa enfermedades cutáneas y sis-
témicas en África. Las levaduras son más grandes que las del H. capsula-
tum variante capsulatum. y las paredes son más gruesas, recordando a las
células del B. dermatitidis. pero sin los bordes de base ancha. El Paracoc-
cidioide brasiliensis produce infecciones cutáneas, diseminadas y pulmo-
nares en América Central y del Sur (Londero. 1972: Restrepo, 1970). Hay
pocos casos importados de paracoccídioidomicosis, que se producen oca-
sionalmente en EE.UU. (Murray, 1974). Las células levaduriformes carac-
terísticas del Paracoccidioides tienen múltiples brotes periféricos, dando
una apariencia que se ha comparado con una rueda marina. La infección
por P. mametlei se caracteriza por células intracelulares parecidas a las
levaduras que recuerdan al H capsulatum en macrófagos. Esta infección
es endémica en el sureste asiático, pero se han descrito casos importados
en pacientes inmunocomprometidos que regresaron a EE.UU.
DERMATOFITOS
Los hongos dermatofitos son causas comunes e importantes de morbilidad
humana, pero no producen infecciones que pongan en peligro la vida (Hay.
1992; Midgley, 1994; Odom. 1994: Weitzman, 1995). Se reconocen tres géne-
ros: Microsporum. Trichophyton y Epidermophyton. Las especies de Acremo-
nium, especies de Fusarium. Scytalidium spp. y las especies de Scopulanop-
sis en ocasiones han estado implicadas en enfermedades de las uñas
(onicomicosis). Los hechos ocasionales de un papel etiológico para otros hon-
Figura 54-27. Las conidias de Sporothnx schenckii nacen en grupos en los extre-
mos de las conidioforas laterales (lactofenol anilina azul).
 1182 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

gos saprofíticos son difíciles de evaluar por la existencia común de estos
mohos como colonizantes o contaminantes de la flora. Como un grupo, los
hongos dermatofitos se distribuyen alrededor del mundo, pero las especies
individuales pueden tener una distribución geográfica más restringida (Aly,
1994). Los dermatofitos pueden encontrarse asociados con humanos (antro-
pofílicos), con animales (zoofílicos) o con tierra (geofilicos). Los factores de
riesgo incluyen el contacto con la fuente de infección, que nos puede dar una
pista para el diagnóstico. Por ejemplo, la infección de la cara en granjeros que
se apoyan en las vacas mientras las ordeñan es característicamente causa-
da por el T. verrucosum. un dermatofito zoofílico que se encuentra en el gana-
do. La importancia de la variación geográfica en los patógenos dermatofíticos
se ilustra en un estudio de una epidemia de infección cutáneo fúngica entre
tropas americanas durante la guerra de Vietnam (Alien. 1973). La mayoría de
las infecciones fueron causadas por una variante con gran esporulación del T.
mentagrophytes, que no se había reconocido en EE.UU. Las tropas america-
nas tuvieron mucho mayor nesgo de infección que los vietnamitas. Epidemio-
lógicamente, las foliculitis y lesiones anulares se asociaban con el tiempo de
servicio en Vietnam y el tiempo pasado en una patrulla. La infección se pro-
ducía de modo predominante en la estación de lluvias, y la única fuente que
no fuera humana de los hongos eran las ratas. Las asociaciones medioam-
bientales de los hongos dermatofíticos aislados con mayor frecuencia se re-
sumen en la Tabla 54-12.
las lesiones. La terminología clínica utiliza el nombre latino linea seguido de
la parte del cuerpo afectada, como linea capitis (cabello), linea barbae (bar-
ba), linea corporis (tronco y miembros), linea pedis (pie de atleta) o linea cru-
ris (Inguinal). En ocasiones excepcionales, el Epidermophyton floccosum
infecta sólo la piel. Microsporum spp. y Trichophyton spp. afectan al cabello,
así como a la piel fina. El Trichophyton spp. produce infección de las uñas
(onicomicosis), así como del cabello y la piel. I tonsurans es la causa más
común de infección del pelo en EE. UU. M. canis es una causa común de
infección del cuero cabelludo, sobre todo en niños. Cuando hay una infección
profunda del folículo del pelo, se produce un proceso inflamatorio llamado
querión. El T. mentagrophytes y el T. verrucosum se asocian particular-
mente con querión. T. mentagrophytes, T. rubrum y M. canis se encuentran
normalmente en la linea corporis y linea pedis. Las lesiones producidas por
T. rubrum por lo general son crónicas e intratables. El E. floccosum es una
causa común de linea cruns y tinea pedís.
Las enfermedades dermatofiticas se limitan a la epidermis. Sólo raras
veces hay una invasión más profunda por los mohos. La diseminación de la
infección es poco corriente y, por lo general, se produce cuando la inmuno-
supresión es grave (Porro, 1997).
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones

El tratamiento de las infecciones dermatofiticas no se dirige por la identifi-

Enfermedad clínica
Los dermatofitos producen infección de la epidermis, del pelo y de las
uñas (Hay. 1992). La infección de la dermis y tejido subcutáneo se produ-
ce rara vez. La infección del pelo y la piel por lo general se refieren como
una imagen en lombriz anular, un nombre derivado del avance serpíginoso de
cación específica del aislamiento, por eso la demostración de hífas en los ras-
pados de piel es importante para el inicio del tratamiento (Fig. 54-28), La talla
y morfología de las hitas sugiere la inclusión de los dermatofitos en la infec-
ción. La confirmación de la identificación específica generalmente no es
necesaria, pero es útil para confirmar que las hitas, en realidad, pertenecen
a los hongos dermatofíticos, para valorar la fuente probable de infección y

Tabla 54-12 Características de los m o h o s dermatofíticos

Dermatofito Ecología Tasa de crecimiento Estructuras d i a g n ó s t i c a s Test auxiliares Z o n a s más frecuentes

Microsporum Antropolílico Lento Raramente observadas Lámpara de Wood Cuero cabelludo

audouinii del pelo
Microsporum canis Zoofílico Moderado Rugosa o espinosa, de pared Lámpara de Wood Cuero cabelludo,
(6-10 días) gruesa, macroconidias del pelo: pigmento piel
de contorno espinoso: brillante amarillo limón
2-14 septos; microconidias
con forma de porra
Microsporum Geofilico Moderado Suave o finamente rugosa, Colonia en estallido de Cuero cabelludo,
gypseum macroconidias de pared estrella; color desde piel
gruesa. 4-6 septos, marrón a canela
microconidias con forma
de porra
Trichophyton Zoofílico, Moderado Microconidias típicamente Penetración del pelo Piel, cuero
mentagrophytes antropofilico redondas y agrupadas positivo; ureasa positiva; cabelludo, barba
en ramas de conidioforas a veces puede producir
(racimos de uvas): puede pigmento rojo
tener forma de lágrima:
macroconidias de pared fina
y lorma de cigarrillo
Trichophyton rubrum Antropofilico Lento Microconidias con lorma Pigmento rojo intenso Piel, uñas
de lágrima ("pájaros en que puede ser
(hasta 14 días) una verja"). Puede formarse incrementado en medios
en macroconidias; especiales, como el agar
macroconidias más largas y patata; ureasa negativa;
estrechas que las del penetración del pelo
Trichophyton mentagrophytes negativa
Trichophyton Zoofílico Lento Microconidias pequeñas Cadenas de conidias Barba, cuero
verrucosum y delicadas; ocasionales a 37°C; mejor cabelludo,
macroconidias finas crecimiento en agar piel
(en cola de rata) T3 o en agar T3
yT4
Trichophyton Antropofilico Lento Microconidias con forma de Mejor crecimiento Cuero cabelludo,
tonsurans lágrima o de porra con un en agar T3 y T4 piel
tamaño muy variable, raras
macroconidias
Epidermophyton Antropofilico Moderado Macroconidias caracteristicas. Ninguno Pie
floccosum no microconidias
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Figura 54-28. Las hifas de un dermatolilo se demuestran en un raspado de una
lesión de liña. La presencia de estas hifas finamente segmentadas establece el
diagnostico de dermatomicosis. aunque no define la especie etiológica (preparación
con KOH). (Fotografía cortesía de Centers for Disease Control and Prevention.)
para valorar el incremento de parecido para infecciones crónicas y recaídas
cuando aislamos T. rubrum. Los raspados de piel, uñas y pelos pueden exa-
minarse en preparaciones de KOH, que puede incorporar calcoflúor blanco
para facilitar la detección de hifas. Los fragmentos de tejidos, fibras y los
cristales de colesterol pueden ser confundidos con hifas por un observador
inexperto.
Los pelos infectados deben seleccionarse para analizarlos. Cuando el hon-
go que infecta es H. audouinii. M. canls o M. ferrugineum. el pelo flúoresce
con una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lámpara de Wood). M.
canis es el único miembro de este trio de patógenos que se aisla normal-
mente en EE.UU. El examen microscópico de la relación de los hongos con
el pelo infectado puede usarse para estrechar el diagnóstico diferencial del
agente etiológico: esporas en el exterior del pelo (entothrix), esporas dentro
del pelo (ecdolhrix), hifas sin esporas dentro del pelo, o que no haya invasión
del pelo. El análisis de los pelos infectados requiere una experiencia consi-
derable y una práctica regular.
Los pelos infectados, raspados de uñas o raspados de los bordes de las
lesiones cutáneas deben llevarse al laboratorio en un recipiente limpio y
seco o ser colocados en la superficie de un medio de aislamiento primario
suministrado por el laboratorio. Se ha sugerido picar los recortes de uñas en
un homogeneizador como un aumento de las levaduras de los dermatolilos.
El agar de dexlrosa Sabouraud (ue elegido para recuperar los hongos der-
matofíticos, y también es efectivo para aislar Candida spp., especialmente
C. albicans, la cual puede producir infecciones similares de la piel y uñas.
La cicloheximida no inhibe los dermatofitos, pero si inhibe muchos hongos
saprofíticos. El medio del test dermatofito, que produce un pigmento rojo en
la alcalinización, es utilizado normalmente por los dermatólogos para de-
mostrar la presencia de un dermatofito, que por lo general no se estudia
más. Desafortunadamente, el medio del test de dermatofitos no es especí-
fico para dermatofitos. Otros organismos, incluido H. capsulatum, pueden
alcalinizar este medio, y no es el medio de aislamiento preferido por los
laboratorios clínicos.
Todos los hongos dermatofíticos tienen septos, hifas hialinas. Producen
macro y microconidías de vanas combinaciones. También pueden producir-
se artroconidias y clamidiosporas. pero la morfología de las macroconidias
y especialmente, la de las microconidias es más importante para la identifi-
cación. Se ha identificado el estado sexual de muchos dermatofitos, pero no
se han encontrado en el laboratorio clínico.
Especies de Microsporum
Las especies de Microsporum producen macroconidias características. Figura 54-29. Macroconidias de pared gruesa, rugosas y afiladas de Microsporum
que son las estructuras diagnósticas clave. En algunos casos se producen canis e hifas finas segmentadas (lactofenol anilina azul).
1183
macroconidias, que diagnósticamente no son útiles. M. audouinii, un agen-
te antropolilico clásico de forma anular, produce pocas, o ninguna, estruc-
turas diagnósticas. Afortunadamente, en la actualidad no se aisla con fre-
cuencia, quizá porque hay mayor higiene. Las características de las
estructuras diagnósticas producidas por los patógenos más comunes se
resumen en la Tabla 54-12. M. canis. las especies que con mas frecuencia
se aislan, produce un pigmento amarillo limón característico (Lamina 54-9)
que se intensifica por el crecimiento en agar copos de patata. Las macro-
conidias de estas especies se muestran en la Figura 54-29. Las macroconi-
dias del M. gypseum. las especies geofílicas mas comúnmente aisladas, se
muestran en la Figura 54-30.
Especies de Trichophyton
El género Trichophyton incluye los hongos dermatofíticos importantes: 7!
tonsurans (Fig. 54-10 y Lámina 54-10). T. rubrum (Lámina 54-11), T. verru-
cosum y I mentagrophytes (Lámina 54-12 y Fig. 54-31). Las colonias pue-
den tener apariencia de pelusa, granular o, menos comúnmente glabrosa.
Las macroconidias, que son extremadamente útiles para la identificación,
pueden ser producidas por este género, en especial en cadenas que pro-
ducen colonias en polvo, pero desafortunadamente suelen estar ausentes.
Las microconidias se forman con más frecuencia. Las microconidias tiene
pared fina, lisa, y tienen un número variable de septos. La apariencia clá-
sica de las estructuras diagnósticas en las especies que se aislan más
comúnmente se resumen en la Tabla 54-12. En el mundo real, la interpre-
tación de la morfología microscópica en algunos aislamientos puede ser
muy difícil, porque con frecuencia se forma un solapamiento. Afortunada-
mente, los test adicionales son útiles para hacer diferenciaciones especifi-
cas dentro del género (Tabla 54-12). En particular, los agares Trichophyton
son útiles para la caracterización de los requerimientos nutricionales entre
los miembros del género (Fig. 54-32). Se han descrito siete medios, de los
cuales hemos encontrado los cuatro primeros medios a base de ácido
casamino como los más útiles. En combinación, estos medios permiten la
valoración de la dependencia en inositol, liamina o ambos componentes
juntos.
La diferenciación de T. mentagrophytes y 7! rubrum se facilita por varios
test no morfológicos (Tabla 54-12). Un pigmento difusible puede ser produ-
cido por ambas especies, pero el pigmento rojo intenso del T. rubrum se
fomenta por el cultivo en agar copos de patata o agar córnea con dextrosa
al 1%. La producción de ureasa dentro de los tres o cinco días por T. men-
tagrophytes. pero no por T. rubrum, ayuda a diterenciar estas dos especies.
Por ultimo el test de penetración del pelo puede utilizarse como un test dife-
rencial. T. mentagrophytes produce defectos en forma de cuña en los pelos
in vitro (Fig. 54-33), mientras tanto T. rubrum crece fuera del pelo sin pene-
 1184 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Figura 54-30. Macroconidias lisas de pared gruesa del Microsporum gypseum (lac-
Figura 54-32. Agares de Trichophyton. El crecimiento del Trichophyton verrucosum
lolenol algodón azul).
se aumentaba en agar T (contiene tiamma e inositol) en comparación con los aga-
s

resT. yT,

trar en él. El uso de ambos acercamientos, morfológico y no morfológico,
proporciona la identificación más exacta de los aislamientos suficientes
para proporcionar experiencia continua con las características diagnósticas
de estos mohos.
Epidermophyton floccosum
colonias, que en principio son marrones amarillentas, grises o marrón caqui,
a medida que maduran se vuelven aterciopeladas y se pliegan. E. llocco-
sum no produce microconidias. pero unas macroconidias distintivas pro-
porcionan las pistas para la identificación (Fig. 54-11). Estas estructuras
tienen paredes externas lisas, más de cuatro paredes cruzadas y forma de
palo.

El único patógeno dentro del género Epidermophyton es un hongo antro-

pofilico. que es una causa importante de Tinea cruris y linea pedis. Las
MOHOS DEMATIACENOS

Los mohos dematiacenos son un grupo fascinante y complejo de hongos

Interpretación del
Medio Constituyentes que producen enfermedad debilitante de la piel y del tejido subcutáneo y
Crecimiento estimulado
pueden invadir profundamente. Las infecciones se encuentran más común-
T1 Medio basal Agar con el que se comparan mente en los trópicos y subtrópicos, aunque la infección diseminada puede
otras formulaciones raramente encontrarse en EE.UU.. especialmente entre pacientes grave-
T2 Inositol Estimulado con mositol solo mente inmunocomprometidos. La clasificación de estos mohos ha registra-
T3 Inositol + liamina Estimulado solo cuando están do cambios según se ha ido refinando el entendimiento de la conidiogéne-
presentes los dos sis (Larone, 1989). Se muestra un resumen breve de las formas clínicas de
compuestos enfermedad producidas por especies patogénicas, pero la descripción deta-
T4 Tiamina llada de la micología está más allá del propósito de este capítulo. La mor-
Estimulado con tiamina sola

Figura 54-31. Gaipos de microconidias y macroconidias de pared fina de 7ri- Figura 54-33. Penetraciön del pelo por Trichophyton mentagrophytes El pelo es
chophyton mentagrophytes (laclofenol algodón azul) (Fotografías cortesía de Cen- penetrado por las hilas por los lados (Fotografia cortesia de Centers for Disease
ters lor Disease Control and Prevention.) Control and Prevention)
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
Figura 54-34. Cadenas de conidias producidas por especies de Cladosporium, un
germen aislado en el medio ambiente de los laboratorios clínicos. Las hilas son
septadas Tanlo las hitas como las conidias están pigmentadas de color oscuro
(lactolenol anilina azul).
fologia de las especies de Cladosporium. mohos saprofíticos comunes que
frecuentemente encontramos en laboratorios clínicos, se muestra en la
Lámina 54-2 y en la Figura 54-34. El crecimiento lento y el crecimiento en
presencia de cicloheximida. el aislamiento del tejido y los hallazgos histoló-
gicos compatibles y/o historias clínicas son pistas que pueden encontrarse
en las especies patógenas. Es importante comentar con los médicos las
características clínicas del caso antes de catalogar estos mohos como
insignificantes.
Enfermedad clínica
El Micetoma es una infección crónica indolente de la piel y del tejido blan-
do que se desarrolla en el lugar de la inoculación de una variedad de hon-
gos o bacterias. La infección puede extenderse profundamente, incluso lle-
gar al hueso, y por lo general se desarrollan senos drenantes. La infección
la encontramos más frecuentemente en los trópicos y subtrópicos, pero
pueden encontrarse en el sur de EE.UU. Madurella mycetomatis es el pató-
geno dematíaceno más común. Hay lesiones parecidas que pueden produ-
cirse por otros hongos (p. ej., Acremonium. Pseudallescheria boydti. Fusa-
num). por actinomicetos aeróbicos (Nocardia. Slreptomyces. Actinomadura)
y ocasionalmente por bacterias (botriomicosis).
La cromoblastomicosis es una infección crónica, de avance lento, de la
piel y del tejido subcutáneo que se produce principalmente en pacientes
que viven en los trópicos. Se producen algunos casos aislados ocasional-
mente en el sur de EE. UU. Las lesiones pueden ser únicas o múltiples, y
pueden parecerse a las lesiones cutáneas de blaslomicosís. La caracterís-
tica que la distingue es la presencia de células redondas, no hítales y
marrones (cuerpos muriformes) en los tejidos (Fig. 54-35). Estas estructu-
ras, que se dividen por seplación, son diagnósticas, aunque no proporcio-
nan una pista para identificar el moho. Los agentes etiológicos de la cromo-
blastomicosis son Phialophora verrucosa. Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea
compacta. Rhinocladiella aquaspersa. Cladosporium carnonii. E. jeansel-
mei y E spinilera.
Feohilomicosis es un término utilizado para describir la infección del teji-
do cutáneo y subcutáneo, y de los órganos sistémicos, particularmente el
sistema nervioso central. Estas infecciones oscilan entre lesiones subcutá-
neas indolentes, probablemente como resultado de la inoculación directa de
hongos de la zona, y una infección devastadora y destructiva que casi siem-
pre es mortal. Los aislamientos más frecuentes han sido E. jeanselmei. E.
dermalitidis. Cladosporium bantianum (trichoides). especies de Fonsecaea
y especies de Bipolaris. Una entidad clínica distintiva es la sinusitis crónica.
1185
en la que las hilas pueden estar dentro de los senos o. menos comúnmen-
te, extenderse a través de las paredes oseas para invadir el tejido adya-
cente. Entre las especies que producen esta infección, se encuentran S/po-
laris spp., Curvularia spp. y Alternaría spp. Los hongos dematiacenos son
causas raras de queratomicosis.
La característica diagnóstica de la feohilomicosis. es una pigmentación
marrón de la melanina de las hifas. El color generalmente puede percibir-
se en trozos sin teñir. Las cadenas poco pigmentadas pueden reconocer-
se al aplicar un tinte para la melanina. como la técnica Fontana-Masson.
CIGOMICETOS
Los cigomicetos son causas importantes de infecciones fungicas en
huéspedes comprometidos (Williams, 1976). El patógeno más común es el
Rhizopus. Otros mohos que han estado implicados en la enfermedad
humana son Absidia. Rhizomucor, Mucor y Cunnmghamella (Bergman.
1969). La enfermedad invasiva causada por estos hongos se ha llamado
históricamente mucormicosis. En vista de que las especies Mucor son
causas poco comunes de infecciones, un término clínico mejor, es cigo-
micosis.
Factores de riesgo y enfermedad clínica
Hay dos presentaciones clínicas comunes de la cigomícosis. y los facto-
res de riesgo son algo diferentes entre ambas (Straatsma. 1962). Una infec-
ción invasiva que empieza en los senos paranasales se conoce como cigo-
mícosis rinocerebral o craneofacial. La infección comienza como una
sinusitis indiferenciada. pero las hifas rápidamente atraviesan las paredes
finas del seno y se extienden por la órbita, avanzando hasta la piel de la
cara e introduciéndose en la cavidad craneal. El factor de riesgo para este
tipo de infección es predominantemente la diabetes mellitus, y la mayoría de
los pacientes presentan cetoacidosis en el momento en que la infección se
desarrolla (McNulty, 1982). La enfermedad rinocerebral puede avanzar rápi-
damente y. por lo general, suele terminar en la muerte. Puede producirse
una trombosis de la arteria carótida o del seno cavernoso.
La segunda presentación principal de la cigomícosis es la enfermedad
pulmonar, que puede seguirse de una diseminación hematógena. La infec-
ción comienza con una neumonía no diferenciada que puede complicarse
con hemoptisis y cavitación. La diseminación de la infección es común y el
Figura 54-35. Cuerpos muriformes de un hongo dematíaceno en una lesión de cro-
moblastomicosis. Las células oscuramente pigmentadas están sutnendo sepla-
ción. En la lesión están presentes macrófagos y células gigantes multmucleadas
(tinción hematoxilina-eosma).
 1186 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

desenlace casi siempre latal. Los factores de riesgo para la infección pul-
monar son neutropenía e inmunosupresión. particularmente por malignidad
hematológica (Meyer. 1972). Otros factores de riesgo que se han observa-
do son una sobrecarga de hierro, abuso de drogas intravenosas y uremia
(Kwon-Chung, 1992). La diabetes con cetoacidosis está presente en algu-
nos pacientes.
Una presentación menos común de la cigomicosis es la infección de la
piel y de los tejidos blandos (Meyer, 1973a). Las hifas pueden alcanzar la
piel por vía hematógena, por una extensión directa de un foco profundo o
por introducción del exterior. Un comienzo drástico de enfermedad del teji-
do blando se produjo en pacientes que estaban contaminados con esporas
Rhizopus (Gartenberg, 1978). Antes de que se hiciera el potencial de infec-
ción, los fabricantes no siguieron los pasos para la esterilidad de los ven-
dajes. Las heridas por arma blanca y otro tipo de heridas traumáticas tam-
bién son zonas de entrada de estos hongos comunes en el ambiente
(Cocanour. 1992).
La enfermedad pulmonar limitada con cavitación es una presentación poco
Figura 54-36. Una coloma gris vellosa de Rhizopus llena el espacio de la placa
usual de la cigomicosis en individuos inmunológicamente competentes (Re-
de Petri (lid lifters) (fotografia cortesia de Centers for Disease Control and Pre-
cord, 1976). vention).

Patología de la infección por cigomicetos

La histopatologia está dominada por la necrosis del tejido, sin reparar en

la zona de infección (Straatsma. 1962). La propensión de estos mohos para
invadir a través de las paredes de las arterias y venas, produciendo trombo-
sis agudas, conducen a necrosis coagulativa extensa. Las hifas aparecen
como cintas de hifas anchas que por lo general están torcidas y plegadas
(Fig. 54-3). Los septos están esparcidos y por lo general no se observan en
el tejido, pero un londo compuesto de las paredes exteriores de las hifas ple-
gadas puede confundirse con septos. Los segmentos hinchados de las hifas
y las hifas cortadas en perpendicular pueden ser malinterpretadas por células
levaduriformes. Las ramificaciones tienen tendencia a producirse en ángulos
rectos. Las hitas de estos mohos con frecuencia se tiñen mejor con hemato-
xilina-eosina que con la técnica de ácido periódico de Schiff o incluso el méto-
do de plata metenamina.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Los cigomicetos con frecuencia están considerados como contaminan-
tes comunes (Kwon-Chung. 1992). Las implicaciones clínicas potenciales
de los aislamientos deberían investigarse cuidadosamente antes de que
sean tachadas de saprofitos. La demostración de hifas en el tejido nos pro-
porciona una evidencia importante de que un moho aislado estuvo presen-
te in vivo y no es un contaminante medioambiental. Las hifas anchas y con
septos esparcidos pueden demostrarse en trozos de tejidos o en extensio-
nes impresas de tejido usando el tinte de calcoflúor blanco. El tejido debe
ser corlado, mejor que sea homogeneizado. después de lo que se inyecta
en la superficie de un aislamiento agar primario. Los cigomicetos se inhi-
ben por la cicloheximida. Los aislamientos crecen rápido y producen abun-
dantes hifas aéreas que rápidamente alcanzan la tapg de las placas Petri
"lid lifters". Los cigomicetos producen cigosporas sexuales in vilro. pero las
estructuras reproductivas asexuales son más útiles para la identificación.
La identificación de especies es difícil, y para la mayoría de los propósitos
clínicos no es necesaria.
Especies de Rhizopus
Los Rhizopus crecen rápidamente, llenando las placas de Petri dentro
de las 48-72 horas con hifas blancas y como de lana, pasando de gris a
negro según se desarrollan las esporas (Fig. 54-36). Los esporangios diag-
nósticos se encuentran mejor en los bordes o en el centro del cultivo, don-
de pueden verse como puntos negros. Las hifas son anchas (de 6 pm a 15
pm de diámetro), raramente septadas e hialinas. Las esporangiosporas no
tienen ramificaciones y sostienen esporangiosporas redondas (de 60 pm a
350 LIm) con una columela elipsoidal. Las esporangiosporas (5 ppm) son
ovales o romboidales y pueden tener un pigmento marrón (Fig. 54-5). Una
característica diagnostica importante es la presencia de estructuras hiali-
nas parecidas de raiz marrón (rizoides), que se desarrollan en el punto
donde crecen las esporangiosporas (Fig. 54-5). Se ha inlormado de que el
60% de los casos de cigomicosis y el 90% de los casos de enfermedad
rinocerebral son causadas por el Rhizopus arrhizus (citado en Known-
Chung, 1992)
Otros cigomicetos
A diferencia de Rhizopus. los rizoides de las especies de Absidia surgen
de los estolones de las conidioforas. Las esporangiosporas de Absidia tie-
nen forma de pera más que redondas, y se ve un collarete alrededor de la
columela cuando los esporangios se desintegran. Las especies Mucor no
producen rizoides. Las conidioforas generalmente están más ramificadas
que otros cigomicetos, y no hay crecimiento por encima de 37 C. El Rhizo-
mucor. que es morfológicamente intermedio entre Rhizopus y Mucor. tiene
rizoides rudimentarios y conidioforas ramificadas, y crece a temperaturas de
hasta 58 C. Uno de los patógenos principales en el género Mucor (Mucor
pusillus) se ha translerido al género Rhizomucor. Cunninghamella produce
vesículas hinchadas en la punta de las conidioforas. Desde las vesículas,
múltiples esporangiolas unicelulares crecen en tallos pequeños.
MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS)
Este gran grupo de hongos saprofitos se encuentra con frecuencia en el
laboratorio clínico y contiene algunos de los mohos patógenos más impor-
tantes. En esta sección consideramos Aspergillus, Fusanum. Penicillium.
Paecilomyces y Pseudalieschezria. Pseudallescheria boydii. el patógeno
más común en este género, tiene una fase asexual llamada Scedosporium
apiospermum, y el moho puede encontrarse de cualquier forma. Este moho
se considera generalmente como un organismo hialino (Sutton, 1998). aun-
que algunas autoridades lo han colocado en el grupo de dematiacenos
(Larone, 1992). Cualquiera de los miembros de este grupo puede ser pato-
génico bajo las condiciones clínicas adecuadas. Debería intentarse una
correlación clínica cuidadosa antes de descartar aislamientos de tejidos y
fluidos como contaminantes. Por otro lado, es un error aceptar sin criticar
el aislamiento de un patógeno no común como evidencia de que no se ha
determinado la etiología de la infección. Son de utilidad múltiples aisla-
mientos de mohos, y una documentación de patogenicidad requiere una
correlación patológica.
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICOTICAS
Factores de riesgo
Los hipomicetos son hongos ubicuos a los que todos nosotros estamos
expuestos de manera regular. Residen en todo tipo de vegetación. Aspergillus
fumigatus está presente en hojas de vegetales y se ha descrito la enfermedad
alérgica en pacientes que estuvieron expuestos a excrementos de abonos
(Kramer. 1989). A. fumigatus y A. Nigerse aislaron en una planta en la habi-
tación de un paciente con aspergillosis (cita de Know-Chung, 1992). y los
comienzos han coincidido con la construcción del hospital (Amow. 1978; She-
rertz, 1987). Será prudente, por tanto, evitar la exposición de los pacientes
más gravemente inmunocomprometidos. En un estudio epidemiológico, no
hubo ningún caso de aspergillosis invasiva en 39 pacientes que residían en
habitaciones con un filtro de aire HEPA. mientras que hubo 14 infecciones
invasivas en 74 pacientes similares que estaban en habitaciones convencio-
nales (Sherertz. 1987).
Los factores de riesgo más importantes para la infección invasiva por hipo-
micetos son enfermedad inmunosupresiva o quimioterapia (Scherr, 1992:
Walker, 1978: Williams. 1976). La neutropenia también es un factor predispo-
nente importante (Young. 1989). Es importante reconocer, sin embargo, que
puede haber una enfermedad invasiva grave en pacientes que no están
inmunodeprimidos por la quimioterapia o por enfermedad maligna (Rosen-
berg, 1982; Smith. 1982). Es rara, sin embargo, la enfermedad invasiva en
individuos totalmente normales. Las infecciones locales superficiales, que
pueden extenderse a estructuras más profundas o diseminarse a otros ór-
ganos, pueden terminar en quirófano (Stern, 1986) o habrá que usar medi-
caciones, especialmente corticoesteroides, por una infección local o una
aplicación tópica. Las infecciones de las heridas han sido un problema en
pacientes con quemaduras extensas y en individuos expuestos a materiales
contaminados con conidias, una situación típica de los cigomicetos (McCar-
ty. 1986). Las bolas de hongos en los pulmones se producen en pacientes
con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquiectasias y con cavi-
dades antiguas causadas por tuberculosis. En los senos paranasales tam-
bién existen bolas de hongos causadas tanto por especies hialinas como
por dematiacenos.
Enfermedad clínica
Infecciones ótica y ocular
La queratomicosis por lo general es consecuencia de un traumatismo del
ojo, especialmente en pacientes que han sido tratados con esteroides tópi-
cos. El dolor y la visión borrosa siguen al traumatismo, y si no se trata ade-
cuadamente, la infección puede extenderse a la cámara anterior. Si el pro-
ceso no se comprueba, puede ser necesaria una enucleación. A. fumigatus
(Gingrich, 1962) y Fusarium sotaní son agentes etiológicos comunes (Liese-
gang, 1980). La otomicosis es una infección del oído extemo, causada gene-
ralmente por A. niger o A. fumigatus. Dolor, pérdida de audición y disfunción
se acompañan de un crecimiento de una pelusa verde o negra en el canal de
la oreja. La extensión más allá del oído externo es rara (Phillips. 1990), pero
puede producirse en pacientes inmunodeprimidos.
Infección cutánea
Las especies de Aspergillus pueden infectar la piel después de la disemi-
nación desde otra zona, por lo general pulmonar, tanto en pacientes infecta-
dos por VIH como en pacientes no infectados. Es menos común que haya una
infección cutánea primaria en cualquier grupo. Entre los factores de riesgo
reconocidos está la inmunosupresión. pero también son importantes los fac-
tores de riesgo que disminuyen los mecanismos de defensa de la piel. Los
ejemplos incluyen quemaduras y heridas quirúrgicas, especialmente si están
presentes vendajes oclusivos (van Burik, 1998).
Bolas de hongos
Las dos zonas más comunes para esta infección son los senos paranasa-
les y las cavidades pulmonares (Dar. 1984: Meyer. 1994). En los senos, los
signos y síntomas son los de la sinusitis crónica. Las bolas de hongos pul-
monares con frecuencia son asintomáticas, pero pueden producir hemoptisis
1187
(Conlan. 1987). La invasión a través de las paredes de los senos parana-
sales es la complicación más seria de la enfermedad de vía aérea alta, y es
de gran importancia en los pacientes infectados por VIH (Meyer. 1994). La
colonización endobronquial también se produce en pacientes con enferme-
dad pulmonar obstructiva crónica y en pacientes con fibrosis quistica que
puedan tener bronquiectasias (Gilligan, 1991; Nelson, 1979). A. fumigatus
es el moho más común aislado en pacientes con fibrosis quistica. pero
hemos encontrado otros mohos, como las especies de Penicillium. las es-
pecies de Paecilomyces y S. apiospermum. El curso clínico de la mayoría
de los pacientes con fibrosis quistica no parece modificarse por la presen-
cia de Aspergillus en los pulmones, pero se ha descrito una aspergillosis
alérgica broncopulmonar en parte de estos individuos, que desarrollan
hipersensibilidad a los antigenos fúngicos (Nelson, 1979). A. fumigatus y A.
niger son mohos comunes encontrados en las bolas fungicas pulmonares.
A fumigatus. A. flavus y Fusarium spp.. al igual que los hongos dematiace-
nos. se encuentran normalmente en los senos paranasales.
La aspergillosis broncopulmonar alérgica es una complicación en pacien-
tes que tienen una diátesis alérgica (Ahmad, 1984; Golbert, 1970). Las hifas
colonizan el tracto respiratorio bajo, pero no invaden el tejido. La detección
de anticuerpos precipitantes en el suero es útil, pero algunos investigadores
no consideran que los reactantes disponibles comercialmenle sean validos
(Kwon-Chung. 1992). Las manifestaciones clínicas incluyen asma, infiltra-
dos pulmonares y, al final, fibrosis pulmonar en algunos pacientes. Las
especies de Aspergillus son los agentes incitanles más comunes. Un pro-
ceso similar puede incluir los senos paranasales (Katzenstem, 1983).
Infección pulmonar y enfermedad invasiva
La neumonía puede ser difícil diferenciarla de un proceso bacteriano, pe-
ro la tos y la producción de esputo son con frecuencia menos marcados que
en la mayoría de las neumonías bacterianas (Mehta, 1984). La progresión
hasta la cavitación y la falta de respuesta a los antibióticos son pistas que de-
berían considerarse en la infección fúngica. Un aislamiento repetitivo del mis-
mo moho de muestras clínicas aumenta la probabilidad de que el hongo sea
un colonizador o patógeno invasivo más que un contaminante de laboratorio.
La demostración de hifas en muestras clínicas indica que el moho está pre-
sente in vivo. La caracterización definitiva del proceso infeccioso puede pre-
cisar una correlación clínica cuidadosa y con frecuencia un estudio morfológi-
co de las muestras de tejido.
La diseminación desde el pulmón u otras zonas puede incluir cualquier ór-
gano (Meyer, 1973b). La propensión de las hifas para invadir las estructuras
vasculares y causar trombosis conduce a infartos y abscesos en múltiples ór-
ganos. A. fumigatus y A. flavus son las especies que con más frecuencia se
aislan, pero otras especies de Aspergillus. como A. terreus. también produ-
cen neumonía e infección diseminada (Tritz. 1993). A. niger rata vez lo encon-
tramos en enfermedad invasiva, pero virtualmenfe cualquier hongo puede
producir infección diseminada si las condiciones clínicas y medioambientales
son adecuadas.
Patología de la infección por hipomicetos
La respuesta histológica a estos agentes puede ser granulomatosa. pero
normalmente está más dominada por los neutrófilos polimorfonucleares, a
menos que el paciente esté gravemente neutropénico. La invasión vascular,
la trombosis y el infarto con frecuencia son características importantes. Las
hifas son delgadas (de 2 jim a 5 uní), septadas y ramificadas en ángulos
agudos (dicotomos) (Fig. 54-2). El tinte hematoxilina-eosina con frecuencia
colorea bien las hifas. pero, para avanzar, puede verse la morfología con las
técnicas del ácido periódico de Schiff o la técnica de plata metenamma. Es
importante darse cuenta de que es imposible identificar el moho por la mor-
fología de las hifas. ¡Ramificación dicotómica, hifas delgadas y septadas no
siempre es igual a Aspergillus.'
Cuando el proceso patológico es una bola de hongos, las hilas que pre-
sumiblemente están muertas pueden teñirse pobremente con todos los tin-
tes. Cuando la cavidad está en contacto con el aire, como en el pulmón o
en los senos, pueden desarrollarse unas cabezas afrutadas, un suceso que
 1188 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
permite la asignación de un género especifico, tal como Aspergillus (Fig. 54-37).
Las conidioforas, que no están septadas y que pueden ser más anchas que
las hitas vegetales, no deben contundirse con los cigomicetos. Las células
Hülle de pared gruesa y los cleistotecios se han descrito In vivo. Los cristales
de oxalate demostrables con filtros polarizantes, pueden encontrarse en las
bolas de hongos producidas por A. niger (Louthrenoo, 1990: Staib, 1979).
Cuando el paciente es inmunocompetente y la respuesta histológica es
granulomatosa, las hifas pueden fragmentarse y reducirse a citoplasma de
macrófagos y células gigantes mullinucleadas (Ahmad. 1981). La respues-
ta granulomatosa al Aspergillus en el pulmón puede confundirse con una
granulomatosis broncocéntnca (Bosken, 1988; Nagata, 1990), por lo gene-
ral en pacientes que tienen enfermedad alérgica. En las aspergillosis alér-
gicas son comunes la mucosidad impactada con eosinófilos y los cristales
Charcot-Leyden (Bosken. 1988). La infección alérgica por Aspergillus en
los senos paranasals se parece a la enfermedad broncopulmonar (Kat-
zenstein, 1983).
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Estos mohos son hongos saprofitos, algunos de los cuales se aislan co-
múnmente en los laboratorios clínicos. Sin embargo, nunca deberían ser des-
cartados de contaminantes sin determinar la situación clínica. El aislamiento
de una zona estéril o varios aislamientos obliga a llamar al médico. Las hifas
tienen que ser demostradas directamente en las muestras clínicas, en las pre-
paraciones fijadas o preparaciones en fresco. Una vez más, el calcoflúor blan-
co es útil para demostrar los mohos. La presencia de hifas en una muestra
siempre es más significativa que aislar los mohos solos. Sin embargo, en las
secreciones respiratorias, incluso aunque encontremos hifas, no se define la
naturaleza de la interacción entre hongos y huéspedes. Una correlación clíni-
ca detallada y, algunas veces una biopsia son necesarias para la determina-
ción final.
Es importante obtener tejidos, raspados, fluidos o curetajes para analizar,
con la excepción de la otomicosis por Aspergillus. El tejido tiene que ser pre-
parado e inoculado directamente en la superficie de un medio de aislamiento.
Estos mohos crecen rápidamente, pero la mayoría se inhiben parcial o total-
mente por la cicloheximida.
La identificación específica de las especies la hacemos por el estudio de:
Células pie
Color de la colonia
Morfología de la cabeza colonial
Figura 54-37. Se demuestra la cabeza de Aspergillus niger dentro de un miceto-
ma pulmonar (bola de hongos). Se observan bien las tiálides y las conidias. Aun-
que las hifas de Aspergillus no son diagnósticas, la demostración de dicha cabe-
za demuestra la presencia de este género (hematoxilina-eosina).
Número de fiálides
Morfología de las colonias, incluido el tamaño
Presencia y forma de las células Hülle
Presencia de cleistotecios
El color y morfología de las especies de Aspergillus se estudian correcta-
mente en el agar Czapek-Dox.
El reverso de las colonias de hipomicetos es de color claro, pero puede
tener pigmentación amarilla, marrón o roja. Las hifas vegetales son delga-
das, septadas y ramificadas. Las colonias de muchos de estos mohos rebo-
san de conidias. Para evitar la contaminación del trabajador y de otros cul-
tivos, debe manipularse con cuidado en una cabina de seguridad de flujo
laminar, y después las superficies de las cabinas tienen que limpiarse con
una solución fungicida. Mantener los mohos aislados en bolsas de plástico
mientras continúa la incubación también reduce la probabilidad de contami-
nar otros cultivos.
Como ya se dijo antes, delectar los anticuerpos de las especies de Asper-
gillus puede ser diagnósticamente útil, especialmente para aspergillosis alér-
gica broncopulmonar (Kurup, 1991).
Aspergillus fumigatus
A. fumigatus es uno de los más comunes, si no el más común, aislado
en los laboratorios de micología. Las colonias crecen muy rápidamente,
produciendo una apariencia de pelusa. El desarrollo de cabezas afrutadas
concede una apariencia azul-verdosa a la colonia (Lámina 54-1). Examinar
la colonia con un microscopio de disección nos muestra las conidioforas con
sus vesículas expandidas como globos pequeños protegiendo por arriba el
micelio vegetativo. La conodiolora es lisa, relativamente corta (de 300 um a
500 um). y se extiende en una vesícula en forma de frasco. Las fiálides se
desarrollan en una hilera única (uniseriada), y lo más común es que se des-
arrollen sólo en los dos tercios superiores de las vesículas paralelas al eje
de la conidiofora (Fig. 54-7). Las conidias son rugosas (equinuladas) y de
forma redonda u oval.
Aspergillus flavus
El segundo patógeno más importante en el género Aspergillus es A. flavus.
Las colonias crecen rápidamente y, una vez que las cabezas afruladas se
desarrollan, tienen una apariencia aterciopelada de amarillo a verde (Lámina
54-13). Las conidioforas son largas (de 400 pm a 700 pm), terminando en
una vesícula que puede ser elíptica o redonda. La conidiofora es rugosa o
achaparrada. Una hilera sencilla o doble (biseriada) de las fiálides se produ-
ce sobre toda la vesícula o los tres cuartos superiores (Fig. 54-38). Las coni-
dias de redondas a ovales parecen amarillas verdosas en masse y miden de
3 um a 4,5 pm. Las estructuras de descanso (esclerotia) se encuentran en
las hifas vegetales de algunos aislamientos.
Aspergillus niger
Este saprofito común se aisla con frecuencia del canal auditivo externo.
Tiene una apariencia colonial espectacular, con cabezas afrutadas negras
contra un fondo de micelios vegetales blancos como la nieve (producen una
apariencia de sal y pimienta) (Lámina 54-14 y Fig. 54-39). Las conidioforas
son lisas y largas (de 1,5 pm a 3,0 pm). sosteniendo una vesícula redonda
con fiálides biseriadas, que se irradian fuera desde la vesícula entera. Las
conidias marrones y rugosas son redondas y miden 4 pm. Puede estar pre-
sente esclerotia.
Otras especies de Aspergillus
El grupo A. glaucus consiste en mohos de color verde con manchas ama-
rillas que crecen rápidamente. Las conidioforas son lisas y las fiálides unise-
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICOTICAS 1189

Figura 54-38. La cabeza de Aspergillus tlavus es unísenada y biseriada. Las Iiáli- Figura 54-40. Conidias de la especie Fusarium con lorma de piragua Las conidias
des se extienden alrededor de muchas de las vesículas. Puede verse la apariencia generalmente son septadas. (Lactofenol algodón azul.)
rugosa de las conidioforas. (Lactofenol anilina azul.)

nadas. Normalmente están presentes cleistotecios (Fig. 54-11). Aspergillus
terreus produce una colonia marrón canela, conidioforas cortas (<250 um) y
fiálides biseriadas. A nidulans produce colonias entre verde y verde oliva os-
curo, conidioforas onduladas cortas (<150 um) y fiálides biseriadas. La for-
mación de cleistotecios de la etapa sexual se realza por el cultivo en agar
Czapek-Dox. Los cleistotecios, que miden de 100 um a 300 um, son redon-
dos y marrón rojizo Están rodeados por una capa marrón-amarillenta de hifas
que contienen células Hülle redondas. Ocasionalmente se encuentran otras
especies.
Especies de Fusarium
Este género está altamente implicado en la queratomicosis, en quema-
duras y en la enfermedad diseminada en pacientes inmunocomprometidos
(Anaissie, 1992; Nelson, 1995; Wheeler, 1981). Las colonias se desarrollan
rápidamente, produciendo un micelio aéreo como pelusa, que con frecuen-
cia es de color rosa, lavanda o salmón. Unos pigmentos difusos pueden ver-
se en los alrededores del agar. Las fiálides simples o ramificadas se des-
arrollan directamente de la hila sin una conidiofora que las separe. Pueden
producirse macroconidias cortas ovaladas, pero la estructura distintiva es
una macroconidia con forma de canoa o semicírculo que puede tener uno o
más septos.
Pseudallescheria boydii/Scedosporium apiospermum
P boydii es la fase sexual de esle patógeno, mientras que S. apiosper-
mum es la fase imperfecta, asexual. El moho crece rápidamente en un
medio de aislamiento, produciendo una colonia vellosa que evoluciona de
color marrón grisáceo a gris oscuro ("ratón") después de incubarlo durante
varios días. El cultivo se oscurece más aún con una incubación continua-
da (Lámina 54-15). Este moho puede crecer en un medio que contenga
más de 8 mg/ml de cicloheximida. La fase asexual se caracteriza por agru-
paciones simples o pequeñas de aneloconídias en una conidiofora recta o
ramificada que puede crecer terminal o lateralmente de la hifa vegetativa
Las conidias son de marrón claro y tienen una morfología oval parecida al
esperma (Fig. 54-41). En la fase sexual, los cleistotecios marrones contie-
nen ascosporas (Fig. 54-42). Los cleistotecios, que se encuentran más pre-
parados en los bordes de la colonia, se desarrollan mejor en un medio
nutricional deliciente. como el agar cornea. Estrictamente hablando, la
cepa debe referirse como P. boydn si se demuestran cleistotecios. y como

Figura 54-41. Las microconidias de Scedosponum apiospermum con forma de

Figura 54-39. Las cabezas de Aspergillus niger se demuestran con un microsco- renacuajo o de espermatozoide dan al organismo su nombre. (Lactofenol algodón
pío de disección (Preparación sin teñir.) azul.)
 1190 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 54-42. Un asco de la lorma sexual Pseudallescheria boydiivene un exterior
rugoso causado por hitas especializadas.
S. apiospermum si las conidias asexuales son las únicas estructuras diag-
nósticas observadas.
Especies de Penicillium
Este hongo saprofito se aisla comúnmente en el laboratorio de micologia. por
lo general sin ninguna enfermedad clínica asociada. Las especies comúnmen-
te aisladas crecen bien en un medio de aislamiento fungico, pero se inhiben por
la cicloheximida. La colonia es aterciopelada, y se desarrolla una apariencia
verde, en ocasiones con un borde blanco (Lámina 54-16). La estructura diag-
nóstica es el penicilo, que recuerda la mano de un esqueleto con cadenas de
conidias creciendo desde la punta de los dedos (Fig. 54-43). Las especies de
Penicillium tienen que dilerenciarse de las Paecilomyces spp. que son morfoló-
gicamente similares. P. mameflei es un miembro poco normal del género que
es dimórfico y regularmente produce enfermedad humana sistémica (Kwon-
Chung. 1992). Esta especie es endémica en el sureste asiático, y la mayoria de
los casos en EE.UU. se han producido en pacientes inmunodeprimidos que han
viajado a Asia (Phiehl, 1988) La infección por P. mame/Ye/puede parecerse clí-
nicamente a la tuberculosis, moluscos contagiosos, histoplasmosis o cnptoco-
cosís (Cooper. 1997). A 25 C-30 C. las colonias de mohos son grises con un
pigmento rojo soluble; según maduran las conidioforas, el color de las colonias
se vuelve verde. Las células de levadura se producen a 37"C o en los tejidos,
pero la división es por septación o fisión más que por gemación.
Figura 54-43. El penicilo de las especies de Pénicillium está compuesto de cade-
nas de conidias nacidas de fiálides que han sido comparadas con los huesos del
esqueleto de la mano El género Paecilomyces. que posee más fiálides. puede ser
confundido con el Penicillium (lactofenol algodón azul).
Figura 54-44. La septación de las células algiformes de Prototheca wickerhamn
produce muchos cuerpos mtracelulares y estructuras conocidas como mórulas (he-
matoxilina-eosina).
Otros mohos hialinos
Hay una gran lista de mohos hialinos que son saprofitos del ambiente, o
de virulencia baia. y por lo general no se asocian con enfermedad clínica
cuando se aislan en el laboratorio de micologia. Como ya se ha dicho
antes, cualquiera de estos mohos puede ser patogénico ba)0 condiciones
adecuadas. En la mayoria de los casos, las defensas del huésped están
deprimidas de algún modo, o el hongo se introduce en el cuerpo por un
traumatismo o manipulaciones médicas. Como ejemplo. Paecilomyces lila-
cinus es un moho hialino que se parece morfológicamente a las especies
Penicillium (Westenleld, 1996). Este moho fue considerado hasta hace
poco como un contaminante de laboratorio. Un gran número de documen-
tos cuentan la capacidad de los llamados contaminantes para producir
infecciones del tejido profundo y de los órganos sistémicos. La demostra-
ción de hifas en el tejido es extremadamente importante para averiguar la
patogenicidad del aislamiento.
INFECCIONES CAUSADAS POR ALGAS ACLORÓFILAS
Prototheca wickerhamii y P. zopfii son dos especies de algas que no pro-
ducen clorofila. Producen en ocasiones infecciones humanas, y se conside-
ran en este capitulo porque se parecen a las infecciones de enfermedades
fúngicas (Sudman, 1974; Tindall, 1971). Los Prototheca se encuentran en
aguas frescas y marinas, y probablemente entran en el cuerpo a través de
heridas superficiales. Algunos pacientes son inmunocompetenles, pero
algunas enfermedades subyacentes, como diabetes mellitus, o terapias
inmunosupresivas con frecuencia predisponen a los pacientes a la infección
por este patógeno. Otros pacientes han recibido inyecciones de corticoes-
teroides en la zona de infección o han tenido infección musculoesquelética.
sobre todo con afectación de los tendones. Las infecciones normalmente
afectan a la piel y al tejido subcutáneo, y después afectan a los tendones y
las articulaciones (Holcomb, 1981; Nosanchuk. 1973). Son crónicas e intra-
tables, y puede ser difícil eliminarlas sin dañar las estructuras que están
debajo, particularmente en la mano (Lee. 1975). La diseminación de la in-
fección es rara (Cox, 1974).
Las algas crecen en medios fúngicos de aislamientos preparados que no
contienen cicloheximida. y las colonias se parecen a las de las especies
Candida (Lámina 54-17). Las células de las algas tienen una apariencia ca-
racterística, en la que múltiples células hijas (esporangiosporas) se des-
arrollan dentro de la célula madre (esporangio), recordando a una esférula
(Chandler, 1978; ElAni. 1967). También podemos encontrar estas estructu-
ras en secciones histológicas, donde deben ser diferenciadas de hongos
dimórficos (Fig. 54-44). Pueden verse en las preparaciones de hematoxili-
na-eosina y se tiñen bien con el ácido periódico de Schiff o métodos de pla-
ta matenamma. Las especies de Prototheca se incluyen en la base de datos
 CAPÍTULO 54 • ENFERMEDADES MICÓTICAS
de los sistemas de identificación de levaduras comerciales, tales como API
20C (BioMerieux. Hazelwood. MO) y sistemas Vitek (BioMéneux, Hazel-
wood, MO).
PNEUMOCYSTIS CARINII
Hace pocos años, este importante patógeno hubiera sido incluido en el
capítulo de parasitología. El organismo tiene características peptónicas. tan-
to de protozoos como de hongos, pero los estudios moleculares han estable-
cido su relación con los hongos ascomicetos (Edman, 1988).
Factores de riesgo
Pneumocystis cariniies un patógeno de humanos (Bartlett, 1991: Masur.
1989; Walzer. 1974: Watts, 1991). Organismos morfológicamente similares
causan infecciones en especies de roedores. Primero se reconoció en los
comienzos de la enfermedad pulmonar entre niños malnutridos en el este
de Europa durante y después de la Segunda Guerra Mundial. No se cono-
ce ninguna fuente en el medio ambiente conocida para los hongos. Pode-
mos comprobar que la mayoría de los individuos se infectaron asintomáti-
camente en la infancia por análisis serológicos (Maddison. 1982: Peglow,
1990). También se han encontrado infecciones asintomáticas o ligeramen-
te sintomáticas en adultos (Sheldon. 1959). Hay una evidencia sugerente
de que los hongos pueden colonizar el tracto respiratorio bajo, producien-
do una infección activa cuando interviene un tratamiento o enfermedad
inmunosupresiva. La neumocistosis es una enfermedad de individuos com-
prometidos inmunológicamente (Walzer, 1974). El tratamiento con cortico-
esteroides y malignidad hemalológica fueron los principales factores de
riesgo antes de que apareciera el VIH, que se ha convertido en el principal
factor de riesgo (Phaír, 1990). El sida se descubrió por la apariencia de
esta enfermedad en hombres jóvenes que previamente estaban sanos en
Los Ángeles y Nueva York (Gottlieb. 1981: Masur, 1981). y la infección por
Pneumocystis carinii ha sido una de las infecciones que se encuentran en los
comienzos del síndrome. La incidencia ha descendido en estos años, quizá
por la introducción de un tratamiento retroviral efectivo y el uso extensivo de
antibióticos profilácticos que son activos contra los hongos (Kovacs, 1992;
Sehonanda. 1996).
Enfermedad clínica
La neumonía es la manifestación más común de la enfermedad y el pulmón
era el único órgano afectado antes de la aparición del VIH. El comienzo pue-
de ser agudo o insidioso y predomina la disnea. Con frecuencia los infiltrados
son mucho más extensos de lo que se pensaría por el grado de los síntomas
(Dee, 1979) Es normal que haya infección concurrente con otros agentes,
sobre todo con citomegalovirus y C. neoformans. La infección con frecuencia
es mortal en pacientes no tratados, inmunodeprimidos que mueren de un fallo
respiratorio progresivo. La diseminación de los hongos más allá del pulmón
es común en pacientes infectados por VIH. pero no es común en pacientes
con otros factores de nesgo (Telzak, 1990).
Patogenia de infecciones por Pneumocystis
La presentación patológica inicial en niños malnutridos fue una neumonía
intersticial grave con un infiltrado molecular que tenia un gran componente de
células plasmáticas (neumonía de células del plasma). El patrón histológico
clásico es un exudado alveolar espumoso que puede calcificarse (Weber.
1997). Un daño alveolar difuso con membranas hialinas es una presentación
menos específica pero común (Askin. 1981). Se han descrito, aunque son
menos comunes, enfermedad granulomatosa, enfermedad cavitaria y necro-
sis coagulativa que se parece a los infartos. Las lesiones extrapulmonares
son mínimamente inflamatorias, y consisten en cúmulos focales de exudado
espumoso en el que se encuentran células fúngicas. Los estudios ultraes-
tructurales de los organismos cultivados (Murphy, 1977) y la histología extra-
pulmonar apoyan la evidencia ultraeslructural de que el exudado espumoso
1191
se produce por los hongos, más que por una reacción del tejido especifico
para el pulmón.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Pneumocystis carinii ha sido cultivado en cultivos celulares, pero no se
ha acompañado de un mantenimiento senado de los subcultivos (Latorre.
1977; Pifer. 1977). Por tanto, el diagnóstico es morfológico y. más reciente-
mente, inmunológíco. El ciclo vital del Pneumocystis carinii afecta al des-
arrollo de los esporozoitos dentro de quistes, después de lo cual los espo-
rozoitos se liberan. El lavado broncoalveolar nos proporciona la fuente más
fiable para material diagnóstico (Kelley. 1978), y la biopsia pulmonar rara
vez tiene que realizarse. En pacientes con VIH se produce un número de
microorganismos suficientes para que con un esputo inducido con salino
pueda proporcionarnos el diagnóstico. La experiencia con los esputos ha
variado, sin embargo, en diferentes centros y el rendimiento es muy bajo en
pacientes que tienen otras infecciones aparte del VIH (Lau. 1976). La tinción
con Giemsa nos muestra bien los esporozoitos. pero las estructuras peque-
ñas son más difíciles de detectar que los quistes. El tinte comercial Diff-Quik
(Corporación de Salud Baxter. McGaw Park, IL) es el que se utiliza normal-
mente. El tinte de plata metenamina, modificado para Pneumocystis, se uti-
liza normalmente en laboratorios de patología quirúrgica (Fig. 54-45). El
azul de toluidma 0 ha sido empleado en muchos laboratorios de microbiolo-
gía (Gosey, 1985). El calcofiUor blanco también tiñe los quistes y se ha uti-
lizado con éxito en algunos laboratorios (Baselski. 1990). Los quistes, que
miden 5 um son redondos, pero las formas plegadas son comunes. Los
quistes plegados con forma de casco y los engrasamientos de las paredes
del quiste que recuerdan a las comillas en preparaciones teñidas con plata,
son característicos, pero no diagnósticos. Los quistes deben diferenciarse
de otros hongos, en particular de H. capsuiatum. El uso de tintes para quis-
tes y trolozoitos, separados o combinados, nos da una gran sensibilidad (Bar-
tlett, 1991; Blumenfeld. 1988). La llegada de anticuerpos monoclonales com-
binados con fluoresceína para P. carinii nos ha proporcionado un método
específico para identificarlo. La técnica de la inmunolluorescencia. según
algunos artículos, ha sido más sensible en tintes histoquímicos (Baughman.
1989; Kovacs, 1988). pero la destreza y el cuidado de los observadores sin
duda tienen un papel importante al comparar la sensibilidad de las técnicas
(Bartlett, 1991; Cregan. 1990). El Pneumocystis encontrado en las ratas no se
tiñe con el monoclonal para quistes humanos (Bauer, 1993). pero la especi-
ficidad de estas especies es un problema sólo en la competencia de los test
de las muestras. Debe decirse que los quistes del P. carinii en ocasiones
pueden encontrarse en las preparaciones teñidas con Gram (Fig. 54-46).
aunque esta técnica no es un método sensible para detectarlos. La detección
Figura 54-45. Los quistes de Pneumocystis carinii pulmonar son redondos o colap-
sados y lienen un engrasamiento focal en la pared del quiste que le da una apa-
riencia de paréntesis (tinción con plata metenamina).
 1192 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 54-46. En esta tinción de Gram de un lavado bronquial, se objetiva un quis-
te de Pneumocystis carinii con esporozoitos claramente visibles en su interior.
de antígenos circulantes se ha descrito tanto en la infección pulmonar como
en la diseminada (Pifer. 1984), pero los ensayos no están disponibles co-
mercialmente.
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 Parasitología médica
• Thomas R. Fritsche, M.D., Ph.D.
• James W. Smith, M.D.

MÉTODOS DE LABORATORIO 1198 HELMINTOS INTESTINALES 1221

Examen de sangre Nematodos
Examen de muestras fecales Cestodos
Examen de muestras urogenitales y otras muestras Tremátodos
(expustos, aspirados y biopsias) HELMINTOS TISULARES 1228
Técnicas de cultivo parasitario Nematodos
Métodos de inmunodiagnóstico Cestodos
Métodos de diagnóstico molecular Tremátodos
Control de calidad, de mejora y seguridad
ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA 1231
PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES 1204
Características biológicas
Malaria
Mecanismos de lesión
Babesiosis
Aproximación de laboratorio a la identificación de artrópodos
Hemoflagelados
Insectos
Toxoplasma gondii
Arácnidos
Amebas oportunistas de vida libre
Clases de menor importancia médica
PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES 1211
INFECCIONES PARASITARIAS Y HUÉSPEDES
Amebas y Blastocystis hominis INMUNOSUPRIMIDOS 1237
Flagelados
BIBLIOGRAFÍA 1237
Ciliados
Coccidios
Microsporidios

El estudio de la parasitología ha ganado renovada importancia en un
mundo cada vez más pequeño debido al rápido desplazamiento de la
gente, especialmente viajeros y emigrantes de áreas endémicas para
enfermedades parasitarias, y por la aparición de patógenos que surgen y
resurgen en individuos inmunodeprimidos por diferentes razones. Las
enfermedades parasitarias de los humanos y animales domésticos tienen
un gran peso en las áreas de recursos de salud limitados, y afectan de un
modo adverso al desarrollo social y económico de muchos países en todo
el mundo. Mientras que los organismos clasificados como parásitos cons-
tituyen un gran grupo, los que afectan a los humanos son más limitados en
número y están compuestos mayoritariamente por protozoos, helmintos y
artrópodos (Tabla 55-1).
Médicos de EE.UU. y otros lugares se están encontrando con un cre-
ciente número de problemas en el diagnóstico de las enfermedades parasi-
tarias. También los laboratorios han cambiado con el desarrollo de nuevas
tecnologías para diagnosticar, rápidamente y con precisión, parásitos como
Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayelanensis, Toxoptasma gondii y
microsporidios tanto en inmunocompetentes como en immunosuprimidos.
El resurgimiento mundial de la malaria y otras enfermedades parasitarias ha
requerido también un mayor esfuerzo de los laboratorios para detectar pro-
tozoos y helmintos sanguíneos, intestinales y tistulares.
Una vez diagnosticados, pueden surgir problemas adicionales en su trata-
miento debido a la falta de terapias efectivas o al incremento de las resistencias
a las terapias tradicionales. Muchos parásitos precisan de un vector artrópodo
para su transmisión, y el uso irregular de los esfuerzos erradicadores de los vec-
tores ha producido, en muchas ocasiones, una aparición de resistencias a los
insecticidas. La malaria está resurgiendo en muchas áreas debido a un descui-
do en las medidas de control, así como por la aparición de parásitos resistentes
a los fármacos y mosquitos resistentes a los insecticidas. La esquistosomiasis se
ha extendido a nuevas zonas debido a un aumento de la irrigación a causa del
crecimiento de la población, que necesita una expansión de la agricultura.
Debido a la naturaleza crónica de muchas enfermedades parasitarias, asi
como a los largos períodos de incubación (tiempo entre la infección y la apa-
rición de estadios diagnósticos), los médicos pueden no considerarlas en el
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA 1197

Tabla 55-1 R e s u m e n d e los parásitos m á s f r e c u e n t e m e n t e hallados e n h u m a n o s y s u principal zona d e infección

S u b r e i n o de los protozoos S u b r e i n o d e los m e t a z o o s

Filo Sarcomarligophorea Filo Platelmintos (gusano plano)

Sublilo Sarcodina (amebas) Clase ceslodos (lenias)
£. histolytica (I)' Diphyllobothrium spp. (I)'
£ d/spar(l) Dipylidium caninum (I)*
£ hartmanni (I) Echinococcus granulosus (H)"
£ coft'(l) £ multilocularis (H)'
lodamoeba butschlii (I) Hymenolepis nana (I)'
Endo/imex nana (I) H. diminuta (I)'
Nacglcria fowleri(T. C)* Taen/a saginata (1)"
Acanthamoeba spp (T. C, E)" 7 solium (I. T)"
Balamulhia mandrillaris (T, C)* Clase Tremátodos (lombrices)
Blastocystis hominis (I) Clonorchis sinensis (H)
Subfilo Mastigophora (flagelados) Fasciola hepática (H)*
Giardia lamblia (I)* Fasciolopsis buski(i)
Dienlamoeba fragihs (I)' Heterophyes heterophyes (I)
Chilomasyix mesniii (I) Metagonimus yokagawai(I)
Relor ¡amonas intestinalis (I) Nanophyetus salmincola (1)"
Enteromonas hominis (I) Opistorchis viverinni (H)
Trychomonas hominis (I) Paragonimus spp (L)*
Ttychomonas vaginalis (V)" Schistosoma haematobium (B)
Leishmania tropica (T) S japonicum (B)
L. major (T) S. mekongi (B)
L aethiopica (T) S. manson/(B)
£.. mexicana (T)" Filo Nematodos (gusanos redondos)
/.. braziliensis (T)
L. donovan/(T) Clase Adenophoros (aplasmidios)
Trichinella spiralis (T. 1)"
-
Trypanosoma gambiense (B, C) Trichuris trichiura (I)
7" rhodesiense (B. C) Capillaria philippinensis (I)
7" CYÍ/;>7(B. T)' Clase Secernentia (plasmidios)
Filo Ciliophora (ciliados) Enterobius vermicularis (I) -

Balanlidium coli (I)* Ascaris lumbhcoides (I)'

Filo apicomplexa (apicomplejos) Ancylostoma duodenale (I)
Clase Sporozoea Necator amencanus (I)*
Subclase Piroplasmea Strongyloses stercoral (I)
Babesia spp. (B)° Trichostrongylus spp. (I)'
Subclase coccidios Amsaki spp. (1)"
Plasmodium falciparum (B) Wucfiereria bancrotli (T, B)
P malariae (B) Brugia malayi (T. B)
P ova/e (B) Loa toa (T, B)
P wvax (B) Onchocerca volvulus (T)
Cryptosporidium parvum (I)" Mansonella perstans (TB)
Cyclospora cayetanensis ( I ) - M. ozzardi (T. B)
Isospora belli (I)* M streptocerca (T)
Toxoplasma gondii (T)' Dracunculus medinensis (T)
Filo Microspora (microsporidios) Angiostrongylus cantonensis (T)
Encephalilozoon spp. (E, H, T)* A costaricencis (T)
£ intestinalis (I. T)'
Enterocytozoon bieneusi (I)'

* Parásitos patógenos naturales de Estados Unidos B sangre. C liquido cefalorraquídeo: E 0|0: H: hígado: I: intestino L pulmón T: tejidos; V: vagina
Adaptada de Murray PR Barron EJ Pfaller M. y cois. Manual of Clinical Microbiology, 6a ed Washington DC ASM Press. 1995

diagnóstico diferencial a menos que el paciente aporte información volunta-
riamente o se le interrogue específicamente sobre la historia de viajes u otras
exposiciones. La malaria es una de las patologías parasitarias que cursa con
un cuadro febril agudo, que puede tener consecuencias letales a menos que
se la considere en el diagnóstico diferencial y se recoja una historia de viajes
a una zona endémica.
Se han hecho varias estimaciones de la prevalencía y mortalidad de las
infecciones parasitarias en todo el mundo (Tabla 55-2). Se desconoce la
incidencia actual de las infecciones por parásitos en los EE.UU. porque la
mayoría no se declaran a las oíicmas de salud pública. Giardia lamblia.
otros protozoos intestinales y los gusanos redondos intestinales son los
más frecuentemente declarados (7,2%. 10% y 3.5%, respectivamente) por
los laboratorios, pero probablemente son más comunes otros parásitos,
entre los que se incluyen Cryptosporidium. Cyclospora y los microspori-
dios, aunque están infradiagnosticados (Kappus, 1994).
Este capítulo hace una revisión del abordaje general de los laboratorios
para la detección y el reconocimiento de los protozoos y helmintos en las
muestras humanas. Se necesita una descripción de las distintas especies
de parásitos para tener una información clínica y biológica esencial para el
diagnóstico y tratamiento. Para una mayor descripción de los parásitos.
 1198 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

N cuencia de muestras necesarias para el diagnóstico. También son útiles en

Tabla 55-2 Prevalencia mundial e s t i m a d a para las infecciones muchas ocasiones los métodos de diagnóstico inmunológico y molecular, y
parasitarias a veces pueden ser los únicos métodos de diagnóstico disponibles. Se
Población estimada N. anual
Enfermedad afectada de muertes puede encontrar una descripción completa de los procedimientos de labora-
torio general para la delección e identificación de los parásitos en distintas
Protozoos fuentes a las que nos remitimos (Ash. 1987; Balows, 1 9 8 8 : Beaver. 1984; Gar-
Amebiasis Aprox. 10% de 40.000-110.000 cia. 1997.1999: Isenberg. 1992; Murray. 1999: Price. 1994).
la población
Tripanosomiasis 100.000 nuevos casos 5.000 La familíarización con la calibración y el uso de un micrómetro ocular es
africana al año necesaria para llevar a cabo cualquier examen parasitológico en cualquier
Tripanosomiasis 24 millones 60.000 laboratorio. La medición del tamaño de los trolozoítos de los protozoos y los
americana quistes, así como de los huevos de los helmintos y las larvas, es algo muy
Giardiasis 200 millones necesario para una rápida identificación. Diferenciar entre amebas patóge-
Leishmaniasis 1.2 millones nas y no patógenas (concretamente entre Entamoeba histolytica y E. hart-
Malaria 400-490 millones 2.2-2.5 millones
Helmintos manni) sólo puede realizarse con seguridad a través de la cuidadosa medi-
Ascariasis 1.3 billones 1 550 ción del tamaño. Igualmente, los huevos de Diphyllobothrium spp.,
Ceslodos 65 millones Paragonimus westermani y Fasciola>Fasciolopsis pueden distinguirse según
Clonorquiasis- su tamaño (Smith, 1979).
Opistorquiasis 13.5 millones
Dracunculosis < 100.000
Fasciolopsiasis 10 millones
Filarías linfáticas 128 millones Examen de sangre
Uncinanas 1,3 billones
Oncocercosis Los parásitos que se pueden detectar en muestras de sangre son los
17.7 millones
Paragonimiasis 2.1 millones agentes de la malaria (Plasmodium spp.). babesiosis (Babesia spp.), tri-
Esquistosomiasis 150 millones 500 000-1 panosomiasis (Trypanosoma spp.) y leishmaniasis (Leishmania donovam)
millón y filanasis (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi. Loa loa y Mansonella
Estrongiloidiasis 35 millones spp.). Las técnicas más importantes que debe realizar el laboratorio para
Tricoeslrongiliasis 5,5 millones el diagnóstico de los parásitos sanguíneos son la preparación, la tinción y
Tncunasis 900 millones
el examen de las extensiones gruesa y fina de sangre. Otras técnicas
Adaplada de Marken EK. John DT Krotoski WA Marken and Voge's Medical Pa menos frecuentes son aquellas de concentración reservadas para la de-
rasilology 8 ed Filadelha. WEt Saunders Company. 1999
tección de microfilarias (National Committee tor Clinical Laboratory Stan-
dards [NCCLSj, 2000).

Frotis sanguíneos gruesos y finos

Es necesario el examen de frotis sanguíneos teñidos para la identifica-

nos remitimos a un gran número de textos disponibles (Beaver. 1984; Cook.
1996: Garcia. 1997. 1999; Goldsmith. 1989: Kettle, 1995; Lañe. 1993; Mar-
kell. 1999: Strickland, 2000; Warren. 1990: entre otros) Una importante
fuente de información la tenemos también en los atlas de parasitología para
todo laboratorio que trabaja con parásitos, y que debe estar disponible para
consulta (Ash, 1987. 1997; Brooke, 1984; Isenberg, 1992: Murray, 1999;
Peters, 1989: Spencer, 1982; Sun, 1988). En otros textos se documentan
aspectos específicamente patológicos de la inlección parasitaria (Binford,
1976; Connor, 1997; Gutiérrez, 2000; Orihel, 1995; Marcial Rojas, 1971;
Sun, 1982; Von Lichtenberg, 1991; Woods, 1993). Las infecciones parasita-
rias en los mmunodeprimidos también han sido objeto de revisión (Walzer.
1989)
MÉTODOS DE LABORATORIO
Se han descrito numerosos métodos para la detección e identificación
de parásitos en las muestras clínicas, algunas de las cuales son útiles para
detectar distintas especies, mientras que otras detectan una única especie
en particular. Es preferible para el laboratorio ofrecer un número limitado,
pero competente, de procedimientos a llevar a cabo, en vez de proporcio-
nar una gran variedad de pruebas poco empleadas que puedan resultar
problemáticas. Los análisis de sangre y heces comprenden la mayoría de
los requerimientos clínicos para un estudio parasitológico. Otras muestras
son de uso menos frecuente, como las urogenitales, el esputo, los aspira-
dos y las biopsias. Como cada vez hay nueva información disponible de
algunos de los llamados parásitos emergentes, los laboratorios pueden
necesitar desarrollar y usar métodos adicionales altamente específicos o
encontrar laboratorios de referencia competentes donde llevar a cabo las
pruebas.
Las muestras recogidas para la valoración del laboratorio dependen de la
especie y del estudio del parásito sospechado. El conocimiento del ciclo de
vida del parásito da información de la determinación del tipo, número y fre-
ción de la mayoría de los parásitos sanguíneos. Los frotis finos se prepa-
ran igual que los usados en el diagnóstico diferencial hematológico: la san-
gre se extiende sobre un portaobjetos en una fina capa evitando la
superposición de los elementos celulares. Es importante la integridad de
las membranas celulares para determinar la naturaleza mtracelular o
exlracelular de la inlección. En el frotis grueso, la sangre se concentra en
un área pequeña en la que muchas células yacen en el fondo. Durante la
tinción, los eritrocitos pierden la hemoglobina, de modo que sólo son visi-
bles los núcleos leucootarios. las plaquetas y los parásitos (si estuviesen).
Se prefiere el uso del frotis grueso para el diagnóstico, ya que posee entre
dieciséis y treinta veces más sangre por campo que el frotis fino, incre-
mentándose asi la posibilidad de detectar parásitos reduciendo el tiempo
necesario de examen. La cantidad de sangre estudiada en un frolis grueso
en cinco minutos, usando un objetivo de aceite de inversión (100 x), reque-
riría al menos treinta minutos si se examinase la misma cantidad en un fro-
tis fino. Mientras que la probabilidad de detección de una infección aumen-
ta con el frotis grueso, la identificación de la especie se realiza mediante
examen del frotis fino, ya que así la morfología es más definida, especial-
mente para la malaria Para el examen ordinario, se deberían preparar
ambos tipos de frotis.
Preparación de las extensiones, La sangre para examen puede
obtenerse por punción en el dedo, en el lóbulo de la oreja o por punción
venosa. La sangre de la punción del dedo debe dejarse salir libremente
para evitar su dilución con los líquidos titulares y no debe ser contaminada
con alcohol desinfectante, sino que primero se debe dejar que ésta se
seque. Si se obtiene por punción venosa, se usará la primera gota de san-
gre (sin anticoagulante) para preparar el frotis a la cabecera del paciente.
El uso de anticoagulantes está contraindicado en la sospecha de malaria
porque pueden distorsionar la morfología de los parásitos e interferir en su
tinción. En la práctica, no obstante, la sangre suele remitirse al laboratorio
con anticoagulante, ya que puede ser el único modo de asegurar que se
puedan preparar las extensiones. El anticoagulante más utilizado, en tales
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
casos, es el ácido etilendiaminoletraacético (EDTA). pero debe ser llevado
al laboratorio en menos de una hora para evitar el deterioro de la morfolo-
gía de los organismos. Los anticoagulantes no interfieren en la tinción de
las microfilarias.
Tanto el frotis fino como el grueso se deben preparar en un porta lim-
pio y sin grasa. Los frotis gruesos se preparan poniendo unas cuantas
gotas de sangre en una zona de 1,5 cm de diámetro y dejándolos secar a
temperatura ambiente, casi siempre por la noche. Un frotis grueso debe
ser lo suficientemente fino para que se pueda leer un periódico a su tra-
vés; si fuese demasiado grueso, el frotis puede escurrirse por el portaob-
jetos. El exceso de calor podría fijar los eritrocitos y evitar su deshemo-
globinización.
Tinciones. La sangre empieza a perder su afinidad por las tinciones en
unos tres dias y los Irolis gruesos más antiguos no pierden bien la hemoglo-
bina. Los mejores resultados de la tinción se logran con el uso de la tinción
de Giemsa. ya que la cromatina de las células y la del parásito se tiñe con
viveza, mientras que la hemoglobina de los eritrocitos queda de color rojo
pálido. Es la única tinción que permite ver el punteado entrocitario que se
produce en la infección por algunos parásitos de la malaria. La tinción de
Wright puede usarse para frotis finos, pero tiñe los parásitos peor que el
Giemsa y tiñe los eritrocitos, dejando un fondo poco nítido. Debido a que la
tinción de Wright lleva alcohol como fijador, los frotis gruesos se deben lisar
con agua antes de ser teñidos.
El proceso de tinción con Giemsa requiere mayor atención a la hora de pre-
parar los activos y de realizar el protocolo de tinción, mientras que en el caso
de la tinción de Wright suele estar todo automatizado. Generalmente, el colo-
rante de Giemsa fresco se debe hacer cada día, usando una solución dilu-
yeme con agua tamponada con fosfato. Para lograr una adecuada tinción,
incluyendo la aparición del punteado de Shüflner, el agua tamponada se debe
mantener con un pH entre 6,8 y 7.2. Se debe revisar cada lote de Giemsa
para determinar el tiempo de tinción óptimo y su dilución, ya que hay algunas
variaciones de lote a lote (NCCLS. 2000).
Examen de las extensiones. Tanto los frotis gruesos como los linos
se examinan en su totalidad bajo un objetivo de bajo aumento (10x) para
detectar microfilarias, que no suelen estar en gran número. Particularmen-
te se deben examinar los bordes del frotis fino, ya que las microfilarias se
desplazan allí frecuentemente durante la preparación del frotis. El examen
con aumento de 50x en aceite de inversión puede usarse para la búsque-
da de protozoos en frotis sanguíneos, aunque es aún necesario el examen
en objetivo de aceite de inversión 100x para detectar los parásitos más
pequeños, como Plasmodium spp.. Babesia spp.. y Leishmania spp.
Nuevamente, el examen de los bordes es importante, puesto que los eri-
trocitos son desplazados a una capa de células, permitiendo la evaluación
de su morfología y la existencia de protozoos mtracelulares. Un experi-
mentado microscopisla antes de dar un resultado negativo debe examinar
como poco cien campos con aceite de inversión en frotis gruesos (dedi-
cando cerca de cinco minutos) y doscientos campos en un frotis fino (dedi-
cando al menos quince minutos) usando un objetivo de cíen aumentos
(Ash, 1987).
Técnicas de concentración
Se han descrito una variedad de técnicas especiales para la concenlración
de parásitos sanguíneos, especialmente para leishmanias. tripanosomas y
microfilarias. Los detalles se pueden encontrar en otros textos (Ash, 1987;
Beaver. 1984; Garcia, 1997.1999: Isenberg. 1992; NCCLS, 2000).
La preparación de extensiones tamponadas, que puede realizarse con los
recursos existentes en la mayoria de los laboratorios, es útil para detección
de Leishmania donovani, tripanosomas y microfilarias. Tras la centrifugación
de una muestra de sangre con anticoagulante, la capa de células que queda
entre el plasma y los eritrocitos es recogida y usada para preparar frotis san-
guíneos para teñir o para hacer una preparación en fresco para detectar orga-
nismos móviles (Ash. 1987; Strickland. 2000).
Para la detección de microfilarias, es útil la concentración de Knott o la
filtración de membrana, especialmente cuando la densidad de microfila-
rias en sangre periférica es baja. En la técnica de Knott, la sangre anticoa-
1199
gulada se lisa con formalma al 2% y se centrifuga para concentrar las
microfilarias en el sedimento, que puede ser posteriormente examinado
como una preparación en fresco, o bien se tiñe con Giemsa o hemaloxili-
na. En el proceso de filtración de membrana la sangre es lisada y pasada
a través de un filtro de membrana de 5 pm, que posteriormente es teñida
con hematoxilina para detectar alguna microfilaria (Ash, 1987; NCCLS,
2000).
El uso de naranja de acridina-fluorocromo en un formato de microhemató-
crito (OBC. método de detección de parásitos sanguíneos. Becton Dickinson,
Franklin Lakes. NJ) permite la delección de parásitos sanguíneos y parece
ser más sensible que los tradicionales frotis grueso y fino. Los laboratorios
que detectan malaria infrecuentemente pueden tener dificultades para la inter-
pretación de los resultados con este método, pero sin embargo se les anima
a conservar la experiencia en la realización de las técnicas con los tradicio-
nales frotis sanguíneos (NCCLS. 2000).
Examen de muestras fecales
La identificación de parásitos intestinales se realiza a través del examen
directo de la deposición usando heces acuosas, técnicas de concentración,
tinciones permanentes y, menos frecuentemente, cultivos. Se han hecho
populares los nuevos métodos de inmunoensayo mediante anticuerpos
específicos para detectar antígenos de Giardia lamblia. Cryptosporidium
parvum y Entamoeba histolytica. Los estadios de helmintos más frecuen-
temente vistos son los huevos y larvas, aunque ocasionalmente pueden
verse gusanos enteros o porciones. La infección por protozoos intestinales
se diagnostica por la detección de trofozoítos. quistes u ooquistes. Los
métodos habituales para la identificación de huevos y parásitos (examen
O/P) deberían incluir procedimientos que permitiesen detectar tanto proto-
zoos como helmintos, dejando el uso de técnicas especiales sólo para soli-
citudes especificas. Como existen pocos laboratorios dedicados al examen
parasitológico, deben estar capacitados para realizar un examen directo de
heces frescas acuosas, técnicas de concentración y técnicas de tinción.
Muchas infecciones por protozoos pueden no detectarse a menos que se
realicen exámenes con tinción permanentes (García, 1979,1997; NCCLS.
1997; Price, 1994: Smith, 1996).
Recogida, manejo y conservación de muestras
Una correcta detección e identificación de los parásitos de las muestras
fecales requiere una adecuada recogida y manejo de las mismas. Las mues-
tras antiguas, mal conservadas o contaminadas son de escaso valor. Las
muestras no se pueden recoger en la semana que sigue a la ingestión de sus-
tancias que dejen residuos cristalinos, como componentes antidiarreicos no
absorbibles, antiácidos, bismuto, bario o agentes antimaláricos. Los laxantes
oleosos, como el aceite mineral, también pueden interferir en el examen. El
uso de antibióticos o los medios de contraste pueden disminuir el número de
organismos en el tracto digestivo, especialmente protozoos, durante varias
semanas (Ash. 1987).
Las muestras se deben remitir al laboratorio mientras están frescas o
con los conservantes apropiados. Todas las muestras frescas se deben
examinar en la primera hora tras ser remitidas, y las muestras líquidas
deben examinarse en menos de treinta minutos o ser puestas en con-
servantes para mantener el máximo rendimiento. Estas estrategias ase-
guran que los frágiles protozoos y trofozoítos no sean destruidos inad-
vertidamente. La muestra que no se procese inmediatamente se debe
dejar en una habitación a temperatura ambiente o refrigerada y nunca
colocada en una incubadora, ya que peligraría la integridad de los pará-
sitos.
Las muestras deben ser pasadas directamente a un cartón seco y limpio o
que el paciente defeque sobre un papel encerado y se transfiera una parte a
un recipiente. Las muestras liquidas pueden también ser recogidas en una
cuña limpia. Los contenedores deben tener una tapa hermética y se deben
colocaren una bolsa de plástico antes de llevar al laboratorio. La mezcla inad-
vertida de orina o de agua del inodoro con la muestra puede destruir los pro-
tozoos y trofozoitos, por lo que se debe evitar. También la contaminación con
 I 200 SECCIÓN VI
Tabla 55-3 Fijadores de muestras fecales y técnicas de examen
Técnica de examen
Fijadores , Concentraron
d j r e c 0 p e r
Ninguno (heces Irescas) Si Si
Formatina al 10% Si Si
Fluido de Schaudinn No No
Alcohol polivinilo (PVA)' No No"
PVA modificado' No No'
Mertiolato-yodo-formalina
(MIF) Sí Si
Acetato sódico-lormalina
(SAF) Sí Si
" Aunque las técnicas de concentración con PVA se ha descrito, no son total-
mente usadas debido al problema de reconocimiento de algunos organismos.
' El sulfato de cobre o el sulfato de cinc sustituyen al cloruro de mercurio.
:
Las extensiones preservadas con MIF se deben teñir con policromo IV.
agua o tierra puede introducir accidentalmente organismos de vida libre que
se pueden confundir con los parásitos.
Hay equipos que contienen viales de conservación apropiados para el
examen de extensiones teñidas que están disponibles en el mercado a
bajo precio. Se debe poner inmediatamente una parte de la muestra fres-
ca en estos viales y mezclarlos completamente. Estos equipos son espe-
cialmente útiles para aquellos pacientes a los que es imposible extraer
una muestra fresca en el plazo requerido o para los que han de recoger
varias muestras en días consecutivos. Con la técnica de los dos viales,
una parte se fija en tres porciones de formalina tamponadas al 5%-10%
y otra parte en otras tres porciones de alcohol polivinilo fijador (PVA).
Otros sistemas de conservación disponibles son: mertiolato-yodo-forma-
lina (MIF) y acetato sódico-formalina (SAF) (Tabla 55-3). El SAF tiene la
ventaja de que puede usarse para tinciones permanentes, para el estu-
dio en fresco y para procedimientos de concentración y además no con-
tiene mercurio, que sí está presente en los fijadores de Schaudinn y PVA.
Además de ser venenoso, el mercurio puede presentar problemas de eli-
minación en muchos estados. Sin embargo, la calidad de las tinciones
permanentes con el SAF no es tan buena como con los fijadores de
Schaudinn y del PVA. El PVA con base de sulfato de cinc y otros nuevos
productos comerciales van ganando popularidad y su uso está indicado
cuando los componentes con mercurio no se puedan utilizar (García.
1993, 1997: NCCLS, 1997).
El examen de tres muestras recogidas en días alternos es el mínimo
necesario para realizar una adecuada evaluación E/P (NCCLS, 1997:
Smith. 1996). Este procedimiento asegura un intervalo óptimo de recogi-
da de aquellos parásitos que poseen una eliminación cíclica, especial-
mente Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis. El uso de purgantes
puede dar una sensibilidad adicional para detección de parásitos como E.
histolytica. El laboratorio debe ser avisado antes del comienzo de la purga
para tener personal disponible para el proceso. Las muestras han de reco-
gerse en contenedores diferentes y ser remitidas al laboratorio en pocos
minutos. Se recomiendan purgantes como el sulfato sódico o el fosfato
sódico tamponado.
Examen macroscópico
Se debe examinar de un modo general la consistencia de las heces
(formadas, blandas, acuosas, descompuestas) y si hay presencia de
moco, sangre, larvas o gusanos adultos y proglótides. Los protozoos y tro-
fozoítos se encuentran fácilmente en muestras acuosas o descompues-
tas, mientras que los quistes predominan en las muestras blandas o for-
madas. Los helmintos o sus huevos se pueden encontrar en cualquier tipo
de heces. La mayoría de los parásitos se distribuyen de modo uniforme en
• MICROBIOLOGÍA MÉDICA
la muestra, aunque algunos huevos (especialmente esquistosomas) pue-
den pasar al torrente fecal en el colon descendente y el recto y distribuir-
se irregularmente, como puede ocurrirle a los huevos de Taenia spp. Los
trofozoílos de los protozoos pueden ser más numerosos en la parte final
m a n e n t e
de la deposición y deberían ser buscados específicamente en la mucosi-
Si dad (Smith, 1996).
No
Si
Sí Examen microscópico
Si
Las muestras se deben examinar microscópicamente por examen directo
No' de material fresco o conservado, por examen de los concentrados o con tin-
Sí ción permanente. Cada procedimiento tiene sus ventajas e inconvenientes. La
humidificación de las heces frescas con suero salino permite la detección y
observación de trofozoítos móviles de protozoos y larvas de helmintos, El
estudio de heces conservadas puede permitir la detección de parásitos que
no se concentren bien. Los procesos de concentración son de mayor rentabi-
lidad para la detección de quistes de protozoos y huevos de helmintos, así
como de larvas, pero no es satisfactorio para la detección de trofozoítos de
protozoos. Las tinciones son útiles para la delección y el examen morfológico
de los trofozoítos de los protozoos y los quistes.
Las circunstancias para llevar a cabo cada procedimiento dependen del
tipo de muestra (formada, blanda, descompuesta, acuosa). Generalmente,
las muestras frescas blandas, descompuestas o acuosas deben tener los
tres procedimientos de manejo (Smith, 1996). Las muestras acuosas se
deben concentrar por centrifugación simple mejor que por flotación o con-
centración con formalina-etil acético. El estudio directo se puede omitir si la
muestra llega con conservantes (NCCLS, 1997). Como mínimo, las mues-
tras tomadas se deben estudiar por un proceso de concentración, aunque
se ha demostrado un gran rendimiento cuando se emplea una tinción (Gar-
cía, 1979,1997).
Estudio directo en fresco. El estudio directo es uno de los más fáci-
les de realizar entre los estudios parasitológicos, aunque la correcta inter-
pretación requiere un examen cuidadoso y gran experiencia en el uso del
microscopio. Es más útil cuando las muestras frescas se examinan para
trofozoítos móviles o larvas de helmintos (especialmente residuos líquidos
o aspirados duodenales). Una pequeña cantidad de muestras se mezcla
con una gota de suero salino al 0,85% y se cubre con un cubreobjetos. La
preparación ha de ser lo suficientemente densa para permitir leer un perió-
dico a su través.
El examen de la totalidad del portaobjetos se ha de hacer sistemática-
mente con el objetivo de bajo aumento (10x), con el diafragma del micros-
copio cerrado para aumentar el contraste. Los objetos sospechosos y aqué-
llos retráctiles, como los quistes de los protozoos, se deben examinar con
el objetivo de gran aumento (40x). La detección del movimiento de amebas
de movimiento lento requiere un examen durante al menos 15 segundos. En
ausencia de imágenes sospechosas, por lo menos se ha de examinar un
tercio de la preparación con el objetivo de 40x. El uso del objetivo de acei-
te de inversión no se suele utilizar a menos que el cubreobjetos se haya
sellado con esmalte de uñas o vaspar (una mezcla al 50:50 de jalea de
petróleo y parafina).
Se debe hacer una segunda preparación igual salvo que se añada una gota
de yodo Lugol al 1:5, o una preparación equivalente, en vez del salino, El uso
de yodo Lugol o yodo Gram produce la agrupación del material, por lo que se
desaconsejan. El yodo es útil para incrementar la visibilidad de las estructu-
ras nucleares en los quistes de protozoos y para la detección de inclusiones
de glucógeno. Entre sus limitaciones se incluye una pérdida de la motilidad de
los trofozoítos y de la refractilidad de los quistes, así como la dificultad para
reconocer los cuerpos cromatoides.
Técnicas de concentración. Las técnicas de concentración, que se
pueden realizar con material fresco conservado (Tabla 55-3), son más
sensibles que el estudio directo para detectar quistes de protozoos y hue-
vos de helmintos y sus larvas, debido a que disminuye el material de des-
echo en las preparaciones y, en la mayoría de las ocasiones, se concen-
tran los organismos. Aunque se han descrito gran variedad de métodos y
modificaciones, algunos son útiles sólo para parásitos específicos (Ash,
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
1987: Barnes, 1984; García, 1997, 1999; Melvin. 1982: NCCLS, 1997)
Para el uso sistemático, se debe seleccionar un método que permita la
detección de quistes de protozoos y huevos de helmintos. Los métodos
de concentración se basan en los principios de sedimentación y flotación.
En la sedimentación, los parásitos más pesados emigran al fondo debido
a la gravedad o por centrifugación. En la flotación, los quistes y huevos
más ligeros suben a la superficie de una solución de alta densidad. Los
dos procesos de concentración más usados en los EE.UU. son las técni-
cas de flotación centrífuga con sulfato de cinc (técnica de Faust) y la
sedimentación con éter-formalina (técnica de Ritchie o modificaciones).
En la práctica, el etil acético ha sustituido al éter en el último método
debido al peligro de su uso y a unos resultados superpombles (Truant.
1981).
La concentración con formalina-etil acético es una técnica de sedimenta-
ción básica que es eficiente en la recuperación de la mayoría de los quistes
de protozoos, larvas y huevos de helmintos, incluyendo los huevos con
opérculo, y tiene una moderada efectividad para los huevos de esquistoso-
mas. Con esta técnica se consigue menos distorsión de los quistes que con
la flotación con sulfato de cinc. Sin embargo, los huevos de Hymenolepis
nana se pueden perder y la concentración de G. lamblia y de los quistes de
lodamoeba bütschlii puede ser defectuosa. Para una correcta concentración
de ooquistes de coccidios y esporas de microsporidios se debe prestar
atención a la velocidad y tiempo recomendado de centrifugación (Isenberg,
1992; NCCLS. 1997). A pesar de estos problemas, la técnica es común-
mente empleada por su simplicidad y su disponibilidad en la mayoría de los
laboratorios.
Con la técnica de flotación de sulfato de cinc, la muestra fresca se pro-
cesa usando sulfato de cinc con una densidad específica de 1,18, y la
muestra lormalinizada se procesa con una solución de una densidad de
1.20. Los elementos parasitarios se recuperan de la capa superficial de la
solución Iras la centrifugación. Esto produce una preparación más limpia
que la de formalina-etil acético, pero es inútil para la detección de larvas
de nematodos, huevos inlértiles de Ascaris y huevos de la mayoría de los
tremátodos y de las tenias. También puede haber problemas con las
muestras que contienen gran cantidad de grasas. El uso de material for-
malinizado en vez de fresco ayuda a limpiar los muestras y previene la
apertura de los que opérculos y la distorsión de los parásitos (Bartlett,
1978).
Tinciones permanentes. El uso de preparaciones teñidas permite guar-
dar permanentemente las muestras y su revisión por distintos médicos cuan-
do aparezcan dificultades de identificación. De todos los métodos descritos
para el estudio de las muestras fecales, únicamente la tinción permanente es
la diseñada para el uso del objetivo de aceite de inversión (100x). La tinción
es más útil para la detección de trofozoítos y quistes de protozoos, que pue-
den reconocerse cuando la preparación en fresco y los concentrados sean
negativos. Aunque no suele ser úlil para la detección de huevos o larvas de
helmintos, las tinciones son más sensibles para detectar inlección por proto-
zoos y se recomienda su uso para todas las muestras remitidas para estudio
de O/P (NCCLS, 1997).
Se han descrito una gran variedad de técnicas de tinción y sus modifica-
ciones con todas sus ventajas y desventajas. La tinción de tncromo de
Wheatley y la tinción de hierro-hematoxilina son métodos que permiten
detectar amebas y flagelados. Desafortunadamente, la detección de la
mayoría de las infecciones humanas por coccidios y microsporidios requie-
ren tinciones especiales. Pueden aparecer muchos problemas técnicos a la
hora de realizar la tinción. La mayoría dependen del tiempo transcurrido tras
la toma de la muestra, de la extensión y de la fijación, asi como de la cali-
dad de los reactivos. Se deben realizar controles positivos de extensiones
conocidas con cada batería de extensión. Esto es especialmente cierto para
la realización de tinciones más especificas para coccidios y microsporidios.
Otros tintes menos comúnmente usados, como la tinción policroma IV, usa-
dos con muestras preservadas con MIF y la tinción de negro clorazol E para
muestras en fresco no se revisan aquí y los detalles se pueden encontrar en
otros textos (García, 1997).
Tinción de tricomo de Wheatley. En los EE.UU. la modificación de
Wheatley del método de tricromo sigue teniendo gran aceptación por su sim-
1201
plicidad, fiabilidad y su bajo coste. Los detalles de su realización se pueden
encontrar en muchos textos (Isenberg, 1992; Melvin, 1982: NCCLS, 1997;
Price, 1994). Con tricromo se pueden teñir muestras que se han lijado con el
fijador de Schaudinn o PVA o muestras conservadas con SAF o MIF, pero los
resultados son menos satisfactorios.
Tinción de hierro-hematoxilina. Esta técnica es mas difícil de llevar a
cabo que el tricromo. pero tiene mejores resultados debido a que incremen-
ta la definición del núcleo y las características del citoplasma (Price, 1994).
Una tinción modificada del hierro-hematoxilina que puede ser útil es la que
incorpora carbol-fucsina, permitiendo la tinción de organismos ácido resis-
tentes, como Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora (NCCLS. 1997; Pal-
mer. 1991). Las muestras fijadas con SAF. Schaudinn y PVA pueden teñirse
con hierro-hematoxilina (tinción preferida para el SAF).
Tinciones ácido-resistentes modificadas. Los ooquistes de
Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora son difíciles de reconocer en
extensiones teñidas con tricromo o hierro-hematoxilina. pero se pueden
detectar con la técnica de tinción acido-resistente. como la modificada Kin-
youn. la modificada de ácido-resistente dimetil-sulfóxido (DMSO) o la aura-
mina-0 (Bronsdon, 1984; Current, 1991: Ma, 1983: NCCLS, 1997). Las tin-
ciones ácido-resistentes son sensibles y eficientes para la detección de
estos protozoos, pero pierden especificidad. Se debe prestar especial
atención a los criterios morfológicos cuando se usan estas tinciones y es
obligatorio el uso de controles positivos Para aquellos laboratorios en los
que Cryptosporidium se aisla, rara vez se recomienda el uso de reactivos
de alta especificidad y sensibilidad. Las muestras biliares, los esputos, las
heces en fresco o fijadas con formalina o SAF se deben teñir con tinciones
ácido-resistentes.
Tinciones para microsporidios. Los microsporidios (específicamente
Enterocytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestmalis. junto con un gran
número de otras especies) se han implicado como agentes comunes de
procesos diarreicos, especialmente en inmunosuprimidos, aunque su
detección ha sido problemática. Aunque la biopsia y la microscopía elec-
trónica han sido una clave de sus diagnósticos, se han descrito procedi-
mientos de tinción para ser llevados a cabo en el laboratorio. Una tinción
del tricromo modificada con una concentración aumentada (diez veces) y
2F¡ cromotropo con un incremento en el tiempo de tinción ha ganado acep-
tación como estudio para la identificación de esporas de microsporidios
(Weber, 1994). Las técnicas de tinción fluorescente mediante el uso de
agentes blanqueantes ópticos como el Uvitek-2B y el calcoflúor blanco
también son útiles para el screening rápido y sensible de heces y otras
muestras (DeGirolami. 1995: Didier. 1995: Luna. 1995; van Gool. 1993). El
pequeño tamaño (1,5 pm-3 pm) de estos organismos hace su detección
difícil, y estos estudios no deberían realizarse sin una adecuada compara-
ción con el control.
Técnicas adicionales para el examen de parásitos
entéricos
Técnica de papel de celofán para oxiuros. La hembra del oxiuro,
Enterobius vermicularis. emigra desde el colon a la piel penanal, donde
deposita sus típicos huevos fecundados. Los huevos, y a veces los gusa-
nos adultos, se pueden detectar por el examen de un trozo de adhesivo de
celofán o con los equipos comerciales de recolección de pegado en la piel
perianal. Los huevos o los adultos no suelen encontrarse en las heces, por
lo que se considera una muestra inapropiada para la detección de este
parásito. Las muestras se deben tomar por la noche, cuando los gusanos
son activos, o a primera hora de la mañana, antes de la ducha o de la
deposición. Se deben examinar vanas muestras de diferentes días antes
de descartar infección.
Estudio de los huevos. La estimación de la carga de gusanos es a
veces necesaria para evaluar la eficacia terapéutica o la tasa de reinfección
por nematodos intestinales (Ascaris. Trichuris y uncinarias) y. ocasional-
mente, esquistosomas. Los procedimientos incluyen el método de extensión
 1202 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

directa de Beaver. recuento de huevos con la dilución de Stoll, frolis grueso las gasas y se depositan en la base del embudo, donde se pueden recoger
de Kato y diversas modificaciones (Ash. 1984; Beaver. 1984: García, 1997). para su examen. La recuperación de larvas puede ser superior a la técnica
Hay grandes variaciones en los resultados con estos estudios, y la signifi- de cultivo, ya que examina una gran cantidad de heces. En las infecciones
cación clínica del nivel de recuento de huevos varia según la especie infec- latentes por Strongyloides. en las que hay pocas larvas, pueden requerirse
tante, la edad de la persona y el estado nutricional (Beaver, 1984). varios exámenes a lo largo de una semana para demostrar la infección
Los métodos de incubación de huevos se usan para detectar la presencia (Ash. 1987).
de esquistosomiasis en infecciones leves y para determinar su viabilidad.
Los huevos fecundados de esquistosomas contienen un miracidio que se Objetos semejantes a parásitos entéricos
incuba en varias horas tras ser colocados en agua sin cloro. En la práctica,
la orina o las heces se mezclan con diez partes de agua y se colocan en un Hay una gran variedad de objetos que pueden parecerse a diferentes
matraz de Erlenmeyer. La parte superior del vaso se tapa con papel de plata parásitos y que se pueden ver en las heces y en otras muestras enviadas
y se coloca bajo una lámpara de mesa. Los miracidia incubados son muy para examen. Es necesaria una cuidadosa diferenciación de estos objetos
fototrópicos y se acumulan cerca de la luz. Los huevos, si los hay. pueden para evitar un innecesario o inadecuado tratamiento. Los leucocitos, los
ser examinados por su viabilidad, mediante el estudio de los movimientos macrófagos y las células epiteliales, escamosas y columnares se pueden
ciliares dentro de las células llama (excretoras). asemejar a las amebas; la levadura y los granulos de fécula pueden pare-
cerse a quistes de protozoos; las conidias fúngicas y pólenes pueden con-
Cultivo de nematodos y técnicas de detección. Se usan muchas fundirse con huevos helmintos: las fibras o la piel de las plantas pueden
técnicas de cultivo (coprocullivos) para la detección e identificación de los simular larvas de nematodos, y los trozos de vegetales parecerse a gusa-
distintos nematodos infectantes, entre los que se cuentan el cultivo con fil- nos adultos o proglótides. (Tabla 55-4). Los ejemplos de artefactos y seu-
tro de papel Harada-Mori, el cultivo en filtro de papel inclinado y el cultivo doparásitos se pueden revisar en otros textos (Ash, 1997; Garcia. 1997;
en carbón vegetal (Ash, 1984; Beaver 1984: Garcia, 1997). La diferencia- Isenberg, 1992; NCCLS, 1997).
ción entre lombrices y tricostrongiles según la morfología de los huevos es
difícil, mientras que la larva en fase infectiva es mas fácilmente identifica-
ble. Tales técnicas de cultivo pueden también ser útiles para la detección de Examen de muestras urogenitales y otras muestras
larvas de Strongyloides. que pueden estar en escaso número, y para dife-
renciarlas de las lombrices uncinarias. Con todos los métodos de cultivo, las (esputos, aspirados y biopsias)
heces son incubadas en un ambiente húmedo que permite lograr la incuba-
Los productos vaginales y uretrales, secreciones prostáticas u orina se
ción de los huevos. En las técnicas de arada-Mori y del filtro de papel incli-
pueden remitir a laboratorio para la detección de Trichomonas vaginalis.
nado, las larvas emigran desde las heces a la fase acuosa, donde se pue-
El método más rápido y efectivo es la preparación de varias extensiones
den detectar con más facilidad. En el cultivo del carbón vegetal las larvas
con una gota de muestra (se debe centrifugar la orina) diluida con una
migran primero a una gasa húmeda que se coloca en agua, permitiendo su
gota de suero salino y cubriendo con un cubreobjetos. Se examina con
colonización.
un objetivo de bajo aumento (10x) en condiciones de poca luz para ver
La técnica de Baermann es una técnica sensible y fiable para la delec- los trofozoítos móviles, que poseen un movimiento espasmódico. Los
ción de Strongyloides y otras larvas de nematodos a partir de muestras exámenes con gran aumento pueden revelar el movimiento de los flage-
fecales. En esta técnica, las heces se colocan en varias capas de gasas en los y las características ondulantes de las membranas. El uso de cultivo,
la parte superior de una pantalla de alambre que se suspende en un embu- anticuerpos fluorescentes, o técnicas de ácido desoxirribonucleico (ADN)
do. El extremo del embudo está cerrado con una abrazadera y se añade aumenta la sensibilidad si es necesario (Briselden, 1994). Se precisan
agua hasta el nivel de la gasa. Las larvas emigran activamente a través de cultivos de los organismos para demostrar las resistencias a los fárma-
cos imidazólicos (Meri, 2000).
En el esputo se pueden hallar un gran número de protozoos y helmintos,
y la técnica a usar depende del organismo sospechado. Generalmente la
Tabla 55-4 O b j e t o s e n c o n t r a d o s e n las m u e s t r a s fecales técnica requerida para detectar un parásito en su sitio habitual se aplica al
q u e p u e d e simular parásitos entéricos esputo. Cuando se sospechan amebas, se deben hacer tinciones perma-
Tipo de artefacto Semejanza nentes. Son apropiadas las tinciones ácido-resistentes o anticuerpos espe-
cíficos para Cryptosporidium. mientras que las tinciones tricromo o lluoro-
Neutrófilos Quisles de Entamoeba histolytica
cromo se deben emplear para detectar esporas de microsporidios. Las
Macrófagos Trofozoilos de Entamoeba histolytica
técnicas de identificación para Pneumocystis carinii se describen en otro
Células del epitelio Trofozoilos de amebas
columnar apartado.
Células del epitelio Trofozoílos de amebas Para el examen de aspirados se necesita el empleo de las tinciones ade-
escamoso cuadas para el germen implicado. Además de los métodos utilizados para
Levaduras Quistes de protozoos (especialmente
Endolimax nana) espulo, la tinción de Giemsa es habitualmente apropiada para el examen de
Conidias do hongos Huevos de helmintos protozoos, especialmente los hemoflagelados. Los biopsias se deben remi-
Esporas de champiñón Huevos de helmintos tir para estudio histológico tras haberse hecho extensiones y tras ser pre-
Células de plantas Quistes de protozoos, huevos paradas para la tinción con Giemsa u otros tintes permanentes. El cultivo
de helmintos para leishmanias y tripanosomas también puede hacerse en tejidos y puede
Hebras de plantas Larvas nematodos ser importante para demostrar estas infecciones. Las biopsias cutáneas
Polen Huevos de helmintos
(Ascaris o huevos de tenia) mandadas para Onchocerca o Mansonella deben separarse en salino y ser
Diátomos Huevos de helmintos examinadas a los 30 y 60 minutos para microfilarias. La biopsia muscular
Granulos do fécula, gotas Quistes de protozoos para las larvas de Trichmella spiralis se debe examinar mediante la coloca-
de grasa, burbujas de ción de las muestras frescas en dos portas de cristal o para estudio histoló-
aire, moco gico habitual. Las biopsias de recto o vejiga se pueden examinar para bus-
Huevos de ácaros ingeridos Huevos de helmintos car huevos de esquistosomas.
Huevos ingeridos de Huevos de helmintos
nematodos de las plantas
Larvas ingeridas de Larvas de nematodos
nematodos de las plantas Técnicas de cultivo parasitario
Adaptada de Isenberg HE (ed): Clinical Microbiology Procedures Handbcok.
Se han descrito métodos de cultivo para una gran variedad de proto-
vols t y 2. Washington. DC. American Society for Microbkxógy, 1992
zoos, pero pocos laboratorios químicos se toman el esfuerzo debido a su
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA 1203

Tabla 55-5 P r u e b a s de anticuerpos, antigenos y A D N para mosis o la toxocariasis no se pueden diagnosticar fácilmente por criterios
el diagnóstico de e n f e r m e d a d e s parasitarias* morfológicos, y los estudios invasivos no se recomiendan en primera
medida. Las diarias, los esquistosomas y Strongyloses pueden perma-
Enfermedad Métodos Método de
detección de necer subclinicas debido a infecciones leves o al estadio de la latencia
parasitaria serológicos antigenos o A D N clínica. En esas circunstancias, la evaluación serologica puede resultar
útil, especialmente en individuos que han viajado a zonas endémicas sin
Protozoos residir en ellas.
Amebiasis DD, EIA, IHA EIA
Babesiasis IFA Ya que los test serológicos se piden rara vez, las muestras se remiten a
Enfermedad laboratorios de referencia (centros para el control y prevención de enferme-
de Chagas CF, EIA, IFA, IHA dades [CDC]). Algunos de los tesl más comúnmente usados pueden estar dis-
Criptosporidosis EIA. DFA. IFA ponibles en centros locales, entre los que se incluyen toxoplasmosis, ame-
Giardiasis EIA. DFA, IFA biasis y triquinosis.
Leishmaniasis CF IFA
Malaria IFA IC Los criterios de interpretación vienen establecidos por los fabricantes, y los
Toxoplasmosis EIA. IFA, IHA DFA. IP reactivos pueden variar en los diterentes centros. Las peticiones individuales
Trichomoniasis EIA, DFA. prueba de estos test deben cuestionarse acerca de las características de realización,
de ADN incluyendo sensibilidad y especificidad, y deben estar sobre aviso de que pue-
Helmintos den producirse reacciones cruzadas. Además, las serologías de las enferme-
Triquinisosis EIA. BF, IHA dades parasitarias no diferencian entre infección activa e infección pasada,
Toxocariasis EIA punto impodante cuando se estudia a alguien que ha residido en áreas
Estrongiloidiasis EIA IHA
endémicas.
Filariasis EIA, IHA
Cisticercosis EIA, IHA. IB Hay métodos de detección antígena disponibles para muchas enfermeda-
Equinococosis IHA. IEP. DD (arcS), IB des parasitarias que incluyen amebiasis, criptosporidiosis, giardiasis, malaria,
Esquistosomiasis EIA. IB y tricomoniasis (Tabla 55-5) y pueden ser útiles en aquellos casos en que los
Paragonimiasis EIA. IB test tradicionales son negativos y persiste una alta sospecha clínica Estos
" Equipos disponibles en comercios o en laboratorios de referencia o de salud estudios tienen la ventaja de detectar la infección actual y pueden ser reali-
publica. zados por personas sin demasiada experiencia (Wilson, 1995).
BF lloculacion do benlonila. CF fijación de complemento. DA aglutinación
directa; DD difusión doble: DFA: anticuerpos de fluorescencia directa; EIA:
enziomoinmunoensayo; IB mmunoblotl, IC inmunocaplura: IHA hemaglutina-
cion indirecta; IFA: anticuerpos de fluorescencia indirecta, IP inmunoperoxida-
sa: IEP: inmunoeleclroloresis Métodos de diagnóstico molecular
Adaptada de Wilson M, y Schantz P. Pieniazek, N Diagnosis ol parasitic infec-
tions: Inmunologic and molecular methods En Murray PR. Barron EJ. Pfaller y El uso de métodos diagnósticos mediante la amplificación de ADN y áci-
cois (eds ) Manual of Clinical Microbiology, 6 ' ed Washington, DC. ASM Press. dos nucleicos se ha descrito para la mayoría de las enfermedades parasi-
MA. 1995. p 1.159.
tarias más frecuentes y tiene una gran sensibilidad y especificidad (Per-
sing, 1993; Weiss, 1995; Wilson, 1995). Sin embargo, la mayoria de estas
técnicas han permanecido para un uso de investigación y no están dispo-
nibles para uso habitual (Bendall. 1993). Como dato, el equipo y otros
materiales necesarios, incluido el personal entrenado en biología molecu-
escaso empleo y a la pobre familiaridad con dichos métodos. Cuando se lar, han permanecido fuera del alcance de la mayoría de los laboratorios de
hace una petición de cultivo suele ser para Trichomonas vaginalis. Leis- diagnóstico debido a limitaciones fiscales. Aunque hay gran variedad de
hmania spp., Trypanosoma cruzy, Enlamoeba histolytica. Acanlhamoeba equipos disponibles para el diagnóstico de bacterias y virus, sólo un equi-
spp o Naeglena lowlen. Además, ocasionalmente se pide a los laboratorios po ha recibido la aprobación para un parásito como es Trychomonas vagi-
cultivos para Toxoplasma gondii. Una revisión de los métodos se puede nalis (Briselden. 1994). Los métodos moleculares pueden tener una gran
encontrar en otros textos (Ash. 1987; Fritsche, 1989a: Garcia. 1997: Isen- importancia en la identificación de los vectores de los parásitos y contribuir
berg. 1992; Murray. 1999: NCCLS. 1997). a la prevención mediante programas de control contra dichos vectores
(Weiss. 1995).

Métodos de inmunodiagnóstico
Los métodos de inmunodiagnóstico para la detección de anticuerpos o
antigenos en las enfermedades parasitarias son muchos, pero tienen gran
variabilidad de sensibilidad y especificidad, así como de disponibilidad. El
tema está más allá del propósito de este capítulo, pero se puede encontrar
una revisión asequible (Wilson, 1995). Los test disponibles para uso sanita-
rio, hospitalario o comercial se resumen en la Tabla 55-5.
Históricamente, los procedimientos serológicos para enfermedades para-
sitarias eran desestimados por su baja sensibilidad y especificidad, debido
principalmente a la compleja naturaleza antigénica de los parásitos y la posi-
bilidad de reacciones cruzadas entre las especies descritas. La introducción
de nuevos test, combinados con el uso de componentes altamente antigéni-
cos. está dando mejores resultados con grandes valores predictivos. La
mayoría de los nuevos test utilizan el enzimoinmunoensayo (EIA) o el inmu-
noblot (Western blot), aunque aún son populares la inmunofluorescencia
indirecta (IFA), la hemaglutinación indirecta (IHA). la fijación de complemen-
to (CF) y la lloculacion de bentonita (BF).
El uso de test serológicos en el diagnóstico de enfermedades parasi-
tarias es un suplemento a los métodos habituales de diagnóstico que
intentan detectar el parásito de un modo directo en las heces, la sangre,
los tejidos o los Huidos corporales. Ciertas infecciones como la toxoplas-
Control de calidad, de mejora y seguridad
El programa de segundad para la sección de parasitología del laborato-
rio es semejante al de otras secciones del laboratorio, cubriendo todos los
aspectos esenciales del trabajo, incluidos, entre otros, un manual del pro-
ceso completo que debe ser revisado anualmente, guias de mantenimiento
de todas las muestras y de recogida de datos, así como de los resultados,
programa completo de control de calidad con la apropiada supervisión téc-
nica y revisión, y la participación en programas de competencia. Los labo-
ratorios también necesitan centrarse en la satisfacción del cliente, median-
te la participación en el equipo de trabajo con cuestionarios de opinión, en
la identificación de problemas y en la generación de soluciones para la
mejora de calidad.
Para el rendimiento de la sección de parasitología, se deben monitorizar
periódicamente muestras desconocidas, tanto internas como extemas, y se
debe actualizar la competencia, especialmente en aquellos laboratorios con
escaso volumen de muestras. Debe existir un material de referencia disponi-
ble para el uso del laboratorio que incluya muestras positivas, atlas impresos
y atlas de preparaciones.
Se deben considerar potencialmente infecciosas las muestras sin pre-
servar. Toda la sangre y fluidos corporales se deben manejar de acuerdo
 1204 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
con las normas universales de precaución realizadas por la administración
de salud y seguridad laboral (Federal Register, 1991). Además de los virus de
transmisión sanguínea, los parásitos de la malaria y los hemoflagelados
también pueden ser infecciosos. Una gran cantidad de parásitos pueden
seguir siendo infectivos en muestras de heces frescas, como los quistes
de protozoos entéricos, los huevos de Taenia sotium. Enterobius vermicu-
larís H. nana, y las larvas de Strongyloides stercoralis. Trichuris trichiura,
Ascaris lumbricoides y las uncinadas pueden persistir infectivas en mues-
tras antiguas, y los huevos de Ascaris pueden sobrevivir en formalina al
5%. Las muestras fecales también pueden contener patógenos como Sal-
moneiia, Shigella o virus, Es esencial una observación cuidadosa del
manejo de las muestras. También es necesaria una especial atención al
lavado de las manos. En uso de etil acético en vez de éter en las técnicas
de concentración es recomendable para evitar la posibilidad de explosión
(Truant, 1981).
PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES
Malaria
La malaria (del italiano malaria, que significa mal aire) es una infección
aguda y a veces crónica del torrente sanguíneo que se caracteriza por fie-
bre, anemia y esplenomegalia, y es provocada por parásitos apicomplejos
del género Piasmodium. Los hallazgos clínicos defimloríos de un ataque de
1
malaria consisten en escalofríos, fiebre (mayor de 40 C), diaforesis gene-
ralizada, seguidos por el cese de la fiebre. Las crisis se producen cada 6-
10 horas y se desatan por la ruptura sincrónica de eritrocitos, de los que se
libera una nueva forma infecciosa conocida como merozoito. La enferme-
dad se produce generalmente entre los 45" norte y 40° sur de latitud
(WHO, 1987) y se transmite únicamente por mosquitos Anopheles hembra.
Las cuatro especies de Piasmodium que producen la malaria humana son
P. vivax. P. lalciparum. P. malariae y P. ovale. La infección por P. falciparum
se da principalmente en zonas tropicales de todo el mundo, mientras que
las infecciones por P. vivax se producen tanto en zonas tropicales como
templadas. P. malariae también se da en todo el mundo, pero mucho
menos extendido que P. lalciparum o P. vivax. P. ovale es el menos fre-
cuente de la malaria, siendo la mayoría de los casos en el oeste de África,
India y Sudamérica.
Dado que la infección de la malaria es potencialmente tratable, se debe
considerar en el diagnóstico diferencial de la fiebre de origen desconocido y
en historia de viajes a zonas endémicas. En una era de creciente empleo de
los viajes por todo el mundo, el riesgo de contraer malaria no es insignifican-
te, y la rápida extensión de las resistencias a los fármacos se debe conside-
rar a la hora de valorar una profilaxis o un tratamiento.
La evaluación del laboratorio ante la sospecha de la malaria sigue
basándose en el examen de los frotis grueso y fino de la sangre, para
objetivar los parásitos intraeritrocitarios. Aunque su aproximación diag-
nóstica es sencilla, la realización de estas técnicas puede ser problemáti-
ca. La identificación de este organismo requiere un entrenamiento conti-
nuo para mantener la experiencia, por lo que los laboratorios que no
suelen ver muchos casos pueden optar por mandar las muestras a labo-
ratorios de referencia.
Otros métodos más avanzados de laboratorio, incluidas la tinción naranja-
acridína (véase Métodos de laboratorio) o la detección del ADN específico
(Lanar, 1989; Persing. 1993; Weiss, 1995), dan una mayor sensibilidad y
especificidad pero no suelen estar disponibles en laboratorios pequeños. El
reciente desarrollo de los ensayos inmunológicos para la detección de lacta-
to deshidrogenasa específica de Piasmodium parece dar una alta sensibilidad
y especificidad en el diagnóstico de la malaria. Uno de estos test, realizado
con una tira de reactivo, es especialmente prometedor en aquellas situacio-
nes donde la facilidad de la realización de los estudios es crítica y hay esca-
sez de medios (Piper, 1999; Palmer. 1998).
Ciclo vital. Los parásitos de la malaria tienen una fase sexual (esporo-
gonia) en el mosquito Anopheles. que produce esporozoítos infecciosos, y
un estado asexual (esquízogonia) en los humanos que deriva en esqui-
zontes y merozoítos (Fig. 55-1). En el torrente sanguíneo algunos mero-
zoítos se diferencian en gametocitos (gametogonias), que. cuando son
digeridos por un mosquito hembra de Anopheles, maduran a microgame-
tos masculinos y macrogametos femeninos. La lusión de un microgameto
y un macrogameto da lugar a un oocineto móvil que emigra a través de la
pared de estómago y forma un ooquiste. Dentro del ooquiste se forman
numerosos esporozoítos móviles. La ruptura del ooquiste maduro en la
cavidad corporal libera esporozoítos que emigran a través de los tejidos de
las glándulas salivares, desde donde pasan a huéspedes vertebrados
cuando el mosquito se alimenta. El tiempo requerido para el desarrollo en
el mosquito es de 8-21 días.
Los esporozoítos en los vertebrados alcanzan las células hepáticas en
pocos minutos e inician una fase de proliferación conocida como esquízogo-
nia exoeritrocitaria. La liberación de merozoítos tras la ruptura de los esqui-
zontes hepáticos o la ruptura de esquizogonias eritrocitarías produce la infec-
ción del torrente circulatorio, causando la clínica de la malaria. P. vivax y P.
oválese diferencian de P. lalciparum y de P. malariae en que las recaídas por
especies antiguas pueden producirse semanas o meses después tras el pri-
mer brote. Esto es consecuencia de la renovación de las esquizogonias exoe-
ritrocilarias, y a veces eritrocitarías. a partir de esporozoítos hepáticos laten-
tes que se conocen como hipnozoitos (Krotoski, 1982). Las recurrencias
debidas a P. lalciparum o P. malariae, llamadas recrudescencias, se deben a
un incremento en el número de formas sanguíneas hasta niveles clínicamen-
te detectable, no a formas hepáticas persistentes. Los hepatocitos se infectan
sólo por esporozoítos a través del mosquito, de este modo la infección por P.
vivax o P. ovale adquiridas por transfusión no recidivan.
Los merozoítos liberados de los hepatocitos afectados infectan a los eri-
trocitos. La consiguiente amplificación del parásito en el torrente sanguíneo
durante un tiempo y su aparición sincrónica desata las crisis de malaria. Los
parásitos de P. vivax y P. ovale infectan a los eritrocitos jóvenes, mientras
que P. malariae infecta a los viejos y P. falciparum a los eritrocitos de cual-
quier edad.
Los estadios morfológicos observados en los eritrocitos incluyen trofozoi-
tos (formas en crecimiento), esquizontes (formas en división) y gametocitos
(formas sexuales) (Láminas 55-1 a 55-4). Los trofozoítos más jóvenes tienen
un contorno globuloso o con una vacuola central, una masa de cromatina
roja y un citoplasma azul. En frotis teñidos, los trofozoítos se asemejan a ani-
llos de sello y se describen como anillos o con forma anular. Los trofozoítos
en crecimiento tras la fase de anillo mantienen una única masa de cromati-
na, pero tienen un citoplasma abundante que puede ser compacto o ame-
boide (irregular). Los trofozoítos maduros aún poseen una única masa de
cromatina y un grandísimo citoplasma que rellena parcialmente el eritrocito.
El pigmento hemozoína (hematina), un derivado de la hemoglobina, es
característico de todos los eritrocitos que contienen formas maduras de la
malaria, pero no se detecta en las formas anulares. Los esquizontes inma-
duros tienen dos o más masas de cromatina y un citoplasma sin dividir, mien-
tras que los maduros poseen tanto el citoplasma como la cromatina dividi-
dos, de tal modo que los merozoítos son evidentes. Los esquizontes
maduros rompen el eritrocito, liberando merozoítos e iniciando un nuevo
ciclo de infección. El ciclo eritrocitario se realiza en 48 horas aproximada-
mente (periodicidad terciana) para P. falciparum. P. ovale y P. vivax, y en 72
horas (periodicidad cuartana) para P. malariae. En algunos momentos de la
infección una subpoblación de merozoítos se transforma en gametocitos.
Los de P. vivax, P. malariae y P. ovale son redondeados, mientras que los de
P. falciparum son alargados (forma de salchichas). Característicamente, los
macrogametocitos (femeninos) poseen una masa compacta de cromatina,
mientras que los microgametocitos (masculinos) la tienen más dispersa. Los
gametocitos en desarrollo son más compactos que los trofozoítos en creci-
miento.
Epidemiología. La transmisión endémica de la malaria requiere un
reservorio, un mosquito vector y un huésped susceptible. El control de la
malaria se dirige a la eliminación del mosquito, al tratamiento de los casos
activos y a la profilaxis de personas susceptibles. Sin embargo, la aparición
de resistencias a los insecticidas por parte de los mosquitos y de la resis-
tencia al tratamiento y profilaxis por parte de P. falciparum. y recientemente
por P. vivax (Murphy, 1993), y la falta de recursos hacen difícil el control en
muchas zonas.
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA 1205

Figura 55-1. Ciclo de vida del parásito de la malaria (Cortesía del CDC. Parasitology Training Branch. Atlanta. GA.)

Los negros con anemia falcilorme son menos susceptibles a la malaria por
P. falciparvm. y las personas que carecen del grupo sanguíneo Duffy están
protegidas contra la infección por P. vivax (Miller. 1976). El déficit de glucosa-
e-fosfato deshidrogenasa (G6PD) se ha asociado a una protección contra la
malaria, pero la evidencia está menos demostrada que con las otras anoma-
lías hereditarias.
La malaria secundaria a transfusión puede producirse cuando el donante
padece una malaria subclínica. y puede resultar mortal para el receptor. Del
mismo modo, puede darse una malaria congénita en niños nacidos de madres
de zonas endémicas. Los niños la adquieren durante el nacimiento a causa
de la rotura de los vasos placenlarios en una transfusión malerno-fetal. Ni en
la malaria congénita ni en la secundaria a transfusión se esperaba que exis-
tieran recaídas, ya que no se forman esquizogonias exoeritrocitarias El nú-
mero de casos de malaria en EE.UU. aumentó de 151 en 1970 a 1.838 en
1980, pero descendió a 1.411 en 1993 (CDC. 1988,1993). Las especies cau-
santes de la infección en 1987 fueron P. vivax (44%), P. falctparum (43%), P.
malariae (4%). P. ovale (3%) y un 6% indeterminado. El intervalo entre la lle-
gada a EE.UU. y el desarrollo de la enfermedad fue menos de un mes para
el 25% de los casos de P vivax y del 80% de los casos por P. lalciparum. Sólo
un 3% de los pacientes desarrollaban la enfermedad tras un año. Los ciuda-
danos de EE.UU. adquirieron la infección en África (63%), Asia (18%). hemis-
ferio occidental (14%) и Oceanía (4%).
 1206 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Enfermedad clínica. La mayoría de los pacientes con infección por
P. lalciparum desarrolló los síntomas en menos de un mes tras la exposi-
ción, mientras que esto podía ser mayor de seis meses con otras especies
de Plasmodium. Los síntomas comunes de malaria incluyen escalofríos y
fiebre, que suele asociarse a esplenomegalia. En los estadios precoces,
los episodios febriles son irregulares, pero luego se van haciendo más sin-
crónicos, tomando la periodicidad terciana (P. vivax. P. falciparum y P.
ovale) o cuartana (P. malaria). Los pacientes pueden tener anemia y otras
manifestaciones como diarrea, dolor abdominal, cefalea y mialgias. La
malaria por P. falciparum puede producir mucha parasitemia (50%). llegan-
do a producir hemolisis grave, hemoglobinuria y gran anemia. Los eritroci-
tos infectados por trofozoítos en crecimiento y esquizontes de P. falciparum
tienden a ser secuestrados en capilares, pudiendo llegar a ocluirlos, cau-
sando clínica asociada y anoxia tisular. La afectación cerebral se conoce
como malaria cerebral, produciendo desorientación, delirio, coma y. fre-
cuentemente, la muerte. En las infecciones graves por P. falciparum las
transfusiones pueden salvar la vida (Nielson. 1979; Organización Mundial
de la Salud [OMS], 1987).
La evolución de la malaria sin tratamiento depende de la especie cau-
sal. La mayoria de los casos fatales se deben a P. falciparum. En los res-
tantes casos, las crisis febriles pueden ir siendo progresivamente menos
graves y desaparecer gradualmente. Los pacientes con infección por
P. vivax o P. ovale pueden sufrir recaída tras meses o incluso tras años.
Los pacientes con infección por P falciparum y P. malariae pueden tener
períodos asintomáticos y sufrir recaída debido a la presencia de parasi-
temia de bajo grado. Las recaídas y reagudizaciones se pueden asociar
con cambios en la inmunidad del huésped o con cambios antígénicos en
los parásitos.
Las extensiones periféricas pueden mostrar leucocitos con pigmento
malárico. Un aumento del número de reticulocitos se debe al rápido
recambio eritrocitario. Se puede detectar la presencia de grandes pla-
quetas alargadas en la sangre periférica debido a un rápido recambio,
secundario a un secuestro esplénico, La infección por malaria puede
interferir con otros test serológicos, produciendo falsos positivos, espe-
cialmente con los de la sífilis.
El tratamiento y profilaxis de la malaria puede ser difícil debido a apari-
ción de resistencias a la cloroquina por P lalciparum. así como otros anti-
palúdicos, y a la menos extendida resistencia a la cloroquina por P. vivax.
También, personas que han adquirido P. vivax o P. ovale, o que han pasa-
do mucho tiempo en zonas muy endémicas para estos parásitos, requie-
ren tratamiento con primaquína para erradicar los hipnozoítos y prevenir
así las recaídas. El uso de primaquína puede ser peligroso en los déficit
de G6PD y se debe realizar un screening previo antes de empezar el tra-
tamiento.
Diagnóstico. Se debe incluir a la malaria en el diagnóstico diferencial de
fiebre en pacientes que han viajado o residen en zonas endémicas, droga-
dictos o gente que ha recibido transfusiones. El diagnóstico suele hacerse
por la detección de parásitos en frotis de sangre finos y gruesos. Las mues-
tras de sangre se deben tomar preferiblemente justo antes del pico febril o
tras el pico febril. A veces es necesaria la toma de muestras separadas
varias horas para detectar la infección e incluso la especie, ya que el núme-
ro y fase de los parásitos varían según el ciclo. Un cuidadoso examen de los
frotis gruesos revelaría la presencia de parásitos en casi todos los pacientes
con clínica de malaria.
La identificación de parásitos de la malaria en los frotis finos requiere un
abordaje sistemático. Hay tres factores principales a tener en cuenta: la
aparición de eritrocitos infectados, la aparición de parásitos y los estadios
hallados. En la Tabla 55-6 se resumen las características diagnósticas de
las especies que se ilustran en las Láminas 55-1 a 55-4. Los eritrocitos
infectados por P vivax o P ovale suelen estar aumentados de tamaño en
comparación con los que les rodean, mientras que los parásitos P. mala-
riae y P. falciparum suelen encontrarse en eritrocitos de un tamaño normal.
Más del 20% de los eritrocitos con P. ovale pueden ser ovales o con fim-
brias (proyecciones irregulares en los márgenes de la célula), mientras que
menos del 6% de los eritrocitos infectados por P vivax son ovales. Pueden
verse numerosos granulos rosas uniformes dentro del eritrocito (granulos
de Schüffner) en las células infectados con P vivax y P. ovale, aunque pue-
den no ser evidentes en las células infectadas con formas tempranas o en
extensiones que no se han teñido al pH apropiado (véase previamente en
Métodos de laboratorio). La presencia de granulos de Schüffner es útil, ya
que no se ven en P malariae y P falciparum.
Mientras los trofozoítos crecen en las células infectadas, la cantidad de
hemoglobina en el eritrocito disminuye y se acumula pigmento de hemo-
zoína. La cantidad y aspecto del pigmento varían según la especie. Las for-
mas anulares de todos los parásitos pueden ser similares si solo se
encuentran formas anulares, impidiendo diferenciar las especies. Los ani-
llos jóvenes de P. falciparum son más pequeños que los de las otras espe-
cies (un sexto del diámetro de la célula roja, en comparación con un tercio
del diámetro de la célula roja de las otras especies). Los anillos de P. falci-
parum que han crecido son similares en tamaño a los de oirás especies.
Los trofozoítos que yacen en la superficie del eritrocito o que protruyen se
denominan formas apliqué o accolé. y se ven más frecuentemente en infec-
ciones por P. falciparum. La presencia de células doblemente infectadas y
doble punteado de cromatina en los trofozoítos en anillo es más frecuente
en P falciparum. pero puede producirse en las demás especies.
Los trofozoítos en crecimiento de P vivax tienen una forma irregular y se
denominan ameboideas. Los de P. malariae y P. ovale permanecen com-
pactos. Los trofozoítos y esquizontes maduros de P. falciparum suelen ser
secuestrados en el lecho capilar por adherencia a las células endoteliales.
por lo que no se ven en sangre periférica excepto en infecciones graves.
Cuando se detectan esquizontes en la sangre periférica, la determinación
del número de merozoítos puede ser útil para dilerenciar las especies. Los
gametocitos de P. falciparum son fácilmente identificables por su forma
característica en salchicha. Los gametocitos de P. vivax, P. malariae y
P. ovale son similares y difíciles diferenciar, aunque las características de
la célula roja infectada pueden ayudar.
La variedad de los estadios en la sangre penférica puede ser útil. En la
detección de infecciones por P. falciparum predominan las formas en anillo, y
el hallazgo de numerosas formas en anillo sin otras formas maduras es una
evidencia de infección por P falciparum. En las infecciones por P. vivax.
P. malariae y P ovale se encuentran diferentes estadios de parásitos con
algún predominio, dependiendo de la fase del ciclo.
Para la detección de la malaria se prefieren frotis gruesos, ya que se exa-
mina mayor cantidad de sangre (véase previamente en Métodos laboratorio).
Las formas en anillo suelen tener la apariencia de signos de puntuación más
que de anillos completos, y debe buscarse la presencia de cromatina roja y
citoplasma azul para identificarlos como parásitos. Los granulos de Schüffner
pueden ser útiles para la identificación y se deben reconocer alrededor de los
trofozoítos en crecimiento como un halo rosa. El carácter ameboide de los tro-
fozoítos de P vivax no es tan evidente en los frotis gruesos, pero es útil el
número de merozoítos en los esquizontes maduros. Los macro y microgame-
tocitos pueden no ser diferenciabas. La forma distintiva en salchicha de los
gametocitos de P falciparum es aún evidente, sin embargo puede ser más
estirado que en los frotis finos. Los gametocitos de otras especies se pueden
detectar y diferenciar fácilmente de los núcleos celulares por la presencia de
pigmento de hemozoina de refracción.
Pueden producrise infección mixta (en aproximadamente el 5% de las
veces), pero se debe ser prudente a la hora de hacer el diagnóstico, a menos
que exista evidencia de dos poblaciones claramente separadas de parásitos.
La mezcla más común es la infección por P falciparum y P. vivax. El hallazgo
de gametocitos de P falciparum en una persona claramente infectada con
P. vivax es diagnóstico.
Hay múltiples artefactos que pueden simular parásitos en el frotis. Los
más frecuentes en los frotis finos son las plaquetas superpuestas a los
glóbulos rojos. Estas plaquetas se pueden identificar fácilmente porque
no tienen una auténtica forman anillo y no muestran diferencia de la cro-
matina y de citoplasma y, además, no contienen pigmento. Se pueden
confundir grupos de bacterias o plaquetas con esquizontes. A veces,
masas de plaquetas pueden asemejarse a gametocitos de P. lalciparum,
pero no muestran el colorante diferencial o el pigmento. También se pue-
den confundir con parásitos los grumos de colorante, las bacterias con-
taminantes o las esporas.
Tabla 55-6 Comparación de las especies de Plasmodium que afectan a los humanos
Apariencia del eritrocito Apariencia del parásito Estadios hallados en
Especies Tamaño Granulos del eritrocito Citoplasma Pigmento Número de merozoitos sangre periférica

Plasmodium Aumentado. La talla máxima
vivax alcanzada por los trofozoítos
y esquizontes puede ser
1-2 veces el diámetro normal
Plasmodium Normal
malariae
Plasmodium Aumentado. Tamaño máximo
ovale V*-V veces el diámetro
del eritrocito.
Aproximadamente el 20% o más
de los eritrocitos infectados son
ovalados y/o fimbriados el borde
tiene proyecciones irregulares
Plasmodium Normal. Los eritrocitos infectados
falciparum son normales
De Smith JW Melvm DM. Onhel TC. y cols.: Diagnostic Parasitology-Blood and Tissue Parasites Chicago. American Society of Clinical Pathologists. 1976. con autorizaciOn
Irregular, ameboide en los Marrón dorado, 12-24, Todos los estadios La mayoría n
En todos los estadios trofozoítos. Tiene apariencia poco llamativo la media es 16 de los estadios pueden verse
excepto en las formas "extendida" en el mismo frotís >
precoces de anillo c
Redondo, trofozoítos compactos Marrón oscuro, 6-12, promedio Todos los estadios. La gran r-
(Rara vez se ven los puntos con citoplasma denso. basto, llamativo de 8: a veces variedad de los estadios o
de Ziemann) Trofozoítos con forma de se ven esquizontes no suele verse. en
C7!
banda ocasionalmente en "roseta Relativamente pocos anillos
o gametocitos presentes >
+
En todos los estadios excepto Redondo, trofozoítos compactos Marrón oscuro. 6-14, Todos los estadios
en las formas de anillo A veces levemente ameboide. llamativo promedio de 8 9
tempranas Los trofozoítos en crecimiento O
tienen grandes masas de cromatina
Los anillos jóvenes son pequeños, Negro. 6-32. Anillos y/o gametocitos. Otros
(Ocasionalmente se ven Basto y llamativo estadios se desarrollan en
>
delicados y frecuentemente promedio 20-24
puntos de Maurer) con doble punteado de cromatina en los gametocitos los vasos sanguíneos u
Los gametocitos están alargados órganos internos, pero no en
la sangre periférica, excepto
en infecciones graves

K5
O
-4
 1208 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Los test serologicos para malaria son específicamente útiles para estudios
epidemiológicos y para la detección de donantes de sangre infectados. No
obstante, estos test no están capacitados para diferenciar entre infección
actual o pasada. Hay test sensibles y específicos disponibles en el CDC de
IFA que utilizan antígenos para las cuatro especies humanas (Wilson. 1995).
Babesiosis
Como el parásito de la malaria, los agenles de la babesiosis o piroplasmo-
sis son protozoos apicomplejos extendidos por todo el mundo que infectan
eritrocitos, produciendo enfermedades febriles de gravedad variable. A dife-
rencia de la malaria, se transmite por garrapatas y hay una gran variedad de
animales que actúan como reservorio.
La infección en EE.UU. se produce principalmente en estados del noreste
y del medio oeste, donde el parásito de los roedores Babesia microli es el
responsable de la infección (Herwaldt. 1995). /. capulahs es la garrapata vec-
tor. Estudios recientes han implicado a otra especie de Babesia, aun sin
nombre (por el momento conocida como WA1), como causante de la enfer-
medad en el oeste de EE.UU. Se cree que este parásito, asociado con la en-
fermedad en Washington y California, se transmite por la garrapata de patas
negras. Ixodes paciticus (Persing, 1995: Quick. 1993). En Europa, es el pará-
sito canino Babesia divergens. transmitida por Ixodes ricinus. el que infecta
a los humanos.
El espectro clínico varía desde enfermedad latente y subclínica a hemoli-
sis fulminante. Se han descrito fatalidades, especialmente en espleneclomi-
zados o inmunosuprimidos. Las personas mmunocompetentes pueden tener
sintomas similares a la malaria, como fiebre, escalofríos, malestar general y
anemia, aunque sin la característica periodicidad. La investigación de un
brote por Babesia microli en la isla de Nantucket, en Nueva Inglaterra, mos-
tró que algunos pacientes sinlomálicos portaron el parásito durante meses,
Figura 55-2. Morfología de los hemoflagelados.
y otros mostraron evidencia serológica de infección sm historia de enferme-
dad clínica (Ruebush, 1980). Otra evidencia es que la infección crónica sub-
clínica puede ser infrecuente (Persing, 1995).
El parásito se multiplica en los eritrocitos como esquizogonias, pero no
produce gametocitos. Aunque los trofozoitos de muchas especies tienen
forma de pera, en algún momento de su desarrollo los de S. microli suelen
parecerse a delicadas formas anulares que pueden confundirse con las de
la malaria, especialmente P. falciparum (Lámina 55-5A) (Healy, 1980). Los
trofozoitos de Babesia se pueden diferenciar de los de la malaria por la
presencia de múltiples anillos en una célula que pueden formar una tetra-
da (cruz de Malta) y por la ausencia de trofozoitos grandes en crecimiento
y de los gametocitos. También, las células de los infectados por Babesia
carecen de pigmento de hemozoina, que está presente en las células
infectadas por Plasmodium. La historia de residencia o viaje en zonas
endémicas, o picadura reciente por garrapatas, puede sugerir infección por
Babesia. Hay disponibles test serológicos (IFA) para Babesia microtiy WA1
en el CDC con referencia a los departamentos de salud estatal. Los test
serológicos de malaria son negativos en la babesiosis. aunque pacientes
con malaria pueden tener actividad cruzada con las serologías de Babesia
(Wilson. 1995).
Hemoflagelados
Los hemoflagelados de humanos y animales son miembros del orden de
los Kinetoplastida y se caracterizan por la presencia de un gran mitocon-
drión conocido como cinetoplasto, que contiene suficiente ADN para ser
visto por microscopio de luz cuando se tiñen con Giemsa. Los dos géneros
importantes en la patología humana son Trypanosoma y Leishmania. Am-
bos se transmiten por artrópodos y tienen huéspedes animales como reser-
vónos.
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
Los cínetoplástídos tienen diferente morfología dependiendo de su pre-
sencia en huéspedes vertebrados, incluidos los humanos, o en sus vecto-
res (Fig. 55-2). El estadio amastigote es esférico, de 2 urn a 5 pm de diáme-
tro, y posee un núcleo y cinetoplasto. Por definición le falta un flagelo externo,
aunque a nivel ultraestructural es aparente un axonema (parte inlracelular del
flagelo) Los amastigotes se pueden encontrar en huéspedes humanos o ani-
males infectados con T. cruzío Leishmania spp.. donde se multiplican única-
mente dentro de las células. El promastigote es un organismo alargado y del-
gado con un núcleo central, un cinetoplasto anterior y un axonema. y un
flagelo libre que va desde el extremo anterior. Esta fase se da en el insecto
vector de Leishmania y es la que se detecta en los cultivos. El epimastigote
es similar al promastigote. pero el cinetoplasto está más cerca del núcleo y
posee una pequeña membrana ondulada que acaba en un flagelo libre. Todas
las especies de Trypanosoma que infectan a humanos toman la forma de epi-
mastigote en el vector o en el cultivo. En el tripomasligote, el cinetoplasto
está en el extremo posterior y el flagelo forma una membrana ondulada que
se extiende a lo largo de la célula, acabando como un flagelo libre en el ex-
tremo anterior. La forma de tripomastigote se da preferentemente en el to-
rrente sanguíneo en el huésped de mamíferos infectados con Trypanoso-
ma spp. Las fases infecciosas encontradas en los vectores formados a partir
de epimascigotos se conocen como tnpomastigotes metacíclicos
Trypanosoma
Las infecciones por Trypanosoma incluyen las causadas por T. brucei
(tripanosomiasis africana o del Viejo Mundo) y T. cruzi (tripanosomiasis
americana o del nuevo mundo o enfermedad de Chagas). Ambas son de
gran importancia en zonas endémicas, pero rara vez pueden verse en
EE.UU. Una tercera especie. T. rangeti, se ha descrito en humanos en
América, pero no produce de enfermedad clínica. El tripomastigote del
torrente sanguíneo del grupo T. brucei (Lámina 55-5B) es mayor de 30 um
de longitud, con unas curvas graciosas y un pequeño cinetoplasto. Los del
T. cruzi son más pequeños (20 um), tomando formas de S y C en los fro-
tis teñidos, y poseen un cinetoplasto más largo.
En África ecuatorial, los parásitos del grupo T. brucei infectan tanto a huma-
nos como a animales y se transmiten por la picadura de la mosca tsetse, del
género Glossina. La proliferación de los organismos en el punto de punción
produce un chancro transitorio. En el este de África, la tripanosomiasis es
causada por I brucei rhodesiense, que tiene un gran número de huéspedes
animales como reservónos. La enfermedad se caracteriza por un cuadro febril
agudo rápidamente progresivo y adenopatias. La muerte del paciente se da
tras la afectación del sistema nervioso central.
La infección en África occidental es debida a T. brucei gambiense, que es
el causante de la clásica enfermedad del sueño africana. La enfermedad
posee un curso crónico que empieza con fiebre intermitente, sudoración noc-
turna y malestar. Pueden ser llamativas las adenopatias, especialmente las
cervicales (signo de Winterbottom). Con el tiempo, acaba afectando al siste-
ma nervioso central: somnolencia, confusion, fatiga y estupor progresivo,
coma e incluso muerte. Los humanos son el principal reservono ante esta
enfermedad (OMS. 1986).
El diagnóstico se debe sospechar con la historia geográfica y los hallazgos
clínicos. Se observa un aumento en la IgM total en sangre y el líquido cefalorra-
quídeo (LCR). Existe pleocitosis con 50-500 células mononucleadas/microlitro
en el liquido cefalorraquídeo. El diagnóstico se confirma por la demostración
de los parásitos en frotis sanguíneos, tanto gruesos como finos, extensiones,
aspiraciones de adenopatias o de la médula ósea, o en el centrifugado de
líquido cefalorraquídeo teñido con Giemsa (Cattand, 1988; Van Meirvenne,
1985). Los cultivos o la inoculación en animales también pueden ser útiles si
estuviesen disponibles.
La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas está causada
por T. cruzi. En su forma selvática, se da en EE.UU., Centroamérica y.
sobre todo, en Sudamérica. La infección humana es común en zonas de
México, Centroamérica y Sudamérica, donde se transmite por chinches de
la familia de los Reduviidae. Los géneros y especies implicadas en la trans-
misión varian de un país a otro y según los diferentes nichos ecológicos.
Algunas de las chinches son responsables de mantener el ciclos selvático
en los reservónos animales, mientras que otras están acostumbradas a la
1209
vida doméstica, donde infectan a casas de pobre construcción, especial-
mente en zonas rurales. A la hora de alimentarse, las chinches defecan.
Las heces contienen tripomastigotes infectivos que tras el rascado entran
en el cuerpo por el punto de la picadura a través de la mucosa intacta de
la boca o la conjuntiva. La forma infectiva entra activamente cerca de las
células tisulares, donde se transforman en amastigotes en división. Cuan-
do las células infectadas se llenan de amastigotes, se transforman en tri-
pomastigotes, seguido de la rotura celular. Los tnpomastigotes se liberan
en la sangre periférica alcanzando los tejidos distantes, donde comienza el
ciclo reproductivo de novo.
La enfermedad de Chagas puede causar infección aguda o crónica. La
aguda es más frecuente en niños menores de cinco años y se caracteriza
por malestar, escalofríos, fiebre, hepatoesplenomegalia y miocarditis. El
edema palpebral (signo de Romana) puede presentarse si la inoculación se
produce en la cara. El edema tisular en otras partes, tras la picadura de las
chinches infectadas, se llama chagoma. En personas ancianas, el curso
agudo es leve o frecuentemente asintomático. En ambos casos, el pacien-
te estará afectado de por vida Las manifestaciones crónicas de la infec-
ción, incluido el megaesófago, el megacolon y las alteraciones de la con-
ducción miocárdica. son debidas a la destrucción de las células efectoras
del sistema parasimpático por autoanticuerpos. La infección se puede
transmitir por transfusiones, y las infecciones latentes pueden exacerbarse
por ¡nmunosupresión.
El diagnóstico en el estadio agudo se hace demostrando el parásito en fro-
tis gruesos o finos de sangre, extensiones o en aspirados de los chagomas o
de las adenopatias. Estas muestras también se pueden cultivar con el uso del
medio Novy-MacNeal-Nicolle (Ash, 1987; Garcia, 1997; Vísvesvara, 1992c).
En las áreas endémicas se puede usar el xenodiagnóstico (examen de con-
tenido gástrico de chinches a las que se les ha permitido picar a un paciente).
En los estudios en los estadios crónicos, el diagnostico serológico es el méto-
do de elección. El EIA. IFA y el test de CF están disponibles, aunque no per-
miten diferenciar entre enfermedad aguda o crónica y pueden tener reacción
cruzada con pacientes con leishmaniasis.
Leishmania
La leishmaniasis es una enfermedad del sistema reticuloendotelial pro-
ducida por protozoos cinetoplástidos del género Leishmania. Todas las
especies que infectan a humanos tienen reservónos anímales y se trans-
miten por moscas que pertenecen a género Phlebolomus en el Viejo
Mundo y Lulzomyia en el Nuevo Mundo. Los parásitos toman la forma de
amastigotes en los mamíferos y la forma de promastigotes en los insectos
vectores. Las especies de Leishmania no se pueden diferenciar por exa-
men de otros amastigotes o promastigotes. La leishmaniasis puede lomar
diferentes formas clínicas: la forma cutánea, mucocutánea y visceral son
las más conocidas. La forma y gravedad varían según la especie infec-
tante, el estado inmune del huésped y la exposición previa (Peters. 1987:
Strickland, 1999).
Leishmaniasis cutánea. La leishmaniasis cutánea del Viejo Mundo
(llaga oriental) se produce en el sur de Europa, norte y este de África,
Oriente Medio. Irán, Afganistán y el sur de Rusia. Las infecciones están
producidas por L tropica. L. major y L. aethiopica. aunque L. donovam y
L. infantum también pueden producir lesiones cutáneas. L. tropica causa
la úlcera urbana o seca, que es más duradera que la rural o la úlcera
húmeda de L. major. Estas úlceras suelen producirse en una zona expues-
ta del cuerpo y se cura espontáneamente. La infección deja inmunidad
duradera. L. tropica puede llegar a ser viscerotrópica. tal como se demos-
tró recientemente en personal militar que participó en la operación Tor-
menta del Desierto (Magill, 1993). L. aethiopica produce una infección cu-
tánea más agresiva, que en algunos casos puede producir lesiones
mucosas a distancia o leishmaniasis cutánea difusa, cuyo extremo se ca-
racteriza por múltiples módulos cutáneos que se asemejan a la lepra lepra-
matosa.
La leishmaniasis cutánea del Nuevo Mundo es causada por muchas
especies, incluidos L. mexicana. L. braziliensis. L. amazonensis. L vene-
 1210 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
zuelensis. L. garnhami, L. pifanoi. L. peruviana. L. panamensis y L. guya-
nensis. Las lesiones causadas por L. mexicana pueden afectar al lóbulo
de las orejas (úlcera del chiclero), siendo autolimitada, y se desconoce su
afectación a distancia de las mucosas. Sin embargo, L. mexicana y L.
amazonensis pueden causar lesiones cutáneas difusas similares a las de
L aethiopica. Existe un foco de leishmaniasis cutánea en el sur de Texas,
donde las infecciones están causadas por una o más especies (Gustaf-
son, 1985). L. peruviana, hallada en las pendientes occidentales de los
Andes peruanos, causa una infección llamada uta. una lesión cutánea
benigna que se da preferentemente en niños. L. peruviana se adquiere en
las casas, donde los principales reservorios son los perros domésticos.
Esta situación epidemiológica contrasta con otras leishmaniasis cutáneas
que suelen adquirirse en los bosques y tienen animales salvajes como
reservónos.
Leishmaniasis mucocutánea. La Leishmaniasis mucoculánea (espun-
dia) es provocada por L. braziliensis y rara vez por otras especies causan-
tes de lesiones cutáneas más agresivas, y a veces se disemina a membra-
nas mucosas, especialmente la nasal, la oral y la faríngea. En estas zonas
puede producir lesiones desfigurantes por erosión de las partes blandas y de
los cartílagos. L. braziliensis se distribuye en México, América central y Sud-
aménca.
Leishmaniasis visceral. La leishmaniasis visceral del Viejo Mundo se
produce esporádicamente a lo largo de toda la geografía y es causada bien
por L. úonovanio por L. infantum. L. donovanies predominante en África.
Asia y la India y L. infantum predomina en las regiones mediterráneas y en
el Oriente Medio, aunque existen superposiciones. La leishmaniasis visce-
ral del Nuevo Mundo está producida por L. chagasiyse produce esporádi-
camente en América central y Sudamérica. Algunas especies que produ-
cen enfermedad cutánea también pueden ser responsables, en ocasiones,
de enfermedad visceral, como se demostró recientemente en algunos gru-
pos que participaron en la operación Tormenta del Desierto (Magill. 1993).
En algunas áreas los humanos pueden servir de reservorios. aunque sue-
len ser diversos animales, incluidos perros y gatos, los que toman este
papel.
La infección suele ser benigna y a veces subclínica, aunque algunos indi-
viduos, especialmente chicos |óvenes e individuos mal nutridos, tienen mar-
cada afectación visceral, especialmente hígado, bazo, médula ósea y gan-
glios linfáticos. En algunos casos la muerte se produce tras meses o años, a
menos que se les trate adecuadamente. La infección se llama Kala-azar en la
India, por el oscurecimiento que toma la piel La leishmaniasis visceral es tam-
bién una infección oportunista en individuos inmunosuprimidos (VIH), como
mala respuesta a tratamiento (Medrano, 1992).
Diagnóstico de leishmaniasis. El diagnóstico se realiza habitual-
mente por la visualización de los amastigotes en las extensiones o en las
biopsias, o por el crecimiento de los promastigotes en cultivos. En la leish-
maniasis tegumentaria, el borde de la lesión (que es más activo) debe ser
biopsiado y se debe emplear en fresco para hacer muestras. También se
debe preparar una extension haciendo una incisión de 2 mm a 3 mm en el
borde de la ulcera y cogiendo pequeña cantidad de tejido de la superficie
tras cortar la superficie con la hoja del bisturí. Tanto la extensión como la
muestra de la biopsia se deben tratar con Giemsa. Las muestras que se
deben tomar cuando se sospecha leishmaniasis visceral incluyen prepara-
ciones teñidas, aspirados de adenopatías o de médula ósea y biopsias de
bazo o hígado.
El cultivo es deseable, ya que es más sensible y permite determinar las
especies y subespecies. práctica que puede ayudar al tratamiento clínico del
paciente. Las biopsias y aspirados recogidos asépticamente se cultivan en el
medio de Novy-MacNeal-Nicolle o en el medio de Drosophila de Schneider
suplementado con suero fetal de carnero (Visvesvara, 1992c). Los cultivos
suelen empezar a mostrar promastigotes de 2 a 5 días, pero se debe esperar
al menos cuatro semanas.
Los amastigotes hallados en las biopsias, extensiones y secciones tisú-
lares se reconocen por su tamaño (de 2 pm a 4 pm), por su citoplasma, por
el núcleo y un cmetoplasto (Lámina 55-5C). En las secciones tisulares pue-
den parecer mas pequeños debido a su reducción de tamaño durante la fija-
ción. Los amastigotes deben diferenciarse de otros organismos mtracelula-
res. incluidos células levaduriformes de Histoplasma capsulatum y los trofo-
zoitos de Toxoplasma gondii. Leishmama spp. tiene un cmetoplasto y no
posee pared celular. En contraste, Histoplasma pierde el cinetoplasto. y la
pared celular se tiñe con ácido periódico de Shifl (PAS) y con plata mete-
namina. De acuerdo con un estudio (Weigle, 1987), la sensibilidad de las
secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina es del 14%. las
impresiones del 19%. de los cultivos del 58%. y de todos los métodos com-
binados del 67%.
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii es un parásito protozoo del filo Apícomplexa con una
distribución mundial en el ser humano y en los animales tanto domésticos
como salvajes, especialmente carnívoros. La infección en inmunocompe-
tentes suele ser asintomática o leve, pero en los mmunocomprometidos
puede traer serias complicaciones. La infección in útero puede producir una
infección congénita grave con secuelas o causar la muerte letal (Reming-
ton, 1990).
El estadio sexual del ciclo vital de este parásito coccidio se completa en
el epitelio intestinal de los gatos y otros felinos, que le sirven exclusiva-
mente como huéspedes definitivos. Durante este ciclo, pueden formar
esquizogonias asexuales y gametocitos sexuales, dirigidos al desarrollo de
los ooquistes inmaduros que pasan a las heces. Los ooquistes maduran a
una fase infectiva (que contiene dos esporoquistes y cuatro esporozoítos
cada uno) en el plazo de 2 a 21 días. La ingestión de estos ooquistes puede
conducir a la infección de una gran variedad de vertebrados susceptibles en
los que los trofozoitos en crecimiento (taquizoitos) pueden infectar activa-
mente cualquier célula nucleada. La proliferación de los taquizoitos produ-
ce la muerte celular. Una vez que se desarrolla la inmunidad, los organis-
mos forman quistes tisulares que pueden contener cientos o miles de
bradizoítos de crecimiento lento. La presencia de quistes tisulares es carac-
terística de las infecciones crónicas. Todos los estadios del ciclo vital se pro-
ducen en los felinos, pero sólo los estadios de trofozoitos y quistes se pro-
ducen en humanos y otros huéspedes intermediarios.
Los humanos adquieren la infección por Toxoplasma gondii por la inges-
ta de carne mal cocinada, especialmente cordero o cerdo, que contiene
quistes tisulares, o por la ingesta de ooquistes inactivos de material conta-
minado por heces de gato. Los brotes pueden producirse por la inhalación
de polvo contaminado en el interior de establos (Teutch, 1979) y por beber
agua contaminada o leche sin pasteurizar (Benenson. 1982: Sacks. 1982).
También puede producirse por la transmisión por transfusión o por tras-
plantes
La mayoría de las infecciones agudas son asintomáticas o similares a
otras enfermedades en las que destacan la fiebre y las adenopatías. La
infección congénita puede producirse cuando la madre tiene infección
aguda durante la gestación. El riesgo de inlección en neonatos no se rela-
ciona con la presencia o ausencia de síntomas en la madre, sino que la
gravedad de la infección depende del estadio de la gestación. Si se con-
trae en la primera mitad del embarazo, puede aparecer muerte intrauteri-
na, microcefalia o hidrocefalia con calcificaciones intracraneales. Si se da
la infección en la segunda mitad del embarazo, suelen ser asintomáticos al
nacimiento, aunque puede aparecer fiebre, hepatoesplenomegaha e icteri-
cia. La coriorretmitis, el retraso psicomotor y las convulsiones pueden apa-
recer meses o años después.
En inmunosuprimidos, especialmente aquellos con sida, las infecciones
por Toxoplasma gondiiduelen presentarse con afectación de líquido cefa-
lorraquídeo (Luft. 1988). Otras posibles manifestaciones clínicas y patoló-
gicas son neumonitis. miocarditis, retinitis, pancreatitis y orquitis (Luft,
1989; Schnapp, 1992). La toxoplasmosis puede ser difícil de diagnosticar
clínicamente y a veces se descubre en las autopsias (Gutiérrez, 2000).
Estas infecciones suelen ser resultado de la reactivación de infecciones
latentes, adquiridas meses o años antes, pero ocasionalmente pueden ser
infección primaria.
El diagnóstico de toxoplasmosis se puede establecer por el examen de
tejidos, sangre o fluidos corporales. El hallazgo de taquizoitos o quistes tisu-
lares es definitivo, pero puede existir dificultad para demostrarlo en las tin-
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
clones con hematoxilina-eosina; las tinciones fluorescente o con inmunope-
roxidasa suelen ser útiles. El Giemsa es bueno para la tinción de extensio-
nes de fluidos corporales y tejidos. Los organismos se pueden demostrar
inoculando material adecuado en cultivo de tejido o en un ratón. La recupe-
ración en cultivos virales también se ha descrito, pero requiere una incuba-
ción prolongada (Shepp, 1985). El aislamiento de los organismos a partir de
la sangre o fluidos corporales es evidencia de infección aguda, mientras que
su obtención en tejidos puede significar infección crónica. En las extensio-
nes, los taquizoítos son ovalados o en forma de media luna, midiendo apro-
ximadamente 3x7 um; los quistes miden más de 30 urn de diámetro y sue-
len ser esféricos, excepto en las fibras musculares, donde están alargados
(Láminas 55-50. E y F).
El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es de alta sen-
sibilidad y especificidad para su detección en la encefalitis por Toxoplas-
ma, enfermedad diseminada e infección intrauterina (Cazenave. 1991;
Grover, 1990. Parmley. 1992; Weiss. 1995). Estos procedimientos no es-
tán completamente disponibles, sin embargo requieren un control de cali-
dad cuidadoso para evitar resultados falsos positivos.
La serologia permanece en primera linea para el diagnóstico por Toxo-
plasma (Wilson. 1995). El test de Sabin-Feldman y el test de IFA son los
estándares con los que se comparan los otros métodos, aunque el pri-
mero es llevado a cabo sólo en algunos centros. Muchos de los test EIA
están disponibles a la venta y generalmente dan un resultado similar al
del IFA Los anticuerpos aparecen en una o dos semanas y los titulos
pico entre la sexta y octava semanas. Los test para los anticuerpos IgM
específicos son especialmente útiles para diagnóstico de infección aguda
e infección congenita, pero el conocimiento de las limitaciones (especial-
mente de los falsos positivos) es de gran importancia. La persistencia de
anticuerpos IgM en ocasiones durante un año o más, es también proble-
mático y se debe interpretar en conjunto con los resultados de la IgG.
Debido a que muchas personas han tenido infecciones asintomáticas, los
titulos bajos de IgG tienen poco significado. Los títulos en pacientes con
infección crónica ocular también pueden ser bajos. Los inmunosuprimi-
dos, como los pacientes con sida que tienen infecciones activas por
Toxoplasma, casi siempre tienen anticuerpos IgG existentes, aunque los
títulos pueden ser bajos y la actividad de IgM rara vez es detectada. La
interpretación de los titulos de IgG e IgM varía según el método usado y
quien lo haya llevado a cabo. El laboratorio que lo hace debe dar los cri-
terios necesarios para su interpretación.
Amebas oportunistas de vida libre
Las amebas de géneros Naegleria. Acanthamoeba y Balamuthia habitan
en la tierra, el agua y otros substratos ambientales, donde se alimenta de
otros organismos microscópicos, especialmenle bacterias y levaduras. Los
tres géneros se han asociado con infecciones oportunistas del sistema
nervioso central, y la infección por Acanthamoeba causa queratitis (Kil-
vmgton. 1994: Marciano-Cabral. 1988; Martínez. 1985: Ubelaker. 1991; Vis-
vesvara. 1999).
La memngoencefalitis causada por el ameboflagelado Naegleria lowle-
ri suele afectar típicamente a niños y jóvenes adultos que han estado
nadando o buceando en lagos o piscinas de aguas dulces calientes. Los
ameboflagelados entran en el cerebro a través de la lámina cribiforme y
del bulbo olfatorio, alcanzando los lóbulos frontales, donde produce una
meningoencefalitis aguda hemorrágica que suele ser latal en el plazo de
una semana Iras el comienzo de los síntomas. Tiene un malísimo pro-
nóstico a pesar del tratamiento vigoroso. El diagnóstico suele estable-
cerse por autopsias al encontrar trofozoítos (los quistes no se suelen ver)
en los cortes histológicos (Lámina 55-6/1). El diagnóstico en vida se hace
ocasionalmente al ver trofozoítos típicos en el líquido cefalorraquídeo,
bien sea en examen directo o en preparaciones teñidas o en cultivo. Los
trofozoítos miden de 10 pm a 35 pm, y tienen cariosomas largos, redon-
deados y centrales: si se ponen en agua destilada templada, se convier-
ten en formas flageladas en una o dos horas. Los quistes son esféricos y
miden de 7pm a 15 pm de diámetro. El cultivo se suele hacer en placas
de agar no nutriente (1,5% agar, 0,5% cloruro sódico. pH 6.6-7,0) sem-
1211
brado con un tapiz de E. col! viva o muerta con calor (Visvesvara. 1999).
Las amebas digieren las bacterias, dejando huellas en el tapiz de bacte-
rias, que pueden ser vistas con bajo aumento utilizando poca luz (Lámi-
na 55-60).
La meningoencefalitis amebiana granulomatosa (GAE) puede ser causa-
da por varias especies de Acanthamoeba. incluidas A. castellao!. A. cul-
bertsoni. A. polyphaga y A. astrnyxis entre otras Suele ser una infección
oportunista subaguda o crónica de pacientes con enfermedades crónicas
debilitantes e inmunosuprimidos. causando la muerte en semanas o meses
tras el inicio de los síntomas. Se cree que la infección se extiende por vía
hematógena a partir de un foco primario de la piel, la faringe o de tracto res-
piratorio. Pueden producirse infecciones sistémicas en personas con sida y
presentarse como lesiones cutáneas o ulcerativas, abscesos subcutáneos o
nodulos eritematosos (Lámina 55-6C) (Tan, 1993). No es necesaria la expo-
sición al agua, ya que los quistes de Acanthamoeba son llevados fácilmen-
te por el aire y pueden hallarse en la nariz y la garganta (Lawande, 1979;
Wang. 1967). La reacción tisular consiste en granulomas con trofozoítos en
los tejidos viables y quistes en las áreas de necrosis. El diagnóstico se suele
hacer en autopsias, pero se pueden ver organismos en las biopsias cere-
brales mediante técnicas de cultivo descritas para Naegleria. Los trofozoí-
tos de Acanthamoeba son algo más grandes que los de Naegleria, midiendo
entre 15 pm y 45 pm, y poseen unas proyecciones filamentosas similares a
agujas, conocidas como acanlopodios. Los quistes miden de 10 pm a 25 pm
y tienen doble pared: una externa rugosa (ectoquistes) y otra interna poli-
gonal estrellada o redondeada (endoquistes) (Lámina 55-60). La identifica-
ción de las especies es problemática y refleja la incertidumbre a la hora de
reconocer las dieciocho o mas especies descritas. El uso de técnicas de
inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa puede resultar útil para diferen-
ciar especies y están disponibles por el CDC (Visvesvara, 1999).
La GAE puede ser causada por amebas leptomyxldes, especialmente
Balamuthia mandrillaris (Visvesvara. 1993). Morfológicamente. Balamu-
thia no se puede diferenciar de Acanthamoeba por la histología habitual,
aunque se pueden detectar diferencias a nivel ultraeslructural. Estos or-
ganismos son antigénicamente diferentes y se pueden identificar me-
diante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales en ensayos con
inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (Visvesvara, 1999). Balamuthia
no crece en las placas de agar usadas para Naegleria y Acanthamoeba,
pero se puede hallar en cultivos de tejido usando lineas celulares de ma-
míferos.
La queratitis por Acanthamoeba es una dolorosa infección de la córnea
cada vez más frecuente y que es más habitual que se produzca en per-
sonas que usan lentes de contacto blandas o que sufren un traumatismo
en la córnea (Anuran. 1987: Kilvington, 1994). La desinfección incomple-
ta o infrecuente y el uso de suero salino casero son factores de riesgo
conocidos para sufrir la infección (Stehr-Green, 1990). La enfermedad se
caracteriza por el desarrollo de un infiltrado en anillo en el estroma cor-
neal que progresa a ulceración y riesgo de perforación con pérdida del
ojo. La infección se puede confundir con una queratitis fúngica. bacteria-
na o herpética que característicamente es refractaria a los antimicrobia-
nos más habituales. Se ha empleado la queratoplastia en el tratamiento
de esta enfermedad, aunque se han descrito avances recientes en la
terapia médica (Varga, 1993). El diagnóstico se establece por la demos-
tración de trofozoítos amebianos o quistes en los raspados o biopsias
corneales (Lámina 55-6E). Se pueden usar un gran número de tinciones,
incluidos el Giemsa, el PAS y el tricromo. El uso de fluorocromo-calcoflú-
or blanco es especialmente útil en la detección de quistes de amebas
(Lamina 55-6F) (Marines. 1987). Los cultivos (descritos previamente)
aumentan la sensibilidad.
PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES
Los grupos de protozoos que habitan el tracto intestinal en humanos inclu-
yen las amebas, flagelados, ciliados, coccidios y microsporidios, sin ser todos
ellos patógenos. En una revisión de muestras fecales enviadas a los labora-
torios del departamento estatal de salud, Giardia lamblia estaba presente en
 1212 SECCIÓN VI
•II
RetOrttmOfUU inlestinalis
I nlcToiiHuus h o m i n i s
I ni a m o e b a ha r i m a n i l i
I nclionumas homniis
Indohmax nana
I rofozoítoi ( hilomaslix nKsnili
(nanita lamblia
D i e n l i i m o c b a tVagilis
lodaniocha hüischlii
r-nlamocba coli
l.iiiamocba histoMica
lialaniitlium coli
Itosponi IK-IIÍ
J L
XI) 40 20
M M
un 7,2%, £ histolytica en un 0,9%, Dientamoeba tragilis en un 0.5% y Cryp-
tosporidium spp. en un 0.2% de las muestras. Los protozoos no patógenos se
encuentran en aproximadamente el 10,7% de las muestras (Kappus, 1994).
La mayoría de las infecciones intestinales son adquiridas por vía fecal-oral,
tanto directamente, desde manipuladores de alimentos, como indirectamente,
a través del agua contaminada.
Para la mayoría de los laboratorios, la identificación de los protozoos intes-
tinales es uno de los aspectos más difíciles de la parasitología. Los protozoos
son pequeños y las especies patógenas se deben diferenciar de las no pató-
genas y de las células inflamatorias, de las células de endoteliales, de las
levaduras, de los pólenes y de otros objetos. Hay un número de característi-
cas que ayudan para la identificación de los protozoos intestinales. El tama-
ño es útil (Fig. 55-3) y un adecuado micrómelro ocular debe estar disponible.
La diferenciación de amebas de los flagelados en muestras húmedas o mate-
rial fresco es relativamente fácil por los seudópodos típicos de las amebas,
mientras que los flagelados se mueven más rápidamente, de un modo que se
asemeia a una hoja cayendo.
El número y el tamaño de los núcleos y el patrón de la cromatina. visto en
preparaciones con tinción permanente, son también útiles. Las características
del citoplasma incluyen fibrillas y otras estructuras típicas de los flagelados,
material ingerido en los trofozoitos amebianos y la masa de glucógeno y cuer-
pos de cromatina en quistes de amebas. Los flagelados suelen estar agran-
dados y con forma de huso, con uno o varios núcleos en un extremo.
Cuando se examina por cualquier método, las características nucleares y
citoplasmáticas se deben determinar a partir de un número de organismos
para completar la identificación. Cuando se informa de la presencia de dos o
más especies en una muestra, el observador debe ser capaz de definir las
diferentes poblaciones para evitar confundir algún organismo con apariencia
atípica.
Los trofozoitos predominan en las heces líquidas, pero degeneran en
menos de una hora a menos que se pongan conservantes. Los quistes pre-
dominan en las heces formadas y son más resistentes a la degeneración.
Ambas formas se pueden ver en el examen directo a partir de heces fres-
cas. La formalina no conserva bien los trofozoitos, y se pueden perder a
menos que se preparen extensiones con tinciones permanentes. Para la
• MICROBIOLOGÍA MÉDICA
0 20
Ooqu
Figura 55-3. Rangos de los tamaños de los proto-
20 40 (.0 zoos intestinales. (Los trofozoitos de B. cotí pue-
den medir hasta 200 pm.)
identificación definitiva se debe hacer un examen de muestras con tinción
permanente.
Amebas y Blastocystis hominis
Los tres géneros de amebas que pueden habitar el tracto intestinal huma-
no son: Entamoeba. Endolimax y lodamoeba. Los quistes se digieren y se
exquistan en el intestino delgado. El resultado es la proliferación de trofozoi-
tos por fisión binana en la luz del colon. Tanto los quistes como los trofozoitos
pueden salir con las heces, pero sólo los quistes maduros son infectivos.
Entamoeba histolytica es la única especie de ameba capaz de invadir tejidos
y producir enfermedad.
El género Entamoeba, caracterizado por la presencia de cromatina de la
membrana nuclear, incluye E. histolytica, el agente de la amebiasis; E. dis-
par, una especie no patógena idéntica a E. histolytica; E. hartmanni y £ coli.
que se encuentran habitualmente como especies comensales: y £ polecki que
se encuentra a veces en personas que tienen contacto con cerdos (Fig. 55-4)
(Gay, 1985: Levin, 1970). £ gingivaiis. que no tiene un estadio quistico
conocido, puede habitar en la boca de individuos con pobre higiene bucal
(Dao, 1983). £ polecki y £ gmgivalis se ven rara vez y no se describen más
adelante. Endohmax nana e /. bütschlii son especies no patógenas. Dienta-
moeba fragilis se reconoce actualmente como flagelada, aunque pierde su
flagelo externo y se explica en el texto dentro de los flagelados, pero puede
ser encontrada con las amebas en las tablas y figuras debido a sus simili-
tudes morfológicas.
Entamoeba histolytica. Esta ameba puede producir diversas enfermeda-
des, siendo las más comunes la disentería amebiana, la colitis amebiana y a
abscesos hepáticos (Beaver, 1984; Ravdin, 1988: Strickland, 1999). Los me-
canismos de defensa del huésped, el contacto previo con el parásito, la ali-
mentación y la cepa de Entamoeba histolytica son los responsables de la gra-
vedad de la infección. Los análisis de los patrones de isoenzimas han
mostrado que sólo ciertas cepas son invasivas y que la mayoría de las infec-
ciones no se detectan (Bruckner. 1992; Murray 1999). Las diferencias genéti-
cas y bioquímicas entre las cepas invasivas y no invasivas se han identifica-
 CAPÍTULO 55
do, y se ha propuesto que se denomine a la cepa no patógena Entamoeba
dispar (Diamond, 1993).
La disenteria amebiana, que es rara en EE.UU.. es una enfermedad
aguda que se caracteriza por diarrea sanguinolenta con calambres abdomi-
nales. Se produce una invasión de la mucosa intestinal, causando ulcera-
ción que puede conducir a perforación y peritonitis. La forma más común de
la enfermedad vista en este país es la colitis amebiana, que puede simular
una colitis ulcerosa y otra forma de enfermedad inflamatoria intestinal. Los
síntomas suelen ser menos graves que en la disentería amebiana, pero
pueden incluir diarrea no sanguinolenta, estreñimiento, dolor abdominal y
pérdida de peso. Se pueden formar pequeñas ulceraciones de la mucosa y
extenderse dentro de la submucosa formando úlceras. Se puede afectar
todo el colon o una parte, más frecuentemente el ciego, el recto-sigma o el
colon ascendente.
Los abscesos hepáticos por amebas son la forma extraintestinal más fre-
cuente de amebiasis, dándose aproximadamente en el 5% de los pacientes
que presentan amebiasis intestinal. Se caracteriza por fiebre y dolor en el
hipocondrio derecho. Estos abscesos hepáticos se suelen diagnosticar por
escáner, ecografía y test serológicos. Las amebas están presentes en las
heces en menos de la mitad de los pacientes en el momento de la detec-
ción del absceso hepático. La hepatitis amebiana. caracterizada por un
aumento doloroso del hígado en personas con amebiasis intestinal, también
puede producirse. Su patogénesis es aún poco conocida. Rara vez pueden
aparecer abscesos amebianos en otros órganos como pulmón, cerebro o
piel, bien por diseminación hematógena desde el intestino o bien por conti-
nuidad desde abscesos hepáticos. Se pueden formar masas de tejido gra-
nulomatoso (amebomas) como respuesta a la presencia de amebas,
pudiendo causar en el intestino una lesión en servilletero que podría simu-
lar un carcinoma.
Epidemiología. La mayoría de las infecciones por E. histolytica se
adquieren por ingesta de agua o alimentos contaminados, aunque un brote
se produjo por una irrigación colónica contaminada (Istre, 1982). Se pue-
den ver seudoepidemias a causa de la confusión en el laboratorio de las
* inrrt-cuentc. prohuhli'im'ntt- di- u n g e n aniíiKil.
Figura 55-4. Amebas halladas en las muestras fecales humanas. {Dientamoeba Iragilis es un flagelado.)
• PARASITOLOGÍA MEDICA 1213
células inflamatorias, otras amebas o restos fecales como si fuesen E. his-
tolytica (CDC. 1985; Krogstad, 1978). Aunque £ histolytica es un parásito
endémico de Estados Unidos, muchas personas lo adquieren durante via-
les o viviendo en países extranjeros.
Diagnóstico. El examen de una serie de muestras fecales puede ser
suficiente para el diagnóstico de amebiasis intestinal en la mayoría de los
casos. Si se han administrado antibióticos o medios de contraste, la infec-
ción puede ser enmascarada durante una temporada. El material aspirado
de un absceso hepático puede mostrar trofozoítos al microscopio. La últi-
ma porción del aspirado es la que más trofozoítos suele contener y puede
usarse para el examen microscópico directo o para tinción permanenle. Si
hubiese tejido disponible, la sección puede mostrar organismos que se
tiñen mucho con PAS (Lámina 55-7C)
Los cultivos (Diamond, 1988; Visvesvara. 1992a) no tienen un empleo
muy extendido para diagnóstico, pero son útiles para la investigación y
esenciales para determinar la patogenicidad basándose en las ¡soenzimas
Los test de detección de antigenos por EIA son específicos, sensibles y ca-
paces de diferenciar a Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar y están
disponibles en el mercado (Wilson, 1995; Murray, 1999; Rosenblatt, 1995).
En uso de las técnicas de PCR y de ADN también es útil para diferenciar
Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar (Bendall, 1993; Samuelson,
1989; Weiss, 1995), pero no están comercializadas.
Los test serológicos (Tabla 55-5) son los más útiles para el diagnóstico
de infección extraintestinal, ya que aproximadamente el 95% de los pacien-
tes con abscesos hepáticos son seropositives. Esto disminuye al 70% para
la infección intestinal y al 10% para los portadores asintomátícos. Los titu-
los detectables pueden durar meses o años tras el tratamiento correcto
(Wilson, 1995).
Los trofozoítos de Entamoeba histolytica miden de 10 pm a 60 pm de
diámetro; la forma comensal suele medir de 15 pm a 20 pm y las formas
invasivas unas 20 pm (Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5; Lámina 55-7), En el
examen directo, los trofozoítos muestran una movilidad progresiva gracias
a la rápida formación de un pseudópodo hialino que tiene una clara dife-
 to

Tabla 55-7 Morfología de los trofozoítos de las amebas intestinales

Tamaño (diámetro o Núcleo Citoplasma

Especies Motilidad
longitud) :
Número Cromatina periférica Cromatina cariosómica Apariencia Inclusiones
Entamoeba 10-60 um; talla habitual, Progresiva, con 1 Granulos finos Pequeño, discreto Finamente granular A veces eritrocitos
histolytica/ 15-20 (im en la forma pseudópodos hialinos No visible sin teñir Habitualmente distribución Habitualmente central en las formas
E. dispar comensal', en torno a como dedos y tamaño regular pero a veces excéntrico invasivas—
20 pm para las formas Las no invasivas
invasivas' contienen
bacterias
Entamoeba 5-12 pm; habitualmente Habitualmente no progresiva. 1 Similar a la Entamoeba Pequeño, discreto. Finamente granular Bacterias
hartmanni de 8-10 (im pero a veces puede ser progresiva No visible sin teñir histolytica Irecuentemente excéntrico
Entamoeba 15-50 um; Como una babosa, no progresiva, 1 Granulos bastos de tamaño Grande, discreto, Basto, frecuentemente Bacterias,
coli lo habitual 20-25 um pseudópodos abruptos Frecuentemente y distribución irregular habitualmente excéntrico vacuolado levaduras
visibles en preparación y otros materiales
sin teñir
Endoiimax 6-12 pm; Como una babosa habitualmente 1
nana lo habitual 8-10 (tm no progresivo, pseudópodos A veces visible en Ninguno Grande irregular Granular, vacuolado Bacterias
abruptos preparaciones sin teñir
lodamoeba 8-20 pm; Como una babosa, habitualmente 1
bütschiii habitualmente no progresiva No suele ser visibie sin teñir Ninguno Grande, habitualmente central. Bastamente granular, Bacterias, levaduras
12-15 pm Rodeado por granulos refráctiles vacuolado u otro material
y acromáticos. Estos granulos
no suelen verse en las
preparaciones teñidas
Dientamoeba 5-15 pm. Los pseudópodos son angulares, 2
fragilis* habitualmente aserrados o lobulados y alineados, (En el 20% sólo hay un núcleo.) Ninguno Grandes acúmulos de 4-8 granulos Finamente granular, Bacterias
9-12 pm casi transparentes Son invisibles en vacuolado
preparaciones sin teñir
'Habitualmente hallado en casos as¡niomáticos o crónicos, puede contener bacterias.
'Usuaimente hallado en casos agudos; con frecuencia contienen glóbulos rojos.
'Visible en material sin (¡jar Los núcleos se pueden ver a veces en material lijado
'•Flagelado (véase texto)
Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages Of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. Publicación n.- 1.966. 1969
 CAPÍTULO 55
I nuiiiwbjvu.il
bniumijcbu Insilili Ltv'j
Figura 55-5. Núcleos de amebas. Este dibujo muestra algunas de las distintas apariencias de los núcleos de las amebas en las preparacio-
nes teñidas. (Dientamoeba Iragilises un flagelado: véase texto.)
renciación entre el endoplasma y el ectoplasma: el núcleo no es visible. En
la enfermedad invasiva algunos trofozoítos contienen eritrocitos sin digerir
(Lámina 55-7C), una característica de la infección por E. histolytica. En las
preparaciones teñidas, la cromatina nuclear periférica suele distribuirse a lo
largo de la membrana nuclear como finos granulos. El cariosoma es peque-
ño y a veces centralmente emplazado, con finas fibrillas que no suelen ser
visibles y que lo sujetan a la membrana nuclear. Pueden existir variaciones
en la estructura nuclear, pudiendo estar algunos cariosomas localizados
excéntricamente y la cromatina periférica distribuida irregularmente. La
única característica que es patognomónica de E. histolytica es la fagocito-
sis de eritrocitos, que rarísima vez se produce en otras especies, El cito-
plasma es finamente granular y en los organismos invasivos no hay inclu-
siones, o bien únicamente inclusiones de eritrocitos. En los organismos no
invasivos pueden verse bacterias ingeridas. En los organismos en degene-
ración, el citoplasma puede ser vacuolado y el núcleo puede tener cromati-
na anormalmente agrupada.
Los quistes de E. histolytica son esféricos y miden de 10 pm a 20 pm
(habitualmente de 12 pm a 15 Jim) de diámetro (Tabla 55-8; véanse Figs.
55-3 a 55-5: Lámina 55-7). La fase de prequiste tiene un núcleo único y
carece de pared refráctil. Cuando madura, desarrolla otros núcleos, sien-
do cada uno aproximadamente 1/6 del diámetro del quiste. Los núcleos
son similares a los de los trofozoítos, pero su tamaño menor les hace
menos Utiles como característica dílerenciadora. El citoplasma puede con-
tener vacuolas de glucógeno y cuerpos cromaloides de extremos romos o
agudos. El numero y el tamaño de los núcleos, así como el aspecto de los
cuerpos cromatoides, son criterios importantes para la identificación de
los quistes.
En los laboratorios que no usan alguno de los métodos inmunológicos
o moleculares para diferenciar E. histolytica de E. dispar y que cuentan
únicamente con análisis morfológicos, se deben usar formatos de infor-
mes que tengan en consideración las tecnologías de diferenciación. Asi,
un informe de E. histolytica/E. dispar sería lo más apropiado en última ins-
tancia.
Amebas no patógenas. El microbiólogo debe estar capacitado para dife-
renciar las amebas no patógenas o comensales de la £ histolytica/ E. dispar
y de D. Iragilis (un flagelado), que son potencialmente patógenos. Las
características de identificación, que se ven mejor en cortes teñidos perma-
nentemente, se resumen en las Tablas 55-7 y 55-8 y en las Figuras 55-3 a
55-5. La identificación de trofozoítos se basa en el tamaño y las caracterís-
ticas del núcleo y del citoplasma: la identificación de quistes se basa en el
tamaño, numero y características del núcleo y en la presencia de los cuer-
pos de cromatina. así como en sus características, sin olvidar las masas de
glucógeno.
£ hartmanni tiene características morfológicas similares a las de £ his-
tolytica, excepto en que los trofozoítos tienen un diámetro máximo de 12 pm,
• PARASITOLOGÍA MEDICA 1215
y los quistes de 10 pm. teniendo los quistes a veces un núcleo único. His-
tóricamente. E. hartmanni tue llamada la raza pequeña de £ histolytica. Su
diferenciación requiere cuidadosas mediciones con un micrómetro ocular
bien calibrado.
Entamoeba coli. una habitante habitual del lumen, puede ser difícil de
diferenciar de E. histolytica. El citoplasma se tiñe algo más oscuro que el
de E. histolytica y es más vacuolado. conteniendo numerosas bacterias
ingeridas, levaduras y otros materiales. Aunque las características nucle-
ares difieren de las de Entamoeba histolytica (Fig. 55-5). puede existir
una superposición significativa, especialmente en muestras que no se
han conservado debidamente. Los quistes maduros de £ coli contienen
ocho núcleos, aunque pueden llegar a tener 16 o más. Los quistes inma-
duros, que son poco comunes, tienen cuatro núcleos (un cuarto del diá-
metro del quiste) mayores que los de E. histolytica (un sexto de diámetro
del quiste) y pueden contener glucógeno. La distribución de la cromatina
periférica y los cariosomas no tiene gran importancia en la identificación
de los quistes de Entamoeba. Los cuerpos cromatoides, cuando se pre-
sentan, son irregulares, con extremo desflecado, mientras que los extre-
mos romos se ven en £ histolytica.
Entamoeba nana es la ameba más pequeña que inlecta a los humanos.
Los trofozoítos con frecuencia tienen un núcleo atípico que contiene una
masa de cromatina triangular, una banda de cromatina que atraviesa el
núcleo o dos masas discretas de cromatina en los lados opuestos de la
membrana nuclear (Fig. 55-5). Un halo claro o espacio cariolinfoide rodea
el cariosoma y se extiende a la membrana nuclear. La forma nuclear ati-
pica puede ser útil en la diferenciación de £ nana de /. bütschlii que es
de una apariencia similar pero más larga. Los quistes de Endolimax sue-
len contener cuatro núcleos, aunque se pueden ver con menos núcleos.
El glucógeno, cuando está presente, se dispone difusamente por el cito-
plasma en vez de en masas. Los quistes se diferencian fácilmente de las
otras amebas, pero se pueden confundir con Blastocystis hominis. El
núcleo del Blastocystis hominis pierde el halo que se veía en los quistes
de £ nana.
El núcleo de los trofozoítos de /. bütschlii y sus quistes tienen un cario-
soma grande y central frecuentemente rodeado por granulos acromáti-
cos que pueden no ser diferentes, pero aparecen sólo como un halo o
espacio cariolinfoide. En algunos núcleos, el halo es claro sin granulos
acromáticos, haciendo al organismo indistinguible de £ nana. Los quis-
tes de /. bülschliicontienen un núcleo único en el que el cariosoma suele
ser excéntrico, con unos granulos acromáticos en media luna (véanse
Figs. 55-3 a 55-5). Los quistes se caracterizan por una vacuola promi-
nente de glucógeno que se tiñe de marrón rojizo en las muestras frescas
teñidas con yodo, de ahí el nombre del organismo. El glucógeno se di-
suelve con los fijadores acuosos y puede no ser visible en el material al-
macenado.
Tabla 55-8 Morfología de los quistes de a m e b a s intestinales
Núcleo Citoplasma
Especies Tamaño Contorno
Número Cromatina periférica Cromaiina cariosómica Cuerpos cromatoldes Glucógeno
Entamoeba 10-20 urn; Habitualmente esférico 4 en los quistes maduros. Cromatina periférica. Pequeña, discreta y Presente. Barras Habitualmente difuso.
histolytica/ habitualmente 1 ó 2 en los quistes Granulos uniformes. habitualmente central alargadas con Frecuentes masas
E. dispar 12-15 pm inmaduros finos y homogéneos extremos desflecados concentradas
en los quistes
jóvenes Se tiñen
de marrón rojizo
con el yodo
Entamoeba 5-10 urn Habitualmente esférico 4 en ios quistes maduros Similar a Entamoeba Similar a Entamoeba Presente. Barras alargadas Similar a
hartmanni riabitualmente 6-8 pm 1 ó 2 en los quistes inmaduros histolytica histolytica con extremos desflecados Enthamoeba
histolylica
Entamoeba 10-35 urn; Habitualmente esférico. 8 en los quistes maduros
colt habitualmente 15-25 urn Ocasionalmente ovaiado. Ocasionalmente quistes muy Cromatina periférica. Grande, discreto. Presente. Habitualmente Habitualmente difuso,
triangular u otro contorno nucleados con 16 o más Bastos granulos habitualmente excéntrico. con extremos castigados pero a veces masas
Los quistes inmaduros irregulares en tamaño y pero a veces central bien definidas en los
tienen 2 o más distribución, pero quistes inmaduros.
frecuentemente son más Se liñe de marrón
uniformes que los que se rojizo con el yodo
encuentran en los trofozoitos
Endolimax 5-10 pm; Esférico, ovalado o elíptico 4 en los quistes maduros. Ninguno Grande, habitualmente Ocasionalmente, granulos Habitualmente dituso.
nana habitualmente 6-8 urn A veces se ven quistes central pequeños o masas ovaladas Frecuentes masas
inmaduros con menos pero no están presentes en concentradas en los
de 4 núcleos los cuerpos vistos en quistes |óvenes.
Entamoeba Se tiñe de marrón
rojizo con el yodo
lodamoeba 5-20 pm; Ovalado, elíptico, triangular 1 en los quistes maduros Ninguno Grande, habitualmente Granulos a veces presentes. Masas compactas
biitschlii habitualmente 10-12 urn u otro contorno excéntrico. Granulos pero los cuerpos vistos en bien definidas.
'elráctiles. acromáticos Enlamoeba no están Se tiñen de marrón
en uno de los lados del presentes oscuro con el yodo
cariosoma
Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. PuDlicacion n " 1 966 1969.
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
Figura 55-6. A. Ciliados, coccidios y Blaslocyslis
spp. hallados en muestras tecales humanas. B,
Flagelados hallados en muestras tecales huma-
nas. (Adaptada de Brooke MM. Melvin DM: Mor-
phology ol Diagnostic Stages of Intestinal Para-
?
sites of Man (Publicación n. [CDC] 848116.)
Washington, DL, Departamento de Salud y Re-
cursos Humanos de los Estados Unidos, 1984.
Blastocystis hominis. Blastocystis hominis es un protozoo similar a la
ameba que habita en el intestino y se encuentra frecuentemente en mues-
tras fecales de individuos asintomáticos. Algunos estudios han relacionado
la enfermedad intestinal sintomática con infección grave, aunque esto es
controvertido (Markell, 1986; Miller 1988: Sheehan, 1986; Stenzel, 1996:
Zierdt, 1991). Los quistes pueden tomar una de las siguientes tres formas:
vacuolada, que es la más común, ameboide o granular. La vacuolada tam-
bién se conoce como forma vacuolada central, que suele ser esférica y de
tamaño variable (de 5 pm a 20 pm), con un área central clara y de dos a
cuatro núcleos periféricos (Fig, 55-6A; Lámina 55-8G). Las formas ame-
boides de contornos atípicos pueden predominan en infecciones graves.
La presencia de Blastocystis se debe informar, especialmente cuando son
numerosos (cinco o más por campo de 400x) (Sheehan. 1986; Stenzel.
1996).
Flagelados
Dientamoeba fragilis. Dientamoeba tragilis es un patógeno ameboide
que infecta el colon y se asocia a diarrea, especialmente en niños jóvenes
1217
(Preiss. 1991: Spencer, 1979; Tumer, 1985: Yang, 1977). Aunque es pareci-
do a las amebas. Dientamoeba se ha reclasificado como un flagelado basán-
dose en los detalles ultraestructurales y la similitud antigénica. No se le
conoce un estadio de quiste. Debido a la similitud de Dientamoeba a las
amebas en el microscopio de luz óptica, estas especies se han incluido tra-
dicionalmente en las tablas y figuras de las amebas (véanse Tabla 55-7; Figs.
55-3 a 55-5: Lámina 55-7H).
Los síntomas incluyen diarrea y distensión abdominal Recientes inves-
tigaciones sugieren que la dientamebiasis es una causa de diarrea más
frecuente de lo que se pensaba; el 4,3% de los pacientes en un estudio
podaban este organismo (Spencer, 1979: Murray, 1999). Aproximadamen-
te el 25% de las personas infectadas presentaban síntomas. En contraste
con la amebiasis, esta infección no suele asociarse con otros protozoos
fecales, pero muestra una asociación entre diez y veinte veces mayor de lo
esperado con enterobiasis (infección por oxiuros, analizado más adelante).
Esta asociación sugiere que la infección por D. tragilis puede estar difundi-
da por la ingesta de huevos de lombrices infectadas con D. tragilis
(Burrows. 1956). La infección por D. tragilis pasará desapercibida a menos
que se examinen preparaciones con tinción permanente. Pueden necesi-
 1218 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
tarse muchas muestras, ya que la eliminación varia día a día. Cuando se
preparan extensiones, la última parte de las muestras fecales debe ser la
examinada, ya que es donde mayor número de parásitos se pueden encon-
trar. De 2/3 a 4/5 de los organismos contienen dos núcleos que constan de
un grupo de cuatro a ocho granulos cariosómicos que pueden formar un
cariosoma grande e irregular (Fig. 55-5), Se puede confundir con trofozoí-
tos de Enlamoeba nana o de /. bütschlii. El citoplasma es finamente gra-
nular y suele contener bacterias ingeridas. Los trofozoítos son delicados y
pueden pasarse por alto fácilmente, de modo que la preparación teñida se
debe examinar cuidadosamente. Se ha descrito un método de inmunofluo-
rescencia que puede ayudar a su detección pero que no está comerciali-
zado (Chan, 1993).
Giardia lamblia. G. lamblia es un protozoo patógeno intestinal que pro-
duce endemias y epidemias por todo el mundo, y en EE.UU. es especial-
mente problemática para los viajeros, campistas y homosexuales (Wolfe,
1992), Frecuentemente produce enfermedad en personas que beben agua
contaminada, y se ha descrito un gran número de epidemias a partir del agua
en lugares como Aspen, Colorado. Leningrado. Rusia, Roma y Nueva York
(Craun, 1986). Los protozoos patógenos no mueren por las concentraciones
habituales de cloro de las aguas municipales, y así, salvo que se filtre, puede
actuar de fuente de infección, como ya sucedió en las epidemias de Roma y
Nueva York.
Los trofozoítos de G. lamblia se multiplican en el intestino delgado y
atacan la mucosa mediante una ventosa ventral cóncava. Puede ser
asíntomática o producir patología que va desde diarrea leve con vagas
molestias abdominales hasta un síndrome de malabsorción con diarrea y
esteatorrea, parecido a esprúe. La patogenia no está totalmente com-
prendida, aunque puede darse una interrupción de la integridad del
borde en cepillo de la mucosa, produciendo déficit de disacaridasas debi-
do al efecto directo o indirecto del parásito (Wolfe, 1992). La giardiasis
se debe considerar en todo paciente con diarrea de más de diez días de
duración.
El diagnóstico se hace demostrando los trofozoítos o quistes de Giardia en
las muestras fecales. Los trofozoítos suelen estar en las heces díarreicas,
mientras que los quistes están en las heces formadas. La eliminación de los
organismos varía de día en día, por lo que puede ser necesario el examen
de diferentes muestras en diferentes días. El examen directo suele ser espe-
cialmente útil para el hallazgo de los trofozoítos con su motilidad en "caída
de hoja". Los quistes se pueden ver tanto en examen directo como en con-
centraciones, y tanto quistes como trofozoítos se pueden ver en tinciones
permanentes. En algunos casos no se pueden hallar en muestras fecales y
son necesarios pequeños aspirados intestinales o muestras del test de la
cuerda. El laboratorio debe ser avisado de antemano para que el personal
esté disponible para la realización de un examen directo nada más recibir la
muestra.
Muchos métodos de detección de antígenos por inmunofluorescencia o
por EIA están comercializados (Wilson, 1995; Wolfe, 1992; García, 1997).
Parecen tener buena sensibilidad y especificidad y pueden detectar algu-
nas infecciones no detectadas por el examen de las heces. También pue-
den ser especialmente útiles en investigación epidemiológica, pero no
reemplazan la necesidad de los tradicionales estudios morfológicos para
detectar otros parásitos.
Los trofozoítos de Giardia mirados desde el exterior tienen una torma
de pera con extremo posterior en forma de huso y poseen dos núcleos
que les da el aspecto de una cara sonriendo con ojos prominentes (Tabla
55-9: véanse Fig. 55-68 y Lámina 55-8C a E). Cuando se ven desde un
lado, el extremo anterior es más grueso y ahusado posteriormente: la
mitad anterior consta de una ventosa en la cara ventral. Los cuatro flage-
los laterales, los dos ventrales y los dos caudales no suelen ser evidentes
en las muestras frescas o en las preparaciones teñidas. Los quistes son
ovales y suelen ser tener cuatro núcleos. Bajo el núcleo, los cuerpos me-
dios oscuros con fibrillas se cruzan longitudinalmente, dando unas carac-
terísticas internas distintivas. El citoplasma suele estar apartado de la pa-
red de los quistes.
Chilomatix mesnili. C. mesnili (Tabla 55-9; Fig. 55-68; Lámina 55-8F) es
un flagelado habitual del lumen no patógeno, que se debe distinguir de los tro-
fozoítos de las amebas y de Giardia en las preparaciones. La localización del
único núcleo en uno de los extremos y la forma de huso del otro extremo es
útil. Si se examinan varios organismos, serian visibles el citoplasma y el surco
espiral en algunos de ellos. Los tres flagelos externos no suelen ser visibles
en preparaciones teñidas o fijadas con formalina. Los quistes con forma de
limón contienen varias fibras citosomales curvas con un aspecto parecido a
un imperdible.
Pentatrichomonas hominis. P. hominis. conocida antiguamente como
Trichomonas hominis (Tabla 55-9; Fig. 55-68) es un raro flagelado intesti-
nal no patógeno que se puede confundir con Entamoeba hartmanni o los
pequeños trofozoítos de Entamoeba histolytica. No se tíñen especialmente
bien y frecuentemente se distorsionan en las preparaciones. Hay que exa-
minar muchos de ellos en las preparaciones teñidas para lograr ver el
núcleo único similar al de Entamoeba. la membrana ondulada y los flage-
los. Un objeto prominente similar a una vara, el axostilo, atraviesa el orga-
nismo y protruye en el extremo posterior. No se han descrito estadios quis-
ticos.
Trichomonas vaginalis. Trichomonas vaginalis es una causa fre-
cuente de vaginitis, caracterizada por inflamación, prurito, flujo vaginal y.
a veces, disuria. Se suele transmitir por relación sexual, frecuentemen-
te por varones que tienen una infección asíntomática. A veces los hom-
bres pueden padecer una prostatitis o una uretritis. Trichomonas vagi-
nalis se suele diagnosticar en el mismo despacho del médico mediante
un examen directo del flujo vaginal o del prostético, o bien del sedimento
de orina. Morfológicamente, Trichomonas vaginalis se asemeja al P. ho-
minis. pero es más grande (cerca de 23 pm) y la membrana ondulante
se extiende sólo hasta la mitad del cuerpo. Debido a la diferencia en el
habitat, no suele ser necesario diferenciar estas Trichomonas morfológi-
camente.
El examen directo puede ser insensible y el uso de cultivo o las técnicas
de inmunoensayo se recomiendan cuando el diagnóstico no es fácil (García,
1997; Visvesvara, 1992b; Wilson, 1995). Los cultivos tienen una sensibilidad
de aproximadamente el 90% (Beal, 1992; Krieger, 1988; Schmid. 1989), así
como las técnicas inmunofluorescentes y el EIA que usan anticuerpos mono-
clonales (Kreiger, 1988; Lisi, 1988; Wilson, 1995). La tinción de Papanicolaou
puede revelar T. vaginalis en ocasiones, pero tiene baja sensibilidad y espe-
cificidad.
Otros flagelados. Enteromonas hominis y Retortamonas intestinalis son
flagelados intestinales pequeños, no patógenos, que se ven rara vez y que
cuando están presentes pueden darse en gran número. Las características
morfológicas se revisan en la Tabla 55-9 (véase también la Fig. 55-68). Tri-
chomonas tenax son unas tricomonas que veces se aislan en la cavidad oral,
pero no causan enfermedad.
Ciliados
Balantidium coli. B. coli (Fig. 55-6A; Lámina 55-8H) puede causar un
síndrome similar a la disentería con úlceras en el colon similares a las de
las amebas, pero no produce abscesos hepáticos u otras lesiones sisté-
micas. La inlección humana, rara en EE.UU., se puede adquirir de los cer-
dos, que son los habitualmente infectados. 8. coli es el protozoo más
grande que infecta a los humanos. Los trofozoítos van desde 40 pm hasta
cerca de 200 pm en su mayor tamaño (la mayoría son de 50 pm a 100 pm)
y están cubiertos uniformemente con cilios que son ligeramente más lar-
gos en el extremo anterior, adyacente al citostoma. Hay un gran núcleo
que se ve tácilmente en las preparaciones, y un micronúcleo más peque-
ño que rara vez es visible. En el citoplasma hay numerosas vacuolas ali-
menticias y vacuolas contráctiles. Los quistes son redondos, midiendo de
50 pm a 70 pm de longitud. En los quistes más jóvenes se pueden ver
cilios y las características nucleares son similares a las de los trofozoítos.
Las muestras fecales contaminadas con agua estancada pueden contener
ciliados de vida libre que pueden diferenciarse de 8. coli por el patrón
ciliar.
Tabla 55-9 Morfología de los flagelados intestinales
Especies Tamaño Forma Motilidad U.- de núcleos N° de flagelos' Otras características

Trofozoítos
Pentatrichomonas 8-20 LUTI; Forma de pera Rápida, en sacudidas 3-5 anterior. Membrana ondulada que se extiende a lo largo de
lodo
hominis' habilualmente 11-12 um No visible en preparaciones 1 posterior el cuerpo
sin teñir
Chilomastix 6-24 urn Forma de pera Rotatoria, rígida 1 3 anterior, Citostoma prominente que se extiende un tercio o la
mesnih No visible en preparaciones 1 en el citostoma mitad Surco espiral a lo largo de la superficie
habitualmente 10-15 um sin teñir ventral
Giarda Forma de pera Caída de hoia 2 4 lateral Ventosa que ocupa la mitad o tres cuartos
lamblia 10-20 (im; No visible en preparaciones 2 ventral. de la superficie ventral
sin teñir 3 caudal.
Enteromonas habilualmente 12-15 u.m Oval En sacudidas 1 3 anterior. Un lado del cuerpo es plano. Flagelo posterior que se
hominis No visible en preparaciones 1 posterior extiende libremente hacia el posterior o el lateral
4-10 um; sin teñir
Relorlamonas Forma de pera u oval En sacudidas 1 1 anterior, Citostoma prominente que se extiende
intestinalis habilualmente 8-9 um No visible en preparaciones 1 posterior aproximadamente hasta la mitad del cuerpo
sin teñir
4-9 um,
Especies Forma
?
N. de núcleos Otras características
Quistes habitualmente 6-7 (jrn
Chilomastix 6-10 jim; Forma de limón con unos botones 1 Citostoma con fibrillas de soporte. Habitualmente
mesnih habilualmente 8-9 um hialinos anteriores o "pezón' No visible en preparaciones sin teñir visible en preparaciones teñidas
Giardia lamblia Tamaño
8-13 ym; Oval o elíptico Habitualmente 4 No diferenciabies en Fibrillas o flagelos longitudinales en el quiste
preparaciones sin teñir Habitualmente localizados Citoplasma frecuentemente apartado a una porción
habilualmente il-i2u.m en un extremo de la pared del celular
Enteromonas hominis Alargado u oval 1 -4 habitualmente 2 en el extremo opuesto Se asemeía al quiste de E. nana. Los flagelos o
4-10 um; del quiste, no visible en preparaciones sin teñir fibrillas no suelen verse
Retortamonas intestinalis habitualmente 6-8 ym Forma de pera o similar a un limón •

4-9 um. No visible en preparaciones sin teñir Se parece al quiste de Chilomastix. Sombra exterior al
habitualmente 4-7 um citoplasma con fibrillas de soporte que se extienden
sobre el núcleo
'No es practico para la identificación de especies en el examen ordinario
'Pentatrichomonas hormnis no tiene forma guistica.
Adaplada de Brooke MM Melvm MD Morpnology of Diagnostic Stages of Intestir is of Mai USDHEWPHS Publicación n.1.966 1969

No
—-
~o
 1220 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Coccidios
Los coccidios comprenden un gran grupo de parásitos apícomplejos que
tienen una lase sexual en el intestino de los vertebrados e invertebrados.
Algunas especies pueden también desarrollarse asexualmente en zonas
extraintestinales en los tejidos del huésped. Los géneros infectantes del
intestino humano, como Isospora. Sarcocystis. Cryptosporidium y Cyclos-
pora suelen producir una diarrea autolimitada en personas inmunocompe-
tentes. Se puede desarrollar una diarrea grave en inmunosuprimidos tras la
infección de Isospora. Cryptosporidium y Cyclospora.
Isospora belli. Isospora belli sufre un desarrollo sexual y asexual en el
citoplasma de las células epiteliales del intestino delegado (Lámina 55-9/4).
El desarrollo sexual produce ooquistes. que pasan a las heces y maduran
a fase infectiva en el medio ambiente. La infección humana causa diarrea
y malabsorción. que suele ser autolimitada. En pacientes con sida u otra
inmunosupresión, la enfermedad puede durar meses o años y podría cau-
sar la muerte (DeHovitz, 1986; Mannheimer. 1994). El diagnóstico se hace
hallando ooquistes no esporulados de 12 x 30 pm en las heces, habitual-
mente en examen directo o en preparaciones concentradas (Lámina 55-9S).
Si la muestra sin fijar se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 ho-
ras, se produce la esporulación. Los ooquistes infectivos contienen dos es-
poroquístes, cada uno de los cuales tiene cuatro esporozoitos (Fig. 55-6/4)
Los ooquistes. como los de Cryptosporidium, se tiñen con tinción ácido re-
sistente.
Sarcocystis spp. Las especies de Sarcocystis son coccidios de
doble huésped en los que la lase sexual se da en el intestino de carní-
voros y la asexual o extraintestinal se da en los músculos y tejidos de
huéspedes intermediarios. Los humanos pueden servir como huéspedes
intermedios o como huéspedes definitivos, dependiendo de la especie de
Sarcocystis. La infección intestinal con S. hominis y S. suihominis se
adquiere por ingesta de carne poco hecha (vaca o cerdo) respectiva-
mente, que contiene los quistes tisulares (sarcoquisles), La infección
suele ser asmtomática, pero algunos pacientes desarrollan diarrea pasa-
jera, dolor abdominal o anorexia. La infección intestinal es autolimitada,
ya que la multiplicación asexual se produce en el huésped intermediario
y no se repite en el huésped definitivo. La producción de ooquistes se
limita por el número de organismos ingeridos como sarcoquistes. El diag-
nóstico se hace al detectar los esporoquistes esporulados de 25 x 33 pm
en las heces (Fig. 55-6A). Cada esporoquiste maduro contiene cuatro
esporozoitos. La pared de los ooquistes es fina y no suele verse o se
rompe liberando dos esporoquistes. Estas formas, que se ven mejor en
examen directo o en tinciones ácido resistentes, parecen más grandes
que los ooquistes de Cryptosporidium, y la tinción de tricromo es de poco
valor en la detección de estos parásitos. Los hombres también puede ser-
vir de huésped intermediario en muchas especies innominadas de Sar-
cocystis (conocidos colectivamente como S. lindemannt), en cuyo caso
los quistes se encuentran en los músculos esqueléticos y cardíacos (Bea-
ver. 1979: Strickland, 1999).
Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum utiliza un único
huésped en su ciclo vital, pero puede infectar a humanos y a una gran
variedad de animales, incluidos los de ganado vacuno y ovino. Los pará-
sitos se desarrollan en el borde en cepillo de las células endotelíales del
intestino y a veces se extienden a otras zonas como la vesícula biliar, el
páncreas o el tracto respiratorio (véanse Fig. 55-6A y Lámina 55-9Cy 0).
Cryptosporidium es una causa frecuente de diarrea aguda autolimitada
en personas sanas, especialmente en niños. La epidemiología es similar
a la de Giardia. Uno de los mayores brotes conocidos transmitido por
agua se produjo en Milwaukee y Wisconsin en el año 1993. En este brote,
más de 400.000 personas cayeron enfermas por beber agua contamina-
da con vertidos de granjas tras unas fuertes lluvias (McKenzíe, 1994).
Como los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium son
resistentes a la cloracíón habitual del agua potable, y a menos que el
agua comunitaria se filtre, pueden darse epidemias. En pacientes con
sida, Cryptosporidium puede producir diarrea secretora crónica que
puede durar meses o años y puede acarrear la muerte. El período de
incuóación es aproximadamente de ocho días, y en personas previamen-
te sanas puede durar de 9 a 23 días. Los pacientes pueden tener males-
tar, liebre, anorexia, calambres abdominales y diarrea (Current, 1991;
Mannheimer, 1994).
El diagnóstico se suele hacer examinando las heces. Existen varios
métodos de concentración que son buenos, incluidas la sedimentación con
formalina-etil acético y la flotación en azúcar de Sheather (García, 1983).
La disponibilidad del método de formalina-etil acético hace a esta técnica
muy atractiva, aunque se deben incrementar al máximo el tiempo y la velo-
cidad de centrifugación para maximizar el rendimiento (NCCLS, 1997;
Isenberg. 1992), Se prepara una extensión con el sedimento y se tiñe con
tinte ácido resistente o reactivos inmunolluorescentes. Se han evaluado
muchos métodos de tinción ácido resistente, incluida la auramina-O, pero
el que tiene un uso más extendido es el método de Kinyoun modificado.
Los ooquistes esféricos miden de 4 pm a 6 pm de diámetro y cuando se
tiñen de este modo se tornan a un fucsia profundo, aunque hay algunas
irregularidades en la intensidad de la tinción y puede variar el porcentaje
de los quistes que se tiñen. Se debe usar un control positivo en cada pre-
paración.
Son especialmente buenos los reactivos de inmunofluorescencia y de EIA,
con alta sensibilidad y especificidad (Arrowood. 1989; Murray. 1999; Rosen-
blatt, 1993; Rusnack, 1989), para los laboratorios donde es poco habitual el
hallazgo de Cryptosporidium y donde hay dificultad para la interpretación de
las tinciones ácido resistentes.
La necesidad de examinar heces para Cryptosporidium depende de la
población a cubrir, de los objetivos, de los intereses y de la habilidad del per-
sonal del laboratorio. Algunos laboratorios realizan exámenes para Cryptos-
poridium sólo si se pide específicamente y otros examinan todas las muestras
de los inmunosuprimidos.
Cyclospora cayetanensis. Cyclospora cayetanensis es un parásito
coccidio de reciente descripción responsable de enfermedad diarreica en
inmunocompetentes e inmunosuprimidos (Ortega, 1994: Murray. 1999).
Se ha deteclado en pacientes de diferentes países, incluido Estados Uni-
dos, y fue inicialmente descrito como un alga verde-azulada, similar a un
cuerpo parecido a una cianobacteria, o como un coccidio (Ortega. 1993).
La infección produce un cuadro seudogripal, con náuseas, vómitos, pér-
dida de peso y diarrea acuosa explosiva que dura de una a tres semanas.
Los ooquistes no esporulados son esferas no retráctiles de 8 pm a 10 pm
que contienen un acumulo de glóbulos refráctiles englobados dentro de
una membrana cuando son vistos al microscopio de luz óptica. Se
requieren de una a dos semanas para su esporulación, después los
ooquistes maduros contienen dos esporoquistes, cada uno con dos
esporozoitos. En las tinciones de tricromo los ooquistes aparecen como
objetos claros, redondos y algo arrugados. Los ooquistes autofluorecen
desde un verde brillante a un azul intenso bajo la epifluorescencia ultra-
violeta y las técnicas de tinción con colorante ácido resistente modifica-
do o auramina-O. Se deben diferenciar de los ooquistes de Cryptospori-
dium, que se tiñen de igual forma pero son más pequeños (de 4 pm a 6 pm)
(Lámina 55-9E).
Microsporidios
Los microsporidios son unos parásitos protozoos lormadores de espo-
ras, intracelulares estrictos, del filo Microspore que infectan a variedad de
animales, incluidos los humanos (Franzen. 1999: Shadduck. 1989). Hay
importantes patógenos en los huéspedes inmunosuprimidos, especial-
mente en aquellos con sida, siendo responsable en ellos de un gran por-
centaje de diarreas inexplicables por otra causa (más del 30% en algunos
estudios) (Curry, 1993). Enterocytozoon bieneusiy Encephalitozoon intes-
tinalis, las dos especies más frecuentemente implicadas en la infección
intestinal humana, pueden producir diarrea y pérdida de peso en los
pacientes con sida, similares a las causadas por Cryptosporidium. E.
intestinalis también puede producir enfermedad diseminada (Cali, 1993;
Willson, 1995).
Los organismos se multiplican mtracelularmente (merogonia) y forman
esporas resistentes (esporogonia) que rompen ocasionalmente la célula
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
Figura 55-7. Tamaños relalivos de los huevos de helmintos. (Del CDC. Rama de Entrenamiento Parasitológico, Atlanta. GA.)
huésped e infectan las células adyacentes o se eliminan al exterior. La
esporas contienen un túbulo enrollado que se refuerza por el apropiado
estimulo ambiental y penetra la membrana de las células receptoras. El
esporoplasma del parásito se inyecta a través del túbulo al citoplasma de
la célula huésped, donde se multiplica. Los reservónos no se han identifi-
cado. A veces ha habido pacientes que han sido infectados por otros géne-
ros de microsporidios, incluidos Encephalitozoon (hepatitis, infección ocu-
lar, enfermedad del sistema nervioso central). Nosema (infección
diseminada) y Pleistophora (miosiüs) (Curry. 1993: Shadduck. 1989). entre
otras (Franzen. 1999).
Hasta hace poco, el diagnóstico requería el examen de los tejidos al
microscopio de luz óptica (Lámina 55-9Fy G) y al microscopio electrónico.
El desarrollo de una tinción de tricromo modificada para el examen de
muestras fecales para esporas ha resultado un importante avance en el
diagnóstico (Weber. 1992). Con este método, las pequeñas esporas elípti-
cas (de 1,5 pm a 3 pm) se tiñen de rojo sobre un fondo débilmente verde, y
algunas poseen una característica banda cruzada (Lámina 55-9H). También
se han descrito modificaciones de este método. Las tinciones fluorocromas,
así como la Uvitex 2B y la calcotlúor blanco, parecen ser más sensibles en
la detección de esporas y pueden ser útiles en el screening inicial de la
muestra (DeGirolami, 1995: Luna, 1995: van Gool, 1993). El pequeño tama-
ño de las esporas hacen de su detección todo un reto.
HELMINTOS INTESTINALES
Los helmintos intestinales aquí tratados incluyen nematodos (gusanos
redondos), cestodos (tenias) y tremátodos (lombrices), que residen como
adultos en el tracto de gastrointestinal o en otras localizaciones (hígado,
pulmón o sangre) y que producen huevos que salen dei cuerpo humano
por vía intestinal. Los tamaños para los helmintos adultos van desde 1 mm
1221
hasta cerca de 10 m de longitud, y para los huevos de 25 pm a 150 pm
(Fig. 55-7).
Es importante una comprensión de los ciclos vitales de los helmintos y de
su distribución geográfica para el conocimiento de las fases parasitarias que
pueden encontrarse ante una sospecha, qué órganos o tejidos pueden afec-
tarse y cuándo se puede esperar que aparezcan los diferentes estadios tras
la exposición. Aunque el diagnóstico suele depender del hallazgo e identifi-
cación de un estadio del desarrollo (huevo, larva o adulto), algunas infeccio-
nes se puede diagnosticar principalmente por la clínica o los datos serológi-
cos, o ambos.
Ciertas especies tienen ciclos de desarrollo donde los estadios infecciosos
se pueden transmitir directamente de persona a persona (Enterobius y H.
nana). En otros (Trichuris. Ascaris y Trichostrogylus) se requiere un periodo
extra de maduración en el extenor del huésped antes de que el huevo o la
larva sean infecciosos. La ingesta de los estadios infecciosos puede ser acci-
dental por el parásito vector iDipylidium. Hymenolepis). plantas (Fasciolopsis.
Fasciola) o tejidos animales (Trichinella, Taenia. Diphyllobolhrium. Clonorchis.
Opisthorchis. Paragonimus. Heterophyes. Melagonimus y Nanophyelus). En
algunos casos las larvas pueden penetrar directamente la piel (uncinarias.
Strongyloides y esquistosomas).
La detección e identificación de los huevos y larvas en heces, orina o espu-
to requieren una sistemática aproximación y el entrenamiento adecuado del
personal. El tamaño de los huevos y de las larvas es una característica espe-
cialmente importante, y con frecuencia se requiere el uso de un micrómetro
ocular calibrado. Se debe prestar atención a las características externas de
los huevos, incluida la forma, el grosor de la pared, la presencia o ausencia
de cubierta mamelonada. opérculos, hombros operculares. botón, tapón polar
o espinas. También se debe observar el desarrollo de los huevos (embriona-
dos o sin embrionar) la presencia o ausencia de ganchos, que caracterizan a
los cestodos. El examinador también necesita conocer la gran variedad de
artefactos que se detectan en las heces y que pueden simular huevos o lar-
vas (Tabla 55-4).
 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1222
Nematodos
Enterobius vermicularis. La infección por Enterobius u oxiuros es la
infección helmíntica más frecuente en niños de todos los estratos sociales
en EE.UU. Aunque es principalmente típica de los niños, la rápida madura-
ción de los huevos permite que sea fácilmente transmitida de niño a niño y
a adultos tanto en familias como en instituciones. Los gusanos machos o
hembras viven principalmente en el ciego y en las áreas adyacentes. Las
hembras miden más de 13 mm y tienen un extremo posterior puntiagudo
que da pie a su nombre, oxiuro. Ambos sexos tienen prominentes alas late-
rales que se ven en una sección axial y un bulbo esofágico prominente
(Lámina 55-1OA a C).
Aunque los machos rara vez son vistos, las hembras se pueden encon-
trar en la superficie de las heces o en la piel perianal, especialmente por la
noche, donde deposita sus huevos; éstos son incoloros y ovoidales con un
lado aplanado y miden entre 20 pm y 40 pm de ancho y de 50 pm a 60 pm
de largo (Lámina 55-106). Se hacen infectivos en horas y Iras ser ingeri-
dos completan el desarrollo hasta adultos grávidos en un mes (período de
latencia).
Aunque la infección puede ser asintomática. los niños frecuentemente tie-
nen prurito anal, irritabilidad e insomnio. La infección por Enterobius debe ser
descartada en todo estudio de enuresis. Los gusanos adultos pueden migrar
a zonas inusuales, como la vagina, la trompa de Falopio o la cavidad perito-
neal. Su muerte en estas localizaciones puede producir una reacción infla-
matoria granulomatosa (Symmers. 1950).
La detección de los huevos y. a veces, de los gusanos adultos en la piel
perianal se hace mediante la técnica de papel de celofán durante el sueño o
a primera hora de la mañana (Ash, 1987; García, 1997). En el examen habi-
tual de las heces sólo se detecta del 5% al 10% de los casos. Se requiere un
examen de muestras tomadas en diferentes días para poder detectar los hue-
vos (Sadun, 1956).
Trichuris thchiura. La infección por Trichuris es típica de las zonas tro-
picales y subtropicales. Los gusanos adultos se hallan en el intestino y espe-
cialmente en el ciego, pero las infecciones graves se pueden ver en el colon
y en el recto. Los machos y hembras miden más de 50 mm de longitud y per-
manecen en la mucosa por el extremo anterior, que es fino, mientras que el
otro extremo, más grueso, cuelga libremente en la luz. La hembra es alarga-
da, mientras que la cola de los machos es enrollada (Lámina 55-10D). Tri-
churis tiene un ciclo vital en el que los huevos salen con las heces sin
embrionar y tarda varias semanas, en las adecuadas condiciones de la tie-
rra, en madurar a un estadio infectivo. Cuando se digieren huevos embrio-
nados, se liberan larvas y maduran en el colon, donde se fijan y viven más
de diez años.
Las infecciones leves suelen ser asintomáticas, pero cuando hay muchos
parásitos (más de 300 gusanos) pueden aparecer diarrea o síntomas de
disentería junto con deshidratacíón y anemia (Beaver, 1984; Strickland, 1999).
Una posible complicación en niños con infecciones graves es el prolapso rec-
tal (Cooper, 1988).
El diagnóstico se hace al hallar los huevos en las muestras fecales o
con técnicas de conservación. Los huevos son como barriles, con unos
tapones refráctiles en ambos extremos, y suelen medir de 50 pm a 55 pm
de largo por 22 pm a 24 pm de ancho (Lámina 55-10E). A veces, los
humanos se pueden infectar por el gusano del perro, T. vulpis, que posee
unos huevos más grandes y anchos que los de Trichuris trichiura. A veces
pueden ser necesarias técnicas de cuantificación de los huevos para valo-
rar la intensidad de la infección, la eficacia del tratamiento y la tasa de
reinfección.
Capillaria philippinensis. Este parásito, que normalmente se
encuentra en pájaros que se alimentan de peces, afecta a humanos que
comen pescado crudo y que contiene larvas. Aunque se describió en
personas de Filipinas, y luego en Tailandia, a veces se ven casos en
otras partes de Asia. Oriente Medio y Sudamérica (Cross, 1992). Puede
producir diarrea crónica y los infectados pueden eliminar huevos, larvas
y gusanos adultos en las heces. Los huevos son similares a los de Tri-
churis, aunque miden de 36 pm a 45 pm de largo y 21 pm de ancho, con
un grueso caparazón con estrías radiales y tapones mucosos que son
poco llamativos.
Ascaris lumbricoides. Este es el nematodo más largo que afecta al
tubo digestivo humano y probablemente el gusano intestinal redondo más
frecuente, puesto que infecta a aproximadamente 1,3 billones de personas
en todo el mundo (Markell, 1999). Afecta principalmente a regiones con
pobre higiene y, como el Trichuris, es más común en niños, siendo, a su vez,
los más predispuestos a las infecciones graves.
Ascaris adulto vive principalmente en el duodeno y en el yeyuno proximal.
Las hembras miden más de 35 cm de largo por 6 mm de diámetro. El macho
es algo más pequeño y tiene un extremo curvado ventralmente, a diferencia
de la hembra (Lámina 55-10F). Tanto los inmaduros como los adultos se pue-
den identificar por la presencia de tres labios prominentes en su porción
anterior.
Las hembras producen unos 2.000 huevos al día, que están sin embrionar
y requieren de 4 a 6 semanas en un ambiente óptimo para que sean infecti-
vas. Posteriormente, al ingerirlos alcanzan el intestino y las larvas penetran
en la mucosa llegando al torrente circulatorio. De ahí son transportados a los
pulmones, donde maduran rápidamente en el lecho capilar alveolar y luego
pasan al alvéolo. Los mecanismos de aclaramiento mucociliar los arrastran
hasta la epiglotis y nuevamente son ingeridos y se hacen adultos en el intes-
tino. Desde que son huevos hasta que alcanzan el estadio adulto pasan
aproximadamente dos meses.
La clínica de la ascariasis va desde la infección asintomática a la enferme-
dad grave. El paso de las larvas por los pulmones puede causar una neumo-
nitis por Ascaris o un síndrome de Lóffler, caracterizado por infiltrados pulmo-
nares difusos bilaterales y bronquitis con eosinofília asociada. Este síndrome
es infrecuente y habitualmente se produce en individuos previamente expues-
tos a los antígenos de los Ascaris.
La presencia de escaso número de gusanos en el intestino no suele
advertirse, mientras que la infección grave produce diferentes grados de
diarrea y dolor abdominal. También puede producirse una obstrucción
intestinal con una masa de gusanos, especialmente en niños. Incluso con
poco número de gusanos, hay que estar alerta, ya que tienen facilidad para
invadir sitios ectópicos, como la vía biliar y el hígado, el apéndice y el
estómago. La fiebre y el tratamiento pueden favorecer su migración. En las
zonas endémicas con frecuencia se usan antihelmínticos antes del uso de
anestesia en la cirugía.
El diagnóstico se realiza al visualizar los huevos en las heces o por la
detección de un gusano adulto en el vómito o en las heces. Un recuento
menor de 20 huevos por extensión (2 mg de heces) indica infección leve, y
si es mayor de 100 huevos, por extensión, indica infección grave.
Los huevos fértiles de Ascaris pueden ser redondos o ligeramente ovales,
con una cubierta irregular externa, mamelonada, amarilla-marrón y con un
caparazón grueso. Los huevos que pierden su cubierta se llaman decortica-
dos y pueden asemejarse a los de las uncinarias. Se eliminan sin embrionar
y miden aproximadamente de 55 pm a 75 pm de largo por 35 pm a 50 pm de
ancho (Lámina 55-10G y H). Las hembras pueden producir huevos sin fertili-
zar, que son más largos y más alargados (más de 90 pm de longitud) y tienen
una cubierta más fina y con mamelones irregulares. Estos huevos están lle-
nos de gotas de grasa irregulares.
Trichostrongylus spp. La enfermedad humana causada por Trichos-
trongylus spp. representa una infección zoonótica, ya que infecta principal-
mente a herbívoros como la oveja, la vaca o las cabras. Hay distintas espe-
cies que pueden infectar a humanos como, T. colubriformis. T. orientalis. T.
axei y T. brevis, que se encuentran en muchas partes del mundo. Los gusa-
nos adultos habitan en el intestino y producen huevos que maduran en el
exterior. Las larvas salen y se colocan entre la tierra y la vegetación, donde
pueden ser ingeridos por sus huéspedes definitivos. A diferencia de las unci-
narias. no invaden la piel directamente ni poseen una fase migratoria por los
pulmones. Las infecciones suelen ser leves y asintomáticas, pero las graves
pueden dar diarrea y dolor abdominal, habitualmente con eosinofília. Los hue-
vos son semejantes a los de las uncinarias pero más largos y estrechos, de
78 pm a 98 pm por 40 pm a 50 pm y ligeramente ahusados en un extremo.
Uncinarias. Las uncinarias, que están entre los helmintos que con más
frecuencia afectan a los humanos, se dan en regiones tropicales y subtropi-
 CAPÍTUIO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
Figura 55-8. Larvas de uncinarias y de Strongyloides slercolans A. Larva rabdiloi-
de de S. slercolans en heces humanas. Obsérvese el corto tamaño de la cavidad
bucal y el gran primordio genital (GP). 6, Larva rabditoide de uncinarias vista en las produce en zonas templadas y que históricamente fueron áreas endémicas
heces dejadas 24 horas a temperatura ambiente. La cavidad bucal es más larga y
el primordio es más corto
cales y en algunas zonas templadas. Necaloramericanus se halla en EE.UU.
y en otras partes del mundo, superponiéndose su distribución con la de
Ancylostoma duodenale. que no se da en EE.UU.
Las hembras adultas miden más de 12 mm y los machos un poco me-
nos. Los machos se diferencian por la bolsa copulatoria con forma de aba-
nico en su extremo posterior. En el extremo anterior tienen una cápsula
bucal que contiene dientes o láminas cortantes. Ambos sexos se fijan a la
mucosa intestinal, donde pueden vivir más de dieciocho años (Beaver,
1988).
Los huevos se eliminan por las heces y se desarrollan rápidamente
según las condiciones. Las larvas rabdiformes se liberan y se hacen infec-
tivas en su estadio de filarías en unos siete dias. Cuando contactan con el
huésped apropiado, las larvas penetran la piel y posteriormente acceden a
la circulación llegando a los pulmones, desde donde suben por el árbol
bronquial hasta ser nuevamente deglutidas. Cuando maduran en el intesti-
no, comienzan a poner huevos. Aunque poseen ciclos de vida similares,
Ancylostoma puede madurar directamente en el intestino si se ingiere la
larva infectiva.
Las uncinarias pueden causar patología cutánea en el sitio de entrada
de la larva. Esto se caracteriza por inflamación, eritema y ampollas con
gran picor. Su paso por el pulmón puede causar síndrome de Lóffler, como
se describió para Ascaris. Dependiendo de la carga de gusanos, la infec-
ción intestinal puede dar gastroenteritis con dolor abdominal, diarrea y
nauseas. Sin embargo, las uncinarias son más conocidas por su capaci-
dad para causar pérdida crónica de sangre con anemia ferropénica
1223
secundaria. Por cada adulto de A. duodenale se pueden perder entre 0.15
I y 0.25 mi de sangre al día. comparado con los 0,03 mi de cada N. ame-
ricanus. El crecimiento del niño puede verse afectado con la infección cró-
nica. La pérdida de sangre y el número de uncinarias se correlacionan con
el numero de huevos por gramo de heces, lo que puede a ayudar a deter-
minar cuándo empezar el tratamiento en pacientes en áreas endémicas
(Layrisse, 1964a, 1964b).
El diagnóstico se realiza por el hallazgo de huevos de cubierta fina en
las heces. Éstos son parcialmente embrionados cuando se eliminan y
miden de 58 um a 76 pm de longitud por 36 pm a 40 pm de ancho (Lámi-
na 55-11/4). Los huevos embrionados o de larvas rabdiformes libres pue-
den encontrarse en muestras sin conservar que no se examinan en su
momento. Las uncinarias rabdiformes pueden distinguirse de las de
Strongyloides slercolans. ya que las primeras tienen una cámara bucal
más grande y un primordio genital que no llama la atención (Fig. 55-8). La
maduración de las larvas tiene como consecuencia la aparición de filarías
infectivas, que tienen un extremo puntiagudo y un esófago que mide apro-
ximadamente un cuarto de su longitud. Los huevos de uncinarias se
deben diferenciar de los de Trichostrongylus spp. (que son más largos y
más picudos) y de los de los nematodos de las plantas, especialmente
Heterodera spp. (que son más largos, con el extremo romo, que pueden
ser asimétricos) (Lámina 55-116).
Aunque los adultos se pueden diferenciar según las partes de la boca y la
bolsa copulatoria de los machos, los huevos de las uncinarias humanas son
indistinguibles. En el examen directo, un recuento de menos de cinco huevos
por portaobjetos denota infección leve, que raramente puede producir ane-
mia, mientras que más de 25 indica infección grave y que fácilmente puede
asociarse a síntomas.
Strongyloides stercolaris. La infección por Strongyloides se da en
muchas zonas de los trópicos y subtrópicos, pero la infección también se
del sureste de los Estados Unidos. Las hembras adultas miden de 2 mm a
3 mm y viven unidas a la mucosa del duodeno, donde se reproducen por
padenogénesis (Lámina 55-11C), Los machos no se dan en los vertebra-
dos. Los huevos se abren en el intestino, liberando la lase inicial o larvas
rabditoides que salen en las heces (los huevos casi nunca se hallan). En
este ciclo directo las larvas rabditoides se transforman en diarias infectivas
de tercer estadio en el suelo. Estas larvas infectivas penetran con facilidad
la piel de los individuos y migran a los pulmones por vía circulatoria, y de
ahí al árbol bronquial, siendo nuevamente deglutidas. Es entonces cuando
se completa el desarrollo a estadio adulto. Bajo unas condiciones de suelo
adecuadas con gran humedad, se puede dar un ciclo indirecto transitorio
en el que las nuevas larvas evolucionan a una generación de vida libre
consistente en machos y hembras reproductivas. Los huevos asi formados
desarrollan larvas filariformes que infectan de nuevo a los humanos. Una
tercera variante del ciclo de vida de Strongyloides consiste en autoinfec-
ción. en la que la maduración del estadio filariforme se completa en el trac-
to intestinal, con la consiguiente reinvasión de la mucosa intestinal o de la
piel perianal.
La clínica es variable y depende de la cepa adquirida (Genta, 1989). La
migración de las larvas de tilarias puede causar irritación, eritema y prurito en
el punto de entrada, mientras que una emigración tardía por los pulmones
puede producir síndrome de Lóffler (Purtilo. 1974). La clínica intestinal se aso-
cia a la intensidad de la infección, pudiéndose producir síntomas de ulcera
péptica, dolor abdominal y diarrea. Se han descrito una infección crónica con
un síndrome de malabsorcion.
La capacidad del parásito para autoinfectar puede perpetuar la infec-
ción durante décadas, como se observó en tropas aliadas que estuvieron
prisioneras en la guerra del sudeste de Asia durante la Segunda Guerra
Mundial (Gilí, 1979). Por otra parte, en pacientes sanos, la autoinfección
puede causar larva currens (lesiones urticariformes lineales). En pacien-
tes inmunosuprimidos, alcohólicos o desnutridos la autoinfección puede
acabar en una hiperinfección con riesgo vital por una reproducción rápi-
da del parásito (Genta. 1992; Maaen, 1987). A veces, una forma de pre-
sentación de la hiperinfección es una neumonitis grave, seguida de dia-
rrea, enteritis y septicemia. En los pacientes de las áreas endémicas se
 1224 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
debe descartar Strongyloides antes de terapias inmunosupresoras (Stick-
land. 1999).
El diagnóstico se hace por el hallazgo e identificación de las típicas larvas
rabdiformes en las heces, aunque el examen O/P no siempre logra revelar-
las (Lámina 55-110) (Genta. 1989; Pelletier, 1988). Las larvas rabdiformes
de Strongyloides se deben diferenciar de las de las uncinarias. y se carac-
terizan por una cavidad bucal corta y un primordio genital prominente (Fig.
55-8). Las larvas filariformes de Strongyloides tienen una cola con una
muesca y un esófago que mide aproximadamente la mitad de su cuerpo.
Ambos estadios larvales pueden verse con lacilidad en muestras frescas
con bajo aumento. Si se detectan larvas filariformes infectivas en una mues-
tra reciente, es diagnóstico de superinfección (Eveland. 1975).
El examen del aspirado duodenal o de las muestras del test de la cuer-
da puede ser útil en las sospechas con un examen de ordinario negativo.
El método de concentración del embudo de Baermann o una de las técni-
cas de coprocultivos (véase previamente en Métodos de laboratorio) pue-
den demostrar también la infección (Ash, 1987; García, 1999; Genta,
1989). Las larvas pueden hallarse en el espulo o en otras muestras pul-
monares, especialmente en los síndromes de hiperinfección. Los test sero-
lógicos son útiles cuando se sospecha la infección, pero no se logra
demostrar por otros métodos. El EIA y otros test poseen buena sensibilidad
y especificidad aunque pueden existir reacciones cruzadas con las filarías
y otras infecciones por nematodos. Estos test no suelen distinguir entre
infección pasada y actual, pero son útiles para ver la respuesta al trata-
miento (Wilson, 1995).
Anisakiasis. Véase más adelante en Helmintos tisulares.
Cestodos
Los cestodos o gusanos planos son platelmintos similares a cintas que
viven en el tracto intestinal de los vertebrados como adultos, y en los teji-
dos o cavidades corporales de diferentes huéspedes intermediarios, como
larvas. Se unen a la mucosa intestinal por un escólex. o un órgano de suje-
ción, en el extremo anterior, que puede tener ventosa, surcos (botrios) o
un róstelo con garfios según las especies. El cuerpo del gusano, o estró-
bilo, se compone de una región cervical de crecimiento activo y una serie
de proglótides que se desarrollan secuencialmente a lo largo de los esta-
dios inmaduro, maduro y, finalmente, grávido en el extremo posterior. Ca-
da proglótide posee tanto gónadas femeninas como masculinas, y está ca-
pacitada para producir huevos fértiles. Los huevos de la mayoría de los
cestodos son infecciosos (excepto los de Diphyllobothrium) y pueden dife-
renciarse fácilmente de los de otros helmintos por la existencia de un em-
brión con seis ganchos. Según las especies, los huevos se eliminan con
las heces o se liberan como proglótides. No es infrecuente para algunas
especies con gran longitud de estróbilos que éstas se eliminen intactas o
que las proglótides migren activamente por el ano. Las especies largas de
Taenia y Diphyllobothrium pueden llegar a medir más de 762 cm y vivir
unos 20 años.
Las larvas de cestodos se hacen infectivas tanto en los cuerpos de los
huéspedes vertebrados como de los invertebrados, según las especies, y
completan su ciclo vital cuando son digeridos por un huésped definitivo. Las
larvas de muchas especies pueden infectar a humanos, produciendo cisti-
cercosis. hidatidosis. esparganosis y cenurosis. Estos cuadros se explican
más adelante bajo el epígrafe de Helmintos tisulares
Taenia saginata. Los humanos son los únicos huéspedes definitivos de
Taenia saginata, el gusano plano de la vaca. Aunque su distribución es mun-
dial, son especialmente comunes en Oriente Medio, África. Europa. Asia y
América latina. En EE.UU. es esporádico. Los cisticercos larvales (Cysti-
cercus bovis) se desarrollan en los tejidos del ganado que pasta en tierras
contaminadas con desechos humanos. Cuando los humanos comen carne
de vaca cruda o poco hecha, los cisticercos se transforman en un adulto fér-
til dentro del intestino en un plazo de dos a tres meses. Los síntomas son
infrecuentes, pero pueden incluir malestar abdominal y diarrea. A diferencia
de 7! solium. los huevos de I saginata no son infectivos para los hombres
y su ingesta no provoca cisticercosis.
El diagnóstico se realiza al encontrar los huevos en las heces con téc-
nicas directas o de concentración, o en los pliegues perianales mediante
la técnica de papel celofán. Los huevos son esféricos y miden de 31 pm
a 43 pm de diámetro (Lámina 55-12A). La cubierta es gruesa y radial-
mente estriada, con embriones con seis garfios. Los gusanos de la espe-
cie Taenia son indistinguibles y deben informarse únicamente como hue-
vos de Taenia.
La identificación de las especies se debe hacer recuperando las progló-
tides o, a veces, los escólex. Las proglótides tienen una característica pro-
tuberancia lateral conocida como poro genital. La inyección de tinta china
por dicho poro usando una aguja fina puede lograr definir el útero. El útero
grávido de 7aen/'a saginata tiene de 15 a 20 corchetes laterales, mientras
que el de T. solium tiene de 7 a 13 (Fig. 55-9: Lámina 55-126). Las pro-
glótides también pueden ser aclaradas por la noche en glicerol o teñidas
con carmín o hematoxilina mediante las técnicas descritas (Ash. 1987). Si
se aisla, el escólex de T. saginata se puede identificar por la presencia de
cuatro ventosas y la ausencia de garfios en la corona o róstelo.
Taenia solium. Taenia solium. el gusano plano del cerdo, es más fre-
cuente en Europa, especialmente en Europa del este, América latina, Chi-
na, Pakistán y la India. Ocasionalmente puede verse en los Estados Uni-
dos, principalmente en inmigrantes. La infección con el gusano adulto se
adquiere por la ingesta de cerdo poco hecho o crudo que contiene cisti-
cercos (C. cellulosae). Cuando hay síntomas, éstos son idénticos a los de
la infección por T. saginata. Un dato importante es que la ingesta de hue-
vos de T. solium, bien a partir de un gusano adulto o bien por comida con-
taminada, puede acabar en cisticercosis (Schantz, 1992). Se pueden en-
contrar más detalles en Helmintos tisulares.
Los procedimientos para el diagnóstico de infección intestinal por T.
solium son los mismos que los usados para T. saginata, aunque son apa-
rentes ciertas diferencias morfológicas. En el escólex de T. solium existen
Figura 55-9. Proglótides grávidas de distintos gusanos planos
humanos. 1, Taenia saginata. 2, Taenia solium. 3. Dipylidium
caninum. 4, Diphyllobothrium latum. 5. Hymenolepis spp.
 CAPITULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
cuatro ventosas y, a diferencia de T. saginata. el róstelo tiene dos filas de
garfios. Las proglótides grávidas tienen de 7 a 13 corchetes uterinos late-
rales (Fig. 55-9).
Hymenolepis nana. H. nana, conocida como el gusano plano enano,
tiene una distribución mundial y es la especie de cestodos más frecuente-
mente hallada en EE.UU. Es un parásito común en ratones y el más peque-
ño que infecta a los humanos, midiendo hasta 4 cm de largo. El escólex
tiene un róstelo armado, y las proglótides tienen dos polos genitales loca-
lizados en el mismo lado del estróbilo (Fig. 55-9; Lámina 55-12F). El ciclo
vital puede ser tanto directo, a través de la ingesta de los huevos, como
indirecto, a través de la ingesta de huéspedes intermediarios (habitual-
mente por el escarabajo del grano), que contienen larvas cisticercoides. En
primera instancia, los huevos se pueden pasar directamente de persona a
persona, habitualmente entre niños, o ser ingeridos en la alimentación,
especialmente productos de grano contaminados con excrementos de roe-
dores.
Los huevos se anclan en el intestino y el embrión penetra la mucosa, en
donde pasa la larva cisticercoide. Posteriormente emergen y se vuelven a
anclar en la pared intestinal, donde completan su desarrollo a adultos en
dos a tres semanas. La ingesta de escarabajos con lanzas es mucho
menos (recuente. La autoinfección interna puede producirse en algunos
individuos en los que los huevos se anclan rápidamente tras ser puestos
por el adulto e invaden rápidamente la pared intestinal sin abandonar el
cuerpo. Tal mecanismo es el responsable de los casos esporádicos de
infecciones masivas.
La infección sintomática, caracterizada por dolor abdominal, diarrea,
anorexia e irritabilidad, se da en pacientes con gran número de gusanos.
El diagnóstico se hace por el aislamiento en las heces de los huevos ova-
les de pared fina e incoloros, que miden de 30 um a 47 pm de diámetro
(Lámina 55-12D). Contienen un embrión con seis garfios (oncosfera) cen-
tralmente localizados separados de la pared por un espacio claro. El
embrión posee dos engrasamientos polares de los que surgen finos fila-
mentos que se extienden en el espacio claro hasta alcanzar la pared. A
veces se pueden detectar estróbilos intactos si se examinan las heces
detenidamente.
Hymenolepis diminuta. El gusano plano de la vaca. H. diminuta, tie-
ne una distribución cosmopolita y. a veces, infecta a los humanos. La in-
fección, sin embargo, es infrecuente, ya que necesita un huésped artró-
podo intermediario en el que las larvas cisticercoideas se desarrollen. La
infección humana suele producirse por ingesta accidental de escarabajos
infectados, que contaminan los productos de grano o cereales. Los gusanos
adultos se desarrollan en el intestino, donde pueden crecer hasta 60 cm. Al
igual que los de H. nana, las proglótides tienen poros genitales en un
único lado, pero se diferencian de estas especies en que el escólex care-
ce de róstelo armado. Las infecciones suelen ser asintomáticas debido al
pequeño número de gusanos que suelen infectar a una persona, aunque
se han descrito síntomas intestinales. El diagnóstico se obtiene por el
hallazgo en las heces de huevos de pared gruesa, ligeramente ovoides,
de color amarillo-marrón, que miden de 70 pm a 85 pm por 60 pm a 80
pm (Lámina 55-12E). Los huevos son los que más fácilmente se confun-
den con los de H. nana pero se diferencian porque no poseen filamentos
polares.
Diphyllobothrium spp. Los humanos se pueden infectar por una de
las variadas especies de gusanos planos del pescado llamado Diphyllo-
bothrium. que suelen infectar a mamíferos que se alimentan de peces y.
posiblemente, a pájaros (Connor, 1997; Curtís, 1991). Estos parásitos se
dan en las zonas templadas, especialmente en el norte de Europa, Escan-
dinavia, la antigua URSS y Japón, La infección también se produce en Ca-
nadá y en los estados centrales del norte de la costa pacifica y en Alaska.
Aunque Diphyllobothrium latum es la especie conocida que con más fre-
cuencia infecta a humanos, su diferenciación no se puede basar en la mor-
fología de los huevos.
El parásito habita en el intestino, donde puede llegar a medir 10 m y per-
sistir durante años. Los huevos se eliminan por las heces sin embrionar y
deben alcanzar un arroyo o un lago para desarrollarse. En las siguientes
semanas surge una forma de larva ciliada, el coracidio de los seis garfios, y
1225
es ingerido por un tipo de zooplancton. El coracidio se desarrollará en una
larva procercoide. que es infectiva para el segundo huésped intermediario,
un pez. En éste, el procercoide migra a los tejidos y se transforma en larva
de pleurocercoide. Los pleurocercoides pueden escalar la cadena alimenti-
cia y afectar a peces más grandes. Los humanos lo adquieren a través de
la ingesta de pescado poco hecho o crudo que ha pasado al menos parte
de su vida en agua dulce.
Los gusanos adultos maduran y se inician en la producción de huevos en
un mes. La infección puede ser asintomática. con la eliminación de trozos de
estróbilos como manifestación inicial. En otros, puede presentarse un grado
variable de molestias abdominales y diarrea. Raras veces puede producirse
una obstrucción intestinal. En las áreas endémicas del norte de Europa, un
pequeño porcentaje de pacientes desarrolla un déficit de vitamina B,, con
anemia megaloblástica.
El diagnóstico se hace al hallar los típicos huevos marrones, ovalados
y operculados en las heces mediante las técnicas habituales. Éstos miden
de 58 pm a 76 pm por 40 pm a 51 pm y, además del opérculo, poseen
una proyección abotonada pequeña y redondeada en el extremo (Lámina
55-12F). La presencia del opérculo es la única entre los cestodos que
infecta a humanos y se debe tener cuidado para no confundir los huevos
con los de los tremátodos, especialmente con el Paragommus o Nano-
phyetus. La identificación del género es posible cuando una porción de
estróbilo o un gusano intacto es eliminado. El escólex es alargado y posee
un par de surcos longitudinales conocidos como botrios, que suplen a las
habituales ventosas. Las proglótides grávidas son más anchas que largas
y tienen sus poros genitales colocados en mitad de la cara ventral, adya-
centes al útero con forma de roseta que se halla en el centro (Fig. 55-9;
Lámina 55-12G).
Dipylidium caninum. D. caninum es un gusano liso frecuente de
perros y gatos en la mayor parte del mundo y no es raro que afecte a
humanos, especialmente a niños. En su habitual ciclo de vida, los huevos
se ingieren por las larvas de pulga, que infestan las áreas frecuentadas por
perros o gatos. Las larvas cisticercoideas persisten hasta que la pulga
pasa al estado adulto. La ingestión accidental de pulgas adultas que con-
tienen el cisticercoide produce la infección. Los niños tienen el mayor ries-
go de infección, ya que están en gran contacto con animales. Los gusanos
maduran en el intestino y crecen hasta 70 cm de largo. La infección tiene
pocos síntomas, generalmente causados por las proglótides que se mue-
ven activamente.
La detección se basa en el hallazgo de los huevos típicos, paquetes de
huevos o proglótides en las heces. Los huevos son esféricos y contienen un
embrión con seis garfios. Miden de 24 pm a 40 pm de diámetro y aparecen
aislados o formando paquetes (Lámina 55-12H). El escólex es alargado, con
cuatro ventosas y un róstelo retráctil y pequeño. Las proglótides tienen forma
de barril y dos poros genitales, uno en cada lado, lo que le da el nombre
común de gusano plano de doble poro (Fig. 55-9).
Tremátodos
Los tremátodos, o lombrices, son helmintos dorso-ventralmente aplanados
(platelmintos) que incluyen tanto formas hermafroditas (lombrices intestinales,
hepáticas y pulmonares) como otras con diferenciación de sexos (lombrices
sanguíneas o esquislosomas). Todas las especies de los humanos se carac-
terizan por una ventosa oral, por la que se abre al tracto digestivo, y otra ven-
tosa para su fijación. Los adultos miden desde 1 mm (Metagonimus) a 70 mm
(Fasciola gigantica).
Los huevos llegan al exterior eliminados por las heces, el esputo o la
orina, según las especies. Los hermafroditas producen huevos opercula-
dos que no están embrionados (Clonorchis y Opisthorchis son excepcio-
nes). Los huevos de esquistosomas no son operculados y cada uno con-
tiene una larva madura cuando se elimina. La larva trematodo. o miracidia.
es ciliada y capaz de penetrar los tejidos de un molusco. Cada especie de
trematodo usa algún tipo de caracol como primer huésped intermediario.
Un proceso de multiplicación asexual compleja dentro de caracoles produ-
ce un gran número de larvas que nadan libremente y se llaman cercarías.
 1226 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MEDICA
Las cercarías de esquistosomas son capaces de penetrar la piel humana
directamente, produciendo esquistosomiasis. Las lombrices hermafrodi-
tas enquistan en la vegetación acuática o invaden los tejidos de un segun-
do huésped, como un pez o un cangrejo, según las especies. La ingesta
de estas larvas enquistadas, llamadas metacercarias, produce infección
humana.
La infección se produce en muchas zonas tropicales y subtropicales. Su
presencia depende de la ausencia de tratamiento de las aguas residuales,
de la disponibilidad de los huéspedes intermediarios apropiados y, en el ca-
so de las especies hermafroditas. de las costumbres dietéticas asociadas a
la ingesta de metacercarias. Alguna de estas enfermedades, especialmente la
esquistosomiasis, se están extendiendo debido al incremento del uso de irri-
gaciones en las áreas endémicas. La clínica varía según el número de gusa-
nos parasitarios, los órganos afectados y la respuesta del huésped. Muchas
infecciones son asintomáticas.
El diagnóstico se hace identificando los huevos típicos en heces, esputo,
orina y, a veces, tejidos. Los métodos directos y los de concentración con
lormalma-etil acético son más útiles para el aislamiento de estos huevos,
mientras que los métodos de flotación con sulfato de cinc son menos satis-
factorios.
Fasciolopsis buski. Es el trematodo intestinal más largo que infecta a
humanos, variando de 20 mm a 75 mm de largo y de 8 mm a 20 mm de
ancho. Se da en China, sudeste de Asia y la India, hallándose con frecuen-
cia en cerdos como reservorio natural. Se adquiere por la ingesta de meta-
cercarias de las plantas acuáticas, como el castaño de aguas. Los gusanos
se unen a la pared del duodeno y del yeyuno, donde maduran a adultos en
tres meses. Los síntomas incluyen diarrea, dolor epigástrico y náuseas, si
hubiese suficientes gusanos como para producir ulceración de la mucosa.
Puede existir eosinolilia incluso en los asintomáticos.
El diagnóstico se hace al ver los huevos largos (de 130 pm a 140 um por
80 pm a 85 pm), marrones, ovales y de pared delgada (Lámina 55-13/4). El
opérculo puede pasar desapercibido y los huevos ser eliminados sin embrio-
nar. La diferencia con los huevos de Fasciola no suele ser posible, aunque las
infecciones pueden diferenciarse basándose en la historia geográfica y en la
clínica. Los huevos de tremátodos equinostomas. cuando afectan a humanos,
son similares pero más pequeños (Beaver. 1984).
Heterophyes y Metagonimus. Estos dos géneros incluyen un número
de especies de minúsculos gusanos intestinales (de 1 mm a 3 mm de lon-
gitud) que infecta a humanos. Heterophyes heterophyes y Metagonimus
yokogawai son parásitos comunes en Asia, pero, (unto con otras especies,
se encuentran también en otras partes del mundo. La infección se adquiere
por la ingesta de metacercarias en pescado de agua dulce poco hecho.
Aunque son de poca importancia médica, pueden producir diarrea y dolor
abdominal. La infección es autolimitada, ya que los gusanos tienen una vida
de tan sólo unos pocos meses.
El diagnóstico se realiza por el hallazgo de huevos embrionados y oper-
culados que miden de 20 pm a 30 pm de largo por 15 pm a 27 pm de
ancho (Lámina 55-138). La diferenciación de estos huevos de los de Clo-
norchis y Opisthorchis es difícil, aunque el opérculo es más profundo en
Opisthorchis. No obstante, tal distinción puede ser importante por razones
médicas.
Nanophyetus salmincola. Nanophyetus salmincola es un pequeño
gusano intestinal (de 0,8 mm a 1.1 mm) descrito en el este de Siberia y
en el noroeste de la costa pacífica de EE.UU. (Eastburn, 1987: Fristche.
1989b). Estos gusanos se adquieren por la ingesta de salmón crudo o
poco cocinado o bien ahumado, o por truchas con metacercarias infec-
ciosas. Los sintomas están en función del número de gusanos y puede in-
cluir dolor abdominal, diarrea y, a veces, eosinofilia. Los huevos, de 60 pm
a 80 pm por 34 um a 50 pm son ovoidales. operculados y de un color ma-
rrón amarillento (Eastburn, 1987). Hay un engrosamiento en el extremo
de la pared que lo diferencia de botón visto en los huevos de Diphyllo-
bothrium.
Fasciola hepática. Las vacas, las ovejas y las cabras de muchas par-
tes del mundo están infectadas con la lombriz hepática Fasciola hepática
y, menos Irecuentemente, con especies de Fasciola giganiica. Los parási-
tos adultos habitan en el árbol biliar y de|an huevos que se eliminan por las
heces. Las cercarías eliminadas a partir de los caracoles huéspedes se
enquistan en la vegetación acuática, donde las metacercarias quedan a
merced de los huéspedes herbívoros. Los humanos lo adquieren al comer
berros. Una vez ingeridas, las larvas pasan la pared intestinal y migran por
el peritoneo hasta el higado. Atraviesan la cápsula hepática y el parénqui-
ma, llegando a alojarse en el interior de los conductos biliares, donde la
puesta de huevos comienza en aproximadamente dos meses. La migración
a través de higado provoca una reacción inflamatoria dolorosa en el parén-
quima y. posteriormente, en los conductos biliares, pudiendo acabar en
fibrosis. Las manifestaciones clínicas incluyen cólico, ictericia obstructiva,
dolor abdominal, colelitiasis y eosinolilia.
El diagnóstico se realiza al hallar los huevos en las heces. Los huevos
operculados. sin embrionar. son de un color marrón amarillento, de 130 pm
a 150 um por 63 pm a 90 pm, pudiendo ser difíciles de distinguir de los de
Fasciolopsis (Lámina 55-13A). Falsas infecciones, como la producida por la
ingesta de higado de vaca u oveja infectados, se diagnostican mediante una
buena anamnesis y realizando un seguimiento del examen de las heces pa-
ra buscar la eliminación de los huevos.
Clonorchis sinensis y opisthorchis viverrini. Clonorchis sinensis.
la lombriz hepática oriental, y una especie cercana. Opisthorchis viverrini.
habitan el sistema biliar de los humanos y de otros piscívoros, incluidos ga-
tos y perros. C. sinensis se da principalmente en China, Taiwan, Corea, Ja-
pón y Vietnam, mientras que Opisthorchis viverrini se halla en el sureste de
Asia, especialmente en el norte de Tailandia. También se conoce la in-
fección humana por O. lelineus en Europa y por Amphimerus pseudoleli-
neus en Ecuador (la misma que O. guayaquilensis).
Todos estos parásitos se adquieren al ingerir las metacercarias en pes-
cado crudo o poco cocinado. Las lanzas emigran a la via biliar, donde viven
más de 20 años y crecen hasta 25 mm (Lámina 55-13C). Producen huevos
que se eliminan en la bilis y posteriormente en las heces.
Con frecuencia las infecciones son asintomáticas, aunque gran número
de lombrices e infecciones de repetición pueden producir inflamación biliar
y posterior hiperplasia fibrosa y cirrosis hepática. Se ha descrito el desarro-
llo de un colangiocarcinoma en las infecciones mantenidas.
El diagnóstico se realiza al aislar los huevos operculados en las heces.
Estos huevos son pequeños, marrones y embrionados (Lámina 55-13D)
Los huevos de Clonorchis no pueden ser diferenciados fácilmente de los
de Opisthorchis. Ambos miden de 25 pm a 35 um por 12 pm a 20 pm y
tienen un opérculo prominente y un pequeño botón en el extremo. Éstos
son difíciles de diferenciar de los del grupo de Heterophyes'Metagommus.
aunque estos últimos carecen de opérculo y del botón del extremo. Cuan-
do no se logra una identificación, en el laboratorio deberá reflejarse (p. ej..
catalogándolos como huevos de Clonorchis/Opisthorchis/Heterophyes/
Metagonimus).
Paragonimus spp. Muchas especies de Paragonimus pueden parasi-
tär los pulmones de gatos, perros y otros carnívoros, incluidos los hom-
bres. P westermani es problemática en muchas áreas de Asia, mientras
que en América del Sur y América Central se han implicado diferentes
especies, incluidas P. mexicanus. P. caliensis y P. ecuadoriensis. P. kelli-
cotti se ha implicado en ocasiones en casos en Norteamérica, y se han
descrito otras especies en África (Mariano, 1986; Pachucki, 1984; Stric-
kland, 1999).
Los gusanos adultos miden hasta 12 mm por 6 mm y Irecuentemente se
hallan por parejas en el parénquima pulmonar, donde residen en una cáp-
sula librótica causada por el huésped (Lámina 55-13E). La cápsula comu-
nica con los bronquios, pudiendo eliminar los huevos en el espulo o en las
heces. Aunque es un caracol el que sirve de primer huésped intermediario,
los cangrejos de agua dulce sirven como segundos intermediarios para las
metacercarias. La ingesta de crustáceos crudos o marinados puede causar
la infección. Las larvas se liberan en el estómago y migran a través de la
pared intestinal al peritoneo, alcanzando, a veces, los pulmones a través del
diafragma. La maduración tarda aproximadamente de cinco a seis semanas
y los gusanos pueden vivir durante años.
Los síntomas, cuando existen, se pueden deber a la migración de las lar-
vas a través de los tejidos o ser causados por los adultos asentados en el
pulmón. No es infrecuente que los gusanos se desarrollen en zonas ectó-
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
picas como el peritoneo, tejido subcutáneo o el cerebro. La afectación de
los pulmones suele asociarse con fiebre, escalofríos y eosinofília. Una vez
estabilizado, los síntomas incluyen tos crónica con abundante expectora-
ción y episodios de hemoptisis. La radiografía puede mostrar infiltrados
nodulares, calificaciones o infiltrados parcheados. Los huevos que perma-
necen en los pulmones o en sitios ectópicos pueden producir reacción gra-
nulomatosa extensa.
El diagnóstico se hace al encontrar los típicos huevos en las heces, en el
esputo o en los tejidos. Los huevos de las diferentes especies de Paragoni-
mus no se pueden distinguir fácilmente y se deben deducir según el área de
origen. Los huevos, operculados y sin embrionar, miden de 80 pm a 120 pm
por 45 pm a 70 pm y poseen una capa externa moderadamente gruesa de
color marrón amarillenta (Lámina 55-13F). El opérculo es aplanado y suele
sobresalir del resto de la pared por unos prominentes hombros. El extremo
operculado está algo endosado pero carece de botón. Los huevos de Para-
gonimus se pueden diferenciar de los de Diphyllobothrium y Fasciola/Fas-
ciolopsis por el tamaño.
Schistosoma spp. La esquistosomiasís, o bilharziasis, está entre las
más importantes enfermedades parasitarias del mundo, afectando entre
200 y 300 millones de individuos. Los machos adultos y hembras habitan
en las venas mesentéricas o de la vejiga. Las especies más importantes
para los humanos son S. imansoni, S. japonicum, S. mekongi. S. intercala-
tum y S. haematobium. Las otras especies infectantes de humanos son
menos frecuentes.
Los esquistosomas adultos y hembras son más finos y miden cerca de
26 mm por 0,5 mm. Los machos, que son algo más cortos, se abrazan a la
hembra con unos márgenes laterales del cuerpo (el canal ginecóforo) para
fecundarla. Cuando se examinan in situ, los esquistosomas son encontrados
frecuentemente copulando. En este sitio de asiento producen poca o ninguna
respuesta inflamatoria. Los huevos se depositan en las vénulas, donde pue-
den causar una gran respuesta inflamatoria que resulta en una expulsión de
los huevos a la luz intestinal o a la luz de la vejiga. La patogenia está en fun-
ción del sitio, el número de huevos y la respuesta de los huésped a los antí-
genos de los huevos.
Los huevos están totalmente embrionados cuando se eliminan y listos
para eclosionar cuando se depositan en agua dulce. El miracidio penetra en
un caracol apropiado, donde sufre una transformación y una extensa divi-
sión asexual. Tras cuatro semanas, un gran número de cercarías de cola
bífida emergen del molusco. Éstas nadan durante horas y penetran fácil-
mente en la piel del huésped susceptible, incluidos los humanos. Tras la
penetración, las cercarías, llamadas ahora esquistosomulas, pasan a la cir-
culación atravesando los pulmones antes de llegar a los vasos mesentéri-
cos-porta.
La clínica se produce en primer lugar por la penetración de la cercaría
(dermatitis cercarial). por el inicio de la puesta de huevos (esquistosomiasis
aguda o fiebre de Katayama) y como una complicación tardía de la prolife-
ración tisular y reparación (esquistosomiasis crónica). Tras la penetración de
la cercaría, puede aparecer un exantema papular con prurito en cuestión de
horas. Este es un fenómeno de sensibilización producido por una exposición
previa a los antígenos de cercaría. La forma más grave de dermatitis se da
en individuos que tienen una exposición repetida a esquistosomas de cerca-
rías. La dermatitis por cercarías o picor del nadador se produce en todo el
mundo y es una entidad bien conocida en EE.UU. (Hoeffler, 1974).
El comienzo de la puesta de huevos por adultos entre las cinco y siete
semanas puede producir una esquistosomiasis aguda o fiebre de Kata-
yama, un síndrome similar a la enfermedad del suero que se da en las
infecciones primarias graves, especialmente en las del S. japonicum. La
respuesta al antígeno es a través de la producción de inmunocomplejos
(Boros, 1989).
La infección crónica produce puesta continua de huevos, pudiendo per-
manecer algunos en el cuerpo. Alrededor de esos huevos se producen
granulomas en el intestino y en la vejiga y se van sustituyendo por coláge-
no pudiendo causar fibrosis y cicatrización. Los huevos atrapados en el
hígado pueden causar fibrosis con obstrucción del flujo portal. A veces, los
huevos se depositan en lugares ectópicos, como la médula espinal, los pul-
mones o el cerebro.
1227
El diagnóstico se hace viendo los huevos en las heces u orina por examen
directo o métodos de concentración con formalina-etil acético. La concentra-
ción con sulfato de cinc no es satisfactoria para detección de los huevos pesa-
dos de esquistosomas. Los huevos también pueden detectarse en las biop-
sías de recto, vejiga y, a veces, del hígado (Lámina 55-14). El uso de métodos
de eclosión de huevos puede emplearse a veces para determinar su viabili-
dad o, menos frecuentemente, para detectar la enfermedad leve. La mezcla
de heces con agua destilada se coloca en un frasco cubierto por papel de
aluminio para protegerlo de la luz, exponiendo a una luz brillante sólo el cue-
llo o un lateral. Los miracidios, si estuviesen presentes, nadarían hacia la luz
y se podrían detectar con una lupa.
Los test serológicos pueden ser útiles para el screening en personas
que han viajado a zonas endémicas y que. aun teniendo orina o heces ne-
gativas, tienen el riesgo de infección, o para monitorízar la respuesta al
tratamiento. Aunque no está totalmente disponible, hay laboratorios de
referencia y el CDC puede realizarlo. Generalmente, los test serológicos
varían según el antígeno empleado y la metodología usada. El CDC usa
el test del screening de Falcon. una técnica inmunoabsorbente con enzi-
ma fijadora (FAST-ELISA). Aquellos que son positivos en el screening se
evaluarán posteriormente por inmunoblot para aumentar la especiticidad
(Wilson, 1995).
Schistosoma mansoni. S. mansoni se da en África, especialmente en
áreas tropicales y en el delta del Nilo, Sudáfrica y Madagascar, Brasil, Vene-
zuela, Surinam y algunas islas del Caribe, incluido Puerto Rico. Los adultos
de S. mansoni viven principalmente en la vena porta y en la mesentérica
inferior. La puesta de huevos en el intestino produce dolor abdominal y
disentería, con abundante aparición de sangre y moco en las heces. En este
momento se pueden detectar huevos en las heces. La infección crónica
puede acabar produciendo fibrosis hepática e hipertensión portal, según el
número de gusanos. Los huevos son más difíciles de encontrar en esta
fase.
Los huevos, que miden de 116 pm a 180 pm por 45 pm a 58 pm, son ova-
lados, con una espina lateral larga que sale del huevo cerca del extremo
(Lámina 55-14A y S). Si la espina no se viese, el huevo podría estar rotado
en el cubreobjetos. En el caso de que la larva sea viable, puede ser evidente
el movimiento del miracidio dentro de los huevos en las muestras sin fijar. Se
pueden necesitar técnicas de concentración para detectar huevos, ya que los
individuos con exposición limitada o con infección crónica pueden eliminar
pocos.
Schistosoma japonicum. Schistosoma japonicum. que se da en Chi-
na, sureste de Asia y Filipinas, produce una patología que es similar a la
de S. mansoni. pero frecuentemente más grave porque se producen más
huevos (aproximadamente diez veces más). Esta enfermedad ha sido erra-
dicada en Japón, aunque aún existen reservónos animales. Los gusanos
adultos viven en el territorio de la vena mesentérica superior y los huevos
alcanzan fácilmente el hígado, causando fibrosis e hipertensión portal,
siendo la complicación más frecuente de la infección crónica. El menor
tamaño de los huevos predispone a su diseminación, especialmente al cere-
bro y la médula espinal. Los huevos suelen ser ovalados, de entre 75 pm
y 90 pm por 60 pm a 68 pm, con una espina lateral que pasa desaperci-
bida, por lo que es difícil de demostrar (Lámina 55-14C y D).
Schistosoma mekongi. Esta especie se da en reservónos humanos y
en animales de países a lo largo del río fvlekong, especialmente Camboya
y Laos (Bruce, 1980). Es similar al S. japonicum, pero se diferencia por va-
rias características biológicas y por los huevos más pequeños (de 60 pm a
70 pm por 52 pm a 62 pm), que de otro modo serían indistinguibles de los
de S. japonicum.
Schistosoma haematobium. La esquistosomiasis urinaria se da en
muchas partes de África. Oriente Medio y Madagascar. Los parásitos emi-
gran por vía hemorroidal al plexo venoso de la vejiga, la próstata, el útero y
la vagina. Uno de los síntomas más comunes y tempranos es la hematuria,
especialmente al final de la micción. La enfermedad crónica puede causar
dolor pélvico y cólico vesical con tenesmo vesical. El acumulo de huevos en
los tejidos puede producir hipertrofia del urotelio, metaplasia escamosa y
fibrosis, que puede progresar a obstrucción y, finalmente, fracaso renal. La
 1228 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

esquístosomíasís urinaria se ha asociado también a carcinoma escamoso de
vejiga (Badawi. 1992).
Los huevos se aislan de la orina mediante el examen del sedimento. Éstos
son alargados, de 112 pm a 180 iim por 40 pm a 70 pm con una caracte-
rística espina terminal (Lámina 55-14£). A veces se detectan en las heces o
en la biopsia del recto.
Schistosoma intercalatum. Esta especie se da en muchas partes de
Álrica central y en África occidental y produce esquistosomiasis intestinal. Los
huevos tienen una espina terminal similar a la del S. haematobium, pero se
dan principalmente en las heces y son más largos (de 140 pm a 240 pm por
50 pm a 85 pm).
do evolucionar a linfedema y fibrosis obstructiva (Lámina 55-15A). La afec-
tación grave de los miembros inferiores y de los genitales produce elefan-
tiasis.
En la mayoría de las áreas, las microfilarias circulan por la sangre perifé-
rica con una periodicidad nocturna que corresponde con las actividades ali-
menticias de los vectores habituales (mosquitos Culex. Aedes y Anopheles).
La infección del pacífico Sur suele ser sin periodicidad. Los microfilarias
están envainadas, aunque esto puede no ser evidente con la tinción de
Giemsa. La cola es punteada y no hay núcleos en la punta. El espacio cefá-
lico no es tan largo como ancho y los núcleos de la columna nuclear son
diferenciales (Fig. 55-10; Lámina 55-15S). Pueden ser necesarias técnicas
de concentración para su aislamiento, ya que las microfilarias suelen estar
en pequeño número.

Brugia malayi. Esta especie produce una enfermedad similar a la de

HELMINTOS TISULARES W. bancrofti. aunque suele ser más moderada y con mayor frecuencia
afecta a los linfáticos de los miembros superiores. Se da principalmente en
la India, sudeste de Asia, Corea, Filipinas y Japón. La infección humana
Nematodos por especies zoonóticas se encuentran periódicamente en EE.UU.
La microfilaria circula por la sangre de un modo periódico. Sus vainas
Filarías se tiñen bien con Giemsa. La punta tiene un ensanchamiento con dos
núcleos solitarios al final de la columna nucleada (llamados núcleos sub-
Los nematodos filariales son parásitos comunes de los vertebrados trans-
terminal y terminal). El espacio cefálico puede ser más largo que ancho
mitidos por artrópodos. Los adultos son largos y finos, midiendo cerca de
(Fig. 55-10; Lámina 55-15C). B. timones otra especie que se da en el este
100 mm. y es sabido que afectan distintos tejidos, como el subcutáneo, lin-
del archipiélago indonesio, especialmente en las islas de Timor y Flores.
fáticos, vasos sanguíneos, espacio pleural y peritoneal, corazón y cerebro.
Sus microfilarias son muy similares a las de la B. malayi, aunque algo más
Todos producen larvas denominadas microfilarias, que pueden detectarse
largas.
en la sangre o en la piel, según las especies. Las microfilarias de algunas
especies circulan por la sangre con una periodicidad bien definida (tanto
diurna como nocturna), mientras que otras no. Las microfilarias siguen su
desarrollo sólo en el apropiado artrópodo vector, usualmente un mosquito o
una mosca, donde maduran a la fase infectiva. Cada larva es entonces
depositada en los tejidos de un huésped definitivo cuando el vector se ali-
menta de sangre.
El diagnóstico se hace por el hallazgo de microfilarias en la sangre o
en la piel, ya que los estadios adultos son habitualmente secuestrados en
los tejidos. El uso del Irotis sanguíneo grueso teñido con Giemsa o hema-
toxilina es la técnica habitual, aunque suelen requerirse otros procedi-
mientos más sensibles, como un filtro de membrana, la concentración de
Knott o análisis por saponificación (García, 1997). Las microfilarias pue-
den verse moviéndose en el examen directo de la sangre o de los fluidos
tisulares.
La identificación de las especies es importante debido a su diferente
patogenicidad. La característica principal usada para la identificación de
microfilarias incluye la presencia o ausencia de vaina, así como sus
características de tinción, la morfología de la cola y la distribución de los
núcleos celulares en su interior, y el tamaño del espacio cefálico, asi
como la apariencia de su columna nuclear. Ya que las microfilarias de
Wuchereha y Brugia suelen poseer una periodicidad nocturna, la sangre
de los pacientes en los que se sospecha debe recogerse entre las 10 de
la tarde y las 2 de la madrugada. Loa loa posee un periodo diurno, por lo
que la sangre debe recogerse en torno al mediodía. M. ozzardiy M. Pers-
ians carecen de periodicidad. Las microfilarias de M. streptocerca y
Onchocerca volvulus están presentes en la piel y se detectan por examen
de biopsias.
Los test serológicos para el diagnóstico de filarías linfáticas pueden ser úti-
les en pacientes seleccionados, especialmente en los no nativos de áreas
endémicas. Tales métodos son limitados en su capacidad para diferenciar
entre exposición pasada o actual y además pueden existir reacciones cruza-
das con otras especies de nematodos. Los test de detección de antigenos
también pueden ser útiles para la filariasis linfática, pero no suelen estar dis-
ponibles (Wilson, 1995).

Wuchereria bancrofti. Esta especie, responsable de la filariasis ban-

croftiana, es la filaría que más frecuentemente infecta a los humanos. Las
zonas endémicas son África central. África del Norte, la India, sureste de
Asia y ciertas islas del Pacifico Sur, así como partes de Centroamérica y
Sudamérica y las Indias occidentales. Los gusanos adultos residen en el
sistema linfático, donde producen adenopatias y linfangitis crónica, pudien-
Figura 55-10. Exiremos anterior y posterior de las microfilarias más frecuentemen-
te encontradas en humanos. í, Wuchereria bancrofti. 2. Brugia malayi. 3. Oncho-
cerca volvulus. 4. Loa loa. 5. Mansonetla perstans. 6. Mansonella ozzardi.
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
Loa loa. Conocido como el gusano del ojo. Loa loa vive en el tejido sub-
cutáneo. Los nematodos están migrando continuamente produciendo una
reacción inflamatoria local transitoria (de 2 a 3 dias) conocida como Calabar.
La aparición ocasional en la conjuntiva permite su extirpación. La loasis se da
principalmente en África occidental y central, donde las moscas ciervo del
género Chrysops sirven como vector.
El parásito provoca una gran eosinofilia y se le ha visto a veces en EE.UU.
en gente que viajó a África. La microfilaria, que circula por la sangre con una
periodicidad diurna, está envainada, pero esta vaina no es visible con
Giemsa. Los núcleos de la cola llegan hasta la punta redondeada. La colum-
na nuclear es distintiva y el espacio cefálico es más corlo (Fig. 55-10: Lámi-
na 55-150).
Onchocerca volvulus. La infección por Onchocerca es una de las pri-
meras causas de ceguera en las zonas endémicas, como África central.
América central (México y Guatemala) y el norte de Sudaménca. Los vec-
tores son las moscas negras del género SimuHum. Los gusanos adultos
viven en nodulos subcutáneos fibrosos y en el tejido más profundo,
pudiendo crecer hasta 40 mm de diámetro (Lámina 55-15f). Los nodulos
suelen darse en la mitad superior del cuerpo de las personas infectadas
en Centroamérica y en la mitad inferior del cuerpo en las personas afec-
tadas de África. Los gusanos adultos producen microfilarias que emigran
por la piel. Las complicaciones son secundarias a dicha migración, cau-
sando múltiples formas de dermatitis. Los movimientos de las microfilarias
por la superficie del ojo pueden causar queratitis, opacidad corneal y
daños en las cámaras del iris causando asi ceguera por infecciones repe-
tidas. El diagnóstico se hace al hallar las típicas microtilarias en los ras-
pados cutáneos o biopsias cutáneas, preferiblemente de la región esca-
pular o de la cresta iliaca. Como alternativa se puede examinar el exudado
de la piel cicatricial o el aspirado de los nodulos (Beaver. 1984). Las
microfilarias en las preparaciones teñidas pierden tanto la vaina como los
núcleos de la cola (Fig. 55-10).
Mansonella spp. Hay muchas especies de Mansonella que infecta a
los humanos, pero se las considera como mínimamente patógenas. Sin
embargo, las microfilarias se deben diferenciar de las auténticas filarias
patógenas. M. ozzardi se halla en el centro de América y Sudamérica y en
algunas zonas del Caribe. Los parásitos adultos residen en los tejidos
subcutáneos. M. perstans se da en áreas de África tropical y. a veces, en
Sudamérica. Se cree que los adultos residen principalmente en las cavi-
dades corporales y mesenténcas. Los microfilarias carecen de vaina y circu-
lan por la sangre sin evidencia de periodicidad. La microfilaria de M. ozzardi
tiene una cola fina, afilada, sin núcleos, mientras que la cola de M. Pers-
ians es ancha y abrupta, con núcleos que llegan hasta la punta (Fig. 55-10;
Lámina 55-15F). M. streptocerca, que se halla en África tropical, se puede
confundir con O. volvulus, ya que tanto los adultos como las microfilarias
se localizan en la piel y en los tejidos subcutáneos. También pueden cau-
sar dermatitis. Las microfilarias que se encuentran en las muestras cutá-
neas carecen de vaina y poseen un pliegue en la cola con núcleos hasta
la punta. Todas las especies de Mansonella se transmiten por mosquitos
del género Cuhcotdes.
Filarias zoonóticas. Ciertos nematodos filanales de los géneros Di-
rolilaria y Brugia, que habitualmente parasitan a mamíferos salvajes y do-
mésticos, pueden afectar a humanos. Dirofilaria immitis está muy exten-
dida y la infección humana está bien documentada. La larva transmitida
por mosquito migra hasta el lado derecho del corazón. Cuando el gusa-
no muere, se transporta hasta una arteriola pulmonar, causando un nodu-
lo granulomatoso que puede verse como una lesión con forma de mone-
da en la radiografía de tórax. El diagnóstico suele hacerse por histología
de dicho nodulo.
Otras especies de Dirofilaria como D. tenuis. D. repens y D. ursi suelen
producir nodulos subcutáneos. Estos nodulos se han descrito en múltiples
sitios del cuerpo, como la cara, la conjuntiva y la mama y se suelen quitar
con cirugía. El examen histológico muestra una gran reacción inflamatoria
mixta rodeando a un gusano muerto. Los criterios para identificar las fila-
rías zoonóticas en la histología se pueden encontrar en otros textos (Con-
nor, 1997; Ohnel, 1995: Gutiérrez, 2000).
1229
Otros
Dracunculus medinensis. Los gusanos adultos viven en el tejido sub-
cutáneo y se hacen clínicamente evidentes cuando la hembra migra a la
superficie cutánea y produce ampollas, habitualmente en los miembros infe-
riores. Cuando las extremidades se meten en el agua, las ampollas se rom-
pen y liberan múltiples larvas móviles. El zooplanclon ingiere las larvas, que
después maduran a estadios infectivos y se transmiten nuevamente a huma-
nos al tragar accidentalmente el zooplancton del agua.
Es endémico de áreas de África, Oriente Medio y Asia y puede causar cica-
trices cutáneas desfigurantes con riesgo de sobreinfección bacteriana grave
posterior. Se han hecho grandes esfuerzos de control en los últimos años
para erradicar este parásito (CDC, 1992).
El diagnóstico se hace al ver a la hembra en la superficie cutánea y las
larvas en el Huido de las ampollas. El gusano puede ser cuidadosamente
extraído en varios días, pero procurando no dañarlo. La muerte de un
gusano in situ produce gran reacción inflamatoria y posterior sobreinfec-
ción bacteriana.
Angiostrongylus cantonensis y Angiostrongylus costaricencis.
La menmgoencefalitis eosinofílica humana producida por A. cantonensis se
produce tanto en epidemias como esporádicamente en áreas del sur del
Pacífico, sudeste de Asia y Taiwan. Los parásitos maduros se suelen
encontrar en las arterias pulmonares de las ratas. Las larvas migran hasta
la traquea, donde se eliminan con las heces. Se transforman en infectivas
dentro de babosas o caracoles terrestres y. cuando son comidas por un
huésped roedor, emigran por el cerebro antes de madurar en las arterias
pulmonares. Los humanos lo adquieren al comer caracoles o cangrejos o
camarones crudos, que pueden actuar de huéspedes transportadores, así
como vegetales contaminados con moluscos infectados. En los humanos,
las larvas de A. cantonensis migran al sistema nervioso central, causando
una meningitis con gran eosinofilia en el líquido cefalorraquídeo (Alicata.
1991). El diagnóstico se hace tanto por la clínica como por la anamnesis,
aunque la larva se ha aislado ocasionalmente en el liquido cefalorraquídeo
(Kubersky, 1979).
A. costaricencis se da en América central y Sudamérica (LonaCortez.
1980). El parásito, responsable de la forma intestinal de la angiostrongiliasis.
suele residir en las arterias mesentéricas del íleon y del ciego de los roedo-
res. La infección humana se da en esas mismas localizaciones, causando
inflamación granulomalosa y abdomen agudo. El diagnóstico se hace por el
examen histológico de la pieza quirúrgica y el hallazgo de huevos en los teji-
dos (Strickland. 1999).
Trichinella spiralis. La infección por Trichinella humana se da en todo
el mundo, aunque su incidencia en EE.UU. está actualmente descendien-
do, con menos de cien casos al año. Los humanos adquieren la infección
por la ingesta de carne de cerdo cruda o, a veces, con la carne de oso, que
posee larvas infectivas. Los gusanos ingeridos maduran en el intestino y
producen nuevas larvas en dos a tres semanas. Durante esta fase apare-
cen síntomas gastrointestinales que duran varios dias. Posteriormente las
larvas pasan a los linfáticos y vénulas, alcanzando así la circulación sisté-
mica. Invade principalmente los músculos esqueléticos, donde sufre el des-
arrollo y se encapsula. Durante la fase de migración y encapsulación pue-
de aparecer fiebre, dolor muscular, dificultad respiratoria, edema periorbital
y eosinofilia. dependiendo de la cantidad inoculada. Tras enquistarse, los
síntomas son mínimos. Asi, pueden persistir viables durante años, aunque
a veces se calcifican.
El diagnóstico se hace con la anamnesis y la clínica, y se confirma
mediante la biopsia del músculo esquelético, especialmente del gastrocne-
mio o del deltoides (Lámina 55-11E y 11F). Los test indirectos incluyen la
medición de la creatina fosfocinasa, que suele estar elevada, y la detección
de anticuerpos por floculación con bentonita o con EIA. De éstos, el más
específico es la creatina fosfocinasa y el EIA es el más sensible (Wilson,
1995).
Larva migratoria. La larva migratoria se produce por la migración de lar-
vas de ciertas uncinarias, ascáridos y especies de Strongyloides a través de
los tejidos. El síndrome varia según la especie causante, el número de gusa-
nos y los tejidos afectados.
 1230 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
La larva migratoria cutánea (CLM), o picor del suelo, se produce por la
migración cutánea de uncinarias de perros o gatos del género Ancylostoma,
que penetra la piel pero no puede tener el habitual patrón de maduración.
Aparecen en la piel tractos serpiginosos, eritematosos y pruriginosos en
zonas expuestas al contacto con el suelo. Especial problemática surge en
los climas húmedos y cálidos, donde los huevos y larvas de estas uncina-
rias viven más tiempo. Algunas especies de Strongyloides que parasitan
animales salvajes pueden causar una dermatitis similar.
La larva visceral migrans (VLM) suele estar causada por el áscaris cani-
no Toxocara canis y, en menor grado, por Toxocara cali, del gato domésti-
co. Los niños suelen infectarse por la ingesta accidental o intencional de tie-
rra contaminada con heces de perros o gatos. Tras la eclosión de la larva,
ésta es incapaz de completar su ciclo vital y comienza una migración pro-
longada a través de diferentes órganos y tejidos. Los niños pueden debutar
con retraso del crecimiento y aparición de fiebre, hepatomegalia, neumoni-
lis, eosinofilia e hipergammaglobulinemia. Una reacción inflamatoria en la
retina puede simular un retinoblastoma, un tumor maligno con el que se de-
be hacer el diagnóstico diferencial. El diagnóstico de VLM se suele realizar
mediante los hallazgos clínicos, ya que el parásito raramente se consigue
aislar. Los test serológicos pueden ser útiles para confirmar la sospecha y
actualmente se recomienda el EIA, que usa los antígenos de la fase larval
(Wilson, 1995).
Un síndrome similar al VLM puede ser causado por especies de Gna-
thostoma. que inlectan el estómago de mamíferos. La infección humana
es más frecuente en el sudeste de Asia, pero también se han descrito
casos en México y Ecuador. Este parásito utiliza un cefalópodo como pri-
mer huésped intermediario y peces y anfibios como huéspedes secunda-
rios. También pueden servir como huéspedes diferentes clases de repti-
les, pájaros y mamíferos. Las larvas pueden migrar a través del tejido
subcutáneo, produciendo inflamación transitoria y, ocasionalmente, inva-
sión del sistema nervioso central. La existencia de lesiones migratorias y
una historia de ingesta de pescado crudo pueden ayudar para el diagnós-
tico clínico.
Capillaria hepática. Aunque suele parasilar roedores, a veces cau-
sa enfermedad en humanos, especialmente en niños, en los que puede
simular una VLM, hepatitis, absceso amebiano hepático u otras enfer-
medades patológicas. En el huésped roedor, los huevos se digieren y
producen una larva migratoria que llega al higado, donde madura y pone
huevos en el parénquima. Cuando el hígado es ingerido por un depre-
dador, los huevos se eliminan en las heces y contaminan el suelo. Los
niños están en riesgo para adquirirlos si ingieren la suciedad. En las
áreas endémicas el diagnóstico se hace por el examen de biopsia hepá-
tica o por autopsias. Los huevos son fácilmente reconocibles en la biop-
sia al tener paredes estriadas gruesas.
Anisakis. Pseudoterranova y Eustrongyloides spp. La ingesta de
pescado crudo, aunque se considere una exquisitez en algunas partes del
mundo, tiene como resultado un incremento en el número de casos de
inlecciones por nematodos del pescado. Anisakiasis y Pseudoterranova son
parásitos comunes gastrointestinales de mamíferos marinos, y las fases
infectivas se encuentran en diferentes peces de agua salada, salmón y cala-
mares como huéspedes intermediarios. Los pequeños crustáceos similares
al camarón sirven como primer huésped. Cuando se digieren, esta larva
penetra la pared gástrica o del intestino, produciendo dolor abdominal
agudo. La infección por Anisakis se puede diagnosticar por presunción
basándose en una anamnesis y hallazgos clínicos, y se puede confirmar
mediante el aislamiento de un gusano en la endoscopia o por la presencia
de un granuloma eosinólilo que contenga un nematodo en una de las pie-
zas quirúrgicas. Las especies de Anisakis tienden a ser más productoras de
enfermedad invasiva, mientras que Pseudoterranova spp. tienden a ser tosi-
das o vomitadas intactas (Lámina 55-11 £7 y 11H) (Sakanari. 1989). La larva
de Anisakis es difícil de identificar (Binford, 1976).
Se han descrito escaso número de infecciones por Eustrongyloides spp. en
personas que ha comido sushi casero. Estos parásitos suelen infectar pája-
ros que se alimentan de pescado, pero en humanos la larva rojo brillante inva-
de la cavidad abdominal, precisando tratamiento quirúrgico (Wittner. 1989).
Cestodos
Son muchas las especies de cestodos que afectan a humanos en sus esta-
dios de larva y pueden causar seria enfermedad. Las más habituales son
fácilmente distinguibles de las otras y tienen patrones de transmisión únicos
Cuando se ven en secciones tisulares, las larvas y adultos contienen cuerpos
laminados basofilos conocidos como corpúsculos calcáreos, importantes para
su identificación.
Cisticercosis. La infección humana con la (ase larval del gusano plano
del cerdo, Taenia solium. se da en todo el mundo tras la ingesta accidental
de huevos de un adulto. Es especialmente prevalente en México y el resto
de América latina, Europa, la India y Asia. La mayoría de los casos en
EE.UU. se originan en zonas endémicas, aunque en los últimos años el nú-
mero de casos de origen local ha aumentado (Richards, 1985).
Los huevos se pueden ingerir accidentalmente con comida contaminada
o con agua; posteriormente eclosionan en el tracto gastrointestinal pene-
trando los embriones en la mucosa intestinal, que diseminan posteriormen-
te por el torrente sanguíneo a sitios a distancia, especialmente el músculo
esquelético y también al corazón, cerebro u ojos, donde la clínica inflama-
toria puede ser muy evidente. Una complicación frecuente en áreas endé-
micas son las crisis y frecuentemente es el síntoma de presentación (Lámi-
na 55-16/1).
El diagnóstico suele hacerse con los hallazgos clínicos en las zonas
endémicas, pero puede ser más difícil en áreas no endémicas. El uso de la
tomografía computanzada (TC) es muy útil, pero no suele estar disponible
en la mayoría de las áreas endémicas. La radiografía es útil para ver la exis-
tencia de quistes calcificados, pero no para el diagnóstico de infección
reciente. El aislamiento de cisticercos intactos mediante cirugía confirma el
diagnóstico. El cisticerco, o gusano vesiculado, es un saco lleno de líquido
translúcido, oval que contiene un único escólex que mide 5 mm o más de
diámetro (Lámina 55-16S).
Entre los test serológicos, el inmunoensayo con glucoproteinas disponi-
ble por el CDC tiene alta sensibilidad y especificidad, superando al EIA
(Díaz. 1992). Desafortunadamente, estos test no diferencian entre infección
activa e inactiva, por lo que no son útiles para monitorizar la respuesta al
tratamiento.
La existencia de cisticercosis en personas de un área no endémica y sin
clara historia de viaje obliga a la investigación de la exposición de los mani-
puladores de alimentos relacionados con el paciente, o de la posibilidad de
infección con una especie diferente de Taenia (Schanz, 1992).
Hidatidosis. La infección humana con estadios larvales de gusanos pla-
nos del género Echinococcus puede tomar una de estas tres formas: hidati-
dosis unilocular causada por E. granulosus. hidatidosis multilocular o alveolai
causada por E. multilocularis e hidatidosis poliquística causada por E. vogeli
(Thompsom. 1995). Los huéspedes definitivos de estos minúsculos gusanos
son los perros. Lo que pierden de tamaño, lo ganan en número de individuos,
con varios cientos o miles de gusanos que ponen gran número de huevos en
un solo huésped. Los huevos se eliminan por las heces y se digieren por
huéspedes intermediarios, como la oveja, la vaca, el cerdo, los roedores y
otros herbívoros. Los humanos, especialmente los niños, se infectan tras la
ingesta accidental de huevos.
Los huevos se rompen en el intestino y el embrión penetra la pared intes-
tinal y pasa a la sangre. Aunque la mayoría de las hidátides se desarrollan en
el higado, algunas se diseminan a otros sitios. El desarrollo de los quistes es
lento y puede durar años para lograr un tamaño de 10 cm o 15 cm de diáme-
tro. En el huésped secundario, los quistes contienen numerosos protoescólex,
que proliferan a partir de la membrana germinal.
E. granulosus es el más importante causante de patología humana, espe-
cialmente en áreas de cuidadores de ovejas o vacas, incluidos los EE.UU.
donde los perros son los huéspedes definitivos. La hidatidosis unilocular se
desarrolla como un quiste único en el higado y, posteriormente, en el pulmón
u otro sitio. Los quistes están llenos de un liquido claro que contiene capsu-
las germinales y numerosos protoescólex pudiendo llegar a ser miles (Lámi-
na 55-16C y D). La clínica es la derivada del lento crecimiento de la masa,
aunque la infección en el sistema nervioso central se hace aparente antes
que en otras zonas. El diagnóstico se basa en la presentación clínica y la his-
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
toría junto con el uso de radiografía o TC y la ecografía. Los test serológicos
son muy útiles para confirmar el diagnóstico y constan de un test de scree-
ning como EIA o el IHA seguido, si fuese positivo, de un test de confirmación
como el inmunoblott o el gel de difusión (Wilson. 1995). La sensibilidad va
desde el 60% al 90% según cada caso. Los falsos positivos se pueden dar
en la cisticercosis, aunque la presentación clínica debería evitar la confusión.
La aspiración de contenido de los quistes es potencialmente peligrosa, ya
que el vertido de su contenido puede producir diseminación o riesgo de
shock anafiláctico, pero si se realiza, revelaría una mezcla de protoescólex,
cápsula germinal, garfios y corpúsculos calcáreos.
E. multiloculans causa hidatidosis multilocular o alveolar en las regiones
del norte de Europa y Rusia, y en Alaska. Canadá y el norte de EE.UU. Los
huéspedes miermediarios incluyen una variedad de pequeños roedores; los
zorros, los lobos y los perros son los huéspedes definitivos. La infección
humana se da en el hígado, donde las hidátides se desarrollan como un
quiste invasivo que se introduce en el tejido con un patrón alveolar. Aunque
la membrana germinal prolifere en el hígado, los protoescólex carecen de
desarrollo, La imagen puede asemejarse a la de un hepatocarcinoma. Los
test serológicos que usan los antígenos de E. granulosus son útiles para el
diagnóstico. El uso diferencial de antigenos de ambos parásitos parece te-
ner un gran potencial para la diferenciación entre estas dos enfermedades
(Wilson, 1995).
£ vogeli produce un quiste hidatidico poliquíslico que es invasivo, pero
se diferencia de £ multilocularis en que £ vogeli produce tanto mem-
brana germinal como protoescólex. La enfermedad está limitada a Latino-
américa, donde los roedores completan el ciclo vital (D'Alessandro. 1979).
La hidatidosis poliquíslica en Sudamérica puede también ser causada por
E. oligarlhus, un parásito de felinos y roedores. Esta especie es morfológi-
camente similar a £ vogeli y en el pasado se confundieron casos (D'Ales-
sandro. 1995).
Esparganosis. La esparganosis está causada por la larva del género Spi-
romelra. emparentada con Diphyllobothrium spp. Habitualmente parásita
perros y gatos y están en Asia (Spirometra mansoni) y Norteamérica ¡Spiro-
metra mansonoides). Los ciclos vitales son similares a los de Diphylloboth-
rium. los cefalópodos sirven como primer huésped intermediario para la larva
procercoide y el pescado como segundo huéspedes para la larva pleurocer-
coide. Los humanos se infectan con estos estadios larvales a través de la
ingesta de cefalópodos en el agua o con el pescado crudo o poco cocinado.
El uso de ranas o serpientes como cataplasmas también puede transferir lar-
vas. La esparganosis se suele presentar como un edema local o migratorio a
nivel subcutáneo junto con eritema y dolor; a veces se da una infección cere-
bral. La exploración quirúrgica puede revelar un delicado gusano, delgado y
de color marfil y de escasos centímetros de largo. Los cortes axiales demues-
tran un grueso tegumento con profundos pliegues y un parénquima con mar-
cadas fibras musculares. No se han visto cavidades corporales en los nema-
todos y los corpúsculos calcáreos son numerosos (Lámina 55-16F) (Orihel,
1995; Gutiérrez, 2000).
Coenurosis. La tenia intestinal de perros y gatos (principalmente T. muí-
ticeps y T. serialis) produce una larva en los huéspedes intermediarios cono-
cida como coenuro. Este estadio consta de un largo saco transparente (de
unos 10 cm) que contiene muchos escólex que surgen de una membrana
germinal que se invagina en quistes llenos de líquido (Lámina 55-16E). Las
ovejas son los huéspedes intermediarios de T. multiceps. y los roedores, lie-
bres y conejos lo son para T. serialis. aunque los humanos juegan este papel
por la ingesta accidental de huevos producidos por gatos y perros domésti-
cos. Como un cisticerco. el coenuro puede desarrollarse en cualquier órga-
no causando una enfermedad similar. El diagnóstico se suele hacer por el
examen de quistes extirpados o en secciones tisulares. La presencia de múl-
tiples escólex invaginados en una sola vesícula lo diferencian del resto de los
cestodos larvales.
Tremátodos
Todos los tremátodos que habitan en el hígado, el pulmón y la sangre y que
maduran en humanos producen huevos que generalmente salen del cuerpo
1231
por las heces, la orina o el esputo. Dada su localización extraintestinal, estas
lombrices y sus huevos se pueden encontrar en los tejidos, como hallazgo o
asociados a clínica.
Los adultos de F. hepática. C sinensis y O. vivernm se pueden hallar en
el hígado y en las vías biliares y. a veces, en sitios ectópicos. La presencia
de los típicos huevos, tanto libres en los tejidos como dentro del útero de los
helmintos, frecuentemente facilita la identificación definitiva. El adulto de Pa-
ragonimus spp. es el que reside principalmente en el pulmón, pero puede
hallarse en sitios ectópicos como el cerebro y el tejido subcutáneo, produ-
ciendo abscesos frecuentemente asociados con una gran producción de
huevos. Los esquistosomas adultos viven en los vasos sanguíneos, princi-
palmente en el territorio de la vena mesentérica interior (S. mansoni). vena
mesentérica superior (S. japonicum y S. mekongi) y en el plexo vesical (S.
haematobium). Aunque los adultos no suelen encontrarse en las biopsias
tisulares. los huevos pueden encontrarse en gran número de tejidos del
intestino, del hígado y de la vejiga (Lámina 55-14 B, Dy F). Los huevos pue-
den diseminarse por la sangre a otros locos, incluidos el cerebro, la médula
espinal, los pulmones, el corazón, los ríñones y el bazo. Los huevos de S.
japonicum tienen tendencia especial a diseminarse debido a su pequeño
tamaño y al gran número de huevos producido. La identificación de los hue-
vos depende del reconocimiento de su tamaño típico y de su morfología en
los tejidos adecuados.
ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA
Los artrópodos comprenden un gran y diverso grupo de organismos, al-
gunos de los cuales tienen una gran importancia clínica o económica. Esto
es debido a que son una importante causa de morbimortalidad en los huma-
nos y para sus animales domésticos, con serias pérdidas económicas para
la agricultura. Aunque quizá los artrópodos son más conocidos entre los clí-
nicos por su capacidad para transmitir agentes infecciosos, como son virus,
bacterias (Rickettsia, espiroquetas y otros), protozoos y algunos helmintos,
éstos también pueden causar patología directamente por invasión tisular.
envenenamiento, formación de vesículas, pérdida de sangre y reacciones
alérgicas. El miedo exagerado a artrópodos (entomofobia) y los delirios de
infestación (delirio de parasitosis) son neurosis no infrecuentes que pueden
afectar a algunos individuos. Las especies que directa o indirectamente
causan enfermedad humana son representativas de todas las clases de ar-
trópodos (Tabla 55-10).
En esta sección, se presenta una aproximación que se puede usar en el
laboratorio clínico cuando se evalúan muestras con artrópodos, seguida por
una breve descripción de cada grupo de artrópodo con relevancia médica.
Existe una variedad de textos generales y especializados disponibles para
una completa cobertura del campo de la entomología (Beaver. 1984; Gar-
cía. 1997: Goddard. 1996: Harwood. 1979; Kettle. 1993; Lane, 1993; Cen-
tro Nacional de Declaración de Enfermedades, 1969; Strickland, 1999).
Características biológicas
Los artrópodos se caracterizan por una simetría bilateral y un cuerpo seg-
mentado, varios pares de apéndices articulados y un caparazón rígido que se
va modificando durante el crecimiento. El desarrollo va desde huevos hasta
adultos a través de una metamorfosis gradual (huevo, ninfa y adulto) o com-
pleta (huevo, larva, pupa y adulto). Las chinches, los revúviros, los piojos y las
cucarachas son ejemplos de insectos que sufren una metamorfosis gradual.
La mosca, el mosquito, las pulgas, las hormigas, las abejas y las avispas, asi
como los escarabajos, sufren una metamorfosis completa. Las formas larva-
les similares a los gusanos se hacen pupa y luego adultos. Los arácnidos
sufren cambios de desarrollo muy similares al proceso gradual de metamor-
fosis. Las larvas de estos artrópodos, que con frecuencia, sufren una meta-
morfosis completa, suelen ser los más difíciles para identificar y se deben
enviar a un especialista.
 1232 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 55-10 Clasificación de los artrópodos de importancia médica
Clase Insecia (insectos)
Orden Anopleura (piojos)
Orden Siphonaplera (pulga)
Orden Diclyoplera (cucarachas)
Orden Hemiptera (chinches, revúviros)
Orden Hymenoplera (hormigas, avispas, abejas)
Orden Coleóptera (escarabajo)
Orden Lepidoptera (orugas, mariposas, polillas)
Orden Díptera (moscas, ácaros. mosquitos)
Clase Aracnida (arácnidos)
Subclase Scorpiones (escorpiones)
Subclase Araneao (arañas)
Subclase Acari (garrapatas, ácaros, ninguas)
Clase Diplopoda (milpiés)
Clase Chilopoda (ciempiés)
Clase Crustácea (crustáceos)
Orden Copepoda ( c e f a l ó p o d o s )
Orden Decapoda (cangrejos)
Clase Pentastomida (gusanos de la lengua)
Mecanismos de lesión
Invasión tisular directa. La invasión de la superficie de tisular (conocida
como inlestación) se produce con gran variedad de artrópodos, de los que los
ácaros, la pulga y algunas larvas de dípteros son los más comunes. La inva-
sión de tejidos profundos y las cavidades (referidos como infección) se da
principalmente con los gusanos y. rara vez. con las larvas de pentastómidos.
La invasión por larvas de dípteros, llamada miasis. puede darse en tejidos
vivos o desvitahzados según las especies.
Envenenamiento. Muchos artrópodos pueden inyectar saliva o veneno
con sus mordiscos o picaduras. Para la mayoría de las personas produce
sólo una reacción local tisular. pero puede producir serias reacciones, como
anafilaxia debido a una previa sensibilización a la toxina en cuestión. Las
picaduras de heminópteros (hormigas, abejas y avispas) y las de escorpio-
nes son las más agresivas (Reisman, 1994). Las mordeduras de ciertos
artrópodos, especialmente los ciempiés, los mosquitos, las moscas, las
chinches, los revúviros, las chinches asesinas, los piojos, las pulgas, las ga-
rrapatas y los ácaros, también pueden ser tóxicas, causando reacciones lo-
cales o sistémicas. Casi todas las arañas son venenosas, pero sólo un pe-
queño grupo (arañas viudas, arañas violín y algunas tarántulas) pueden
causar peligro para la salud humana. Causas de envenenamiento menos
(recuentes pero también descritas son motivadas por la exposición a los pe-
los urticantes de ciertas orugas o larvas de escarabajos.
Vesiculación. Algunos de los milpiés más largos son capaces de rociar
o lanzar una sustancia química vesicante (productoras de ampollas) desde
unas glándulas localizadas en cada segmento del cuerpo. Esto es especial-
mente irritante si alcanza la conjuntiva. Los escarabajos vejiga son llama-
dos así por su capacidad de descargar fluidos vesicantes (cantaridina. el
ingrediente aclivo de la mosca afrodisíaca española) cuando se les ma-
nipula.
Pérdida de sangre. Los artrópodos responsables de causar pérdidas
de sangre a los hombres o animales domésticos incluyen chinches, revúvi-
ros. pioios. pulgas, moscas, mosquitos, garrapatas y ácaros. Aunque no
suele suponer un nesgo para la vida, tiene el riesgo de transmisión de agen-
tes infecciosos.
Transmisión de agentes infecciosos. Muchos artrópodos juegan un
papel muy importante en la transmisión mecánica o biológica de agentes
infecciosos. La mosca doméstica puede ser responsable de la transmisión
del agente de disenteria bacilar, cólera, tifus, diarrea viral, disentería ame-
biana, giardiasis y gusanos. Los mecanismos que intervienen en la trans-
misión biológica varían desde la simple amplificación en el artrópodo vector
hasta cambios más complejos del ciclo vital del parásito. Tanto garrapatas
como ácaros intervienen en la transmisión de ciertas bacterias (Rickellsia.
Ehrlichia. espiroquetas y otras), protozoos (Babesial y virus. Entre los insec-
tos, los piojos transmiten bacterias {Rickettsia, Bartonella y Borrelia): los
revúviros transmiten Trypanosoma: las pulgas transmiten agentes de peste,
tifus y gusanos planos caninos; y los dípteros transmiten arbovirus. malaria.
Trypanosoma, Leishmania. filarías y bacterias.
Reacciones de hipersensibilidad. La mayoría de las reacciones gra-
ves de las picaduras suelen ser producidas por hipersensibilidad alérgica.
Las picaduras de heminópteros son las responsables de la mayoría de las
muertes por artrópodo y suelen ser por hipersensibilidad tras una exposi-
ción repetida al veneno (Reisman. 1994). La alergia también puede exacer-
barse tras la exposición a la saliva, excrementos o partes del cuerpo de los
ácaros. garrapatas, piojos, chinches, orugas, polillas y mariposas. Se puede
producir asma y fiebre elevada como respuesta a estos alérgenos en el am-
biente (Frazier, 1980).
Manifestaciones psicológicas. La entomofobia se define como un
irrazonable o excesivo miedo a la vista o al contacto con artrópodos Aun-
que esto puede causar alteraciones en las actividades habituales de una
persona, rara vez es incapacitante. El delirio de parasitosis es un trastorno
emocional más serio por el que una persona está convencida de que esta-
ba infectada con parásitos o artrópodos a pesar de la evidencia objetiva de
lo contrario. Si esto progresase, podría resultar en una pérdida de empleo,
divorcio, abuso de pesticidas y mudanzas repetidas. Las visitas a los ser-
vicios de salud suelen ser numerosas, aunque insatislactoñas. El problema
puede empezar tanto en el hogar como en el trabajo y se puede transferir
del uno al otro. El delirio puede ser tan convincente que puede ser creído
por otros miembros de la familia o amigos o tomarse como propio. El pa-
ciente puede remitir muchas muestras, como piel, pelo, mocos o pelusa al
laboratorio. Es obligación del laboratorio examinar dicho material para des-
cartar una auténtica infestación. El misterio de la irritación y el picor puede
deberse a picaduras de ácaros, piojos, pulgas o chinches no reconocidas
o bien a insectos y ácaros traídos por un roedor o pájaros en el área habi-
tada por el paciente. Antes de descartar tales causas, se deben buscar y
excluir su presencia (Lynch. 1993).
Aproximación de laboratorio a la identificación
de artrópodos
Las muestras de artrópodos son frecuentemente dirigidas al laboratorio clí-
nico tanto por médicos como por pacientes con la esperanza de que sean
identificados, pero pocos trabajadores de los laboratorios reciben algo más
que un entrenamiento superficial en entomología. Sin embargo, los especia-
listas pueden tener acceso a textos y claves que permiten una identificación
de los grupos encontrados con más frecuencia, especialmente los ectopará-
silos (pulgas, ácaros. piojos y garrapatas). De mayor importancia es la capa-
cidad del personal del laboratorio para reconocer las raras situaciones en las
que se debe buscar la opinión de un experto. Esto es de especial relevancia
en las ocasiones en las que se están lomando importantes decisiones tera-
péuticas y de pronóstico. Los laboratorios de salud pública local o estatal sue-
len tener expertos disponibles o conocen a personas entrenadas en entomo-
logía médica en institutos educacionales, o museos u oirás agencias, incluido
el CDC.
Las muestras recibidas en el laboratorio suelen ser organismos intactos,
raspados cutáneos, tejidos, esputos, orina o heces. También se pueden remi-
tir objetos personales como plantillas, agua, ropa, ropa de cama y alfombras,
entre otras. No es raro que se remitan artrópodos hallados en el inodoro tras
la micción o la deposición. En la mayoría de los casos, la presencia de estos
organismos es coincidencia y no implica infección.
La correcta muerte y conservación de los artrópodos es importante para
preservar sus características, que luego serán necesarias para su identifica-
ción. Los artrópodos pequeños, sin alas, especialmente los ectoparásitos
(piojos, pulga, garrapatas y ácaros). larvas (gusanos, orugas, larvas), arañas
 CAPÍTUIO 55 • PARASITOLOGÍA MEDICA
y escorpiones se deben colocar directamente en alcohol etílico al 70%-80%.
Las grandes formas larvales se matan mejor en agua caliente (sin hervir),
para que sus cuerpos se extiendan sin contraerse antes de meterlos en alco-
hol. Los tejidos afectados u otros escombros se deben manipular con delica-
deza o lavar antes de conservarlos. Las formas más pequeñas (acaras,
pequeñas garrapatas, pulgas, moscas de arena) se deben preparar como
muestras permanentes.
Los insectos alados, especialmente los mosquitos adultos y moscas, se
deben matar exponiéndolos a humos de etil acético o cloroformo y preser-
varlos en seco para mantener la información taxonómica recogida en las
escalas corporales y de las alas. Tales artrópodos suelen pinchar y secar,
seguido por un almacenamiento en cajas herméticas protegidas con nafta-
lina o diclorobenceno. Más detalles de la recolección, preservación y prepa-
ración de las muestras artrópodos se pueden encontrar en otros textos
(Beaver. 1984; García. 1993; Lañe, 1993; Steyskal, 1987).
Insectos
Los insectos comprenden más del 90% de todas especies de artrópo-
dos descritos, aunque sólo algunas especies son responsables de patolo-
gía humana. Los miembros de esta clase se diferencian de los demás
artrópodos por poseer el cuerpo dividido en tres partes (cabeza, tórax y
abdomen), un par de antenas, tres pares de patas y uno, dos o ningún par
de alas. Es la única clase de artrópodos en los que se ha desarrollado el
vuelo.
Piojos. Los piojos están aplanados dorso-ventralmente, sin alas, con
unas características pinzas en el final de cada pata que les permite fijar-
se a los pelos o a la ropa (Lámina 55-17/1 y S). Todas las especies se ali-
mentan de sangre intermitentemente y pueden causar una dermatitis poco
explicada. Los huevos, conocidos como liendres, se depositan en los
pelos o en la ropa, según la especie. Aunque se les nombra según su prin-
cipal localización, no siempre están confinados a esa localización. El piojo
de la cabeza, Pediculus capitis. y el de cuerpo, Pediculus humanus. son
indistinguibles por personal no especialista. Son más largos que anchos y
miden hasta 3 mm. La dilerencias biológicas son aparentes. P. humanus
es el único que transmite el agente del tifus, la fiebre de las trincheras y
la fiebre recurrente (Kim. 1986). La infestación por ambos tipos se da en
gente acinada y con poca higiene. Los niños en edad escolar tienen mayor
riesgo para adquirir el piojo de la cabeza, al compartir gorros, ropa y pei-
nes (Orkin, 1985). Las liendres de piojo de la cabeza se colocan princi-
palmente en el eje del pelo, y las del corporal se colocan en la ropa. Los
productos de cuidado del pelo, las micosis del pelo, así como otros obje-
tos, pueden simular liendres y su diferenciación es importante. Las lien-
dres miden 1 mm y, cuando aún no han eclosionado, poseen un opérculo
intacto (Lámina 55-17C). La transmisión se da principalmente al compar-
tir ropa infestada, así como ropas de cama, ya que el piojo corporal tien-
de a poner los huevos en racimos especialmente a lo largo de las costu-
ras o dobleces de la ropa.
El piojo del pubis. Phlhirus pubis, es diferente de los otros. Es más redon-
deado (mide hasta 2 mm de diámetro), y el abdomen es más parecido al de
un cangrejo. Su primer par de patas es mayor y más largo que las demás
patas (Lámina 55-17S). Estos piojos y sus liendres se hallan principalmente
en el vello púbico. pero pueden extenderse al tórax, las axilas y a la cara. La
transmisión suele producirse durante el acto sexual.
Pulgas. Las pulgas son pequeños ectoparásitos (de 1 mm a 2 mm). sin
alas y lateralmente aplanados que se alimentan de sangre (Lámina 55-
17D). Sus largas y musculosas patas están adaptadas para saltar de gran-
des distancias. Todas las pulgas que alectan a humanos son parásitos de
otros mamíferos o aves de corral. La infestación se produce por la exposi-
ción a animales domésticos y mascotas. Las especies más nocivas son la
pulga del perro (Ctenocephalides canis). la del gato (C. Felis), y la huma-
na (Pulex irrilans). Algunas personas crean alta sensibilización a las mor-
deduras de las pulgas, mientras que a otras casi no les afecta. Las pulgas
de gatos y perros también son huéspedes intermediarios de gusanos pla-
1233
nos de D. caninum y, menos frecuentemente, de H. diminuta y H. nana. Ya
que las larvas de estas especies frecuentemente se dan en los lechos de
los animales, alfombras y muebles, su erradicación puede requerir la fumi-
gación y su limpieza. La pulga de la rata oriental. Xenopsyila cheopis. es
una especie muy importante, ya que transmite el bacilo de la peste y el
agente del tifus murino. Aunque parásita en muchas especies de ratas,
estas pulgas atacan con facilidad a humanos. La pulga ningua o de las are-
nas (Junga penelrans) se halla en América central y Sudamérica y regio-
nes de África tropical. La pulga hembra se une a la piel especialmente
entre los dedos del pie y bajo las uñas, donde crecen hasta el tamaño de
un pequeño guisante. Tras la puesta de huevos, la pulga muere, produ-
ciendo una respuesta inflamatoria con el riesgo de una sobreinfección bac-
teriana. La tungiasis se diagnostica al identificar la porción oscura del
abdomen de la pulga saliendo de la piel en una lesión alargada (Beaver,
1984; Goddard, 1996: Lañe, 1993).
Cucarachas. Las cucarachas se han adaptado rápidamente a la vida de
los humanos compartiendo nuestra comida, cobijo y nuestro calor. Aunque
son unos compañeros algo pesados, éstos son potencialmente transportado-
res de patógenos lecales debido a su capacidad de moverse rápidamente
desde los desagües a las cocinas o despensas. Además de transmitir bacte-
rias, pueden extender poliovirus. virus de la hepatitis, protozoos intestinales,
incluida Entamoeba histolytica. y muchas especies de nematodos entéricos.
También se pueden dar alergias y asma en algunos individuos tras la exposi-
ción a excrementos, caparazones o partes del cuerpo de las cucarachas
(Goddard, 1996).
Chinches y revúviros. Las chinches (familia Cimidiae) y los revúviros
(familia Reduviidae) son insectos chupadores de sangre con probóscides lar-
gas y estrechas que las doblan bajo el cuerpo cuando no las usan. Las chin-
ches (Cimex lectulanus y Cimex hemipterus) son marrones rojizas, aplanadas
dorso-ventralmente, sin alas, de unos 5 mm de longitud (Lámina 55-17£). Tie-
nen una distribución cosmopolita y atacan a la mayoría de los mamíferos, ali-
mentándose principalmente por las noches. Durante las horas del día se
esconden ba|o los colchones, el papel de las paredes las tablas del suelo.
Aunque no se les conocen como transmisores de enfermedades, sus mordis-
cos pueden ser dolorosos, con ampollas, según la sensibilidad del individuo a
su saliva.
Los revúviros (Tnatoma. Rhodnius. Panstrongyius) tienen una cabeza
con forma de cono con un cuello estrecho y un abdomen que se ensancha
en su mitad. Estos son negros o marrones y algunos tienen marcas naran-
jas o negras en el abdomen. Suelen medir de 1 cm a 3 cm y, a diferencia
de las chinches, tienen unas alas bien formadas para volar. Al igual que las
chinches, se alimentan en vertebrados y causan similares reacciones cutá-
neas. En México y América central y Sudamérica transmiten el agente de
la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzí. en las heces, que poste-
riormente se introducen en la piel mediante el rascado (Goddard, 1996; La-
ñe, 1993).
Abejas, avispas y hormigas. Los heminópteros son insectos sociales
que hábilmente defienden sus nidos cuando se les molesta. En las hembras
no reproductoras, el órgano ponedor de huevos se modifica como un agui-
jón capaz de inyectar veneno para capturar presas o para defenderse. El
veneno de la abejas, avispas y avispones causa sólo una inflamación dolo-
rosa temporal en la mayoría de las personas, pero pueden causar a veces
reacciones sistémicas, como anafilaxia en personas sensibilizadas (Reis-
man. 1994). Cerca de cien personas mueren cada año en EE.UU. por este
motivo. La abeja de la miel africana se encuentra ahora en Norteamérica
tras su introducción en Brasil en 1956. Estas abejas, que son fácilmente
más provocadas por otras abejas, muestran un masivo comportamiento a la
hora de picar. Muchas especies de hormigas son problemáticas para los
humanos por su capacidad de morder, y algunos grupos, como las hormi-
gas segadoras y las hormigas del fuego, son capaces de producir picaduras
dolorosas.
Escarabajo. Aunque quiza son con frecuencia conocidos como provo-
cadores de plagas en los campos de agricultura, algunos tienen unas mor-
deduras dolorosas y otros, especialmente los escarabajos vejiga, pueden
exudar un líquido vesicante (cantaridina) que produce dermatitis o ampollas.
 1234 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Las larvas de ciertos escarabajos poseen pelos urticantes que producen
dermatitis o, si se ingieren, irritación del tracto gastrointestinal. Las larvas y
los adultos de los escarabajos del grano pueden actuar como huéspedes
intermediarios para los gusanos planos H. diminuta y H. nana de los roedo-
res y humanos.
Polillas y mariposas. Algunas larvas (orugas) de lepidópteros poseen
pelos urticantes o espinas que inyectan veneno al manipularlas. Aunque la
mayoría de los efectos de estas toxinas pueden quedar en la piel, se han des-
crito efectos sistemáticos, incluidos shock y parálisis (Goddard, 1996). Los
adultos de la polilla gitana y de montecillo de hierba poseen pelos urticantes
que pueden causar dermatitis, conjuntivitis o irritación de la vía aérea, espe-
cialmente en trabajadores forestales (Shama. 1982).
Moscas y mosquitos. Los dípteros se caracterizan por poseer un par
de alas membranosas. Entre todos los artrópodos, son los responsables de
la mayor parte de las enfermedades humanas producidas al alimentarse de
sangre, transmisión de agentes infecciosos y la invasión directa de tejidos
por sus larvas (miasis). Las picaduras suelen causar irritación local debido
a la sensibilidad a la saliva y, en algunos individuos, reacciones sistémicas.
Además de su acción de sangre, los repetidos ataques pueden producir
daños físicos y psicológicos. Ciertas especies chupadoras de sangre son
también responsables de la transmisión de patógenos: malaria, filariasis y
arbovirus por mosquitos; las oncocercosis por la mosca negra; loiasis por la
mosca ciervo; leishmaniasis y bartonellosis por la mosca de la arena; tripa-
nosomiasis africana por la mosca tse-tsé. Otros agentes virales, bacterianos
o parasitarios se transmiten con facilidad de modo mecánico por las mos-
cas no picadoras, como la mosca doméstica o la mosca de la carne que
pueden contaminar fácilmente el alimento.
La miasis puede producirse de un modo accidental, facultativo u obligato-
rio. La mosca doméstica no tiene la necesidad de desarrollarse en los tejidos
de mamíferos, aunque puede hallarse a veces en tejidos muertos. Este tipo
de miasis accidental no es infrecuente, pero no suele tener relevancia clíni-
ca. La miasis facultativa es causada más frecuentemente por la mosca de la
carne, que suele alimentarse de tejidos muertos pero puede ir a los tejidos
viables adyacentes. La miasis obligatoria se produce por especies que se
desarrollan sólo en tejidos vivos. Estas especies tienen un origen zoonótico.
La mosca humana. Dermatobia hominis. se desarrolla en lesiones subcutá-
neas como forúnculos, con el extremo posterior apareciendo por la superfi-
cie cutánea (Lámina 55-17F). Estas especies se encuentran más frecuen-
temente en personas que ha estado algún tiempo en América Central o
Sudamérica, o con menos frecuencia en África. Es raro que los huevos sean
transportados al huésped por otros insectos, habitualmente mosquitos. La
mosca Cordyiobia anthropophaga. hallada en África subsahariana, también
causa una miasis foruncular. Sus huevos se suelen poner en el suelo o en
las ropas tendidas y la larva penetra rápidamente al contacto con la piel. La
miasis obligatoria grave es la causada por Chrysomya bezziana y por Coch-
limyia hominivorax. Estas especies ponen sus huevos en el ganado vacuno,
habitualmente en las heridas o cerca de la nariz. Las larvas se mueven y se
alimentan activamente a través de los tejidos vivos. Las infecciones huma-
nas pueden ser especialmente destructivas y afectar al 0|0, a la nariz o a la
boca. Otras especies también pueden ser causantes de miasis obligatorias
en los humanos (Lane. 1993).
Arácnidos
Los arácnidos de importancia médica son los escorpiones, las arañas, las
garrapatas y los ácaros. Los escorpiones y las arañas poseen dos segmen-
tos corporales, el cefalotórax y el abdomen, mientras que las garrapatas y los
ácaros sólo tienen uno. Poseen cuatro pares de patas, tanto de ninfas como
de adultos. La larva de garrapata y de ácaros tiene tres pares de patas. Todos
carecen de antenas, mandíbulas y alas. Los escorpiones y las arañas son
más conocidos por su capacidad de inyectar veneno, mientras que las garra-
patas y los ácaros son conocidos por actuar como vectores de patógenos
virales, bacterianos y protozoos.
Escorpiones. A diferencia de otros arácnidos, los escorpiones sólo tie-
nen un par de pinzas delanteras, que les da un aspecto similar a un can-
grejo, y una cola segmentada con un aguijón globuloso en el extremo
(Lámina 55-18A). Tienen una naturaleza depredadora, paralizando a sus
víctimas con su veneno del aguijón, aunque también puede usarlo para
fines defensivos. La toxicidad humana varía según las especies. Pueden
no producir más daño que la picadura de una abeja, pero algunos son mor-
tales, causando cerca de mil muertes al año. Las especies venenosas se
dan en el hemisferio oeste, Europa, África y Oriente Medio (Beaver, 1984;
Goddard, 1996).
Arañas. Las arañas carecen de cola con aguijón, pero a cambio po-
seen quelíceros parecidos a colmillos en su zona bucal, a través de los
cuales pueden inyectar veneno. Aunque la mayoría son venenosas, tan
sólo unas pocas tienen quelíceros capaces de penetrar la piel humana. La
mayoría de las picaduras producen sólo irritación y dolor temporal. Las
arañas viudas (género Lactrodectus) son uno de los grupos responsables
de síntomas sistémicos gracias a la acción de una potente neurotoxina
capaz de producir somnolencia, dolor muscular, parálisis, convulsiones y,
a veces, la muerte. La tasa de mortalidad publicada varía del 1% al 6%.
Se han descrito cinco especies en EE.UU., siendo la viuda negra (Lactro-
dectus mactans) la más extendida. Las hembras de la viuda negra poseen
un color negro brillante con una característica marca rojo-naranja en la
parte inferior del abdomen y tienen una envergadura de 3 cm o 4 cm.
Viven en localidades protegidas, como cobertizos, bosques y sótanos
(Strickland, 1999).
Las arañas violin (género Loxosceles) son causantes del aracnidismo
necrótico. En EE.UU., el recluso marrón (Loxosceles reclusa) es el que
más frecuentemente afecta, aunque hay otras especies. Esta especie
mide de 1 cm a 2 cm, con un color entre canela y marrón oscuro, con una
marca oscura en forma de violin orientada hacia la parte delantera en el
dorso del cefalotórax. Cuando se halla en los hogares está recluida en su
guarida, prefiriendo zonas tranquilas como armarios, sótanos o porches.
Su picadura es indolora y con frecuencia no se descubre hasta horas des-
pués, cuando se forma eritema, edema y dolor. El veneno es dermone-
crotizante y hemolítico, causando necrosis cutánea durante varios días.
La lesión puede tener dificultad para cicatrizar y puede sobreinfectarse.
Son raras las reacciones sostenidas, como la hemolisis y el fallo renal
agudo. Otros géneros también se han implicado en aracnidismo necroti-
zante (Fisher, 1994).
Garrapatas. A diferencia de las arañas y escorpiones, las garrapatas
tienen un cefalotórax fusionado con el abdomen y un característico hipos-
toma para alimentarse. Se desarrolla en cuatro fases: huevo, larva, ninfa y
adulto. Tras anclarse, necesita alimentarse de sangre para su desarrollo.
Los humanos la adquieren en las áreas de arbustos o de hierba en las cer-
canías de los huéspedes animales. Son ectoparásitos que necesitan ali-
mentarse de sangre y son importantes vectores de patógenos virales, bac-
terianos y protozoos, tanto para hombres como para animales domésticos.
Su alimentación también causa daño local y pérdida de sangre, especial-
mente al ganado y a la fauna, o la parálisis de la garrapata que es un sín-
drome causado por una neurotoxina secretada por las glándulas salivares
que causa parálisis flácida ascendente y toxemia. La clínica puede ase-
mejarse al síndrome de Guillain-Barré, a la poliomielitis o al botulismo. La
resolución de los síntomas se da en tan sólo unas horas o días tras quitar
la garrapata.
Las especies que afectan a humanos son los miembros de la familia Ixo-
didae (garrapatas duras) y Argasidae (garrapatas blandas). Las duras tie-
nen el aparato bucal dirigido hacia delante y un caparazón escleroso en el
dorso llamado scutum. Este caparazón cubre la totalidad del dorso del
macho, pero sólo la porción anterior de la hembra, permitiendo que se hin-
che cuando engorda (Lámina 55-186 y C). Las garrapatas Argasidae tienen
un cuerpo blando que carece de caparazón y el aparato bucal está dirigido
ventralmente, siendo invisible cuando se la observa desde arriba (Lámina
55-180). Las garrapatas sin engordar miden de 2 mm a 5 mm pero crecen
varias veces tras engordar. Las garrapatas duras engordadas pueden ase-
mejarse a las blandas, por lo que se debe tener cuidado a la hora de su
identificación (Sonenshine, 1991,1993).
La mayoría de garrapatas observadas libres o unidas a la piel son duras.
Las blandas suelen alimentarse brevemente por la noche. Las especies de
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MEDICA
garrapatas duras importantes en América del Norte son Dermacentor varia-
bais (garrapata canina americana). D. andersoni (garrapata de la madera
de las Montañas Rocosas). Amblyomma americanum. Rhipicephalus san-
guineus (garrapata canina marrón). Ixodes escapularis (garrapata de palas
negras) e /. pacificus (garrapata de patas negras del oeste). A Dermacen-
tor y Amblyomma se les llama también garrapatas adornadas por las mar-
cas blancas en sus caparazones. Las otras carecen de adorno.
Las garrapatas Dermacentor transmiten la liebre manchada de las Mon-
tañas Rocosas y posiblemente la tularemia y liebre Q. Ixodes son vecto-
res de la enfermedad de Lyme. babesiosis y ehrlichiosis, y en otras partes
del mundo transmiten ciertos arbovirus. Amblyomma es capaz de trans-
mitir la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y también una tulare-
mia y la enfermedad de Lyme. Todos estos géneros pueden causar la pa-
rálisis de la garrapata. Rhipicephalus se ha implicado en la transmisión de
la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y en ehrlichiosis del norte
de América, y la fiebre botonosa en el área mediterránea. Las garrapatas
blandas del género Ornithodoros se dan en muchas zonas del mundo,
incluido EE.UU. y son importantes vectores de fiebres recurrentes por
espiroquetas (Borrelia recurrentis y las formas relatadas) (Spach. 1993;
Murray, 1999).
1235
Clases de menor importancia médica
Milpiés. Los milpiés son artrópodos similares a los gusanos con nume-
rosos segmentos, cada uno de los cuales posee dos pares de patas que
pueden encontrarse en y bajo la vegetación. Aunque carecen de aparato
bucal mordedor, algunas especies producen secreciones vesicantes desde
las glándulas colocadas en los segmentos. Cuando se les agrede, las lar-
gas especies tropicales pueden lanzar un liquido a una distancia de varios
centímetros. La exposición de la piel o mucosas a estos líquidos causa que-
mazón y ampollas.
Ciempiés. Estos animales son más planos que los milpiés y tienen sólo
un par de patas por segmento; poseen largas antenas. Tienen un movi-
miento rápido y pueden causar picor con un par de pinzas frontales que
están modificadas a partir del primer par de patas. Aunque no suelen cau-
sar serios daños, las especies más grandes (26 cm a 45 cm) del sur de
EE.UU. y de las regiones tropicales son capaces de penetrar la piel al
locarla, produciendo un picor urente y doloroso con inflamación local. Aun-
que podrían existir reacciones sístémicas en personas sensibilizadas, esto
es raro (Goddard. 1996).

Ácaros. Los ácaros son arácnidos microscópicos (menores de 1 mm) am- Crustáceos. Los crustáceos de importancia médica son principalmente
pliamente distribuidos en el ambiente. Las especies con importancia médica los que sirven de huéspedes a larvas de diferentes helmintos. Muchos géne-
pueden afectar a los hombres, actuar de vectores o causar alergias al polvo. ros de cangrejos son huéspedes intermedianos de diferentes especies de
Los hombres son con frecuencia infestados tanto por Demodex tolliculorum lombrices {Paragommus spp.) en todo el mundo. Los cefalópodos son zoo-
como por Demodex brevis. ácaros de los forúnculos, y Sarcoptes scabei. el plancton microscópicos que a veces sirven como huésped intermediario para
acaro de la sarna. Los ácaros del folículo son minúsculos (0,1 mm a 0,4 mm) los nematodos D. medinensis y Gnathostoma spinigerum y para los cestodos
y alargados, con patas achaparradas con las que se pueden asir de los folí- Diphyllobothrium y Spirometra.
culos del pelo y de las glándulas sebáceas (Lámina 55-18F). Suelen ser
hallazgos incidentales en las preparaciones histológicas cutáneas. Aunque
su presencia se ha asociado a varias condiciones cutáneas, son frecuente-
mente hallados en individuos sanos, lo que hace su trascendencia incierta
(Burns, 1992).
Sarcoptes scabieies el acaro de mayor importancia médica dada su capa-
cidad para crear túneles serpigmosos por la capa superior de la epidermis. Se
transmite por contacto personal y se puede encontrar principalmente en los
espacios interdigitales, la cara flexora de las muñecas y los antebrazos y,
menos frecuentemente, en otras zonas como las mamas, las nalgas y los
genitales externos. La inflamación y el prurito intenso son secundarios a la
creación de los túneles y la producción de excrementos y huevos. La clínica
varía según la sensibilización a los parásitos y a sus productos. Las lesiones
se sobreinlectan con frecuencia. La aparición de una dermatitis generalizada
debida a la existencia de miles de ácaros en ancianos o inmunosuprimidos se
conoce con el nombre de sarna noruega.
El diagnóstico se hace colocando los raspados cutáneos de áreas
afectadas en hidroxido potásico al 20% o en aceite mineral para su acla-
ramiento y su examen al microscopio. La detección de huevos, larvas de
seis patas o ninfas de ocho patas o adultos es diagnóstico, pero a veces
puede resultar difícil (Fig. 55-11: Lámina 55-18E). El diagnóstico de
sarna en una institución o en una escuela puede causar seudoepidemias,
en las que muchos desarrollan picores sin evidencia de enfermedad. Se
debe tener cuidado para diagnosticarlos adecuadamente, para diferenciar
los casos reales de las parasitosis psicógenas o ilusorias (Lynch. 1993;
Orkin. 1985).
Un número de ácaros animales pueden afectar a humanos para alimen-
tarse de sangre, tanto como larvas como por adultos, cuando no tienen
otros mamíferos o pájaros disponibles. Las larvas de las ninguas (familia
Trombiculidae) son un problema en muchas partes del mundo, ya que sus
salivas pueden causar grandes reacciones inflamatorias con gran prurito.
Estas larvas de seis patas, frecuentemente de color rojo, se unen a la piel
en zonas donde la ropa aprieta, como es en los tobillos, caderas y muñe-
cas o axilas. En áreas de Asia y Australia los ácaros Trombiculidae son
vectores del agente del tifus de la maleza (Lañe. 1993).
Ciertos ácaros no mordedores juegan un papel en la rinitis alérgica, asma
y ciertas lesiones cutáneas. Las secreciones, excrementos y partes del
cuerpo de Dermatophagoides larinae y de D. pteronyssinus son potentes Figura 55-11. Sarcoptes scabiei. Diagrama de un surco subcutáneo. (Ad = hembra
alérgenos que se dan en el ambiente doméstico (Frazier, 1980). Los test adulta; E = huevos; £e = huevos embrionados; Ex = excrementos; Es = cascara de
ordinarios realizados por un alergólogo pueden identificarles. nuevo: So • orificio de entrada.) (Atter Railliet fn Brumpt.)
1236 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 55-11 Infecciones parasitarias en huéspedes comprometidos

Anomalías
Infección Comentarios Referencias
predisponentes
Protozoos intestinales
Criptosporidiosis Sida (especialmente CD4 + Diarrea grave (mayor 17 litros/dia). Puede Winner y cois. (1993). Thielman
< 200/u.l). trasplantes y tener afectación extraintestinal incluidos yGuerranl(1998)
quimioterapia páncreas, tracto biliar y pulmones Terapia
limitada, no curativa
Isosporiasis Sida, trasplantes y quimioterapia Diarrea grave, afectación extraintestinal Wittner y cois. (1993), Thielman
(adenopatías). existe tratamiento disponible y Guerraní (1998)
Ciclospondiasis Sida, probablemente otra Diarrea grave similar a la criptospondioso Wittner y cois (1993), Thielman
inmunosupresión e isosporiasis. Respuesta al Trimetroprima yGuerrant(l998)
sulfametoxazol
Microsporidiosis Sida, probablemente otra Varios síndromes: Wittner y cois. (1993), Thielman
inmunosupresión grave 1. Enfermedad mullisistémica yGuerrant(1998)
2 Enteritis con diarrea grave (más frecuente)
3 Infección ocular
4. Síndrome hepatobiliar con granulomas,
necrosis hepática, colangilis
5. Enfermedad del músculo esquelético
El examen de sedimentos de orina con
una corréela tinción permite el
diagnóstico de síndrome extraintestinal y
algunos casos de enfermedad intestinal
Giardiasis Inmunodef¡ciencia común variable, Diarrea crónica, malabsorción. Sida no es Thielman y Guerraní (1998)
agammaglobulimemia ligada al una condición predisponente
cromosoma X
Protozoos
sanguíneos
y tisulares
Encefalitis Sida y otros estados de Habilualmente causada por el género de la Martinez y Visvesvara (1997)
granulomatosa inmunosupresión Acanthamoeba o Balamuthia. Causa
amebiana infección subaguda o crónica del sistema
nervioso central, pero puede ser aguda en
los huéspedes inmunodeprimidos con
diseminación
Toxoplasmosis Sida con CD4+ habitualmente Habitualmente especies o reactivación de McCabe y Chirurgi (1993)
< 100/(jl y otros estados de quistes de infecciones previas. Con
inmunosupresión, trasplantes frecuencia enfermedad diseminada con
cardiacos, donante seroposilivo afectación multiorgánica o lesiones del
y receptor seronegativo sistema nervioso central multifocal. Puede
causar neumonitis similar a la del
Pneumocystis carinii. Puede dar
coriorretinitis. Puede producirse tras
trasplantes de médula ósea. El trasplante
cardíaco de donante seropositivo y
receptor seronegativo puede dar una
toxoplasmosis fatal
Leishmaniasis Sida, otra inmunosupresión Limitada influencia de la leishmaniasis cutánea Herwaldt (1999)
Susceptibilidad a leishmaniasis visceral,
pero no aumenta la gravedad. Mayor
lacilidad de recaída tras el tratamiento

Tripanosomiasis Sida, linfoma linfoblástico, En sida, frecuentemente se afecta el sistema Markell y cois. 1999). Mileno
americana trasplantes nervioso central, el miocardio y la piel (1998)
(enfermedad cardíacos, otras
de Chagas) inmunosupresiones

Babesiosis Esplenectomia Habilualmente hay infección subclinica en Markell y cois. 1999). Mileno
los inmunocompetentes. Los (1998)
esplenectomizados suelen desarrollar
Helmintos enfermedad clínica que puede ser latal
Estrongiloidiasis Inmunosuprimidos por trasplantes Por automfección endógena; puede darse Markell y cois. (1999). Mileno
o quimioterapia, corticoïdes o hipennfección o inlección diseminada y (1998)
linloma, El sida noes el mayor presentarse como neumonía o
factor predisponente enfermedad iniestinal grave. Puede
aparecer sepsis por gramnegalivo o
meningitis con gramnegalivo por la
translocación bacteriana causadas por la
larva invasora. Se debe descartar esta
inlección antes del tratamiento
inmunosupresor en las áreas altamente
endémicas
Artrópodos
Sarna Neoplasias, inmunodeprimidos Deriva a una sarna noruega con afectación Markell y cois 1999). Mileno
por trasplantes, quimioterapia, general de la piel. A veces tiene gran (1998)
sida prurito. Los pacientes tienen muchos
ácaros y son muy contagiosos. Pobre
respuesta al tratamiento
 CAPÍTULO 55 • PARASITOLOGÍA MÉDICA
Pentastómidos. Los pentastómidos. o gusanos de la lengua, son ar-
trópodos que pierden las características morfológicas típicas. Los adultos
son como gusanos que viven en las fosas nasales de ciertos reptiles, pája-
ros y mamíferos. Las larvas se parecen a ácaros y residen en roedores,
herbívoros y peces de agua dulce. Se han descrito inlecciones hepáticas y
pulmonares en el hombre tanto en Asia como en África. Se han hallado
adultos en la nasofaringe de personas en Oriente Medio y África, donde
causan una rinopatía obstructiva conocida como halzún (Beaver. 1984:
Strickland, 1999).
INFECCIONES PARASITARIAS Y HUÉSPEDES
INMUNOSUPRIMIDOS
Los huéspedes inmunosuprimidos padecen anomalías en su sistema
inmune humoral o celular secundario a enfermedad, tratamiento o causa
congenita. La malnutrición grave también puede comprometer a las defen-
sas. En la mayoría de los casos suelen deberse a alteraciones celulares
(células T) secundarias a sida, neoplasias, quimioterapia, trasplantes, cor-
ticoides o a la combinación de varias de ellas. Para la giardiasis, el factor
predisponente es el defecto inmune humoral, y para la babesiosis es la es-
plenectomia.
Con la pandemia del VIH y el sida especialmente grave, en países subde-
sarrollados con alta incidencia de parásitos como la malaria, esquistosomia-
sis, ascariasis. amebiasis y filariasis, es una suerte que estas infecciones no
causen especial gravedad en pacientes con sida.
Algunas enfermedades parasitarias, como las causadas por Cryptospori-
dium. Toxoplasma y Slrongyloides. son más graves en inmunosuprimidos,
pero hay diferencias. Por ejemplo, mientras que la infección por Cryptospori-
dium y por Toxoplasma son particularmente problemáticas en personas con
sida, la infección por Slrongyloides no lo es, pero es un problema en los
receptores de trasplantes y en los que reciben quimioterapia,
La Tabla 55-11 recoge las infecciones parasitarias más graves y/o más fre-
cuentes en los inmunosuprimidos. Las manifestaciones clínicas pueden ser
distintas de las de la población normal, como se cita en dicha sección.
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 CAPÍTULO
Patología molecular
de enfermedades infecciosas
Martin G. Cormican, M.D., Ph.D.
Michael A. Pfaller, M.D
APLICACIONES DE MÉTODOS MOLECULARES
EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA 1241
Detección de patógenos sin amplificación de diana
Pruebas de ADN para identificación de cultivos
Amplificación del ADN para diagnóstico
Epidemiología molecular
En la pasada década, las técnicas de biología molecular han contribuido
enormemente para que podamos entender la patogenia y epidemiología de
las enfermedades infecciosas. Como las técnicas se han vuelto más accesi-
bles y refinadas, las que se ocupan del diagnóstico y tratamiento de la in-
fección humana han buscado dirigir el desafío de adaptar estos métodos
para resolver los problemas clínicos habituales, esto es, para el diagnóstico
de la enfermedad, para orientar el tratamiento y para el control infeccioso y
epidemiológico hospitalario La patología molecular representa, cada vez
más, una parte del servicio diagnóstico que una diversión esotérica para
entusiastas. Como las técnicas moleculares se han vuelto sistemáticas, las
preguntas del coste y potencial para contribuir al cuidado del paciente nece-
sitan ser dirigidas en cada caso. En cuanto al valor del método, está en fun-
ción del grado en que facilita el trato con los problemas clínicos, no de la ele-
gancia de la técnica. Por tanto, el diagnóstico molecular es el más apropiado
para agentes infecciosos que son difíciles de detectar, o para identificar o
determinar la sensibilidad antimicrobiana en un tiempo rápido, comparado
con métodos convencionales. Los principios de la biología molecular relacio-
nados con el diagnóstico de laboratorio se comentan con detalle en los Capí-
tulos 58, 59. 63. 66 y 68.
El diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas tiene una gran base
de ácidos nucleicos y necesita el aislamiento de ácidos nucleicos de los
microorganismos y material clínico, y el uso de enzimas endonucleasas de
restricción, electroforesis en gel y técnicas de hibridación de ácidos nucleicos.
Cada vez más se están utilizando técnicas más modernas para amplificación
de ácidos nucleicos para material clínico. El análisis de la secuencia de ácido
desoxirribonucleico (ADN) se ha ido automatizando. Aunque por el momento
no es de uso general en el laboratorio, el análisis secuencial proporciona el
último resultado de los organismos caracterizados, y cuando se acompaña
con técnicas de amplificación, nos ha dado las directrices con las que hemos
podido identificar a los microorganismos que no han podido cultivarse y que
antes eran desconocidos en enfermedades infecciosas (Amann, 1994; Wil-
son, 1994). La tecnología del trozo del gen también parece ofrecer un poten-
cial considerable en el futuro para la caracterización de microorganismos en
el laboratorio clínico.
Una consideración importante en la aplicación general de las técnicas
moleculares es el coste. En el área de diagnóstico de enfermedades in-
fecciosas, la mejoría del paciente y la reducción del coste de los antibióticos
pueden hacer pesar más que el aumento de los costes del laboratorio. En la
actualidad no se han demostrado esos ahorros en muchas aplicaciones diag-
nósticas de métodos moleculares. En el caso de enfermedades transmisibles.
56
ESTANDARIZACIÓN, CONTROL DE CALIDAD
Y VALORACIÓN DE LA COMPETENCIA
DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR 1250
BIBLIOGRAFÍA 1251
el coste puede estar justificado por una mejoría de las medidas de control
para la infección para proteger a los pacientes y cuidar la salud de los traba-
jadores. La epidemiología molecular puede hacer una verdadera contribución
a la detección y control de la extensión de la infección, con capacidad para
reducir los porcentajes de infección nosocomial y la petición de antibióticos
caros utilizados para tratar organismos resistentes En este punto, sin embar-
go, la mayoría de la justificación del gasto en diagnóstico molecular y epide-
miología es especulativo: sin embargo, los costes del equipamiento, reactivos
y expertos son sustanciales, y el director del laboratorio debe también consi-
derar las cuestiones económicas (Kant, 1995).
El nivel de inversión justificada debe determinarse en una institución dada,
y en algunos casos usar el servicio de laboratorio de referencia puede pre-
sentarse como la opción más eficaz.
APLICACIONES DE MÉTODOS MOLECULARES
EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
El uso de métodos moleculares para la identificación y detección directa de
los microorganismos en la microbiología clínica se está desarrollando gra-
dualmente y ya hay varios productos disponibles comercialmente (Tablas 56-1
a 56-3). Los usos prácticos incluyen el uso de pruebas de ácidos nucleicos
para una detección directa de organismos en el material clínico o para la iden-
tificación de organismos previamente aislados. Además, las técnicas basadas
en la amplificación pueden utilizarse para la detección e identificación y para
definir características selectas (p. ej., genes resistentes a los antibióticos) de
organismos. Finalmente, los métodos moleculares proporcionan un gran sig-
nificado de caracterización de organismos, asi como a nivel de subespecies.
en investigaciones epidemiológicas.
Detección de patógenos sin amplificación de diana
La detección de microorganismos patogénicos por la prueba del ADN, direc-
tamente a partir de muestras, ha sido ampliamente investigado usando una
variedad de formatos de hibridación y generadores de señales. El desarrollo
de productos comerciales se ha focalizado en el diagnóstico directo de enfer-
medades transmitidas por vía sexual y patógenos respiratorios utilizando
pruebas de hibridación fase solución y pruebas etiquetadas con éster acridi-
na (Tabla 56-1).
 1242 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 56-1 P r u e b a s d e A D N para la detección de p a t ó g e n o s *

Organismo Formato de h i b r i d a c i ó n Sistema informador Estado

Virus del papiloma humano Fase solución Hibridación ADN/ARN y quimioluminiscencia Comercial'
Slot blot con digoxigenina Comunicado
Virus del herpes simple Fase solución Hibridación Comercial'
1
Citomegalovirus Fase solución Hibridación Comercial
Virus de la hepalitis B Fase sólida Cadena ramificada de ADN Comercial''
Placa microtiter
Chlamydia trachomatis Fase solución Ester acridina Comercial*'
Neisseria gonnorrhoea Fase solución Ester acridina Comercial"
VIH Fase sólida Cadena ramificada de ADN Comercial''
Placa microtiter
1
Virus de la hepatitis C Fase sólida Cadena ramificada de ADN Comercial'
Placa microtiter
'La tabla contiene ejemplos de métodos disponibles y no pretende ser exhaustiva. Las páginas web de los principales labricantes son una fuente útil paia una
mloimacion actualizada
Oigene. Silver Spring. MD
:
Murex/Abbol. Abbott Park, IL.
''Chiron. Emeryville, CA
"Gen-Probe, Irte., San Diego. CA.

Un diagnóstico directo por una prueba de hibridación es rápido y está libre en pruebas diagnósticas fue posible al principio por pruebas de ADN. Una
de los problemas de contaminación asociados con la amplificación de dianas variedad de todas las pruebas genómicas y pruebas de oligonucleotides para
y es menos susceptible a la inhibición que otros muchos procedimientos de los tipos más comunes de HPV (p. ej.. tipos 16 y 18 comúnmente asociados
amplificación. Una limitación de la prueba de hibridación estándar es el reque- con carcinoma uterino cervical y los tipos 6 y 11 asociados con enfermedad
rimiento para detectar 10' o más copias. Para algunas aplicaciones, se debe benigna) han sido descritas y se han utilizado tanto el titulaje isotópico como
valorar un método rápido, conveniente, y que no se base en el cultivo con este el no isotópico (Faulkner-Jones, 1993; Lorinez, 1992; Ángel, 1992). Los for-
nivel de sensibilidad, y las estrategias de señales de amplificación pueden matos Southern blot y ranura/punto blot también se han investigado para el
detectar números tan bajos como 500 genes/ul (Shan, 1994; Murphy, 1999). diagnóstico de toxoplasmosis cerebral y malaria falciparum entre otros, pero
Incluso los formatos de amplificación de señales más sofisticados no parecen aún no han sido utilizados en los laboratorios diagnósticos.
mejorar la sensibilidad analítica de los métodos basados en la amplificación Los sistemas comerciales han utilizado la hibndación de fase solución con un
de dianas, que pueden detectar menos de 50 copias de genes/ml (Erali. titulaie no isotópico. Aquellos que no utilizan señal de amplificación serán con-
1999). La gran sensibilidad de los ensayos de amplificación parece ser la ven- siderados en primer lugar. Los productos titulados con éster acridina PACE 2
laja en ensayos de calidad; sin embargo, la tecnología de pruebas sensibles (Gen-Probe) con una detección quimioluminiscente son quizá los más utiliza-
se está utilizando para muchos ensayos. dos. Otras técnicas para la aproximación diagnóstica son los sistemas de ensa-
En enfermedades infecciosas, la prueba de hibridación basada en la mem- yo de captura de híbridos (HCA) (Digene y Murex). Tanto el Gen- Probe como
brana (Southern blot, ranura/punto blot) parece improbable que sea una los ensayos de captura de híbridos usan un titulaje con prueba no radiactiva
herramienta significativa en el diagnóstico del laboratorio en un futuro. El for- que permite una larga vida. Además, el formato es relativamente sencillo y
mato basado en la membrana es quizás el más aplicable para el análisis de puede utilizarse para un número pequeño o grande de muestras.
un gran número de muestras asi como para buscar aplicaciones. La clasifi- Las pruebas Gen-Probe (titulación con éster acridina) para la detección de la
cación del virus del papiloma humano (HPV) y la detección segura del HPV Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae están disponibles comercial-
mente. Se puede utilizar una muestra clínica para detectar ambos patógenos.
El proceso entero se realiza en un único tubo, y la señal quimioluminiscenle se
Tabla 56-2 P r u e b a s c o m e r c i a l e s d e A D N para la identificación lee en un luminómetro y se interpreta relativamente para un control positivo o
de cultivos* negativo. La liabilidad del equipo Gen-Probe para detectar C. trachomatis en
Formato Sistema muestras clínicas se ha evaluado en luncion del cultivo celular y métodos inmu-
Organismo de h i b r i d a c i ó n informador nológicos. Al igual que los métodos inmunológicos, pero a diferencia del cultivo,
el método no depende de la viabilidad de los patógenos. En un estudio compa-
Mycobacterium tuberculosis En solución Ester acridina
rativo reciente, el método Gen-Probe era más sensible que el enzimoinmuno-
Mycobacterium avium-intracellulare En solución Ésler acridina
ensayo Chlamydiazima (EIA). pero menos sensible que un ensayo comercial de
Mycobacterium gordonae En solución Ester acridina
amplificación de dianas (AMP-CT, Gen-Probe) (Wylie. 1998). El ensayo Gen-
Mycobacterium kansasii En solución Ester acridina
Probe para N. gonorrhoeae se ha evaluado en un número de estudios que
Histoplasma capsulatum En solución Ester acridina
recientemente han sido revisados con exhaustividad (Koumans. 1998). Los
Coccidioides immitis En solución Ester acridina
supervisores dicen que el ensayo puede ser más útil en situaciones donde la
Blastomyces dermatitidis En solución Ésler acridina
optimización del cultivo es difícil. Un punto significativo adicional es el requeri-
Cryptococcus neoformans En solución Ester acridina
miento continuo de cultivo para propósitos médico-legales.
Neisseria gonnorrhoeae En solución Ester acridina
Staphylococcus aureus En solución Ester acridina Los HCA para detectar el HPV. el virus del herpes simple (VHS) y el citome-
Streptococcus pneumoniae En solución Ester acridma galovirus (CMV) ya han sido descritos. Los ensayos HCA se han descrito como
Escherichia coli En solución Ester acridina más sensibles que los cultivos para detectar tanto el VHS como el CMV. Unas
Haemophilus influenzae En solución Ester acridina modificaciones recientes del ensayo HPV están dirigidas a mejorar la sensibili-
Especies de Enterococcus En solución Ester acridma dad. El sistema HC es. sin embargo, menos sensible que la amplificación de
Streptococcus agalactiae En solución Ester acridina ácidos nucleicos (Barret-Muir. 1958: Cope. 1997: Cullen. 1997: Poljiak. 1999).

'Las pruebas recogidas han sido desarrolladas por Gen-Probe Inc . San Die- |
go. CA La tabla contiene ejemplos de las pruebas descrilas sin pretender sei
exhaustiva. Las páginas web de los principales fabricantes son una fuente útil
para una información actualizada.
Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas (Chiron) y Q|3 replicasa (Ge-
ne-Trak) (Shan, 1994) representan test de estrategias diagnósticas que incor-
poran una amplificación de señal. Las pruebas de ADN de cadenas ramifica-
J das se han desarrollado para la detección y cuantificación del virus de la
 CAPÍTULO 56 • PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS 1243

Tabla 56-3 S i s t e m a s diagnósticos comerciales d e amplificación tivo por hibridación no depende de la capacidad para detectar cantidades
de ácidos nucleicos* pequeñas de ácidos nucleicos. La ventaja de la identificación basada en la
prueba sobre métodos no moleculares es mejor para organismos de creci-
Técnica Detección
Organismo de a m p l i f i c a c i ó n de la a m p l i f i c a c i ó n
miento lento, como las micobacteñas u organismos para los que no hay sis-
temas de identificación disponibles en el mercado. En este punto, la identi-
Virus de la hepatitis C Transcnplasa Prueba de captura
ficación por hibridación es relativamente cara, porque en muchos sitios los
inversa y PCR microtltulo'
NASBA Prueba del
aislamientos para identificarlos se hacen de manera individual y hay que
oligonucleótido suieto hacer un gran número de controles para cada aislamiento clínico. En este
al abalorio magnético 1
capítulo se comentarán algunas de las pruebas descritas o disponibles en
VIH PCR y transcriptasa Prueba de captura el mercado.
1
inversa microtltulo La identificación de las micobacteñas cultivadas por un método conven-
NASBA Prueba del cional es lenta, tarda mucho tiempo. Las pruebas de titulación con éster
oligonucleótido sujeto acridina para el complejo Mycobacterium tuberculosis complex. Mycobac-
1
ai abalorio magnético terium avium-intracellulare. M. gordonae y M. kansasii están comercial-
Cilomegalovirus PCR Prueba de captura mente disponibles (Gen-Probe. San Diego, CA). El uso de estas pruebas
microtitulo' permite la identificación del cultivo en un día de trabajo, y la especificidad
NASBA Prueba del y sensibilidad son excelentes (99% y 95,5%, respectivamente) (Goto.
oligonucleótido suieto
1
1991: Walton, 1991; Richter. 1999). En algunas ocasiones, alguna variedad
al abalorio magnético
de M. tuberculosis puede no reaccionar con la prueba del complejo M. tu-
Mycobacterium PCR Prueba de captura
berculosis, y parece que hay subespecies de M. kansasii que no reaccio-
tuberculosis microtltulo'
nan con la prueba M. kansasii(Badak, 1999; Niemann, 1999).
SDA Prueba de captura
microwell' Los métodos de identificación del cultivo de Histoplasma capsulatum.
TMA Prueba do éster acridina"' Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Cryptococcus neolormans
Captura de anticuerpos
también están disponibles (Stockman. 1993). Las evaluaciones indican que
LCR
del producto etiquetado 1 la especificidad es del 100% y la sensibilidad del 97% o más para todas las
Chlamydia PCR Prueba de captura
especies excepto para B. dermatitidis (87.8%) Al repetir el test, la sensibi-
trachomatis microtltulo' lidad aumentó al 97.3% para B. dermatitidis y el 100% para otras especies.
LCR Captura de anticuerpos El sistema Gen-Probe N. gonorrhoeae se ha utilizado para la identificación
de producto etiquetado 1
de cultivos N. gonorrhoeae, además del uso para su aplicación directa en es-
NASBA Prueba del oligonucleótido pecímenes clínicos (AccuProbe) se compara favorablemente con un sistema
suieto al abalorio comercial de utilización rápida de carbohidratos (Quadferm. bioMérieux) y un
1
magnético sistema de coaglutinación (Phadeback Monoclone GC test) para identificación
TMA Prueba del éster acridina" de N. gonorrhoeae cultivadas. Las pruebas de ADN tituladas con éster acridi-
Neisscria PCR Prueba de captura na son válidas para la identificación de cultivos de Staphylococcus aureus.
gonnorrhoeae microtitulo' Streptococcus pneumoniae. Escherichia coli. Haemophilus influenzae, Ente-
LCR Captura de anticuerpos rococus spp., Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes. Estas
1
de producto etiquetado | pruebas se han utilizado para identificar organismos cosechados en los botes
"La tabla contiene eiemplos de las pruebas descritas, sin pretender ser de hemocultivo que hayan sido positivos por centrifugación (Davis, 1991). La
exhaustiva Las paginas web de los principales fabricantes son una luente útil identificación se realiza en treinta minutos y es sencilla.
para una información actualizada
'Roche. Indianapolis. IN
'Organon Teknika. Durham NC
^Becton Dickinson Cockeysville. MD Amplificación del ADN para diagnóstico
"Gen-Probe, Inc.. San Diego. CA
"Abbott. Abbotl Park. IL La amplificación de ácidos nucleicos tiene el potencial para superar la prin-
PCR: Reacción en cadena de la pohmerasa: NASSA amplificación basada en I
la hebra de ácido nucleico. SAD amplificación por desplazamiento de hebra: ! cipal limitación de la hibridación ampliando selectivamente las dianas especí-
TMA amplificación mediada por transcripción; LCR: reacción en cadena de la | ficas que están presentes en concentraciones bajas para niveles detectables.
ligasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Sistemas Moleculares Roche)
fue la primera técnica de amplificación desarrollada y permanece como el méto-
do más conocido y empleado. Nuevas tecnologías de amplificación, la reacción
en cadena de la ligasa (LCR. Laboratorios Abbott), la amplificación de hebras
hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB) (Urdea. 1991; Heerman, de ácidos nucleicos (NASBA, Organon Teknika), la amplificación por despla-
1999). el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Murphy 1999) y para la zamiento de la hebra (SDA. Becton y Dickinson) y la amplificación mediada por
detección del gen mecA. asociado con resistencia a la oxacilina en estafilo- transcripción (TMA. Gen-Probe) forman las bases de los sistemas de diagnós-
cocos (Kolbert, 1998). Este ensayo de hibridación se presenta en un forma- tico adicionales que están disponibles en la actualidad. El desarrollo de los pro-
to similar al del inmunoensayo de enzimas. La prueba para hibridación de ductos comercializados se ha centrado principalmente en sistemas para
dianas se da en una solución, y después se captura el híbrido para el micro- detectar infecciones virales especificas (virus de la hepatitis C. virus de la
título por una prueba adicional unido al microtitulo. El límite de detección de hepatitis B, CMV, VIH), en los agentes principales de las enfermedades de
ácidos nucleicos diana no es tan bajo como el conseguido con la amplifica- transmisión sexual (N. gonorrhoeae y C. trachomatis) y en el complejo M.
ción de la diana (Lunel, 1999; Yen-üeberman, 1996; Zaaijer, 1994). Los resul- tuberculosis. Los productos comerciales se diseñan con vista a que el usua-
tados cuantitativos en un rango alto de concentraciones de dianas pueden rio los acepte, prevenir la contaminación, estandarización de reactivos y
ser útiles para detectar la carga viral, el pronóstico y monitorizar la respues- potenciales condiciones de reconversión. No está claro a qué nivel las dife-
ta al tratamiento en muchas infecciones virales (Heerman, 1999; Yen-Lieber- rencias son significativas entre los niveles de delección logrados utilizando
man.1996; Lunel, 1999). diferentes estrategias de amplificación. Se ha informado de un número de
estudios comparando dos o más métodos de amplificación para patógenos
particulares (Brown. 1999; Griffith. 1997; Schepetiuk, 1997: Slary. 1998) y. en
Pruebas de ADN para identificación de cultivos general, ninguno de los nuevos métodos ha demostrado un nivel de sensibi-
lidad mayor que la PCR. Los factores para elegir entre los sistemas pueden
Las pruebas de ADN tienen unas reglas establecidas para la identifica-
incluir el porcentaje de productos disponibles, el coste y la conveniencia de
ción de cultivos de microorganismos (Tabla 56-2). La identificación del cul-
 1244 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
que pueda hacer en laboratorios individuales. Probablemente es más prácti-
co para un laboratorio elegir un sistema de amplificación sencillo que les pue-
da proporcionar todos los test que ellos piden. En la Tabla 56-3 se resumen
algunos de los patógenos que han recibido mayor atención, y los métodos de
amplificación que se han utilizado. El número de sistemas diagnósticos dis-
ponibles está constantemente aumentando, y las páginas web de algunos de
los principales fabricantes dan información útil y actualizada de los productos
disponibles o en desarrollo.
En la actualidad, los métodos moleculares tienen una regla establecida
para el diagnóstico clínico y la dirección de un número de ¡nlecciones virales,
y puede volverse también valioso en el screening de donaciones de sangre
(Roth, 1999). En el caso de algunos patógenos bacterianos, la evaluación de
la regla de los métodos moleculares relacionados con el cultivo o métodos
inmunológicos puede ser difícil de valorar. En la mayoría de los estudios hay
un numero de muestras que son positivas para los test de ensayos basados
en la amplificación, pero negativas por métodos inmunológicos o de cultivo.
La clasificación de los resultados de estos test son falsos positivos por ampli-
ficación o falsos negativos por cultivo/detección de antígeno, tienen implica-
ciones importantes para los propósitos de calcular la sensibilidad y especifici-
dad de los ensayos basados en la amplificación y en juzgar los méritos
relacionados con las diferentes actitudes para el diagnóstico de laboratorio.
Muchos investigadores han intentado tratar el problema utilizando la técnica
de análisis diferentes. El valor y limitaciones de los análisis diferentes crea
controversias: los que la proponen la consideran como la actitud disponible
más práctica (Schachter. 1998). mientras que los que se oponen creen que el
proceso tiende a predisponer resultados a favor de los ensayos basados en
la amplificación (Hadgu, 1996; Miller, 1998).
Una dificultad adicional en la toma de decisiones concerniente al papel de
ciertos ensayos, basados en la amplificación, en el laboratorio clínico debe
expresar las reservas en una revisión, considerando la calidad de muchos
estudios publicados (Koumans, 1998).
Diagnóstico de infección viral
La identilicación del VHC ha sido posible gracias a las técnicas de biolo-
gía molecular: por tanto, no es sorprendente que la PCR y otros métodos
moleculares tengan un papel importante en su diagnóstico. La serologia nos
permite detectar una infección previa por VHC, pero no permite diferenciar
entre la infección actual y una curación espontánea. Como el VHC es un
ARN-virus, la transcripción inversa en cADN es un paso preliminar necesa-
rio para la amplilicación por PCR. Ya se han descrito una variedad de
reacciones PCR utilizando la transcnptasa inversa y la ADN-polimerasa. El
mercado de Roche Diagnostic comercializa un producto (Amplicor RT-PCR)
en el que la transcriptasa inversa y la amplilicación se realizan por la misma
enzima, la de Tth del Thermus thermophilus. y este proceso ha sido auto-
matizado (COBAS Amplicor System) (Poljak. 1997). La detección del virus
por métodos moleculares confirma la infección reciente y tiene establecida
una regla en el diagnóstico clínico de la infección por VHC y en una res-
puesta monitorizada para el tratamiento.
Para el diagnóstico de infección por VIH se detectan anticuerpos específi-
cos para el virus con un test serológico, y como la acreditación espontánea
del VIH no es anticipada, generalmente se acepta la detección de estos anti-
cuerpos inequívocamente como una evidencia de infección actual. En el caso
de recién nacidos, la detección de anticuerpos puede reflejar una transferen-
cia transplacentaria de anticuerpos maternos, y se requiere un período pro-
longado de seguimiento (mas de 18 meses) para confirmar la infección sólo
por métodos serologicos. La detección de virus por métodos moleculares tie-
ne una regla para resolver el estado de esos niños y también para dirigir a
esos pacientes de quienes el suero es, en repetidas ocasiones, indetermina-
do en los test serologicos. El VIH existe en la sangre como ARN-virus y como
ADN-proviral incorporado en el genoma de células mononucleares de sangre
periférica. La transcriptasa inversa no es necesaria para detectar el ADN-pro-
viral, pero se necesita para la detección o cuantificación de ARN-VIH libre. Se
ha publicado que el ensayo Amplicor Monitor es más sensible que el A DNra-
mificado o el NASBA para la detección del VIH (Bootman. 1999). y niveles de
detección tan bajos como 20 copias de ARN-VIH/ml de plasma pueden con-
seguirse mediante el uso de protocolos de extracción específicos para el ARN
(Fischer, 1999).
La PCR también ha sido ampliamente estudiada para el diagnóstico de la
infección por CMV en pacientes trasplantados, y se ha descrito un sistema
comercial para la delección de CMV por PCR (Long. 1998). Los problemas
del diagnóstico de enfermedad por CMV difieren del VHC y del VIH en que el
virus es ubicuo, y por tanto su detección en sangre por cualquier método no
confirma la enfermedad clínica per se. El desafio en el diagnóstico de CMV
ha sido distinguir a los pacientes inmunocomprometidos que tienen o van a
desarrollar la enfermedad relacionada con el CMV de aquellos en los que la
infección por CMV no es clínicamente signilicativa. Por estas razones, el CMV
estaba entre los primeros virus en los que la cuantificación del virus por la
PCR fue investigada (Gema, 1994). Más recientemente, la detección del
ARN-mensajero CMV. que representa la evidencia de una transcripción activa
del genoma viral, ha sido utilizada para detectar la enfermedad por CMV y
valorar las respuestas al tratamiento con informes micialmente favorables
(Aono. 1998).
La cuantificación de los virus por métodos moleculares ha sido reconocida
ahora como de importancia significativa en relación con VHC, VIH y VHB y,
posiblemente, también con aquellos como el virus Epstein-Barr asociado con
enfermedad linfoproliferativa En test de PCR cuantitativos, una cantidad co-
nocida de una diana alterada por PCR o unas series de concentraciones
conocidas de dianas alteradas se añaden a las reacciones de PCR que con-
tienen dianas de ADN nativo a partir de una muestra de un paciente. Las can-
tidades relativas generadas a partir del nativo y una diana alterada o un patrón
interno reflejan las cantidades relativas generadas en el sustrato de amplifi-
cación, y esto permite su cuantificación. El sistema de detección del genera-
do se debe diferenciar de los originados del nativo y de la secuencia alterada
del patrón estándar. Esto puede acompañarse por el uso del microtitulo wells
que contengan tanto una prueba especifica para el tipo nativo como una prue-
ba especifica de diana modificada.
Una aproximación más actual de la PCR cuantitativa es la tecnología
Taqman. que explota la actividad de la exonucleasa 3 -5 de la enzima poli-
merasa (Kimura. 1999). En adición a los primeros, la mezcla de la reacción
contiene una prueba interna que se degrada durante el primer paso de
extensión de cada ciclo de PCR La degradación de la prueba interna causa un
aumento de la señal fluorescente en la mezcla amplificada. La señal fluo-
rescente puede monilonzarse continuamente a través del proceso de ampli-
ficación, y la intensidad de la señal en relación con el número de ciclos de
amplificación realizados es en función del nivel de templados presentes al
principio. Esta aproximación puede proporcionar una cuantificación más
exacta sobre un rango más amplio de concentración inicial de dianas que la
PCR cuantitativa convencional, en la que la concentración del generado se
determina en un punto del tiempo determinado en un número definido de
ciclos.
La cuantificación del VHC puede ser importante en el pronóstico y monitori-
zación del tratamiento, y una vanedad de sistemas para la cuantificación del
VHC están disponibles o han sido descritos. Los más estudiados han sido qui-
zá los métodos RT-PCR (Roche, Monitor) y el ADN-ramilicado (Chiron, Quan-
tiplex) (Hawkins, 1997; Jacob, 1997: Lu, 1998); sin embargo, el NASBA (Orga-
non) y la tecnología PCR cuantitativa nueva (Roche Taqman) se han descrito
más recientemente (Lunel. 1999; Martel. 1999). La variedad de sistemas y el
desarrollo crean los estatus definitivos acerca de los valores de la dificultad de
los diferentes sistemas. Algunos asuntos importantes para tener en considera-
ción son el registro dinámico de los sistemas disponibles (el registro de con-
centraciones de genomas virales dentro del cual el método es más exacto y
reproducible). la variación en la capacidad para detectar y cuantificar los dife-
rentes genotipos virales VHC y las dificultades del desarrollo de un patrón ade-
cuado para la calibración.
La cuantificación del virus VIH se utiliza mucho para el pronóstico y eva-
luación de la respuesta al tratamiento de la elevada actividad antirretroviral
(HAART) (Ledergerber. 1999). Los acercamientos técnicos y los problemas
asociados con la cuantificación de ARN-VIH son por ío general parecidos a
esos que hemos comentado antes para el VHC (Erali. 1999; Triques. 1999).
También se ha publicado una aproximación alternativa interesante para la cuan-
tilicación del VIH basada en la medición de la actividad enzimática de la trans-
criptasa inversa en el plasma (García-Lerma. 1998).
La PCR ha sido estudiada y/o utilizada para el diagnóstico de una variedad
de otras infecciones virales, incluidas la infección por enterovirus (Pozo, 1998:
 CAPÍTULO 56 • PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Rotbart. 1994). VHS (Tremblay. 1997), virus JC (García de Viedma. 1999) y
parvovirus (Jordán. 1998). Los mélodos basados en la amplificación pueden
llegar a aumentar su importancia en el diagnóstico y tratamiento de la in-
fección viral, como parece que aumenta el número de infecciones virales
inlluidas por agentes antivirales específicos y, particularmente, en situaciones
criticas, como en la infección del sistema nervioso central (Read. 1997).
Detección de patógenos bacterianos
En estos últimos años se han evaluado un gran número de ensayos de
amplificación para la detección del M tuberculosis complex (MTBC) en
muestras respiratorias y no respiratorias. En general, la sensibilidad de estos
ensayos es excelente (del 95% al 100%) para muestras en las que la exten-
sión para bacilos ácido-resistentes (BAAR) es positiva, pero es más baja
para muestras donde la extensión es negativa (con frecuencia del 50% al
80%) (leven, 1997; Piersimoni, 1998; Pfyfler, 1999; Tortoli, 1999), En méto-
dos de PCR que utilizan varios métodos para la preparación de las mues-
tras y dianas para amplificación, se asocian con falta de estandarización,
como lo ilustra Noordhoek (1994), que encontró grandes variaciones en la
capacidad de los laboratorios para detectar MTCB en muestras ciegas y
para informar las muestras negativas correctamente. Para los laboratorios
clinicos, los problemas de una estandarización pobre parecen reducirse por
el uso de ensayos comerciales con un control central de la calidad de los
reactivos y los procedimientos operantes. En general, los ensayos de ampli-
ficación de ácidos nucleicos para la detección de MTBC son más sensibles
que las extensiones BAAR, pero menos sensibles que el cultivo. En la
actualidad, los ensayos comerciales están aprobados por la Food and Drug
Administration (FDA) sólo para los test de las extensiones BAAR positivas
en muestras respiratorias. Aunque un número de estudios han comparado
dos o más métodos basados en la amplificación (Brown, 1999; Piersimoni.
1998; Tortoli. 1998). ninguno de los estudios hasta el momento ha sido lo
suficientemente exhaustivo como para lograr sacar una conclusión firme.
El cultivo conserva su papel central en el diagnóstico de la tuberculosis
porque los ensayos de amplificación existentes no detectan todas las mues-
tras positivas para cultivo, y es necesario aislar el organismo para un test
de sensibilidad (y su tipificación epidemiológica, si estuviese indicada). Los
métodos de amplificación son altamente específicos en distinguir MTBC de
otras micobacteñas que MTBC (MOTT) en muestras BAAR de extensiones
positivas, esto nos permite iniciar un tratamiento adecuado y un control de
la infección. En la actualidad, los test de amplificación no pueden sustituir la
extensión BAAR, porque el último se utiliza para determinar el nivel de
mfectividad de los pacientes (los pacientes con una extensión positiva son
mucho más infecciosos que los de extensión negativa) y para juzgar la res-
puesta inicial al tratamiento. No hay un contexto similar en el que interpre-
tar los métodos basados en la amplificación. Además, los métodos de ampli-
ficación responden una pregunta mucho más específica (¿está el MTBC
presente'') que la extensión (¿están presentes BAAR?). En la actualidad, el
papel de los ensayos de amplificación se complementa con los de micros-
copio y cultivo.
La amplificación de ácidos nucleicos también se ha aplicado para otros pató-
genos bacterianos del tracto respiratorio. Legionella pneumophila es un
patógeno enrevesado para el que un diagnóstico rápido puede ser de una
gran importancia. El sistema Legionella EnviroAmp (Perkin Elmer) puede tener
aplicaciones para una detección rápida de Legionella es muestras óronco-
alveolares (Weir. 1998). De modo similar. Bordetella perlussis, Chlamydia
pneumoniae y Mycoplasma pneumomae presentan dificultades particulares
para el diagnostico de laboratono, que tiene que ser dirigido por PCR (Farrell.
1999; Grondahl. 1999: leven, 1997). Pueden ser prometedores para el futuro
múltiples ensayos de PCR capaces de detectar y discriminar entre un gran
número de patógenos respiratorios potenciales (virales y bacterianos)
(Grondahl, 1999).
El diagnóstico de las enfermedades de transmisión sexual también ha
sido un área importante para el desarrollo de los ensayos de amplificación.
N. gonorrhoeae crece rápidamente en una agar convencional apropiado, y el
cultivo tiene una alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones óptimas
(Koumans. 1998). N. gonorrhoeae es difícil de detectar, sin embargo, una
adecuada recogida y transporte y condiciones de cultivo son criticas y puede
que no sea fácil realizarlas en cualquier lugar. El cultivo de C. trachomalis
1245
también es exigente, ya que requiere facilidades para el cultivo de tejidos, por
tanto, los métodos que no son de cultivo para la detección del anlígeno de
Chlamydia han sido muy utilizados durante vanos años. Casi lodos los
métodos de amplificación se han descrito o desarrollado para la detección de
C. trachomatis (Morre, 1998: Pasternack, 1999: Schepetiuk, 1997, Stary, 1998;
Vincelette. 1999), En general, las evaluaciones publicadas indican que los méto-
dos basados en la amplificación son específicos y más sensibles que el cultivo
celular o los métodos inmunológicos (Schepetiuk. 1997: Stary. 1998; Vince-
lette. 1999; Wyiie. 1998). En un estudio multicéntrico reciente del automatiza-
do test COBAS Amplicor CT/NG (Roche), la sensibilidad y especificidad varia-
ban con el tipo de muestra (Vincelette. 1999). Para muestras uretrales de
hombres, se publicó una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,5%:
para muestras endocervicales la sensibilidad era del 96.5% y la especifici-
dad del 99,4%. y para la orina, la sensibilidad variaba del 94,4% al 95,1% y
la especificidad del 99.8% al 100%. La realización de ensayos de amplifica-
ción de las muestras de orina puede facilitar el screening para la infección
del C. trachomatis. La remisión de muestras de orina parecen ser más acep-
tables que los métodos de recogida de muestras más invasivos. Se han
publicado comparaciones de diferentes métodos de amplitícación (Paster-
nack. 1999: Schepetiuk, 1997; Stary, 1998), pero en la actualidad no hay sufi-
cientes datos para determinar los méritos de cada uno de los diferentes sis-
temas. Ambos, tanto la PCR como el LCR. pueden también utilizarse para
detectar N. gonorrhoeae: hay que examinar una sola muestra para ambos
patógenos, y está disponible un ensayo PCR múltiple para la detección,
tanto del patógeno N. gonorrhoeae como de C. trachomatis (Vincelette.
1999). El LCR ha sido publicado como más sensible que el cultivo (Kehl. 1998).
y puede tener posibilidades para ser aplicado en muestras de orina en el scre-
ening para N. gonorrhoeae en poblaciones de bajo riesgo (Kacena, 1998). Las
limitaciones de algunos estudios de ensayos de amplificación para la detección
de N. gonorrhoeae se han resumido (Koumans. 1998). y esto, junto con la posi-
bilidad de resultados falsos positivos con el Amplicor PCR con Neisseria sub-
flava, enfaliza la necesidad del refinamiento de estas nuevas tecnologías
(Farrel, 1999).
Aunque los patógenos específicos que causan infección de los tractos
respiratorio y urogenital han recibido mucha atención, los ensayos de PCR
tienen también su utilidad. Se han descrito ensayos de PCR que son tam-
bién capaces de amplificar los genes ribosomales rARN de prácticamente
cualquier bacteria y de un gran número de muestras clínicas Una rápida
secuencia de los productos amplificados y la comparación de la secuencia
de datos con las secuencias en una base de dalos ADN puede permitir la
identificación de una amplia variedad de organismos (Goldenberger, 1997:
Tang, 1998). Esta aproximación también ha sido útil en buscar publicacio-
nes para la detección e identificación de patógenos que antes eran desco-
nocidos o incultivables (Fredericks, 1996). El desarrollo de la tecnología de
trozo de gen puede aumentar el potencial de esta aproximación a la ampli-
ficación de un gen diana presente en todos los patógenos potenciales,
seguido de una caracterización rápida del producto amplificado por hibri-
dación entre un margen amplio de pruebas específicas de las especies
(Belgrader, 1998: Marshall, 1998).
Detección de hongos
La infección fúngica invasiva es un problema creciente en muchos países
(Pfaller, 1994). Candida spp. están entre las causas que encabezan la infección
nosocomial del torrente sanguíneo en EE.UU., y la aspergillosis es una cau-
sa significativa de mortalidad en pacientes trasplantados y otros pacientes
inmunocomprometidos La infección fungica sislémica es diticil de diagnosti-
car a tiempo y puede que esto contribuya a una mortalidad elevada. La PCR
ha sido estudiada para su posible uso en el diagnóstico de candidemia (Boug-
noux. 1999) y aspergillosis invasiva (Latge, 1999), y recientemente se ha des-
crito un test de PCR con una amplia especificidad para una variedad de pató-
genos fúngicos (Van Burik, 1998). La aplicación clínica de la PCR para el
diagnóstico de aspergillosis pulmonar invasiva es complicada por una alta
frecuencia de muestras de lavados broncoalveolares positivos (BAL) de suje-
tos sanos, debido a la presencia transitoria de conidias en el tracto respirato-
rio. Es preferible utilizar el suero del plasma, dado que es menos probable la
contaminación con conidias. Se ha publicado recientemente que un test de
PCR progresivo puede ser más sensible que la delección de galactosa por el
 1246 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
análisis de immunoabsorción enzimálica (ELISA) para el diagnóstico precoz
de la Aspergillosis invasiva (Kawamura, 1999). Como las bacterias, la combi-
nación de un amplio espectro de PCR para amplificar un producto de todos o
de la mayor parte de los hongos asociados con infección humana es una
estrategia potencialmente importante (Van Burik, 1998). La amplilicación podría
seguirse de una hibridación del producto amplificado para una serie de espe-
cies. En la actualidad, aunque parece que se van a publicar artículos prome-
ledores. la PCR para el diagnóstico de infección lúngica invasiva no se ha uti-
lizado mucho y no ha sido convincente que pueda compensar las limitaciones
del cultivo en un diagnóstico rápido de infección fúngica invasiva en huéspe-
des inmunocomprometidos.
Detección de parásitos
En los laboratorios clínicos, el diagnóstico de infecciones con muchos
parásitos protozoos depende de las heces vistas al microscopio, de una
extensión de sangre o de médula osea, o de tejido. La detección del anti-
geno en las heces en el caso de la Giardia lamblia y Cryptosporidium par-
vum es una alternativa. El examen microscópico de las muestras implica
dedicarle mucho tiempo, requiere una gran habilidad y tiene una sensibili-
dad limitada para muestras que tengan pocos microorganismos. Por estas
razones, la PCR puede mejorar la detección de parásitos protozoos en los
laboratorios clínicos. En un estudio, el ensayo PCR amplificando la subu-
nidad pequeña rARN de Plasmodium fue más sensible que el examen
microscópico de un frotis grueso de sangre durante veinte minutos realiza-
do por microscopistas entrenados en diagnosticar la malaria falciparum y
para monitorizar la respuesta al tratamiento (Cicerón. 1999). Se han obte-
nido resultados alentadores también para la delección de Babesia spp. en
sangre y parásitos de Leishmania en sangre y médula ósea (Katakura.
1998; Krause, 1996). La detección en el líquido amniótico del ADN de
Toxoplasma gondii puede facilitar un diagnóstico rápido para la toxoplas-
mosis congenita (Gratzl. 1998). y se ha usado en el líquido cefalorraquídeo
(LCR) para el diagnóstico de toxoplasmosis cerebral. También se ha des-
crito su uso para detectar Entamoeba histolytica. Cryptosporidium parvum
y Microsporidium (Haque, 1998; Morgan, 1998). Los sistemas de amplifi-
cación comerciales para detectar protozoos aún no están disponibles, así
como otros patógenos han superado la calidad de la PCR para la detección
de 7! gondii (Pelloux, 1998).
Identificación de cultivos
La sensibilidad de métodos basados en la amplificación facilita su aplica-
ción para una detección directa de genomas de patógenos específicos en
material clínico, pero también son valiosos para la identificación de microbios
cultivados. Una reacción de amplificación específica para las especies puede
identificar especies sencillas de particular importancia, como MTBC. De modo
alternativo, una reacción de amplificación puede destinarse a una diana de un
género especifico o una diana 'universal" y restringir la digestión mediante
endonucleasa o hibridación con múltiples pruebas, o puede utilizarse una deter-
minación secuencial del generado para identificar y discriminar entre una
variedad de especies. Inicialmente se utilizaba la identificación de cultivos por
amplificación para micobacterias de crecimiento lento, pero también tiene
aplicaciones para otros patógenos inusuales. Es lógico y conveniente para un
laboratorio utilizar la amplificación para una detección directa para usar la
misma tecnología para la identificación de cultivos donde sea posible.
La amplificación de especies especificas se ha utilizado para una identifica-
ción rápida de M. tuberculosis. M. avium y M. intracellular cultivados (Ninet,
1999: Tortoli, 1998). La aplicación de esta aproximación a viales BACTEC posi-
tivos con un índice de crecimiento bajo puede reducir dos o tres días el tiem-
po para la confirmación de una diana de todos los miembros del género Myco-
bacterium, y la generación de patrones específicos para las especies mediante
la digestión del generado con endonucleasas de restricción es un método alter-
nativo que puede discriminar entre más de 30 especies de micobacterias
(Devallois, 1997). Recientemente se han publicado múltiples pruebas de PCR
para una diferenciación entre MTBC. M. avium y otras micobacterias (Cormi-
can, 1995; Kulski, 1995). También se han utilizado múltiples PCR para una
confirmación rápida de toxigenicidad en los hallazgos de E. coli citotóxico
(Patón, 1988). La amplificación y la determinación secuencial de una región
527-bp de la región 16S rARN con análisis de ordenador pueden servir para
identificar bacilos gramnegativos aeróbicos inusuales, y pueden tener también
más aplicaciones (Tang. 1998). Se ha hecho énfasis en la necesidad critica de
generar y completar bases de datos genéticas para asegurar la asignación
apropiada de las especies basada en la secuencia del gen 16S rARN, (Frede-
ricks, 1996; Tang. 1998). El potencial para la identificación de organismos
mediante el uso de textos universales para obtener un generado seguido por
un uso rápido de una extensa serie de especies, o incluso pruebas especificas
de subespecies para definir las especies'subespecies. puede aumentar mucho
mediante el desarrollo de la tecnología de los genes (Troesch, 1999).
Detección de resistencia antibiótica
La resistencia a los agentes microbianos es uno de los principales proble-
mas de salud en esta década. Los métodos moleculares han contribuido sus-
tancialmente para que podamos entender la genética de la resistencia anti-
microbiana y la expansión de determinantes de la resistencia. También tienen
la posibilidad de contribuir a detectar pronto la resistencia en el marco clínico
(Tabla 56-4) (Bergeron. 1998). Los test convencionales estandarizados de
sensibilidad antibiótica dependen del crecimiento Inicialmente. se necesita un
cultivo puro del patógeno y, un día más como mínimo para el test de suscep-
tibilidad. Con métodos de test de sensibilidad automatizados, como Vitek, los
resultados pueden estar disponibles en unas horas para ciertos organismos.
Los métodos rápidos que dependen del crecimiento pueden ser menos apli-
cables para la detección de mecanismos de resistencia, en los que es nece-
sario un período de inducción en presencia de antibióticos antes de que se
manifieste la resistencia.
En el caso de resistencia meticilina/oxacilina en estafilococos, la resisten-
cia puede expresarse de varias maneras, particularmente en el estafilococo
coagulasa negativo (CNS), de modo que la resistencia antibiólica clínica-
mente relevante puede ser difícil de detectar por los test de sensibilidad
estandarizados, incluso después de 48 horas de incubación. Por todas estas
dificultades, la detección molecular del gen mecA está siendo cada vez más
aceptada como método de referencia entre los métodos fenotípicos que han
sido comparados. La PCR y, más recientemente, las pruebas de ADN ramifi-
cado han sido ampliamente investigadas para la aplicación para una detec-
ción rápida del estafilococo resistente a la meticilina (Kolbert, 1998; Marshall,
1997: Ramotar. 1998; Vannuffel, 1995).
En el caso de los patógenos de crecimiento lento, especialmente MTBC.
pueden pasar semanas entre el envío de las muestras y el informe final de la
sensibilidad microbiana. Este retraso no fue considerado un gran problema
durante años porque había disminuido la incidencia de tuberculosis y la resis-
tencia antibiótica era infrecuente. Los test de sensibilidad eran realizados
principalmente para confirmar la sensibilidad y para monitorizar la potencial
aparición de resistencias. Desde finales de los años 80, los consejos del tiem-
po de laboratorio en relación al tratamiento de tuberculosis se han vuelto más
esenciales por una sene de razones. Éstas incluyen el resurgimiento global
de la tuberculosis (incluso en países desarrollados), el surgimiento y la expan-
sión de la resistencia antibiótica para MTBC y la aparición de una población
no despreciable con el síndrome de mmunodeficienaa adquirida (sida), en la
que la tuberculosis puede progresar rápidamente hasta producir la muerte si
no se pone el tratamiento adecuado. La amplificación de PCR de las secuen-
cias de ADN del rpoB (resistente a la rifampicina) y los genes katG. mhA y
ahpC (resistente a isoniacida), seguidas por la detección de mutaciones aso-
ciadas con resistencia mediante el polimorfismo conformacional de la hebra
simple (SSCP). tiene una sensibilidad alta para la detección de resistencia a
la rifampicina (>96%) y la isoniacida (87%) (Telenti. 1997). Ha sido reciente-
mente publicado el uso de pruebas de ADN de alia densidad en combinación
con PCR para detectar mutaciones en el gen rpoB. Este método tiene la posi-
bilidad de detectar la resistencia a la rifampicina en pocas horas (Troesch,
1999) y podría, en principio, ser aplicado directamente a las muestras sin cul-
tivo previo. Un reconocimiento rápido de las cadenas de MTBC resistentes a
los antibióticos es importante para prevenir la expansión de la infección con
esas cadenas en pacientes susceptibles y personal sanitario.
Los métodos moleculares tienen también aplicaciones para la detección
de la resistencia a las medicinas en un gran espectro de organismos. Se ha
publicado la detección de resistencia a la vancomicina en enterneceos, neu-
mococos resistentes a la penicilina y en el gen b/a , |5-lactamasa del Hae-
;u
 CAPÍTULO 56 PATOLOGÌA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS 1247

Tabla 56-4 Detección d e los p r o b l e m a s d e resistencia a los antibióticos por m é t o d o s moleculares

Agente Gen Método de detección Organismos

Meticilina mecA" Prueba de ADN estándar Estafilococos
Oxacilina Prueba de ADN ramilicada
PCR
Vancomicma vanA. B. C. D' Prueba de ADN estándar Enterococos
PCR
Bela-lactámicos Prueba estándar Haemophilus influenzae
PCR y RFLP Enterobacteriaceae
PCR y secuencia N gonorrhoeae
Ouinolonas Mutaciones en gyrA. gyrB. parC y parE PCR y secuenciamiento Enterobacteriaceae y
cocos grampositivos
Rifampicina Mutaciones puntuales en rpoB PCR y SSCP Mycobacterium tuberculosis'
PCR y secuencia
trozo de ADN
PCR y
Isoniacida Mutaciones puntuales en katG, inhA, ahpC PCR y SSCP M tuberculosis^
Etambutol Mutaciones puntuales en embB PCR y secuencia M tuberculosis-
Estreptomicina Mutaciones puntuales en rpsL y rrs PCR y RFLP M tuberculosis'*
Aciclovir/lármacos relacionados Mutación/deleción en el gen TK" PCR y secuenciamiento Herpes virus"
Foscarnet Mutaciones puntuales en gen ADN-polimerasa PCR y secuenciamiento Herpes virus"
Mutaciones puntuales en el gel RT* PCR y secuenciamiento VIH
inhibidores transcriptasa inversa PCR y LIPA
-
Mutaciones puntuales en el gen PROT" PCR y secuenciamiento VIH'
Inhibidores proteasa
"El mecA codifica la proteina PBP2a' ligada a penicilina alterada, los métodos fenotipicos pueden requerir 48 horas de incubación o mas para detectar las resisten
cias y poseen una sensibilidad menor del 100%. La detección de mecA tiene una potencial aplicación clínica para circunstancias especificas
'La resistencia a vancomicina en enterococos puede ser descrita en uno de cada cualro genotipos de resistencia, de los cuales vanA y vanB son los de mayor impor-
tancia. La deteción genotipica de la resistencia es útil en la validación de los métodos lenotipicos.
!
La base genética de la resistencia a |i-lactámicos es extremadamente compleja. El bla y el bla son los dos grupos mas comunes de plásmidos codificados que
nu ¡tN

codifican la resistencia a las celalosporinas de tercera generación y a los monopenémicos.

•'Mycobacterium tuberculosis es un organismo de crecimiento muy lento Pueden ser necesarias cuatro o más semanas para lograr los resultados del test de sus-
ceptibilidad fenotípica La detección de los genes de resistencia en M. tuberculosis tiene potencial aplicación clinica a corlo plazo.
"TK: timidina cinasa
'No hay métodos fenolipicos suficientemente prácticos para la delección clinica sistemática de la resistencia a los antivirales. Los métodos genolipicos representan
un método práctico habitual para detección de resistencias antivirales
'RT transcriptasa inversa
•"PROT proteasa.
PCR reacción en cadena de la polimerasa; RFLP: polimorlismo en el Iragmento de restricción. SSCP: polimorfismo en la conlormacion de la hebra simple LIPA: ensa-
yo de la prueba lineal

mophilus inlluenzaeen el líquido cefalorraquídeo (Bergeron. 1998; Cockerill.
1999; Jones. 1997: O'Neill. 1999; Tenover. 1994). También está cobrando
importancia la detección de resistencia en los agentes antivirales desde que
la resistencia a los medicamentos se ha reconocido como una barrera signi-
ficativa para una quimioterapia efectiva de un número de infecciones virales.
La detección fenotípica de resistencia a medicamentos en el VIH es comple-
ja, requiere una gran dedicación de tiempo y, por tanto, es poco práctica para
propósitos clínicos. Las mutaciones especificas en el gen transcriptasa inver-
sa VIH-1 y el gen polimerasa se asocian con resistencia a los agentes
antirretrovirales y pueden detectarse por una gran variedad de métodos
moleculares. La detección de mulaciones en el genoma del VIH se relaciona
con la detección de resistencia por test lenotípicos (Tedder, 1998). Un ensa-
yo comercial, ensayo de la prueba lineal (LIPA), diseñado para detectar
mutaciones en seis codones importantes en el gen transcriptasa inversa,
asociadas con resistencia a los fármacos, se ha desarrollado en un intento
de facilitar una detección más rápida; sin embargo, su realización puede no
ser la adecuada para todas las mutaciones significativas (Puchhammaer-
Stockl, 1999). Como en muchas otras circunstancias, donde se necesita
hacer el screening de un gran número de mutaciones posible en el producto
amplificado, el conjunto de pruebas de alta densidad (trozos de gen) puede
ser útil en el futuro (Gunthard. 1998).
Los métodos moleculares no parecen ser los sustitutos para una detección
fenotípica de resistencia en la mayoría de las situaciones clínicas en un futu-
ro previsible. Estos métodos pueden aplicarse directamente para muestras
clínicas, y pueden, por tanto, ser apropiados para bacterias de crecimiento
lento, sobre lodo en situaciones clínicas urgentes, y para la detección de
resistencia en virus. Además, son aplicables a organismos no viables y pue-
den reducir los riesgos biológicos asociados con la manipulación de patóge-
nos viables, como M. tuberculosis. Los métodos moleculares también pueden
tener ventajas particulares en relación con los mecanismos de resistencia que
se expresan sólo después de un período de incubación largo, desde que los
métodos fenotípicos pueden no ser lo sulicientemente fiables a que no estén
a tiempo en tales casos.
Los métodos moleculares para la detección de resistencia antimicrobiana
están limitados en muchos aspectos (Bergeron, 1998). Primero, la ausencia de
un gen de resistencia conocido no excluye la posibilidad de resistencia por
otro mecanismo. En términos prácticos, la detección molecular se basa en
la detección de genes individuales bien caracterizados en especies o gene-
ros en los que se espera que se produzca. Los métodos moleculares no
detectan los mecanismos de aparición de nuevas resistencias, y no es pro-
bable que se apliquen para la detección de la expresión de genes resisten-
tes en especies en las que no se ha observado previamente. Una segunda
limitación es que la presencia de un gen para resistencia antimicrobiana no
obliga la expresión del fenotipo resistente. Por ejemplo. E. coli tiene un gen
cromosómico para una |i-lactamasa similar a AmpC. pero, casi nunca se
expresa. En principio esta limitación no es insalvable sí se utilizan preferen-
temente los ensayos para detectar mARN mejor que para detectar el gen
cromosómico. Dadas estas limitaciones, parece probable que por el
momento los métodos moleculares para detectar la resistencia antimicro-
biana se vayan a quedar como herramientas de laboratorios de referencia,
útiles en la monitorización a gran escala de los mecanismos de resistencia,
y como estudios de la realización de los métodos fenotípicos.
 1248 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 56-5 Métodos de epidemiología molecular*

Método Ejemplos Comentario
Polimorfismo de los fragmentos de restricción Mycobacterium tuberculosis
Enzimas cortantes frecuentes Enterococcus faecium Gran número de bandas
Staphylococcus aureus Ahora poco empleado
Clostridium difficile
Enzimas cortantes infrecuentes Staphylococcus aureus Escasas bandas
Stenotrophomonas mallophilia Electroforesis de pulso de campo
Candida albicans Aplicación muy amplia
Riboescritura Enterobacter cloacae Escasas bandas
Serratia marcescens Automatizado
Klebsiella pneumoniae
Prueba de hibridación de elementos repetitivos Mycobacterium tuberculosis Escasas bandas
Candida albicans Perfil basado en secuencias específicas
PCR y productos de electroforesis Enterobacter cloacae RAPD y otros
Acinetobacter baumanii Pequeña cantidad de ADN
Mycobacterium tuberculosis Puede bastar extracto crudo
PCR y productos de prueba de hibridación Mycobacterium tuberculosis Pequeña cantidad de ADN
Virus de la hepatitis C Puede bastar extracto crudo
PCR, digestión de productos y electroforesis Staphylococcus aureus Pequeña cantidad de ADN
Virus de la hepatitis C Puede bastar extracto crudo
PCR y productos de secuenciamiento Virus de la hepatitis C Pequeña cantidad de ADN
Puede bastar extracto crudo
PCR y polimorfismo conformacional de la hebra simple Virus de la hepatitis B Permite una detección de cambios de la secuencia
menor en un área especilica
Electroforesis de proteina en gel de poliacrilamida Clostridium difficile Ahora poco empleado
Staphylococcus aureus
Electroforesis de enzima multilocus Neisseria meningitidis Útil para la amplia definición de las relaciones
Entamoeba histolytica dentro de una especie
•La labia contiene eiemplos de métodos disponibles y aplicaciones y no pretende ser exhaustiva.
——__

Epidemiología molecular
La variedad de herramientas disponibles en la aclualidad de epidemiología
molecular es considerable (Tabla 56-5), y en particular ha existido una proli-
feración de métodos basados en la amplificación. Un análisis exhaustivo de
los méritos relativos de estos métodos de aproximación diagnóstica está más
allá del propósito de este capítulo. Es importante destacar que no hay una
técnica universalmente aplicable y que la opción de un uso particular depen-
de de las especies estudiadas, de aquello a lo que la petición hace referencia
y de la conveniencia de la técnica. Las técnicas moleculares son útiles para
responder preguntas de una clínica presente y para el control de infecciones,
y no están limitadas para usos de investigación. Los ejemplos incluyen clari-
ficar el significado de múltiples aislamientos de Staphylococcus epidermidis
de un paciente particular y predecir una respuesta para el interferon en la
infección por el virus de la hepatitis O La evidencia molecular de identifica-
ción del S. epidermidis realizada en diferentes momentos sugiere que el
hallazgo es clínicamente significativo, y los genotipos VHC 1a y 1b parece
menos probable que respondan al interferon que otros genotipos (Martinot-
Peignoux. 1998; Vandelli. 1999). Las técnicas moleculares también sirven de
ayuda para detectar la emergencia y extensión de las cepas de un organismo
con resistencias poco usuales a los fármacos usados, asi como la patogeni-
cidad para determinar la eficacia de los procedimientos de control de la in-
fección, y en la definición de la fuente de epidemias o infección debida a la
comida o productos terapéuticos.
Métodos de tipificación molecular ADN-dependientes
La bibliografía relativa a la tipificación molecular ADN-dependiente, y en
particular a la tipificación por amplificación, se ha convertido en un laberinto
de acrónimos y variaciones sutiles. Para poner algún orden en esta área, es
útil considerar dos aspectos de cada método: el método técnico (amplifica-
ción, restricción de enzimas, prueba o una mezcla de todas eHas) y el princi-
pio (una imagen del cromosoma o foco en secuencias que evolucionan rápi-
damente). Los métodos de tipificación basados en el ADN. se basan en la
divergencia progresiva que se produce en la secuencia de células bacteria-
nas idénticas sobre un gran número de generaciones de división celular.
Cuanto más parecida es la secuencia entre dos organismos aislados en
pacientes distintos, más probable es que lo se originó fuera de una fuente
común en el pasado. El grado de divergencia entre organismos puede adver-
tirse en la secuencia entera de los cromosomas. El grado de resolución más
alto para el método requeriría la secuencia de todos los cromosomas, pero
esto no es práctico. Por tanto, la mayoría de los métodos desarrollados inten-
tan identificar la variación de la secuencia en puntos distribuidos de manera
aleatoria por todo el cromosoma. Esta imagen es la base para el polimorfis-
mo en el fragmento de restricción (RFLP), electroforesis en gel por campo pul-
sado (PFGE), y la tipificación usando textos arbitrarios. La divergencia de la
secuencia no se produce igual en todos los puntos del cromosoma. Algunos
elementos específicos del cromosoma se alteran más rápidamente con res-
pecto a otra secuencia de nucleótidos, o con respecto al número de copias del
elemento y la distribución de las copias por lodo el cromosoma. Los ejemplos
de secuencias de rápido desarrollo, incluidas las secuencias de inserción (IS),
transposones (Tn), secuencias tándem repetidas e integrones (In). Un grupo
de métodos de tipificación ha empleado estas secuencias altamente variables
para estudiar la relación entre los microbios. Algunos métodos utilizan una
combinación de la digestión total del cromosoma seguida de una búsqueda de
secuencias repetidas. Algunas variables a tener en consideración para elegir
un método de tipificación para una aplicación particular son su reproducibili-
dad (tanto en el propio laboratorio como en otros laboratorios), capacidad dis-
enminativa, rapidez y relación beneficio-coste. Cada vez más, la inspección
visual y la evaluación cualitativa de los patrones de unión logrados por mu-
chos de estos métodos de tipificación están siendo complementadas por el
uso de análisis cuantitativos monitorizados. y están apareciendo estudios
de los métodos de análisis disponibles (Gener-Smidt, 1998; Olive, 1999). La
 CAPÍTULO 56 • PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
capacidad para Transferir rápidamente las imágenes dígitalizadas de patrones
de unión a un laboratorio central con la posibilidad de una comparación rápi-
da de cadenas, y la adaptación de consensos a la asignación de los tipos, es
lo deseable para aumentar la capacidad de estas técnicas para seguir la pis-
ta de la evolución y expansión de cadenas específicas a nivel nacional e
internacional. Las dificultades que hay que superar en los métodos de tipifi-
cación moleculares son considerables (Van Belkum, 1997).
El análisis estándar RFLP con enzimas cortantes frecuentes puede gene-
rar un gran número de bandas en el gel de electroforesis. El método ha sido
útil en la tipificación de una gran variedad de organismos. Por ejemplo, Bin-
gen (1991) utilizaba RFLP para demostrar que el Enterococcus faecium resis-
tente a la vancomicína aislado de un hospital francés no presentaba la exten-
sión de una cadena sencilla resistente. Por la complejidad de los patrones de
unión que hacen difícil el análisis, este método ha sido suplantado.
Una solución para la complejidad de los patrones es identificar y analizar sólo
un grupo que tenga una secuencia específica en múltiples copias en el geno-
ma. Esto se consigue por una trasferencia de bandas de ADN del gel de elec-
troforesis a una membrana (Southern blot) y la consiguiente aplicación de
pruebas de ADN a la membrana. La secuencia multicopia que generalmente
usamos es el gen ARN ribosómico. Este proceso, conocido como nbotipifica-
ción, ha sido utilizado para estudiar las relaciones entre cadenas de muchas
especies, y se han publicado estudios comparativos del valor del ribo-
tipificación en relación con los métodos de tipificación tradicionales para algu-
nas especies. Un sistema totalmente automatizado y un sistema rápido para
la realización de la ribotipilicación con una interpretación asistida por ordena-
dor (Ribopnnter. Quahcon. Wilmington. DE) está ahora comercialmente dis-
ponible. El Ribopnnter ha sido presentado para ser más discriminatorio que la
PCR para Salmonella entérica (Hilton, 1998); sin embargo, comparando el
Ríboprinter con la PFGE para la tipificación de E. coli y Pseudomonas aeru-
ginosa. éste era menos discriminatorio que la PFGE (Pfaller. 1996). Se ha
sugerido que el Ribopnnter puede ser útil como una herramienta de tipifica-
ción de primera linea, pero que las cadenas que aparecen indistinguibles en
la ribotipificación pueden ser distinguidas en diferentes grupos en la PFGE.
De un modo similar se utilizan las pruebas que hibridan las secuencias mul-
ticopias diferentes de 16S rARN. Entre las aplicaciones mejor estudiadas está
el uso de una prueba para la secuencia de inserción IS6110 para el tipo
MTBC. Este método es relativamente lento y tiene un poder discriminatorio
limitado para las cadenas de MTBC con pocas copias de la secuencia IS6110
(Yuen, 1993). Está bien estandarizado y ha sido muy informativo para definir
la epidemiología de la tuberculosis (Bradford. 1998; van Embden, 1993). Más
recientemente se han descrito un número de diferentes métodos de tipifica-
ción para MTBC para suplementar o sustituir el IS6110. La comprobación de
las partes digeridas por RLPF con las secuencias ricas en GC polimórficas
multicopia (PGRS) puede ser utilizada para suplementar la tipificación IS6110
para cadenas con un número bajo de copias IS6110 (Bradford, 1998).
Un número adecuado de bandas para el análisis de la mayoría de los
organismos (de 10 a 20 bandas) también puede conseguirse por PFGE
(Allardet-Servent, 1989). PFGE utiliza la restricción de enzimas para cortar
el ADN en secuencias, lo que ocurre poco frecuentemente, produciendo un
número limitado de fragmentos de ADN grandes. Este método requiere que
las fuerzas que causan las roturas aleatorias en el cromosoma bacteriano se
eviten durante la preparación del ADN para la digestión. Esto se acompaña
de la inmersión de la bacteria en tapones de agar antes de la digestión de la
pared celular. También se debe emplear un sistema de electroforesis capaz
de separar los grandes fragmentos de ADN. La separación de los fragmen-
tos grandes es posible gracias a una alteración periódica de la dirección del
campo eléctrico utilizado en la cámara de electroforesis. La PFGE permite la
separación de cromosomas enteros, por lo que para las levaduras, que son
eucarióticas, debe generarse un cariotipo sin la digestión de la enzima de
restricción. La PFGE está considerada por algunos como el método más apli-
cable y el más aceptado para la tipificación molecular. Los principios para la
interpretación de los geles de PFGE han sido propuestos, y para muchos
organismos es el estándar de fado pata la tipificación molecular entre otros
métodos que han sido comparados (Tenover, 1993). Las limitaciones princi-
pales de PFGE son que es un método relativamente lento y costoso; sin
embargo, se ha avanzado al desarrollar protocolos rápidos de PFGE
(Matushek. 1996). La PFGE es aplicable al estudio de la epidemiología de
1249
muchos patógenos, incluido S. áureos resistente a la meticilina (van Bel-
kum, 1997), E faecium resistente a la vancomicína (Fridkin, 1998), Strepto-
coccus pneumoniae penicilin resistente a la penicilina (Rudolph, 1998).
Klebsiella pneumoniae productora de |í lactamasa de amplio espectro (Lin.
1998). E. CO//0157 (Grif. 1998). Stenotrophomonas maltophilia (Sader. 1994)
y especies Candida para las que se puede utilizar tanto el cariotipo como el
análisis RFLP (Cotmican. 1996).
La amplificación ADN por PCR se aplica para la tipificación molecular en
una variedad de modos. Una ventaja de las estrategias de tipificación utili-
zando PCR es que sólo se necesitan cantidades de ADN pequeñas. De
modo adicional, el ADN templado puede ser una preparación bastante ordi-
naria, que generalmente no es el caso de los sistemas digestivos de enzi-
mas de restricción. De modo más sencillo, las tipificaciones basadas en
PCR incluyen el uso de uno o varios principios genéricos que terminan en
la amplificación de varios fragmentos de varios tamaños. El número y tama-
ño de los fragmentos amplificados depende de la secuencia del genoma
microbiano, y se revela un patrón de unión especifico para el tipo de elec-
troforesis en gel (NiRiain, 1994). Este método de variaciones, con una titu-
lación aleatoria de la amplificación del ADN polimorfo (RAPD) o amplifica-
ción de la huella dactilar de ADN (DAF). tiene una gran aplicación para una
variedad de patógenos actuales, incluidos Enterobacter cloacae y Neisse-
riae meningitidis (NiRiain, 1994; Barí. 1998; Woods, 1994). La reproducibili-
dad de los patrones de unión utilizando textos genéricos puede ser proble-
mática. Las uniones débiles pueden aparecer y desaparecer fácilmente; sin
embargo, parece que algunos grupos han superado estas dificultades (Barí.
1998). Por lo general, estas técnicas puede que sean más aplicables a una
caracterización rápida y preliminar de un número pequeño de cadenas den-
tro de una institución sencilla.
También está surgiendo una variedad de aplicaciones de PCR para la tipi-
ficación de bacterias que usan la diversidad de secuencias repetitivas, como
el consenso intergénico repetitivo de enterobacterias (ERIC-PCR) y las
secuencias repetidas extragénicas palindrómicas (REPS). Estos empleos han
sido válidos para tipilicar Acinetobacter spp. y otras muchas especies gram-
negativas (Vila, 1996). La PCR también se ha utilizado en combinación con la
digestión de la endonucleasa de restricción de todo el ADN cromosómico
como polimorfismo amplificado de la longitud de los fragmentos (AFLP) tipifi-
cados. En esta técnica, se amplifica un subgrupo de los fragmentos generados
por una digestión de ADN cromosómico con frecuentes enzimas cortadoras.
En el caso de E. coli, la utilización de cebadores con titulaciones fluorescentes
necesita conocer el tamaño de lodos los fragmentos en un secuenciador
automatizado de ADN. y la disponibilidad de la secuencia completa del
genoma E. coli K-12 ha resultado ser un método muy sofisticado (Arnold.
1999). El conocimiento de la secuencia del genoma del Haemophilus influen-
zae cadena Rd ha sido explotado de un modo similar para desarrollar un
método de tipificación de PCR basado en el número variable de secuencias
en tándem repetidas (VNTR) (van Belkum, 1997). El test de tipificación de
MTBC es otro método que se asemeja bastante a la PCR. basada en la ampli-
ficación de las secuencias espadadoras no repetidas situadas entre las
pequeñas unidades repetidoras (Sola. 1998).
La PCR también se utiliza para amplificar zonas del genoma microbiano
que evolucionan rápidamente, de modo que la conexión puede valorarse
por una evaluación de los producios para una variación de la secuencia. Las
zonas diana incluyen las regiones de espacio entre genes para ARN ribo-
sómico en Aspergillus fumigatus y el gen coagulasa de S. aureus (Hookey.
1998: Radford. 1998). La variación de la secuencia puede verse por la eva-
luación de los patrones de unión producidos en la digestión del producto
amplificado con enzimas de restricción o secuenciación del producto de
PCR. Métodos de tipificación similares han servido para clasificar virus. La
tipificación del VHC es de particular interés, asi como un genotipo viral es
significativo para predecir una respuesta parecida al tratamienlo con inter-
lerón-«. La realización del genotipo del VHC se basa Irecuentemenle en la
detección de la variación de la secuencia en la región 5 conservada sin tra-
ducir del genoma por RFLP. hibridación para pruebas específicas del geno-
tipo (Line Probé Assay. Innogenetics). por secuenciación o por polimorfismo
de la longitud de los fragmentos (Davidson, 1995; Murphy. 1994; Seme,
1997: Sreevatsan, 1998: Stuyver, 1996). Se ha reconocido la posibilidad de
una clasificación errónea de algunas cadenas donde la distinción se basa
 1250 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
en una sola diferencia de los nucleólidos. y puede que sea necesaria la deter-
minación de la secuencia en la región central para algunos subtipos (Seme,
1998). La secuenciación directa del producto PCR obtenido con el equipo
Roche Amplicor ha sido publicada y puede ser un acercamiento coste-bene-
ficio para la determinación del genotipo VHC (Holland, 1998). Unos métodos
similares han entrado en vigor para tipificar VIH y otros virus (Peltola. 1998).
Los perfiles del plásmido se utilizan hoy día mucho menos que antes para
la tipificación molecular, aunque el estudio del resto del ADN del plasmado
es importante para definir la epidemiología de la difusión de los mecanismos
de resistencia antimicrobiana. El estudio de los perfiles del plásmido con-
juntamente con la tipificación basada en el ADN cromosómico ha revelado
que en algunos casos la propagación nosocomial de las resistencias anti-
microbianas puede reflejar la propagación simultánea de las resistencias
ocultas en un plásmido y su facilidad de difusión (Liu, 1998).
Tipificaciones moleculares no ADN-dependientes
Se han utilizado varios métodos de tipificación no basados en ácidos nu-
cleicos para estudios epidemiológicos. La electroforesis de proteínas en gel
de poliacrilamida (PAGE) se ha utilizado para muchas bacterias, pero ya no se
utiliza (Mulligan. 1988). La electroforesis enzimática multilocus (MLEE) se
basa en la movilidad electrotorética de un número de enzimas informativas.
Las variaciones en la movilidad de las enzimas es la base de la tipificación. La
MLEE es demandada técnicamente y puede verse como un modo de exa-
minar las relaciones entre organismos en una escala de tiempo de evolu-
ción más larga que la que se proporciona por una inspección visual de los
patrones de unión en muchos de los métodos de tipilicación basados en
ADN. El estudio de la motilidad electrotorética de las enzimas informativas
puede sustituirse por la determinación de la secuencia de los fragmentos
amplificados de los genes codificando las respectivas enzimas, una técnica
conocida como una secuencia tipificada multilocus (Vogel, 1998). Con el uso
de los análisis asistidos por ordenador de los patrones de unión obtenidos por
métodos de tipificación basados en el ADN o de una secuencia de datos de
ADN. se pueden definir los grados de relación durante una escala de un perio-
do de evolución grande de modo similar a MLEE (Arnold, 1999: Bart, 1998).
ESTANDARIZACIÓN. CONTROL DE CALIDAD
Y VALORACIÓN DE LA COMPETENCIA DE MÉTODOS
DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Como para todo diagnóstico, la calidad de los resultados comienza con el
acierto de la petición de la prueba y la calidad de la recogida de las mues-
tras y su transporte. El laboratorio deberá dar al médico las directrices para
saber qué muestras se pueden permitir, cómo recogerlas y cómo conser-
varlas, así como el tiempo necesario para ser remitida al laboratorio (véan-
se Caps. 1 y 57).
En el laboratorio, el primer escalón en la valoración de la calidad es la
adecuada validación de un test particular antes de su uso diagnóstico y.
cuando se emplee, se debe prestar mucha atención para mantener los
estándares de calidad. Estas directrices se han estipulado en recientes
publicaciones de la Association for Molecular Pathology (1999) y del Natio-
nal Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1995). Pueden
surgir problemas a diferentes niveles. El diseño de los test puede no ser
capaz de distinguir toda la diversidad genética de los taxones (clasificación
errónea del VHC subtipo 2c como 2b [Seme, 1987]) o bien solapar las
características con taxones conocidos (falsos positivos de MTBC en pacien-
tes con infección pulmonar por M. kansasiiy M. avium [Jorgensen. 1999]).
Los problemas en el diseño pueden no ser reconocidos y su realización
puede ser sobrestimada en las evaluaciones que no empleen adecuados
test de referencia (Koumans. 1998). Un reciente informe de la pobre con-
cordancia entre los laboratorios es el estudio de muestras ciegas para
MTBC y para VHC mediante PCR (Noordhoek. 1994; Zaaijerr. 1993). don-
de se sugieren problemas operacionales en el diagnóstico de laboratorio.
En un estudio más reciente. 4 de cada 15 laboratorios informaron de uno o
más falsos positivos en el diagnóstico de toxoplasmosis med'ante prueba de
PCR (Pelloux. 1998). y lo mismo pasaba con la detección de enterovirus
(Muir, 1999). El potencial de incrementar la concordancia entre los labora-
torios gracias a la estandarización de los reactantes y a los protocolos se
enfatiza en un informe para lograr una realización satisfactoria de la PCR
para Chlamydia trachomatis (Mahony, 1994) y el mayor empleo de los sis-
temas comerciales con reactivos estandarizados, asi como de los análisis
automatizados, pudiendo. en un futuro, reducir estos problemas.
La preparación de las muestras es un asunto critico en el que se busca un
equilibrio entre la simplicidad de la preparación (para lograr ser prácticos y
disminuir los riesgos de contaminación) y la profundidad (para asegurar la
liberación de los ácidos nucleicos y la eliminación de las sustancias inhibido-
res). Los controles se deben hacer para detectar la contaminación (p. ej.; el
examen por duplicado, controles negativos múltiples) y para monitorizar la
degradación de la diana o la existencia de inhibidores (control positivo en los
límites de detección, estándar interno para la amplificación). El número ade-
cuado de controles negativos es esencial y se deben llevar a cabo durante el
proceso de preparación de las muestras. Tan sólo una parte de una muestra
negativa es adecuada para este fin.
La selección de controles y normas es muy problemática cuando el agente
infeccioso diana es muy diverso (VIH y VHC) y cuando se requieren muchos
resultados. La complejidad de estos asuntos es evidente en publicaciones de
sistemas comerciales para la cuantilicacion de VHC en que pueden no detec-
tar los genotipos 2 y 3 de un modo tan eficiente como el genotipo 1 (Hawkins,
1997) y en las diferencias en la eficiencia de la hibridación de clones de virio-
nes derivados de ADN en ensayos para la cuantificación de ADN VHB (Heer-
man, 1999). Una evaluación detallada de parámetros que afectan el resultado
de los ensayos para la cuantificación ARN VIH está disponibles, y muchos de
los principios identificados son por lo general aplicables (Lew. 1998).
Para asegurarse de que ios reactivos son de una gran calidad y están libres
de contaminación, es conveniente comprar lampones preparados en otro
lugar. En este caso, el fabricante es el responsable de proporcionar los datos
de la calidad analítica de los reactivos. Una valoración de la calidad funcional
relativa a los lotes previos puede ser adecuada.
La contaminación es un problema considerable para los laboratorios que uti-
lizan PCR diagnósticas. Los estudios entre laboratorios han mostrado que
las muestras negativas pueden dar resultados positivos en algunos laborato-
rios, y la explicación más probable es el sobrediagnóstico de resultado. Cla-
ramente, las consecuencias sobre el cuidado de un paciente con un resultado
falso positivo para VHC. VIH o MTBC son importantes. El fundamento de la
prevención de este sobrediagnóstico en la mayoría de los laboratorios en este
punto es la separación física de la reacción PCR establecida y las zonas de
análisis del producto PCR con un flujo de trabajo estrictamente unidireccional.
La automatización de PCR puede también ayudar en la prevención de este
fenómeno (Wilke, 1995), y la mayoría de los fabricantes de equipos comerciales
de diagnóstico molecular han desarrollado, o están en proceso de desarrollo, sis-
temas automatizados o semiautomatizados para minimizar la posibilidad de un
error humano. Los resultados falsos positivos parecen ser poco frecuentes con
el uso de sistemas de test comerciales automatizados (Víncelette, 1999).
Además de la prevención del sobrediagnóstico, los métodos para prevenir
la amplificación de productos que contaminan la PCR están disponibles. Los
dos métodos principales son aquellos que utilizan isopsoralen para modificar
los resultados a un estado no amplificable, y la ADN uracilo-glucosilasa, para
degradar lo generado antes de la amplificación (Rys, 1993). En cualquiera de
los sistemas que se utilicen, debería determinarse el impacto de la técnica en
el límite de la detección de PCR. También es importante para demostrar la
electividad de la medida dar el coste añadido al procedimiento.
La comprobación funcional en cada uno de los lotes nuevos de enzimas es
una comprobación adecuada en la producción y el procedimiento de reparto.
Para la ADN pohmerasa, puede ser adecuada la comparación con un lote pre-
vio de enzimas utilizando pruebas en el límite de detección. Para la endonu-
cleasa de restricción se recomienda la digestión de ADN lambda. La reprodu-
cibilidad en muchas técnicas moleculares es muy dependiente de un control
preciso de la temperatura y del uso de un reactivo exacto. Lo primero y esen-
cial para asegurar la calidad es la adquisición de un instrumento de alta cali-
dad. Dos veces al año, o con más frecuencia, se recomienda la monitoriza-
ción de la temperatura y su correcta realización (Kopp, 1994). Las pipetas
deben calibrarse dos veces al año.
 CAPÍTULO 56 • PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
El servicio de calidad del laboratorio no termina con la generación del resulta-
do. El tiempo que tarda en darlo es un elemento esencial. Las guías para la
interpretación del resultado son particularmente importantes en relación a los
métodos nuevos, ya que los médicos pueden no estar familiarizados con las limi-
taciones de estos métodos. Las guias para la limitación apropiada del empleo
de los test son importantes por razones financieras, estando implicados los
asuntos de reembolso. Sólo recientemente la Health Care Financing Adminis-
tration (HCFA) ha asignado códigos de pago para la detección e identificación
de un número limitado de patógenos específicos [Health Care Financing Admi-
nistration. 1999) Además, no se sabe con certeza los test que serán reembol-
sados. Dada una realización previa, es improbable que el nivel de reembolso
cubra completamente los costes de los test en todas las circunstancias.
La participación en programas de test de competencia es. obviamente, un
aspecto importante y necesario para mantener la calidad de los servicios de
diagnóstico en el laboratorio de microbiología. Los test de competencia para
los métodos moleculares utilizados en la detección e identificación de agen-
tes infecciosos están solamente disponibles para unos pocos organismos.
El College of American Pathologists (CAP) proporciona modelos de test
para la prueba basada en ácidos nucleicos para la detección e identificación
de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (CAP Inspección HC5): identificación de
cultivos de micobacterias; y amplificación basada en la detección de una
variedad de organismos, incluidos VIH, VHC, CMV. MTBC y Borrelia burg-
dorferi (CAP Inspección ID).
La seguridad de la calidad en el diagnóstico molecular no es esencial-
mente diferente de los principios aplicados en otras áreas de patología clí-
nica. La atención a los detalles, los controles adecuados y un conocimiento
de los problemas potenciales, junto con una cuidadosa conservación, son
esenciales.
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 C A P Í T U L O
Manejo y recogida de
muestras para el diagnóstico
de las enfermedades infecciosas
• Goil L. Woods, M.D.
SANGRE 1255
FLUIDOS CORPORALES 1257
TEJIDOS 1260
OJO 1260
TRACTO RESPIRATORIO 1260
Las claves para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas son una
adecuada recogida y un adecuado manejo de las muestras. Las guias para la
recogida y transporte de muestras y el procedimiento se explican en este
capítulo. Los principios generales se revisarán primero, seguidos de la expli-
cación de los tipos más comunes de ejemplares encontrados en el laborato-
rio de microbiología.
Para una detección óptima de los patógenos responsables de la enfer-
medad infecciosa, las muestras deberían tomarse cuando la probabilidad de re-
coger el agente sospechoso sea mayor. Por ejemplo, la probabilidad de recoger
la mayoría de los virus es en la fase aguda de la enfermedad. Las muestras
para bacterias se deberían recoger antes de la toma de antibióticos.
El volumen de muestras recogido debe ser adecuado para el estudio
microbíológico solicitado. Si el volumen recibido es insuficiente, el médico o
enfermera de la sala deben informar, y se deberá sacar una muestra adicio-
nal o el médico debe priorizar las peticiones solicitadas. Si la muestra se
recoge con una torunda, la punta de poliéster vale para todos los microorga-
nismos. El alginato calcico debería evitarse para recoger muestras para el
cultivo de virus, porque podria inactivar el herpes simple, el algodón podría
ser tóxico para Neisseria gonorrhoeae y los depresores de madera deberían
evitarse porque la madera podría ser tóxica para Chlamydia trachomatis. Las
torundas no son adecuadas para la detección de anaerobios, micobacterias
u hongos, y su uso no debería permitirse cuando se sospechan estos micro-
organismos.
Las muestras deberían obtenerse del sitio de la infección sin que se con-
taminaran con otros tejidos adyacentes ni secreciones. Todas las muestras,
excepto las heces, deberían recogerse en un recipiente estéril y ser etique-
tadas con el nombre y el número de identificación de la persona a la que per-
tenece la muestra, la fuente de la muestra y la hora a la que fue recogida.
Después de recogidas, las muestras deben ponerse en una bolsa de resi-
duos biológicos y ser transportadas al laboratorio tan pronto como sea posi-
ble. Si el retraso es inevitable, la orina, el esputo y otras muestras respirato-
rias, heces y muestras para la detección de Chlamydia trachomatis o virus
deben ser puestas en el frigorífico para prevenir un crecimiento de la flora
normal. El líquido cefalorraquídeo (LCR) y otros fluidos corporales, la sangre
y muestras recogidas para determinar Neisseria gonorrohoeae deben dejarse
a temperatura ambiente, porque el frío afecta adversamente a la determina-
ción de patógenos potenciales en estas fuentes.
57
TRACTO URINARIO 1262
TRACTO GENITAL 1264
HECES 1266
PIEL Y LESIONES SUBCUTÁNEAS 1268
BIBLIOGRAFÍA 1269
Cada director de laboratorio debe establecer unos criterios para rechazar
muestras Inadecuadas para cultivo. La mayoría de los microbiólogos coinci-
den en que las siguientes muestras deberían ser rechazadas.
• Cualquier muestra recibida en formol.
• Esputos recogidos hace 24 horas.
• Muestras de contenedores en los que se ha derramado la muestra.
• Muestras que han sido inyectadas en placas de agar que se han secado o
están caducadas.
• Muestras contaminadas con bario, tintes químicos o agentes grasos.
• Muestras de sondas Foley.
• Muestras duplicadas (excepto hemocultivos) recibidas en un período de 24
horas.
Las siguientes muestras deberían ser rechazadas para el cultivo de anae-
robios: lavados gástricos, la orina de la mitad de la micción, heces (excepto
para determinar Clostridium difficile) para estudios epidemiológicos o para el
diagnóstico de la bacteria asociada a la intoxicación alimentaria (se explicará
posteriormente), muestras orofaríngeas. excepto las muestras obtenidas de te-
jidos profundos durante un procedimiento quirúrgico, esputos, muestras de
colostomía o ileostomía obtenidas con torunda y muestras superficiales de piel.
Además, deberían establecerse unas normas para el manejo de muestras
que no están etiquetadas o mal etiquetadas; dichas muestras no deberían ser
analizadas hasta que se hubieran resuelto las diferencias.
Con el manejo de todas las mueslras deben seguirse unas precauciones
universales. Esto significa que hay que usar barreras adecuadas para preve-
nir la exposición de piel y mucosas a las muestras. En todo momento deben
llevarse guantes, mascarillas y gafas (o trabajar detrás de una protección de
plástico), y deben llevarse trajes o delantales impermeables en situaciones
que haya riesgo de que se derrame el contenido. Lo deseable sería que todos
los recipientes para muestras, como minimo esos que contienen secreciones
respiratorias y los que se someten especialmente para la detección de una
micobacteria u hongo, se abrieran en una cabina de seguridad. Las muestras
recogidas para aislar un virus deberían ser manejadas en una cabina de
seguridad biológica para evitar la contaminación de los cultivos celulares.
Cuando las muestras o cultivos tienen que ser transportados a través del
servicio postal de EE.UU. a un laboratorio de referencia, deben ser empaque-
tados de acuerdo al código interestatal de transporte de agentes biológicos.
 CAPÍTULO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Las muestras deben estar limitadas a no más de 40 mi. Los cultivos de
bacterias y hongos deberían crecer en unos tubos en un medio sólido. El
cierre del recipiente primario (tubo o vial) debería ser sellado con una cinta
resistente al agua e introducido en un segundo contenedor (preferiblemen-
te metal) rodeado por una cantidad de material suficiente para absorber el
volumen total de la muestra por si el primer contenedor se rompiera o salie-
ra. El segundo contenedor debe ser cerrado y puesto en un recipiente para
transportar (hecho de cartón, fibra mecanizada o poliestireno), y etiquetado
con una etiqueta oficial de agentes etiológicos (disponible en los centros
para la prevención y control de enfermedades). Si una muestra debe ser
transportada en hielo seco (que está considerado como material de riesgo),
debe decir "Hielo seco, muestra clínica congelada". El hielo seco debería
ponerse luera del segundo recipiente con el material empaquetado, de
manera que el material no se pierda dentro del recipiente extemo si el hie-
lo seco se evapora.
SANGRE
La detección de patógenos en la sangre es una de las (unciones más
importantes del laboratorio de microbiología. El hemocultivo es imprescin-
dible para identificar la bacteria responsable de la bacteriemia, la sepsis,
las infecciones de válvulas nativas y protésicas, la tromboflebitis infeccio-
sa, los aneurismas fúngicos y las infecciones de injertos vasculares. Los
hemocultivos también son útiles en el diagnóstico de algunas infecciones
víricas e infecciones invasivas o diseminadas causadas por ciertos hongos,
especialmente especies de Candida. Cryptococcus neolormans. especies
de Fusarium e Histoplasma capsutalum. Los parásitos son detectados en
la sangre por un examen microscópico de frotis de sangre periférica. En gene-
ral, la sangre deberia ser recogida para cultivo antes de empezar el trata-
miento con antibióticos o cuando esté presente uno o una combinación de los
siguientes síntomas: fiebre (38"C o más), hipotermia (36"C o menos), leuco-
citosis (especialmente con desviación a la izquierda), granulocitopenia o
hipotensión.
El tiempo de detección y la identificación exacta de los organismos en la
sangre depende de una adecuada recogida, del transporte y del proceso de
la muestra. La técnica para detectar todos los microorganismos en la sangre
es la flebotomía. Para minimizar la contaminación de la muestra sanguínea
con la flora de la piel, el lugar de la venopunción deberia prepararse con un
agente bactericida (el 70% de isopropanol o alcohol etílico) y después con
1%-2% de solución yodada o clorhexidina. Para una asepsia mayor, el lugar
debería estar seco 1 ó 2 minutos antes de la venopunción Otros aspectos de
la recogida de muestras varían para bacterias, virus y parásitos.
Detección de bacterias y hongos. El momento óptimo para sacar los
hemocultivos cuando se sospecha una bacteriemia o funguemia es antes del
resfriado, pero como eso no se puede predecir, la mayoría de los hemoculti-
vos se recogen después de comenzar con fiebre o catarro. La sangre se
extrae con una aguja y una jeringa y, sin cambiar la aguja, se inyecta directa-
mente en los frascos de hemocultivo o en otro sistema de hemocultivo (Krum-
holz. 1990). Los frascos o tubos inyectados deben invertirse inmediatamente
varias veces para asegurar la mezcla, y ésta deberá transportarse al labora-
torio a temperatura ambiente lo antes posible después de haber sido recogi-
da. Los hemocultivos nunca deben ponerse en el frigorífico.
En adultos con bacteriemia, el número de unidades formadoras de colo-
nias (CFU) por mi de sangre generalmente es bajo. En un estudio, por ejem-
plo, el 25% de los pacientes con Staphilococcus aureus y más del 50% con
Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa tienen menos de una colonia
por mililitro de sangre (Henry. 1986). Dado este bajo nivel de bacteriemias en
adultos, es recomendable recoger de 20 mi a 30 mi de sangre para el hemo-
cultivo (Washington, 1986; llstrup, 1983). En recién nacidos y niños, la con-
centración de microorganismos en la sangre es mayor, por lo que con reco-
ger de 1 mi a 5 mi es suficiente (Dietzman, 1974).
Las recomendaciones relacionadas con el número de muestras que hay
que tomar están basadas en la naturaleza de la bacteriemia. dependiendo de
si es transitona, intermitente o continua. La bacteriemia transitoria sigue a un
proceso de manipulación de un foco de infección (un absceso, un forúnculo o
1255
celulitis), instrumentación de una superficie mucosa infectada (como ocurre
en procesos dentales, cistoscopías, sondaje vesical, aborto provocado o sig-
moidoscopia) o un procedimiento quirúrgico de una zona contaminada (como
resección transuretral de la próstata (RTU), histerectomía, resección de colon
y desbridamiento de quemaduras infectadas). La bacteriemia transitoria tam-
bién aparece al principio de muchas infecciones sistémicas y locales, como
meningitis, neumonía, artritis piógena y osteomielitis. La mayor parte de las
bacteriemías intermitentes se asocian con abscesos que no se han drenado,
mientras que una bactenemia continua es evidencia de una infección intravas-
cular, como endocarditis bacteriana, aneurisma fúngico. o un catéter intra-
vascular infectado. Una bacteriemia continua también se produce durante las
primeras semanas de una fiebre tifoidea y brucelosis.
Dos hemocultivos separados son casi siempre los adecuados para des-
cubrir los patógenos responsables de las infecciones intravasculares (Wer-
ner, 1967). En un estudio de personas con infección intravascular, los por-
centajes de positividad del primero, de los dos primeros y tres primeros
hemocultivos por episodio séptico eran del 80%. 90%. 99%. respectiva-
mente (Washington, 1975). Los datos de otro estudio mostraron que el 91%
de los episodios sépticos eran detectados en el primero hemocullivo, por-
centaje que aumentaba hasta el 99% con el segundo hemocultivo (Weins-
tein. 1983). Por tanto, tres hemocultivos en un período de 24 horas debe-
rían ser suficientes para detectar casi todas las bacterias potencialmente
patógenas. El intervalo adecuado entre hemocultivos es desconocido, pero
se ha sugerido que es de 30 a 60 minutos. Sin embargo, si es urgente el
comienzo del tratamiento con antibiótico, los hemocultivos deberían reco-
gerse de sitios diferentes con un intervalo de pocos minutos antes de empe-
zar el tratamiento.
Los organismos como el estafilococo coagulasa negativo. Streptococcus vi-
ridans. Corinebactenum. Bacillus spp. y Propiontbacterium son contaminantes
frecuentes de los hemocultivos, pero también podrían ser verdaderos pató-
genos. Recoger dos grupos de hemocultivos por episodio febril ayuda a dis-
tinguir probables patógenos de contaminantes. Los últimos, generalmente,
están presentes en un solo frasco del cultivo, mientras que los patógenos se
recogen en más de un frasco. Como puede haber más de un episodio febril
en un período de 24 horas y deben sacarse dos muestras de hemocultivo por
episodio, debería estar permitido un máximo de 4 muestras.
La mayoría de las muestras sanguíneas son extraídas por venopunción
periférica. La recogida de muestra arterial no parece que muestre mejor los
microorganismos, y el hemocultivo recogido a través de un catéter intravas-
cular se asocia con un aumento de supuestos contaminantes. Como con este
último método con frecuencia se necesitan más cultivos y tratamiento antibió-
tico innecesario, no se recomienda hacer la recogida de sangre para cultivos
de un catéter intravascular, excepto para catéteres umbilicales arteriales en
niños (Reller. 1982: Cowett. 1976). Sin embargo, varios cultivos recogidos de
un catéter intravascular podrían ser útiles para determinar si el catéter es el
foco de infección (Wmg. 1979).
Los factores del huésped tales como anticuerpos, complemento, células
blancas fagocíticas y agentes antimicrobianos podrían impedir el crecimiento
de los microorganismos en la sangre; por tanto, se han usado varios modos
de contrarrestar estos factores. Diluir la sangre en un medio en una propor-
ción 1:10 produce una adecuada neutralización de la actividad bactericida en
el suero (Washington, 1986). Incorpora de 0,025% a 0,05% de sodio pohane-
tolsulfonato en el medio del cultivo inhibe la coagulación, la fagocitosis y la
activación del complemento e inactiva los aminoglucósidos. Entre los méto-
dos que contrarrestan la presencia de agentes antimicrobianos se incluye
añadir penicilinasas al caldo para inactivar las penicilinas: usar resinas que se
adsorban a los antibióticos o usar el sistema de centrifugación para la lisis, por
el cual se produce la Nsis de las células blancas y rojas, los microorganismos
se concentran por medio de la centrifugación y la concentración se cultiva en
un medio libre de antibióticos.
Existen varios sistemas para analizar la sangre, cada uno con sus venta-
jas y desventajas (Wilson, 1996; Reimer, 1997). En los sistemas convencio-
nales para analizar los cultivos, que usan un medio liquido enriquecido con
nutrientes, se pueden cultivar la mayoría de las bacterias. Para recuperar
aerobios y anaerobios facultativos se utiliza soja triplica, peptona suplemen-
tada. infusión de cerebro-corazón. Columbia o caldo de brúcela y lioglucato
(THIOl o caldo de infusión de corazón anaerobio se usa para aislar anaero-
 1256 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
bios. Por lo general se inoculan dos frascos, y uno de ellos se abre para ase-
gurar el crecimiento de los aerobios. Dada la disminución de las bacteriemias
producidas por anaerobios, se está cuestionando la técnica de usar un Iras-
co para aerobios y otro para anaerobios (Murray, 1992: Sharp, 1991), La ino-
culación sistemática en dos frascos para aerobios y hacer cultivos selectivos
de anaerobios podría permitir la detección de más bacteriemias y fungue-
mias. Los frascos de cultivo se revisan diariamente durante 7 días para ver
si hay crecimiento, indicado bien por turbidez, hemolisis, producción de gas,
un número discreto de colonias o por la combinación de éstos. Cuando el
crecimiento es aparente, una extensión del cultivo se tiñe con una tinción de
Gram y se examina al microscopio, y el caldo es subcultivado en un medio
agar apropiado. Un subcultivo habitual de las muestras macroscópicamente
negativas debería ser realizado del frasco abierto, y de 6 a 18 horas después
de haber inyectado. Hacer un subcultivo del Irasco de anaerobios es inne-
cesario. Las ventajas de los cultivos convencionales son un coste más bajo
de material y un porcentaje menor de contaminación. El principal inconve-
niente es el tiempo que se utiliza en los subcultivos periódicos.
Un método menos laborioso consiste en una botella con medio de cultivo
al que se le añade una cámara que contiene un medio agar. Para subcultivar
este sistema bilásico hay que dar la vuelta al frasco varias veces, permitien-
do que la sangre y el medio agar se mezclen. Las colonias en el medio agar
se usan para identificar y hacer test de sensibilidad. Para cultivar aerobios,
bacterias resistentes y levaduras, este sistema es comparable a otros siste-
mas, siendo igual o mejor que ellos (Murray, 1991). Sin embargo, la rentabi-
lidad para anaerobios podría ser mayor que en los medios de cultivo con-
vencionales.
El sistema de lisis por centrilugación consiste en un tubo que contiene
reactantes que inhiben la coagulación y la cascada del complemento, pro-
duce la lisis de las células sanguíneas y tampona los microorganismos
durante la centrifugación. Se añade la sangre al tubo, que se invierte varias
veces para evitar la coagulación, y se transporta al laboratorio lo antes posi-
ble. Lo ideal es que la muestra se procese inmediatamente, pero puede ser
retrasada 8 horas sin efectos adversos para la recuperación de los microor-
ganismos. Para realizar el cultivo, el tubo es centrifugado durante 30 minu-
tos a 3.000 x g, el sobrenadante se desecha y el sedimento se mezcla en
una mezcladora colocándose en medio agar. También se puede hacer lo
mismo con los tubos más pequeños de menor volumen de muestras de
recién nacidos y niños. Las ventajas de la lisis por centrifugación incluyen
una recuperación mayor de Staphylococcus aureus, algunas enterobacte-
nas y hongos (es el mejor sistema para recolectar mohos, como el Histo-
plasma capsulatum), la disponibilidad directa de colonias para la identifica-
ción y el test de sensibilidad y la capacidad de llevar a cabo varios cultivos.
Además, este sistema es flexible porque se pueden inyectar medios de cul-
tivo especiales para recuperar organismos con unos requerimientos especí-
ficos de crecimiento, tales como especies para Legionelta y micobacterias.
Sin embargo, el sistema es muy laborioso y es menos probable encontrar
Streptococcus pneumonieae. Haemophilus influenzae o anaerobios y el
riesgo de contaminación aumenta.
Están disponibles en el mercado varios sistemas automáticos para tener la
sangre continuamente monitorizada (Wilson, 1996). La ventaja de estos sis-
temas es que eliminan la necesidad de hacer un subcultivo y acortan el perío-
do de incubación habitual de 7 a 5 días (Woods. 1994; Reisner, 1999). Uno
de estos sistemas está basado en el cambio de color ante la detección de CO,
(Thorpe, 1990), gracias a una membrana que es impermeable para la mayo-
ría de los iones y componentes del medio y de la sangre, pero permeable al
CO . Los frascos de aerobios y anaerobios con el inoculo se colocan en cel-
?
das en el aparato, proporcionándoles un movimiento continuo. Si hay bacte-
rias, éstas generan C0 que se libera en el medio; el pH entonces disminuye
2
haciendo que el sensor cambie de verde a amarillo. Los cambios de color se
monitorizan una vez cada 10 minutos por un detector del cambio de color. Los
medios disponibles para utilizar con este sistema incluyen los medios habi-
tuales de aerobios y anaerobios que necesitan de 5 mi a 10 mi de sangre, el
Pedi-BacT, que necesita 4 mi de sangre o menos, y FAN (neutralización cui-
dadosa de antibióticos), que intensifica el crecimiento de hongos y bacterias
en pacientes con tratamiento antibiótico.
Un segundo sistema de monitorízación continua se basa en una tecnolo-
gía de lluorescencia (Nolte, 1993). Hay un sensor de CO en la base de
?
cada vial que es impermeable para los iones, los componentes del medio y
la sangre, pero permeable para el C0 . Si hay organismos presentes, libe-
2
ran CO, en el medio, se difunde por la matriz del sensor y genera iones
:
hidrógeno. El consiguiente descenso del pH aumenta la fluorescencia del
sensor cambiando la señal transmitida a los componentes ópticos y electró-
nicos del aparato. El ordenador genera curvas de crecimiento y los datos se
analizan de acuerdo con unos algoritmos crecientes. Las botellas que han
sido inoculadas se ponen en celdas individuales del aparato, donde los fras-
cos de aerobios y anaerobios están continuamente en movimiento. Los
medios aerobios y anaerobios de poco volumen (de 5 mi a 7 mi de sangre)
y de gran volumen (8 mi o 10 mi de sangre), el medio Peds-Plus (de 0,5 mi
a 5 mi de sangre) y el medio Myco F Lytic son válidos para hallar hongos y
micobacterias (Waite. 1998).
Un tercer sistema detecta el crecimiento de los organismos en el caldo
midiendo el consumo y/o producción de gas (Zwadyx. 1994). Cada vial ino-
culado se ajusta con un conector desechable que contiene una aguja hue-
ca. La aguja penetra en el tapón de la botella y conecta el cuello de la bote-
lla con el sensor. Los monitores del sensor cambian dentro del cuello de la
botella por el consumo y/o producción de gases (CO „ H y H,) producidos
r }
por el crecimiento de organismos y crea unos datos dentro del ordenador.
Hay dos medios básicos disponibles (medio aeróbico y anaeróbico) que
contienen 80 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 10 mi de sangre, y frascos
aeróbicos y anaeróbicos EZ Draw que contienen 40 mi de caldo y alojan de
0.1 mi a 5 mi de sangre.
El hallazgo de algunas bacterias requiere un medio especial o una incu-
bación larga. Por ejemplo, cuando se sospecha brucelosis, la sangre debe-
ría sacarse al principio de la enfermedad y los hemocultivos deberían incu-
barse durante 3 ó 4 semanas, aunque con los sistemas automáticos la
Brucella con frecuencia crece en menos de una semana (Bannatyne. 1997).
Las infecciones producidas por Borrelia, excepto Borrelia burgdorferi (cau-
sante de la enfermedad de Lyme, más frecuentemente diagnosticada sero-
lógicamente), se diagnostican por la detección de espiroquetas en sangre
periférica durante un periodo febril. Los organismos se visualizan al micros-
copio de campo claro u oscuro en preparaciones en fresco mezclando una
gota de sangre con una gota de citrato sódico, o bien en frotis grueso o fino
teñidos con Giemsa o tinte de Wright examinados por un microscopio de luz.
Para aislar la Leptospira mterrogans en sangre, se debe añadir unas gotas
de sangre fresca o anticoagulada, recogida durante la primera semana de
la enfermedad, a cada uno de los 3 ó 4 tubos de medio de cultivo semisóli-
do de leptospiras (el medio de Fletcher o el de Ellinghausen-McCollough-
Johnson-Harris).
Podemos utilizar diferentes métodos para aislar las micobacterias en las
muestras de sangre. Un modo es mediante la lisis por centrifugación, colo-
cando el sedimento en un medio sólido y/o líquido y, posteriormente, los cul-
tivos se incuban durante ocho o más semanas. Otra posibilidad, y quizás un
método más rápido, es la inoculación directa del medio Myco-F Lytic (momto-
rizado para el crecimiento por el apáralo BACTEC 9000) o el medio 13 A
(monitorizado por el BACTEC 460TB).
Detección de virus. Las muestras de sangre son útiles en el diagnóstico
tan sólo en un número limitado de infecciones por virus (Tabla 57-1). La vire-
mia generalmente se produce durante el periodo de incubación o los dos pri-
meros días después de que los síntomas comiencen, por lo que la muestra de
sangre debe tomarse al comienzo de la enfermedad. Una excepción es la
infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que se detecta
con facilidad en sangre periférica, células mononucleares y plasma de la
mayoría de las personas seropositivas y, además, en casi cualquier fase de
la enfermedad. Una muestra de sangre recogida de una vena periférica o de
un catéter intravascular es adecuada para detectar el virus.
Los requisitos de la muestra dependen de cada virus (Tabla 57-1). Todas
las muestras de sangre deberían ser llevadas al laboratorio lo antes posible.
Si es inevitable un retraso en el análisis, las muestras deberían estar toda la
noche a 4°C, excepto las muestras de plasma para la detección del ARN del
VIH, que debe ser analizado dentro de las 6 primeras horas de la recogida de
la muestra. Aquí vamos a hacer hincapié en la técnica de detección del CMV
y de los enterovirus empleados en la mayoría de los laboratorios. Para la
detección de otros virus, los de la Tabla 57-1, por lo general las muestras se
mandan a un laboratorio de referencia.
 CAPÍTULO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Tabla 57-1 R e q u e r i m i e n t o s d e las m u e s t r a s para u n a óptima detección d e los virus hallados e n sangre
Virus Modo de recolección
Citomeqalovirus Con anticoagulante'
Enlorovirus Con o sin anticoagulante'
Virus de la inmunodehciencia humana' EDTA
Virus del herpes humano-6 Heparinizado
Parvovirus B 1 9 Sin anticoagulante
Virus transmitidos por artrópodos' Con o sin anlicoagulante
"Se puede utilizar hepanna o EDTA para ciloinegalovirus: para los enterovirus se puede usar heparina. citrato o EDTA
'Para monilorizar la carga viral de VIH en pacientes en tratamiento con terapia anlirretroviral
•Incluye a los v i r u s del este, oesle y la encefalitis equina venezolana, encefalitis de San Luis y California, fiebre amarilla, dengue y liebre de la garrapa
EDTA: acido etileriediarninoletraacético, VIH: virus de la mmunodeficiencia humana.
Para la detección de CMV y enterovirus en sangre, se debe separar el
componente sanguíneo que tenga más probabilidad de contener el virus y su
inoculación en un cultivo de células en monocapa que aguanten la replicación
viral o preparar una extensión para teñir con anticuerpos monoclonales. El
CMV se detecta con más frecuencia en los neutrófilos, pero podría estar pre-
sente en las células mononucleares de la sangre periférica; de este modo,
para una detección adecuada, los neutrófilos y células mononucleares debe-
han ser cultivados o teñidos (Howell, 1979). Los enterovirus se pueden obte-
ner con igual probabilidad tanto de los leucocitos o células mononucleares
como a partir del suero (Prather, 1984).
Para separar los leucocitos hay que recoger sangre con anticoagulante,
siendo el citrato o la hepanna sódica los anticoagulantes permitidos (Woods.
1987; Storch, 1994). Para separar el suero, la sangre se recoge en un tubo
sin anticoagulante y se coagula a 4 C. Cuando se forma un coágulo, la san-
gre se centrifuga a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 C y el suero se separa
de un modo aséptico.
El tipo de cultivo celular para aislar el virus se debe seleccionar en función
del virus que esperemos encontrar. Para aislar el CMV se recomienda em-
plear dos tubos de MRC-5 u otras células fibroblásticas humanas para culti-
5
vo. La incubación celular en un medio que contenga 10 M dexametasona.
durante un mínimo de 24 horas antes de la inoculación, aumenta el porcen-
taje de detección de CMV y disminuye el tiempo para la aparición del efecto
citopático (Thiele. 1988). Para aislar enterovirus. debería inyectarse MRC-5
y células primarias de riñon de mono, y el porcentaje de aislamiento podria
aumentar también mediante el empleo de células de riñon de búfalo y célu-
las humanas de rabdomiosarcoma (Dagan. 1986). Las muestras de suero
incubadas deben ser posteriormente examinadas para el efecto citopático
especifico del virus. Para las muestras de leucocitos, la capa celular de cul-
tivo debe ser inoculada con 0,5 mi de muestra, añadiendo 1 mi de medio de
mantenimiento y dejando en incubación toda la noche. Posteriormente, la
suspensión celular se coge y se lava con salmo estéril amortiguado con fos-
fato, añadiéndose 1,5 mi de medio de mantenimiento, y se vuelve a colocar
a cultivar.
Además de un cultivo convencional de las células debería realizarse un cul-
tivo del centrifugado cuando se solicite CMV (Woods. 1987). Un método más
sensible para detectar CMV en sangre es el test de la antigenemia, que se
realiza tiñendo la preparación del citocenlrifugado de leucocitos con anticuer-
pos monoclonales contra proteínas virales (pp 65) (Van Der Bij, 1988; Brum-
back, 1997),
Detección de parásitos. Las muestras de sangre son útiles para el
diagnóstico de malaria, babesiosis. tripanosomiasis y algunas diarias. Las
muestras deberían ser recogidas en tubos con anticoagulante y transporta-
das rápidamente al laboratorio. Si las extensiones deben ser enviadas a un
laboratorio de referencia, deben fijarse con alcohol inmediatamente tras su
preparación. Las técnicas utilizadas en el laboratorio para detectar esos
1257
Requerimientos de las muestras de sangre
Parte empleada para la detección Vo lumen (mi)
Leucocitos 5 - 1 0
Suero o leucocitos 5 - 1 0
Células mononuclearcs o plasma 2 - 5
Células mononucleadas 5 - 1 0
Suero 5 - 1 0
Leucocitos o coágulo homogeneizado 5 - 1 0
la de Colorado
parásitos son las mismas y se van a exponer aquí, desde la más simple a
la más compleja.
La técnica más sencilla para detectar parásitos en la sangre es el examen
directo. Para prepararlo se coloca una gota de sangre en un porta de cristal,
se tapa con un cubre portas y se analiza inmediatamente. La observación
directa es excelente para el diagnóstico de tripanosomiasis, ya que los tripo-
masligotes y las microfilarias pueden, con frecuencia, verse en movimiento
con un bajo o mediano aumento. El diagnóstico definitivo se hace por la tin-
ción de las muestras.
La extensión usada en hematología, teñida de un modo similar, es una
preparación habitual para determinar las especies de Plasmodium. Babe-
sia. Trypanosoma y microfilarias. Las extensiones para la búsqueda de
parásitos se deben fijar y después teñirse manualmente con Giemsa. aun-
que la tinción hematológica automática es también válida. Las muestras
se deben observar inicialmente a bajo aumento para detectar microfila-
rias, que son objetos grandes (entre 100 pm y 200 pm) y que por lo gene-
ral se ven con facilidad en los bordes de la extensión. Después de locali-
zadas, las microfilarias deberían estudiarse bajo una lente de aceite de
inmersión para su correcta identificación (véase Cap. 55). Después de ob-
servarla con bajo aumento, la extensión se examina con un objetivo de
gran aumento para buscar tripanosomas, y finalmente con el uso de acei-
te de inmersión para buscar e identificar Plasmodium, Babesia y Trypano-
soma.
Las extensiones más grandes son útiles para detectar todos los parási-
tos antes mencionados y son parte de los requisitos minimos para su diag-
nóstico. Se coloca una gota de sangre en un porta y con la esquina de otro
porta se separa cuidadosamente para que ocupe 1 cm-. La preparación se
deja secar y sin fijarla se tiñe con Giemsa, permitiendo su deshemoglobi-
nización.
FLUIDOS CORPORALES
Líquido cefalorraquídeo (LCR). El LCR se recoge para el diagnóstico
de meningitis y. menos frecuentemente, de encefalitis víricas. Una meningitis
infecciosa es una emergencia médica que requiere tratamiento urgente para
evitar la muerte o secuelas neurológicas serias; se divide en aguda, subagu-
da y crónica en función de la duración de los síntomas (Tabla 57-2). Una pre-
sentación aguda se produce en el 10% de los casos y la causa más frecuen-
te es infección bacteriana. Casi todas las personas con meningitis viral y el
75% de los que tienen meningitis bacteriana tienen un cuadro subagudo.
mientras que el resto presentan meningitis crónica (los patógenos responsa-
bles están recogidos en la Tabla 57-2). Los enterovirus son los causantes más
comunes de la meningitis y deberían ser los primeros en ser considerados en
el diagnóstico diferencial de meningitis en un niño o adolescente al linal de
 1258 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 57-2 Pruebas c o m e r c i a l e s de A D N para la identificación de Tabla 57-4 Parámetros d e l liquido cefalorraquídeo normal y
cultivos* c a m b i o s en la meningitis infecciosa
— — - ~ ~ — ^ ~ ~
Síndrome Duración Probables patógenos GB Proteínas Glucosa
Agudo <24 horas Bacterias piógenas cwwu (célsAil)- (mg/dl) (mg/dl)
; Subagudo t a 7 dias Enterovirus, bacterias piógenas Normal 5 (linlocitos) 14-45 45-100
Crónico Al menos 4 semanas Mycobacterium tuberculosis (2/3 serum)
Treponema pallidum Meningitis
Brucella sp Aguda/subaguda 500-200 000 (PMN) elevado baio
Leptospira interrogans bacteriana
Borrelia burgdorferi Crónica bacteriana 200-2 000 (linfocitos) elevado ba|o
tuberculosas,
Cryptococcus neoformans
hongos
Coccidioides immitis
Enterovirus 200-2 000 elevado normal
Histoplasma capsulatum (al principio PMN;
Candida spp. después linfocilos)
GB células blancas; PMN: leucocitos polimorfo nucleares.
"Se citan las células habitualmente predominantes

verano y principio de otoño. La bacteria productora de pus responsable de la

meningitis varía según la edad del paciente (Tabla 57-3).
El LCR por lo general se obtiene mediante punción lumbar, pero algunas
veces se aspira de ventrículos directamente o se recoge de un cortocircuito.
Al igual que para cultivo de sangre, también la asepsia de la piel es funda-
mental para extracción y recogida del LCR, que se envía normalmente al
laboratorio en tres tubos. Las sugerencias para realizar los test en cada tubo
son: tubo 1. recuento celular; tubo 2, preparación de extensiones para teñir
con la tinción Gram u otros tintes para cultivo; tubo 3. proteínas y glucosa y.
si está indicado, test especiales, como el del antigeno criptocócico, test sero-
lógico para la sífilis, otros estudios serológicos y citología. Los parámetros
normales de LCR y los cambios que se producen durante la meningitis en fun-
ción del organismo causal se recogen en la Tabla 57-4,
El LCR debe llevarse rápidamente al laboratorio y tiene que analizarse lo
antes posible. Si el retraso es pequeño, la muestra debe dejarse a tempera-
tura ambiente, salvo que se pida un cultivo viral, en cuyo caso habría que
meter en el frigorífico una muestra (preferiblemente 1 mi, pero nunca menos
de 0,5 mi) durante un breve espacio de tiempo. El proceso de analizar la
muestra es diferente para bacterias, hongos, virus y parásitos y se expone de
modo separado para cada grupo de microorganismos.
Procesar LCR para un cultivo habitual bacteriológico incluye su concen-
tración (si se recibe 1 mi o más de muestra), preparación de una extensión
pequeña para teñir con tinción Gram y cultivo. La concentración se consi-
gue mediante la centrifugación del líquido durante 15 minutos al menos a
1.500 x g. El sobrenadante se deja en un tubo estéril, dejando como 0,5 mi
de sedimento y liquido, que son completamente mezclados en una mez-
cladora o con la ayuda de una pipeta estéril. Como alternativa, si se reci-
ben 2 o más mililitros, el fluido podría ser concentrado filtrándolo a través
Tabla 57-3 C a u s a s bacterianas m á s habituales de meningitis
aguda s e g ú n la e d a d
Edad Organismos
Neonalos-3 meses Streptococcus del grupo B
Escherichia coli
Listeria monocytogenes'
Streptococcus pneumoniae
4 meses-6 años' Streptococcus pneumoniae
Seis años-45 años Neisseria meningitidis
>45 años Streptococcus pneumoniae
Listeria monocytogenes
Streptococcus del grupo B
"Puede producir meningitis en inmunosuprimidos en rodos los grupos de edad.
'La incidencia en EE.UU. de meningitis debida al Haemophilus inlluenzae tipo
0 ha disminuido drásticamente gracias a la vai unación
de un filtro estéril desechable de 0,45 pm y usar el filtro para su cultivo (se
explica más adelante). Sin embargo, antes de filtrar la muestra, se ponen 0.5
mi en un tubo estéril y se centrifuga para preparar las extensiones para teñir
con la tinción Gram (como ya se ha descrito) o. preferiblemente, se hace una
preparación citocentrifugada (Shanholtzer, 1982), Después de preparar la
extensión, el medio se inyecta como se explica en el Capitulo 50. Las mues-
tras filtradas se colocan hacia abajo en la superficie de agar chocolate, y tras
24 y 48 horas de incubación, se desplaza con una pinza estéril a otro lugar
para detectar las colonias formadas debajo de él.
Además de la tinción de Gram para las muestras y cultivo, los test de aglu-
tinación de látex para la detección de antigenos de Streptococcus del grupo
B. Streptococcus pneumoniae, algún serotipo de Neisseria meningitidis. E.
coli (el antigeno capsular K1 hace una reacción cruzada con el tipo B de Neis-
seria meningitidis) y Hemophilus inlluenzae tipo B. se debería realizar la téc-
nica del sobrenadante de una muestra centrifugada, la filtración de una mues-
tra previamente filtrada o de un muestra original. Estos test de látex son más
útiles para diagnosticar las meningitis tratadas incompletamente (Maxson,
1994; Bhisitkul. 1994) y para confirmar una extensión positiva para la tinción
con Gram. La realización sistemática de los test de látex debería descartarse
porque, en comparación con las muestras teñidas con Gram, su sensibilidad
no es significativamente mayor y son mucho más caros (Perkins, 1995; Kis-
ka, 1995).
El diagnóstico de la meningitis bacteriana crónica requiere una petición
especial, ya que el LCR se maneja de modo diferente para cada entidad. Para
diagnosticar la brucelosis. el LCR se procesa como se ha descrito anterior-
mente para un cultivo bacteriano ordinario, pero los medios se incuban dos o
tres semanas. Para leptospirosis. Leptospira interrogans, debería cultivarse el
LCR de las primeras semanas de la enfermedad. Los medios especiales
(mencionados antes) se inyectan con unas pocas gotas de LCR y se incuban
como se ha explicado en el Capítulo 50
El diagnóstico de neurosífilis se basa en encontrar en el LCR los siguien-
tes hallazgos: pleocitosis. concentración de proteínas aumentada, un test
de laboratorio de investigación de enfermedad venérea positivo (VRDL,
LCR VRDL), que de momento es el único método útil para la detección de
anticuerpos para Treponema pallidum en el LCR (véase Cap. 52). El test
de enfermedades venéreas en el LCR se indica sólo si la persona tiene el
suero positivo para la sífilis (Albright, 1991). La muestra debería conser-
varse en el frigorífico hasta que se haya examinado. La afectación del SNC
por Borrelia burgdoferi (enfermedad de Lyme) también se diagnostica se-
rológicamente mediante la detección de IgM e IgG especificas en el suero
y LCR.
El análisis del LCR para la detección de micobacterias sólo está indicado
en muestras con pleocitosis, elevación de glucosa o proteínas (Albright, 1991).
Para una adecuada recuperación del germen se recomienda el cultivo de al
 CAPÍTULO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
menos 5 mi. El fluido se cenlrifuga a 3.000-3.600 x g durante 30 minutos, se
saca el sobrenadante, el sedimento se mezcla completamente en una mez-
cladora y se usa para preparar muestras para teñir e inocular en medio apro-
piado (véase Cap. 53).
El análisis del LCR para la detección de hongos es el mismo que el des-
crito para la detección de bacterias en un cultivo habitual. Los organismos
se concentran por centrifugación o filtración. Una preparación obtenida por
citocentrifugación o una extensión del sedimento teñido con Gram se exa-
mina, y se coloca en el medio adecuado para cultivo (infusión de cerebro-
corazón o el agar de Shabi sin antibióticos). Para muestras filtradas, el filtro
se corta con unas tijeras estériles en dos partes, cultivando una para bac-
terias y la otra para hongos. El cultivo de las muestras centrifugadas se
hace colocando una parte del sedimento en diferentes lugares de la super-
ficie del agar.
Además de los cultivos de LCR y las tinciones con Gram, hay disponibles
unos test rápidos para el diagnóstico de meningitis causada por Chptococ-
cus neoformans: preparación de tinta china, aglutinación con látex y ensayo
mediante unión enzimática inmunoadsorbente (ELISA), Los dos últimos son
específicos para el antigeno capsular. Las células encapsuladas del C. neo-
formans son visibles en el LCR mezclado con tinta china (una gota de sedi-
mento de LCR con una gota de tinta china, disponible en tiendas de arte) en
un cristal y examinadas bajo un gran aumento (Fig. 57-1). La sensibilidad de
la tinta china es baja excepto en personas infectadas por VIH, por lo que el
test de aglutinación con látex para el criptococo o la ELISA (que son alta-
mente específicos y que tienen más del 90% de sensibilidad) son los reco-
mendados para el diagnóstico. Estos dos últimos test pueden ser hechos en
un filtro de LCR (si la muestra fue concentrada por filtración), en el sobrena-
dante de una muestra centrifugada o en LCR sin centrifugar. Un falso positi-
vo en los resultados de la aglutinación con látex se debe a la presencia de
Trichosporon beigelii en el fluido del test o a la aparición de condensación
del agar en dicho fluido. Para evitar este último problema, el test de látex
debería hacerse antes del cultivo o mejor en una muestra separada (Hee-
lan, 1991).
El análisis del LCR para el diagnóstico de infecciones virales consta de
un cultivo convencional celular (principalmente para la detección de entero-
virus), cultivo para virus causantes de encefalitis (equina occidental, equina
oriental, equina venezolana, San Luis, japonés y La Crosse) y test serológi-
cos. Además, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está siendo
investigada como una herramienta para la detección de enterovirus, virus
del herpes simple y para el análisis del ácido nucleico del CMV en LCR,
pero en la actualidad no hay equipos disponibles en el comercio. Las líneas
celulares para aislar enterovirus son las ya expuestas previamente para las
muestras hemáticas.
Figura 57-1. Preparación de tinta india de líquido cefalorraquídeo que nos mues-
tra las formas de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans. (x 400.)
1259
El LCR es en ocasiones enviado al laboratorio para el diagnóstico de tripa-
nosomiasis africana (Trypanosoma gambiense o Trypanosoma rhodesiense) o
infección con amebas libres (Naegleria fowlery y especies de Acanthamoeba).
Una vez que se recibe la muestra en el laboratorio, debería analizarse inme-
diatamente. Las preparaciones frescas se preparan directamente de la mues-
tra y del sedimento, agitando primero suavemente el tubo para prepararlo
(paso necesario, porque los parásitos con frecuencia se quedan en la pared
del tubo) y después centrifugando la muestra a 250 x g durante 10 minutos.
Las preparaciones se examinan en el microscopio con el condensador a baja
potencia para permitir la visualización de trofozoitos o, preferiblemente, en un
microscopio de contraste.
Los cultivos de amebas de vida libre del LCR se hacen en unas placas de
agar no nutriente cubiertas con una suspensión de E. coli o Enferobacler
aerogenes. El fluido se centrifuga a 250 x g durante 10 minutos, el sobrena-
dante se mueve con una pipeta estéril y el sedimento se mezcla con 0,5 mi
de solución salina y se coloca en el centro de la placa. El cultivo se incuba a
37°C y se examina diariamente durante 10 días bajo el microscopio con un
objetivo 10x (Martínez, 1991).
Otros fluidos corporales. Se recogen del pericardio, de la cavidad torá-
cica o de la peritoneal aspirando con una aguja y jeringa. El volumen ade-
cuado para aislar la mayoría de las bacterias es de 1 mi a 5 mi, pero lo ideal
para recoger bacterias y hongos es de 10 mi a 15 mi, que por lo general es-
tán presentes en pequeñas cantidades. Por otra parte, para diagnosticar una
peritonitis asociada a diálisis peritoneal ambulatoria crónica, la recogida de
hasta 50 mi podria mejorar el aislamiento del patógeno causal (Dawson,
1985). Para transportar el fluido, se debe aspirar en un contenedor estéril y
debe ser llevado al laboratorio sin demora. Alternativamente, la muestra pue-
de ser inyectada en ese momento directamente a los botes de cultivo; pa-
rece ser especialmente útil una aproximación para detectar bacterias en el
liquido peritoneal (Luce, 1988).
Los enterovirus, principalmente los Coxsackievirus A y B, están entre las
causas más comunes de pericarditis infecciosa. Estos virus podrían detec-
tarse en el fluido pericárdico por un cultivo celular convencional, pero como
no se detectan en todos los casos, la recogida de un exudado faríngeo y de
heces (que es donde más probablemente se produzca el virus), además del
fluido pericárdico, es altamente recomendada para aislar el virus en personas
en las que se sospecha una pericarditis enteroviral. Otros virus (herpes sim-
ple, varicela zóster, CMV, Epstein-Barr, hepatitis B. virus parotiditis, virus in-
fluenza) son agentes infrecuentes de la pericarditis y. por general, no se de-
tectan en el líquido pericárdico.
El análisis del líquido de las cavidades corporales para la detección de bac-
terias incluye la preparación de una extensión para la tinción con Gram e
inyectar el medio adecuado para cultivo. Como se ha mencionado antes, las
muestras pueden inyectarse en ese momento o en el laboratorio. En el labo-
ratorio, el fluido se centrifuga a 1.500-2.500 x g durante 20-30 minutos y el
sobrenadante se separa dejando 0,5 mi donde se mezcla el sedimento y des-
pués se usa para preparar las extensiones e inyectar el medio. Alternativa-
mente se puede separar un volumen pequeño (0,5 mi) de fluido antes de la
centrifugación, y se usa para preparar una extensión para citocentrifugar. El
líquido sin centrifugar también podría ser inyectado directamente para un sis-
tema de hemocultivo en el laboratorio, dejando de 0,5 mi a 1 mi para prepa-
rar una extensión para hacer una tinción de Gram.
Las muestras de fluido usadas para la detección de micobacterias se anali-
zan como se ha descrito antes para el LCR. Los fluidos para el cultivo de hon-
gos deberían estar concentrados mediante centrifugación, como se ha descri-
to antes para las bacterias. El sobrenadante se separa dejando de 1,5 mi a
2,0 mi. donde el sedimento entero es mezclado. Una muestra de sedimento se
aparta para la tinción con Gram, calcoflúor blanco, rojo congo o tinción de pla-
ta. Lo ideal es que se inyecten de 0.5 mi a 1 mi de sedimento en un medio
de cultivo de hongos (como para LCR), pero también es posible con menos
volumen.
Los fluidos corporales raramente se recogen para la detección de pará-
sitos; sin embargo Enlamoeba histolylica podría encontrarse en el pericar-
dio, cavidad pleural o peritoneal, debido a la rotura de un absceso en el hí-
gado (en las cavidades peritoneal, pleural o pericárdica) o en los pulmones
(cavidad pleural o pericárdica) o a la perforación de úlceras amebianas (en
cavidad peritoneal). Los quistes hidatídicos no son frecuentemente diag-
 1260 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
nosticados por el análisis de los líquidos de las cavidades corporales, tam-
bién debido a que el quiste se rompe en un lugar contiguo a la cavidad El
Huido recogido es generalmente claro y contiene "arena" hidatídica (véa-
se Cap. 55]. pero alguna vez puede ser turbio debido a sobreintección
bacteriana. En individuos con infección por filarías es raro que el análisis
de una preparación en fresco de un fluido de una cavidad corporal pueda
demostrar las microfilias, y en pacientes con hiperinfección por Strongy-
loides. las larvas podrian detectarse en los fluidos de las cavidades cor-
porales.
TEJIDOS
La toma de muestras de tejidos mediante cirugía posee un riesgo conside-
rable para el paciente y supone un gran gasto; por tanto, le corresponde al
cirujano tomar una muestra suficiente para el estudio histopatológico y micro-
biologico. Las torundas por lo general son poco adecuadas para este propó-
sito. La histopatologia de la lesión sirve no sólo para diferenciar entre infec-
ción y malignidad, sino también para distinguir entre un proceso supurativo y
granulomatoso. En algunos casos los tintes especiales son útiles para esta-
blecer la etiología del proceso. En lesiones crónicas el diagnóstico diferencial
incluye enfermedad debida a Aclinomyces. Brucella. micobacterias y hongos,
y cualquiera de éstos debería estar presente sólo en un número pequeño; de
nuevo queremos recalcar la necesidad de obtener muestras adecuadas para
cultivo y análisis.
Las muestras obtenidas quirúrgicamente para cultivo deben colocarse en
un recipiente estéril de boca ancha y. como regla general, el cirujano debería
separar asépticamente el tejido en el quirófano y remitirlo a análisis histopa-
tológico y microbiológico. Es importante que exista una buena relación entre
histopatólogo y microbiólogo, especialmente en casos de fiebre de origen
desconocido, para lo que se realiza una laparotomía exploratoria y se to-
man varias biopsías.
Los tejidos recibidos en el laboratorio deberían ser examinados, descri-
biendo sus características antes de analizarlos. Debe ser entonces cuando
se corta muy fino con las tijeras estériles y se deja en un mortero, donde se
mezcla con un abrasivo estéril en el caldo para hacer una suspensión al
20%. Esta suspensión se usa para inyectar todo el medio de cultivo nece-
sario y después se deja refrigerar durante por lo menos dos semanas antes
de tirarlo.
OJO
Muestras conjuntivales. Los raspados conjunlivales o las muestras
recogidas con torunda se recogen para determinar el agente etiológico de la
conjuntivitis. Las bacterias son los agentes etiológicos más comunes de
las conjuntivitis inlecciosas, y los que con mayor frecuencia encontramos son:
Streptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epider-
midis en adultos, y Haemophilus influenza. Streptococcus pneumoniae y Sta-
phylococcus aureus en niños. El tracoma, que es causada por Chlamydia tra-
chomatis, es la principal causa de ceguera en el mundo. C. trachomatis puede
causar conjuntivitis de inclusión en recién nacidos y menos comúnmente en
adultos. Los virus son responsables del 15%-20% de los casos de conjuntivi-
tis inlecciosas agudas y, en EE.UU., la mayoría de las epidemias de conjunti-
vitis víricas las causan los adenovirus. Raramente los parásitos son los cau-
santes de la conjuntivitis.
Las células conjuntivas se obtienen de la parte superior e inferior de la
conjuntiva tarsal usando una torunda humedecida en caldo de cultivo o una
espátula estéril de platino. Lo ideal es que las muestras se preparen y, si se
sospecha una infección bacteriana o fúngica, el que recoge la muestra debe
inocularla directamente en el medio de cultivo. Si la preparación directa de
la muestra o la inyección del medio no fuese posible, se deberían recoger
muestras con torunda. Las muestras deberían secarse al aire y rápidamen-
te transportarse al laboratorio junto con el medio inyectado. Si se pide un
cultivo viral, hay que recoger una segunda muestra (un raspado o con torun-
da), colocarla en un medio de transporte viral y llevarla pronto al laborato-
rio, o bien dejarla en el frigorífico durante un rato y después transportarla en
hielo húmedo. Se podría obtener un diagnóstico rápido por una inmunofluo-
rescencia directa o indirecta de las extensiones de células conjuntivas con
anticuerpos específicos para virus, pero el cultivo celular es el método más
sensible para detectar patógenos virales potenciales, por lo que siempre de-
bería hacerse.
Para detectar Chlamydia trachomatis, se debería teñir con Giemsa una
extensión preparada directamente de raspados conjuntivales y debe exa-
minarse para células epiteliales con inclusiones intracitoplasmáticas baso-
filicas diagnósticas de C trachomatis o. preferiblemente, con anticuerpos
monoclonales. que son más sensibles y específicos que la Giemsa. Para
obtener buenos resultados con el test de fluorescencia directa de anticuer-
pos debería usarse el equipo que haya sido proporcionado por el fabrican-
te (véase Cap. 49). Pasamos la torunda directamenle por la superficie del
cristal, fijamos el material y el porta se lleva directamente al laboratorio y
se deja a temperatura ambiente, o se mete un rato en el frigorífico. Los por-
tas se tiñen de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se ven al
microscopio fluorescente para cuerpos elementales (véase Cap. 49). Se
considerarán inadecuadas las muestras que tengan menos de 10 células
columnares o escamosas metaplásicas. y los resultados deberían ser remi-
tidos sin conclusión, dando una explicación, y debería pedirse otra mues-
tra. El cultivo es el método de referencia para la detección de C. tracho-
matis y debería hacerse cuando hay una alta sospecha de diagnóstico de
conjuntivitis por Chlamydia y el test de fluorescencia directa de anticuerpos
es negativo.
Muestras corneales. Los raspados corneales y las biopsías son útiles
para determinar el agente etiológico de la queratitis, una infección que puede
potencialmente producir pérdida de visión y que requiere atención inmediata.
Se encuentran bacterias del 65% al 90% de los casos de queratitis, y Sfrep-
tococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y
especies de Moraxella son los que encontramos con mayor frecuencia en
EE.UU.
Las muestras corneales se recogen con una espátula de platino estéril y se
usa para preparar las extensiones poniéndolas directamente en los portas
para teñirlas e inocularlas en el medio de cultivo adecuado. Si solicitan un cul-
tivo viral, los raspados deben colocarse directamenle en un medio de trans-
porte viral y se llevan rápidamente al laboratorio o se dejan en el frigorífico un
rato y luego se llevan con hielo húmedo. Por lo general, la conjuntiva y los
párpados del ojo infectado y del no infectado se cultivan concomitanlemen-
te para determinar la flora normal, que es útil para valorar los resultados del
cultivo de cornea. Cuando el cultivo de una Ulcera corneal se sospecha que
va a ser negativo, el oftalmólogo debería hacer una queratectomía superfi-
cial o una biopsia corneal, que es muy útil para la detección de hongos y
Acanthamoeba.
TRACTO RESPIRATORIO
Muestras nasofaríngeas. Las muestras de aspirados nasofaríngeos,
lavados y frotis se recogen sobre todo para el diagnóstico de infecciones res-
piratorias virales, pero también para sarampión. Chlamydia trachomatis, neu-
monía en niños, difteria y pertussis. Los frotis nasales también se usan para
identificar los portadores del Staphylococcus aureus.
Las aspirados nasofaríngeos y los lavados son mejores que los Irotís para
determinación viral, pero por lo general el frotis es más conveniente. Los
lavados o frotis se recogen para la detección de Bordetella pertussis: el fro-
tis es la muestra preferida para detectar Chlamydia trachomatis y Coryne-
bacterium difteriae. El aspirado se recoge con un tubo de plástico (como el
que se utiliza para alimentar a los niños) junto con una jeringa de 10 mi o un
catéter para succionar. El lavado se obtiene con una pera de goma, metien-
do y sacando de 3 ml a 7 mi de salino tamponado con fosfato. Para recoger
muestras nasofaríngeas con una torunda se tienen que sacar los mocos de
la cavidad nasal, entonces se inserta una torunda pequeña y flexible naso-
faríngea a través del septo nasal a la faringe posterior y se mueve varias
veces por la mucosa.
Para detectar virus, las muestras nasofaríngeas se colocan en un medio de
transporte adecuado, con o sin antibiótico (tales como infusión de ternera con
0,5% de gelatina, solución salina de Hank o caldo sucrosa-fosfato), y se lie-
 CAPÍTULO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
van rápidamente al laboratorio o se dejan un rato en el frigorífico y se ponen
con hielo lo antes posible. Los métodos de detección de virus se explican con
más detalle en el Capítulo 48.
Para detectar Chlamydia trachomatis se recoge una muestra nasofarín-
gea con una torunda con la punta de poliéster. que puede utilizarse para cul-
tivo, para preparar una extensión para tinción directa con anticuerpos fluo-
rescentes o posiblemente para ELISA (si el sistema es adecuado para
muestras nasofaríngeas). Los métodos de detección se explican en el Capí-
tulo 49. Para cultivo de Chlamydia trachomatis, la torunda deberia colocar-
se en un medio 2-sucrosa fosfato que contenga agentes antimicrobianos y
ser transportada al laboratorio lo antes posible, o bien ponerla en el frigorí-
fico un poco tiempo.
Para detectar Bordetella pertussis nos basta con inyectar el lavado o el
frotis en el mismo lugar. Si esto no es posible, colocamos la muestra en un
cultivo de casamino estéril, llevamos la muestra rápido al laboratorio y se
analiza dentro de la primera hora o segunda después de recoger el culti-
vo, que es el método más sensible para detectar B. pertussis: se realiza la
tinción directa de anticuerpos fluorescentes, que da unos resultados diag-
nósticos rápidos pero se asocian con muchos resultados falsos positivos y
falsos negativos (Friedman. 1988). En la actualidad el medio recomenda-
do para el cultivo es el agar Regan-Lowe (compuesto de agar carbón oxi-
dado. 10% de sangre de caballo y que contiene cefalexina), mejor que el
tradicional agar Bordet-Gengou (infusión de agar patata con el 20% de
sangre de oveja). Las muestras que deben transportarse a un laboratorio
de referencia para cultivarse deberían de inyectarse en un medio de trans-
porte para Regan-Lowe.
Para detectar a los portadores de Staphylococcus aureus, las secreciones
nasales se recogen de la nariz con una torunda de poliéster que se coloca
en un tubo para transportarla rápidamente al laboratorio. La muestra se colo-
ca en un agar con el 5% de sangre de oveja, un medio selectivo para orga-
nismos grampositivos (agar colistina-ácido nalidíxico o agar alcohol fenil-etí-
lico), o agar sal de manitol, un medio selectivo para Staphylococcus aureus
y que ayuda a diferenciar las especies coagulasa positivo de las coagulasa
negativo.
Muestras de garganta. Los frotis faríngeos que se hacen por lo general
se recogen para diagnosticar las faringitis por Streptococcus del grupo A, y las
muestras que se reciben en el laboratorio para cultivo ordinario sólo deberían
buscar este agente. Los lavados de garganta o frotis son útiles para detectar
virus que se encuentran en la cavidad oral sin causar faringitis (virus del her-
pes simple, CMV o enterovirus), y los frotis deberían ser útiles para determi-
nar el agente causante de la epiglotitis, una celulitis que progresa con el ries-
go potencial de causar obstrucción de la vía aérea (casi siempre debido a
Haemophilus influenzae tipo B, aunque en ocasiones a Staphylococcus
aureus o Streptococcus pneumoniae) y en el diagnóstico de gonorrea, neu-
monía por Mycoplasma pneumoniae, difteria y angina de Vincent.
Los frotis de garganta se recogen sujetando la lengua con un depresor,
introduciendo la torunda entre las amígdalas y detrás de la úvula sin tocar
las paredes laterales de la cavidad bucal y moviendo en todas las direc-
ciones por la faringe posterior. Los frotis recogidos para detectar virus
deberían colocarse en un medio de transporte para virus y, los que sean
para detectar bacterias, en un tubo para transportar que contenga medio
Stuart modificado. Los lavados de garganta para el diagnóstico de infec-
ciones virales se obtienen haciendo gárgaras con 5 mi de medio de trans-
porte viral que contenga antibióticos. Los lavados y frotis deberían llevarse
pronto al laboratorio o dejarlos un rato en el frigorífico, si es inevitable un
retraso.
Para el diagnóstico de faringitis por Streptococcus del grupo A, el cultivo es
el más sensible. Utilizar un medio selectivo aumenta la recuperación de Strep-
tococcus pyogenes, y si inhibimos la flora normal, disminuye el tiempo reque-
rido para leer las placas y la interpretación de colonias |i-hemolíticas (Bellon.
1991). Cuando se solicita urgente un test directo para Streptococcus grupo A
(hay varios disponibles comercialmente) se deben recoger dos muestras. Si
el test directo es positivo, la segunda muestra debe desecharse; pero si el test
directo es negativo, hay que cultivar la segunda muestra, porque la sensibili-
dad del test es sólo del 70% (Bisno, 1991).
Para determinar el agente causante de la epiglotitis, el médico debería
recoger un frotis en un lugar donde se pudiera intubar al paciente en caso de
1261
ser necesario. Para detectar la Neisseria gonorrhoeae en la garganta, la
muestra debería inocularse en ese mismo lugar, o tendría que ser transpor-
tada al laboratorio lo antes posible y ser inoculada tan pronto como sea po-
sible en un medio selectivo, como el agar Thayer-Martin modificado. Si el
retraso es inevitable, la muestra tiene que estar a temperatura ambiente. El
frotis de faringe es la muestra para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae,
aunque para el diagnóstico de la neumonía por M. pneumoniae por lo gene-
ral es suficiente con la clínica o un test serológico. La muestra debe dejar-
se en el frigorífico hasta que se inyecte en un medio de cultivo adecuado
(véase Cap. 49).
Para el diagnóstico de difteria se recoge una muestra nasofaríngea y
una (o mejor dos) de garganta y se llevan al laboratorio inmediatamente. Si
el personal del laboratorio no tiene experiencia en la identificación y recu-
peración de Corynebacterium diphteriae, tienen que remitir las muestras
secas en paquetes o tubos que contengan gel de silica u otro secante a un
laboratorio de referencia. Para analizar las muestras de los individuos de
los que se sospecha difteria, se preparan dos extensiones de una de las
muestras de garganta; una se tiñe con Giemsa, para diferenciar la difteria
de la angina de Vicent, y la otra con azul de metileno Loftier, para visuali-
zar los granulos metacromáticos profundos teñidos de azul de las especies
de Corynebacterium. diphteriae no puede identificarse por la morfología de
las células, por lo que deben realizarse cultivos. Las muestras nasofarín-
geas y de garganta deberían colocarse en un medio de suero de Lóffler y
en un medio que contenga telurito potásico. Además tiene que inyectarse
y analizarse una placa de agar de sangre de oveja para Streptococcus del
grupo A.
La angina de Vincent es una amigdalitis aguda, ulcerativa y necrotizante
que puede ser causada por Fusobacterium necrophorum y otros anaerobios.
Una enfermedad con esta clínica debería llamarse angina de Vincent si en las
extensiones preparadas de una muestra faríngea o la muestra de la lesión
ulcerada encontramos gramnegativos, bacilos fusiformes y espiroquetas al
teñirlas con Gram. El cultivo del área de alrededor no suele ser útil porque
existen muchas especies de anaerobios que están presentes en la cavidad
oral; sin embargo, deben realizarse cultivos de sangre porque la enfermedad
suele acompañarse de sepsis.
Esputo y aspirado traqueal. Los estudios microbiológicos de los espu-
tos (expectorado e inducido) y de las muestras de aspiración traqueal son lo
primero que se hace para determinar los agentes etiológicos de la neumonía.
Lo mejor es que el esputo se recoja a primera hora de la mañana antes de
comer. El individuo deberia enjuagarse la boca con agua y después recoger
la muestra, preferiblemente de 5 ml a 10 ml, que resultará de una tos profun-
da. Para las personas que no tienen tos productiva se debería inducir, ponien-
do al individuo aerosoles de una solución de cloruro sódico al 15% y glicerina
al 10% durante aproximadamente 10 minutos o hasta que se inicie el reflejo
de la tos. La aspiración traqueal obtiene secreciones respiratorias bajas de
pacientes con traqueostomía recogidas en un recipiente de Lukens. Los pa-
cientes con traqueostomía enseguida se colonizan con gramnegativos y otros
patógenos nosocomiales, y como la bacteria que coloniza el aparato respira-
torio no puede ser diferenciada de la bacteria que causa la enfermedad inva-
siva por el cultivo de aspiración traqueal, la interpretación de los cultivos es
muy difícil.
Las muestras de esputo y de aspiración traqueal deben llevarse al labo-
ratorio o, si el retraso es inevitable, se dejan un rato en el frigorífico. Ambos
tipos de muestras se deben someter a screening antes de colocarlas en las
placas para hacer el cultivo, para determinar si lo que tienen son pocas
secreciones o saliva (Morris, 1993). Una extensión obtenida de una parte de
la muestra que consiste en material purulento se tiñe con Gram. Por lo ge-
neral, las muestras que encontramos con más de 10 células epiteliales por
campo de bajo aumento están significativamente contaminadas con saliva,
por lo que deberían rechazarse. Las muestras con menos de 25 células epi-
teliales y más de 25 neutrófilos por campo de bajo aumento probablemente
se acepten (Murray, 1975). El número de neutrófilos no se suele tener en
cuenta cuando se determina la calidad de la muestra, porque el individuo
del que la hemos recogido puede estar neutropénico. Por lo general no se
pide un screening en las muestras de esputo inducido y esputos no induci-
dos para la detección de Mycoplasma neumoniae, especies de Legionella y
mícobacteria para valorar la calidad (Ingram, 1994; Havlik. 1995). Sin em-
 1262 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
bargo. los dalos de un estudio sugieren que la presencia de neutrófílos en
un screening de las muestras de esputo es un método efectivo para evaluar
la aceptación del esputo para el cultivo y muestra micobacteriana. (McCar-
ler, 1996).
Las extensiones teñidas con Gram que se han preparado de una muestra
adecuada para cultivo se examinan con inmersión en aceite para determinar
los diferentes organismos. La cantidad de organismos (raros, pocos, mode-
rados o muchos) se estima para cada tipo de bacterias (p. ej.. cocos grampo-
sitivos en parejas, cadenas o racimos; bacilos grampositivos. diplococos
gramnegativos y gramnegativos en varillas), diferenciando si son o no intra-
celulares. Las muestras de secreciones traqueales teñidas con Gram en las
que no se observan organismos deberían rechazarse (Gilligan, 1999). Los
trozos de muestras aceptadas que contengan material purulento se inyectan
como se describe en el Capítulo 50: para muestras de individuos con fibro-
sis quística. también se recomienda inyectar en un medio selectivo para Bur-
kholderia (Pseudomonas) cepacia.
Hay algunos organismos que no encontramos en un cultivo ordinario, y para
aseguramos de que se detectan hay que pedir unos test específicos. Por ejem-
plo, cuando se sospecha enfermedad por Legionella, se recomienda un culti-
vo de Legionella y un test directo rápido (anticuerpos fluorescentes). El cultivo
es el método más sensible y debería realizarse siempre. Las muestras de
esputo y aspiraciones traqueales que vayan a ser sometidas a un cultivo para
Legionella deberían diluirse 1:10 en un tubo con caldo tnpticasa que contenga
pedas de cristal estériles, y se agita en una mezcladora o se trata lavándolo
con una solución acida para evitar el crecimiento de la llora bacteriana normal.
Habría que inocular algunas gotas de la muestra de cada una de las dos pla-
cas de agar extracto de levaduras carbón tamponado con u-cetoglutarato, una
con agentes microbianos y otra sin ellos. La tinción con fluorescencia directa
de los anticuerpos, que puede darnos resultados en unas horas frente a los 5-
7 días que tardan los cultivos, debería usarse para suplementar. pero no para
sustituir el cultivo.
Para una detección adecuada de micobacterias en los esputos, se reco-
mienda recoger las muestras en tres días diferentes. El esputo y otras secre-
ciones respiratorias deben descontaminarse para evitar el sobrecrecimiento
bacteriano rápido de la flora respiratoria saprofita sobre las micobacterias de
crecimiento. Este proceso y los métodos para detectarlo se comentan en el
Capítulo 53.
Todas las muestras destinadas para el cultivo de hongos se deben mane-
jar en una cabina de seguridad biológica. La calidad de las muestras debe-
ría determinarse con un screening de las extensiones teñidas con Gram
(como se ha descrito para las bacterias). Para el cultivo de hongos se de-
berían inyectar en el medio de cultivo muestras adecuadas de esputo no in-
ducido, esputo inducido y aspiraciones traqueales. Por lo general, para el
cultivo de hongos se recomiendan los siguientes principios generales: de-
bería usarse un medio con y sin enriquecimiento de sangre con y sin ciclo-
heximina; todos los medios deberían contener agentes antimicrobianos. Sin
embargo, cuando se haga la selección, el director del laboratorio también
debería considerar el coste y los tipos de hongos que se suelen encontrar
en la población.
Las muestras de esputo inducido son útiles para el diagnóstico de neu-
monía por Pneumocystis carínii en personas con el síndrome de inmunode-
ficíencia adquirida (sida) (Wolfson, 1990). Primero se analiza una extensión
teñida con Gram para ver si es representativa de secreciones del tracto res-
piratorio bajo. Las muestras aceptadas se tratan son un agente mucolítico
(como W-acetil-L-cisteína), y las extensiones se preparan y se tiñen para de-
tectar P. carínii (véase Cap. 54).
Muestras por cepillo telescopado. El cepillado es útil para el diag-
nóstico de neumonía bacteriana en pacientes ventilados que no han reci-
bido tratamiento antibiótico, y probablemente es útil para el cultivo de aero-
bios y anaerobios (Baselski. 1994). La muestra se recoge con un cepillo
pequeño que obtiene de 0.01 ml a 0,001 mi de secreciones, colocado en
un catéter, dentro de una cánula doble. La cánula de luera tiene en la pun-
ta un tapón desplazable de polielileno glicol. Para obtener la muestra, se
inserta la cánula, mediante broncoscopia, en el sitio deseado, la cánula de
dentro se saca quitando el tapón (hidrosoluble) y se extiende el cepillado
más allá de la cánula interna. Una vez que se ha tomado la muestra, el
cepillo se mete en la cánula interna y ambos, el cepillo y la cánula interna,
se meten en la cánula externa para evitar la contaminación del cepillo
cuando se retira el catéter. Después se coloca el cepillo en una solución
estéril con 1 mi de suero salino. La muestra debe llevarse inmediatamente
al laboratorio y analizarse lo antes posible. Si el retraso es inevitable, tie-
ne que guardarse en el frigorífico. Para analizar la muestra, hay que agi-
tarlo en la mezcladora donde se deja el cepillo. Las preparaciones del cen-
trifugado se tiñen con una tinción Gram y con el asa de inoculación
calibrado de 0,01 mi, y se deja el cultivo en un medio apropiado Las colo-
nias de más de 1.000 organismos/ml en el cultivo (que corresponde a 10'
organismos/ml de la muestra original) parece que corresponden con una
infección (Baselski, 1994).
Lavado broncoalveolar. Las muestras de lavado broncoalveolar son
útiles para el diagnóstico de neumonía en pacientes ventilados que no han
recibido tratamiento antibiótico, y para detectar patógenos oportunistas en
pacientes con neumonía e inmunocomprometidos (Baselski. 1994). Sin em-
bargo, para el cultivo de las especies de Legionella son preferibles las mues-
tras de esputo, porque las muestras broncoalveolares se diluyen en salino y
podrían contener pequeñas cantidades de anestésico local, que inhibe los
organismos. Para recoger el fluido, la punta del broncoscopio se introduce
cuidadosamente en la luz de la vía aérea. A través de la luz, se inyecta un
volumen de salino (por lo general > 140 mi) en 3 ó 4 alícuotas lavando 1 millón
de alvéolos. El volumen total que se saca varia en función del volumen meti-
do, pero por lo general es de 10 ml a 100 mi. El tiempo que tarde en llevarse
al laboratorio tiene que ser mínimo (<30 minutos), y una vez que esté en el
laboratorio debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse un retraso,
el liquido debería conservarse en el frigorífico.
El análisis de las muestras de lavado broncoalveolar para detectar virus
incluye un examen microscópico directo y un cultivo celular. El análisis de las
preparaciones centrifugadas teñidas con la tinción de Papanicolau permite
detectar los cambios citopáticos, útiles en especial para el diagnóstico de
neumonía por CMV (Fig. 57-2) (Woods. 1990). Se recomienda teñir las pre-
paraciones centrifugadas del fluido con Gram: visualizar una o más bacterias
sin células escamosas epiteliales por campo de aceite de inmersión es alta-
mente sugerente de una neumonía bacteriana aguda (Baselski. 1994; Kahn,
1987). Las preparaciones centrifugadas también pueden teñirse con tinción
acido-resistenle. con anticuerpos específicos, como aquellos para delectar
las especies de Legionella o Pneumocystis carínii. o con tintes no específicos
para detectar Pneumocystis carinii u otros hongos (como tinte de plata, calco-
flúor blanco o Giemsa).
Los datos indican que un cultivo cuantitativo de muestras de lavado alveo-
lar es útil para el diagnóstico de neumonía bacteriana aguda (Baselski. 1994).
La muestra se inyecta en un medio agar usando un asa de inoculación cali-
brado de 0,001 mi (como se vera después para los cultivos de orina) La pre-
sencia de más de 10.000 colonias/ml corresponde con la enfermedad. Para
detectar micobacterias, las muestras deben ser descontaminadas y maneja-
das como se describe en el Capítulo 53. Para detectar virus, debe hacerse un
cultivo convencional y un cultivo centrifugado para CMV. Para recuperar los
hongos, se debe inyectar el sedimento de una muestra centrifugada en un
medio de cultivo primario.
TRACTO URINARIO
Los métodos aceptados para recoger la orina incluyen recogida de la mitad
de la micción (preferiblemente la primera de la mañana), sondaje y aspiración
suprapúbica. Por lo general, las muestras de orina de 24 horas deberían des-
echarse, excepto cuando se pida específicamente detectar Schistosoma hae-
matobium. Lo más común es que se recoja la micción de la mitad de un modo
limpio. Para mujeres, primero se limpia la zona periuretral y penneanal con
unas gasas estériles, con jabón de delante hacia atrás, y se enjuaga con una
gasa estéril mojada y se seca con una gasa estéril. Para hombres, limpiar el
área genital no va a mejorar la detección de bactenuria de modo significativo,
por lo que no es necesario (Lipsky, 1984). Durante la micción, las mujeres de-
ben separar los labios, los hombres no circundados deben retirarse el prepu-
cio. Los primeros mililitros de orina se desechan para limpiar las bacterias que
normalmente colonizan la uretra, y la micción central se recoge en un con-
tenedor estéril de boca ancha y se cierra fuertemente la tapa.
 CAPÍTULO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Figura 57-2. Preparación cite-lógica de fluido del lavado broncoalveolar que nos
muestra una célula alargada con inclusiones intranucleares e intracitoplasmáticas.
que se corresponden con el citomegalovirus. (Tinción de Papanicolau, 250x.) (Cor-
tesía de Vicki J. Schnadig, M.D., Departamento de Patología, Universidad de
Texas, Rama Médica, Galveston, TX.)
El sondaje se asocia con el riesgo de inducir una infección nosocomial y,
por tanto, deberia estar restringido a personas que no pueden recoger la
mitad de la micción; por ejemplo, personas con una alteración sensitiva o
aquellos que no pueden miccionar por razones urológicas o neurológicas.
Utilizando una técnica estrictamente aséptica, se introduce la sonda en la
uretra, se desechan los primeros mililitros para limpiar los organismos que
pueden haberse introducido por la punta de la sonda mientras se colocaba y
la mitad de la micción se recoge para cultivo. La orina puede recogerse de
una sonda aspirando con una jeringa y una aguja del 28 a través del conec-
tor de goma, teniendo cuidado de limpiar el punto de punción. La orina no
debe recogerse de la bolsa de orina, y las puntas de la sonda Foley no debe-
rían ser aceptadas para cultivo, porque casi siempre están contaminadas
con organismos de la uretra.
La aspiración suprapúbica se usa principalmente en neonatos. El procedi-
miento requiere que la vejiga esté llena; la piel se desinfecta, se pincha la veji-
ga por encima de la sínfisis del pubis, y con una aguja del 22 y una jeringa as-
piramos aproximadamente 10 mi de orina.
Todas las muestras deberían llevarse al laboratorio nada más recogerse,
y se deberían analizar dentro de las dos primeras horas después de haber
sido recogidas. Si el retraso es inevitable, deben meterse en el frigorífico un
mínimo de 24 horas. Hay equipos que se comercializan que contienen con-
servantes para mantener las bacterias durante 24 horas a temperatura
ambiente, pero no ofrecen ninguna ventaja con respecto a meterla en el fri-
gorífico.
El tracto urinario por encima de la uretra en personas sanas es estéril,
pero la uretra está normalmente colonizada con muchas bacterias, por lo
que las muestras recogidas por métodos no invasivos (media micción, re-
cogida limpia) son contaminadas durante su tránsito. Las bacterias comen-
sales se diferencian de los patógenos por varios cultivos de orina, proceso ¡ni-
cialmente promovido por Kass (Kass, 1956). Al principio, un crecimiento de
5
10 o más CFU de bacterias por mililitro de orina era altamente indicativo
de infección, pero este criterio se ha modificado para las diferentes situa-
ciones. Por ejemplo, en mujeres jóvenes sexualmente activas con sinto-
?
matología uretral aguda (disuria, frecuencia y urgencia), 10 CFU/ml se con-
sidera significativo en presencia de piuria concomitante (Stamm, 1982).
5
Infecciones de orina reales asociadas con menos de 10 CFU/ml pueden
producirse en bebés y niños, en hombres y en personas que están sonda-
das, que se han tratado recientemente con antibióticos, con ingesta hídri-
ca abundante (para diluir la orina), tienen síntomas y piuria concomitante.
Obstrucción urinaria o pielonelritis adquirida por una diseminación hema-
tógena (especialmente infecciones debidas a levaduras y Stalilococcus
1263
aureus) (Pezzlo. 1988; Barón. 1990). Por consiguiente, para una correcta in-
terpretación del cultivo, se necesita comunicación entre el médico y el per-
sonal del laboratorio.
Los cultivos de orina para bacterias se hacen inyectando el medio adecua-
do (véase Cap. 50) en una determinada cantidad de orina con un asa cali-
brado de plástico o alambre, diseñado para repartir un volumen conocido. Un
asa de 0,001 mi se utiliza para inyectar todas las muestras de orina, excepto
las que se recogen en mujeres con sospecha de síndrome uretral agudo y
aspiraciones suprapúbicas. Las dos últimas se inyectan con un asa de 0,01
mi. El asa adecuado se mete verticalmente en la muestra de orina bien mez-
clada, y el asa repleto de orina se saca y se extiende sobre una superficie de
placa agar como se indica en la Figura 57-3. Sin remover el asa, se mete ver-
ticalmente otra vez en la muestra de orina y la muestra que sacamos se inyec-
ta en una segunda placa.
Para determinar el número de microrganismos por mililitro de la muestra
original, se cuenta el número de colonias en la placa agar y se multiplica por
1.000 (sí se ha usado un asa de 0,001) o por 100 (si se ha usado un asa de
0.01 mi). El crecimiento de 3 o más especies en una recogida limpia de la mi-
tad de la micción por lo general indica contaminación. En ese caso, los orga-
nismos se enumeran y se caracterizan mínimamente (p. ej.. Staphylococcus
coagulasa negativa o bacilo gramnegativos lactosa positiva) y no se hace el
test de sensibilidad. Uno o dos aislados presentes en un número mayor de
10.000 en una mitad de micción limpia deberían identificarse y deberia ha-
cerse un test de sensibilidad antibiótica. Los organismos en un número me-
nor de 10.000 se dejan, con las siguientes excepciones: un cultivo puro de
Staphylococcus aureus es considerado significativo independientemente
J
del número y debería hacerse un test de sensibilidad. Un crecimiento de 10
4
a 10 CFU/ml podría ser significativo en infecciones que tienen que ver con
3
la sonda. En hombres con sintomatología, un crecimiento de 10 CFU/ml o
más se considera infección, y se debería identificar el organismo, pero el
test de sensibilidad se hará sólo si lo piden específicamente. Para todos los
organismos aislados de una punción suprapúbica. se identifican y se hace
el test de sensibilidad. Un crecimiento único en un número de 100 o mayor
de una mujer con sospecha de síndrome uretral agudo debería identificarse
si hay piuria, y el test de sensibilidad debe hacerse sólo si se pide específi-
camente.
Más de la mitad de las muestras de orina que se llevan al laboratorio
para cultivo no tienen crecimiento, o tienen niveles bacterianos por deba-
jo de lo que se considera clínicamente significativo; por tanto, los test de
screening que identifican de un modo rápido las muestras como "negati-
vas" para el cultivo se han desarrollado en un intento de proporcionar
resultados rápidos, eliminar las muestras negativas y permitir tener más
tiempo para las muestras positivas, mejorando la eficiencia y el coste. La
comprobación de la orina y los cultivos se corresponden cuando la referen-
s
cia es 10 CFU/ml o más, pero son menos adecuadas para un número
menor de colonias (Pezzlo, 1988). Otras razones para considerar adecua-
do el screening de la bactenuria son la capacidad de detectar piuria y el
coste. Este último es especialmente importante cuando consideramos la
automatización.
Comprobar las muestras de orina con una tinción Gram es rápido y eco-
nómico. Encontrar uno o más organismos por campo con aceite de inmer-
sión en una extensión preparada de una muestra centrifugada se corres-
r
ponde con bacteriuria con 10' o más CFU/ml. La sensibilidad del tinte Gram.
sin embargo, disminuye cuando se trata de un número menor de colonias,
y continuar con el análisis es una pérdida de tiempo. Comercialmente hay
disponibles tiras de reactivos que combinan la nitrato reductasa (una enzi-
ma presente en la mayoría de los bacilos gramnegativos que causa infec-
ciones del tracto urinario) y la esterasa leucocitaria (una enzima producida
por neutrófilos), son métodos baratos y fáciles de manejar, pero su sensibi-
lidad es demasiado baja para comprobar las infecciones del tracto urinario
(Pezzlo. 1988).
Hay sistemas de screening para la orina disponibles comercialmente. Un
sistema de filtración de colores proporciona resultados rápidos y detecta más
del 90% de las muestras positivas (incluidas las que contienen neutrófilos
г
y sólo ^0 CFU/ml), pero pueden dar falsos negativos para enterococos y
Pseudomonas aeruginosa (Pezzlo. 1988; Shaw, 1997). La orina se pasa a
través de un filtro de papel que retiene las células y después se pasa el tin-
 1264 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 57-3. Tècnica para inocular orina en placas agar. (De Woods GL Gutierrez
Y: Diagnostic Pathology of Infectious Diseases. Filadelfia, Lea 8 Febiger, 1993, con
permise.)
te a través del filtro. La intensidad del color del resultado, que se lee manual-
mente o con un fotómetro, se corresponde con el número de partículas adhe-
ridas al filtro.
Un sistema bioluminiscente se basa en la reacción de ATP (presente en
todas las células vivas) con lucíferina y luciferasa, que producen luz que se
mide con un luminómetro. Se puede estimar el número de CFU en una mues-
tra de orina por el ATP liberado selectivamente por las bacterias solas. Esta
5
técnica se compara favorablemente con el cultivo a nivel de 10 CFU/ml o
más. pero como necesita un tiempo de incubación, los resultados tardan unas
pocas horas.
Un sistema de fotometría automatizada detecta la bactenuria midiendo
los cambios de transmisión de la luz a través de un medio de caldo inyec-
tado con la muestra de orina. El crecimiento bacteriano hace que el medio
se ponga turbio en 2 ó 3 horas generalmente, pero los resultados negati-
vos no pueden darse hasta pasadas 5-13 horas. Este sistema se compara
5
favorablemente con un cultivo a nivel de 10 CFU o más y tiene la capaci-
dad de identificar el organismo y hacer el test de sensibilidad anlimicro-
biana.
Algunas bacterias no se detectan en un cultivo ordinario de orina, y cuan-
do se sospecha de estos patógenos, se debe pedir un test específico. Por
ejemplo, una muestra de orina es válida para detectar Neisseria gonorrboeae
y Chlamydia trachomatis pata la amplificación de ácidos nucleicos. Las
instrucciones del fabricante deben seguirse tanto para la recogida como
para el análisis. Leplospira interrogans puede detectarse en la orina después
de la primera semana de la enfermedad y hasta varios meses después. La
orina debería ser analizada lo antes posible, porque la acidez podría
dañar los organismos. Inyectamos una o dos gotas de orina sin diluir y de
orina diluida 1:10 en 5 mi de medio Fletcher o de medio Ellinghausen-
McCullough-Johnson-Harris. que contienen 5-fluoracilo. El urocultivo para
micobacterias se ve en el Capítulo 53. Las levaduras deberían recuperar-
se de la orina en el medio que utilizamos para un cultivo bacteriano habi-
tual, pero si se pide específicamente un cultivo para hongos, debe colo-
carse el sedimento de una muestra de orina centrifugada en un medio que
contenga agentes antimicrobíanos. como un inhibidor de mohos o el agar
Shabi.
Cuando las muestras de orina se cultivan para virus, deberían añadirse an-
tibióticos (p. ej„ penicilina, gentamicina y anfotericina B) para minimizar la
contaminación bacteriana de los cultivos celulares. Las lineas celulares se se-
leccionan para la inoculación basada en los virus que encontramos con más
frecuencia aislados: CMV, adenovirus y virus del herpes simple.
TRACTO GENITAL
Secreciones vaginales. Las secreciones vaginales son útiles para de-
terminar el agente etiológico de la vulvovaginitis y la vaginosis bacteriana
(así llamada porque no es invasiva). En mujeres pospuberales, los pató-
genos más comunes son Gardnerella vaginalis (asociada con anaerobios
como especies de Mobiluncus), especies de Candida y Trichomonas vagi-
nalis. Una preparación en fresco es el test más adecuado para el diagnós-
tico, y puede ser realizado por el médico allí presente: los cullivos no son
necesarios para el diagnóstico, Para preparar la muestra fresca, se coloca
la torunda de la muestra en un tubo que contiene cerca de 1 mi de salino
y se agita con cuidado: una gota de esa suspensión se coloca en un porta
de cristal. De modo alternativo, colocamos una gota de salino en el porta y
la mezclamos con una muestra de material vaginal. Ponemos un cubre-
portas y calentamos la muestra pasándolo a través de una llama o mante-
niéndolo sobre una bombilla incandescente. Se examina el porta a bajo y
gran aumento, buscando "células clave" (células epiteliales cubiertas con
pequeñas bacterias cocobacilos) (Fig. 57-4) compatibles con el diagnósti-
co de vaginosis mespecífica, pseudohifas, sugestivo de candidiasis vagi-
nal, y Trichomonas móviles.
Además de la muestra en fresco, también son útiles para el diagnóstico
determinar el pH vaginal y el test del olfato, que se realiza añadiendo KOH
al 10% a una gota de muestra vaginal situada en el porta o en el espéculo.
El pH vaginal es de cerca de 4,5 en mujeres con candidiasis vulvovaginal,
pero está por encima de 4,5 en aquellas con vaginosis o tricomoniasis. Un
lest del olfato positivo (es decir, hay un olor acre como a pescado) se aso-
cia por lo general con vaginosis bacteriana, pero en ocasiones con tricomo-
niasis.
Muestras endocervicales y uretrales. Las muestras endocervicales se
recogen para determinar el agente etiológico de las cervicitis y para identificar
las personas asintomáticas con un organismo que causa enfermedad de trans-
misión sexual. Las muestras endocervicales se obtienen con la ayuda de un
espéculo humedecido sólo en agua caliente, porque los lubricantes pueden
contener agentes antibacterianos. Si se indica una muestra Papanicolau, esa
muestra debería recogerse primero. Las muestras para estudios microbioló-
gicos por lo general se recogen con una torunda, aunque en mujeres no
embarazadas el uso de un cepillo endocervical podría aumentar la sensibili-
dad de los test de cultivo y no cultivo para Chlamydia trachomatis (Linder,
1987). Como se ha dicho anteriormente, en este capitulo se recomienda usar
una torunda con la punta de poliéster y un recipiente de plástico. Si se utiliza
un equipo para test que no sea para cultivo para detectar organismos, la
muestra tiene que recogerse con la torunda que viene en el equipo o con
lo que el fabricante diga. La muestra para detectar Neisseria gonorrhoeae
hay que recogerla antes que la de Chlamydia trachomatis o la del virus del
herpes simple (VHS).
Antes de recoger las muestras para estos dos últimos organismos, hay
que sacar todas las secreciones de la cavidad cervical. La torunda o el cepi-
llo se insertan 1 cm o 2 cm en el canal cervical (pasada la unión escamoco-
lumnar), se frota firmemente contra la pared durante 10-30 segundos, con
cuidado de no tocar la pared de la vagina, y se coloca en un medio de trans-
porte adecuado o un sistema de tubo, que se utiliza para preparar un porta
de cristal para la tinción directa con anticuerpos fluorescentes (para Chla-
mydia trachomatis) o para inyectar inmediatamente un medio agar para re-
cuperar Neisseria gonorrhoeae.
El manejo de las muestras varía en función del organismo que busquemos.
Para aislar N. gonorrhoeae, está indicada la inyección directa de un medio
agar, como Thayer-Martin modificado, dentro de un recipiente al que se haya
añadido una pastilla para generar CO. . De otro modo, la muestra de la torun-
¿
da puede colocarse en un sistema de transporte de lubo y se lleva al labora-
torio lo antes posible. Si el retraso es inevitable, hay que dejar la muestra a
temperatura ambiente, nunca en el frigorífico. Si utilizamos una muestra de
ADN o amplificación de ácidos nucleicos para detectar Neisseria gonorrhoeae,
tendremos que utilizar un equipo y seguir las instrucciones del fabricante para
el almacenaje y transporte.
Para detectar Chlamydia trachomatis podrían usarse métodos de cultivo u
otros (véase Cap. 49). Para el cultivo de células de Chlamydia, utilizamos
 CAPÌTUIO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EI DIAGNÓSTICO DE IAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
normalmente como medio de transporte 2-sucrosa fosfato o sucrosa-gluta-
mato-fosfato, y añadimos antibióticos (como gentamicina, vancomicina y nis-
tatina o anfotericina B) para impedir el sobrecrecimiento de hongos y bac-
terias Para mantener con vida las clamidias. la muestra debe transportarse
inmediatamente al laboratorio, o se deja almacenada en el frigorífico si el
transporte no puede ser inmediato. En el laboratorio la muestra debe ana-
lizarse lo antes posible. Si no puede evitarse el retraso, las muestras deben
dejarse en el frigorífico si pueden ser analizadas dentro de las siguientes
48 horas. Si se sabe de antemano que el retraso va a ser mayor, las mues-
tras deben dejarse a - 7 0 C o más frío, aunque el proceso de congelación
puede disminuir el porcentaje de aislamiento de C. Irachomatis en un 2 0 %
(Mahoney, 1985). Para detectar los cuerpos elementales de Chtamydia por
una tinción de fluorescencia directa de anticuerpos, se debe utilizar el equi-
po de recogido y seguir las instrucciones del fabricante. La torunda se da una
vuelta en el porta que se va a observar al microscopio, se deja secar y se
aplica un producto para fijar. Para el inmunoensayo enzimático, las pruebas
de ácido desoxirribonucleico (ADN) y la amplificación de ácidos nucleicos, el
equipo de recogida y transporte que deja el fabricante es el que hay que
usar, salvo que el fabricante diga que vale olro sistema de transporte especi-
fico. También deben seguirse las instrucciones del fabricante para las condi-
ciones de transporte, los requisitos de almacenamiento y el tiempo para ana-
lizarlo.
Para detectar adecuadamente el VHS es necesario hacer un cultivo celu-
lar. El exudado se coloca en un medio de transporte viral y se lleva lo antes
posible al laboratorio. Si el transporte inmediato no es posible, la muestra
debe almacenarse en el frigorífico. Para pacientes que tengan una lesión visi-
ble en el cérvix, los cambios virales citopáticos pueden verse en las extensio-
nes preparadas de raspados de la lesión base Las extensiones se lijan inme-
diatamente y se liñen con el tinte Wright o Giemsa (preparación Tzanck) o con
anticuerpos monoclonales.
Para diagnosticar las mismas enfermedades de transmisión sexual en
varones, se deberia coger un exudado uretral o una muestra de la primera
micción, dependiendo del método que se use para detectarlo. Lo ideal es que
los exudados uretrales se recojan por lo menos dos horas después de que el
paciente haya miccionado. Las muestras para Neisseria gonorrhoeae son
las primeras que se obtienen. Las condiciones en función del tipo de torunda
y transporte son las mismas que las descritas para muestras endocervica-
les, aunque se usan torundas genitales que son más pequeñas. La torun-
da se inserta en la uretra 2 cm-4 cm, se rota en un sentido durante 5 se-
gundos, se retira y se coloca en un medio de transporte adecuado, o se usa
Figura 57-4. Células clave" en una extensión de una muestra vaginal. (Tinción
Papanicolau. 400x.) (Por cortesia de Vicki J. Schnadig. M.D., Departamento de
Patología, Universidad de Texas. Rama Médica. Galveston. TX.)
1265
para preparar extensiones para una tinción fluorescente directa de anti-
cuerpos para detectar Chlamydia trachomatis o con tinción Gram para diag-
nosticar gonorrea (la detección de diplococos gramnegativos mtracelulares
en una extensión uretral de hombres sintomáticos nos proporciona un diag-
nóstico de presunción).
Vesículas. Las muestras de lesiones vesiculares en los genitales se
recogen para confirmar la infección por VHS. El líquido de la vesícula se as-
pira con una aguja de pequeño calibre en una jeringa de tuberculina. Si só-
lo hay presente una vesícula pequeña, se corta y la base se raspa con una
torunda Dracon o un depresor para asegurarse de que recogemos las cé-
lulas. El liquido de la vesícula o el exudado debe llevarse en un medio de
transporte adecuado y analizado para cultivo convencional El VHS también
se puede detectar directamente en la muestra por tinción directa de las ex-
tensiones, pero es menos sensible que los cultivos, y si es negativo, debe-
ria hacerse un cultivo. Para hacer una extensión, las células recogidas con
el depresor o torunda Dracon se extienden en el porta de cristal y se fija el
material con acetona. Hay que teñir la muestra con el tinte Papanicolau,
Wright o Giemsa para detectar los cambios citopáticos típicos (Fig. 57-5).
tintes que no distinguirán entre VHS o el virus varicela zóster. o con anticuer-
pos monoclonales.
Úlceras. El material de las úlceras genitales se recoge para identilicar el
patógeno responsable; VHS. Haemophilus ducreyí. Treponema pallidum. Chla-
mydia trachomatis (serogrupos L,, L,, L ) y Calymmatobacterium granuloma-
3
lis deberían ser considerados en el diagnóstico diferencial. El protocolo de
recogida, transporte y análisis de las lesiones ulcerativas para detectar el
VHS es el mismo que para las vesículas. En general, la sensibilidad de los
test directos descritos antes y la recuperación de virus son más bajas en lesio-
nes ulcerativas.
Si hay sospecha de infección por Haemophilus ducreyí, el material de la
base de la úlcera se recoge con dos torundas Dracon o algodón, se lleva en
un medio de Stuart modificado al laboratorio y se deja en una habitación a
temperatura ambiente hasta que se analice. Una muestra se utiliza para pre-
parar una extensión para teñir con Gram. Si observamos muchos bacilos
gramnegativos pleomórficos y cocobacilos organizados en grupos o cade-
nas, es sugerente de H. ducreyí. Sin embargo, el cultivo es más sensible y
es necesario para confirmar. El segundo exudado se inyecta en un medio
especial.
Las espiroquetas de Treponema pallidum pueden detectarse en los geni-
tales u otras lesiones, pero la sífilis por lo general se diagnostica serológi-
camente. Deberían llevarse guantes cuando se manejen muestras obteni-
das de estas lesiones. Para recoger las muestras, se limpia la superficie de
la lesión (si hay varias lesiones, se debe recoger la más reciente) con sue-
ro salino y se deja secar, y se quitan las costras si las hubiera. Raspamos
la lesión superficialmente hasta que sangre un poco y aplicamos una pre-
sión pequeña en la base. El exudado se recoge de la superlicie tocando el
liquido con un porta de cristal o usando una pipeta capilar y pasando el
liquido a un porta de cristal. Se pone un cubreportas y la muestra se exa-
mina inmediatamente al microscopio de campo oscuro. Otro modo es aspi-
rar el material con una aguja de un calibre de 26 de la base, y después se
mete una gota de salino en la aguja. El material se extiende en un porta de
cristal, se cubre con un cubreportas y se examina inmediatamente al micros-
copio de campo oscuro. Las espiroquetas de T pallidum tienen de 10 pm a
13 pm de longitud y 0,15 pm de ancho, tienen una cola ancha y regular y son
puntiagudas al final.
Los serogrupos L,, L^, L, de Chlamydia trachomatis pueden detectarse por
cultivo de células en una biopsia de la lesión ulcerada o del material celular
recogido de quitar primero cualquier exudado de la lesión y después girando
la torunda (en un palo de plástico) contra la base. El transporte y análisis de
las muestras son iguales que para los exudados endocervicales. Para una
detección ideal de Calymmatobacterium granulomatis. se biopsia un tejido
de una zona de granulación activa e inmediatamente se transporta al labo-
ratorio en un recipiente estéril y seco, o en uno que contenga una pequeña
cantidad de salino sin conservantes. Las extensiones se preparan de un tro-
zo de tejido aplastado y se tiñen con Giemsa o tinte de Dieterle. El diagnós-
tico se basa en encontrar C. granulomatis característicos encapsulados den-
tro de los macrófagos.
 1266 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 57-5. Célula giganle mullinucleada con inclusiones inlranucleares por virus
herpes simple en una extensión de células endocervicales. (Tinción de Papanico-
lau, 400x.) (Cortesía de Vícki J. Schnadig, M.D. Departamento de Patología. Uni-
versidad de Texas, Rama Médica. Galveston. TX.)
HECES
Las heces y, en algunos casos, los exudados rectales son útiles para deter-
minar el agente etiológico de la diarrea infecciosa o intoxicación alimentaria,
confirmando el diagnóstico de botulismo, diagnosticando infecciones causa-
das por adenovirus, enterovirus, algunos patógenos de transmisión sexual,
protozoos intestinales y helmintos y, en algunos casos, helmintos de los trac-
tos respiratorio y biliar. La recogida, el transporte y el análisis de estas mues-
tras son diferentes para virus, bacterias y parásitos, y se explican más ade-
lante para cada grupo.
Se prefieren las heces para detectar adenovirus, enterovirus y los virus
responsables de la gastroenteritis. Las muestras se recogen en un recipiente
limpio de tapa ancha. Si no puede obtenerse una muestra de heces, se inser-
ta una torunda a través del esfínter anal, se gira, se saca y se coloca en un
medio de transporte viral que contenga agentes microbianos. Cualquiera de
las muestras debe llevarse pronto al laboratorio, si no se pudiera, tiene que
meterse un rato en el frigorífico y debe llevarse en hielo húmedo. Si hay
que enviar la muestra a un laboratorio de referencia, debe almacenarse a
-70°C y tiene que transportarse en hielo seco.
Se recomienda el cultivo celular para detectar adenovirus y enterovirus,
aunque el test de ELISA es válido para detectar adenovirus. Los rotavirus son
los responsables de la mayoría de las gastroenteritis virales y los únicos virus
que se asocian con gastroenteritis, y que se detectan en muchos laboratorios
virales. Lo más corriente es que los rotavirus se detecten por ELISA; los equi-
pos de aglutinación de látex también son válidos, pero parece que son menos
sensibles (Christensen, 1989). Las muestras se analizan según las indicacio-
nes del fabricante. El examen directo de las muestras de heces en el micros-
copio electrónico es el método de referencia para detectar los rotavirus y es
el que más se usa para detectar calicivirus, astrovirus. el virus Norwalk y los
virus similares al de Norwalk.
Las heces también se prefieren para detectar las bacterias responsables
de la diarrea infecciosa, aunque un exudado rectal es una alternativa válida.
Las muestras de heces tienen que recogerse en un contenedor limpio y de
tapa ancha, y la muestra no tiene que contaminarse con orina, bario o papel
higiénico, Los exudados rectales, que se obtienen como se ha descrito antes
para los virus, se colocan en un sistema de transporte de tubo que contenga
medio Stuart modificado. Ambos tipos de muestras deben transportarse rápi-
do al laboratorio y ser analizadas lo antes posible, porque la bajada del pH
que se produce cuando las heces se enfrían puede inhibir el crecimiento de
algunos patógenos, especialmente Shigella. Si el retraso es inevitable, o hay
que llevar la muestra a un laboratorio de referencia, se recomienda añadir un
conservante, como fosfato tamponador 0.03M. mezclado con un volumen
igual de glicerol.
El análisis de las muestras de heces, o los exudados rectales para
bacterias, se basa en el organismo o grupo de organismos que espera-
mos que estén presentes. Las muestras que se reciben para un cultivo
bacteriano ordinario deben analizarse de modo que se pueda encontrar
Shigella, Salmonella y Campylobacter jejuni/coli. En las instituciones pe-
diátricas, también sería razonable de modo sistemático buscar Aeromo-
nas. Las muestras se colocan directamente en un medio adecuado (véa-
se Cap. 50); de manera alternativa, para detectar C. ¡ejuni/coli. la muestra
se puede filtrar utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,65 pm. y
dejar el filtro en un agar sangre de oveja brúcela o agar chocolate. Las
especies de Aeromonas crecen en el medio utilizado habitualmente para
el cultivo de bacterias de las heces, o de los exudados rectales, pero uti-
lizar un medio selectivo (cefsulodina-irgasán-novobiocina [CIN] que con-
tenga 4 mg/l de cefsulodina mejor que el típico agar sangre de oveja con
C
10 mg/l de ampicilina) incubado a 25 C-30"C puede aumentar la eficien-
cia del screening.
La prevalencia de la gastroenteritis causada por la shiga productora de
toxinas (enterohemorrágica) Escherichia Coli (STEC), Yersinia enterocolilica,
Vibrium cholerae u otras especies de Vibrio o Plesiomonas shigelloides es
baja en la mayor parte de EE.UU.; por tanto, las peticiones específicas para
detectarlo son más eficientes. Como mínimo, las muestras de heces sangui-
nolentas deben analizarse para detectar la STEC, Para detectar la STEC, la
muestra de heces podría inyectarse en agar sorbitol-MacConkey (que contie-
ne un 1% o-sorbitol en lugar de lactosa), que es un medio que diferencia las
STEC de manera aislada, las que no fermentan en sorbitol, de casi todas
las £ coli. que son sorbitol-positivas. Un método más sensible que el cultivo
para delectar STEC es la detección de toxina en las heces o en las heces fil-
tradas (Kehl, 1997).
Cuando se pide aislar Yersinia enterocolilica. el agar CIN se inyecta y se
incuba a una temperatura ambiente. El organismo también puede recuperar-
se inyectando un medio típico para el cultivo bacteriano ordinario (véase
Cap. 50). La placa MacConkey se incuba a 35'C las primeras 24 horas y des-
pués a temperatura ambiente durante otras 24 horas; las colonias de Y. ente-
rocolilica son moradas y del tamaño de una cabeza de alfiler.
Las especies de Vibrio con frecuencia crecen en el medio que se utiliza
habitualmente. pero para recuperarlas mejor se inyecta agar citrato tiosul-
fato sales biliares sucrosa (TCBS) y agua alcalina (para enriquecer). Ple-
siomonas shigelloides también crecen en los medios usados para cultivos
ordinarios, pero como más del 30% de P. shigelloides se aislan en lactosa
fermentada, las colonias no se diferencian lo suficiente para reconocerlas
en este medio, y hacer un screening de todas las colonias no es rentable.
Por esta razón, el cultivo de heces o exudados rectales para P. shigelloides
debe solicitarse de manera específica. El uso de un medio selectivo-dife-
rencial agar inositol sales biliares verdes brillantes es recomendable, pero
no es imprescindible.
Los exudados rectales que vayan dirigidos a detectar Chlamydia tracho-
matis se colocan en un medio de transporte y se llevan rápido al laboratorio,
o se dejan un rato en el frigorífico. Los exudados recogidos para diagnosti-
car gonorrea se tratan como se ha dicho antes para las muestras endocervi-
cales.
Las muestras de heces o el contenido gástrico recogido de personas con
un período de incubación corto de una intoxicación alimentaria deberían
analizarse para Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. El análisis inclu-
ye la preparación y examen de las extensiones teñidas con Gram y culti-
vadas. Como los dos organismos pueden estar presentes normalmente en
la comida, hay que hacer varios cultivos. Se hacen una serie de diluciones
1 2 3 5
de la muestra (10 , 10' , 10' , 10* y 10' ) y se preparan en diluyente de
gelatina tamponada, y 0,1 mi de la muestra sin diluir y cada una de las
muestras diluidas se colocan en colistina ácido nalídixico o agar sangre al-
cohol feniletilico (selectivo para organismos grampositivos). Además, para
mostrar la producción de endoesporas de B. cereus, se mezcla 1 mi de la
muestra original con 1 mi de etanol puro, y la mezcla se deja una hora a
temperatura ambiente. Las diluciones de la muestra se preparan como se
ha dicho antes, y 0,1 mi de cada una, de la muestra diluida y de la de sin
 CAPÍTUIO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EI DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
diluir, se colocan en agar sangre de oveja. Todas las placas se incuban a
35"C-37"C durante 18-24 horas y se cuentan las colonias. La presencia de
10'' CFU ó más de S. aureus o B. cereus por gramo de muestra es signifi-
cativa, especialmente si se encuentra en la mayoria de los individuos afec-
tados.
El diagnóstico clínico de botulismo alimentario y botulismo infantil tiene que
confirmarse detectando Closíridium botulinum. la toxina botulinica o ambos en
las heces. Lo ideal sería recoger 25 ml-50 mi de heces. 15 ml-20 mi de sue-
ro y una muestra del alimento sospechoso. La mayoria de los laboratorios no
están equipados para analizar las muestras de personas con sospecha de
botulismo. En EE.UU., cuando se sospecha un caso de botulismo se debe
notificar a los investigadores del CDC. asegurar el diagnóstico, el tratamiento
e investigar una epidemia potencial.
Las enfermedades asociadas con Closíridium dillicile. tales como coli-
tis seudomembranosa y diarrea por antibióticos, están producidas por las
toxinas que produce el organismo y se diagnostican detectando la toxina
A y B o ambas en heces. Ei método de referencia para detectar la citoto-
xma es el ensayo de cultivo celular. Deben recogerse 25 g (25 ml-50 mi)
de heces líquidas en un recipiente limpio de tapa ancha, y tiene que lle-
varse inmediatamente al laboratorio. La muestra debería analizarse den-
tro de las dos horas de la recogida o dejarla almacenada en el frigorífico.
Para extraer la toxina, aclaramos la muestra de heces por centrifugación
a 2.000 x g durante 20 minutos o a 10.000 x g durante 10 minutos, y se
filtra a través de una membrana de 0,45 pm. Se preparan varias dilucio-
nes y se inyectan a una monocapa de células, que se incuban durante
24-48 horas. Por otra parte, la toxina A o ambas toxinas, la A y la B, deben
detectarse en las muestras de heces por ELISA. Esta técnica parece ser
tan sensible como el cultivo celular y nos proporciona resultados en pocas
horas (Merz, 1993; Whittier, 1993). La sensibilidad de los diferentes test
de ELISA comercializados sin embargo varía (Lyerty, 1998; Fedorko, 1999).
Un test de aglutinación de látex es válido, pero no da resultados fiables
(Lyerly. 1988).
Para estudios epidemiológicos, C. dillicile tiene que aislarse en las heces o
exudados rectales poniéndolo en un sistema de transporte anaeróbico. Como
hay muchas bacterias en las heces, hay que utilizar procedimientos selectivos
para C. dillicile. La muestra de heces se diluye en gelatina tamponada (se
recomienda 1:200). y ambas muestras, la diluida y la no diluida, se inyectan
en un medio selectivo para C. dillicile. como el agar cicloserina cefoxitina fruc-
tosa yema de huevo (CCFA), y se incuban anaeróbicamente 48 horas. C. dil-
licile también puede aislarse de otras formas, por ejemplo, con el método de
selección del alcohol, como se describe para Bacillus cereus. excepto que las
muestras se ponen en un medio selectivo como el CCFA y se incuban anae-
róbicamente.
Closíridium pedringens es una de las causas de una intoxicación ali-
mentaria de larga incubación (7-15 horas después de tomar la comida con-
taminada); también puede causar la diarrea asociada a antibióticos, que es
típica en pacientes ancianos hospitalizados, y enteritis necrotizante. Para
diagnosticar una intoxicación alimentaria causada por C. pedringens tie-
nen que hacerse varios cultivos de heces y transportarse en un medio
anaeróbico El material fecal, tanto el que está tratado con etanol como el
que no está tratado, se diluye como se ha dicho antes para detectar las
bacterias asociadas a una intoxicación alimentaria de periodo de incuba-
ción corto. Las placas de agar de alcohol leniletílico se inyectan y se incu-
5
ban anaeróbicamente durante 48 horas. Un recuento de esporas de 10 o
más por gramo de heces puede ser significativo, sobre todo si se encuen-
tran en las muestras de la mayoria de los individuos. La toxina tiene que
detectarse en la muestra de heces original, pero este test por lo general se
realiza en los laboratorios de referencia. Un criterio similar se utiliza para
diagnosticar la diarrea producida por C. pedringens durante el tratamiento
antibiótico.
En relación con el cultivo bacteriano, las muestras de heces, por lo gene-
ral, se destinan para aislar Mycobaclerium avium complex (principalmente de
pacientes con sida), pero también se pueden aislar Mycobaclerium tubercu-
losis y otras especies de Mycobactehum. Analizar la muestra (de 1 g a 2 g de
heces formadas o 5 mi de heces liquidas) incluye la descontaminación y con-
centración, preparación de extensiones y la inoculación de medio como se
comentó en el Capítulo 53.
1267
Lo ideal para el diagnóstico de parásitos en el laboratorio es el examen
de las muestras de heces para protozoos, parásitos y huevos de helmintos
o larvas. Los laboratorios que realicen esos test deberían tener las condi-
ciones adecuadas para manejar las muestras fecales y un buen microsco-
pio con una escala para medir los organismos encontrados. Para identifi-
car los protozoos intestinales, también se requiere teñir las extensiones
fecales.
La muestra (que por lo general la recoge el paciente) puede recogerse sin
tenerla que fijar, y se llevará al laboratorio si se piden estudios bacterianos y
de parásitos. La muestra de heces reciente debe colocarse en un contene-
dor limpio, seco y de tapa ancha. No debe recogerse de la taza del baño y
no debe contaminarse con orina, aceites, componentes antídíarreicos o con-
traste radiológico. Una vez recogida, la muestra tiene que llevarse inmedia-
tamente al laboratorio. Primero se hacen los estudios bacteriológicos, des-
pués la muestra se pasa al personal que hace los test parasitológicos,
preferiblemente dentro de los 30-60 minutos después de recoger la muestra.
Los retrasos en el análisis dan como resultado la degeneración de trotozoi-
tos de Entamoeba histolytica, que es el único parásito por el que se requie-
re que la muestra sea reciente. Como es posible adquirir una infección en el
laboratorio, se ha cuestionado el uso de muestras frescas para el examen
parasitológico.
Si la muestra fecal se ha recogido sólo para detectar parásitos, puede
fijarse a la vez que se recoge. La muestra se lleva al laboratorio cuando la
persona pueda, y el análisis se hace según la rutina del laboratorio. Hay
varios equipos disponibles comercialmente para la recogida y transporte de
las muestras fecales; la mayoría tienen dos viales, uno con fijador (forma-
lina) para trofozoitos y quistes, y otro con un fijador (solución de Schau-
dinn) más alcohol pohvinilo (PVA) para preparar las extensiones para teñir.
La pregunta de cuántas muestras son necesarias para identificar a todos
los individuos con protozoos intestinales y helmintos aún no tiene respues-
ta. Para el diagnóstico de amebas, se recomienda que se recojan como
mínimo tres muestras en tres días diferentes y que se analicen (Proctor,
1991). Para disminuir el coste, los médicos deben pedir el análisis de una
muestra sólo, porque cerca del 90% de las infecciones se diagnostican en
la primera muestra (Montessori. 1987). Si no se encuentra ningUn parásito
en la primera muestra, se debe pedir una segunda o tercera. Si se reciben
dos o más muestras al mismo tiempo recogidas en días diferentes, deben
evaluarse como una sola (Peters, 1988). Los exámenes de heces de
pacientes que han estado ingresados más de tres días no son útiles (Sie-
gel, 1990).
El análisis de las muestras lecales para parásitos incluye preparar una
solución salina y de yodo (Lugol) y teñir las muestras frescas que se han
recogido recientes (p. ej., aquellas que pueden analizarse dentro de las po-
cas horas de su recogida). A esto le sigue la concentración de quistes y
huevos de helmintos y. al final, la preparación de extensiones para teñir
con el tinte tncromo. Las preparaciones frescas, de realizarse, deberían
analizarse y prepararse antes de hacer la concentración y el tinte tricromo.
Si el diagnóstico está claro con el análisis de la muestra fresca (p. ej„ el
diagnóstico de giardiasis cuando encontramos Giardia en la muestra fres-
ca), no es necesario hacer las otras pruebas. Sin embargo, en muchos la-
boratorios no se analizan las muestras frescas, porque cuando las reciben
ya no están frescas.
La extensión fecal estándar, que tiene cerca de 2 mg de heces, se hace
de una muestra fecal reciente del siguiente modo: se coloca una gota de
salmo en un porta de cristal limpio: con un depresor se coge un poco de las
heces y se mezcla con el suero salino con movimientos circulares (hasta
que haya bastante muestra disuelta), y la mezcla se tapa con un cubre-
portas cuadrado de 22 mm. Una muestra está bien preparada si la dejamos
encima de un pequeño papel escrito y podemos leer a través de la exten-
sión lo que hay escrito. La extensión que teñimos con yodo la preparamos
de la misma manera. Las dos preparaciones frescas, la de la solución sali-
na y la de la solución yodada, pueden hacerse en el mismo porta de cris-
tal, a la vez. mezclando las heces primero con suero salino y después con
yodo. La extensión de solución salina nos mostrará protozoos y quistes de
protozoos, además de los huevos de helmintos y larvas. En la extensión
teñida con yodo no encontraremos Irofozoitos, porque el yodo los destru-
ye, salvo que la muestra se haya fijado primero. La principal ventaja de la
 1268 SECCIÓN VI • MICROBIOLOGÍA MÉDICA
extensión teñida con yodo es que permite visualizar mejor algunas carac-
terísticas de los quistes. La solución salina permite ver el movimiento de
los trofozoitos. que es útil para identificarlos. Para preparar las muestras
frescas del material fijado con formalina, los contenidos se mezclan bien
y se coloca una gota directamente en el porta y en una gota de solución
yodada.
El examen de la extensión hecha con salmo se hace con un aumento me-
dio (objetivo de 10x) al principio. Empezando por el vértice superior izquier-
do, movemos el porta horizontalmente. de derecha a izquierda. Repetiremos
esta operación hasta que terminemos de ver los 22 mm del porta. Debemos
ver todos los huevos de helmintos, larvas y quistes de protozoos. El examen
con el objetivo de gran aumento se hará después para detectar e identificar
los protozoos, mirando aleatoriamente durante unos 5-10 minutos para cada
preparación.
La técnica para la concentración, que puede hacerse tanto en muestras
frescas como fijadas, es muy útil porque permite el enriquecimiento de
muestras con un número bajo de organismos. El método ideal para un exa-
men ordinario es la concentración con éter-formaiina, que se ha hecho más
segura por el uso de etil-acético que con el éter-dietil. El tinte permanente
de la extensión fecal para el diagnóstico de infección por protozoos intesti-
nales se considera el patrón de buena práctica en los laboratorios de Amé-
rica del Norte. Los tintes se hacen en las extensiones preparadas con un
pequeño cepillo mojado suavemente en solución salina y se fijan en solu-
ción Schaudinn antes de secarse. Las extensiones se hacen también de
muestras recibidas fijadas en PVA: utilizando un depresor de madera, colo-
camos unas gotas de muestra en el porta, asegurándonos de que la pelícu-
la toca los bordes del porta, para evitar que se caiga mientras se tiñe. y
ocupa la mitad del porta. Después de que la película se seca completa-
mente a temperatura ambiente, se tiñe. Ciertos parásitos intestinales, como
Cryptosporidium, Microsporidium y Cyctospora, requieren tintes especiales
para detectarlos, como se ha visto en el Capitulo 55.
PIEL Y LESIONES SUBCUTÁNEAS
Vejigas, bullas y pústulas. El liquido de una vejiga o una bulla puede
extraerse con una aguja y una jeringa, y puede inyectarse este líquido a un
tubo estéril. También se puede recoger una muestra de las vesículas y las
bullas cortando la bulla y frotando la base con una torunda. Las muestras
de las pústulas se recogen de modo similar, con una torunda quitando las
costras que haya. Como mínimo hay que recoger dos exudados para pre-
parar las extensiones para teñir. Sin embargo, si lo que piden es buscar
más de un grupo de organismos (p. ej., virus y bacterias, o bacterias y hon-
gos), lo ideal es recoger al menos tres exudados. Ante una sospecha de
infección viral, la persona que recoge la muestra debe preparar una exten-
sión en ese mismo lugar, pasando la torunda por todo el porta y dejándolo
secar al aire.
Todas las muestras tienen que colocarse en unos tubos para el transporte
que contengan medio Stuart modificado. Sin embargo, si se pide una análisis
para virus, se recomienda colocar una torunda en un medio de transporte
viral; y si se pide un cultivo anaerobio, la torunda debe colocarse en un medio
de transporte anaerobio. Los exudados y extensiones tienen que llevarse
inmediatamente al laboratorio.
El análisis de las muestras de vejigas o pústulas para detectar virus inclu-
ye un cultivo celular, y para el virus varicela zóster, y posible VHS. ayuda
también el examen de las extensiones teñidas. Las muestras para cultivo se
dejan en el frigorífico hasta que vayan a analizarse. El líquido que sacamos
con la jeringa de una vejiga, que se recibe en medio de transporte viral, y
los exudados, que se reciben en medio de transporte viral, se agitan en la
mezcladora y se saca la torunda. El análisis de las muestras para detectar
bacterias y/u hongos incluye preparar una extensión para teñir con Gram
(para bacterias) o tinte de plata, calcoflúor blanco o rojo Congo (para hon-
gos) e inyectar en un medio de cultivo adecuado, como se explica en los
Capítulos 50 y 54.
Úlceras cutáneas. Las muestras que se recogen de las úlceras cutáneas,
exudado o aspirado, son para estudios microbiológicos. Las lesiones pueden
ser primarias (p. ej., las causadas por virus. Bacillus anthracis. Corynebacte-
rium diphtheriae, Francisella lularensis, Pseudomonas aeruginosa, micobac-
terias u hongos) o úlceras por decúbito, que pueden ser colonizadas o infec-
tadas con bacterias aeróbicas y anaeróbicas.
La recogida, el análisis y el transporte de los exudados de úlceras cutáne-
as para detectar virus son idénticos a los descritos anteriormente para vejigas
y pústulas. El manejo de las muestras de úlceras cutáneas es diferente para
hongos y bacterias, y se explica de modo separado para cada uno de los
organismos que causa lesiones primarias y para las bacterias asociadas con
úlceras crónicas.
Bacillus anthracis causa ántrax, una enfermedad rara en EE.UU.: se limi-
ta a personas que trabajan con lana importada bruta y otros productos ani-
males contaminados con esporas de B. anthracis. El ántrax cutáneo co-
mienza con una pápula y un dolor, que se convierte en vesicular, después
hemorragia, necrótica, y se cubre con una escara. Para un diagnóstico ade-
cuado, se recogen dos exudados: uno para cultivos y el otro para preparar
extensiones para teñir con Gram y anticuerpos fluorescentes (esto último
debe hacerse en un laboratorio de referencia). Debido a la naturaleza peli-
grosa de B. anthracis. debe considerarse si se mandan las muestras de una
persona sospechosa al laboratorio. Si las muestras se analizan en el labora-
torio, tienen que manejarse en una cabina de seguridad. El exudado que se
va a cultivar se inyecta en un agar sangre de oveja y se deja incubándose a
temperatura ambiente.
Corynebacteríum diphtheriae es el causante de la difteria cutánea, que es
una lesión ulcerativa que se cubre con una capa de tejido necrólico que
semeja a una membrana. Para hacer un diagnóstico real, se prepara una
extensión con material del borde de la membrana, se tiñe con azul de meti-
leno y se recogen dos exudados de la membrana. Una muestra se utiliza
para cultivo ordinario y la otra para inyectar en un medio de cultivo ade-
cuado para C. diphtheriae (expuesto anteriormente en muestras de la gar-
ganta).
El ectima gangrenoso es una lesión cutánea ulcerativa que casi siempre
se produce cuando hay óacteriemia por Pseudomonas aeruginosa, pero rara
vez se desarrolla cuando existe bacteriemia por otros bacilos gramnegativos.
Lo ideal es recoger dos muestras de la base de la úlcera: una se utiliza para
preparar una extensión con tinción Gram y la otra para inyectar en medio de
cultivo.
Para hacer el diagnóstico de la forma úlcero-glandular de tularemia es ne-
cesario recoger dos exudados de material de la base de la úlcera. Uno para
cultivo ordinario y el otro para detectar Francisella lularensis, o para enviarlo
a un laboratorio de referencia.
Las micobacterias que podemos aislar son: Mycobacterium tuberculosis.
Mycobacterium avium complex. Mycobacterium kansasii. Mycobacterium lor-
tuitum-cheionae. Mycobacterium marinum, Mycobacterium haemophilum y
Mycobacterium ulceraos. El exudado recogido con aguja y jeringa es válido
para recuperar las micobacterias. Para transportar el material, se mete den-
tro de un tubo estéril, que se cierre bien, y se lleva pronto al laboratorio. No
es recomendable recoger el exudado con una torunda de algodón, porque
las micobacterias se quedan atrapadas en las fibras y es difícil sacarlas. Las
muestras tienen que guardarse en el frigoríficopoco tiempo hasta que sean
analizadas (véase Cap. 53).
Muchas bacterias aeróbicas, facultativas, y anaeróbicas colonizan las úlce-
ras cutáneas crónicas, Para identilicar el organismo responsable, el cultivo de
los tejidos profundos o una aspiración profunda de material purulento recogi-
do con aguja y jeringa nos proporciona la información bacteriológica más útil.
Para transportar el pus aspirado, lo colocamos en un tubo estéril, lo tapamos
bien y se lleva inmediatamente al laboratorio. El proceso de la muestra inclu-
ye preparar una extensión para teñir con Gram e inyectar en el medio adecua-
do para cultivo de aerobios y anaerobios.
Para detectar hongos, basta con un exudado del margen activo de la úlce-
ra (el transporte es como para las bacterias). El exudado con torunda de al-
godón es válido, aunque debería descartarse esta práctica. Analizar las mues-
tras para detectar hongos incluye preparar una extensión para examen
microscópico directo (preparación de hidróxido de potasio o los lintes seña-
lados para las muestras de vesículas y pústulas) y la inyección en un medio
de cultivo adecuado, tal como infusión cerebro-corazón, inhibidor de moho o
agar Shabi, que contiene antibióticos y cicloheximína.
 CAPÍTULO 57 • MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Heridas infectadas y abscesos. Lo ideal es aspirar el material purulen-
to con aguja y jeringa y transportarlo como se ha dicho para las lesiones ulce-
rativas. Si no se puede aspirar de la herida, es válido un exudado recogido de
la parte prolunda de la lesión. Para el cultivo ordinario, nos valen dos mues-
tras; una para preparar una extensión y teñir con Gram y otra para cultivo. Pa-
ra encontrar anaerobios, debe recogerse un exudado más y ser colocado en
un sistema de transporte anaerobio. Todas las muestras tienen que llevarse
pronto al laboratorio y ser analizadas lo antes posible. Si el retraso es inevi-
table, hay que poner las muestras en el frigorífico- excepto las de anaerobios,
que hay que dejarlas a temperatura ambiente.
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 S E C C I Ó N V I

Patología molecular
Chester J. Herman, M.D., Ph.D.
John Bernard Henry, M.D.
 CAPÍTULO
Introducción a la patología molecular
• Chester J. Herman, M.D., Ph.D.
• John Bernard Henry, M.D.
REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD 1273
FARMACOGENÓMICA Y TERAPIA GÉNICA 1273
ANÁLISIS DE DATOS 1274
Hace algunos años, la revista Time publicó un reportaje con una ilustración
en portada del viejo simboto de la profesión médica, el caduceo, transfor-
mándose en una doble hélice de ADN. y encima el titulo "El Futuro de la
Medicina'. Articulos como este, en la prensa de información general, son un
ejemplo de cómo el público no profesional reconoce lo que la profesión médi-
ca sabe desde hace algún tiempo que los avances de la biología molecular y
de la genética están transformando todas la áreas de la medicina, y que estos
avances aumentarán y se comedirán en el paradigma predominante de la
ciencia médica en el siglo xxi. La patología se encuentra ahora a la vanguar-
dia de esta transfonvación. Las técnicas moleculares ya han revolucionado,
en muchas áreas, los diagnósticos de laboratorio y han ampliado enorme-
mente los horizontes para ejercer la patología social y la académica. La revo-
lución es tan global y tan profunda como lo es el último gran avance de la
patología, la inmunobiologia. ya que las técnicas moleculares se aplican a
todas las secciones del laboratorio. Y lo que es más impoñante. prometen
liberar a la anatomía patológica de su dependencia de los análisis morfológi-
cos. El advenimiento de esta nueva tecnología, aunque quizás intimide a
algunos patólogos de formación clásica, debería ser bienvenida por su con-
moción científica intrínseca, por su promesa de rejuvenecer la práctica de la
patología tradicional y de lanzarla hacia nuevas direcciones, y por su auténti-
co potencial para hacer que la patología sea la especialidad médica preemi-
nente en la nueva era de la medicina molecular, según avanzamos en el
nuevo milenio.
/Adaptado con el permiso de Wayne W. Grody. M.D.. Ph.D.)
La patología molecular se aplica a los análisis de los ácidos nucleicos para
diagnosticar enfermedades, para predecir el pronóstico de la enfermedad,
conducir la terapia y para evaluar la susceptibilidad a la enfermedad antes de
que ésta se haga evidente.
A pesar del poder de las técnicas patológicas moleculares y del hecho de
que proporcionan nuevos puntos de vista, que antes eran imposibles, éstas
son complementarias a los análisis tradicionales del laboratorio, no una sus-
titución en la mayoria de las aplicaciones. Las aplicaciones significativas y las
interpretaciones seguras de la mayoría de las técnicas moleculares requieren
que éstas se establezcan sobre una base firme de aplicación de las determi-
naciones bien establecidas del laboratorio. Quizá, el mejor ejemplo de que
estas lécnicas son complementarias es el hecho de que se deben emplear las
técnicas morfológicas, la histopatologia y la citopatologia para garantizar que
los lejidos y las células apropiadas se analizan molecularmente. De otro
modo, el análisis de lo que no sean tejidos o células diana puede conducir y
conducirá a resultados erróneos y, a veces, a engaños peligrosos, a pesar de
los métodos técnicos de alta calidad, que se interpretan con pericia y expe-
riencia.
58
GARANTÍA DE CALIDAD 1274
BIBLIOGRAFÍA 1274
REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD
La disponibilidad de la secuencia del genoma humano y la identificación de
todos los genes humanos han cambiado rápidamente nuestra forma de en-
tender la salud, la susceptibilidad a la enfermedad y los precursores, y la
enfermedad (Pandey, 2000) La capacidad para identificar el patrón de expre-
sión génica que hace única la entidad de una enfermedad permite luego al
patólogo definir especialmente enfermedades clínicamente diferentes, que
pueden ser difíciles o imposibles de distinguir, basándose sólo en la morfolo-
gía o en otros datos del laboratorio (Heller, 1997; Golub, 1999). También se
delmen, más claramente, las relaciones entre las enfermedades, y a veces
cambian radicalmente, comparando los perfiles de expresión génica de las
enfermedades (Anbazhagan. 1999).
En la dirección opuesta, la secuenciacion de los genes causantes de una
enfermad y los análisis de las mutaciones demuestran que las enfermedades
tienen formes ¡rustes no reconocidos previamente y que pueden incluir com-
plejos de síntomas leves que no se han reconocido previamente de lorma ais-
lada como síntomas de la enfermedad. Un ejemplo convincente de este aumen-
to tan acusado de los síntomas de los que se compone la enfermedad es la
fibrosis quistica (Friedman. 1999). Además de las disfunciones pulmonares y
pancreáticas, leves y agudas, que están aceptadas desde hace mucho tiempo
como fibrosis quistica, se han asociado ejemplos aislados de la ausencia con-
genita bilateral de los vasos deferentes, la pancreatitis crónica y las dolencias
sinopulmonares a las mutaciones del gen de la fibrosis quistica (FCRT). Estas
son mutaciones frecuentes no asociadas a la forma clásica y aguda de la enfer-
medad. Reconocer que los complejos de síntomas expanden la definición de
las enfermedades sobre la base de las mutaciones de los genes, enfocará el
tratamiento apropiado del paciente, en las formas más leves o alípicas de la
enfermedad, y definirá la patobiologia, no sólo de los genes enteros sino tam-
bién de los exones y de los intrones específicos afectados.
FARMACOGENÓMICA Y TERAPIA GÉNICA
Los genes y las regiones no codificantes de los genomas tienen tales poli-
morfismos que en el genoma humano 1 de cada 1.000 pares de bases (pb)
aproximadamente es distinto entre individuos diferentes. La secuenciación de
partes del genoma demuestra que algunos de estos polimorfismos están en
genes cuyas funciones son importantes en la respuesta a la terapia de algu-
nos pacientes individuales (Evans, 1999). Los genes de las enzimas metabo-
lizadoras de fármacos, activadores o mactivadores. y los genes de ligandos y
receptores pueden mostrar poliformismos que disminuyen o aumentan los
efectos terapéuticos o la toxicidad de los fármacos que ya son ampliamente
 1274 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
utilizados; esto explica algunas respuestas de hipersensibilidad que no se
conocían o que no eran previsibles con anterioridad. Según se correlacionan
e identifican más polimorfismos con la respuesta individual de los pacientes al
tratamiento, el patólogo necesitará perfilar los polimorfismos corrientes en los
pacientes que empiezan una terapia para enfermedades frecuentes, como la
diabetes, la hipertensión, el cáncer y las infecciones. La definición del labora-
torio de cada genotipo/fenotipo individual de los pacientes determinará los fár-
macos específicos y las dosis adecuadas para ese paciente. Esta evolución
sitúa al patólogo en una posición más definitiva para determinar la terapia
apropiada que el pronóstico tradicional de la evolución de la enfermedad,
basado en la morfología de las lesiones o en las características del cultivo de
los organismos infecciosos.
Más allá de las alteraciones en genes individuales, los patrones de sobre e
infraexpresión de muchos genes definen un perfil relacionado, en algunas
enfermedades, para responder o resistirse a las terapias especificas. Además,
los genes afectados pueden no estar directamente relacionados con las rutas
metabólicas involucradas en la terapia afectada (Bubendorf, 1999).
Del mismo modo, el laboratorio de patología verifica el éxito de la terapia
génica. Después de que se introduce un gen, el tejido en el que el gen debe
ser activo tiene que ser monitorizado para la expresión normal del gen intro-
ducido y para la (unción y estructura normales del producto génico. Es muy
importante señalar que el laboratorio de patología debe monitorizar también
la integración correcta de los genes transfectados, de modo que la integración
permita la expresión normal del gen y no produzca una función y estructura
anormales en los otros genes del paciente.
ANÁLISIS DE DATOS
Para capitalizar al máximo el poder de la patología molecular, se están des-
arrollando propuestas, completamente nuevas, para el análisis de datos y
para los datos relativos a los tratamientos de las enfermedades. La investiga-
ción patológica de la enfermedad y la biología básica han relacionado y ana-
lizado, tradicionalmente, sólo uno o unos pocos marcadores, como los antí-
genos, las enzimas, las proteínas estructurales y cosas por el estilo. Las téc-
nicas moleculares producen datos de muchos miles de genes, tanto de sus
expresiones como de sus secuencias. El procesamiento de todos estos datos,
organizarlos en perfiles de enfermedades o de pacientes, y el relacionar los
diferentes perfiles exige nuevas propuestas de la bioinformática. Estas pro-
puestas requieren también que el patólogo trabaje más estrechamente con
los matemáticos y que aprenda a utilizar herramientas analíticas más sofisti-
cadas que las utilizadas tradicionalmente (Bitner, 1999).
GARANTÍA DE CALIDAD
Como con todos los métodos del laboratorio, es necesario contar con pro-
gramas de garantía de calidad para asegurar que los resultados de la patología
molecular son exactos y útiles. Dos componentes esenciales de los programas
de garantía de calidad son la estandarización de los métodos y la comparación
de los resultados de los análisis entre laboratorios. El National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha publicado los métodos estandariza-
dos para realizar los análisis clínicos de patología molecular más comunes. La
utilización de las directrices del NCCLS garantiza que los datos generados en
los laboratorios de patología molecular son el estándar de una práctica exce-
lente. La comparación entre laboratorios de la realización de los análisis la pro-
porciona el College of American Pathologists (CAP) (www.cap.org). Los exá-
menes de las comparaciones entre laboratorios del CAP incluyen las aplicacio-
nes de la microbiología molecular, de la genética, de la hematología, de pater-
nidad e identidad y de las forenses en general.
Si el patólogo aplica los estándares de garantía de calidad y utiliza las téc-
nicas patológicas conociendo a fondo su fuerza y su debilidad, respectiva-
mente, como se detalla en los siguientes capítulos, seguirá capitalizando las
oportunidades que ofrecen estas técnicas para mejorar la atención al pacien-
te y para comprender la patobiologia básica.
En resumen, la patología molecular está penetrando e impregnando el
laboratorio clínico en su conjunto, igual que lo hizo la inmunopatologia hace
dos décadas. Se seguirán rompiendo y disolviendo las barreras y los límites
sectoriales en esta transformación de la medicina de laboratorio a través del
impacto de la nueva biología de la medicina, "la biología celular y molecular".
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Diagnósticos moleculares:
técnicas y principios básicos
• Elizabeth R. Unger Ph.D., M.D.
• Margaret A. Piper, Ph.D., M.P.H.
BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE
LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 1275
Estructura y composición molecular
Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos
Replicación del ADN
Transcripción del ADN a ARN
Modificación postranscripcional
Traducción de ARN a proteínas
Control transcripcíonal
Mecanismos de reparación del ADN
Mutaciones del ADN
ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 1280
Separación electroforética
Hibridación del ácido nucleico
Los ácidos nucleicos son las moléculas clave de la vida. El ácido desoxirri-
bonucleico (ADN) reside en las células eucariotas y conserva toda la infor-
mación necesaria para la conservación del organismo, y transfiere esa in-
formación a las generaciones sucesivas. El ácido ribonucleico (ARN) lleva la
información del ADN al citoplasma de una célula y dirige la síntesis de las pro-
teínas que se necesita para la función del organismo. De la estabilidad del
ADN y de la duplicación exacta del ADN y su traducción a proteina depende
el estado de salud normal. La biología celular moderna busca determinar los
mecanismos básicos de la función y de la estructura de la célula, y los estu-
dios se enfocan cada vez más a nivel del gen, las unidades del ADN que codi-
fican proteínas. Como consecuencia de esto, los métodos de diagnóstico se
dirigen también hacia la evaluación de los ácidos nucleicos. El objetivo de
esle capitulo es el de proporcionar la estructura conceptual para las aplica-
ciones diagnósticas de los análisis de los ácidos nucleicos.
BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE
LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
La bioquímica de ácidos nucleicos es muy importante para la biología celu-
lar moderna y dicta muchos aspectos de las aplicaciones diagnósticas. Mu-
chas de las enzimas asociadas con la reparación, la degradación y con la sín-
tesis de ácidos nucleicos in vivo se han convertido en herramientas básicas
del laboratorio para la manipulación y el análisis del ADN y del ARN. Los me-
canismos celulares que actúan para dirigir y controlar la traducción, la trans-
cripción y la replicación del ADN dirigen la biología básica de la célula en la
salud y en la enfermedad. La investigación, el diagnóstico y la terapia se diri-
gen, cada vez más, al nivel molecular de la (unción de la célula. Para com-
prender las aplicaciones diagnósticas actuales de la biología molecular se
necesita una visión general de los aspectos de la biología y la bioquímica del
ácido nucleico, que se describen en esta primera sección. Hay más detalles
disponibles en los libros de texto de biología celular (Alberts, 1994).
CAPÍTULO 59
Ensayos de hibridación: componentes básicos
Formatos de ensayos de hibridación
Métodos de amplificación
Ensayos basados en los polimorfismos de
la longitud de los fragmentos de restricción
RELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LA
EVALUACIÓN DEL LABORATORIO 1286
Diagnóstico molecular
Más allá del diagnóstico
BIBLIOGRAFÍA 1286
Estructura y composición molecular
El ADN es una molécula polimérica de doble hebra (dsDNA). larga, que
existe predominantemente en forma de doble hélice dextrógira. Cada molé-
cula de ADN de una hebra (ssDNA) está compuesta de un número pequeño
de monómeros. El esqueleto del polímero del ssDNA es el azúcar desoxirri-
bosa. que está unida por grupos fosfato (Fig. 59-1A). Los enlaces fosfodiés-
ter entre el carbono 3' de un residuo de azúcar y el carbono 5' del siguiente
le dan al esqueleto su estructura invariable y su direccionalidad 5' a 3'. Uni-
da al carbono 1' de cada azúcar está una de las cuatro bases posibles: la timi-
na (T) y la citosina (C) (pirimidinas); la adenina (A) y la guanina (G) (purinas).
Las bases pueden aparecer en cualquier orden secuencial y por eso forman
la porción variable del ssDNA. Los monómeros del polímero de una hebra son
los cuatro deoxirribonucleótidos trifosfato (dTTP. dCTP dATP, dGTP). cada
uno se compone de una base, un trifosfato y una molécula de azúcar. Duran-
te la síntesis del ADN los nucleólidos se desprenden primero de dos grupos
fosfato y luego se unen enzimáticamente por dos enlaces fosfodiéster para
formar una cadena.
El ADN es una molécula extraordinariamente estable que sólo pierde su
conformación normal por altas temperaturas, por el pH o en presencia de
agentes desestabilizadores. La hélice de doble hebra es el estado más
energéticamente favorable para el ADN. y el examen de los componentes
del ADN explica este hecho. El azúcar y los grupos fosfato son hidrofílicos,
en solución forman enlaces de hidrógeno estables con las moléculas de
agua circundantes. Sin embargo, las bases son hidrofóbicas y no son solu-
bles en agua a un pH normal. Una molécula estable de ADN debe asegu-
rarse que las bases no entran en contacto con el agua. Esto es posible
cuando dos polímeros ssDNA antiparalelos (uno va en dirección 3 a 5 y
el otro en dirección 5' a 3) giran alrededor del mismo eje. Esta ordenación
permite la formación de los enlaces de hidrógeno planares entre la adeni-
na y la timina y entre la guanina y la citosina (Fig. 59-18). Mientras que las
dos cadenas tienen secuencias de bases en orden complementario, las
 1276 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR

l'IKIMIIMWs I'LKINAS

Citosina Guanina

Figura 59-1. Estructura repetida de ADN y pares de bases complementarios. A. Una cadena de ADN de una sola hebra. Las unidades de nucleótidos reoetidas son uni-
das por enlaces toslodiéster que unen al 5 -carbono de un azúcar al 3 -carbono de la siguiente. ('En el ARN el azúcar es nbosa. que tiene un 2 -hidroxilo añadido a la des-
oxirribosa). S. Bases de purina y de pirimidina y la lormación de pares de bases complementarios Las rayas sombreadas indican la formación de enlaces de hidrógeno.
("En el ARN la timina es reemplazada por uracilo. que se diferencia de la timina en que le falta el grupo metilo) (Adaptada y por cortesía de Piper MA, Unger ER: Nucleic
Acid Probes: A Primer lor Pathologists. Chicago, ASCP Press. 1989.)

hebras de la hélice tienen una estructura parecida a una escalera con pel- matina) de forma altamente estructurada. La estructura del cromosoma in-
daños (pares de bases [pb]) de tamaño consistente. La flexibilidad de los cluye varios niveles jerárquicos de cromatina empaquetada, de un nucleo-
enlaces entre moléculas de oxigeno y carbono en el enlace fosfodiéster soma "como cuentas en un collar" (146 pares nucleótidos enrollados alre-
permite que la escalera se enrolle, formando una hélice regular, de modo dedor de un núcleo de histona) a asas altamente condensadas. cada una
que los pares de bases planares se quedan apilados uno encima de otro y de las cuáles contiene alrededor de 100.000 pb de ADN. Cada núcleo de
no dejan sitio intermedio para las moléculas de agua. Las series poliméri- célula humana contiene 23 cromosomas de longitud característica y se-
cas de enlaces de hidrógeno en los pares de bases mantienen las cade- cuencia de pares de bases única. Estos cromosomas juntos constituyen el
nas de ssDNA fuertemente unidas, y la conformación helicoidal protege a genoma humano.
los pares de bases del agua, quedando expuestos sólo los esqueletos hi-
drofílicos.
El dsDNA es estable sobre un límite de pH de 4-9 aproximadamente. Las
soluciones con pH fuera de estos limites son capaces de romper los enla-
ces entre pares de bases y pueden ser la causa de que la hélice de ADN se
desnaturalice o se desenrolle en dos rizos separados al azar. También tie-
nen el mismo efecto las altas temperaturas y los disruptores de los enlaces
de hidrógeno, como la formamida. La transición de la forma hélice a la for-
ma rizo puede ser seguida espectrofotométricamente a A (Fig. 59-2). A
26ü

esa longitud de onda las bases absorben al máximo la luz ultravioleta, pero
a una absorbancia molar menor en el dsDNA: cuando el dsDNA se convier-
te en ssDNA, la absorbancia aumenta de un 20% a un 30%. Debido a que
a menudo se utiliza la temperatura para efectuar esta transición, a este pro-
ceso se le denomina fusión, y a la temperatura a la cual se convierte el 50%
del dsDNA en ssDNA se le llama punto de fusión o T. del ADN. La T„ de las
moléculas de ADN depende del contenido de pares de bases G-C frente a
A-T relativo, ya que los tres enlaces de hidrógeno de los pares de bases
G-C precisan más energía para romperse que los dos enlaces de hidróge-
no de los pares de bases A-T. Se puede revertir el proceso de tusión bajan-
do la temperatura, así las dos hebras complementarias pueden rehacer la
hélice original si se reforman los pares de bases en la conformación lineal
correcta.

La longitud de una molécula de ADN eucariótica es mucho más larga que

la célula misma. El ADN purificado y no degradado forma una solución visco-
sa astringente que refleja la enorme longitud del ADN genómico (Fig. 59-3).
Sin embargo, In vivo, el ADN se organiza en unidades regulares, altamen-
te compactas, que se llaman cromosomas. Un cromosoma se compone de
su hebra de ADN enrollada alrededor de proteínas asociadas al ADN (cro-
'Icmperaliira I (.')
Figura 59-2. Curva de anillamienlo y fusión del ácido nucleico helicoidal de doble
hélice. (Adaptada de Pioer MA. Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer lor Patho-
logists. Chicago. ASCP Press, 1989, con autonzacion.)
 CAPÍTULO 59 • DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS 1277

Tabla 59-2 E n z i m a s de ácido nucleico y funciones asociadas

Enzima F u n c i ó n in vivo
Polimerasas Las polimerasas mantienen unidos a los
Polimerasas de ADN nucleótidos de ADN o ARN para formar
Polimerasas de ARN una molécula hija de una sola hebra,
utilizando como molde el estiramiento de
una molécula padre de una sola hebra
Estas enzimas ejecutan la síntesis de
acuerdo a las reglas de los pares de
bases y actúan en la dirección 5 a 3
Transcnptasa inversa La transcriptasa inversa, que se encuentra
sólo en los virus, cataliza la síntesis del
ADN. tanto de un molde de ARN como
de uno de ADN
ADN ligasas Unen los fragmentos de ADN formados por
las síntesis discontinuas en la replicación
del ADN o por las vías de reparación del
ADN.
Nucleasas
DNasas, RNasas Las nucleasas "digieren" las moléculas de
ácido nucleico por medio de la rolura de
los enlaces foslodiéster
Endonucleasas Las endonucleasas digieren los ácidos
Exonucleasas nucleicos del centro de la molécula
mientras que las exonucleasas empiezan
en un extremo libre y pueden necesitar
un extremo 3 o uno 5 Las nucleasas
pueden tener la especificidad de una
sola hebra, de doble hebra de ADN o de
ARN Algunas polimerasas tienen
actividad nuclear.
Endonucleasas Son endonucleasas bacterianas que
de restricción reconocen secuencias de pares de
Figura 59-3. Fologralia de ADN purificado que demuestra la naturaleza viscosa bases de ADN cortas específicas y
astringente del ADN genómico recortado mínimamente. rompen la molécula de ADN
sólo en el sitio de reconocimiento.

El ARN difiere del ADN en su función, en estructura y en composición quí- funcionamiento para dirigir la síntesis de las proteínas necesarias. El ADN se
mica (Tabla 59-1). En el ARN. el azúcar es ribosa. que contiene un grupo debe degradar durante la reparación de los segmentos dañados y el ARN
hidroxilo en la posición 2' y se sustituye la timína por uracilo metilado (U). El se está degradando y resmtetizándose continuamente. Estas y otras funcio-
ARN sólo existe como una molécula monohebra y de longitud mucho más cor- nes se ven afectadas por las enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos.
ta que el ADN. La estructura del ARN es mucho más irregular, por la natura- La Tabla 59-2 enumera las principales categorías de enzimas específicas de
leza monohebra de la molécula, pero puede contener algunas secciones heli- los ácidos nucleicos y sus funciones in vivo. Para el biólogo molecular, las
coidales. Las moléculas de ARN con la misma secuencia de bases, sin enzimas purificadas in vitro se han convertido en herramientas de laborato-
embargo, formarán la misma estructura tridimensional como resultado de rio, haciendo posible la ingeniería genética y muchos ensayos de ácidos
adoptar la conformación más favorable energéticamente. El ARN es mucho nucleicos.
menos estable que el ADN. debido no sólo a la estructura monohebra, más Las enzimas especificas de ácido nucleico incluyen a las polimerasas. que
azarosa, sino también a su susceptibilidad a la hidrólisis alcalina vía el grupo catalizan la formación de enlaces fosfodiéster durante la síntesis: y las nu-
de hidroxilo 2 de la ribosa. El ARN también se degrada rápidamente por enzi- cleasas. que hidrolizan estos enlaces. Las nucleasas especificas de ARN
mas específicas de ARN que son ubicuas. (RNasas) están virtualmente presentes en todos los sitios, lo que hace mucho
más difícil trabajar in vilro con ARN que con ADN. Las endonucleasas de res-
tricción son una categoría especial de nucleasas y se encuentran sólo en bac-
Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos
terias, donde su función es destruir el ADN extraño. Las dianas de reconoci-
El ADN se debe duplicar antes de la división celular para que las células miento de las enzimas de restricción están situadas dentro de las moléculas
hija retengan una copia exacta de la información genética contenida en los del ADN. no en uno u otro extremo, son de secuencia especifica y su longitud
cromosomas paternos. El ARN debe ser sintetizado por todas las células en puede variar, aproximadamente, de 4 pb a 12 pb. Las enzimas de restricción
generan cortes específicos asimétricos o romos en la secuencia de reconoci-
Tabla 59-1 C o m p a r a c i ó n de las características clave del ADN y miento (Fig. 59-4). En las siguientes secciones se verán las funciones ¡n vivo
del ARN y la utilidad in vitro de muchas de estas enzimas.
Característica ADN ARN
Azúcar Desoxirribosa Ribosa
Replicación del ADN
Pares de bases Timina-adenma Uiacilo-adenma
Citosina-guanina Citosina-guanina El proceso de duplicación del ADN, conocido como replicación semicon-
Estructura Doble hebra Una sola hebra
servativa. utiliza cada hebra de la molécula progenitora para dirigir la sínte-
Hélice-a Al azar (véase texto)
Estabilidad Estable Expuesto a hidrólisis de sis de una hebra hija (Virshup. 1990). Ya que la secuencia base de la hebra
base progenitora ordena la secuencia de la hebra hija, la replicación es exacta y
Se degrada con DNasa Se degrada con RNasa el producto de la replicación son dos moléculas de dsDNA. compuestas cada
Función Mantiene la información Lleva la información una de una hebra progenitora y una hebra hija con la misma y exacta
genética en el núcleo genética al secuencia de pares de bases. Aunque el concepto es simple, el proceso es
citoplasma complicado e involucra a un número de enzimas y proteínas accesorias.
 1278 SECCIÓN VII • PATOLOGIA MOLECULAR
Figura 59-4. Ejemplos de enzimas de restricción de ADN y sus especificidades. A
las enzimas se las denomina como a las bacterias de las que son aisladas (don-
de N es cualquier base y N' es su pareja).
Para que la síntesis comience, primero hay que producir una pequeña región
de una hebra. Esto no es favorable energéticamente y se debe efectuar con
proteínas que desenrollen y separen las hebras de la hélice. A continuación
se sintetiza un oligonucleótido corto de ARN complementario a la secuencia
de una hebra. La polimerasa III de ADN actúa con la síntesis del ADN y más
tarde el oligonucleótido se corta y se sustituye con ADN por la polimerasa I
de ADN. El ADN del cromosoma contiene muchos sitios de inicio para la
replicación y este proceso se produce simultáneamente a través del cromo-
soma. La polimerasa III de ADN es una enzima direccional y sólo puede sin-
tetizar ADN en dirección 5' a 3', ya que requiere una terminación ЗОН libre.
Esto significa que puede ser sintetizada continuamente sólo una hebra hija,
denominada hebra lider. La otra hebra, denominada hebra recesiva, es ce-
bada por primasa de ARN, que no requiere una terminación ЗОН libre. Se sin­
tetiza discontinuamente en fragmentos cortos (fragmentos Okazaki) según
se abre la burbuja de replicación. Entonces, estos fragmentos son unidos por
la ligasa de ADN. La polimerasa III de ADN es también única, porque tiene
actividad exonucleasa y es a prueba de fallos de lectura. Si se añade un nu-
cleótido incorrecto a la cadena en crecimiento, es detectado y cortado por la
porción nucleasa de la enzima y entonces se añade el nucleótido correcto.
Esto ayuda a explicar la fidelidad extraordinaria del proceso de replicación
del ADN. Los mecanismos de reparación postsíntesis también contribuyen a
la exactitud de la replicación (véase más adelante en Mecanismos de repara-
ción del ADN).
Transcripción del ADN a ARN
A las secciones de ADN que especifican secuencias de aminoácidos de
proteínas se las denomina genes; un gen contiene el código de la secuencia
de aminoácidos para una proteína, así como las secuencias de ADN necesa-
rias para regular la producción de esa proteína. Aunque las secuencias codi-
ficadoras de genes son de suma importancia para la célula y para la función
del organismo, como un todo, la gran mayoría del genoma humano no está
compuesto por genes. Sin embargo, no son bien conocidas las funciones de
las regiones no codificadoras del ADN. A veces a estas secuencias se las de-
nomina ADN basura, pero es más que probable que desempeñen funciones
estructurales u otras, como permitir que se produzca la recombinación, que
aún no han sido descubiertas.
La síntesis de la proteina comienza con la activación del gen apropiado.
Una copia del gen está hecha de ADN en forma de ARN. Debido a que la
copia ARN lleva el código del ADN en el núcleo de la célula al citoplasma don-
de se produce la síntesis de los aminoácidos, este tipo de ARN recibe el nom-
bre de ARN mensajero (ARNm). El ARN mensajero se sintetiza solamente de
una hebra del gen del ADN; no se utiliza la hebra del ADN complementaria.
Esto se realiza por medio de un proceso que se denomina transcripción. La
síntesis de ARNm se hace de idéntica forma que la replicación de ADN, con
la secuencia de ssDNA ordenando la secuencia ARNm que utiliza las mismas
reglas de complementariedad de pares de bases (pares de bases de uraci-
lo con adenina). Cuando se alcanza el fin del gen, se termina la síntesis de
ARNm.
Modificación postranscripcional
La molécula de ARNm se modifica de varías formas antes de enviarla al
citoplasma (Rosenthal. 1994). El ARN mensajero contiene secuencias codifi-
cadoras de aminoácidos (exones) y secuencias no codificadoras (intrones);
los intrones son cortados de la molécula de ARNm antes de la síntesis de pro-
teínas. Un complejo molecular denominado maquinaria de procesamiento
(Sharpe, 1988), que está compuesto de ARN de bajo peso molecular y de pro-
teina. reconoce las secuencias del ARNm que identifican los límites de un
intrón. une a los exones flanqueantes y libera al intrón. El procesamiento debe
ser exacto, ya que la suma o la resta de un solo nucleótido en la unión de pro-
cesamiento podría cambiar el marco de lectura de 3 nucleótidos en las si-
guientes secuencias de nucleótidos.
Otras modificaciones de la molécula de ARNm incluyen la suma de resi-
duos de 7-melil-guanosina al extremo 5' en un único enlace 5-5' fosfodiés-
ter. A esto se le llama un cap. que ayuda a unir el ribosoma a la molécula de
ARNm para iniciar la síntesis de proteínas. Al extremo 3' se le añade una cola
de poli-A, que puede ser necesaria para la estabilidad y el transporte al cito-
plasma. La señal de poliadenilación es especificada, en parte, por la secuen-
cia AAUAAA, que está, por lo general, en la región 3' no traducida de la trans-
cripción del ARN. En este punto, la molécula de ARNm está preparada para
dirigir la síntesis de su proteína correspondiente.
Traducción de ARN a proteínas
La síntesis de proteínas necesita traducir el lenguaje de los nucleótidos
al de los aminoácidos. Se utilizan 21 aminoácidos diferentes en la síntesis de
proteínas; cada aminoácido es especificado por uno o más tripletes de nucle-
ótidos del ARNm. denominados codones. Debido a que un aminoácido puede
ser codificado por más de un codón. al código se le conoce como código de-
generado. Por ejemplo, AAG es el codón para lisina y UCG es el triplete para
serina. Por tanto, la secuencia que codifica un aminoácido se lee en grupos
de tres nucleótidos que van en dirección 5' a 3': este es el marco de lectura
de una secuencia que codifica proteínas. Tres codones específicos no codifi-
can para aminoácidos, sino que señalan el extremo de un gen (codones de
parada).
La traducción del código de nucleótidos de ARNm a proteínas es mediada
por ribosomas en el citoplasma de la célula. Un ribosoma se une al extremo 5'
del ARNm y proporciona un ambiente químico estable para todas las molécu-
las involucradas en la síntesis de proteínas. Los aminoácidos son unidos en la
secuencia correcta por la acción de pequeñas moléculas de ARN adaptadoras.
denominadas ARNs de transferencia (ARNt). Cada molécula ARNt contiene
una región que es complementaria de un codón ARNm especial: el anticodón.
El aminoácido que corresponde al codón ARNm complementario del ARNt está
unido a un extremo del ARNt. Un ARNt con el anlicodón complementario
correcto se une al primer codón en la secuencia de ARNm. que siempre es
AUG. Cuando otro ARNt específico se une al codón siguiente, las enzimas
ribosómicas catalizan la formación de un enlace peptidico entre los dos ami-
noácidos unidos al ARNt, eliminando la unión entre el primer aminoácido y su
molécula ARNt. El primer ARNt se desprende del hbosoma y un ARNt nuevo
se une al codón siguiente. Mientras este proceso continúa, el ribosoma se
mueve a lo largo de la molécula de ARNm, completando la síntesis de la
cadena de aminoácidos. Cuando se llega al codón de parada (UAG, UGA o
UAA), el ribosoma se desprende del ARNm. En realidad, a lo largo de la mis-
ma molécula de ARNm se pueden mover varios ribosomas, cada uno de ellos
traduce el código de ARNm dentro de una nueva molécula de proteínas.
Control transcripcional
Son necesarios los mecanismos de control del repertorio de la transcrip-
ción génica y de la traducción de las proteínas para permitir la diferenciación
 CAPÍTULO 59 • DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
celular y para la respuesta al estímulo ambiental. Algunos de estos mecanis-
mos actúan a nivel del ADN y controlan la transcripción del ARNm (Rosenthal,
1994). Por ejemplo, los promotores son secuencias de ADN importantes para
el inicio de la transcripción del ARNm. Los promotores se encuentran secuen-
cia arriba, como aguas arriba de un río, (hacia el extremo 5) a una distancia
relativamente invariable del inicio de la secuencia codificadora de proteínas.
Hay varias clases diferentes de secuencias consenso de los promotores
(secuencias de nucleótídos que están en muchos ejemplos). Los promotores
más comentes son ricos en adenina y timina y son denominados cajas TATA.
Al repetir las secuencias A-T, el ADN se desenrolla con más facilidad, debi-
do a que los enlaces de pares de bases A-T son más débiles que los enla-
ces de pares de bases G-C. Hay otras secuencias de promotores reconoci-
das, las cajas GC y el motivo CAÁ. Después de la activación transcrípcional
y por la unión de la polimerasa de ARN con sus cofactores. se produce y
estabiliza una región de ssDNA local. El ARN mensajero es sintetizado des-
de la región local de ssDNA. y el ARNm es desprendido rápidamente a la vez
que el ADN vuelve a su estado, más favorable energéticamente, de doble
hebra helicoidal.
Los amplificadores son secuencias de ADN que pueden aumentar la trans-
cripción del ARNm y se pueden encontrar en localizaciones diferentes relati-
vas al gen que afecten. Los factores de transcripción son proteínas que se
unen a los amplificadores y a los promotores y estimulan o inhiben, selectiva-
mente, la transcripción del ARNm (Papavassiliou. 1995). A su vez, los facto-
res de transcripción son controlados por acontecimientos celulares, como la
fosforilación, o por otras proteínas, como las hormonas y los factores del cre-
cimiento. Una red de comunicaciones químicas intra y extracelulares puede
asi seleccionar y controlar la síntesis de proteínas necesaria.
Debido a que el ARNm es mucho menos estable que el ADN, la vida media
del ARNm es muy corta. Nuevas moléculas del ARNm se están transcribien-
do continuamente a partir del ADN. A la vez que la célula responde a los cam-
bios en las señales de transcripción, los genes que están transcritos en ARNm
pueden cambiar rápidamente y dar como resultado la síntesis inmediata de
nuevas proteínas. Por tanto, la célula tiene la capacidad de ajustar su pro-
ducción proteica en respuesta a su ambiente.
Mecanismos de reparación del ADN
Se deben minimizar los errores en la replicación del ADN y los daños al
ADN durante la vida celular normal para preservar la salud de todo el orga-
nismo. Hay varios mecanismos que actúan para mantener normal la secuen-
cia del ADN. Primero están los mecanismos para anular los errores, que ac-
túan durante la replicación del ADN. La polimerasa del ADN, que sintetiza
nuevos polímeros de ADN. selecciona cada monómero de nucleótídos suce-
sivo basándose en su complementariedad al nucleólido siguiente en la hebra
molde. La fidelidad a este nivel es grande y en esta etapa se anulan la mayo-
ría de los errores en la síntesis. Sin embargo, a la hebra en crecimiento se le
puede añadir, ocasional e incorrectamente, una base. Para corregirlo, la acti-
vidad a prueba de errores de lectura de la polimerasa reconoce el error, eli-
mina la base incorrecta y continúa de nuevo con la síntesis. Los mecanismos
para anular errores reducen los fallos en los pares de bases en aproximada-
mente 1 entre 10 millones (Radman. 1988). Esto representa un aumento de
100.000 veces en eficacia, comparándolo con el índice de error de 1 en 100
bases para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida in vitro.
A pesar de la extraordinaria anulación de errores en la replicación del ADN,
se producen equivocaciones ocasionales. Aún más. el ADN puede ser daña-
do por reacciones bioquímicas normales y por agentes no fisiológicos, como
la luz ultravioleta y los carcinógenos ambientales. Hay varios mecanismos de
reparación que reparan el ADN dañado (Yu, 1999) (Tabla 59-3).
Los mecanismos de reparación directos reparan los daños a través de una
e
reacción en un solo paso. Por ejemplo, la O - metil-guanina ADN metiltrans-
ferasa repara los daños por alquilacíón, transfiriendo el grupo alquilo desde la
lesión al sitio activo de la enzima. Otro mecanismo de reparación directo,
caracterizado en Escherichia coli, puede existir, también, en las células huma-
nas (Yu, 1999).
La reparación de errores (RDE) funciona inmediatamente después de la re-
plicación del ADN para reemplazar las bases erróneas por las correctas (Mo-
drich, 1994). Algunas proteínas RDE reconocen el erraren la hebra hija recién
1279
sintetizada y cortan la región que incluye el fallo. La polimerasa III del ADN y
la ligasa restablecen la secuencia correcta y la integridad de la hebra hija. La
importancia de este mecanismo en la estabilización del genoma se ha evi-
denciado por estudios recientes que asocian el cáncer colorrectal no polipó-
sico hereditario con defectos en las proteínas reparadoras de errores.
La escisión de bases repara las dianas pequeñas, los aductores que no defor-
man la doble hélice, como los producidos por metilacíón. oxidación, reducción o
fragmentación de bases por radiación ionizante. La escisión de bases deja hue-
cos de 34 nucleótídos que luego se sellan con los nucleótídos reparados: los
cortes se sellan con ligasa. Los aductores de bulto más grandes o los dimeros
que distorsionan la hélice de ADN pueden ser causados, entre otros agentes, por
la radiación UV, los carcinógenos y por los fármacos terapéuticos. Estas lesiones
se eliminan por la vía de reparación de escisión nucleotidica (REN), que utiliza
un sistema de enzimas, compuesto de muchas proteínas, para cortar un oligo-
nucleotide de una hebra que contiene la lesión (Sanear, 1994). Luego el hueco
se sella con la polimerasa ADN y se liga. Hay dos vías de reparación de escisión
nucleotidica: una, en la que las lesiones que bloquean la transenpción son elimi-
nadas rápidamente (reparación acoplada a la transcripción; Hanawalt. 1994), y
dos, una vía global que repara el ADN basura, incluyendo la hebra no transcrita
de los genes activos. Algunas de las consecuencias posibles originadas por la
pérdida de actividad REN tienen como ejemplo la enfermedad xeroderma pig-
mentosa (XP). cuya causa son las mutaciones de REN. La XP acusa una extre-
ma sensibilidad a los rayos solares y. como consecuencia, aparecen cánceres
de piel a una edad muy temprana (Weeda, 1998).
Los cortes no (recuentes de la doble hebra o los que se producen por la
radiación ionizante o por el daño oxidativo presentan problemas importantes.
Si no se resuelven, se bloquearán la transcripción y la replicación de las
secuencias involucradas. Para mantener la integridad genómica, local y total,
se reparan los cortes de la doble hebra por mecanismos de reparación de
recombinación no homologa o alélica.
Ahora queda claro que la reparación de ADN juega un papel importante en
la vida de la célula. Hay evidencias recientes que indican que varias proteí-
nas, que son proteínas de reparación primaria, también funcionan en la regu-
lación y en la transcripción del ciclo de la célula. Por tanto, el proceso que
concierne al ADN parece estar altamente integrado y se estudiará, cada vez
más. como un todo y en relación a las enfermedades humanas.
Mutaciones del ADN
A pesar de los extensos mecanismos de reparación, se producen altera-
ciones de las secuencias de bases en el ADN (mutaciones), y en alguna medi-
da deben producirse, para que continúe el proceso de evolución. Incluso para
un organismo individual, algunas mutaciones son claramente dañinas y pue-
den estar asociadas al cáncer y a las enfermedades genéticas hereditarias. Los
estudios de estas enfermedades han conducido a la caracterización de varios
tipos de mutaciones que se producen el genoma humano (Weatherall, 1987). És-
tas pueden ser agrupadas, conceptualmente, en varias categorías principales
(Tabla 59-4). Una mutación puntual se encuentra en el gen de la (J-globina en
Tabla 59-3 Vías de reparación del ADN
Repara ciertos tipos de lesiones del ADN
Reparación directa
en una reacción de un solo paso
Reparación de errores Comprueba los errores cometidos cuando
el ADN se ha replicado Elimina a
cualquiera de las bases mal emparejadas
y las reemplaza por las correctas.
Reparación de la Repara los pequeños aductores que no
escisión de la base deforman la hélice, como los originados
por la metilacíón. la oxidación, la
reducción o la fragmentación
de la base mediante radiación ionizante
Reparación de la Elimina los aductores de bulto del ADN.
escisión del como los dimeros de timina y ciertos
nucleótido fotoproductos, asi como a los aductores
químicos y a los enlaces cruzados.
Reparación de la rotura Repara las roturas de la doble hebra
de la doble hebra originadas por procesos fisiológicos o
por la radiación ionizante y las
agresiones oxidativas
 1280 SECCIÓN V I I • PATOLOGÌA MOLECULAR

Tabla 59-4 Tipos de m u t a c i o n e s de A D N y e j e m p l o s de las e n f e r m e d a d e s

Mutación Descripción Enfermedad

Punto Sustitución de un solo par de bases. Anemia drepanocitica

Deleción o inserción Sustracción o adición de codones de aminoácido Distrofia muscular de Becker
en múltiplos de tres Se conserva el marco de lectura
Deleción o inserción con frameshilt Sustracción o adición de codones en no múltiplos de tres. Distrofia muscular de Duchenn<
El resultado es un desplazamiento del marco de lectura y
una secuencia que codifica aminoácidos completamente
diferente a partir de la mutación.
Amplilicación o repetición Aumenta el número de secuencias en el ADN microsatélite. Cromosoma X frágil
de los Irinucleótidos
Origina la disrupción de la expresión del gen
Translocación Leucemia mielógena crónica
Cambio intercromosOmico de segmentos largos de cromosoma
Origina una nueva proteina con una función diferente.

la anemia de células enfermas (Kan. 1992). Una base de timina reemplaza a

una base de adenina y origina un cambio grave en la estructura de la hemo-
globina. La deleción en el gen de la proteína muscular distrófica es la causa
de la distrofia muscular. En la variedad Becker de la enfermedad, las delecio-
nes no interrumpen el marco de lectura, pero en la mayoría de los casos de
la variedad Duchenne, mucho más grave, las deleciones sí cambian el mar-
co de lectura, eliminando eficientemente la función de las proteínas (Liechti-
Gallati. 1989).
El ADN humano contiene muchas secuencias cortas de nucleótidos (ADN
microsatélile) que algunas veces se agrupan en repeticiones en tándem y que
se repiten muchas veces por todo el genoma humano. El número de repeti-
ciones en tándem en lugares especiales es un carácter hereditario. Se ha ob-
servado que algunas repeticiones de trinucleólidos aumentan en número en
asociación con la enfermedad (Sutherland, 1994). En el síndrome del cromo-
soma X frágil, la expresión de la enfermedad está asociada a la amplificación,
más allá de un cierto limite, del número de una secuencia de repetición trinu-
cleótida intragénica. La expansión de las repeticiones trinucleótidas, más allá
de un número crítico, rompe la expresión del gen.
No siempre se pueden detectar las translocaciones por el análisis del cario-
tipo cromosómico. A nivel del gen, una translocación puede crear un gen de
fusión, la combinación de dos genes diferentes unidos de forma anormal en
el sitio de la translocación. Esto no sólo puede crear una transcripción del gen
alterada, sino que también puede producir un gen bajo el control transcripcio-
nal de otro. Por ejemplo, el cromosoma Filadelfia. que se encuentra en la ma-
yoría de los casos de leucemia mielógena crónica, es el resultado de una
translocación recíproca entre el gen c-abl. en el cromosoma 9, y una región
denominada región de agolpamientos de puntos de sutura (raps), en el cro-
mosoma 22. El gen de fusión producido por este reordenamiento cromosómi-
co se compone de la mayor parte del gen c-abl y de una raps truncada, codi-
lica una proteína c-abl, que es más grande que el producto normal, tiene una
actividad enzimática incrementada y se cree que interfiere con las vias de
transducción de señales que, normalmente, están involucradas en el control
de proliferación y muerte de las células.
Lo que determina el efecto último en el producto proteico es el tipo de muta-
ción, asi como su localización en relación al gen. Las mutaciones pueden no
tener efecto sobre la expresión de la proteina o su actividad funcional: existen
muchas proteínas humanas, en variantes perceptibles, que no están asocia-
das con la enfermedad. Las mutaciones que se producen en las regiones intró-
nicas se supone que no tienen ningún efecto. Sin embargo, incluso las pe-
queñas mutaciones en regiones que codifican para dominios funcionales clave
(exones) pueden alterar o eliminar funciones drásticamente. Las "mutaciones
sin sentido" son mutaciones que transforman un codón de aminoácido en un
codón de parada, o viceversa, y dan como resultado productos proteicos
anormalmente cortos o largos, respectivamente. Las mutaciones de sentido
erróneo son aquellas que cambian el código de un aminoácido a otro y que
pueden alterar o no la función de la proteina dependiendo del cambio y de la
función del aminoácido. De igual forma, las mutaciones dentro de las secuen-
cias que señalan los sitios de unión pueden eliminar exones e introducir intro-
nes en el ARNm transcrito. Las mutaciones pueden producirse también en las
secuencias reguladoras, como las promotoras y las amplificadoras, que pro-
ducen efectos drásticos en los niveles de transcripción,
ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Las propiedades bioquímicas únicas de los ácidos nucleicos han sido el de-
tonante para proporcionar información de la biología o bioquímica de un sis-
tema. Mientras que algunos ensayos, como la electroforesis. se aplican a
otras unidades básicas, como las proteínas y los lípidos, la gran mayoría son
específicos para los ácidos nucleicos En las siguientes secciones se descri-
ben brevemente los principios de las categorías de análisis básicas utilizados
para caracterizar el ADN y el ARN. las separaciones electroforéticas. los
ensayos de hibridación, las técnicas de amplificación y los polimorfismos de
la longitud de los fragmentos de restricción. En la práctica, las categorías, a
menudo, se combinan para producir nuevas variaciones del mismo tema. Por
ejemplo, un ensayo completo puede involucrar a la amplificación, la electro-
foresis y la hibridación.
Separación electroforética
El esqueleto de azúcar-fosfato repetitivo de los ácidos nucleicos da como
resultado una carga neta negativa distribuida ligeramente sobre estas molé-
culas lineales. Por tanto, el movimiento del ADN o del ARN en respuesta a un
campo eléctrico será proporcional al peso molecular o a la longitud de la molé-
cula. Esta propiedad se utiliza para caracterizar el tamaño de los fragmentos
de ácido nucleico por separación electroforética. El formato es similar al que
se utiliza para la separación de proteínas según su tamaño. Se ponen múlti-
ples muestras en pocilios separados, en un extremo de un medio de separa-
ción sólido pero poroso. Cuando se aplica el voltaje, la muestra se mueve
hacia el electrodo positivo de manera lineal, formando cada muestra una linea
de migración. Se conoce como ge/al medio electroforético sólido y a la repe-
tición de pocilios de muestra. Los tamaños estándar, a los que nos referimos
como escaleras de ADN o ARN, son mezclas de ácidos nucleicos de longitud
de fragmento conocida que son analizados en una o más líneas del gel. La
determinación del tamaño se hace comparando la distancia de migración de
una muestra desconocida con la escalera, bien ~a ojo" o por mediciones asis-
tidas por ordenador.
La composición y la concentración del medio de separación determina el
tamaño de los fragmentos, los cuales se pueden separar en bandas diferen-
tes. Otras variables que contribuyen a la resolución son el grosor del gel, la
longitud de la vía de electroforesis, la duración de la electroforesis y el volta-
je aplicado. En la práctica, estos factores se gustan empiricamenle y se con-
trolan tan cuidadosamente como es posible para asegurar la capacidad de
reproducción de día en día. La agarosa es el medio de separación que se uti-
liza con más frecuencia y. por lo general, conjuntamente con una cubeta de
electroforesis horizontal, en la que se sumerge el gel en tampón. el gel sumer-
gido. Las muestras se espesan con sacarosa o Ficoll y son cargadas en los
pocilios del gel por medio del tampón (Fig. 59-5). Se obtiene un poder mayor
de resolución con acrilamida, utilizada normalmente en un lormato vertical,
que permite la diferenciación en longitud de un solo par de bases. El método
más simple para visualizar las bandas separadas por electroforesis es la tin-
ción con colorantes intercalados (p. ej.. el bromuro de etidio), que se insertan
 CAPÍTULO 59 • DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS 1281

entre las bases emparejadas, y visualizando con transiluminadores de luz UV.

La visualizacíón directa requiere que la banda consiga un concentración sig-
nificativa. En algunas aplicaciones se pueden delectar los fragmentos de áci-
do nucleico por fluorescencia o por radiactividad, marca que puede aumentar
la sensibilidad.
Las moléculas en el ADN genómico son reducidas a fragmentos que se —
pueden resolver por electroforesis por medio de la digestión con enzimas de —

restricción. Las enzimas de restricción con una secuencia de reconocimien-

to relativamente simple producen fragmentos de menos de 50 kilopares de
bases (kpb) de longitud. Los fragmentos de ADN extremadamente largos,
medidos en megapares de bases (Mpb). se producen por la digestión con
enzimas con una secuencia de reconocimiento compleja, y deben ser sepa-
rados en sistemas electroforéticos especiales utilizando un campo eléctrico
pulsado. La mayoría de las aplicaciones de la electroforesís de ADN utilizan
condiciones no desnaturalizantes (es decir, los fragmentos que se resuelven
en bandas son de doble hebra). Por el contrario, la mayoría de las separa-
ciones del ARN utilizan condiciones desnaturalizantes (bien fornamida o glio-
xal) para eliminar la estructura secundaria de las moléculas monohebra. Las
moléculas de ARN, que son transcritas de ADN. son "premedidas" y relati- Figura 59-6. Ilustración de la astringencia. Según aumenta la astringencia de la hi-
vamente pequeñas, por lo que no se requiere digestión antes de la electro- bridación se toleran menos errores en un hibndo dúplex Con la astringencia muy
foresís. alta, incluso un error en un solo par de bases interrumpirá el dúplex.

estables las forman las moléculas dúplex, con complementariedad exacta en

Hibridación del ácido nucleico
La hibridación es un concepto fundamental en la bioquímica del ácido nu-
cleico: se le define como la interacción entre dos moléculas monohebra de
ácido nucleico para formar una molécula dúplex (de doble hebra), basada en
el emparejamiento de bases complementarias de sus respectivas secuencias.
La hibridación es consecuencia directa de la estructura estable de doble he-
bra del ADN bajo condiciones fisiológicas. Como se ha visto antes, la hélice
está formada por dos hebras antiparalelas de ADN sujetas por la fuerza com-
binada de muchos enlaces específicos de hidrógeno entre pares de bases
complementarios, asi como por una carcasa hidrofóbica de bases de un am-
biente acuoso. Lo importante de la reacción de hibridación es el hecho de que
las uniones entre moléculas complementarías separadas (hebras) sea reversi-
ble y especifica de secuencia de bases.
Al proceso de reforma de la estructura de la doble hebra estable, cuando
ninguna de las hebras está marcada, se le denomina amllamiento. Si una he-
bra está marcada (es decir, si tiene un marcador que puede ser detectado
de alguna manera), a esa hebra marcada se la denomina sonda, y al proce-
so se le conoce como hibridación, debido a que se forma una molécula híbri-
da entre una hebra marcada y otra sin marcar. Las moléculas de ARN tam-
bién pueden participar en el proceso de hibridación. El emparejamiento de
bases puede producirse entre hebras de ADN complementarias, entre el ADN
y el ARN y entre hebras de ARN complementarias, dando como resultado
estructuras dúplex de ADN-ADN. ADN-ARN y ARN-ARN. Las estructuras más
la secuencia de bases, pero pueden formarse estructuras con diversos gra-
dos de error de ios pares de bases dependiendo de las condiciones. La ines-
tabilidad relativa de estos dúplex erróneos se reflejará en la baja temperatura
de su disociación (por debajo de la T,,).
Se pueden manipular las condiciones ambientales para controlar el grado
de errores de los pares de bases que se tolerarán en una estructura dúplex
(es decir, la astringencia de la coincidencia de la secuencia) (Fig. 59-6). Una
baja astringencia tiene que ver con las condiciones, como sal elevada, baja
temperatura, ausencia de fornamida. que favorecen a la carcasa de bases
hidrofóbicas de un ambiente acuoso, incluso sin un alineamiento perfecto; la
coincidencia no necesita ser perfecta. Las condiciones de alta astringencia
-alta temperatura (cerca de T,„). baja sal y fornamida alta- sólo permitirán
estructuras dúplex perfectamente alineadas para permanecer en una confor-
mación helicoidal estable.
Ensayo de hibridación: componentes básicos
El proceso conocido como ensayo de hibridación es el que utiliza la reac-
ción de hibridación para analizar el contenido del ácido nucleico de una mues-
tra no conocida. La propiedad del emparejamiento de bases complementarias
permite a los fragmentos de una composición conocida (la sonda) interrogar
a una desconocida por la presencia de secuencias (complementanas) de com-
paración. Por tanto, todos los ensayos de hibridación requieren varios ele-
mentos básicos: una sonda, una muestra, condiciones controladas permisivas
para el emparejamiento de bases complementarias y un método para el des-
cubrimiento de híbridos específicos de sonda-muestra. A continuación se
verán brevemente cada uno de estos elementos, así como las variaciones en
los formatos que se han desarrollado para permitir la ejecución y la interpreta-
ción de los ensayos de hibridación

Sonda

La sonda determina la especificidad de la reacción de hibridación. Por eso

Figura 59-5. Fotografía de la carga de una muestra y su tinción mediante lampón
en un pocilio de gel de agarosa en un apáralo de electroforesis de gel sumergido.
la sonda es capital para un ensayo de hibridación, de la misma manera que
el anticuerpo primario es capital para un inmunoensayo. Una sonda es un
fragmento bien caracterizado de ácido nucleico, bien de ADN o bien de ARN.
En la mayoría de los ensayos, y aunque se producen variaciones, la sonda es
la que porta al grupo reportero para delectar moléculas hibridadas dentro de
la reacción. Los grupos reporteros pueden ser radiactivos o no radiactivos (es
decir, mareaje por afinidad).
La mayoría de las sondas son producidas por la tecnología de ácidos nu-
cleicos recombinantes, como se ilustra en la Figura 59-7. Los plásmidos, seg-
mentos de doble hebra cortos y circulares de ADN, son utilizados para pro-
 1282 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
pagar las secuencias deseadas en las bacterias. El segmento que interesa se
introduce en el plásmido, utilizando la digestión de enzimas de restricción y
ligación, lo que da como resultado una nueva molécula "recombinada" que
mantiene la capacidad de propagarse en la bacteria y que incluye a la secuen-
cia de ADN que interesa. Las bacterias que contienen el plásmido recombi-
nante pueden ser crecidas en cultivo y los piásmidos pequeños y circulares
pueden ser fácilmente separados del genoma bacteriano en base al tamaño.
Así se obtienen muchas copias idénticas y por eso nos referimos al ADN
como clonado. El plásmido purificado puede ser utilizado en ensayos donde
las secuencias de vectores no interfieren con la especificidad de la reacción.
En muchas aplicaciones, la secuencia de ADN insertada es separada de la
secuencia de vectores por medio de la digestión del plásmido aislado con la
misma enzima de restricción, utilizada originalmente en la construcción de la
molécula recombinante. La sonda resultanle, por cualquiera de esos méto-
dos, es una molécula de ADN de doble hebra. Antes de utilizarlas, las sondas
de doble hebra deben ser desnaturalizadas, y el reanillamiento de la sonda
limita la extensión de la hibridación de la sonda con una diana. El vector del
plásmido que no contiene ADN clonado es un control negativo utilizado co-
rrientemente para este tipo de sonda.
Los vectores de los piásmidos han sido construidos para incluir a las
regiones promotoras de ARN adyacentes a la secuencia de ADN insertada.
Estos piásmidos recombinantes se usan para producir transcritos de ARN a
partir del ADN insertado. El resultado es una sonda de ARN monohebra que
no experimentará autohibndación. El control de la orientación del ADN in-
sertado con respecto al promotor de ARN permite la producción de transcri-
tos en la dirección sentido (igual que el ARNm) o antisentido (complementa-
ria al ARNm). En muchas aplicaciones, los transcritos de sentido forman
sondas de control negativas, ideales para las reacciones de hibridación con
sondas antisentido. Una sonda de ARN enlazada no especiticamenle (es
decir, el ARN no es una estructura dúplex estable) puede ser eliminada uti-
lizando RNasa específica de ARN monohebra. Como el ARN es muy deli-
cado, es necesario que las sondas sean manejadas con un cuidado extre-
mo para prevenir su degradación (técnicas estériles, agua tratada y material
de cristal).
Las sondas recombinantes. sean de ADN o de ARN. son genéticamente
complejas, lo que significa que pueden incluir muchas kilobases de informa-
ción genética, al contrario que las sondas producidas por métodos sintéticos,
que son segmentos de ADN relativamente cortos. Las sondas de oligonucleó-
Figura 59-7. Producción de sondas clonadas. La inserción de un segmento
extraño conocido de ADN en un vector de plásmido produce un plásmido
recombinante Los piásmidos de este tipo son pequeños trozos circulares
de ADN que se propagan mediante su cultivo en un huésped bacteriano.
El ADN plásmido se separa fácilmente del cromosoma bacteriano en base
al tamaño. El plásmido recombinante purificado puede ser utilizado como
sonda. Esto produce una sonda de ADN de hebra doble con secuencias
del inserto y del vector De forma alternativa, se pueden purificar las se-
cuencias del inserto del vector del plásmido y utilizarlas solas como la son-
da. Si el plásmido contiene una región de ARN promotor, se pueden pro-
ducir sondas de ARN utilizando una polimerasa de ARN para transcribir las
secuencias del inserto. Como solamente se transcribe una hebra, las son-
das de ARN que se producen son de una sola hebra. (Por cortesía y adap-
tada de Unger ER: In situ hybndization. Principies and praclice Clin Immu-
nol Newslett 1990:10:120-126, copyright © 1990 Elsevier Science.)
tidos producidas por reacciones químicas automatizadas son, normalmente,
de 15 a 45 bases de longitud, sintetizadas para producir una secuencia de
bases específica. Se pueden diseñar sondas con una especificidad de hibri-
dación muy alta, en base a la información de secuencias disponible en los
bancos de datos. Se pueden generar en dirección sentido o antisentido, con
costes relativamente baios. Estas sondas cortas son monohebra. esparcidas
en la diana y de hibridación rápida, debido a su pequeño tamaño, y extrema-
damente sensibles incluso a un solo error en los pares de bases. Debido a su
limitada complejidad genética, la susceptibilidad última que se consigue con
las sondas de oligonucleótidos es más baja que la que consigue con las son-
das recombinantes. Las múltiples sondas de oligonucleótidos dirigidas a dife-
rentes áreas de la misma diana han sido utilizadas, en algunos casos, para
aumentar la susceptibilidad, incrementando la representación de la secuencia
diana en la mezcla de la sonda. Este método es análogo a la ulilización de
una mezcla de anticuerpos monoclonales que reaccionan frente a epitopos di-
ferentes del mismo antigeno complejo.
Se pueden generar sondas más largas que las obtenidas por la síntesis
química directa con la reacción en cadena de la polimerasa o con otra tecno-
logía de amplificación. Estas sondas pueden ser monohebra o de doble he-
bra, dependiendo de las condiciones empleadas, y pueden ser tan largas co-
mo el producto de la reacción de amplificación; en la mayoría de los casos de
100 pb a 1 kben longitud.
Muestra
Mientras que la selección y la preparación de las sondas es esencial para
determinar la susceptibilidad y la especificidad del ensayo de hibridación, no
se debe olvidar que la preparación de la muestra contribuye al éxilo del ensa-
yo. Para aplicaciones clínicas, las muestras de interés deben ser bastante di-
versas. Por ejemplo, un laboratorio de microbiología podría contar con mues-
tras de análisis de sangre, de orina, de heces y de esputos. Puede ser difícil
mantener la integridad de las dianas de ARN bajo en tales condiciones, e in-
cluso el ADN puede ser degradado si no se maneja adecuadamente. El obje-
tivo de la preparación de la muestra es mantener la integridad del ácido
nucleico y hacer asequible la información genética de la diana para la inter-
acción con la sonda. Para algunas aplicaciones, la necesidad de integridad de
la diana aconsejará una congelación inmediata o añadir lampones de lisina
que contengan inhibidores de RNasa o de DNasa potentes. En otras aplica-
 CAPÍTUIO 59 • DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
ciones, la utilización de métodos de recogida de muestras más habituales per-
mitirá una preservación adecuada de la diana.
Las similitudes fisicas y químicas de los ácidos nucleicos, sea cual sea la
fuente, permiten métodos uniformes de purificación y extracción. En muchos
ensayos, para eliminar inhibidores de enzimas que son añadidos al ensayo
(como una enzima de restricción o una polimerasa) y para maximizar la acce-
sibilidad de la diana a la sonda, es preferible purificar extensivamente el ADN
o el ARN. Sin embargo, los sistemas de purificación completos consumen
mucho tiempo y requieren una cantidad relativamente grande de muestras
de partida. En muchas aplicaciones se pueden utilizar purificaciones de
muestras relativamente abreviadas. Normalmente para las purificaciones se
utiliza la lisis de la célula (mecánica, quimica o ambas), tratamiento de pro-
teasa y extracciones orgánicas o inorgánicas.
Condiciones controladas permisivas para
el emparejamiento de bases complementarias
La susceptibilidad y la especificidad de las reacciones de hibridación son
influenciadas, en gran medida, por el ambiente lisico-quimico durante la reac-
ción y la consecutiva detección/recogida de las moléculas híbridas. En la
práctica, el medio utilizado para controlar el ambiente de la reacción de hibri-
dación es el cóctel de hibridación. Diseñado empíricamente, el cóctel de hibri-
dación es una mezcla de reactivos seleccionados para favorecer la interac-
ción de los ácidos nucleicos a través de enlaces de hidrógeno específicos de
secuencia, más que en base a la carga. Sus componentes varían mucho, pe-
ro incluyen tampones, sales, desnaturalizantes como la formamida. polímeros
de alto peso molecular, ADN o ARN portador y varios componentes más que
se le añaden para reducir el fondo (como detergentes, suero de bovino, albú-
mina y Ficoll). A esta mezcla tan compleja se la denomina, con toda propie-
dad, un cócfeí La luerza iónica del cóctel de hibridación, y los lavados subsi-
guientes, es modulada, muy frecuentemente, por la concentración de un
tampón citrato sódico salmo (SSC). compuesto de 0.15 mol/I de cloruro de
sodio. 0.015 mol/l de citrato de trisodio y un pH 7.0. La abreviatura de estas
condiciones hace referencia a la fuerza del SSC. esto es. 2 x SSC. 0,1 x
SSC. La astringencia final de la reacción de hibridación está controlada por la
formamida y por la concentración salina del cóctel de hibridación, por la tem-
peratura de la reacción de hibridación y por la temperatura y la concentración
salina de los pasos de lavado.
Detección de híbridos
Se ha aplicado una amplia variedad de técnicas para la recogida y el aná-
lisis de híbridos específicos, que se verán brevemente más adelante bajo el
titulo de Formatos de ensayos de hibridación. Una vez que se han recogido
los híbridos específicos, los métodos de detección van unidos, obviamente, a los
métodos de mareaje. Se han utilizado marcas radiactivas, como el lósloro-32
iS M ]
(*P), el yodo 125 ("'-I), el azufre-35 ( S), el carbono-14 ( C) y el tritio ( H).
que se detectan por medio de la autorradiografía o por el contador de cente-
lleo en muchas aplicaciones de investigación y en las primeras aplicaciones
clínicas. La actividad especifica de la marca influye directamente en la sensi-
bilidad de la detección. Se han buscado, para las aplicaciones clínicas, alter-
nativas al mareaje radioisotópico. Las sondas radiactivas tienen una vida
media, relativamente corta, haciendo que uno de los reactivos claves en el
ensayo de hibridación sea inestable. También han contribuido a la necesidad
de encontrar métodos no radiactivos el peligro que corre el personal del labo-
ratorio y los costes de la eliminación de los desechos radiactivos. Las sondas
marcadas no isotópicamente son reactivos estables, facilitan enormemente la
producción industrial y la estandarización, lo que es crucial para la capacidad
de reproducción de los ensayos.
El mareaje no isotópico y los métodos de detección de los ácidos nucleicos
tienen muchas similitudes con los ensayos mmunoquimicos desarrollados por
la detección de proteínas no isotópicas. En algunas aplicaciones, los ácidos
nucleicos son enlazados directamente a un compuesto emisor de señal, nor-
malmente a un fluorocromo. aunque ocasionalmente a una enzima. Esta
situación es igual para los inmunoensayos, en los cuales es marcado el anti-
cuerpo primario. Los ácidos nucleicos son detectados, más cornentemente,
en un ensayo de múltiples pasos, cuyo concepto es similar a la reacción indi-
1283
recta de los anticuerpos. El primer mareaje por afinidad introducido en los áci-
dos nucleicos fue la biotina, un mareaje por afinidad utilizado corrientemente
en los inmunoensayos (Langer, 1981). La biotina por sí misma no genera
señales, pero es delectada por la interacción de alta afinidad con una molé-
cula de avídina o estreptavidina. que a su vez se combina o conjuga con una
enzima generadora de señales o fluorocromo. Muchos otros grupos funcio-
nales se han desarrollado como marcas monoisolónicas. como la bromode-
soxiundina. la digoxigenina y la sullona. En estos casos, la detección se con-
sigue con anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra el grupo funcional.
Estos anticuerpos están, por lo general, directamente enlazados a una enzi-
ma generadora de señales o fluorocromo que actúa como un anticuerpo se-
cundario marcado en una reacción inmunoquimica. La biotina también puede
ser detectada con un anticuerpo antibiotina más que con una molécula de aví-
dina o estreptavidina.
Debido a que las marcas de afinidad son detectadas con proteínas gran-
des, como la avidma o los anticuerpos, la disponibilidad de la marca al reac-
tivo de detección es un factor crucial en la determinación de la sensibilidad.
El aumentar el número de marcas de afinidad no incrementará necesariamen-
te el número de moléculas detectaras que serán unidas al ácido nucleico.
Además, y debido a que las marcas de afinidad son grandes, su sobremeor-
poración en la molécula de ácido nucleico puede conducir a un bloqueo es-
pacial de la reacción de hibridación. Por estas razones, la actividad especi-
fica de la marca de afinidad no controla directamente la sensibilidad de la
detección.
Una ventaja de la detección indirecta de las marcas de afinidad es que para
la misma marca se pueden utilizar varios métodos de detección (Fig. 59-8).
Por ejemplo, la biotina puede ser detectada con avidina unida a una enzima
con color subsiguiente o con una detección quimioluminiscente o con avidina
con marca fluorescente. Para todos los métodos no radiactivos, la parte de
detección del ensayo es crucial para obtener una sensibilidad óptima. Una
reacción de hibridación eficaz se puede frustrar por reactivos de detección
con poco fondo y una generación de señal subóptima Para conseguir resul-
tados óptimos, lo más importante es elegir los marcadores de enzimas (pero-
xidasa frente a fosfatasa alcalina), el sustrato de la enzima (colorimétnco tren-
te a quimioluminiscente) e incluso la procedencia de los reactivos.
Formatos de ensayos de hibridación
Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de ensayos de hibri-
dación, cada uno de ellos diseñado para resolver los problemas metodológi-
cos del ensayo de hibridación: las condiciones que permiten el empareja-
miento de las bases complementarias específicas, un método para detectar
híbridos y una interpretación del resultado. Cada método tiene su punto débil
y su punto fuerte, y la selección del formato la dicta el marco clínico y la pre-
O Suslralo (colorìmclrico o quimioluminisccntc)
Figura 59-8. Sistemas de delección de sondas de marcaje por afimdad. (Por corte-
sia de Unger ER. Piper MA: Nucleic acid biochemistry and diagnostic applications
En Burlis CA. Ashwood ER led.]: Tietz Textbook ol Clinical Chemistry. 2" ed. Fila-
delfia. WB Saunders Company, 1994 )
 1284 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
gunla diagnóstica específica. No hay un ensayo perfecto, y a continuación se
describen, brevemente, varios de los formatos básicos, con sus puntos fuer-
tes y sus puntos débiles especiales.
Cada ensayo de hibridación requiere controles positivos y negativos para
su verificación. Un control de muestras positivo es aquel que se sabe que con-
tiene secuencias complementarias de la sonda. Se utiliza para establecer que
la preparación de la muestra es la adecuada para liberar la diana para el en-
sayo de hibridación, y para garantizar que la sonda se hibridará con la diana
especifica bajo las condiciones del ensayo. El control de muestras también se
puede utilizar para monítorizar la susceptibilidad del ensayo, si el control posi-
tivo se elige cerca de los límites de detección más bajos. Un control de mues-
tras negativo (es decir, del que se sabe que no contiene secuencias comple-
mentarias de la sonda) se utiliza para monítorizar la especificidad de las
interacciones de la sonda diana. Los controles de la sonda incluyen secuen-
cias de vectores o sondas marcadas no relacionadas, hibridadas y detecta-
das bajo las mismas condiciones del ensayo. Estos últimos controles permi-
ten la monitorización del fondo de la señal generada por la localización de la
sonda a través de interacciones no hibridadas, como carga o atrapamiento.
En la práctica clínica se pueden emplear controles adicionales para monítori-
zar cada paso del ensayo de hibridación.
Hibridación de fase líquida o solución
En los ensayos de hibridación líquida tanto la muestra como la sonda actúan
reciprocamente en solución, lo que maximiza la cinética de la reacción. Los
ácidos nucleicos de la muestra se purifican, generalmente, de proteínas con-
taminadoras y de lípidos, que podrían interferir en la obtención de híbridos al
final del ensayo, aunque el ensayo tolera alguna degradación de la muestra.
La muestra se desnaturaliza y se trocea al azar antes de añadirte la sonda de
una hebra que no tiene capacidad de autohibridación.
Se puede detectar la hibridación por la unión específica de los híbridos a
una matriz como la hidroxiapatita. que sólo une estructuras dúplex. Una vez
que los híbridos están unidos, la sonda no hibridada se puede eliminar efi-
cientemente lavándola. La detección de la marca en la sonda ya unida per-
mite la cuantificación de la reacción de hibridación. En una variante de esta
propuesta, un ensayo comercial (captura de híbridos) utiliza un anticuerpo
específico de ADN y ARN híbridos para unir específicamente estructuras
dúplex formadas de la diana de ADN y la sonda de ARN, Un análisis alter-
nativo incluye la digestión de la mezcla de reacción de hibridación con la
nucleasa S1, que es una enzima que sólo actúa en el ácido nucleico mono-
hebra. Las estructuras dúplex que son resistentes a la digestión pueden ser
precipitadas por un tratamiento de ácido tricloroacético. En el ensayo de pro-
lección por la hibridación, la marca de la sonda está protegida de la degra-
dación química solamente cuando la sonda está insertada en una estructura
dúplex.
En la actualidad se utilizan muchas otras variaciones del ensayo de hibri-
dación de fase de solución. Lo que hace que este ensayo se adapte a las
aplicaciones clínicas es la óptima cinética, la tolerancia a los pasos de puri-
ficación abreviados y alguna degradación de la muestra. Se puede conseguir
la cuantificación del producto de la reacción, dependiendo del sistema de
detección. El lormato de lase de solución no permite la identificación del ta-
maño del producto hibridado. Las reacciones positivas bajas son difíciles de
interpretar, ya que los bajos niveles de las dianas específicas y los altos nive-
les de las dianas de reacción cruzada débiles darán resultados similares. La
hibndación en lase de solución se puede adaptar al formato de 96 pocilios
con un lector tipo del empleado en un ensayo mmunosorbente unido a enzi-
ma (ELISA), lo que permite anticipar un aumento de la automatización del
ensayo.
Hibridación de soporte sólido
Las variaciones de los ensayos de hibridación de soporte sólido incluyen la
hibridación en puntos o por transferencia, la hibridación Southern y Northern
y la hibridación m situ. En estos ensayos la hibridación se produce en un am-
biente bifásico, una fase sólida (generalmente la muestra) y una fase líquida
(generalmente la sonda). La cinética de la hibridación de un ácido nucleico
unido a un soporte sólido se retrasa enormemente y limita la extensión de la
reacción de hibridación. Estas desventajas se compensan, frecuentemente,
por la conveniencia de disponer de un medio sólido que nos lleve a través de
los múltiples pasos del ensayo.
Hibridación de punto o transferencia. En este formato de ensayo,
múltiples muestras están inmovilizadas en una repetición geométrica sobre
una membrana de nailon o de nitrocelulosa. El nombre del ensayo deriva
de la forma de cada muestra sobre la membrana. Cuando se aplican las
muestras a mano, la forma es más fortuita (mancha). Con la utilización de
instrumentos de vacío, disponibles comercialmente. las muestras se apli-
can utilizando la succión, la forma de la muestra es más regular, redonda
(punto) o alargada (muesca). La matriz sólida permite que múltiples mues-
tras sean procesadas simultáneamente a través de todos los pasos del en-
sayo. El hecho de que estén expuestos todos los controles y muestras a
exactamente los mismos reactivos y condiciones aumenta la estandariza-
ción del ensayo.
La prolongación de la preparación de la muestra varia desde la purificación
completa de los ácidos nucleicos, antes de su aplicación al filtro, a la aplica-
ción directa de una muestra no purificada. El ensayo tolera algún grado de
degradación de la muestra. Los ácidos nucleicos purificados tienen la venta-
la de que están muy dispuestos a la interacción con la sonda y no tienen ape-
nas problemas con el fondo. Sin embargo, la purificación individual de la prue-
ba consume mucho tiempo y el trabajo es intensivo. Los métodos que utilizan
la aplicación directa de la muestra no purificada llevan el experimento a tra-
vés de un procedimiento abreviado de purificación que incluye, normalmente,
la lisis y la desnaturalización, la digestión de la proteina y el lavado con deter-
gente. Las ventajas de este método son que se aplica a pequeñas cantidades
de material de partida y reduce el tiempo de preparación de muestras. Sin
embargo, la susceptibilidad final de la reacción es más baja y el fondo de las
interacciones no especificas de las sondas puede hacer que el ensayo no sea
fiable.
La interpretación de los resultados de un ensayo de hibridación man-
cha/punto es relativamente directa. Si ha tenido lugar la hibridación se gene-
ra una señal en el punto especifico. Los resultados se pueden cuantificar.
dependiendo de la marca utilizada para generar las señales, aunque nor-
malmente se da una interpretación simple de si o no (es decir, la muestra tie-
ne más o menos señal que las muestras contiguas y reconocen controles
positivos y negativos). Suelen provocar errores de interpretación las señales
débiles, que pueden ser el resultado de una cantidad muy pequeña de dia-
nas específicas o de una gran cantidad de dianas de reacción cruzada débi-
les. No hay información disponible sobre el tamaño de los fragmentos que se
hibridan.
Se conoce como ensayo inverso de mancha/lineas de puntos a una varia-
ción interesante del ensayo de mancha/punto. En este formato, que se aplica
en situaciones en las que una muestra tiene que ser analizada con muchas
sondas diferentes y donde la muestra puede estar limitada, es la muestra la
que porta la marca. Las sondas no marcadas o las dianas son fijadas a un
soporte sólido en repeticiones lineales o de matriz. Se identifican e interpre-
tan las áreas de formación de híbridos específicos igual que en el ensayo
estándar de mancha punto. Este lormato de ensayo es una forma útil para
identificar el producto de un ensayo de amplificación (vide intra y Cap. 60), co-
mo en HLA (Bugawan, 1994) o para tipificar el papilomavitus humano (Gra-
vitt, 1998),
Hibridaciones Southern y Northern. Ambas hibridizaciones. Southern
y Northern, combinan la separación por electroforesis del ácido nucleico a
analizar, con su transferencia a un soporte sólido y la hibridación subsi-
guiente. Por tanto, este ensayo no sólo da información sobre la presencia de
hibridación, sino que permite determinar el peso molecular de las especies
hibridadas.
Se dio el nombre de hibridación de mancha Southern o manchas de Sou-
thern al procedimiento original en honor a su inventor, E M. Southern
(Southern. 1975). En este ensayo, el ácido nucleico a analizar es ADN, A la
técnica que utiliza ARN como ácido nucleico a analizar se le dio, por analo-
gía, el nombre de manchas Northern. (Y yendo aún más lejos con la analo-
gía, las manchas western son un proceso similar en el que las proteínas
están expuestas a la electroforesis y a la transferencia: a una mancha
south-western se la ha descrito como una técnica que mancha y separa al
 CAPÍTULO 59 • DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
ADN seguida por la incubación con soluciones de proteínas, lo que permite
la evaluación de las proteínas específicas de unión a ADN.)
En estas dos últimas técnicas, la preparación de muestras lleva mucho
tiempo y el trabajo es intensivo. El ensayo no tolera la degradación del ácido
nucleico de la muestra y requiere una cantidad relativamente grande de mate-
rial de partida. En la hibridación Southern, el ADN debe ser purificado con cor-
tes mínimos. Esto se debe a que el tamaño de los fragmentos se consigue a
través de la digestión con una o más enzimas de restricción. La degradación
y los cortes presentan roturas aleatorias en la muestra, lo que reduce la can-
tidad disponible para ser cortada específicamente en las secuencias de reco-
nocimiento adecuadas. Las impurezas de la muestra pueden interferir con la
actividad y la susceptibilidad de la secuencia de la enzima de restricción. Las
muestras digeridas parcial o inadecuadamente pueden producir tamaños de
bandas espúreos o dar como resultado una concentración reducida de la ban-
da especifica que ya no será detectada durante la hibridación. El material de
partida para las hibndizaciones Northern es el ARN. y hay que tener un cui-
dado excesivo para evitar la degradación durante la recogida y preparación
de las muestras, debido a la naturaleza ubicua de las RNasas. El ARN esta
compuesto de fragmentos de tamaños determinados por la transcripción y el
procesamiento del ARN mensajero y ribosómico. No se digiere antes de la
electroforesis, pero se separa bajo condiciones desnaturalizantes para elimi-
nar la estructura secundaria.
Los fragmentos separados por tamaño en el gel de agarosa son luego
transferidos a un filtro de nailon o de nitrocelulosa. La transferencia se produ-
ce de forma pasiva por la acción capilar, como se diseñó originalmente. En la
mayoría de las aplicaciones actuales se utiliza el vacio o la presión para ace-
lerar la transferencia. Después de ser transferidos, los ácidos nucleicos están
inmovilizados por horneado o por uniones cruzadas generadas por luz UV y
toda la membrana hibridada con sondas marcadas.
A la hibridación le sigue la detección por autorradiografia, colorimetria o
quimioluminiscencia de bandas que contienen secuencias complementarias
de la sonda. La interpretación incluye la detección de las especies hibnda-
das y la determinación del peso molecular de la molécula. Estos ensayos, téc-
nicamente muy exigentes, necesitan varios días para ser ejecutados, aunque
pueden ser necesarios para aplicaciones clínicas en las que no se pueda ob-
tener la información por medio de ningún otro formato. La presencia de ban-
das de pesos moleculares diferentes de muestras normales o de linea germi-
nal (no alteradas por el desarrollo experimental) puede indicar un cambio en
el material genético.
Hibridación in sito. La hibridación in situ es, simplemente, la detección
de información genética en un contexto morfológico. Este tipo especializado
de ensayo de soporte sólido incluye el tomar tejidos morfológicamente intac-
tos, células o cromosomas adheridos a un portaobjetos de cristal de micros-
copio a través del proceso de hibridación. Se han aplicado métodos de de-
tección autorradiográficos, colonmétricos y lluorescentes. La evaluación del
producto final es muy similar a la evaluación de inmunoquímica, y es nece-
sario tener experiencia en histopalología. La fuerza de este método recae en
la unión de la evaluación morfológica microscópica con la detección de la
hibridación.
Este método tiene también aplicaciones en los análisis citogenéticos de
cromosomas metalásicos esparcidos o de núcleos en mterfaz. La detección,
en este contexto, se hace normalmente por fluorescencia, y a la técnica se
la denomina hibridación in situ fluorescente (HISF). Se puede conseguir,
rápidamente, la detección de aberraciones numéricas o la translocación de
cromosomas utilizando sondas para dianas especificas. La HISF evita algu-
nas de las dificultades de la citogenética convencional y puede tener una
mayor susceptibilidad hacia algunas dianas. Aunque la HISF no puede reem-
plazar completamente a los canotipos, puede complementar y reducir la ne-
cesidad de la frecuencia de los análisis citogenéticos. Las nuevas variacio-
nes de la HISF (Luke. 1998) explotan las posibilidades de automatización
(HISF-rápida). y difusión de la información que se puede obtener de un solo
ensayo. La FICTION (inmunofenotipado fluorescente y la citogenética de in-
terfaz como una herramienta para la investigación de neoplasmas) combina
el inmunofenotipado con la HISF; la HISF de fibra hace posible el detectar y
hacer un mapa de los puntos de rotura cromosómicos simultáneamente. La
HISF se explica con más detalle en el Capitulo 62. La hibridación in situ pue-
de ser tediosa y de trabajo intensivo. Las recientes mejoras han dado como
1285
resultado el procesamiento automatizado de portaobjetos durante el ensayo
y son muy prometedoras en cuanto a que esta técnica se adopte más
ampliamente.
Tecnología de los chips de ADN. Se ha desarrollado una nueva varia-
ción de hibridación de soporte sólido (Pease. 1994) Utilizando chips de al-
cona miniaturizados y síntesis de fase sólida generada por luz. se han cons-
truido repeticiones densamente empaquetadas de oligonucleólidos unidos.
Los chips, que contienen todas las combinaciones de oligonucleótidos rela-
tivamente cortos (p. ej.. 65.536 combinaciones para un octámero). se pue-
den hibridizar a una muestra marcada por fluorescencia (un formato de ensa-
yo inverso de hibridación de puntos). La fluorescencia localizada índica la
presencia de una secuencia complementaria, y por el alineamiento de se-
cuencias superpuestas se puede ejecutar un análisis rápido de secuencias.
Hay muchas variaciones sobre este tema, incluidos los portaobjetos de cris-
tal (microrrepeticiones) o los filtros (repeticiones de filtros de alta densidad)
con las dianas de ADNc inmovilizadas. Este tema se expone con más deta-
lle en el Capitulo 61.
Métodos de amplificación
Es prácticamente imposible leer cualquier revista médica sin encontrarse
con. al menos, una aplicación de la tecnología de la reacción en cadena de la
pohmerasa (PCR). La PCR ha cambiado para siempre el ámbito de los pro-
blemas de investigación, que pueden ser solucionados eliminando práctica-
mente el problema del tamaño limitado de las muestras. Se ha reconocido la
importancia y elegancia de este concepto concediéndole el Premio Nobel de
Quimica a su inventor. Kary Mullís, menos de 10 años después de la publica-
ción de la primera aplicación práctica de la PCR (Saiki. 1985). Ahora hay otras
metodologías que han dado como resultado la multiplicación de las dianas,
las sondas y las señales. Todas ellas se pueden agrupar bajo el epígrafe de
tecnologías de amplificación y se exponen en el Capitulo 60
Ensayos basados en los polimorfismos de
la longitud de los fragmentos de restricción
Los ensayos de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de res-
tricción (PLFR) son conocidos como los ensayos que utilizan la propiedad de
las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción para demos-
trar las variaciones de los polimorfismos en la secuencia de ADN de dos
muestras. El ADN genómico o el ADN producido por la PCR. es digerido por
una enzima de restricción y los fragmentos son analizados por la electrofo-
resis en gel. seguido de la visualizaron de la banda o del análisis de man-
chas Southern con una sonda específica de sitio. Los cambios en la secuen-
cia del ADN pueden dar como resultado la alteración de la secuencia de
reconocimiento de la enzima. Esta alteración puede introducir sitios de enzi-
mas de restricción adicionales, eliminar sitios de restricción o insertar o eli-
minar secuencias entre los sitios de restricción. Estos cambios se verán
reflejados en el cambio del tamaño de la banda visualizada en un gel o hibn-
dizando a la sonda específica de sitio. No todos los cambios, por supuesto,
se verán reflejados en una secuencia de reconocimiento alterada, por eso el
tamaño de la banda inalterado tiene que ser interpretado en el contexto de
los marcadores y de las frecuencias conocidas de los polimorfismos en la
región En algunos ensayos, en cada muestra se produce la digestión de una
o varias enzimas de restricción antes del análisis de manchas Southern.
Esta propuesta es muy útil para los estudios de familia, como se ve en la
Figura 59-9. Se pueden utilizar los polimorfismos en el ADN estrechamente
enlazados a un gen de la enfermedad para predecir la herencia del alelo alte-
rado. Muchos marcadores son específicos de locus y existen mapas cromosó-
micos de estos marcadores. Para establecer marcadores alélicos. estas regio-
nes que tienen el máximo de vanaciones y el máximo de polimorfismos son las
de más fácil utilización. Las áreas de secuencias repetitivas dentro del cromo-
soma, conocidas como números variables de repeticiones en tándem, son
algunos de los marcadores más polimórficos, y pueden dar lugar a un patrón
complejo de bandas o 'huella genética". En los estudios de familias con enfer-
medades hereditanas (genética clásica) y para identificar regiones del genoma
 1286 SECCIÓN VII • PATOLOGÌA MOLECULAR
Figura 59-9. Ejemplo del análisis de los polimorfismos de la longitud de los frag-
mentos de restricción (PLFR). (M = madre; P = padre; H = hijo.) (Por cortesía y
adaptada de Piper MA, Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer for Pathologists.
Chicago, ASCP Press, 1989.)
alteradas durante la neoplasia (mutaciones somáticas), el PLFR es muy útil pa-
ra establecer el vínculo de una región del genoma con la enfermedad.
RELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON
LA EVALUACIÓN EN LABORATORIO
Los capítulos siguientes describen las aplicaciones actuales de los diag-
nósticos moleculares. Está claro que esta nueva tecnología ha ¡mpactado en
todas la áreas de diagnósticos del laboratorio. Los métodos moleculares tie-
nen también el potencial de redefinir la evaluación de la enfermedad por el
laboratorio, para incluir resultados más allá del diagnóstico de la enfermedad.
Diagnóstico molecular
Las ventajas del enfoque molecular para los diagnósticos se expondrán de-
tallando cada aspecto de las aplicaciones actuales. Sin embargo, es muy im-
portante recordar que estos nuevos análisis moleculares probablemente no
sustituirán a los análisis tradicionales en un futuro inmediato. El coste y la
complejidad de esta tecnología tienden a restringir sus primeras aplicaciones
para situaciones diagnósticas especiales, donde la información obtenida no
se podía proporcionar por ningún otro método. El aumento de la automatiza-
ción y los métodos diseñados comercialmente rebajarán los costes, reducirán
el nivel de los técnicos especializados que se precisan para realizar los aná-
lisis y el resultado será la integración de la tecnología molecular en la línea
central de los análisis del laboratorio.
En el centro de la explosión de información actual de la ciencia médica está
la detección de las mutaciones y su asociación con la enfermedad y en mu-
chas de las aplicaciones de los diagnósticos moleculares. La capacidad de lo-
calizar un gen responsable de una enfermedad sin conocer la proteína pro-
ducto es una de las consecuencias más importantes de la revolución de la
genética molecular. Se denomina clonación posicional y es un proceso que
utiliza el análisis de enlaces PLFR de familias que portan y expresan la enfer-
medad, para localizar marcadores polimórficos que se acercan cada vez más
y más al gen de la enfermedad, hasta que éste es localizado al fin. Los mar-
cadores polimórficos, fuertemente unidos, que tienden a segregarse con la
enfermedad, se pueden utilizar en los análisis diagnósticos, clínicamente úti-
les, antes incluso de que el gen esté completamente caracterizado y de que
la proteína producto esté finalmente idenlificada. En esta línea, primero se
desarrollan y utilizan los análisis moleculares de diagnóstico, que luego se sus-
tituyen por métodos más simples y económicamente más efectivos, dirigidos
al nivel del producto génico, cuando se ha entendido por completo el resul-
tado de la mutación.
Más allá del diagnóstico
Los análisis moleculares tienen el potencial para desarrollar al máximo el
papel del laboratorio en áreas que van más allá del diagnóstico de la enfer-
medad. El análisis molecular de las mutaciones somáticas del cáncer tiene la
posibilidad de proporcionar información sobre el pronóstico, de aconsejar la elec-
ción de una terapia óptima y de monítorizar la respuesta a la terapia. Ahora se
están examinando en varios tipos de malignidades las implicaciones del uso
de marcadores moleculares para detectar células neoplásicas, en ausencia
de evidencia clínica o morfológica de la enfermedad, conocida como enfer-
medad mínima residual (véase Cap. 65). Esta propuesta de utilizar marcado-
res moleculares para detectar la enfermedad puede anticipar las consecuen-
cias de los métodos secundarios de la prevención del cáncer (selección) y la
valoración de suficiencia de la resección quirúrgica (evaluación de márgenes).
La terapia génica para las enfermedades genéticas hereditarias, así como pa-
ra el cáncer, se está llevando a la práctica y está basada en el conocimiento
detallado de la enfermedad subyacente. La monitorización de estos pacientes
para conocer la presencia y la actividad del gen terapéutico introducido añadi-
rá otro aspecto a la evaluación de la enfermedad del laboratorio.
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 C A P Í T U L O
Reacción en cadena de la polimerasa
y otras tecnologías de amp ificación
• James C. Zimring, M.D., Ph.D.
• Frederick S. Nolte, Ph.D.
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE LAS DIANAS 1287
Reacción en cadena de la polimerasa
Amplificación mediada por transcripción/amplificación
del ácido nucleico basada en secuencias
Amplificación del desplazamiento de la hebra
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SONDA 1291
Reacción en cadena de la ligasa
Tecnología invasora/enzima de rotura
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por Mullís y
otros colaboradores (Saiki. 1988) tue un hito en la biotecnología y anunció el
comienzo de los diagnósticos moleculares. Aunque la PCR es la estrategia de
amplificación del ácido nucleico más ampliamente utilizada, se han desarro-
llado otras estrategias, y algunas de ellas tienen propiedades y ventajas úni-
cas en su género. Estas estrategias están basadas en la amplificación de las
dianas, de las sondas y de las señales. En las secciones siguientes se expo-
nen los ejemplos de cada una de ellas. Estas técnicas tienen una sensibilidad
sin igual en la medicina de laboratorio y han originado nuevas oportunidades
para que el laboratorio clínico sea efectivo en el tratamiento de los pacientes,
en las áreas de las enfermedades infecciosas, en el cáncer y en los desórde-
nes genéticos.
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE LAS DIANAS
Todos los sistemas de amplificación de las dianas comparten ciertas carac-
terísticas fundamentales. Son procesos mediados por enzimas en los que una
sola enzima o múltiples enzimas sintetizan copias de un ácido nucleico diana.
En todas las técnicas, los productos de la amplificación están especificados
por 2 oligonucleótidos cebadores que se unen a las secuencias complemen-
tarias en las hebras opuestas de las dianas de doble hebra. Todo el resultado
de la producción de millones a billones de copias de la secuencia a amplificar
es cuestión de horas y, en cada caso, los productos de la amplificación pue-
den servir como moldes para las rondas de amplificación subsiguientes Debi-
do a esto, todas estas técnicas son sensibles a la contaminación con produc-
tos moleculares de anteriores amplificaciones y pueden originar reacciones
de falsos positivos. Sin embargo, se han desarrollado diseños de laboratorio
especiales, prácticas y flujos de trabajo para reducir, a niveles aceptables, la
posibilidad de reacciones de falsos positivos.
Reacción en cadena de la polimerasa
La PCR es una sencilla reacción química, in vitro. que permite la síntesis
de cantidades esencialmente ilimitadas de una secuencia de un ácido nuclei-
co diana. Esto se hace a través de la acción de una polimerasa de ADN que,
bajo las condiciones adecuadas, puede copiar una hebra de ADN. En su
forma más simple, la PCR consiste en ADN diana, un exceso molar de 2 oli-
gonucleótidos cebadores, una polimerasa de ADN termoestable, una mezcla
60
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑALES 1294
ADN ramificado
Ensayo de captura de híbridos
CONCLUSIONES 1294
BIBLIOGRAFÍA 1294
equimolar de desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP. dCTP. dGTP y dTTP). de
MgCI , KCI y un tampón de Tns-HCI. Los dos cebadores flanquean a la
?
secuencia que va a ser amplificada, suelen ser de menos de 100 bases y son
complementarios a las hebras opuestas de la diana.
Para iniciar una PCR se calienta la mezcla de la reacción, para separar las
dos hebras del ADN diana, luego se enfría para permitir a los cebadores que
se anillen al ADN diana de forma secuencia-especifica. Después, la ADN poli-
merasa inicia la extensión de cada cebador desde sus extremos 3 en direc-
ciones opuestas. Los productos de la extensión de los cebadores se disocian
de la diana de ADN mediante calor. Cada producto de la extensión, lo mismo
que la diana original, puede servir como un molde para las rondas subsi-
guientes de anillamienlo y extensión del cebador.
Un ciclo de PCR consta de tres etapas: desnaturalización, anillamiento y
extensión. Los productos de la PCR se duplican, teóricamente, después de
cada ciclo. Por eso, después de n ciclos de PCR la secuencia de la diana se
puede amplificar 2" veces. Todo el procedimiento se lleva a cabo en un ter-
mociclador programable que controla con exactitud la temperatura a la que se
producen las etapas, la cantidad de tiempo en el que se mantiene la reacción
a las diferentes temperaturas y el número de ciclos. Lo ideal es que después
de 20 ciclos de PCR. se consiga una amplificación del orden de millones de
veces y después de 30 ciclos, una del orden de billones de veces. En la prác-
tica, la amplificación puede que no sea completamente eficiente, debido a
errores en la optimización de las condiciones de la reacción o a la presencia
de inhibidores de la ADN polimerasa. En estos casos, la amplificación total
está mejor descrita por la expresión (1 + e)", donde e equivale a la eficiencia
de la amplificación (0<e<1) y n es el número total de ciclos
PCR transcriptasa inversa
La PCR, como se la describió originalmente, tue una técnica para la ampli-
ficación del ADN. La PCR transcriptasa inversa (PCR-TI) se desarrolló para
amplificar las dianas de ARN. En este proceso, primero se produce el ADN
complementario (ADNc). a partir de dianas de ARN. por transcripción inversa,
y más tarde se amplifica el ADNc por PCR. De acuerdo a la descripción origi-
nal, la PCR-TI emplea dos enzimas: una TI termolábil, como la transcriptasa
inversa del virus de mieloblastosis aviario (VMA-TI). y una ADN polimerasa
termoestable. La síntesis del ADNc debe producirse a temperaturas más
bajas, debido a los requisitos de temperatura de la enzima termolábil. Esto
presentaba problemas en cuanto al anillamiento de cebadores no específicos
 1288 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
y a la extensión ineficaz del cebador a causa de la formación de estructuras
secundarias de ARN. Estos problemas se han superado con creces por el
desarrollo de una ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Ther-
mus thermophilus. que bajo las condiciones adecuadas puede funcionar efi-
cientemente como una TI y como una ADN polimerasa (Myers. 1991). Las
PCR-TI que utilizan esta enzima son más eficientes y específicas que los pro-
tocolos anteriores que utilizan enzimas de TI termolábil convencionales. Se
pueden obtener equipos comerciales (Roche) que emplean PCR-TI de una
sola enzima para la detección del ARN del virus de la hepatitis C (VHC) y para
determinar la cantidad del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-11
y de ARN-VHC en muestras clínicas.
PCR anidada
La PCR anidada se desarrolló para aumentar tanto la sensibilidad como la
especificidad de la PCR (Haqqi, 1988). Emplea dos pares de cebadores de
amplificación y dos rondas de PCR. Por lo general se utiliza un par de ceba-
dores en la primera ronda de PCR de 15 a 30 ciclos. Los productos de la pri-
mera ronda de amplificación están sujetos, después, a una segunda ronda
de amplificación utilizando la segunda serie de cebadores, que anillan en
una secuencia interna a la secuencia amplilicada por la primera serie de
cebadores. El aumento de la sensibilidad proviene del alto número total de
ciclos y el aumento de la especificidad proviene del anillamiento de la segun-
da serie de cebadores a las secuencias que sólo se hallan en los productos
de la primera ronda. El alto índice de contaminación, que puede darse duran-
te la transferencia de los productos de la primera ronda al segundo tubo para
la segunda ronda de amplificación, es la mayor desventaja de la PCR anida-
da. Esto se puede evitar bien por la separación física de las muestras de la
primera y de la segunda ronda, con una lámina de cera o de aceite, o bien
diseñando protocolos de amplificación de un solo tubo. En la práctica, rara-
mente se requiere para las aplicaciones clínicas el aumento de la sensibili-
dad que proporcionan los protocolos de la PCR anidada, y generalmente se
confirma la identidad de un producto de amplificación, hibridándolo con una
sonda de ácido nucleico.
PCR múltiple
En la PCR múltiple están incluidas en la misma mezcla de reacción dos
series, o más, de cebadores, diseñados para la amplificación de diferentes
dianas (Chamberiain, 1988). Con esta técnica se puede co-amplificar en un
solo tubo más de una secuencia diana en una muestra clínica. Los cebado-
res que se utilizan en las reacciones múltiples deben ser cuidadosamente
seleccionados para que tengan temperaturas de anillamiento similares y
carezcan de complementariedad. Las PCR múltiples son más complicadas de
desarrollar y tienen menos sensibilidad que las reacciones de la PCR donde
se usa una sola pareja de cebadores, pero permiten detectar múltiples dianas
en una sola muestra en una reacción.
PCR y PCR-TI cuantitativas
Puede existir una relación lineal entre la cantidad de molde inicial y la can-
tidad de producto de la amplificación. Sin embargo, ya que la cantidad final de
producto de la PCR depende de la amplificación exponencial de la cantidad
inicial de molde, pequeñas diferencias en la eficiencia de la ampliación pueden
conducir a enormes diferencias imposibles de predecir en el rendimiento del
producto final (Clementi, 1993). Las diferencias tubo-a-tubo pueden depender
de la preparación de la muestra y de los procedimientos de purificación del
ácido nucleico, de la presencia de inhibidores y de la actuación del termoci-
clador. Por estas razones, la simple cuantificación del producto amplificado y
la utilización de curvas de referencia de patrones externos no proporcionan
una cuantificación exacta del molde que estaba inicialmente presente en la
muestra.
Se han desarrollado varias estrategias basadas en la PCR para cuantificar
exactamente las dianas de ADN y de ARN en muestras clínicas. Está gene-
ralmente aceptado que un método de PCR competitivo (PCRc) es el más fia-
ble y robusto.
El concepto básico detrás de la PCRc es la coamplifícación en el mismo
tubo de reacción de dos moldes diferentes de longitud igual o similar y con
las mismas secuencias de unión de cebadores. La garantía de la eficiencia
de la ampliación y la idéntica termodinámica se debe a que ambos moldes
se amplifican con el mismo par de cebadores. Se debe conocer la cantidad
de uno de los moldes y. después de la amplificación, se tienen que poder
distinguir los productos de ambos. En la PCRc se han utilizado diferentes
tipos de competidores, pero, en general, aquellos que actúan de una
manera más eficiente son los que tienen un tamaño similar y una compo-
sición de bases igual a la diana. Para acometer el problema de la eficien-
cia variable de la TI, en las PCR-TI cuantitativas se deberían utilizar com-
petidores de ARN.
El rendimiento del producto de la PCR está descrito por la ecuación
Y = /(1+e)\ donde Y es la cantidad de producto PCR, / es la cantidad de
molde al principio de la reacción, e es la eficiencia de la reacción y n es el
número de ciclos. Esta ecuación, para la PCRc, está escrita para ambas
n n
muestras y es como sigue: competidor. Y = 4(1 + e) ; y diana, V, = f,(1 + e) .
c
Dado que e y n son iguales para el competidor y la diana, el índice relativo del
producto Y,IY, depende directamente de su índice de concentración inicial
l ll. y la función. V /y, = l U es lineal.
c c c r
En teoría, para cuantificar una cantidad desconocida de dianas sin tener
que utilizar una curva patrón es suficiente una sola concentración de compe-
tidor. Sin embargo, generalmente se ejecuta la PCRc que utiliza vanas con-
centraciones de competidores dentro de la esperada y amplia concentración
de la diana, ya que el análisis de dos especies de moldes presentes en una
muestra, en cantidades enormemente diferentes, puede ser difícil e impreci-
so en la práctica. Por otro lado, este método no proporciona resultados más
exactos que la utilización de una sola concentración de competidores, según
recientes estudios de diferentes métodos para la estandarización de la PCRc
(Haberhausen, 1998). Los ensayos de la PCR cuantitativa para el citomega-
lovirus (CMV), el VIH-1 y el VHC (Sistemas Moleculares Roche), comercial-
mente disponibles, utilizan todos ellos una sola concentración de un competi-
dor para determinar la concentración inicial de la diana.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real describe los métodos por los que la detección y la
amplificación de la diana se producen simultáneamente en el mismo tubo.
Estos métodos precisan de termocicladores especiales de precisión óptica,
que son capaces de monítorizar la emisión de fluorescencia de los pocilios de
muestras. El software del ordenador que da soporte a los termocicladores
monitoriza los datos, durante toda la PCR, de cada ciclo y genera un campo
de amplificación en cada reacción.
En su formato más simple, el producto de la PCR es detectado al mismo
tiempo que se produce, utilizando colorantes fluorescentes que se unen, pre-
ferentemente, al ADN de doble hebra. Uno de los colorantes que se utilizan
en esta aplicación es el SYBR Green I (Morrison, 1998). La fluorescencia es
relativamente baja en el estado de no ligado, pero cuando se une al ADN de
doble hebra, la fluorescencia se amplifica enormemente. El colorante unirá a
los productos específicos y no específicos de la PCR. Se puede incrementar
la especificidad de la detección mediante un análisis de la curva de separa-
ción. El producto específico amplificado tendrá un pico de separación carac-
terístico en su temperatura de separación prevista (TJ, mientras que los
dímeros cebadores y otros productos no específicos tendrán una T,„ diferen-
te o darán unos picos más amplios (Ririe, 1997).
También se puede incrementar la especificidad de la PCR en tiempo real
incluyendo sondas de hibridación en las mezclas de las reacciones. Estas
sondas están marcadas con colorantes fluorescentes o con combinaciones
de fluorescencia y un colorante aplacador. En el ensayo de la PCR de nuclea-
sa 5' (Taqman). la actividad 5' a 3' exonucleasa de la ADN polimerasa Taq
se utiliza para cortar una sonda de hibridación que es incapaz de alargarse
durante la primera fase de alargamiento de la PCR (Holland, 1991). Este
método utiliza sondas de hibridación fluorogénicas de mareaje dual. Un
colorante fluorescente sirve como reportero y su espectro de emisión es
aplacado por el segundo colorante fluorescente. La degradación de la
sonda de hibridación por la nucleasa libera al colorante reportero, y el resul-
tado es un aumento del pico de emisión de fluorescencia. El aumento de la
 CAPÍTULO 60 • REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
emisión fluorescente indica que se ha obtenido el producto de la PCR espe-
cifico y que la intensidad de la fluorescencia es relativa a la magnitud del
producto (Heid, 1996)
La base de otro método de PCR en tiempo real es la transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia (TERF) (Lay, 1997). Este método
necesita dos sondas de oligonucleótidos específicos de secuencia especial-
mente diseñadas. Estas sondas de hibridación están diseñadas para hibri-
darse. una al lado de la otra, en la molécula del producto. El extremo 3' de
una sonda está marcado con un colorante donador y el extremo 5' de la otra
sonda está marcado con un colorante aceptador mediante un proceso deno-
minado TERF. El colorante aceptar excitado emite luz en una longitud de
onda más larga que el colorante donador no unido, y la intensidad de emi-
sión de luz del colorante aceptador es proporcional a la magnitud del pro-
ducto de la PCR.
También se puede realizar la detección y la cuantificación en tiempo real
del producto de la PCR, utilizando guías moleculares (Tyagi, 1998). Las guías
moleculares son sondas de oligonucleótidos en forma de horquilla con un
fluoróforo aplacado internamente cuya fluorescencia se restablece cuando se
unen a un ácido nucleico diana. Están diseñadas de tal manera que la porción
del asa de la molécula de la sonda es complementaria a la secuencia de la
diana. El tallo se forma por el anillamiento de secuencias de brazos comple-
mentarias en los extremos de la sonda. Un colorante fluorescente está inser-
tado en un extremo de un brazo y una molécula aplacadora está insertada en
el extremo del otro brazo. El tallo mantiene en contacto al fluoróforo y al apla-
cador, de modo que no se produce ninguna emisión de luz. Cuando la sonda
encuentra una molécula diana, forma un híbrido más largo y más estable que
el tallo y sufre un cambio de conformación que obliga al tallo a abrirse, lo que
hace que el fluoróforo y el aplacador se alejen el uno del otro, restablecién-
dose la fluorescencia.
Los métodos de la PCR en tiempo real disminuyen el tiempo que se
requiere para los ensayos de ácido nucleico, debido a que no existen eta-
pas de procesamiento post-PCR. Además, y dado que la detección y la
amplificación tienen lugar en el mismo tubo cerrado, estos métodos elimi-
nan las manipulaciones postamplificación, que pueden dar lugar a la conta-
minación del laboratorio con el producto de amplificación. Más aún, los
métodos de la PCR en tiempo real se prestan a las aplicaciones cuantitati-
1289
vas, porque el análisis se ejecuta en la fase temprana del registro de acu-
mulación del producto.
Amplificación mediada por transcripción/
amplificación del ácido nucleico
basada en secuencias
La amplificación mediada por transcripción (AMT) y la amplificación del
ácido nucleico basada en secuencias (AANBS) son dos técnicas isotérmi-
cas de amplificación del ácido nucleico, aunque en la práctica son ligera-
mente distintas, cuyo concepto es exactamente igual, por lo que se descri-
ben juntas (Kwoh, 1989; Compton. 1991). Esencialmente, estas técnicas
resumen el ciclo de vida del retrovirus ¡n vilro convirtiendo el ARN en ADN
y utilizando luego el ADN como molde para la transcripción de copias múlti-
ples de ARN. El proceso comienza cuando una diana de ARN. que en la
mayoría de los casos existirá como una entidad de una sola hebra (Fig. 60-1,
etapa 1), elimina la necesidad de desnaturalización termal del molde antes
de la amplificación. Un cebador de ADN específico de secuencia se une a
la diana de ARN (Fig. 60-1. etapa 2). Luego la transcriptasa inversa prolon-
ga el cebador, creando un heterodúplex de ADN-ARN (Fig. 60-1. etapa 3).
El extremo 5' del cebador especifico de secuencia no es complementario a
la diana; más bien contiene al promotor de una T7 polimerasa bacteriólaga.
La presencia de este promotor T7 en el extremo 5' del cebador da como
resultado la síntesis de una hebra de ADN complementaria a la diana inicial
de ARN que contiene al promotor T7 en su extremo 5'. En el caso de la
AMT, la enzima transcriptasa inversa degrada el molde inicial de ARN al
mismo tiempo que sintetiza su ADN complementario. En la AANBS. una
enzima separada. ARNsa H. degrada al molde inicial de ARN. La ARNsa H
rompe selectivamente el ARN, que forma estructuras heterodúplex con el
ADN. pero no al ARN solo (Fig. 60-1, etapa 4). En ambos casos, el T7 que
contiene ADN complementario es liberado de su ARN asociado, liberándolo
para unirse a un segundo molde, que se une al extremo 3' de la molécula
de ADN (Fig. 60-1, etapa 5). La ADN polimerasa se prolonga desde este
segundo molde, dando como resultado la síntesis de una molécula de ADN
de doble hebra que contiene un promotor T7 intacto. (Fig. 60-1, etapa 6).
 1290 SECCIÓN Vil • PATOLOGÍA MOLECULAR
Esta molécula de ADN puede servir ahora como sustrato para la polimera-
sa T7. una enzima bacteriófaga que reconoce específicamente al promo-
tor 17 y que sintetiza copias múltiples de ARN (Fig. 60-1, etapa 7). Cada
una de estas moléculas de ARN, recientemente sintetizadas, es antisenti-
do a la diana inicial, lo que les permite hibridar al segundo molde. Luego,
la transcriptasa inversa, el segundo cebador, la ARNsa H y la ADN poli-
merasa utilizan esta molécula de ARN antisentido como un molde para sin-
tetizar nuevos cebadores de ADN de doble hebra, quienes a su vez expre-
san más molde de ARN. Asi, de esta lorma se produce una amplificación
exponencial.
La AMT y la AANBS tienen algunas ventajas que las diferencian de otras
técnicas de amplificación del ARN. Quizá la más significativa de estas venta-
jas es que no se necesita la desnaturalización inicial para que se produzca la
amplificación. Por tanto, las secuencias de ADN de doble hebra no se sepa-
ran nunca y por eso no son capaces de unirse a los cebadores en la reacción.
La contaminación del ADN puede ser esencialmente problemática cuando se
utilizan técnicas, como la PCR, para los ensayos de los transcritos del ARN
de los genes retrovirales o de los genes eucariotas sin intrones. La AMT y la
AANBS eliminan el problema de la contaminación del ADN dando una deter-
minación falsamente elevada de ARN. Una segunda ventaja es que esta tec-
nología utiliza procesos isotérmicos, lo que hace innecesario el uso de ter-
mocicladores muy sofisticados. Combinando esta tecnología con guias
moleculares o con otras sondas especificas de secuencia, que se pueden
añadir directamente a la mezcla de la amplificación, se crea un sistema de
tubo cerrado que ayuda a prevenir la contaminación cruzada con productos
de amplificación en el laboratorio.
La AMT y la AANBS se han aplicado con éxito en una amplia gama de sis-
temas de ensayo. Se han utilizado para detectar varios patógenos, incluyen-
do a virus, como el VIH, el VHC, el de la varicela, el virus zóster, los citome-
galovirus (CMV), el rinovirus, el del sarampión y el papilomavirus. y a
bacterias, como Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae y
Campylobacter ¡ejuni. Además, esta tecnología ha cuantificado la carga viral
del VIH y del VHC. También se han realizado análisis de genes, como la tipi-
ficación del HLA y la mutación del factor V de Leiden.
En resumen, la AMT y la AANBS son técnicas de amplificación de ARN iso-
térmicas, con amplias aplicaciones y ventajas únicas sobre otros métodos de
amplificación, en especial para la eliminación de los problemas de contami-
nación y, en particular, para aquellos relacionados con los genes sin intrones
y los retrovirales. La combinación de estas técnicas con sondas fluorescentes
permite la amplificación en tiempo real, en tubo cerrado y en una etapa, sin
necesidad de termocicladores.
Amplificación del desplazamiento de la hebra
La amplificación del desplazamiento de la hebra (ADH) es una técnica
isotérmica de amplificación del molde que puede ser utilizada para detectar
los rastros de ADN o de ARN en una secuencia específica. La ADH, según
se la describió al principio, era un proceso de amplificación conceptual-
mente directo y con algunas limitaciones técnicas (Walker, 1992a. 1992b).
Sin embargo, desde entonces ha evolucionado, y se ha convertido en una
herramienta muy versátil que es técnicamente simple, aunque conceptual-
mente compleja. Para explicar la ADH. primero hay que hablar de las meto-
dologías iniciales y después rastrear el desarrollo de la tecnología ADH
actual.
El proceso de la ADH. según se describió al principio, empieza con una
digestión de restricción de la muestra de ADN para generar un fragmento de
ADN que ha reconocido los extremos 3' y 5' (Fig. 60-2. paso 1). Este ADN
digerido es separado luego (Fig. 60-2, paso 2) por la presencia de un ceba-
dor cuyo extremo 3' híbrida al extremo 5' del ADN diana (Fig. 60-2. paso 3).
El resultado es un fragmento de ADN con un extremo saliente 5' a ambos
extremos. Luego, la ADN polimerasa se alarga desde el cebador, para sellar
el fragmento de una sola hebra de la diana, y se alarga desde el molde, para
sellar el Iragmento de una sola hebra del cebador (Fig. 60-2, paso 4). Esta
síntesis del ADN se produce en presencia de dCTP. dGTP, dTTP y de des-
oxiadenosina 5-[t/.-thio) trifosfato (dATP[u-S]). La incorporación de dATP
(a-S) da como resultado una nueva hebra de ADN sintetizada (representa-
da por lineas pespunteadas) que no puede servir como sustrato para cier-
tas endonucleasas de restricción, que precisan, en su sitio de reconoci-
miento, de un dATP auténtico. El cebador está diseñado para contener, jus-
tamente, este sitio de reconocimiento, en este caso un sitio de Hinc II. La
digestión del sitio de restricción da como resultado una muesca en el ceba-
dor, pero deja al dATP[a-S] que contiene la hebra intacto (Fig. 60-2, paso 5).
La muesca en el extremo 5' del cebador que contiene la hebra permite que
la ADN polimerasa se alargue desde el sitio de la muesca en dirección 3 .
desplazando al ADN, previamente sintetizado, según se va alargando (Fig.
60-2, paso 6) En esta etapa, se utiliza el fragmento Klenow mutado de la
ADN polimerasa I, que está perdiendo su actividad 5' a 3' exonucleasa.
para que la hebra desplazada continúe intacta. A la vez que el alargamien-
to desde el sitio de la muesca desplaza a la hebra existente, regenera un
sitio de restricción intacto. La presencia de dATP[i/.-S] en posición 5 del sitio
de restricción restablecido no inhibe las digestiones subsiguientes por Hinc
II. Por tanto, se puede producir una segunda digestión que regenere una
muesca, y de esta manera se produce un sustrato para un segundo des-
plazamiento de la ADN polimerasa. Este proceso continúa de forma cíclica
y da como resultado la amplificación de la ADN diana. Para obtener una
amplificación exponencial, se utilizan dos cebadores, uno para cada hebra.
En este caso, el producto del desplazamiento del cebador 1 híbrida al ceba-
dor 2 y genera un nuevo ADN de doble hebra con hemifosforotioato, que
puede generar sus propios productos de desplazamiento, los cuales a su
vez rehibridan al cebador 1, dando lugar a una amplificación exponencial
(Fig. 60-3).
La metodología inicial de la ADH tiene bastantes limitaciones, incluyendo la
necesidad de la digestión de restricción de la muestra, antes de la amplifica-
ción de la diana, y que el producto de la amplificación no contenga el mismo
sitio de restricción que el se ha utilizado para la digestión del cebador. Para
superar la primera de estas limitaciones, se desarrolló un sistema inteligente
que utiliza cuatro cebadores para definir una región diana. Para hacer más
fácil la explicación, se expondrá por etapas amplias, enfocándolo primero
hacia una sola hebra. Claro que. en realidad, el resultado de este sistema es
un proceso dinámico, con muchos procesos que suceden simultáneamente.
En este procedimiento, el ADN no digerido es separado (Fig. 60-4, paso 1), y
un cebador igual al que se describe en la Figura 60-2 híbrida a su región diana
en el ADN (Fig. 60-4, paso 2). El extremo 3 del cebador que hibnda al molde
es alargado, luego, a lo largo del molde por la ADN polimerasa, como se ha
descrito previamente (Figura 60-4, paso 3). En este caso, y dado que el ADN
no ha sido digerido el extremo 5' del cebador no es un extremo saliente, sino
que está simplemente no hibndado. Por esta causa, el extremo 5 del ceba-
dor no está sellado por la ADN polimerasa. En este punto, el segundo ceba-
dor híbrida hacia arriba (como las aguas de un río) al primer cebador, lo que
permite a la ADN polimerasa alargarse desde él en dirección 3 y desplazar
a la hebra que contiene al primer cebador (Fig. 60-4, pasos 4 y 5). También
están presentes otro par de cebadores, diseñados para ejecutar la misma
tarea en la hebra opuesta. La amplificación exponencial se produce a lo largo
de las líneas, como se muestra en la Figura 60-3. debido a que los produc-
tos de un par de cebadores sirven como molde para el segundo par de ceba-
dores. En realidad, lo que ocurre en el tubo de ensayo es más complicado
que todo esto, en él se forman vanos subproductos teóricos a lo largo del
proceso; sin embargo, aquí se describen los productos mas importantes del
sistema.
Las aplicaciones clínicas de la ADS incluyen la detección directa en mues-
tras clínicas de M. tuberculosis, C. trachomatis y N. gonorrhoeae. La ADH ha
demostrado tener una susceptibilidad lo suficientemente alta como para
delectar sólo de 10 a 50 copias de una molécula diana (Walker, 1992a). Utili-
zando una serie de cebadores diseñados para amplificar una secuencia repe-
titiva, con 10 copias en el genoma de M. tuberculosis, el ensayo es tan sus-
ceptible que es capaz de detectar de una a cinco copias del genoma de la
bacteria. La ADH ha sido adaptada, recientemente, para cuantificar ARN, aña-
diéndole una etapa de transcriptasa inversa (TI-ADH). En este caso, un ceba-
dor híbrida a la ARN diana y una transcriptasa inversa sintetiza a un ADNc.
Este ADNc sirve luego como molde para la incorporación del cebador y el des-
plazamiento de la hebra. Los productos del desplazamiento de esta hebra se
alimentan después en el lugar de la amplificación descrito anteriormente. Se
ha utilizado la TI-ADH para la determinación de la carga viral del VIH (Nycz.
1998).
 CAPÍTULO 60 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN 1291

Digestion de restricción
Paso I ;•
^ Molde desnaturalizado
Paso 2
p 3
a s o S G-T-T-G-A-C
La mayor ventaja de la ADH es que es un proceso isotérmico
''
que, a dife-
I 5-

3' Reacción en cadena

5' de la ligasa
rencia de la PCR. se puede ejecutar5a' una mise; ma|temperatura
[ , \ (- después de la
( Ì'
desnaturalización inicial
p
aso4 de la sonda.
r Este
_ _ (proceso
\ \ <elimina
l . la necesidad de En una reacción en cadena
5' de la ligasa estándar (RCL), las sondas de 2-
utilizar termocicladores caros. Otra de las ventajas s es
s que las muestras se oligonucleótido se hibridan una junto a la otra en cada una de las hebras de
pueden someter a la ADH en un solo tubo, con tiempos de amplificación que ADN desnaturalizadas de dianas, de forma que se produce una "muesca".
varían de 30 minutos a dos horas, La mayor desventaja de la ADH es el hecho Una ADN ligasa termoestable sella la "muesca" uniendo el extremo 3' de una
lime II I ^
de que, al contrario que la PCR, por la temperatura relativamente baja a la sonda al extremo 5' de la otra. Cada producto ligado, así como la diana origi-
„ . 5' i i i i ii \ r ^'
que se realiza la ADHMaso*el resultado puede
V _ _ser la\ hibridación
( \ , i , del cebador no
(
nal, sin/en de molde enyrondas subsiguientes de desnaturalización, anilla-
S S
específico a secuencias que se hallan en las mezclas complejas, como el miento y el ligado, y el resultado es una acumulación de productos exponen-
ADN genómico. Es por eso que cuando hay poca abundancia de ?dianas, en +(Wu. 1989; Barany. 1991).
cial
comparación ai ADN de fondo, los productos
5' lde• la
I amplificación
K i A I - no específi- Una modificación de esta técnica, denominada espaciada RCL (G-RCL),
cos pueden anegarPaso 6
el sistema, disminuyendo
r - - C- \- \ - t -1 -G de esta técni-
la susceptibilidad difiere de la RCL estándary en que después del anillamiento de las sondas al
s
ca Sin embargo, este problema se ha mitigado smucho por la utilización de molde se forma un pequeño hueco. Este hueco es rellenado por una ADN
o
solventes orgánicos que aumentan la astringencia a bajas temperaturas, y por polimerasa termoestable y la muesca que se produce es ligada por una ADN
la reciente introducción de polimerasas más termoestables capaces í del des- + (Birkenmeyer. 1991). Aunque la RCL es útil y se automatiza con faci-
ligasa
plazamiento de la hebra. s lidad, puede resultar difícil controlar la contaminación por los productos del
y
5' G-T-T-G-A -C
ligado. Hay en el mercado un equipo de combinación G-RCL (Abbol) para
Paso 7 r - - C-A-A-C-T-G 5'
detectar en las muestras clínicas C. Irachomalis y N. gonorrhoeae.
Figura 60-2. Representación
MÉTODOS por medio de un di
DE AMPLIFICACIÓN agrama
DE de la ADH de una hebra. (Por cortesía y adaptada de Walker GT, Little MC. Nadeau JG: Isothermal m vitro ampli-
SONDA
fication ol DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA. 1992b: 89:392-396.) (Véase texto para más detalles.)
Tecnología invasora/enzima de rotura
Los métodos de amplificación de sonda difieren de los métodos de amplifi-
cación de diana en que los productos de la amplificación contienen sólo una Los ensayos invasores son un método de amplificación de la sonda que se
secuencia presente en las sondas iniciales Los ejemplos de métodos de basan en el reconocimiento específico y en la ruptura de estructuras de ADN
amplificación de sonda, con potencial comercial, son la reacción en cadena particulares por miembros de la familia FEN-1 de las ADN polimerasas. Estas
de la ligasa (Wu, 1989), replicasa Qbeta (Kramer, 1989) y la tecnología de polimerasas romperán el extremo 5' saliente de una sola hebra de un dúplex
enzima de rotura/invasora (Lyamichev, 1999). Sin embargo, sólo se desarro- de pares de bases en forma de racimo (Fig. 60-5). Esta actividad enzimática
lla comercialmente la tecnología enzima de rotura/invasora y la reacción en juega, probablemente, un papel esencial en la eliminación de estructuras de
cadena de la ligasa. ácido nucleico complejas que afloran durante la replicación y la reparación del
 1292 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR

5'-
-

Figura 60-3. Representación por medio de un diagrama de la amplilicación exponencial de la ADH de las dos hebras. (Véase texto para más detal les.)

ADN. Dado que estas estructuras pueden darse en cualquier sitio del geno- herramienta muy útil en los análisis de ADN y es la base de los ensayos inva-
ma replicante, la enzima reconoce la estructura molecular del sustrato sin sores.
tener en cuenta a la secuencia de los ácidos nucleicos que construyen el com- El ensayo invasor se basa en el hecho de que sintetizando sondas de ADN
plejo de ADN (Lieber, 1996). Esta actividad enzimàtica ha demostrado ser una de una sola hebra superpuestas que pueden hibridar a una diana específica,

Figura 60-4. Representación mediante un diagrama de

la reacción de la ADH de un cebador dual. (Véase texto
para más detalles.)
 CAPÍTULO 60 • REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
Figura 60-5. Representación gráfica del complejo ternario reconocido mediante
segmenlación y los productos de la digestión producidos por la actividad de seg-
mentación.
creando la estructura reconocida por la ruptura, un miembro de la familia
FEN-1 puede generar un producto de ruptura en respuesta a una diana espe-
cifica. Se diseñan dos cebadores que hibndan a la secuencia de la diana de
manera superpuesta (Fig. 60-6). Bajo las condiciones adecuadas de anilla-
miento, el cebador 1 se puede fijar en la secuencia de la diana (Fig. 60-6.
paso 1). El cebador 2 está diseñado de tal forma que híbrida 3' al cebador 1
con una región solapante entre el extremo 3 del cebador 2 y el extremo 5' del
cebador 1. Bajo las condiciones adecuadas, el cebador 2 "invade" el sitio de
unión del cebador 1, dando como resultado el desplazamiento equilibrado
entre los cebadores (Fig. 60-6. paso 2). La ruptura sólo romperá los extremos
salientes 5', por eso el extremo 5' del cebador 1 se rompe y se elimina (Fig.
60-6, paso 3). De esta manera, la secuencia de la diana actúa como un anda-
mio sobre el que se puede formar la estructura de ADN apropiada. La gene-
ración de productos de ruptura indica la presencia de la diana, debido a que
la estructura de ADN que se necesita para servir como sustrato de ruptura
sólo tendrá lugar en presencia de la secuencia de la diana. La utilización de
una enzima de ruptura termoestable permite que las reacciones transcurran a
temperaturas suficientemente altas, de modo que, para poder existir, el ceba-
dor intercambie el equilibrio. Esto hace posible que se lormen múltiples pro-
Figura 60-6. Representación mediante un diagrama del ensayo invasor. (Véase lexto para más detalles.)
1293
ductos de ruptura de una sola molécula diana. Por esle motivo, se puede
efectuar el ensayo invasor bajo condiciones isotérmicas, eliminando la nece-
sidad de utilizar cualquier termociclador.
La lectura del ensayo de ruptura depende de la capacidad para cuantificar
y detectar específicamente al producto de la ruptura. Se pueden utilizar varios
métodos de detección. Third Wave Technologies ha desarrollado esta tecno-
logía, que comercializa un sistema para generar una lectura lluorescente de
productos de ruptura específicos. Se han desarrollado varios ensayos inva-
sores, incluyendo la mutación del factor V Leiden, la cuantificación del ARNm
de citocmas y la detección del Slaphylococcus aureus resistente a meticilina.
de la hepatitis B, del CMV y de puntos de mutaciones en genes humanos,
como el ApoE (Rossetti, 1997: Ryan. 1999).
El ensayo invasor tiene varias ventajas añadidas. Esta tecnología se puede
adaptar fácilmente para detectar puntos de mutación de interés, diseñando una
región solapante que rodee a la mutación que ha de ser detectada, debido a que
el solapamiento de la sonda mvasora sólo necesita ser de un par de bases. La
detección de estos puntos de mutación no requieren de digestión de restricción
postreacción, dado que los cebadores se romperán de forma diferencial en base
a la presencia o ausencia de la mutación en cuestión. Esto hace posible la loca-
lización de alelos mutantes asociados a las enfermedades hereditarias y muta-
ciones en patógenos asociadas a la resistencia, o la virulencia de los fármacos.
Además, y al contrario que las técnicas de amplificación, como la PCR. la ADH
y la AMT. en las que la secuencia diana se amplifica por ella misma, el ensayo
invasor no aumenta el nivel de la secuencia de la diana. Por esta causa, el ensa-
yo invasor es menos propenso a los problemas de falsos positivos ocasionados
por la contaminación cruzada del producto de amplificación.
Además del ensayo invasor, también se puede utilizar el método de ruptura
para fabricar polimorfismos de la longitud de los fragmentos (de manera simi-
lar al polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción). Desnatura-
lizando el ADN genómico y enfriándolo rápidamente, se producen en el ADN
estructuras secundarias de asas en lorma de horquilla que se reproducen
velozmente y que pueden servir como sustrato para la ruptura. La digestión del
ADN da como resultado un patrón preciso, que se ha utilizado con éxito para
el análisis de la hepatitis C resistente al interferón-o. (Sreevatsan, 1998) y para
detectar mutaciones específicas en los genes humanos (Rossetti, 1997). Esto
ofrece un análisis versátil del patrón de fragmentación, debido al hecho de que
las asas en forma de horquilla se producen con mucha mayor diversidad que
la mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.
 1294 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
Por eso se pueden utilizar nucleasas especificas de estructura para detec-
tar dianas de ácido nucleico en una secuencia especifica, que se emplean en
los ensayos de puntos mulantes y que se aplican para generar diversos patro-
nes de fragmentación, que son capaces de distinguir genotipos complejos.
Todas juntas, estas tecnologías añaden herramientas muy poderosas a los
análisis de ácidos nucleicos.
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑALES
En los métodos de amplificación de señales no se aumenta la concenlra-
ción de sondas o de dianas. El aumento de la susceptibilidad analítica proce-
de del aumento de la concentración de moléculas marcadas adheridas al
ácido nucleico de la sonda. Para amplificar la detección de la sonda, se han
utilizado múltiples enzimas, múltiples sondas, múltiples capas de sondas y se
han reducido los ruidos del entorno (Kricka, 1999). Los sistemas de amplifi-
cación de las dianas tienen, generalmente, una mayor susceptibilidad analíti-
ca que los métodos de amplificación de señales, pero el desarrollo tecnológi-
co, especialmente en los ensayos de ADN ramificado, ha rebajado los limites
de detección, en algunas aplicaciones, a niveles que pueden rivalizar con los
ensayos de amplificación de las dianas (Kern, 1996).
Los ensayos de amplificación de la señal tienen diversas ventajas sobre los
ensayos de amplificación de la diana. En los sistemas de amplificación de la
señal no se altera el número de las moléculas diana, y el resultado es que la señal
es directamente proporcional a la magnitud de secuencias de la diana, pre-
sentes en la muestra clínica. Esto reduce la preocupación por los falsos posi-
tivos, debidos a la contaminación cruzada, y simplifica el desarrollo de los
ensayos cuantitativos. Puesto que los sistemas de amplificación de la señal
no dependen de procesos enzimáticos para amplificar las secuencias de la
diana, no se ven afectados por la presencia de inhibidores de enzimas en las
muestras clínicas. Por consiguiente, se pueden utilizar menos métodos difíci-
les de extracción del ácido nucleico. Clásicamente, los sistemas de amplifica-
ción de la señal utilizan sondas más grandes o mayor cantidad de sondas que
los sistemas de amplificación de la diana y. en consecuencia, son menos sus-
ceptibles a los errores producidos por la heterogeneidad de la secuencia de
la diana. Finalmente, el ARN puede ser medido directamente sin la síntesis de
un ADNc intermediario.
ADN ramificado
El sistema de la amplificación de la señal del ADN ramificado (ADNb) es un
ensayo de hibridación en sandwich de fase sólida que incorpora series múlti-
ples de sondas de oligonucleótidos sintéticos (Nolte, 1998). La molécula ampli-
ficadora es la base de esta tecnología; es una molécula de ADNb con quince
ramas idénticas, cada una de las cuales puede unir tres sondas marcadas.
Se utilizan varias sondas especificas de secuencia para capturar al ácido
nucleico diana sobre la superficie de un pocilio de microlítulo. Una segunda
serie de sondas específicas de diana también se une a la diana. Las molécu-
las pre-amplificadoras se unen a la segunda serie de sondas dianas y hasta
a ocho amplificadoras de ADNb. Tres sondas marcadas de fosfatasa alcalina
hibridan a cada una de las ramas de la amplificadora. Se consigue la detec-
ción de las sondas marcadas unidas incubando el conjunto con un sustrato
activable por una enzima, dioxetano, y midiendo la emisión de luz con un lumi-
nómetro. La señal que se produce es directamente proporcional a la cantidad
de sondas en la muestra. La cantidad de sondas en la muestra está determi-
nada en una curva estándar externa.
La hibridación no específica de cualquiera de las sondas de amplificación
y los ácidos nucleicos no dianas conduce a la amplificación de la señal del
entorno. En los ensayos de ADNb de tercera generación se introdujeron iso-
citidina (isoC) e isoguanosina (isoG) en las sondas de amplificación para
reducir la hibridación potencial de todas las bases no diana y no naturales
(Collins, 1995). Los pares de bases isoC e isoG mutuamente, pero no con
cualquiera de las cuatro bases, se producen naturalmente (Piccirilli, 1990). En
los ensayos de ADNb, la utilización de sondas de isoC y de isoG aumenta la
amplificación especifica de la sonda sin un aumento concomitante en el entor-
no, con lo cual se amplifican enormemente los limites de la detección. El lími-
te de detección del ensayo de ADNb de tercera generación de' ARN VIH-1 es
de 50 copias/ml. Hay, comercialmente disponibles, ensayos de ADNb para la
cuantificación del ADN del VHB, del ARN del VHC y del ARN del VIH-1
(Bayer). El Sistema 340, plataforma para el ensayo de ADNb. automatiza la
incubación, el lavado, la lectura y el procesamiento de datos.
Ensayo de captura de híbridos
El sistema de captura de híbridos es un ensayo de captura de anticuerpos
de hibridación en solución que utiliza la detección quimioluminiscente. El ADN
diana en la muestra se desnaturaliza y se híbrida con una sonda de ARN
específica. Los híbridos de ADN-ARN son capturados por anticuerpos espe-
cíficos de híbridos de ADN-ARN. con los que se recubre la superficie de un
tubo. Los anticuerpos antihíbridos acoplados a la fosfatasa alcalina unen a los
híbridos inmovilizados. El anticuerpo de unión acoplado es detectado con un
sustrato quimioluminiscente, y la luz que emite se mide en un luminómetro. La
intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN diana en la
muestra. El ensayo de captura de híbridos para la detección de VPH (Cope,
1997) y del CMV (Mazzulli, 1999), en muestras clínicas, está disponible
comercialmente (Digene).
CONCLUSIONES
En este capítulo hemos proporcionado las bases para comprender los prin-
cipios que subyacen en los métodos de amplificación de los varios ácidos
nucleicos y su fuerza y sus limitaciones relativas. La tecnología ya ha tenido
un tremendo impacto en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y en
los desórdenes genéticos, y promete revolucionar la atención y los diagnósti-
cos de los pacientes con cáncer. El poder real de la tecnología se basa en su
capacidad para derribar las disciplinas tradicionales de la medicina de labo-
ratorio. La compresión, por medio de los principios básicos de la tecnología
de amplificación del ácido nucleico, es importante para todos los que están
involucrados en el ejercicio de la medicina de laboratorio, dado que es la tec-
nología que representa el futuro de los laboratorios clínicos.
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 CAPÍTULO 60 • REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
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 C A P Í T U L O
Tecnologías de la hibridación en serie
• Jacques Schrenzel, M.D.
• Jonathan R. Hibbs, M.D.
• David H. Persing, M.D., Ph.D.
TECNOLOGÍAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIÓN 1296
EN SERIE
Macroseries
Microseries
Sustratos de microseries
Fabricación de microseries
Microseries de oligonucleótidos
Microseries de ADNc
Bioinformática
TECNOLOGÍAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIÓN
EN SERIE
Desde hace muy pocos años, la tecnología de la hibridación en serie, que
hace posible la ejecución de miles de reacciones de hibridación simultáneas
en un sustrato sólido sin un solo proceso analítico, ha pasado de ser una teo-
ría a ser una realidad práctica. Estas determinaciones, masivamente parale-
las, ofrecen oportunidades, antes inimaginables, de aplicaciones diagnósti-
cas, que van de la secuenciación del gen y la detección de polimorfismos
genéticos a la medición de los perfiles de expresión del gen en las células
cancerígenas. Las sondas moleculares están unidas a una superficie sólida,
en las series definidas, para permitir la discriminación espacial de las nume-
rosas reacciones que se producen simultáneamente.
La hibridación en serie es el equivalente molecular de una hoja de exten-
sión, donde cada célula o dirección revela un dato específico, que normal-
mente se deducen del enlace de un ligando a su diana específica. Los pri-
meros métodos basados en las series fueron aprovechados en los ensayos
de inmunidad (Ekins, 1987, 1999). Las series también han sido propuestas
para estudios paralelos sobre diferentes moléculas, como las proteínas, los
lípidos, los carbohidratos y las moléculas pequeñas (Fodor, 1991; Guschin,
1997: Pirrung. 1992: Schena. 1998; Southern, 1996a).
Al igual que las interacciones antígeno-anticuerpo en las inmunoseries,
el principio fundamental de las series de ácidos nucleicos se basa en la de-
lección de interacciones intermoleculares específicas. En las series de áci-
dos nucleicos, esta complementariedad se deriva del apareamiento de
bases de nucleótidos de las dos hebras (hibridación). Los estudios ante-
riores sobre la desnaturalización y reformación del dúplex, realizados en
soluciones de ácido desoxirribonucleico (ADN), han hecho posible vaticinar
la cinética de la hibridación y el punto de fusión de los productos, como una
función de la composición del ácido nucleico y de la concentración de sal,
Muchos de los primeros trabajos en este campo están ligados al uso de
membranas de nilrocelulosa (Gíllepsie, 1965) en puntos/manchas (Kafatos.
1979). en sondas de linea y en manchas de Southern (Southern, 1975).
Los rápidos cambios experimentados en este campo en los últimos años
han sido liderados, en parte, por una convergencia tecnológica sin igual de
microfabricación, robótica y bioinformática, fomentados por las demandas
de altas cantidades de análisis genéticos asociados al proyecto del geno-
ma humano.
61
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA TECNOLOGÍA 1299
DE LAS MICROSERIES
Secuenciación de las series
Series de expresión
BIBLIOGRAFÍA 1302
Muchos investigadores especulan ahora con que esta tecnología puede
sustituir, finalmente, a la microscopía de luz para la clasificación de lipos de
tumores, para la determinación de la sensibilidad cromoterapéutica, para la
caracterización de respuestas inflamatorias y para determinar la identidad de
un patógeno infeccioso, debido a la capacidad que tiene la tecnología de hibri-
dación de la matriz para impactar en los procedimientos diagnósticos de
muchos tipos. En la actualidad, muchos fabricantes de EE.UU. y del extran-
jero afirman que están desarrollando matrices para la hibridación. El propósi-
to de este capítulo es revisar las bases teóricas de varios programas de hibri-
dación de la matriz y proporcionar una perspectiva sobre su utilización en el
laboratorio clínico, tanto ahora como en el futuro.
Macroseries
El término macroseries se aplica a la fabricación de series de hibridación
genéticas en matrices macroscópicas, como las membranas de nailon o nitro-
celulosa. La densidad de las macroseries va desde unas pocas docenas de
sondas (también llamadas rasgos, en inglés features) hasta cientos e incluso
miles de sondas depositadas sobre la membrana por impresión o por man-
chas de puntos, que luego se secan y se almacenan para su uso futuro.
La membrana de nitrocelulosa es de interés histórico, ya que fue la prime-
ra matriz sólida que se utilizó ampliamente en la hibridación de ácidos nuclei-
cos. Este material ha dejado de ser popular debido a su fragilidad y a que es
muy inflamable. El nailon y el cristal (sello de silicio) son los soportes están-
dar para hacer microseries. El nailon tiene varias desventajas si se le compa-
ra con el silicio, que ahora se ha convertido en la matriz preferida para las
series de la hibridación fvide infra). Además de su naturaleza porosa, el nai-
lon muestra una autofluorescencia alta, limitando la sensibilidad de la detec-
ción basada en la fluorescencia, debido a los altos valores de fondo. Esto últi-
mo evita, también, la posibilidad de desarrollar ensayos para medir
relaciones. Esta propuesta utiliza dos dianas distintas, cada una marcada con
un flúor diferente (p. ej., las muestras que se toman antes y después de la
administración de un fármaco recetado). Utilizando un control constante,
como una de las sondas, y expresando una relación de las dos señales fluo-
rescentes emitidas, uno puede minimizar las variaciones sonda a sonda al
igual que las diferencias interexperimentales (Brown. 1999; Duggan, 1999).
Actualmente, el uso de las macroseries de nailon está limitado a aplicaciones
específicas, por las cuales las sondas de interés parecen existir en los ensa-
yos prefabricados. Por ejemplo, existen algunas series comerciales que con-
 CAPITULO 61 • TECNOLOGÍAS DE LA HIBRIDACIÓN EN SERIE
tienen todos los genes de citosma conocidos y genes identificados dentro de
las vías de transducción de la señal que se activan durante los procesos infec-
ciosos e inflamatorios. Estas series han sido útiles para el estudio de las res-
puestas del huésped a los procesos infecciosos. Otras series, que incluyen
todo sobre los oncogenes conocidos, han sido utilizadas en la investigación
del cáncer (p. ej., Series del Atlas Humano Clontech, Palo Alto. Ca; o Gene-
filters Research Genetics, Huntsville, AL).
El uso de las macroseries prefabricadas está limitado a los genes conocidos,
y la capacidad limitada de las series de membranas limita su utilización como
objetivo para descubrir genes. Algunos grupos han tenido éxito produciendo
series de nailon de alta densidad, a petición de clientes, con el propósito de
descubrir genes (Clark. 1999; Granjeaud. 1996: Gress, 1992; Pietu, 1996; Taka-
hashi. 1995) La mayor desventaja de las series de nailon, por lo que a esto se
retiere, ha sido el tamaño de la membrana, que representa, prácticamente, una
limitación con respecto al volumen de la sonda que se debe utilizar, en especial
cuando sólo se dispone de pequeñas cantidades de tejido. Debido a que se
espera que las microseries. en vez de las macroseries, representen la platafor-
ma elegida, el grueso de este capítulo se centra en las microseries.
Microseries
Los ensayos de miniaturización ahorran tiempo, a la vez que reducen los
costes en las aplicaciones de diagnósticos biomédicos y en la investigación.
El trabajo con volúmenes más pequeños reduce el consumo de reactivos y
aumenta la concentración de la muestra, por lo que mejora la reacción cinéti-
ca. Estas mejoras le permiten al investigador determinar cientos o miles de
resultados en el tiempo que antes se necesitaba para un solo experimento.
Ahora se pueden conseguir microseries de varios distribuidores comerciales,
junto con la lectura y la fabricación de equipos, a gusto del cliente, de series
dedicadas a la investigación específica o a las aplicaciones diagnósticas (vide
intra).
Sustratos de microseries
La distinción principal entre las microseries y las macroseries consiste en la
elección de un soporte sólido y no poroso. Impidiendo la difusión de los ácidos
nucleicos diana, las superficies no porosas (sustratos de plástico, de cristal o
de silicio) permiten una hibridación cinética más rápida y unos pasos de lava-
do más fáciles. La declaración de las sondas sobre un sustrato sólido es tam-
bién más receptiva para la automatización y posibilita densidades de serie más
altas con una definición de la imagen óptima. Estos rasgos se aplican a cual-
quier tipo de microseries, desde los productos de oligonucleótidos sintéticos a
los de los ADNc clonados o los de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) (Southern. 1999). Actualmente, la mayoría de las microseries se des-
arrollan sobre cristal. Al contrario que en los derivados del plástico, la transpa-
rencia del cristal y la falta de autolluorescencia permiten la detección basada
en la fluorescencia de bajo fondo. Sin embargo, ya que la ciencia de los mate-
riales empieza a estar más comprometida con las tecnologías de sene, puede
que en el futuro inmediato, estén disponibles sustratos alternativos, incluidos
el cristal bañado y los sustratos de plástico.
Fabricación de microseries
Para obtener la inmovilización covalente sobre cualquiera de estas dos
superficies, de cristal o de polipropileno, se requiere la funcionalización del
extremo 3 (esto es, la modificación química) de los oligonucleótidos de ácido
nucleico, de los productos de la PCR, de los ADNc o de los oligómeros de pép-
tidos y ácidos nucleicos (Beier, 1999: Matson, 1995), Por ejemplo, el trata-
miento de láminas de cristal con silano permite al cristal amino tratado unir son-
das ligadas a grupos amino utilizando moléculas bifuncionales, como una
dialdehído o una disotiacina (Case-Green, 1994; Guo, 1994). De forma alter-
nativa, el cristal bañado con un policatión (p. ej.. polilisina) permite la unión
acoplada a la carga directa de las sondas de ADN polianiónico (Maskos.
1993a), un paso de entrecruzamiento por ultravioleta añade enlaces covalen-
tes a la interacción iónica. El enlace covalente es esencial para permitir los
lavados astringentes y, por tanto, la discriminación exacta de las especies
hibridadas. Se han publicado varios protocolos para dirigir la activación de las
1297
superficies (Beattie, 1 9 9 5 : Beier. 1999; Maskos, 1992; Matson, 1995). Hay una
alternativa interesante que consiste en la declaración de parches pequeños de
poliacrilamina a los que los oligonucleótidos presintetizados son unidos por
microinyección (Guschin. 1997; Khrapko. 1991: Yershov. 1996).
La densidad de empaquetamiento de las sondas unidas a las superficies
sólidas influirá enormemente en el rendimiento de las matrices de hibridación.
La poca eficiencia del emparejamiento, que se encuentra, a menudo, en las
matrices de cristal, puede dar como resultado una baja densidad de la sonda
y bajos índices de señal/ruido. Por otra parte, el empaquetamiento demasiado
denso de los oligonucleótidos sobre una superficie sólida ongma un impedi-
mento espacial. Este obstáculo puede ser incluso más impresionante con bio
moléculas más largas, como los ADNc. Se puede aumentar el rendimiento de
la hibridación por hasta dos órdenes de magnitud introduciendo espaciadores
entre la superficie y los oligonucleótidos (Southern. 1999). Cuanto más largo
sea el espaciador, mejor será la hibridación, pero es interesante saber que hay
una longitud del espaciador óptima, más allá de la cual desciende el rendi-
miento de la hibridación (Duggan, 1999: Shchepinov, 1997). Por ejemplo, un
espaciador de 40 átomos de carbono proporciona un aumento de la hibrida-
ción de 150 veces, ya descrito (Shchepinov. 1997). Aproximadamente, la den-
7
sidad de los oligonucleótidos es de 0.1 pmol'mm en superficie de cristal, dos
órdenes de magnitud menos que en el polipropileno aminado. Por eso, en la
actualidad, la ventaja potencial de las matrices de cristal sobre las de plástico
es una densidad ohgonucleótida óptima asociada a un impedimento espacial
más bajo (Southern, 1999). Si se mejora la calidad de las superficies químicas,
algún día se podrán fabricar series sobre película o sobre hojas de plástico, lo
que reducirá enormemente los costes de producción,
La composición terminal (extremo-5) de los oligonucleótidos influencia su
rendimiento. Como se esperaba, los extremos 5' ricos en G:C llevan a un ren-
dimiento mejor que sus homólogos (la misma composición pero secuencias
diferentes) (Maskos, 1993b). Por tanto, para minimizar esta contribución, se
pueden considerar las propuestas para modificar el extremo 5' de los oligonu-
cleótidos (p. ej.. la adición covalente de un nexo degenerado). Por otra parte,
el saber que los errores en los extremos son menos desestabilizadores y. por
tanto, más difíciles de discriminar por la hibridación (Southern, 1999) ha lleva-
do a introducir mejoras inteligentes para la detección de los acontecimientos
de la hibridación. Se han desarrollado métodos enzimáticos con una detección
de astringencia mejorada (minisecuenciación de fase sólida [Pastinen. 1997.
1998; Syvanen. 1999]. análisis de unidades de información genética [Nikilorov,
1994] o ensayos de ligación [Landgren, 1988: Nickerson. 1990], ya que las
polimerasas y las ligasas son más sensibles a los errores terminales (como
oposición a los internos).
Marshall (1998) ha analizado las series que hay en el mercado. La fabrica-
ción de microseries comprenden dos amplias categorías: las que se hacen
depositando la sonda directamente sobre la superficie sólida y las que se
hacen por síntesis in situ. Hay un tercer método, desarrollado por Nanogen (San
Diego. CA), que se compone de oligonucleótidos prefabricados caplurados sobre
manchas electroactivas en chips de silicio (Cheng. 1998: Edman, 1997; Heller,
1998; Sosnowski. 1997). La modificación del campo eléctnco por electrodos inde-
pendientes dirigibles espacialmente puede acelerar la hibridación, y cuando la
polaridad es invertida, proporciona un lavado astringente (Edman, 1997).
Tecnologías de liberación
Pat Brown y otros colaboradores fueron los que iniciaron la declaración de
moléculas presintetizadas (Schena. 1995; Shalon. 1996). Se preparan las
sustancias bioquímicas (p. ej.. las proteínas, los péptidos. los oligonucleóti-
dos, los ADNc), se purifican y se almacenan en placas de microtitulos. Mecá-
nicamente se depositan pequeñas cantidades de moléculas en las localiza-
ciones exactamente definidas sobre una superficie sólida, utilizando diversos
sistemas robóticos de precisión. Este método es muy flexible en cuanto a la
composición bioquímica, a la topología de la microserie (p. ej.. el tamaño y la
densidad de las manchas, las manchas de réplica para cada molécula) y a su
facilidad para hacer prototipos. Los métodos mecánicos permiten la síntesis
de microseries de elevada a moderada densidad (hasta cerca de 16.000 son-
das por cm- [Graves. 1999]). Es el método elegido cuando se necesita gran
número de microseries con la misma composición, así como para secuencias
largas que utilizan productos de la PCR. En la actualidad, varias compañías
 1298 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
están fabricando y vendiendo senes prefabricadas (p. ej„ Micromax. NEN Life
Science, Boston, MA) o repetidores basados en la deposición (Cheung, 1999)
como alternativa a la construcción de un repetidor (Brown, 2000).
Los procedimientos de liberación se componen de diferentes sistemas de
microimpresión y han sido recientemente revisados (Bowtell. 1999). La mayo-
ría de los repetidores utilizan puntas microdispensadoras parecidas a una
pluma estilográfica (p. ej.. Cartesian Tecnologies. Irvine, CA), aunque se han
desarrollado algunos sistemas originales, como la técnica de pincho y anillo
(Genetic MicroSystems. Woburn, MA). En general, y debido a la tensión
superficial, a la electricidad estática y a otros electos, la reproducción de las
senes impresas es más baja que la síntesis in situ. y debe ser corregida por
medio de experimentos separados (repetidos), por las réplicas de las man-
chas (en la misma plancha), por la detección de la lluorescencia multicolor y
por otros algoritmos de detección específicos o por ambos (Chen. 1997).
Debido a su flexibilidad y a su disponibilidad, la tecnología de las senes impre-
sas tendrá, probablemente, el mayor impacto en los laboratorios clínicos y de
investigación en el curso de los próximos años.
Síntesis in situ
La síntesis in situ permite producciones más altas, variaciones de chip a chip
más bajas, asi como densidades de sondas más altas. Estos métodos también
permiten la fabricación de series de "acceso al azar" genuinas. esto quiere decir
que cada oligonucleótido. en cualquier posición, puede tener cualquier secuen-
cia elegida (Southern, 1999). Las estrategias de combinación se refieren a
métodos que han sido desarrollados para hacer microseries que contienen
todas las secuencias de una longitud dada (también se las conoce como "senes
genéricas"). Las series de combinación se han fomentado, principalmente, para
estudiar el comportamiento de las hibndaciones a gran escala (Southern. 1994),
o para la secuenciación de los ácidos nucleicos en estado sólido (Drmanac,
1993a, 1993b, 1999. 1998: Lipshutz, 1993: Macevicz. 1991; Strezoska. 1991),
Las técnicas de fabricación incluyen a las máscaras fotolitográficas para
controlar la activación química por medio de pasos de fotodesprotección
(Fodor, 1991). de declaraciones por inyección de tinta (Stimpson, 1998), así
como de barreras físicas para la inundación secuencial de los precursores
(Maskos. 1993c). Affymetrix ha emparejado la desprotección fotoquímica con
la síntesis del ADN en fase sólida adaptando las técnicas de la industria de los
semiconductores (Lipshutz, 1999; Lockhart. 1996: Pease, 1994). Los nexos
sintéticos modificados con grupos protectores transportables por medio de la
fotoquímica son unidos a los chips de silicio. La fotodesprotección localizada
se produce por medio de rayos UV brillantes a través de una máscara fotolito-
gráfica y deja que las unidades básicas (desoxinucleósidos protegidos de
hidroxilos) reaccionen con los grupos desprotegidos (Fodor. 1991). Los ciclos
alternos de fotodesprotección e incubación con distintas unidades básicas quí-
micas permiten la síntesis dirigida por rayos de los polidesoxinucleótidos. Los
ohgonucleótidos sintetizados tienen una longitud práctica máxima debido a la
eficiencia limitada de la fotodesprotección (del 80% al 95% en cada ciclo) (For-
man, 1999). Por tanto, la proporción de 20-mers que muestra la secuencia pre-
definida está entre el 1% y el 36% (0.8E20 a 0.95E20) (Fodor. 1991).
Las máscaras o barreras mecánicas permiten la limitación de las áreas de la
superficie antes de ser inundadas por los precursores definidos. Las máscaras
físicas de formas diferentes (en forma de rombo, de circulo) permiten la sínte-
sis in situ de un precursor dado en localizaciones conocidas. El desplazamien-
to secuencial de las máscaras, seguido por la inundación de otro precursor, per-
mite la síntesis de las series de combinación extensas de desoxinucleótidos
(Maskos, 1993c; Southern 1992,1996b). A fecha de hoy, Affymetrix es capaz de
sintetizar hasta 400.000 polidesoxinucleótidos diferentes en un área de 1,6 cm-
(Fodor, 1991). A pesar de su alto coste, este es el método elegido para los estu-
dios de la expresión génica diferencial a gran escala, debido a su susceptibili-
dad, su capacidad de reproducción y a la redundancia de información.
Las tecnologías de inyección de tinta deben su desarrollo a la industria impre-
sora y actualmente están siendo desarrolladas por varias compañías Incyte
Pharmaceuticals (Palo Alto, CA), Protogene (Palo Alto, CA) y Rosetta Inphar-
matics (Kirkland, WA) (Blanchard, 1996). Esta tecnología también está disponi-
ble en el mercado (Ink-Jet. Packard Instruments. Meriden, CT: Piezoelectric
pump. GeSiM. Grosserkmannsdorf, Alemania). Esta propuesta ofrece versatili-
dad en las biomoléculas que están siendo liberadas y elimina la necesidad del
contacto físico con las superficies de las series; esta última propiedad puede ser
relevante para el desarrollo de las series bañadas con finas láminas de metales
y que utilizan diferentes métodos de detección (Heyse, 1998; Schmid, 1998). Se
puede detectar una leve dispersión de las micropartículas que eslán marcando
a las secuencias dianas cuando, de inmediato, aflora en la superficie del cristal
una ola evanescente. Este método permite la medición de afinidad en tiempo
real con un poso muy bajo (Stimpson. 1996).
Microseries de oligonucleótidos
Se ha estudiado ampliamente la termodinámica, la cinética de la hibrida-
ción y los aspectos cuantitativos de la hibndación de los oligonucleótidos
(revisado por Hoheisel, 1996; Wetmur. 1991). La utilización de los oligonu-
cleótidos en las series tiene ventajas y desventajas potenciales. Las desven-
tajas potenciales son: una susceptibilidad más baja que las series
de ADNc, para la detección de mensajeros poco comunes o para la de dia-
nas de hibndación, y su poca capacidad, desde el potencial de la hibridación,
para predecir las características de la hibridación y, por tanto, la intensidad
esperada de la señal no parece correlacionarse bien con el contenido de G:C
o con la temperatura de fusión (Graves, 1999; Lockhart, 1996), Basándose
en estos conocimientos, las series de oligonucleótidos se pueden hacer por
la deposición de oligonucleótidos sintéticos o por la síntesis in situ. Esle
método ofrece numerosas ventajas sobre la liberación de los productos de
ADNc o de la PCR. Las condiciones de la hibridación pueden ser más homo-
géneas que en la serie del ADNc, con tal de que ésta esté diseñada con oli-
gonucleótidos de tamaños equivalentes.
Las series de oligonucleótidos no requieren, necesariamente, del conoci-
miento anterior de las secuencias dianas. Se pueden dividir en dos campos: las
series genéncas (que representan a una matnz de oligonucleótidos azarosa) o
las series especializadas (por vanaciones moleculares de una diana predermi-
nada). Las series genéricas han sido propuestas como una alternativa barata a
la secuenciación. Es posible "pasearse" por todas las posiciones a lo largo
de una secuencia de nucleólidos si se utilizan todas las combinaciones posi-
bles de un n-mer. Hyseq (Sunnyvale, CA) reclama una posición de liderazgo en
el campo de la secuenciación por hibridación. Esta propuesta inteligente está,
actualmente, limitada por la complejidad del algontmo que se necesita para
generar grupos (la conversión de una lista de n-mers hibridados en una secuen-
cia significativa). Además, si la secuencia que se está analizando contiene una
región repetida (la misma secuencia aparece más de una vez sin la molécula
diana), el diagrama de reconstrucción tendrá que desplegar un número corres-
pondiente de puntos de ramificación que derivarán a una secuencia ambigua.
Una propuesta de este tipo depende del acceso azaroso de la síntesis. Este tipo
de serie es el único capaz de detectar las secuencias que faltan en las grandes
bibliotecas electrónicas. Como contraste, las senes especializadas se utilizan
para las secuenciaciones repetitivas (resecuenciación) de la misma diana para
la detección de polimorfismos de nucleótidos o de mutaciones funcionales. Esto
implica el conocimiento de las dianas y sus variantes más frecuentes, para incor-
porar grupos predeterminados de nucleótidos en las series diagnósticas. Este
método se ha utilizado para la detección de polimorfismos genéticos asociados
a la resistencia a los fármacos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), así
como para otros polimorfismos (vide iníra). Las series de oligonucleótidos tam-
bién se pueden utilizar para definir los polimorfismos de un solo nucleótido (Guo,
1994). incluso comparando dos muestras con fluorescencia multicolor (Chee,
1996). Más adelante se describen otros ejemplos de este método.
La búsqueda de oligómeros de afinidad más elevada ha abierto el camino
para las modificaciones químicas de las sondas y de los moldes de oligonu-
cleótidos para mejorar la cinética y la termodinámica de los enlaces. Las son-
das de péptidos de ácido nucleico (PAN) hacen que la hibridación se efectúe
en una astringencia más elevada, debido a la alta estabilidad de las PAN-ADN
dúplex (Corey. 1997). Las sondas mediadas de ARN (Corey, 1998) muestran
afinidades similares relativas. Sin embargo, las PAN muestran condiciones de
hibridación más rápidas que sus ácidos nucleicos equivalentes, debido, funda-
mentalmente, a su estructura neutral de columna vertebral (Freeman, 1999).
Por regla general, se puede decir que, a pesar de que sería una clara ventaja
la reducción de los tiempos de hibridación de horas a minutos, se debe supe-
rar el problema que hay de no poder predecir los puntos de fusión de estos oli-
gómeros de alta afinidad antes de su aplicación en las microseries (Weiler.
 CAPÍTULO 61 • TECNOLOGÍAS DE LA HIBRIDACIÓN EN SERIE
1997). Además de las sondas, también las dianas pueden ser modificadas quí-
micamente para localizar las señales amplificadas. Las regiones dianas ricas
en pirimidina pueden generar señales más altas de hibridación añadiendo
5-metiluridina durante la transcripción in vilro (Hacia. 1998).
Microseries de ADNc
Las microseries de las secuencias de ADNc permiten la monitorización
basada en la hibridación de genes similares. Por tanto, esta estrategia impli-
ca el acceso a los clones o la posibilidad de generar productos de la PCR.
Hasta la fecha, las mejores estrategias utilizan la detección fluorescente de
dos colores para discriminar entre una muestra y su control y para comprobar
el nivel diferencial de la expresión. Pat Brown y sus colaboradores en la Uni-
versidad de Stanford fueron los pioneros y verificaron este método (Schena.
1995,1996; Shalon. 1996). Las ventajas de este método se basan en calcu-
lar una relación en cada sonda, en controlar la calidad de la sonda, en las pro-
piedades específicas de hibridación de cada par de dianas o sondas y en la
eficacia en el mareaje. Synteni (una compañía subsidiaria de Incyte. Palo Alto.
CA) ha desarrollado para este propósito su microserie de expresión génica
(Schena. 1998). La compañía NEN Life Science vende ahora portas de cris-
tal con 2.400 genes humanos conocidos (MicroMax).
A pesar de que parecen intrínsecamente menos reproducibles, en la actuali-
dad las microseries de ADNc ofrecen la mayor versatilidad en cuanto a la depo-
sición de las sondas se refiere, y a la accesibilidad de la tecnología. Varias com-
pañías están ahora ofertando equipos para la fabricación de senes y para la
lectura de las matnces hibridadas. Las series de ADNc y las series de oligonu-
cleótidos de densidad elevada probablemente tendrán papeles complementa-
rios relevantes, en los próximos años, en los laboratorios de investigación: las
senes de densidad elevada se usarán, primordialmente, para el descubrimiento
de locus de relevancia diagnóstica, y las series dedicadas se utilizarán, cada vez
más. para los análisis de densidad media a baja de los locus de relevancia diag-
nostica descubiertos por los análisis de sene de densidad elevada.
Problemas de la propiedad industrial
La tecnología de las microseries es un campo que avanza rápidamente y en
el que existe una competencia feroz. Por eso es importante enfatJzar el hecho
de que se han registrado muchas patentes y de que algunas de ellas son direc-
tamente relevantes en los diagnósticos clínicos. Por ejemplo, Affymetrix (Santa
Clara, CA) posee derechos sobre las patentes que son esenciales para las
series de oligonucleótidos de densidad elevada (Chee. 1998; Holmes. 1998),
sin tener en cuenta los propósitos para los que fueron hechas. Si un laborato-
rio, presuntamente, decide desarrollar series de densidad moderada para aná-
lisis de tumores y cobra por este servicio, este ensayo puede infringir los dere-
2
chos de las patentes de Affymetrix si exceden las 400 unidades/cm. sin tener
en cuenta de qué tipo es el método de la síntesis (Fodor, 1998). Las tecnolo-
gías de las series que utilizan micromatnces de tampones de gel de poliacrila-
mida (elementos de gel tndimensionales), representan un método nuevo que
puede que no infrinja los derechos de Affymetrix (Guschin, 1997; Khrapko. 1991
Yershov, 1996). Esperemos que. como ocurrió con las tecnologías de amplifi-
cación de los ácidos nucleicos, la competencia entre fabricantes rebaje los cos-
tes y permita la democratización de esta tecnología tan poderosa.
Bioinformática
La bioinformática es un componente esencial en las microsenes, desde que se
empieza a diseñar la serie hasta los sofisticados análisis de datos. Utilizando
robots controlados por ordenador, las biomoléculas pueden ser distribuidas, exac-
ta y precisamente, en cualquier configuración de gradilla deseada. Este paso es
relativamente trivial y parece que se adapta bien a la capacidad de los instru-
mentos que hay en el mercado (Bowtell. 1999). Sin embargo, se debe seguir con
atención el vinculo secuencia arriba entre cada punto y el pocilio (y la placa) de
donde procede la biomolécula. El nuevo software (p. ej„ CloneTracker, BioDisco-
very, Inc. Los Angeles, CA) garantiza la identificación correcta de cada sonda
durante la fabricación de las microseries y el tratamiento de los datos para corre-
lacionar rápidamente una señal con una sonda específica. En los lugares donde
se llevan a cabo las senes de tamaño medio a grande, lo más sensato es la utili-
zación de un sistema de código de barras. La obtención de datos genera gran
1299
cantidad de grupos de datos (generalmente una imagen utiliza de 10 a 50
megabites) que se tienen que almacenar en formatos estándar (BMP, GIF.
JPG). El software procesador de imágenes mostrará una creciente automatiza-
ción. Este software debe garantizar el ajuste apropiado de la gradilla y la detec-
ción de restos, así como identificar las características para obtener información
significativa. El aspecto de las microseries que más desafios encara empieza
aquí, cuando las grandes cantidades de grupos de datos se han reunido y pur-
gado de restos y esperan para el análisis (Vingron, 1999). Se pueden utilizar
dos estrategias. La hipótesis clásica del análisis consiste en la agrupación (uti-
lizando vanas herramientas estadísticas) de genes que se comportan de forma
similar. Entonces, se pueden deducir los genes potencialmente co-regulados o
detectar la expresión diferencial. Sin embargo, estos datos son. sólo, fortuitos.
La otra estrategia asume que. después de ejecutar un proceso estadístico o de
visualización, los datos "hablan por si mismos" (Bassett, 1999; Brown. 1999). El
software que está disponible comercialmente permite hacer estos análisis, pero
con frecuencia los investigadores tendrán que personalizar estos programas, e
incluso puede que tengan que escribir sus propios algoritmos. Uno de los pro-
blemas logísticos que han surgido y que entrañan más desafios para las tec-
nologías de las microseries son las extensas bases de datos capaces de ser
tratadas por la red. Ya está muy claro que probablemente la información signi-
ficativa provenga de la comparación entre experimentos múltiples, más que de
las deducciones de un experimento basado en un solo fragmento, siendo esto
tan complejo. Por eso, debido a la imperiosa necesidad del reconocimiento del
patrón, de la interpretación multidimensional de los datos y de la comparación
cruzada del programa, las tecnologías de las microseries van a tener una ínti-
ma relación con la bioinformática, y la evolución conjunta del hardware y del
software parece ser inevitable (véase Cap. 6).
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA TECNOLOGÍA
DE LAS MICROSERIES
En los últimos años se han propuesto numerosas aplicaciones de la tecno-
logía de las microseries, que van de la clasificación molecular de tumores
a la identificación y caracterización de agentes microbianos. Esto ha llevado
a muchos a especular con que la tecnología de las senes representa la
"nueva ola" de los avances tecnológicos, que va a tener un impacto práctico
en los diagnósticos de las enfermedades humanas, precedida sólo por la
PCR, como tecnología central en los laboratorios clínicos de diagnósticos
moleculares. Esta sección se centra en las aplicaciones, actuales y futuras,
de la tecnología de las series.
Secuenciación de las series
Los datos de las secuencias de los ácidos nucleicos son fundamentales
para la biología molecular moderna. Los métodos convencionales (Maxam,
1977: Sanger, 1977) llevan tiempo, el trabajo es intensivo y son caros. Los
métodos de secuenciación alternativos que utilizan la hibridación en fase sóli-
da se propusieron en base a una teoría (Bains. 1988; Khrapko, 1989) a menos
de 15 años del descubrimiento de estos métodos (Southern. 1975). A los artí-
culos teóricos les siguieron después los datos, que confirmaban los principios
de la secuenciación basada en la serie, de moldes cortos artificiales (Pannov,
1996: Pease, 1994; Southern, 1992). En 1999 se publico un artículo, muy bien
escrito, sobre los métodos de secuenciación de las microseries (Hacia. 1999).
Sin embargo, el lector puede advertir que muchos de los trabajos publicados y
citados en esta área provienen de investigadores con intereses financieros en
uno o varios dispositivos patentados, y que estas publicaciones evalúan, Más
que respaldar a un método o dispositivo especial, este capítulo trata de fami-
liarizar al lector con los principios básicos de las senes,
En teoría, cualquier secuencia de ácido nucleico se puede romper en
subgrupos de longitud n. Después, todos esos oligonucleótidos posibles, de
longitud n (n-mers) se pueden situar en localizaciones estables sobre una
superficie sólida. El ácido nucleico que va a ser secuenciado (el molde) se
amplifica, si es necesario, se marca con una molécula fluorescente, luminis-
cente o radiactiva y se le permite que hibride a las series de unión de n-mers.
La detección de la marca permite, al que está haciendo la secuencia, verificar
un resultado con un n-mer en un locus particular en la superficie sólida. La
 1300 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
intensidad de la señal en ese locus debería ser directamente proporcional al
número de dominios en el molde correspondiente al n-mer en ese locus. De
los métodos para todos estos pasos, se ha dado una idea general en las sec-
ciones precedentes de este capítulo.
Para las aplicaciones de la secuenciación, los n-mers que se ajustan al
molde se agrupan, luego, en un orden definido por el análisis de los n-mers
con la secuencia solapante, que en principio es igual al ordenamiento de gru-
pos por los programas de secuenciación a gran escala. Piensen en un molde
nonanucleólido que bajo condiciones astringentes es unido solamente a los
locus que contienen cuatro tetrámeros en una serie con todos los 256 tetrá-
meros posibles:
Tetrámero Intensidad
5ACTG 2
5'CTGA 2
5'TGAC 1
5'GACT 1
Desde las áreas replegadas, no es muy útil razonar que el molde nonanu-
cleótido fuera 5'ACTGACTGA. Este tipo de análisis se hace directamente por
ordenador. Desde el ordenador se puede automatizar el escáner de la serie
para detectar la marca, el mareaje mismo y, en alguna medida, incluso la
extracción y la amplificación del ADN: es estupendo imaginar que una "caja
negra" puede realizar todo esto en una tarde. Sin embargo, pensemos en un
nonanucleótido que une a los locus que contienen los siguientes tetrámeros:
Tetrámero Intensidad
5'TCTA 1 que el 0,5% de prevalencia de la resistencia a los fármacos no sea importan-
5'CTAC 1 te en un virus que genera más de un billón de copias al día.
5 TACT i
5'ACTT 1
5'CTTC 1
5TTCT 1 Series de expresión
Esto podría representar 5' TCTACTTCT o 5' TTCTACTTC, y no hay mane-
ra de resolverlo por ordenador. Donde n es menos que la mitad de la longitud
del molde, repetir la misma longitud como n/2 puede dar resultados ambiguos.
El ordenador empieza a tener cada vez más dificultades, ya que la longitud del
molde llega a ser un múltiplo de n cada vez más alto; en consecuencia, es
deseable tener un n tan largo como sea posible para la secuenciación de los
dominios no conocidos. En la práctica, la longitud de n sigue limitada por la
tecnología, sin embargo, desde entonces 4" (el número de locus que se preci-
san para la representación universal) excede a 1 millón por n = 10. Esto limi-
ta los métodos actuales del número de oligonucleótidos diferentes que pueden
ser diferenciados sobre un chip fotolitográfico (Lipshutz, 1999).
Y una vez descritas estas limitaciones intrínsecas, en la actualidad es mejor
reservar la secuenciación basada en las microseries para los sitios amplia-
mente conservados, donde el conocimiento de la secuencia esperada es
mucho mayor. Aquí, el número de locus que se precisan no necesita aproxi-
marse a 4". ya que hay un número limitado de secuencias posibles para ser
identificadas. La detección de polimorfismos de un solo nucleótido de un gen
fenotípicamente definido (Cronin. 1996; Hacia, 1996) es una estrategia arque-
tipica apropiada para la secuenciación basada en las microseries. Sus aplica-
ciones especificas incluyen la detección de alelos de resistencia antimícrobia-
nos (Kozal. 1996; Troesch, 1999), las mutaciones de puntos asociados con el
cáncer (Ahrendt, 1999), las secuencias específicas de especies en un sitio
ampliamente conservado (Gingeras, 1998) y la identificación de mutaciones
en genes conocidos para determinar su papel en una enfermedad de origen
desconocido (Halushka, 1999). A pesar de que los costes de esta tecnología
siguen siendo altos, es posible que bajen según vaya aumentando la pro-
ducción. Suponiendo que los costes bajen, los métodos de secuenciación a
través de microseries serán, probablemente, los preferidos en las aplicaciones
clínicas donde se requiera la secuenciación repetitiva de la misma diana.
Además de los costes, la secuenciación de microseries tiene algunas limi-
taciones técnicas, incluso para sitios ampliamente conservados. En la mayo-
ría de los casos, mientras que al investigador se le proporciona la secuencia
interpretada, el instrumento de recogida de datos sigue siendo una "caja
negra", sin las señales visuales que relacionan directamente a un nucleótido
específico de la secuencia mencionada. Algunas veces, una imagen del cro-
matograma (de un secuenciador capilar) o del gel (de una secuenciación
de gel) puede resolver las ambigüedades o las inconsistencias de los datos de
la secuenciación. Sin embargo, los usuarios de los secuenciadores actuales
de microseries quizá tengan que aceptar que los datos primarios de los cua-
les se deduce su secuencia no pueden ser interpretados directamente, bien
porque es demasiado complejo o bien porque la composición y la localización
en el chip de los oligonucleótidos específicos sigue siendo un secreto indus-
trial de los fabricantes, o por ambas cosas. Esto no tiene que ser, necesaria-
mente, una desventaja para los laboratorios clínicos, aunque sea frustrante
para los investigadores, ya que, en ellos, es cada vez más corriente el uso de
sistemas automatizados y de la interpretación guiada por el ordenador. Para
las aplicaciones clínicas, en general, una limitación más seria es intrínseca a
la secuenciación como una estrategia diagnóstica. Debido al potencial de
velocidad y de automatización, la secuenciación de microseries resulta atra-
yenle como alternativa a los métodos fenotipícos clásicos y. muy notable-
mente, a la selección de resistencias a los fármacos. Como todas las estrate-
gias de secuenciación, las microseries tienen una sensibilidad limitada para
los alelos minoritarios. Particularmente instructivo es el ejemplo de la identifi-
cación de la resistencia a los fármacos en el VIH basada en la secuencia. La
secuenciación de microseries de aislados clínicos puede pronosticar correc-
tamente algunos casos de resistencia a los fármacos basándose en mutacio-
nes específicas (Race, 1998), y ya se está convirtiendo en una práctica están-
dar (Perez-Olmeda, 1999). Incluso suponiendo que la secuenciación pueda
detectar un alelo resistente cuando está representado en más de o igual a un
1% de la población vírica, hay razones, sin embargo, para dudar del valor pro-
fético de una prueba negativa de resistencia. Pocos virólogos argumentarían
La expresión diferencial del gen es el problema fundamental de la biología
molecular. Generalmente, la pregunta que nos hacemos es" ¿La expresión de
qué gen está asociada con este resultado en particular?". Desde los viejos
malos tiempos de sustracción de bibliotecas y de manchas de Northern a los
métodos más modernos de selección, como la demostración de la diferencia
(Liang, 1992) o la amplificación de la diferencia (Lisitsyn, 1993), los métodos
siguen siendo caros, el trabajo intensivo y se emplea mucho tiempo. Las
microseries son prometedoras en cuanto a afrontar este problema de una
manera no solamente menos cara, con menos trabajo y más rápida que con
los métodos antiguos, sino que permitirán los análisis mucho más complejos
del problema en cuestión. Los métodos más antiguos se basan en la identifi-
cación de uno o, a lo sumo, de un puñado de secuencias para comparar entre
muestras de control y experimentales. Los sistemas basados en las microse-
ries ofrecen un programa para cuantificar la expresión de miles de genes al
mismo liempo (Brown, 1999). Esto permite el análisis de cassettes enteras de
genes, o patrones de expresión del gen. nada menos que de uno, dos o tres
genes al mismo tiempo. El método que permite el estudio de los aconteci-
mientos de la transcripción puede estar anticuado, debido a que en la ciencia
biomédica la mayoría de los problemas de interés general involucran a varios
genes que actúan todos de acuerdo.
Por lo general existen dos tipos de series para hacer los análisis de expre-
sión. En uno se pueden utilizar series de porciones enteras o sustanciales de
ADNc o de exones. utilizando en la microserie secuencias largas de cientos de
bases en locus individuales. Aunque la síntesis comercial se encuentra en el
mercado, estas series se pueden preparar en cualquier laboratorio utilizando
mecanismos hechos con componentes caseros (Brown, 2000: Schena. 1995).
Esto permite hacer análisis de la expresión personalizados a un precio razo-
nablemente bajo y dando un rodeo a las patentes de fotolitografía. Por otra
parte, estas series representan una pequeña o ninguna variedad de alelos
para cada gen, con poca distinción en la representación entre las regiones
variables y constantes del gen expresado. Alternativamente, se pueden utilizar
series hechas de oligonucleótidos solapantes, que incluyen las regiones de
diferenciación de varios genes. Estas series se preparan por medio de la foto-
 CAPÍTULO 61 • TECNOLOGÍAS DE LA HIBRIDACIÓN EN SERIE
litografía, utilizando métodos propios y máscaras complejas. Debido a esto
son caros, y para los pequeños laboratorios su disponibilidad es limitada (Fox,
1999). No obstante, permiten que miles de genes a la vez detecten a todos
los alelos conocidos y proporcionen información cuantitativa y detallada de
cualquiera de las secuencias (incluidos los alelos patógenos) que están repre-
sentadas en la transcripción. Incluso se puede detectar, rápidamente, la
expresión de bajo nivel del gen con un alcance de más de 1.000 (Lockhart.
1996). Las series de ADNc y las de oligonucleótidos se han utilizado con éxito
para afrontar los eternos problemas de la biología de la expresión. En 1999
se publicaron los aspectos prácticos y los méritos relativos de varios sistemas
(Bowtell, 1999).
La investigación publicada en 1995. por Schena y cois, del laboratorio de
Pat Brown, fue la de un resultado seminal en la utilización de senes de ADNc
de alta densidad sobre cristal para el análisis de la expresión (Schena, 1995).
Los autores marcaron el ADNc de la Arabidopsis. cuyo genoma está entre los
más pequeños de cualquier eucariota. En un prototipo de los experimentos
subsiguientes se marcó a los ADNc de la hoja y de la raíz de la planta con dife-
rentes fluorocromos. Utilizando series de productos amplificados por PCR de
clones seleccionados al azar de una biblioteca del ADNc de la Arabidopsis, los
autores identificaron 26 genes, cuyo índice de transcripción era diferente en
cinco veces o más entre la hoja y la raíz. Esta diferencia ambiental no era
especialmente sutil, pero esta investigación representó una desviación notable
de las publicaciones anteriores de la expresión diferencial, en las que el des-
cubrimiento de cinco o menos genes expresados diferencialmente podría
haber sido considerado un triunfo colosal. Las acciones subsiguientes efec-
tuadas por el mismo laboratorio encontraron en las células humanas once
genes regulados hacia arriba y seis regulados hacia abajo dos veces o más
por medio de un choque de calor de 43" C, así como también seis genes regu-
lados hacia arriba dos veces o más por exposición a esteres de lorbol (Sche-
na. 1996). En estos experimentos hibndaron el material del molde sobre, apro-
ximadamente. 1.000 secuencias de genes a la vez. aumentando por dos
órdenes de magnitud el número de acontecimientos de la transcripción que
podrían ser asociados con un estímulo delinido en un bloque de experimentos.
Desde estas primeras publicaciones, otros laboratorios han utilizado métodos
similares para descubrir 30 genes regulados hacia arriba por radiación ioni-
zante (Amundson. 1999), 62 genes expresados diferencialmente en neuronas
afectadas de esclerosis múltiple (Whitney. 1999) y 89 genes expresados dife-
rencialmente entre las células del carcinoma de las células renales y las célu-
las derivadas de un riñon humano normal (Moch, 1999).
Se han hecho progresos similares con programas de oligonucleótidos foto-
litografiados. Éstos se han utilizado para identificar 23 transcritos que median
la respuesta a un gen asociado al cáncer de mama (Harkmg, 1999). 94. 268
y 129 genes cuyos niveles de transcripción cambiaron dos veces o más des-
pués de la exposición a interferón (IFN) -a, y -y, respectivamente, de célu-
las derivadas de un librosarcoma (Der, 1998); y 258 transcritos cuyo nivel
cambió cuatro veces o más después de la exposición a otomegalovirus de
fibroblastos humanos (Zhu, 1998).
Las últimas publicaciones citadas, que sólo son unos pocos ejemplos de toda
una gran y creciente documentación, analizan aproximadamente 5.000 ADNc al
mismo tiempo, en comparación con los aproximadamente 1.000 de las prime-
ras investigaciones de las microseries de ADNc. El número más amplio se
aproxima al número de secuencias codificantes de proteínas en los genomas
procarióticos. La proporción en aumento de estos análisis de expresión de las
microseries hace que estos métodos sean especialmente atractivos para los
estudios in vilro de las procariotas (de Saizieu. 1998). de las cuales más de
20 se han secuenciado en su totalidad. Si bien la extracción de ARN de las
procariotas es menos precisa, desde que se debe utilizar ARN entero, en vez
de ARN poliadenilado, como molde para la transcripción inversa, la globalidad
de este análisis es una gran ventaja. Se puede capturar una imagen comple-
ta de genes de procariotas codificantes de proteínas en una sola membrana
de nailon (Tao. 1999). También es posible una propuesta similar del genoma
completo con eucariotas simples. El bloque Ye6100 de cuatro chips de oligo-
nucleótidos fotolitograliados contiene información secuencial acerca de más
de 6.000 marcos de lectura abiertos, lo que posibilita una evaluación detalla-
da de la respuesta Iranscripcional a través del genoma completo de la leva-
dura Saccaharomyces cerevisiae (Holslege. 1998: Jelinsky, 1999; Wodicka,
1997).
1301
Además de incrementar el numero total de las secuencias analizadas, las
nuevas estrategias analíticas de los datos de las microseries también están
mejorando los análisis de la expresión de los genes. Estos métodos hacen
evidentes los límites para analizar uno o varios genes a la vez, los cuales
demuestran amplios grupos de genes que responden a estímulos individua-
les. Y lo que es peor, los genes cuyos niveles de transcripción responden a
un estímulo a menudo también responden a otros estímulos (Fambrough.
1999). En vez de analizar cada transcnptor como un pronosticador de resul-
tados, los datos paralelos masivos que proporcionan las microseries permiten
identificar familias enteras de genes implicados en acontecimientos biológicos
complejos (Eisen. 1998). El año pasado se publicó un éxito paradigmático de
esta propuesta, que fue la clasilicación de las leucemias mediante el perfil de
la expresión génica (Golub. 1999). En este artículo los autores explican que
empezaron por extraer ácido ribonucleico (ARN) de las muestras de médula
ósea de 38 pacientes con leucemias linfoblásticas y mielógenas. Los trans-
critos biotinílados del ADN derivados de esas muestras fueron hibridados por
series de Affymetrix HU6800 con oligonucleótidos representantes de más de
6.800 genes humanos, luego marcaron los chips con ficoeritrina-estreptavidi-
na para su cuantificación en un escáner confocal. Los autores identificaron
50 genes cuya expresión estaba asociada con una de las dos clases de leu-
cemia por medio de la utilización de métodos matemáticos, desarrollados por
este proyecto (Lander, 2000), y de procedimientos de verilicación repetitiva.
Después probaron el modelo diagnóstico verificado en células derivadas de
la sangre y de la médula ósea de 34 pacientes adicionales con leucemia. El
funcionamiento del modelo no fue perfecto en esta segunda verificación, ya
que no se pudieron hacer predicciones precisas sobre cinco pacientes. Por
otra parte, el modelo sí hizo predicciones diagnósticas seguras de 29 (85%)
de estas muestras, todas las cuales eran correctas. Yendo aún más lejos con
la ampliación de estas técnicas, los autores utilizaron su software GENE-
CLUSTER para configurar un mapa de auto-organización (Tamayo, 1999) de
los datos de la expresión de los 38 pacientes iniciales. Estos mapas identifi-
can grupos de genes cuyos patrones de expresión están asociados unos con
otros. Los patrones de expresión que surgieron del mapa no sólo identifica-
ron a las leucemias linfoblásticas y mielógenas, sino que incluso pudieron dis-
tinguir entre la leucemia linfoide derivada de células T y la derivada de célu-
las B. Y lo más importante es que, al contrario que en los análisis iniciales,
estos grupos de patrones de la expresión no estaban basados en el conoci-
miento previo de las bases para hacer diagnósticos. Lo que esto sugiere es
que estos métodos podrían conformar una nueva y amplia base para la clasi-
ficación de enfermedades poco clasificadas hasta ahora y para otros proce-
sos biomédicos.
Una de las aplicaciones clínicas obvias de esta estrategia es la identifica-
ción del pronóstico de las enfermedades con resultados variables. Esto ilus-
tra la reciente identificación de los perfiles de la expresión génica asociados
con la supervivencia, corta y larga, en el linfoma (Alizadeh, 2000). En este
artículo los autores explican que extrajeron ARN poliadenilado de lineas de
células de leucemia y de linfoma, así como tejido linfoide humano normal Los
ADNc marcados con fluorescencia de esos extractos fueron unidos a las
series que contenían secuencias de 17.856 clones moleculares representan-
tes de células B del medio germinal, de células de leucemia y de linfoma y de
una colección de genes de respuesta a mitógenos o citocinas. Cada ADNc
experimental fue hibridado a la serie en la presencia del ADNc de control mar-
cado con un fluorocromo de contraste. Este ADNc control se hizo con una
gran cantidad de ARN linfoide, cuyas alícuotas fueron utilizadas en cada
experimento. Esto hizo posible la comparación de los niveles relativos de la
expresión entre todas las muestras experimentales. Los resultados se repre-
sentaron y se analizaron con software disponible libremente (Eisen, 2000).
Como ya se ha anticipado, los análisis revelaron perfiles de la expresión
característicos de la proliferación y del estado de los restantes, así como per-
files asociados a localizaciones anatómicas específicas, como el medio ger-
minal, y perfiles asociados a los tipos de malignidad establecidos. No obstan-
te, se hizo un avance significativo al identificar un nuevo perfil de la expresión
génica que podría pronosticar la supervivencia tan bien o mejor que los crite-
rios clínicos existentes. En particular, el nuevo perfil identificó correctamente
a un subgrupo de pacientes con alto nesgo de mortandad prematura, incluso
entre pacientes clasificados previamente por criterios clínicos de ser de bajo
riesgo. Futuros avances en el diagnostico, la clasificación y el pronostico
 1302 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
esperan a que los métodos basados en las microseries los descubran en un
futuro cercano. Como se ha enfatizado antes, el lector debería tomar buena
nota de que lo que hace que esto sea posible no es el mero perfecciona-
miento de los equipos, sino el desarrollo de más estrategias analíticas sofisti-
cadas, para estar al día con los datos más complejos generados por esos
equipos (Bassett. 1999).
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 C A P Í T U L O 62

Aplicaciones de la citogenètica
en la patología moderna
Constance K. Stein, Ph.D.

DEFINICIONES 1304 RESUMEN 1331

CITOGENÈTICA 1305 BIBLIOGRAFÍA 1331
Cromosomas
Anomalías cromosómicas
CLÍNICA 1321
Aplicaciones clínicas
Desórdenes citogenéticos
Otros fenómenos citogenéticos

La genética, en la medicina actual, es uno de los campos que progresa Mutación: Es un cambio hereditario permanente en la secuencia del ADN
más rápidamente. La investigación está identificando continuamente nuevos genómico. Éste se puede manifestar tanto en los niveles citogénicos como
genes y mutaciones asociados con las enfermedades. Las nuevas técnicas en los moleculares. No todas las mutaciones son sucesos negativos,
de laboratorio en genética molecular y citogenètica proporcionan métodos Muchas de ellas son benignas (p. ej.. el color de ojos azul) y algunas tienen
mejores para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Las perspecti- efectos positivos (p. ej., el carácter de célula falciforme en países con un
vas de la terapia gènica y las posibilidades de curar algunas enfermedades riesgo significativo de malaria). Un individuo que tenga una mutación cons-
genéticas son prometedoras. titucional (es decir, una mutación presente en cada célula del cuerpo)
A la genética se la define, en general, como el estudio científico de la puede transmitir la mutación a toda su progenie por la transmisión de línea
herencia, pero en la medicina de los laboratorios clínicos el interés se centra germinal. En algunos casos, de manera notable en el cáncer, puede surgir
en dos subespecialídades en este campo: 1 ) la genética humana, el estudio una mutación adquirida en una sola célula somática. Esta mutación esta-
de la herencia en el hombre, y 2) la genética médica, el estudio de las varia- rá limitada al clon compuesto de productos mitóticos de la célula original
ciones genéticas humanas significativas para la medicina. La genética médi- mulante y no será trasmitida a la progenie del individuo. En casos raros de
ca se puede subdividír en cinco grupos, dos campos especialmente clínicos mosaicismo gonadal puede aparecer en las gónadas una mutación adqui-
(genética clínica y genética consultiva) y tres ciencias de laboratorio (citoge- rida de novo, dando como resultado una población mixta de gametos nor-
nètica, genética molecular y genética bioquímica). Este capítulo desarrolla males y mutantes. La progenie que recibe la nueva mutación puede pre-
con mayor intensidad la citogenètica, y en el Capitulo 66 se exponen los sentar un fenotipo que no está presente en ninguno de los progenitores.
diagnósticos moleculares. Cariotipo: Es la constitución del cromosoma de un individuo. También es una
figura que muestra la disposición de los cromosomas emparejados de
una célula en una secuencia estándar.
DEFINICIONES
Diploide: Es la presencia de dos copias de cada cromosoma único por cada
célula. En el hombre los cromosomas están dispuestos en pares y el núme-
Como en todas las áreas de la medicina, la genética, para su comunica- ro diploide (2N) es 46.
ción, depende del uso apropiado de los términos específicos. Las siguientes Haploide: Es una copia de cada cromosoma único. En el hombre los game-
definiciones proporcionan el vocabulario básico para este campo. tos son haploides (N = 23).
Gen: Es una secuencia de nucleótidos que representan una unidad funcional Homocigoto: Ambos alelos están en un locus al mismo tiempo. (En el siste-
de la herencia; una región de ADN que codifica para un producto, bien un ma ABO, un complemento AA representa la homocigosidad).
ARN o bien una proteína. Heterocigoto: Los dos alelos en un locus son diferentes. (En el sistema
Cromosoma: Es una estructura altamente ordenada compuesta de ADN y ABO, un complemento AO representa la heterocigosidad.)
proteínas que porta la información genética. En el hombre hay 46 cromo- Hemicigoto: La presencia de un cromosoma solamente o de un segmento
somas ordenados en pares. del cromosoma en vez de los dos normales; se aplica a los varones y
Autosoma: Son todos los cromosomas excepto los cromosomas X e Y, a los machos con un cromosoma X solo.
que se les denomina cromosomas sexuales. Genotipo: Es la constitución genética de un individuo o de un organismo (es
Cromosomas homólogos: Son los cromosomas hermanos, miembros de decir, qué alelos están presentes). (En el sistema ABO, AA, AO. BB. BO,
un par de cromosomas en el que uno es heredado de la madre y el otro del AB y 00 son genotipos.)
padre. Fenotipo: Es la apariencia de un individuo como resultado de la interacción
Locus: Es la posición de un gen en un cromosoma. del genotipo y del medio ambiente. (En el sistema ABO. los tipos de san-
Alelo: Es una forma alternativa de un gen que ocupa el mismo locus. Un alelo gre A, B y 0 representan la expresión genotípica de los alelos de un indivi-
puede ser el resultado de una mutación. Hay un máximo de dos alelos por duo determinado.)
cada complemento del cromosoma diploide (un alelo por cromosoma), pero Alelo dominante: Es un alelo que es expresado cuando está presente en una
dentro de una población pueden existir múltiples alelos. sola dosis (esto es, que "domina" a los otros alelos presentes). (En el siste-
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
ma ABO, A es domíname sobre 0, igual que un genotipo AO tiene como
resultado a un fenotipo con el tipo de sangre A. De forma similar, la presen-
cia de pigmento [T] es dominante de la ausencia de pigmento [t] [esto es. el
albinismo], de manera que Tt tiene como resultado la pigmentación.)
Alelo recesivo: Es un alelo que está expresado solamente cuando es homo-
cigoto en un organismo diploíde. (En el sistema ABO, el grupo de sangre O
sólo se ve con un genotipo 00: O es recesivo de A y de B. Igualmente, el
albinismo [t] es recesivo de la pigmentación [T], y un fenotipo albino sólo
aparece con un genotipo tt.)
Alelos codominantes: Son los alelos que muestran no dominación o que
no son recesivos el uno al otro en un organismo diploide, pero que cuando
están presentes juntos, ambos están expresados completamente. (En el
sistema ABO. A y B son codominantes, igual que un genotipo AB expresa
antígenos A y B.)
Clasificación independiente: Es la clasificación azarosa de los cromoso-
mas (paternos y matemos) en los gametos: la oportunidad de heredar un
cromosoma determinado de uno de los progenitores es del 50%.
Enlace: Es la presencia de dos o más genes en el mismo cromosoma que
tienden a ser heredados juntos.
Sobrecruzamiento: Es el intercambio físico de material genético entre los
cromosomas homólogos.
Recombinación: Es la generación de combinaciones alélicas nuevas en los
cromosomas, normalmente por entrecruzamiento.
Mitosís: Es la división somática de la célula en la que se replica el ADN y se
distribuye, uniformemente, a dos células hijas iguales.
Meiosis: Es la división celular en las gónadas que produce los gametos. Una
sola replicación del ADN es seguida de dos divisiones celulares, lo que redu-
ce el contenido total de ADN de una célula de 2N a N. La recombinación se
produce para incrementar la diversidad genética dentro de una población.
No disyunción: Es el error de los cromosomas o de las cromátidas para
separarse hacia los polos opuestos en la división celular. Normalmente da
como resultado un cromosoma de más o uno de menos en una célula.
CITOGENÈTICA
A la citogenética se la define como la ciencia que combina los métodos y
los hallazgos de la citología y de la genética para investigar la herencia a nivel
celular. Esto incluye la evaluación cuidadosa de los cromosomas, estructuras
compuestas de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble hélice que están
unidas con proteínas histonas y no histonas. Sólo 16 años después de que
Mendel estableciera que la genética era un nuevo campo de la ciencia,
Walther Fleming, en 1882. lúe el primero en observar cromosomas en células
tumorales, haciendo de la citogenética uno de los campos más antiguos de la
genética. Poco después de comenzar el siglo xx se estableció la importancia
de los cromosomas sexuales, y en 1959 se utilizaron por primera vez los estu-
dios citogenéticos en las investigaciones de los laboratorios clínicos. La capa-
cidad para detectar cambios en la estructura de los cromosomas, y de corre-
lacionarlos directamente con la enfermedad, y las anomalías fenotipicas en
los individuos demostró que era un gran avance para los diagnósticos clíni-
cos. Pasado el tiempo, se han acrecentado el número y los tipos de los estu-
dios, y muchos de los análisis que se han hecho se han convertido en el
"estándar oro" para los diagnósticos. En la actualidad, cuando cada vez se
clonan mayor número de genes de enfermedades, el énfasis en el desarrollo de
análisis moleculares de mutación directa es cada vez mayor (véase Cap. 66).
Todos estos estudios funcionan bien cuando el diagnóstico se sabe o se sos-
pecha, pero en ausencia de un desorden conocido, la citogenética aún con-
serva su posición como el único análisis de laboratorio clínico que es capaz,
con un solo análisis, de examinar la constitución celular genética de un indi-
viduo. En consecuencia, las aplicaciones clínicas de los análisis citogénicos
se pueden encontrar en todos los campos y en todas las edades, desde el
diagnóstico prenatal a la evaluación del cáncer.
Cromosomas
Para comprender las anomalías lo primero es comprender en qué consiste
una serie de cromosomas "normales". El complemento del cromosoma huma-
1305
no incluye 46 cromosomas ordenados en 23 pares (Fig. 62-1). Uno de los
miembros de cada par se hereda de la madre y el otro del padre. Se sabe que
22 pares son autosomas y se presentan como homólogos los unos de los
e
otros (es decir, que no se pueden distinguir unos de otros). El par 23. inclu-
ye a los cromosomas sexuales, que son homólogos en las mujeres o hembras
que tienen dos cromosomas X y no homólogos (estructuralmente diferentes)
en los hombres o machos que tienen un cromosoma X y uno Y (Fig. 62-1).
Los genes son codificados en el ADN y están ordenados a lo largo de la lon-
gitud de los cromosomas. La longitud absoluta de los cromosomas variará
durante el ciclo celular, pero su mayor condensación se alcanza en la meta-
fase, que es cuando se puede observar a los cromosomas con más facilidad.
Debido a esto, los cromosomas de la metafase son la base de la mayoria de
los estudios citogenéticos.
Estructura del cromosoma
Un solo cromosoma en metafase está compuesto de dos dobles hélices de
ADN. A cada doble hélice se la denomina cromátida: las dos cromátidas
se mantienen unidas por una región hasta ahora no replicada de ADN que se
conoce como centrómero o constricción primaria. El centrómero actúa
como una señal y divide al cromosoma en dos regiones diferentes conoci-
das como brazos (Fig. 62-2A). Al brazo más corto se le designa brazo p y
al más largo brazo q. Cuando el centrómero está casi equidistante de ambos
extremos, se dice que el cromosoma es metacéntrico, pero si está más cerca
de un extremo que del otro, el cromosoma es submetacéntrico (Fig. 62-26).
Cmco pares de cromosomas acrocéntricos modifican los brazos cortos con
tallos que sólo contienen copias múltiples de genes de ARNr cubiertos por
una caperuza producida por un telómero modificado, denominado satélite
(Fig. 62-2A).
El extremo de un cromosoma es el telómero. Se sabe que estas regiones
están compuestas de ADN repetido en tándem con la secuencia (TTAGGG)„
que funciona para estabilizar a los cromosomas. Los mecanismos de la re-
plicación del ADN son de tal forma que no todo el ADN telómero se puede
replicar en cada división, por lo que con el paso del tiempo se produce un
acortamiento de los telómeros. Se da por sentado que la pérdida total de los
telómeros lleva a un aumento de las aberraciones cromosómicas, que, en
parte, pueden ser las responsables del proceso de enveiecimiento humano
(Harley. 1990; Wright, 1992: de Lange. 1998).
Cultivo celular
Para hacer un análisis cromosómico, las células de un paciente se deben
cultivar in vitroa fin de obtener células en metafase. Como promedio, las célu-
las humanas se dividen una vez cada 24 horas, de forma que sólo un 1% de
la población celular se divide en un tiempo determinado. Sin embargo, algu-
nas células, como los linfocitos en un individuo sano y normal, no se dividen
en absoluto, por lo que se han desarrollado técnicas especiales de cultivo
para estimular la división de las células y así aumentar la producción de célu-
las en metafase.
Especímenes. Se puede utilizar, prácticamente, cualquier muestra de cé-
lulas, siempre que contenga células viables y nucleadas. Sin embargo, se
puede favorecer a ciertos tipos de células, que son fáciles de obtener y de cul-
tivar, por medio de preparaciones cromosómicas. La muestra preferida para
hacer estudios citogénicos sistemáticos de niños y de adultos es la sangre
periférica heparinizada. Dado que muchos otros análisis de laboratorio depen-
den de estas muestras, el obtener una alícuota para los estudios citogénicos
en general es fácil de organizar y no resulta doloroso para el paciente. En los
desórdenes hematológicos, las muestras de médula ósea son las que pro-
porcionan mejores resultados, ya que son el foco del proceso de la enferme-
dad. Una fuente adecuada de células en metafase la proporcionan los culti-
vos de fibroblastos obtenidos de una biopsia de piel o de piel extraída con un
sacabocados. No se utilizan, habitualmente. los tejidos del hígado, del riñon,
de los pulmones y de los músculos, debido a la naturaleza invasora de los
métodos utilizados para la extracción de estas muestras; sin embargo, estos
tejidos proporcionan, con frecuencia, una fuente excelente de material si se
obtienen como resultado de una pérdida fetal o poco después de la muerte,
durante la autopsia. Las muestras de productos de la concepción pueden con-
1306 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 62-1. Cariotipo del complemento de cromosoma humano de un hombre: los 46 cromosomas están ordenados en pares. Obsérvese el
par no homólogo de los cromosomas sexuales con un cromosoma X y un cromosoma Y.

Figura 62-2. A, Esquema de la anatomía del cromosoma de

metalase que muestra marcas importantes. Se contrasta la forma
del metacéntrico con la del acrocéntrico, que tiene la estructura
del brazo corto modificada y está integrada por tallos y satélites. En
todos los casos, el brazo corto, o brazo p, está orientado hacia arri-
ba y el brazo largo, o brazo q, está orientado hacia abajo. 8, La posi-
ción relativa del centrómero puede variar, originando cromosomas
metacéntricos. submetacéntricos y acrocéntricos.
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1307

tener una mezcla de tejidos fetales y maternales, y por esta causa se requie-
re un cuidado extra al establecer el cultivo (De Martinville. 1984).
Para los análisis prenatales, la muestra más corriente es el líquido amnió-
tico. que se consigue por medio de una amniocentesis. Este procedimiento se
ejecuta con una guía ecográfica para evitar al feto cuando el médico introdu-
ce una aguja, a través del abdomen y del útero de la madre, en la bolsa
amniótica. Esto se hace, generalmente, a las 16 ó 18 semanas de gestación,
en ese momento se pueden extraer entre 20 mi y 30 mi de fluido amniótico
(orina fetal) sin riesgo para el feto. Las células presentes en la muestra son
derivadas del feto y proporcionan material tanto para el análisis citogenético
como para el análisis genético molecular. El liquido contiene o-letoproteina
(AFP), así como otras proteínas y enzimas que forman el sustrato para otros
análisis prenatales (véase Cap. 22). El riesgo de pérdida fetal debido a la
ammocentesis es de aproximadamente un 0,5%.
Otro procedimiento prenatal es utilizar una muestra de vellosidad conónica
(CVS), que proporciona el tejido de la placenta en desanollo (vellosidades cortó-
nicas) (Blakemore, 1988; Rhoads. 1989) El procedimiento transabdominal ó
transvagmal se efectúa a las 10 ó 14 semanas de gestación y tiene un riesgo de
pérdida fetal de, aproximadamente, 1 entre 100. Si no se extrae líquido amnióti-
co. no se pueden hacer análisis relacionados o de AFP, aunque es posible hacer
análisis estándar citogénicos. bioquímicos y moleculares.
El resultado de una muestra de sangre umbilical percutánea (MSUP) o cor-
docentesis se convierte en un espécimen de sangre fetal que puede ser utili-
zado para hacer un rápido cariotipo o para estudios moleculares. Este proce-
dimiento se efectúa en fases de gestación más tardías (>20 semanas) y con-
Figura 62-3. Diseminación cromosómica de melafase. Los cromosomas de una
lleva un riesgo mayor de pérdida fetal (del 2% al 5%). sola célula según se ven en un portaobjelos de microscopio.
Todas las muestras clínicas para los análisis citogénicos se deben recoger de
la forma más estéril posible. La presencia de hongos o bacterias harán peligrar,
muy gravemente, el estudio, debido a que las células procariólicas crecerán hípotónicamente (hasta el punto de que la membrana de la célula se eslire,
demasiado y dejarán fuera de combate a cualquier célula humana presente. pero no se rompe) y luego son fijadas. Al soplar suavemente el cubre que con-
Para maximizar el número de células viables, las muestras deben ser llevadas tiene células lijadas de los cultivos in silu. se rompe la membrana de la célu-
al laboratorio tan pronto como sea posible después de ser recogidas. La san- la y los cromosomas de la melafase se dispersan. Aunque en la mayoría de
gre, la médula ósea, el liquido amniótico y la vellosidad coriónica se deben man- los laboratorios todavía se efectúan estos pasos manualmente, se ha des-
tener a la temperatura del lugar donde se vayan a analizar, mientras que el teji- arrollado un recolector robótico automatizado que puede procesar gran canti-
do sólido se transporta sobre hielo húmedo. Esta diferencia de temperatura en dad de cultivos con bastante eficiencia. En los cultivos de suspensión, las
el transporte se debe a las condiciones innatas de la muestra. Las células de la células fijadas se deben colocar, mediante un goteo, sobre una placa de
sangre, de la médula ósea y del líquido amniótico se comportan como células microscopio limpia, la cual, mecánicamente, rompe las membranas y deja a
individuales en un sustrato liquido, y la integridad de la muestra no se pone en los cromosomas ligeramente separados los unos de los otros, pero en una
peligro siempre que se mantenga esta relación a una temperatura cercana a la región diferente ocupada por una sola célula (Fig. 62-3). Las placas, después
corporal. Sin embargo, la obtención de tejidos necesita células para ser extraí- de secarlas con un secador, están listas para la coloración. En algunos casos
das del cuerpo, dejando a las células rotas o agonizantes en la periferia de la se mejora la calidad de la coloración envejeciendo las células a 65 C duran-
muestra. La liberación de enzimas lisosómicas facilita la degradación de las te 30 a 60 minutos.
células muertas y bajo condiciones adecuadas atacarán a las células vivas con-
tiguas. Si la temperatura se baja a unos 4"C, se inhibirá la actividad de las Coloración
enzimas y así se mantiene la viabilidad de la muestra.
Los cromosomas se tiñen habitualmente utilizando Giemsa, un tinte de
Técnicas de cultivo celular. Dependiendo del tipo de célula, se pue- carga positiva que se une a una molécula de ADN de carga negativa. La trip-
den utilizar técnicas de cultivo, bien de suspensión (dotando) o bien de sinización suave de los cromosomas antes de la tinción aparentemente debi-
monocapa (fijadas a una superficie). Las células sanguíneas y las de médu- lita las interacciones de la proteina con el ADN, lo que da como resultado un
la ósea se cultivan en suspensión y se alicuotan directamente dentro de un patrón definido de regiones alternativamente claras y oscuras, al que se le
medio de cultivo apropiado. Las de médula ósea se cultivan, normalmente, denomina patrón de bandas (bandeo G para bandeo Giemsa) (Yunis. 1973:
durante 24 a 48 horas, mientras que los linfocitos. para obtener un resulta- Burkholder. 1977; Holmquíst. 1982). Cada par de cromosomas tiene un patrón
do máximo, necesitan estar en cultivo tres o cuatro días. Además, dado que de bandas único que está representado esquemáticamente como un ideo-
normalmente los linfocitos no se dividen en cultivo, tienen que ser inducidos grama (ISCN. 1995) (Fig. 62-4), y que se utiliza para identificar a cada cro-
mediante la utilización de un mitógeno. normalmente la fitohemaglutinina mosoma y a las sub-regiones cromosómicas.
(PHA). de esta manera se pueden recoger después las células de la meta- Si bien el bandeo G es el adecuado en la mayoría de las situaciones, se
fase resultantes por medio de un inhibidor mitótico, como colcemida. Las puede obtener información adicional de la estructura del cromosoma utilizan-
células del líquido amniótico y el tejido sólido se cultivan in silu como una do otras tecnologías especiales de tinción. Las coloraciones especiales más
monocapa. Primero se disgregan los tejidos y VC utilizando un tratamiento corrientes son el bandeo Q. el bandeo C y el bandeo R. En un principio se uti-
de colagenasa suave y a continuación se esparcen las células individuales lizó el bandeo Q. o tinción de fluorescencia de guinacrina, para hacer carioti-
sobre cubres de cristal y se cubren con medios de cultivo. En las muestras pos ordinarios (Comings. 1975). Sin embargo, y debido a que la fluorescencia
de líquido amniótico, las células, antes de ser colocadas en placas, deben es transitoria, ahora ha sido reemplazado por el bandeo G, que admite una
ser disociadas del líquido por medio de la centrifugación, y se las deja para preparación de coloración permanente. En la actualidad el bandeo O se aplica
que formen colonias in silu. Los tiempos normales de cultivo son de 5 a 10 principalmente para lograr una identificación rápida del cromosoma Y. El extre-
días para el VC y los amniocitos y hasta de dos semanas para los cultivos mo distal del brazo largo del cromosoma Y esta compuesto de heterocromati-
de tejidos sólidos. na y es la región fluorescente más brillante en una metalase humana (Fig. 62-5A).
Una vez que se ha conseguido el máximo crecimiento, se recolectan todos En los casos de genitales ambiguos, una preparación rápida de bandeo Q
los tipos de células utilizando técnicas similares. Las células son agrandadas puede, normalmente, contestar a la pregunta de si hay presencia o ausencia
 1308 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
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1 7
Figura 62-4. Ejemplos de ideogramas de los cromosomas 1.7,14 e Y que muestran el patrón estándar de las bandas claras y de las bandas oscuras.
del cromosoma Y en el paciente. El bandeo C, constitutivo o bandeo de cen-
trómero. se utiliza para evaluar la heterocromatina constitutiva o para determi-
nar si un cromosoma tiene dos centrómeros (dicéntrico). Normalmente el cen-
trómero aparece como un solo punto oscuro en un cromosoma teñido en su
totalidad con una coloración clara (Holmquist, 1979) En el caso de un cromo-
soma dicéntrico, la presencia de dos regiones oscuras permitirá identificar con
claridad a los dos centrómeros (Fig. 62-5S). El bandeo R, o bandeo inverso,
presenta a los cromosomas con el mismo patrón de bandeo que el que hemos
visto en el bandeo G, pero las bandas claras y las oscuras están invertidas, de
ahí su nombre. Debido a que los telómeros de los cromosomas tienen ten-
dencia a ser pequeños, bandas de tinción claras, si se utiliza un bandeo G
estándar puede que no sea fácil detectar una deleción. Sin embargo, en el
bandeo R los telómeros se colorearían como bandas oscuras y su ausencia,
como resultado de una deleción, es más obvia.
Análisis del carie-tipo
Para efectuar un análisis citogenético es esencial poder identilicar cada
cromosoma, rápida y exactamente, y determinar cuándo se presentan ano-
malías cromosómicas. El primer paso que hay que dar es contar el número de
cromosomas presentes en la célula que se está evaluando. El número de cen-
trómeros activos define el número total de cromosomas, que serán 46 en una
célula diploide humana normal. El que haya cromosomas de más o de menos
indica una anomalía numérica potencial. El cultivo in vitro puede dar como
resultado artefactos de cultivo, por eso no se utiliza una sola célula para defi-
nir el complemento de cromosomas de un paciente, asi que para un estudio
clinico típico se necesitan analizar de 15 a 20 células: en los casos de mosai-
cismo o para otras situaciones especiales tal vez haya que evaluar de 10 a 30
células adicionales.
Los cromosomas individuales se identifican basándose en el tamaño total
de cada cromosoma, en la posición de su centrómero y en el patrón de ban-
deo. En este momento se debería detectar cualquier variación en la estructu-
14 Y
ra del cromosoma. Para cumplir con los objetivos diagnósticos clínicos, en
casi todas las circunstancias es suficiente el bandeo G de los cromosomas
metafásicos. Sin embargo, quizá no se puedan resolver algunos desórdenes
que están asociados con deleciones muy pequeñas del material cromosómi-
co a este nivel. En estas situaciones se utilizan análisis de alta resolución. Las
células se cultivan de manera que se puedan recolectar en una etapa ligera-
mente más temprana de la división celular, la prometafase. En este momento
de la división celular, los cromosomas están menos condensados. haciendo
que sea más fácil detectar la presencia de pequeñas anomalías.
El análisis lo ejecuta un leenólogo examinando las células a través del
microscopio, y una vez que se ha completado el estudio se hace una deter-
minación de si el complemento de cromosomas es "normal" o "anormal". Para
la documentación se fotografían las células de la metafase utilizando una
cámara de 35 mm montada en un microscopio. Luego se revela la película,
se hacen las copias, se recortan los cromosomas y se pegan en una hoja de
papel con cinta adhesiva o con pegamento. Los pares homólogos están orga-
nizados, de mayor a menor, en siete grupos a los que se les designan letras
de la A la G. más el par de cromosomas sexuales. Siguiendo la costumbre, el
brazo más corto, denominado brazo p, está orientado hacia arriba y el brazo
más largo, o brazo q, está orientado hacia abajo. El producto final es una ilus-
tración de los cromosomas de una célula especifica y se la conoce como
cariotipo (Fig. 62-1).
Imagen asistida por ordenador
Los cariotipos que proceden de fotografías dan una imagen de alta resolu-
ción, pero requieren tiempo y esfuerzos significativos. En los últimos años los
ordenadores han tenido un gran impacto en los laboratorios clínicos, ya que
permiten la automatización de muchas tareas tediosas y se han hecho un
hueco en los laboratorios de citogenética bajo el formato de sistemas para
hacer cariotipos asistidos por ordenador. En lugar de una cámara de 35 mm,
se monta en el microscopio una videocámara DCA (dispositivo de carga acó-
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
piada). Utilizando un software especialmente diseñado, se capta la imagen de
una célula en metafase usando un captador de imágenes estándar, se dígita-
liza y aparece en el monitor del ordenador. Llegados a este punto, el softwa-
re permite modificar la imagen, aclarándola, oscureciéndola o cambiando el
contraste, de modo que se pueden hacer múltiples modificaciones de los cro-
mosomas, incluso enderezarlos e importar cromosomas de otros campos.
Después se puede hacer un cariotipo, utilizando una sub-rutina de reconoci-
miento del patrón que reconocerá los cromosomas, automáticamente, y los
emplazará en sus lugares adecuados, en forma de cariotipo. La precisión de
este procedimiento puede variar entre un 10% y un 85%, dependiendo del
software y de la calidad de la imagen. Después de que el ordenador haya cap-
turado a su "mejor huésped", las correcciones adecuadas las debe hacer un
tecnólogo citogenético especializado. Una vez que los cromosomas están
correctamente posicionados se pueden hacer las amplificaciones cosméticas
adicionales para eliminar los bordes rasgados o residuos de posos. Luego se
imprime la versión final del cariotipo en una impresora de alta resolución.
Aunque la calidad total no es tan alta como la de una presentación fotográfi-
ca, la utilización del sistema por ordenador conlleva un enorme ahorro de
tiempo. Un tecnólogo especializado puede tardar en hacer un cariotipo ordi-
nario, desde la captura hasta la impresión, de 15 a 20 minutos por término
medio. Otra gran ventaja de los sistemas asistidos por ordenador se encuen-
tra en la microscopía de fluorescencia.
Figura 62-5. A. Metalase de bandeo-0 que muestra la fluorescencia brillante del
cromosoma Y (flecha). 6, Cromosomas de bandeo-C que muestran a los centró-
meros teñidos de oscuro. Se detectó un cromosoma dicéntrico con dos bandas
oscuras (dos flechas).
1309
Hibridación in situ fluorescente
Los tipos clásicos de coloración citogenética que se han descrito son el resul-
tado de los tintes que se unen al ADN o a las proteínas de un cromosoma y que
permiten su visualización por medio de la microscopía óptica. La hibridación in
situ. que es la combinación de la biología molecular y de la citogenética, abrió
otra puerta que hizo posible las investigaciones de las anomalías cromosómicas
posteriores. En éstas, en lugar de un tinte, es una sonda molecular (esto es, un
fragmento de ADN) la que se une al cromosoma. En los primeros estudios se
marcó a la sonda con una mezcla radiactiva (normalmente tritio), de manera que,
después de su exposición a un película de rayos X durante un tiempo de 5 a 10
días, se pudo detectar un patrón de granos de plata que identificaban la locali-
zación cromosómica de la sonda. Esta técnica facilitó el poder hacer el mapa
génico por medio de la identificación de los locus del gen (Trask. 1991).
La autorradiografía tuvo su utilidad, pero sólo se podía utilizar una sonda
cada vez. necesitaba una cantidad de tiempo significativa y había un grado de
dispersión de los granos de plata que requería un análisis estadístico de los
datos obtenidos. A mediados de los años 80 (del siglo xx), se desarrolló una
variante de esta técnica que ha demostrado ser extremadamente útil en las
aplicaciones clínicas. Esta nueva tecnología, la hibridación in situ fluorescen-
te (HISF), es más rápida, más específica y permite la utilización de múltiples
sondas en un solo procedimiento de hibridación. Además, en vez de sondas
marcadas con radiactividad, se utiliza una tinción fluorescente que se visuali-
za a través de la microscopía de fluorescencia (Ledbetter, 1989).
A pesar de que la HISF se puede utilizar para hacer mapas de genes, la
meta, en las aplicaciones clínicas, es determinar si hay un gen o una muta-
ción específica, por eso la sonda molecular tiene que estar bien caracteriza-
da y tiene que ser específica para el locus en cuestión. Hay tres tipos básicos
de sondas. La sonda de secuencia única aislada de un gen causante de la
enfermedad clonado y que se utiliza para identificar la presencia o ausencia
de ese gen (Cheríf, 1989; Lindsay, 1993). Las sondas de coloración del cro-
mosoma son, en realidad, un cóctel de muchos fragmentos de ADN únicos
recogidos a lo largo de toda la longitud de un cromosoma, de modo que en la
hibridación siguiente todo el cromosoma emite luz fluorescente (Fig. 62-6A).
Las sondas de secuencias repetitivas son aisladas de las regiones de teló-
meros o de centrómeros. Las sondas de centrómeros se utilizan, general-
mente, para la enumeración de los cromosomas (es decir, para detectar el
aumento o la pérdida de cromosomas específicos) (Figs. 62-66 y C) (Lichter,
1990). Las sondas de telómeros se utilizan, a menudo, para caracterizar los
reordenamientos crípticos (esto es, para determinar si ambos telómeros de un
cromosoma están presentes y localizados en el cromosoma correcto o si se
ha producido una deleción o reordenamiento).
Técnica HISF. La HISF combina los métodos de la biología molecular y de la
citogenética, como en la hibridación in situ original. Las células se cultivan y se
recolectan, y se preparan las placas exactamente igual que para un estudio cito-
genético clásico. Luego se desnaturaliza el ADN de las placas y se deja que una
sonda molecular de una sola hebra marcada con fluorescencia hibride al ADN
cromosómico. utilizando una temperatura de anillamiento que favorece la hibri-
dación de las regiones homologas del ADN (Fig. 62-7A). Después de un perio-
do de hibridación adecuado, se eliminan los restos de la sonda por medio del
lavado y al ADN no hibridado se le aplica una contracoloración con otro fluoro-
cromo para poder visualizar el complemento de cromosoma en su totalidad. La
evaluación de la célula se hace utilizando un microscopio fluorescente con la luz
de una bombilla de mercurio de 100 W combinado con juegos de filtros excita-
dores apropiados. En un microscopio fluorescente típico sólo se pueden visuali-
zar tres colores como máximo, debido a las limitaciones ópticas de los filtros de
cristal. Se puede utilizar una cámara de 35 mm unida al microscopio para la
documentación del estudio. Sin embargo, si se utiliza un sistema asistido por
ordenador para obtener las imágenes fluorescentes, se obtienen resultados muy
superiores. Además, los paquetes de software adecuados permiten la amplifica-
ción de las señales débiles y la nitidez de la imagen.
Uno de los elementos de la HISF más críticos es la elección de una sonda
o sondas específicas, ya que ayudarán a dar respuesta a las preguntas clíni-
cas. Por ejemplo, una de las aplicaciones clínicas de la HISF más útiles es la
detección de microdeleciones que son demasiado pequeñas para poder ser
vistas utilizando la citogenética clásica (Figs. 62-76 a D). El gen debe ser co-
nocido y la sonda utilizada debe ser homologa a la región del gen que es eli-
 1310 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR

minado, la región critica. La hibridación con la sonda deberia aparecer como
una señal fluorescente sólo en el locus diana. Si aparece una señal, es que
está presente el ADN complementario a la sonda, por tanto no hay deleción.
Sin embargo, la ausencia de la señal indica que existe la deleción (esto es,
no hay secuencia de ADN presente en el cromosoma que es complementario
a la sonda, por tanto la hibridación no puede producirse). Un individuo no
afectado deberia tener dos señales por célula en cada gen autosómico, una
señal en cada cromosoma del par (Fig. 62-8A). Un individuo afectado por una
deleción deberia tener una sola señal por célula, mostrando un cromosoma
normal y otro delecionado (Fig. 62-86).
Uno de los problemas de los análisis de deleción es que lee la ausencia de
señal como una indicación positiva de la deleción. El fracaso de la hibridación
también puede tener como resultado la ausencia de la señal. Para eliminar
esto como fuente de errores, se deben evaluar 20 células como minimo y
todas las células deben concordar en el cómputo de la señal. Si se sospecha
de que existe mosaicismo, se deben examinar células adicionales. Además,
las sondas de secuencia única se utilizan actualmente en combinación con
una sonda control (Fig. 62-7C). La segunda sonda se localiza en el mismo
brazo del cromosoma que el locus de deleción. Se puede marcar con el
mismo lluorocromo que a la sonda de locus de deleción, pero se ha visto que
resulta más fácil interpretar los resultados de la hibridación si se marca a la
sonda de control del sitio con un íluorocromo de color diferente.
Se deben ver dos señales de control claras en todas las células evaluadas
y luego se pueden registrar las señales que se corresponden con el locus de
enfermedad. Esto proporciona un control de hibridación, asi como un marca-
dor para los cromosomas de interés (Fig. 62-70). Se puede hacer el estudio
en células en metalase, asi como en las de mterfaz. si se utiliza un sistema
de color dual.
Las sondas de coloración de cromosomas son muy útiles para identificar
reordenamientos complejos o cromosomas marcadores. Si un paciente tiene
un cromosoma anormal con material extra de origen desconocido, se podría
utilizar la tinción del cromosoma para identificar la fuente del ADN extra. Esto
puede ayudar en el diagnóstico o en el pronóstico del individuo. En el caso de
un paciente con 46 cromosomas, incluyendo un cromosoma X y un cromoso-
ma marcador no identificado pequeño, será importante determinar si el origen
del marcador es un cromosoma X o uno Y. Esto se puede hacer utilizando tin-
tes de cromosomas en los cromosomas X y en los Y marcados con lluoro-
cromos diferentes.
Las sondas HISF proporcionan mucha información cuando se evalúan en
las células en metalase, donde es posible identificar al cromosoma especifi-
co al que híbrida la sonda. Sin embargo, en algunas preparaciones celulares
quizás estén presentes muy pocas células en metalase, y en estos casos se
puede obtener información con sondas de secuencia única o de secuencia
repetida en los núcleos de inlerfaz. Pero aquí aumentan los problemas técni-
cos, debidos a la pérdida azarosa de la señal, a las señales extra y a las seña-
les solapadas en las células, asi que se deben contar células adicionales (un
total de 50 a 200) para obtener un resultado estadístico significativo.
HISF multicolor. Una de las ventajas que tiene la HISF sobre la vieja
hibridación in silu es su capacidad de hibridar múltiples sondas a una sola

Figura 62-6. A. Sonda de tinción del cromosoma completo que hace resaltar a los dos cromosomas X en una célula de mujer B y C. Sonda
de centrómero de secuencia repetida para el cromosoma 21. B. A la izquierda se ve la tnsomía 21 en un núcleo de mterfaz y a la derecha en
una metalase. C, Complemento normal de dos copas del cromosoma 21 visto en mterfaz (derecha e izquierda) y en una melafase (centro).
 CAPÍTUIO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1311

Figura 62-7. A. Esquema de la tecnología HISF. El ADN derivado de un gen conocido se separa quedando una sola hebra, se marca con una
señal fluorescente y luego se le híbrida de vuelta a los cromosomas de una célula en metafase. B.CyD. Dibujos de cromosomas metalási-
cos fluorescentes con sondas marcadas que hibridan a las dianas (flechas) 6. Señales duales que indican la hibndación de ambos alelos del
gen diana. C. El gen diana está señalado en rojo y la sonda de control en verde. Hibridación completa de todos los alelos. D, Hibridación de
ambos controles (verde), pero la presencia de un único gen diana solamente indica la deleción de un alelo.

Figura 62-8. Detección medíame HISF de una microdeleción del cromosoma 22 asociada al síndrome DiGeorge y al síndrome velocardiota-
cial. A. Un individuo "normal" con no deleción muestra la presencia de una señal roja (locus de gen) y de una señal verde (locus de control)
en cada cromosoma 22 B. Paciente con una deleción que se visualiza en un cromosoma con una única señal verde solamente. El cromoso-
ma 22 homólogo es "normal", con una señal roía y una señal verde.
 1312 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
rojo:amanllo
13 100:0
21 75:25
IX 25:75
Y 5(1:50
\ (l:l(K)
Figura 62-9. HISF multicolor A. Diagrama de tinción real de cinco sondas de combinación. La tabla de la derecha muestra las proporciones
de colores relativas para cada sonda utilizada. 8, Diagrama de la imagen obtenida de un ordenador de la misma célula que muestra el color
artificial que se le ha asignado (la clave se nuestra en el recuadro a la izquierda de la imagen).
placa y obtener un conocimiento mejor de los reordenamientos de cromoso-
mas (Schrock. 1996; Speicher. 1996). Sin embargo, incluso aqui existen lími-
tes. Una imagen fluorescente se produce por la luz de una bombilla de mer-
curio que pasa a través del filtro estimulador, da en el fluorocromo de la placa
y transmite la imagen del color adecuado a la lente del microscopio para su
visionado. Cada fluorocromo requiere su propio filtro, por eso. para cada color
adicional que se desee conseguir, la luz debe pasar a través de diferentes
grosores del cristal. Por tanto, las propiedades ópticas de la luz y del cristal
limitan a tres el número de colores que pueden verse. Sin embargo, con el
advenimiento de los sistemas asistidos por ordenador, ya es posible distinguir
múltiples colores en una sola hibridación El ordenador no "ve" realmente más
colores, pero puede detectar, meior que el OJO humano, diferencias sutiles en
las tonalidades. Para hacer un examen relativamente sencillo, se utilizan dos
fluorocromos, que, mezclados en proporciones variables, dan una gama de
colores (Fig. 62-9A). El ordenador registra cada color como una tonalidad
diferente de gris y luego asigna un color único a esa tonalidad para su pre-
sentación en el monitor (Fig. 62-98). Esa imagen multicolor se puede imprimir
después, aunque los colores de la impresión son completamente diferentes a
los que en realidad había visto el sistema. A partir de la asignación de un color
único por ordenador, se han desarrollado combinaciones de fluorocromos que
permiten la detección de cada uno de los 24 cromosomas diferentes (Reíd.
1992a. 1992b; Divane. 1994).
Anomalías cromosómicas
Los análisis citogenéticos clínicos se han convertido en una parte impor-
tante de la medicina clínica, ya que el descubrimiento de una anomalía cro-
mosómica específica puede explicar un problema físico o una anomalía feno-
típica en el paciente y se la puede asociar directamente con el diagnóstico de
la enfermedad. El propósito del ensayo clínico es determinar si un individuo
tiene un complemento de cromosoma diferente del patrón estándar de 23
pares de cromosomas de morfología conocida. Hay dos categorías básicas
de vanaciones detectables a través de la citogenética; 1) numérica y 2) de
cambio estructural.
Anomalías numéricas
En el hombre y en otros mamíferos los cromosomas se producen en pares,
por lo que de los 46 cromosomas sólo hay 23 especialmente diferentes. Un
conjunto de 23 incluye el número haploide (N) de cromosomas, que es el
número de cromosomas en un gameto. En el momento de la fertilización, se
unen dos complementos haploides para formar un zigoto con 46 cromoso-
mas, que es el complemento diploide (2N). Los errores en la división pueden
dar lugar a complementos de cromosoma que tengan más de 46 cromosomas
o menos de esta cantidad. A los múltiplos exactos del conjunto haploide del
cromosoma se le denomina euploidia. Y aneuploidia al aumento o a la pérdi-
da de uno o unos cuantos cromosomas
Euploidia. La diploidía, que es el estado normal de las células humanas, es
una lorma de euploidia. Las euploidías anormales incluyen la triploidía (3N =
69 cromosomas) y a la tetraploidía (4N = 92 cromosomas), que no son com-
13 rojo
21 verde
IX rosa
Y blanco
X amando
patibles con la vida y que se detectan, principalmente, en tejidos procedentes
de abortos espontáneos. La triploidía (Fig 62-1OA) puede estar causada por
un error en la gametogénesis de una de las divisiones meióticas que da ori-
gen a un gameto 2N. el cual, al ser fertilizado por un gameto haploide del otro
progenitor, produce un zigoto triploide. Por otro lado, un complemento 3N
puede estar derivado de la dispermia (fertilización de un huevo haploide por
dos espermatozoides), y esto, generalmente, da como resultado una masa
parcial hidatidiforme (véase Cap. 20) La tetraploidía es un acontecimiento
posmeiótico y se presenta como una duplicación de un complemento diploide
(XXXX o XXYY). que seguramente se debe al error de una escisión de la divi-
sión mitótica temprana en el zigoto.
Aneuploidia. Los errores de no separación que dan como resultado la
aneuploidia son más corrientes. En estos casos un solo par de cromosomas
no logra separarse correctamente en la división, originando un cromosoma
extra o perdiendo un cromosoma por célula. Algunas veces pueden verse
involucrados más de un par de cromosomas, pero estos casos son extrema-
damente raros. Los errores de la no disociación pueden producirse tanto en
la meiosís como en la mitosis. La no disociación mitótica temprana en el zigo-
to puede dar lugar a un individuo con el complemento de cromosoma abe-
rrante en todas las células del cuerpo, pero un error en la división más tardío
produce un mosaico (un individuo con dos lineas de células que únicamente
se diferencian en un solo cromosoma). Los errores meiósicos producen
gametos, bien con un cromosoma extra o bien con uno de menos (Fig. 62-11)
(Angelí. 1994). Una vez fertilizados, el primero dará una concepción trisómica
al cromosoma no disociado (Fig. 62-1 Ofi) y el ultimo dará una monosomía.
Tanto la trisomia como la monosomía pueden producirse en cualquier cro-
mosoma, pero la mayoría de éslas son incompatibles con la vida y se elimi-
narán de forma espontánea. Por ejemplo, la trisomia 16 es la trisomia que se
detecta, más frecuentemente, en los tejidos procedentes de abortos espontá-
neos, pero no se ha informado de ningún caso en seres nacidos vivos. Las tri-
somias autosómicas de seres nacidos vivos incluyen los cromosomas 13.18
y 21. Muy raramente se identifican pacientes con un complemento de cromo-
soma mosaico de trisomías 8. 9 ó 22. Las tnsomías de los cromosomas
sexuales son viables y están bien documentadas (vide mira). La única mono-
somia viable es la del cromosoma X (45,X). Más adelante, en este capitulo se
describirán las aneuploidías clínicamente significativas.
En los últimos años se ha detectado un efecto secundario de las concepcio-
nes aneuploides. Dado que las trisomias y las monosomias son, en gran parte,
incompatibles con la vida, se asumió que podrían dar lugar a la pérdida del feto.
Pero ahora se sabe que un pequeño fragmento de estas concepciones aneu-
ploides es "rescatado" y sigue adelante para originar niños nacidos vivos. En
caso de una monosomía. el rescate se produce por la duplicación del único cro-
mosoma existente, que da como resultado un complemento de cromosoma con
isodisomia uniparental para ese cromosoma (dos copias del mismo cromoso-
ma heredado de un progenitor) (Fig. 62-12) (Ledbetter. 1995). Esto está desen-
to en vanos casos publicados, en los que se demuestra que un niño afectado
de fibrosis cistica (FC) es homocigoto a la mutación AF508, aunque los análi-
sis moleculares de ambos progenitores revelaron que sólo uno de ellos era el
portador de AF508 (Spence, 1988; Voss, 1989). Esto se interpreta como que la
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
concepción fue una monosomia 7 no viable rescatada por la duplicación del cro-
mosoma 7 existente, que por casualidad era el portador de la FC. En el caso de
una trisomía también es posible una situación similar. Volvemos a repetir que la
mayoría de las tnsomías no son viables, pero si se pierde uno de los tres cro-
mosomas, se restablece una disomía para ese par de cromosomas. En un con-
junto de tres cromosomas la pérdida de un solo cromosoma originará, dos de
cada tres veces, un complemento con un cromosoma paterno y uno materno
Iheterodisomia biparental). La tercera vez. los dos cromosomas restantes son
de un solo progenitor (esto es, disomía uniparental). En esta situación, la dife-
rencia está en cuál de las divisiones meióticas se produjo el error. Una disocia-
ción en la primera división tendrá como consecuencia una heterodisomía, es
decir, dos cromosomas homólogos pero heterocigotos (uno de la abuela y otro
del abuelo): sin embargo, un error en la segunda división originará copias dupli-
cadas de un solo cromosoma, esto es, la isodisomia (Figs. 62-11 y 62-13).
Podria pensarse que mientras que estén presentes un par de cromosomas no
debería importar su origen específico, pero los datos indican, firmemente, que
la evidencia es otra. Los problemas de disomía uniparental frente a biparental y
de isodisomía frente a heterodisomía tienen una enorme importancia para com-
prender los fenómenos de impronta, un tema descrito con detalle en el Capitulo 66
(Nichols. 1998; Hall. 1990; Cassidy. 1992: Petersen, 1992).
Anomalías estructurales del cromosoma
Los cromosomas no son estructuras estáticas, sino que experimentan
recombinaciones tanto en la meiosis como en la mitosis. Este es un proceso
natural que es vital para generar variaciones en las especies, por eso está
altamente regulado y rara vez se producen errores. Sin embargo, es posible
que se produzcan reordenamientos cromosómicos que cambien la estructura
de uno o de varios cromosomas. Estas anomalías son bastante variadas y
con frecuencia son especificas del paciente. Las reordenaciones pueden ser
A 19 20 21
Figura 62-10. Anomalías cromosómicas numéricas. A. Complemento de cromosoma triploide (3N) con tres copias de cada cromosoma |69,XXY).
1313
1) equilibradas, si todo el material cromosómico está presente y es funcional,
pero está ordenado en una conformación diferente, o 2) desequilibradas, si
hay pérdida y/o adición de material cromosómico. Las reordenaciones equili-
bradas son, en general, clínicamente benignas y tienen tendencia a ser tras-
mitidas de forma estable, aunque pueden aumentar el riego de errores en la
meiosis. que originarán desequilibrios cromosómicos en los letos o en los
niños nacidos vivos. Los complementos de cromosoma desequilibrados
están, generalmente, asociados a un fenotipo clínico anormal que a menudo
incluye el retraso en el desarrollo y el retraso mental.
La deleción es la pérdida de una parte de un cromosoma y produce la
monosomia parcial del cromosoma involucrado (Fig. 62-14). Las deleciones
varían en tamaño, desde bastante grandes a muy pequeñas, y pueden ser
terminales (Fig. 62-15A). la pérdida de un fragmento del cromosoma que con-
tiene al telómero, o intersticiales (Fig. 62-156), la pérdida de un trozo interno
del cromosoma. Las roturas de los cromosomas, sobrecruzamientos des-
iguales, o los errores de no separación comprendidos en las reordenaciones
cromosómicas pueden dar como resultado una deleción. En general, las dele-
ciones mayores originarán anomalías clínicas más graves, debido a que fal-
tan un mayor número de locus genéticos.
La duplicación es la presencia de una copia adicional de un segmento del
cromosoma, que origina una trisomía parcial en ese cromosoma (Fig. 62-14).
Esta anomalía puede ser también terminal o intersticial.
Las duplicaciones auténticas parecen ser bastante raras y son, normalmen-
te, esporádicas. Las duplicaciones están generadas por los mismos mecanis-
mos que las deleciones y quizá sean la consecuencia recíproca de estos pro-
cesos. Al igual que en las deleciones. cuanto mayor sea el fragmento duplica-
do del cromosoma, las anomalías clínicas tenderán a ser más graves.
La inversión es el cambio de un segmento cromosómico respecto al orde-
namiento génico normal y necesita un mínimo de dos roturas en un cromoso-
ma (Fig. 62-14). Las inversiones están clasificadas como 1) paracéntricas,
22 X T
Esta ilustración continúa en la página siguiente.
 1314 SECCIÓN VII
dos roturas que tienen lugar en el mismo lado del cenlrómero (esto es, en el
mismo brazo), o 2) pericéntricas, las roturas se producen en lados opuestos
del centrómero y la inversión involucra a ambos brazos (Fig. 62-16/4). La
mayoría de las inversiones son equilibradas, pero se pueden detectar ano-
malías clínicas si el cromosoma se rompe dentro de un gen e interrumpe la
producción normal de un producto génico necesario. Existe un aumento del
riesgo de error meiótico y los portadores de la inversión muestran, frecuente-
mente, infertilidad o pérdida fetal espontánea temprana debido a los produc-
tos cromosómicos desequilibrados.
En la meiosis I, los cromosomas homólogos se emparejan y se origina la
recombinación. Para que un cromosoma invertido se empareje con su homó-
logo, se debe formar una estructura conocida como asa de inversión (Fig. 62-
166). Los gametos no serán impactados negativamente si no se produce la
recombinación y los cromosomas se separan normalmente. Sin embargo, el
sobrecruzamiento dentro del asa de inversión puede originar producios meió-
ticos desequilibrados. En la inversión paracéntrica, los resultados de la
recombinación son, normalmente, no viables, por lo que hay una supresión de
la recombinación aparente (es decir, los únicos gametos viables producidos
PATOLOGÍA MOLECULAR
proceden de cromosomas no recombmados) (Fig, 62-168). En las inversiones
pericéntricas es posible que los gametos con duplicación cromosómica y de-
leción, o ambas, puedan ser derivados. En general, las inversiones pericén-
tricas mayores pueden originar deficiencias en las duplicaciones más peque-
ñas y aumentan las probabilidades de que un niño nazca vivo, a pesar de que
el desequilibrio cromosómico puede generar anomalías en ese niño. Una vez
que se ha identificado al portador de la inversión, se puede utilizar el diag-
nóstico prenatal para valorar los cromosomas del feto.
Las translocaciones son las reordenaciones de dos o más cromosomas no
homólogos. Cada cromosoma se rompe una vez y los fragmentos se inter-
cambian de lugar, originando dos (o más) cromosomas derivados (Fig. 62-
14). Al igual que en las inversiones, la mayoría de las translocaciones son
equilibradas, y sólo tienen ramificaciones clínicas cuando se elimina un gen
estructural importante.
Por otra parte, el peligro principal de una translocación equilibrada es el
de que el portador tiene un mayor riesgo de tener hijos vivos con anomalías
cromosómicas. En la primera división meiótica los cromosomas translocados
adoptan una estructura en forma de cruz para que todos los alelos se empa-
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1315

No s e p a r a c i ó n - M e i o s i s I No separación - Meiosis II

A
Figura 62-11. Los errores de la no separación en la meiosis generan gamelos aneuploides. A, La no separación en la meiosis I produce una
copia extra del cromosoma A (heterodisomía) en dos gametos, pero también la falta de cualquier cromosoma A en los dos gametos restan-
tes S. La no separación en la meiosis II origina dos gametos con un complemento de cromosoma normal (abajo a a derecha), la falla de un
gameto en el cromosoma A y un gameto con un cromosoma extra duplicado (dos copias del cromosoma A1 producen isodisomia en el cro-
mosoma Al)

No separación

Figura 62-12. Generación de disomía uniparental por los errores de la

no separación. A la izquierda del diagrama se puede ver la heterodiso-
mia originada por la reducción de una trisomia a una disomía A la
derecha se observa la isodisomia producida por el rescate de la mono- Heteródísomfa Heteródísomfa Isodisomia
somía (la duplicación del único cromosoma que existe). uniparental hiparcntal uniparental
 1316 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
Isodisomia Heterodisomia Heterodisomia
uniparental uniparental biparental
Figura 62-13. Isodisomía Irente a heterodisomia. La conformación nalural de una
célula es la heterodisomia biparental: un cromosoma de cada padre. Los errores
en la división pueden originar una distribución aberrante de los cromosomas de
ambos padres, de forma que se pueden producir dos copias de un cromosoma de
uno de los padres (isodisomía uniparental) o dos cromosomas diferentes del mis-
mo padre (heterodisomia uniparental).
rejen adecuadamente (Fig. 62-17). En la anafase los cromosomas altemos
se deben segregar juntos para generar gametos equilibrados. Una de cada
tres veces los cromosomas no se segregarán de esta manera y producirán
gametos desequilibrados. A los errores más corrientes se les denomina
segregación adyacente 1 y segregación adyacente 2. A pesar de que ambos
patrones producen deficiencias en la duplicación del material cromosómico,
la segregación adyacente 2 es más deletérea, ya que está caracterizada por
la presencia de centrómeros homólogos en una sola célula. La viabilidad de
un feto que recibe un gameto desequilibrado depende de los cromosomas y
de los genes involucrados en la translocación y del tamaño de la duplicación
o de la deleción. Los cromosomas también pueden seguir un patrón de
segregación 3:1, en el cual tres cromosomas se separan en una célula y el
resto de los cromosomas en una segunda célula. Esto produce desequili-
brios totales del material cromosómico y por lo general es letal in útero. El
diagnóstico prenatal es posible una vez que se ha identificado al portador de
la translocación.
Las translocaciones Robertsonian son una variación de la translocación
clásica. Se producen, solamente, entre dos cromosomas acrocéntricos y se
presentan como una fusión de los brazos largos al centrómero, cuyo resulta-
do es la pérdida de los dos brazos cortos (Fig. 62-14). La pérdida de los bra-
zos cortos no es deletérea, dado que se localizan múltiples copias de los
genes de ARNr en todos los cromosomas acrocéntricos. Una persona porta-
dora de la translocación Robertsonian tiene 45 cromosomas, ya que dos cro-
mosomas se han convertido en uno que es funcional. Estas personas están
más expuestas a los errores de la no separación meiótica, cuyo resultado son
hijos con una trisomia en uno de los cromosomas reordenados. El ejemplo
más corriente de esto es el de una persona con una translocación Robertso-
nian en los cromosomas 13 y 14 que tiene hijos vivos con trisomia 13 (Fig. 62-
18). El hijo afectado tendrá 46 cromosomas con dos copias libres de cromo-
somas 13 y la translocación Robertsonian. Otra reordenación corriente es la
translocación Robertsonian 14;21. que podria dar lugar a que su progenie
tuviera una trisomia 21.
Aunque las translocaciones robertsonianas más corrientes se producen
entre cromosomas acrocéntricos no homólogos, es posible que se produzcan
estas reordenaciones entre cromosomas homólogos. Por ejemplo, un indivi-
duo con una translocación robertsoniana 21;21 tendrá un total de 45 cromo-
somas, incluida la translocación en la que los dos 21 están unidos al centró-
mero. Este tipo de reordenación es siempre virtualmente de novo, ya que los
portadores de esta anomalía, no es probable que tengan una progenie nor-
mal. Los gametos viables incluyen 1) una célula con la translocación Robert-
sonian (dos copias del cromosoma 21), que si es fertilizada dará lugar a un
niño con síndrome de Down, o 2) una célula sin copias del cromosoma 21,
que si es fertilizada dará como resultado una monosomía 21, que es incom-
patible con la vida.
El cromosoma que es el resultado de la división errónea del centrómero
durante la división celular que produce dos copias de uno de los brazos del
cromosoma pero al que le falta el otro brazo es un isocromosoma (Fig. 62-
14). Por tanto, el portador de esta reordenación tiene una trisomia en el
brazo duplicado y una monosomia en el otro brazo. El ejemplo mejor cono-
cido es el isocromosoma del brazo largo del X. Esta configuración produce
una trisomia en el brazo largo y una monosomía en el brazo corto del X, y
dado que se necesitan dos copias funcionales del brazo corto del X para
que se desarrolle un ser del sexo femenino, esta anomalía cromosómica es
coherente con el síndrome de Turner (véase más adelante en Aneuploidias
cromosómicas sexuales). Los cromosomas acrocéntricos también pueden
formar isocromosomas (duplicación inversa del brazo largo), pero esto pro-
duce la homocigosidad de todos los locus presentes, lo que puede llevar a
expresar desórdenes recesivos que de otra manera no habrían sido evi-
dentes.
Un cromosoma de anillo se produce cuando se pierden los dos telómeros
de un cromosoma y el fragmento del cromosoma que queda se hace un
circulo para restablecer la estabilidad cromosómica (Figs. 62-14 y 62-19).
Desafortunadamente, estas construcciones son, por lo general, inestables,
ya que la replicación puede producir círculos entrelazados que llevan a la
rotura del cromosoma y a su pérdida cuando los homólogos intentan sepa-
rarse en la anafase. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, los anillos
pueden ser transmitidos de forma estable en lineas celulares. Esto se pro-
duce cuando el anillo contiene material genético, que es esencial para la
función celular normal.
El cromosoma marcador es un cromosoma con un centrómero que se
transmite de forma estable a las células hijas, pero no puede ser claramente
identificado debido a que es demasiado pequeño o a que el patrón de bandeo
es demasiado ambiguo. La HISF ha sido de gran ayuda para determinar el ori-
gen de los marcadores.
Conclusiones. Las anomalías cromosómicas, tanto las numéricas como
las estructurales, que producen un complemento de cromosoma desequili-
brado están asociadas a algún tipo de descubrimiento clínico anormal, y el
tamaño del desequilibrio es proporcional a la gravedad del problema. La
mayoría de los individuos a los que les han diagnosticado una anomalía cro-
mosómica constitucional sólo tienen un único defecto cromosómico. Sin
embargo, hay casos raros de personas que tienen dos o más errores cromo-
sómicos. Las anomalías cromosómicas adquiridas (vistas en células cancerí-
genas) pueden ser más complejas y pueden tener múltiples cambios, numé-
ricos y estructurales, en una sola linea celular.
Nomenclatura
Con un campo tan amplio de variaciones cromosómicas. se hizo necesario
desarrollar un sistema de clasificación que hiciera posible que el complemen-
to de cromosoma de cada individuo fuera descrito sucintamente y compren-
dido por todo el mundo. La primera nomenclatura citogenética proporcionó
una línea de trabajo y desde entonces se ha ido desarrollando el "idioma".
Actualmente, el estándar reconocido es el Sistema Internacional de Nomen-
clatura Citogenética (SINC). y la última revisión ha sido en 1995.
La nomenclatura que describe a un complemento de cromosoma se divide
en tres partes básicas: 1) el número total de cromosomas, 2) el complemen-
to de cromosoma sexual y 3) cualquier anomalía cromosómica. Estas unida-
des están enumeradas por orden y separadas por comas. Así, una mujer o
hembra aparentemente normal se debe codificar como 46.XX y un hombre o
macho será 46.XY. Si hay dos o más líneas presentes, se enumeran secuen-
cialmente separadas por una barra inclinada, y si está presente un clon diploi-
de normal, siempre se le enumera al final (45,X/46,XX). A otros clones se les
ordena por tamaño, poniendo primero al clon más grande. El número de célu-
las en cada clon se indica por un número encerrado en un paréntesis angular
(45,X[15]/47.XXX[3J/46,XX[12]. Para las anomalías numéricas, el número de
cromosomas se aumenta o se disminuye para indicar el cambio total, y el cro-
mosoma especifico adquirido o perdido se anota al final. Por ejemplo, la tri-
somia 13 en una mujer o en una hembra se debe escribir 47,XX,+13 y la
monosomía 8 en un hombre o en un macho se debe escribir 45.XY.-8. Sin
embargo, para una variación cromosómica sexual que se sabe que es cons-
titucional, no es necesario utilizar el símbolo + o el -, ya que se puede notar
directamente el cambio en el complemento de cromosoma. La monosomía X
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1317

Figura 62-14. Represeniación esquemálica de las diferentes anomalías cromosómicas estructurales, descritas en el texto, asociadas con
ejemplos de cada anomalía. El primer panel muestra la conliguración normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B. C. D y E
indican a los diferentes locus de genes y el centrómero está indicado por un punto entre los locus B y C Deleaon La delación cromosbmica
muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la deleción terminal del brazo codo del cromosoma 4. Duplicación: La duplicación
cromosómica muestra las conliguraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicación terminal del brazo corto del cromosoma 5 (las dos fle-
chas indican la banda duplicada). El isocromosoma está originado por una división errónea del centrómero que produce duplicaciones inver-
tidas del brazo corto y del brazo largo del cromosoma original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del cromosoma X Inversión: La
inversión cromosómica muestra las formas paracéntnca y pencéntrica. Ejemplo: la inversión pericéntrica del cromosoma 9 (las flechas indi-
can los centrómeros) Translocación: Translocación reciproca frente a Iranslocación Robertsonian. Ejemplo: la transiocactón Robertsonian de
los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: el anillo 18.

La ilustración continua en el pagina siguiente.

8 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR

18 a(18)
Figura 62-14. Continuación. Representación esquemática de las diferentes anomalías cromosómicas, descritas en el texto, asociadas con
ejemplos de cada anomalía. El primer panel muestra la configuración normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B, C, D y E
indican a los diferentes locus de genes y donde el cenlrómero está indicado por un punto entre los locus B y C. Delación: La deleción cro-
mosómica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la deleción terminal del brazo corto del cromosoma 4. Duplicación: La
duplicación cromosómica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicación terminal del brazo corto del cromosoma
5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma está originado por una división errónea del centrómero que produce dupli-
caciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del cromosoma original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del cromosoma X.
Inversión: La inversión cromosómica muestra las formas paracénlrica y pericéntrica. Ejemplo: la inversión pericéntrica del cromosoma 9 (las
flechas indican los centrómeros). Translocación: translocación recíproca frente a translocación Robertsonian. Ejemplo: la Iranslocación
Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: anillo 18.
 CAPÍTULO 6 2 • APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1319

Figura 62-15. Ejemplos de deleciones cromosómicas A. Deleción del brazo largo disial del cromosoma 4 El cromosoma de la derecha es
significativamente más cono (Hecha) que el cromosoma normal de la izquierda, fl. Deleción intersticial del brazo largo del cromosoma 11. El
ideograma de la izquierda muestra la región de ADN que falta en el cromosoma que ha sufrido la deleción. A la derecha están los cromoso-
mas bandeados reales con el cromosoma 11 que ha sufrido la deleción a su derecha (las Hechas indican la deleción).

Figura 62-16. Inversión cromosómica. A. Diagrama de la inversión

pericéntrica del cromosoma 9 que utiliza los ideogramas para indi-
car los mecanismos de inversión. A la derecha se ven los cromo-
somas bandeados que demuestran esta inversión. 8 . Asa de
inversión que indica el emparejamiento de homólogos en la meio-
sis de un cromosoma normal y uno con una inversión paracéntri-
ca. Si la recombinación se produce en el punto indicado por el cro-
mosoma X en el asa, se generarán cromosomas recombinantes
como se muestra abajo. En el caso de una recombinación para-
céntrica. los cromosomas que se producen son dicénlncos o acén-
tncos.
 1320 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 62-17. Translocación cromosómica. En el diagrama se muestra la generación de gametos procedentes de una translocación hipotéti-
ca durante la meiosis. Los cromosomas se emparejan, en la meiosis 1. con una configuración en lorma de cruz. La segregación alterna gene-
rará gametos equilibrados. La segregación adyacente 1. la adyacente 2 o la adyacente 3:1 producirán gametos desequilibrados, los cuales
pueden originar un niño nacido con vida anormal. (Sólo se muestra una de las distintas segregaciones 3:1 posibles.)

se pone 45.X y la adquisición de un cromosoma sexual será 47.XXY.47.XXX
o 47.XYY. Por otro lado, si el cambio cromosómico sexual es adquirido, como
en algunas líneas celulares cancerígenas, se necesita un + o un - para indi-
carlo (es decir, 45.X-Y para un hombre o macho que haya perdido su cromo-
soma Y como resultado de su enfermedad).
Los cambios estructurales en los cromosomas no afectan a los cromoso-
mas presentes, pero se deben anotar al final para clarificar el estatus del o de
los cromosomas reordenados. Para no alargar la nomenclatura, se han gene-
rado una serie de abreviaciones para las anomalías estructurales corrientes
que acortan el total de la misma (Tabla 62-1). Una anomalía estructural se
indica con la abreviatura de la anomalía seguida del cromosoma implicado y
el punto de ruptura en el mismo. Para las reordenaciones en las que hay dos
cromosomas implicados, los cromosomas se dan en un primer conjunto de
paréntesis (primero el número más bajo o el cromosema sexual), seguido de

Figura 62-18. Los cromosomas bandeados y los de ascendencia muestran la

herencia de una translocación Robertsonian de los cromosomas 13 y 14. La
madre es la portadora de la translocación (tlecha larga) en una lorma equili-
brada, pero un error mekótico origina la transmisión, de la madre al hijo, de un
cromosoma con la translocación Robertsonian y de otro cromosoma 13. El
niño tiene trisomia 13 (las flechas cortas indican el 13S normal, la Hecha larga
indica la translocación Robertsonian). Nota: la segunda copia del cromosoma
14 no falta, sino que está unida al centrómero del tercer cromosoma 13.
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENETICA EN LA PATOLOGÌA MODERNA 1321

Tabla 62-2 A n o m a l í a s c r o m o s ó m i c a s en las pérdidas fetales

e s p o n t á n e a s y en niños nacidos con vida
Pérdidas fetales Incidencia en los
Anomalías
espontáneas % nacidos vivos

45.X 18 1/10.000
Triploidia 17 1/60 000
Tetraploidía 6,0 0
Tnsomias
16 16 0
22 5.7 0
21 4,7 1/700
15 4,2 0
14 3.7 0
18 3.0 1/8.000
13 2.0 1/10.000
Translocación desequilibrada 3.0 1/2.100
Reordenamiento equilibrado 4,0 2/1.000
Figura 62-19. Cromosoma anillo. El cromosoma 18 normal está a la izquierda. A la
derecha se indica el cromosoma de un solo anillo y el cromosoma de doble anillo. Los dalos proceden de Hook (1977). Jacobs ( 1992) y Mueller ( 1998)
El cromosoma anillo de la parte superior es de un solo anillo, como confirma la
imagen de banda-C de la derecha (un solo centrómero oscuro). El cromosoma ani-
llo de la parte inferior es mucho más grande y la tinción de banda-C indica dos cen-
trómeros oscuros, lo que lo confirma como un cromosoma de doble anillo. Citogenètica prenatal
Los estudios han demostrado que 1 de cada 13 productos de la concep-
ción tiene una anomalía cromosómica, pero de éstos, sólo 6 de cada 1.000
los puntos de ruptura de la reordenación en el mismo orden relativo; esto es, nacen vivos, lo cual indica que son reconocidos y eliminados la mayoría de
t(4;9)(q21,2;p22) es una translocación entre los cromosomas 4 y 9 con los los errores. Por ejemplo, de todas las concepciones 45.X, el 95% acabará
puntos de ruptura 4q21,2 y 9p22. espontáneamente. La misma frecuencia en el fin del embarazo se registra en
Los siguientes ejemplos incluyen a: las trisomías de los nacidos vivos (no llegarán a término el 90% de las con-
Deleción: 46,XX.del(4)(p15) Deleción terminal del brazo cepciones con trisomía 13. el 80% de las concepciones con trisomía 18 y el
corto del 4 en la banda 15 65% de las concepciones con trisomía 21). Por término medio, el 15% de
Duplicación: 46,XX,dup(11)(q23) Duplicación terminal del brazo todos los embarazos reconocidos termina con la pérdida fetal de manera
largo del 11 en la banda 23 espontánea, y el 80% de éstos se producen durante los tres primeros meses.
Translocación: 46.XY,t(4:9)(q21,2;p22) Translocación entre el 4 y el 9 De todos los abortos espontáneos, el 60% se deben a anomalías cromosó-
Inversión: 46.XY,mv(9)(p11q21.1) Inversión pericéntrica entre las micas (Tabla 62-2), y de éstos el 52% se deben a trisomías autosómícas. La tn-
bandas p11 yq21.1 somia más comente que se ve en material procedente de un aborto, es la
tnsomia 16. pero el tipo más frecuente de error cromosomico en las pérdidas
espontáneas es el 45,X.
CLINICA El diagnóstico prenatal se ha convertido en el área más importante de los
esludios citogenéticos clínicos, debido a esta clase de información y a los cono-
Aplicaciones clínicas cimientos, cada vez más amplios, de la genética. Los datos de referencia más
corrientes deben contar con una historia familiar del o de los hijos anteriores
Las anomalías citogenéticas se pueden encontrar en individuos aparente- con una anomalía cromosómica. de niveles anormales de AFP en un análisis
mente normales, asi como en pacientes con anomalías fenotipicas o con (véase Cap. 22), de una anomalía detectada por ecografia y de la edad de la
desórdenes genéticos diagnosticados. El diagnóstico se puede producir en madre. La razón exacta de este fenómeno no está clara, aunque los estudios
cualquier etapa de la vida. Se puede establecer la existencia de un síndrome sobre la población han demostrado que en las mujeres de más de 35 años
cuando se observa que varios individuos, no emparentados, tienen un con- está aumentando la frecuencia de hijos nacidos con anomalías cromosómi-
junto de rasgos iguales. Ya se sabe que las características asociadas a un cas, especialmente trisomías (Hassold. 1985) El análisis estadístico se ha
síndrome tienen una base común, las cuales son, con frecuencia, una ano- realizado, debido a la frecuencia relativamente alta de nacimientos con sín-
malía cromosómica especifica. Sin embargo, aunque un síndrome está defi- drome de Down, y muestra, claramente, la correlación entre los niños afecta-
nido por un conjunto de caracteres, los individuos afectados pueden ser via- dos y la mayor edad de la madre (Fig, 62-20). Esto se está convirtiendo en un
bles y no todos mostrarán un fenotipo idéntico. problema para una sociedad en la que las mujeres están dejando los emba-
razos para edades más tardías.
Las anomalías cromosómicas más comentes detectadas en los análisis
Tabla 62-1 Abreviaturas c o m u n e s de a n o m a l í a s prenatales son las trisomías en los nacidos vivos y las aneuploidías de los
cromosómicas cromosomas sexuales. Pero debido a que éstas son, normalmente, el resul-
tado de un error de la no separación meiótica, el nesgo de reincidencia es
Abreviatura Signiticado
muy bajo. Ocasionalmente se identifica a un niño con una anomalía cromo-
cen Centrómero sómica estructural equilibrada o desequilibrada. En estas circunstancias, se
del Deleción hace un análisis del cariotipo de los dos progenitores biológicos para diferen-
dup Duplicación ciar si el niño tiene una reordenación heredada o una anomalía de novo. Por
ejemplo, en un niño con una translocación equilibrada heredada, el nesgo de
ins Inserción
que la reordenación cromosómica plantee cualquier problema es menor de un
mv Inversión
1%. Sm embargo, si la translocación aparentemente equilibrada que se ha
i Isocromosoma visto en el feto no es detectada en ninguno de los padres biológicos, se ha
marcador Mar tenido que originar de novo en el niño y hay de un 5% a un 10% de nesgo de
a Anillo perjuicio para el niño. Desafortunadamente, encontrar una translocación no
rob TranslocacíOn Robertsonian equilibrada en un feto, a pesar del estatus portador de los padres, es una
l TranslocaciOn situación grave y casi siempre origina algún tipo de defecto genético en el
 1322 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
niño. Sin embargo, en esta situación, el determinar si uno de los padres es el
portador de la translocación equilibrada proporcionará información sobre el
riesgo de reincidencia en embarazos futuros.
Posnatal
Aproximadamente el 0,6% de los recién nacidos tienen una anomalía cro-
mosómica. Estos niños pueden presentar señales o síntomas de un síndrome
definido o pueden tener anomalías clínicas no relacionadas con un desorden
específico, pero de las que, sin embargo, se puede sospechar que se deben a
una anomalía cromosómica. Los genitales ambiguos son un síntoma para exa-
minar el complemento de cromosoma sexual de un recién nacido. Si un niño
muere poco después de su nacimiento, el análisis citogenético puede propor-
cionar la información necesaria para comprender el porqué de esa muerte. Los
hallazgos cítogénicos para establecer el diagnóstico deberán estar correlacio-
nados, siempre que sea posible, con los resultados de la autopsia.
Infancia y edad adulta
Un malentendido corriente sobre los desórdenes genéticos es que porque
son heredados el diagnóstico será obvio al nacer. De hecho, la presencia clí-
nica de muchos desórdenes tarda en manifestarse y puede no ser expresada
completamente hasta más tarde en la vida. En consecuencia, algunos de los
problemas diagnósticos más difíciles se dan en niños y adultos. Además, para
considerar el amplio alcance de las posibilidades citogenéticas, también se
deben tomar en consideración las opciones bioquímicas y moleculares.
Genética del cáncer
Otra área de la medicina en la que la citogenética está siendo cada vez
más importante es la oncología. A pesar de que la amplitud de variabilidad en
los hallazgos cariotípicos de la mayoría de los tumores sólidos hace que las
decisiones sobre los tratamientos sean difíciles, existen datos clínicos exce-
lentes, de las leucemias y de los linfomas, que incluyen a reordenaciones cro-
mosómicas específicas que están directamente asociadas a la tumorigénesis
(Tabla 62-3; véase Cap. 65; Block, 1998). Al identificar estas anomalías se
podrá hacer un diagnóstico a nivel citogenético, aunque en la práctica la cito-
genética es, generalmente, sólo una parte de los datos que se utilizan para
hacer un diagnóstico. Una vez que se ha detectado una anomalía cromosó-
mica, se puede monitorizar el progreso de la enfermedad del paciente. Si el
tratamiento tiene éxito, la mayoría de las anomalías cromosómicas ya no
serán evidentes en la médula ósea y se dirá que el paciente está en remisión,
mientras el cariotipo sea aparentemente "normal". Sin embargo, si el trata-
miento no elimina completamente la línea celular aberrante, la remisión puede
ser sólo un intervalo, en el cual las células causantes de la enfermedad pue-
den estar detenidas a unos niveles tan bajos que no son detectables a través
de los análisis de cariotipo rutinarios. Después, en la recaída, reaparecerán
las mismas anomalías cromosómicas, que pueden ir acompañadas de ano-
Figura 62-20. Aumento del riesgo de una concepción con sindrome
de Down relacionado con el aumento de la edad materna. El número de
niños nacidos con vida de madres con más edad es menor, debido a
la intervención de los diagnósticos prenatales, seguido de la interrup-
ción de embarazos anormales.
malías adicionales y/o de líneas celulares más complejas, resultados acordes
con progresión de la enfermedad. Un aumento en la complejidad de la recu-
peración es lo que se conoce como la evolución del cariotipo y. por lo gene-
ral, el número y el tipo de las anomalías cromosómicas vistas están correla-
cionados con un mal pronóstico y con la gravedad de la enfermedad.
La HISF de interfaz ha sido un elemento valioso para los estudios oncoló-
gicos clínicos (Cremer, 1988: Anastasi, 1991). Muchas de las anomalías cito-
genéticas importantes que se han visto en las leucemias son translocaciones,
y se han desarrollado sondas HISF de combinación que hibridan a los lados
opuestos de los puntos de ruptura de la translocación. Por ejemplo, la leuce-
mia mielógena crónica (LMC) está caracterizada por una translocación entre
el proto-oncogen ABL en el cromosoma 9 (9q22.3) y el gen BCR en el cro-
mosoma 22 (22q11.2). La reordenación origina un gen quimérico en el cro-
mosoma 22 derivativo. Para detectar la translocación se utilizan un par de
sondas: 1) se localiza al lado distal del locus ABL en el cromosoma 9 (rojo) y
2) situada en el lado proximal del locus BCR en el cromosoma 22 (verde).
Cuando hay no translocación presente, deberían estar presentes en cada
célula dos señales verdes (que detectan cada alelo ASÍ.) y dos señales rojas
(que detectan cada alelo BCR) (Fig. 62-21 A). La presencia de una transloca-
ción da una señal verde y una señal roja contiguas la una a la otra, y con la
resolución del microscopio de luz, las dos señales se unen, dando una sola
señal amarilla. Por tanto, una célula con una translocación tendrá sólo tres
señales, una verde, una roja y una amarilla (Fig. 62-216). Aunque se puede
hacer este estudio en células en metafase, la utilización de células de interfaz
proporciona una muestra mucho más grande con la que se puede hacer el
ensayo más rápidamente (Werner, 1997). De la misma manera se pueden
comprobar otras translocaciones leucémicas.
Otras aplicaciones de la HISF en oncología incluyen 1) la utilización de una
sonda de centrómero específica del cromosoma 12 para análisis de una
población de células de interfaz para las células de trisomia 12 indicativas de
LLC. 2) la utilización de una sonda de cromosoma 7 para detectar la mono-
somía 7 en el síndrome mielodisplásico (SMD) y la leucemia mieloide aguda
(LMA) y 3) la utilización de una sonda de cromosoma 8 para identificar la tri-
somia 8 en los desórdenes agudos y en los crónicos. También ha tenido
mucho éxito la utilización de sondas de X e Y de diferentes colores, para eva-
luar el éxito de un trasplante de médula ósea en el que el donante y el recep-
tor eran de sexos diferenles. Después del trasplante, el hombre que ha reci-
bido células de un donante femenino debería tener un complemento XX, pero
si se encuentra un número significativo de células XY, indicaría un problema
potencial o posiblemente el fallo del injerto, La HISF se puede repetir, a inter-
valos regulares, para monitorizar el progreso y para advertir de que empieza
a proliferar la población de células leucémicas del paciente.
La HISF multicolor también se ha utilizado para evaluar las líneas celulares
leucémicas. Es interesante hacer notar la discrepancia que hay, a menudo,
entre lo que se detecta a través de la citogenética habitual y lo que se ve uti-
lizando la HISF (Veldman, 1997). Se ha sugerido que las células cancerige-
 CAPÍTUIO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1323

Tabla 62-3 R e o r d e n a m i e n t o s cltogenéticos c o m u n e s e n la Desórdenes citogenéticos

leucemia y en el linfoma
Síndromes de aneuploidías cromosómicas
Reordenamiento
Desorden
cromosomico Aneuploidías autosómicas. La causa más común del retraso mental es
LMC (leucemia mielógena crónica) t(9;22)(q34 1q11 2) la trisomía 21 o síndrome de Down. La incidencia de este desorden es de 1
+8 de cada 700 nacimientos y está caracterizado por hipotonia. caras aplana-
'd 7q) das, cisuras palpebrales oblicuas, orejas pequeñas, lengua protuberante,
segundo Ph' pliegue palmar transversal, defectos del corazón e hipogonadismo.
+ 19 Aproximadamente el 92.5% de todos los individuos con síndrome de Down
LMA (leucemia mieloide aguda) tienen 47 cromosomas, incluidas tres copias del cromosoma 21 originadas
MI t(9;22)(q34 1;q11 2) por un error de no separación en la meiosis (Tabla 62-4). Sin embargo, sólo
+ 11 menos del 3% de los pacientes tienden a expresar un fenotipo menos seve-
M2 t(8:21)(q22:q22)
t(9.22)(q34.1;q11.2) ro y se manifiestan como mosaicos con dos líneas celulares que pueden
I(6.9)(p23q34) incluir una línea 46.XX o una 46.XY. Además, alrededor de un 5% de los
t(7.11)(p15;p15) pacientes con síndrome de Down sólo tienen 46 cromosomas, dado que el
+8 21 extra es parte de una translocación Robertsonian o de otras translocacio-
M3 (APL) t(15;17Kq22;q11-22) nes. Con frecuencia, un niño con una translocación indica la presencia de un
t(11;17Kq23:q21) padre portador de una translocación, por lo que en estos casos es recomen-
M4 (AMMoL) mv(16)(p12q22)
t(16:16)(p13:q22) dable hacer un análisis de cariotipo a ambos padres, para determinar si la
del(16)(q22) pareja tiene un riesgo mayor de tener más hijos con síndrome de Down en
mv(3)(q21q26). futuros embarazos.
I(3;3)(q21;q26)
I(11;19)(q23:p13) Los estudios citogenéticos de los individuos con reordenaciones del cro-
+8 mosoma 21 han revelado que no es necesario que se triplique el cromosoma
+22 21 en su totalidad para que esté presente el fenotipo del síndrome de Down.
M5 (AMoL) I(8;16)(p11;p13) A menudo, tres copias del brazo largo proximal producen presentaciones clí-
I(9;11)(p21-22:q23) nicas distintas de las del síndrome de Down. A la inversa, la triplicación del
t(11;19)(q23;p13)
brazo largo distal está directamente correlacionada con un claro fenotipo
t/del(11q23)
M6 t(3.5)(q21-25:q31-35) del síndrome de Down. Los análisis de pacientes con reordenaciones citoge-
inv(3)(q21q26). néticas diferentes han identificado una región conocida como la región crítica
t(3;3)(q2l;q26) del síndrome de Down. la cual incluye bandas de la 21q22.12 a la 21q22.3
M7 t(1.22)(p13;q13) (Fig. 62-22). La presencia de tres copias de este fragmento del 21 es sufi-
Cualquier subtipo +8 ciente para establecer un diagnóstico claro del síndrome de Down (Koren-
-7
berg. 1990; Delabar, 1993).
Y
20q- A pesar de que al hacer el mapa cromosómico se ha estrechado la región
9q crítica del síndrome de Down, los esludios comparativos entre pacientes con
K17q) síndrome de Down e individuos con otros desórdenes asociados a genes
LLA (leucemia linfoblástica localizados en el cromosoma 21 (Fig. 62-22) han dado correlaciones intere-
aguda) hiperdiploidía santes. Los análisis de la estructura cerebral de pacientes con síndrome de
L1 I(1;19)(q23;p13) Down o con Alzheimer, en particular, han revelado una anomalía arquitectóni-
del/t(12p)
1(4:11)(q21;q23) ca similar, lo que sugiere que la triplicación y la mutación del locus del gen de
L I , L2
del(6q) la proteina |3-precursora amiloide (PPA) pueden producir resultados negativos
I(9:22)(q34.1;q11.2) similares.
I(11:19)(q23:p13) Las otras dos trisomías de los nacidos vivos son la trisomía 13 y la tnsomia 18.
+21
La trisomía 13, el síndrome de Patau, con una frecuencia de 1 de cada 4.000
hiperdiploide, mn 50-56
I(8;14)(q24;q32) a 1 de cada 10.000 nacimientos, está caracterizado por cabeza pequeña, labio
L3
1(8;22)(q24;q11) leporino o paladar hendido, o ambos, ciclopía. pliegue palmar transversal, poli-
I(2:8)(p12:q23) dactilia de las manos, de los pies, o ambas, talón prominente, defecto septal
LLC (desórdenes imloproliferativos ventricular y cuero cabelludo puntiagudo. Aproximadamente se diagnostica de
crónicos) trisomía 18 o síndrome de Edwards (Fig. 62-23A) a uno de cada 8.000 recién
Célula B + 12 nacidos, que tienen poco peso al nacer, boca y mandíbulas pequeñas, delec-
14q+ to septal ventricular, hipoplasia de los músculos, un occipucio prominente, ore-
Célula T 14q+ jas malformadas y bajas, pies de base basculante y dedos cruzados.
14q 11 reordenamientos
Por lo general, el síndrome de Down es bastante manejable, a pesar de
Síndromes mielodisplásicos 5q del(5)(q13q33)
-7, del(7q) que tiene, frecuentemente, consecuencias clínicas graves y los pacientes lle-
+8 gan a vivir veinte o treinta años. La trisomía 13 y la trisomía 18 son mucho
+ 19 menos compatibles con la vida y los pacientes suelen morir durante el primer
dcl(20q) mes de vida. Si un individuo sobrevive al primer año, el porvenir es sombrío,
ya que esos pacientes no aprenden a hablar, a caminar o a cuidar de sí mis-
mos. Por este motivo, la opción de la interrupción del embarazo, está entre
los consejos para los casos con diagnóstico prenatal de trisomía 13 y triso-
mía 18.
ñas experimentan, realmente, un grado significativamente mayor de reorde-
naciones cromosómicas de las que se habían apreciado previamente y que Aneuploidías cromosómicas sexuales. Las aneuploidías cromosó-
algunas de las nuevas reordenaciones que se han detectado pueden eviden- micas sexuales son relativamente comentes (su Irecuencia, por lo general,
ciar nuevos genes relacionados con el cáncer. Sin embargo, llevará algún es de 1 de cada 500 nacimientos) y son fenotipicamente más leves que las
tiempo antes de que se pueda recoger un conjunto de datos significativos que aneuploidías autosómicas, debido al efecto de la inactivación del cromoso-
proporcionen las correlaciones clínicas de estas nuevas reordenaciones. ma X y al número limitado de genes presentes en el cromosoma Y. La
 1324 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 62-21. Detección mediante la HISF de la translocación 9:22 en la LMC. A. No hay translocación presente, como se ve por dos copias
de cada sonda del cromosoma 9 (en rojo) y del cromosoma 22 (en verde) en la célula en metalase (a la derecha) y en la de interfaz (a la
izquierda). 8. Translocación en un paciente que ha sido detectada mediante la señal amarilla (Hecha) más una señal verde y una roja (en célu-
las de interfaz).

causa, en la mayoria de los casos, es debida a cuatro desórdenes, tres tri- bres] a menudo no son detectados en toda la vida. La incidencia de los naci-
somías y una monosomía. Todos son originados por errores de no separa- mientos es relativamente alta. 1 de cada 1.000, pero salvo que son algo más
ción durante la meiosis y excepto el XYY. que es exclusivamente paterno, altos que la mayoría, no tienen rasgos chocantes que pudieran indicar una
los otros desórdenes pueden ser originados tanto por el error materno como anomalía cromosómica. Algunas de estas personas tienen dificultades de
por el paterno. aprendizaje generalizadas, por lo que pueden ser identificadas mediante los
Los cariotipos aberrantes de los individuos con tres cromosomas X programas de rendimiento escolar. También se puede detectar a las mujeres
[47,XXX mujeres] o con un cromosoma X y dos cromosomas Y [47.XYY hom- XXX y a los hombres XYY en las clínicas de infertilidad, aunque la anomalía
citogenética no está, generalmente, relacionada con el motivo de referencia,
ya que las evaluaciones globales muestran que estas personas son comple-
Tabla 62-4 Errores d e n o s e p a r a c i ó n q u e p r o d u c e n trisomia 21
detectados mediante tecnología citogenética y molecular tamente fértiles y que, por lo general, tienen hijos cromosómicamente norma-
les. Los hombres XYY tienen más riesgo de padecer problemas de conducta,
Citogenéticos Moleculares y los primeros estudios sugirieron que también tienen tendencias criminales
Meiosis materna I 70% 75% debido a la incidencia, más alta de lo que se esperaba, de XYY en presos de
Meiosis materna II 10% 20,6% instituciones penales (Jacobs, 1968; Price, 1970). Sin embargo, los trabajos
Meiosis paterna I 10% 1,2% posteriores muestran que la criminalidad, más probablemente, se deba a la
10% 3,2% combinación de múltiples causas y que los hombres XYY no son más pro-
Meiosis paterna II
pensos a tener una conducta criminal que cualquier otro hombre (Witkm,
Dalos de Sherman (1991. 1994) Anlonarakls 11992) 1976; Pitcher, 1982; Theilgaard, 1984).

Figura 62-22. A la derecha se ve el mapa del cromosoma 21. que muestra la región critica del síndrome de Down y las posiciones relativas
de los locus asociados a vanos rasgos clínicos. A la izquierda se muestra otro mapa de los locus (SUH1E = sindrome de Usher PPA = pro-
teína |5-precursora amiloidea [asociada a la enfermeoad de Alzheimer; DS01 = dismutasa superóxida-1; ELA1 = esclerosis lateral amilrópi-
ca; DFNB8 = sordera 8: ETS2 = oncogén ETS-2; HPE1 = holoprosencefalia alobar-1 : COL6A1'COL6A2<COL18A1 = genes de colágeno.) (Los
datos proceden de Korenberg [1990]; Delabar [1993]: OMIM [1999].)
 19 20
Figura 62-23. Cariolipos de los síndromes cromosómicos numéricos A, Síndrome de Edwards (trisomía 18): 47.XX.+18.
Los hombres con síndrome de Klinefelter (47.XXY) tienen tendencia a ser
altos y delgados, de piernas relativamente largas, aunque en los primeros
años estos hallazgos rara vez los apartan de los demás niños. A algunos indi-
viduos se les identifica en el colegio por sus dificultades en el aprendizaje,
pero las causas de referencia más corrientes son hipogonadismo pospuberal.
desarrollo del pecho como en una mujer, infertilidad debida a la pequenez tes-
ticular, tubos testiculares híalinizados y azoospermia. En individuos con un
complemento de cromosoma mosaico, incluida una línea celular 46.XY
[47.XXY/46.XY], se ve una forma más leve del síndrome de Klinefelter con fer-
tilidad potencial a causa de un desarrollo testicular normal. La llave de la fer-
tilidad es la proporción relativa de células XXY y XY durante la determinación
sexual en el primer zigoto y en los testículos. Un exceso de células XXY lle-
vará al individuo a ser un verdadero Klinefelter, mientras aue un mayor núme-
ro de células XY moderarán el fenotipo y aumentarán las probabilidades de
que sea fértil.
El sindrome de Turner: 45,X(Fig. 62-348) es la aneuploidia cromosómica
sexual más comúnmente reconocida, presente en un fenotipo femenino. En la
determinación sexual, el desarrollo femenino normal depende de la presencia
de dos cromosomas X aclivos. La región critica de la diferenciación femenina
se ha estrechado a una región del brazo corto del cromosoma X, justamente
proximal al centrómero. Si esa región no existe o está inactiva, se originará un
individuo con el síndrome de Turner. Aproximadamente la mitad de todos los
pacientes con sindrome de Turner tienen el complemento de cromosoma
21 22 X T
La ilustración continua en la página siguiente.
45.X clasico, que representa la única monosomia de los que nacen vivos via-
ble. Normalmente, el único cromosoma X es de origen materno e indica que
una no separación meíótica paterna es el origen del error más corriente.
También puede haber cariotipos más complejos además del 45.X (Tabla 62-
5) (Palmer, 1976). A los que más les atañe es a los individuos que tienen un
cromosoma Y, completo o parcial, en al menos una línea celular: éstos tienen
un nesgo mayor de gonadoblastoma.
El fenotipo del sindrome de Turner es altamente variable. Los individuos
afectados son típicamente bajos (<1,50 m) con disgenia gonadal y dificulta-
des de aprendizaje. Otros rasgos comunes son membrana cervical originada
por higroma quístico in útero, nacimiento del pelo posterior bajo, anomalías
renales y del corazón, cubitus valgus (aumento del ángulo de porte en el
codo) y tórax de caparazón. Los pacientes al nacer pueden presentar edemas
en las manos y en los pies. Los pacientes con síndrome de Turner tienen una
capacidad amplia para las habilidades mentales, y muchos tienen una inteli-
gencia normal, pero algunos tienen detectos mentales significativos. Más aún,
aunque en el síndrome de Turner la infertilidad se solía aceptar como el están-
dar, ahora se sabe que algunos pacientes se pueden reproducir con éxito,
normalmente los que tienen cariotipos mosaicos. Por tanto, y debido a la gran
diversidad de las presentaciones, el asesoramiento prenatal a una pareja con
un feto con un síndrome de Turner no identificado es extremadamente difícil.
Sin embargo, la mayoría de los pacientes nacidos vivos con síndrome de
Turner, por lo general, pueden tener vidas productivas, y los individuos afee-
1326 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
Tabla 62-5 Distribución d e los c o m p l e m e n t o s d e c r o m o s o m a
diferente q u e origina el s í n d r o m e de Turner
Porcentaje Anomalía
de casos % cromosómica
bü 45.X
20 45.X,i(Xq)
15 Deleciones del cromosoma X o anillos.
o la presencia de un cromosoma Y
10 Mosaicos 45.X/46.XX
41>.X/46. XY
lados levemente quizá no sepan que están afectados por el desorden hasta
que lleguen a la pubertad.
Otras anomalías cromosómicas sexuales
En los humanos, la determinación sexual es el resultado de una vía bio-
química compleja, que conlleva la interacción de proteínas producidas por
genes presentes en los cromosomas X e Y, así como por los genes en los
autosomas. El sexo natural, en los humanos, es el femenino, por eso se des-
arrolla un individuo femenino en ausencia de cualquier estímulo que defina a
un varón. El primer desencadenante para el desarrollo de un varón es un gen
localizado en el brazo corto del cromosoma Y. denominado FDT. factor que
determina los testículos, que está localizado en la región determinante del
sexo del cromosoma Y (RSY) (Fig. 62-24). La proteína producida por el FDT
inicia la vía para el desarrollo de un varón. Se han identificado vanos desór-
denes asociados a mutaciones en distintos genes dentro de esa vía que pue-
den originar genitales ambiguos o errores del genotipo o del fenotipo (un hom-
bre fenotípico con un complemento de cromosoma sexual XX o una mujer
tenolípica con un complemento XY).
El origen de un hombre XX se puede atribuir, generalmente, a una o dos
causas. La más corriente de las dos es la virilización de un leto femenino,
que con frecuencia es el resultado del desorden recesivo autosómico hiper-
plasia adrenal congénita (HAC). Este desorden lo produce la carencia de la
Figura 62-24. Diagrama de las localizaciones relativas del FDT, del RSY y de las
regiones seudoautosómicas del cromosoma X y del cromosoma t
1327
enzima 21 -hidroxilasa. que origina un bloqueo en la via de biosintesis nor-
mal y produce una acumulación de andrógenos. Los niveles excesivos de
hormonas masculinas en la circulación femenina pueden dar origen a una
persona de apariencia masculina, a pesar del complemento de cromosoma
femenino. Además, un feto femenino normal puede desarrollar genitales
ambiguos, debido a la exposición a un exceso de hormonas de la madre
afectada de HAC, dado que los andrógenos son capaces de atravesar la
placenta.
También se puede originar un hombre fenotípico con un complemento de
cromosoma sexual XX a causa de una translocación críptica entre el cromo-
soma X y el cromosoma Y. Los extremos distales de los brazos cortos de los
cromosomas X e Y son homólogos, e incluyen a las que se denominan regio-
nes seudoautosómicas (Fig. 62-24). Este es el primer lugar de apareamiento
del cromosoma X y del Y durante la meiosis y se puede producir la recombi-
nación entre el alelo X y el Y. De forma ocasional se puede producir un acon-
tecimiento de recombinación fuera de las fronteras de la región seudoautosó-
mica, originando la transferencia de los únicos locus Y, incluyendo a la RSY.
en la punta del cromosoma X. La cantidad de material cromosómico presen-
te en este intercambio es extremadamente pequeña y no puede ser detecta-
da por medio de la citogenética. Un hombre con una translocación tan equili-
brada no tendrá anomalías clínicas debido a que todos los genes están pre-
sentes, aunque en localizaciones alternas. Sin embargo, si este hombre
transmite su cromosoma X reordenado a un hijo que haya recibido un cromo-
soma X de la madre, el niño tendrá un complemento de cromosoma XX apa-
rente, pero tendrá un fenotipo masculino o un fenotipo masculino Klinefelter
debido a la presencia del gen FDT, que desencadena la via de desarrollo de
un hombre.
De forma recíproca, la translocación descrita antes puede originar una
mujer Turner con un complemento XY aparente. La vía para desarrollar a
un hombre no se iniciará en un individuo con un cromosoma Y que no
tenga el FDT y la RSY. y la determinación sexual se decantará hacia una
mujer. Sin embargo, la ausencia de dos copias intactas del brazo corto del
X proximal impedirá el desarrollo de una mujer "normal" y dará origen a un
individuo con síndrome de Turner. Esta situación es bastante infrecuente.
En una mujer XY el resultado más común es la insensibilidad andrógena,
que también es conocida como "feminización testicular". En estos indivi-
duos el cromosoma Y está intacto y el FDT está presente y es funcional. El
problema surge en otra parte de la via bioquímica por un defecto del gen
receptor de andrógeno que está localizado en el brazo largo del cromoso-
ma X (Xq21.3). El FDT inicia el desarrollo de un hombre, pero la vía esta-
rá bloqueada en el punto donde se necesita el producto del gen receptor
de andrógeno para hacer un compuesto de testosterona con dihidrotestos-
terona. No se puede ir más lejos en la diferenciación de un hombre y por
eso el fenotipo se revelará en una mujer. Sin embargo, estos individuos no
son fértiles por la falta de algunos genitales internos funcionales y presen-
tan, comúnmente, una vagina ciega y testículos en el abdomen o conduc-
to inguinal.
Anomalías cromosómicas estructurales
Se ha descrito un número razonable de síndromes directamente relaciona-
dos con una anomalía cromosómica estructural. La mayoría de ellos son bas-
tante raros. A continuación se explican algunos de los más comunes (véase
también Jones. 1997).
El síndrome de Wolf-Hirschhorn. también conocido como 4p-sindrome. se
debe a una aparente deleción terminal del brazo corto del cromosoma 4
[del(4)(p16|] (Fig. 62-14). Los resultados clínicos incluyen microcefalia.
micrognalia, hipotonia, pliegues epicánticos y retraso en el desarrollo. Se aso-
cia la apariencia facial característica de estos individuos con el casco de un
guerrero griego, debido a la nariz larga y a las cejas arqueadas. Las personas
que tienen este desorden necesitan educación especial y tienen un gran ries-
go de padecer convulsiones.
El Cri du chat o síndrome 5p- [del(5)(p15)j está caracterizado por un llanto
como de gato, agudo y distintivo, en la infancia. Otros rasgos son poco peso
al nacer y el crecimiento lento subsiguiente, hipotonia. microcefalia. hiperte-
lorismo. pliegues epicántico. anomalías cardiacas y retraso mental. Los niños
afectados tienen un desarrollo retrasado y pueden alcanzar los niveles socia-
les y cognitivos a los cinco o seis años.
 1328 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR

Síndromes de microdeleción y síndromes de genes contiguos
Por definición una microdeleción es una deleción muy pequeña, normal-
mente sólo una fracción de la banda de un solo cromosoma. Las microdele-
dones pueden ser confundidas con deleciones moleculares, asi que es
importante reconocer que, aunque las microdeleciones son pequeñas, son
significativamente más grandes (>500 kb) que la deleción molecular típica
(1 par de bases [pb] a varios cientos pb), que sólo se pueden resolver por
medio de la tecnología molecular (véase Cap. 66). El tamaño real de una
micro-deleción puede variar de un paciente a otro, y algunas pueden ser lo
suficientemente grandes para identificarlas mediante un análisis citogenético,
aunque la mayoría para ser detectadas necesitarán la utilización de la HISF.
Aunque al principio se creía que las deleciones estaban dentro de los genes
solos, ahora se ha demostrado que ciertos síndromes se deben, en realidad,
a deleciones que abarcan porciones de varios genes no relacionados adya-
centes. La presentación clínica, por tanto, puede ser una combinación de
características, debido a la ausencia de varios productos génicos diferentes.
El tamaño de la deleción y el número de genes afectados puede variar tanto
que el fenotipo expresado puede ser significativamente diferente entre los
individuos. A estos síndromes se les denomina colectivamente síndromes de
genes contiguos y representan una serie dentro de la categoría más amplia
de los síndromes de microdeleción (Tabla 62-6).
El síndrome de Miiler-Dieker ilustra con claridad el solapamiento entre la
microdeleción y los síndromes de genes contiguos. Este desorden se ha aso-
ciado con una microdeleción del brazo corto distal del cromosoma 17
(17p13.3), y los rasgos clínicos esenciales son lisencefalia (cerebro liso) y
anomalías craneofaciales. La lisencefalia aislada (LSA) ha sido reconocida
como una entidad independiente, así que el síndrome de Miiler-Dieker es una
presenlación más compleja que une el defecto cerebral con los rasgos facia-
les característicos. El análisis molecular muestra que hay al menos dos genes
involucrados en el síndrome de Miiler-Dieker. así que es un auténtico síndro-
me de genes contiguos originado por una microdeleción. Una deleción más
pequeña del gen LIS1 origina una lisencefalia aislada (Ledbetler, 1992).
Los síndromes de microdeleción mejor conocidos son el síndrome de
Prader-Willi (SPW) y el síndrome de Angelman (SA). Ambos comparten la
misma deleción intersticial del brazo largo proximal del cromosoma 15
[del(15)(q11.2q11.2)], pero la presentación clínica es significativamente dife-
rente. Los pacientes con el síndrome de Prader-Willi cuando nacen son
pequeños e hipotónicos, pero cambian durante el primer año de vida y empie-
zan a ganar peso con rapidez. Si no se les pone una dieta controlada, pue-
den ser bastante obesos debido la sobrealimentación. Tienen otras caracte-
rísticas, como manos y pies grandes, hipogonadísmo y mal genio. Aunque
son retrasados en su desarrollo, la mayoría se desenvuelve bien en las cla-
ses de educación especial. A los pacientes con el síndrome de Prader-Willi se
les puede internar en casas para grupos especiales, que les proporcionan un
ambiente adecuado, debido a su temperamento y a la dificultad para controlar
su dieta. Por otro lado, los pacientes con el síndrome SA tienen un retraso
mental agudo. Aunque son muy amistosos, por lo general no pueden mante-
ner una conversación normal y la interrumpen, con frecuencia, con estallidos
de risa inapropiados. Este desorden está también caracterizado por hiperac-
tividad, estatura baja, microcefalia, convulsiones y ataxia.
La deleción 15q se puede detectar en casi un 60% de los individuos con el
SPW. y en los pacientes con SA sólo entre un 10% y un 20%, por medio de
un análisis ordinario o criogénico de alta resolución. La utilización de la HISF
ha proporcionado una herramienta para el diagnóstico mucho mejor, y ahora
se pueden establecer las deleciones en el 80% a 85% de los casos. Aunque se
aceptaba que no todas las deleciones fueran visibles a nivel citogenético,
parecía extraño que la HISF no fuera capaz de detectar una delación en el
100% de los casos. Esto, unido al hecho de que el SPW y el SA parecen com-
partir la misma deleción aunque tienen fenotipos completamente diferentes,

Tabla 62-6 Microdeleción y síndromes de genes contiguos

Trastorno Localización Genes Rasgos clínicos
Angelman (SA) 15q11.2 UBE3A RM agudo, retraso en el desarrollo, boca grande, progriatia, ataxia,
convulsiones
DiGeorge (SDG) 22q1l.2. 10p, 4q, 6q ?GCSL Cara caracteristica. paladar hendido, hipoplasia del limo y
7
y otros
¿ paratiroides, corazón delectuoso e hipocalcemia
Icliosis Xp22.32 STS Piel escamosa, estatura baja, hipogonadismo, RM
Kallmann Xp22.3 KAL1 Hipogonadismo, incapacidad para oler
Larger-Giedion (SLG) 8q24 11-q24.13 TRPSI Dismorfismo craneofacial. anomalías esqueléticas, deficiencia
TRPSII mental de moderada a aguda
EXT
Lisencefalia (SIL) 17p13,3 LISI Cerebro liso, retraso mental profundo, convulsiones
Miiler-Dieker (SMD) 17p13.3 LIS1 Lisencefalia. microcefalia, trente alta, nariz pequeña, micrognatia,
¿y otros? orejas bajas
Prader-Willi (SPW) 15q11.2 SNRPN Hipotonia al nacer, ojos almendrados, RM de moderado a agudo,
ausencia de saciedad, lo que lleva a comer de más. manos y
pies pequeños, hipogonadismo
Retinoblastoma 13q14.1-q14.2 Rb1 Tumores del relinoblasto del ojo
Rubinstein-Taybi (SRT) 16p13.3 CBP Nariz rota, columela prominente, maxilar superior hipoplásico,
fisuras palpebrales inclinadas hacia abajo, dedos
pulgar y primero del pie anchos, RM y lenhtud al hablar
Smith-Magenis (SSM) 17p11.2 Braquicefalia, hipoplasia en media cara, puente nasal ancho.
mandíbula prominente, manos pequeñas y anchas,
hiperactividad. lentitud al hablar, conducta autodestructiva, RM
Síndrome velocardiofacial (SVCF) 22q11.2 ?GCSL Defectos en el paladar, alae nasi hipoplásica con nariz larga,
incapacidad para el aprendizaje, enfermedad cardiaca congénita
WAGR 11p13.3 WT1 Tumor de Wilms, aniridia, defectos genitourinarios y retraso mental
AN2
¿y otros?
Síndrome de Williams (SEW) 7q11? ELN Cl bajo, hipersensibilidad auditiva, oíos azules con un patrón
en forma de estrella en iris, labios prominentes, voz ronca,
estenosis aórtica supravalvular u otro defecto cardíaco,
hipercalcemia y envejecimiento prematuro de la piel
RM = retraso mental.
v ...
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA 1329

WAGR entre repeticiones directas que están contiguas a la región de deleción

común. Esta recombinación intercromosómica generará una estructura de
asa que, si se escinde, producirá la deleción del segmento intermedio.
También se han detectado recombinaciones intercromosómicas entre repeti-
ciones directas (Edelman, 1998).

Otros fenómenos citogenéticos

Síndrome del cromosoma X frágil

El síndrome del cromosoma X frágil es la segunda causa más importante
de retraso mental y la primera de retraso mental heredado. Herbert Lubs des-
cribió por primera vez este desorden en 1969, cuando se dio cuenta de que
en los miembros de la familia afectados había una correlación entre el retra-
so mental y un cromosoma X "marcador" (Lubs, 1969). Posteriormente se
conoce al cromosoma X marcador como el cromosoma X frágil, que es una
rotura o abertura en la estructura del cromosoma X que se puede delectar por
medio de la citogenética cultivando células en el medio de inducción adecua-
do (Fig. 62-26). Desgraciadamente no todos los individuos afectados expre-
san el cromosoma X frágil por medio de la citogenética, por lo que el análisis
clínico es imperfecto. Sin embargo, durante muchos años fue el único ensa-
11
yo disponible y proporcionó una muy necesaria confirmación de los diagnós-
Figura 62-25. Diagrama del síndrome de genes contiguos WAGR que muestra la ticos de muchos pacientes. En 1991 se clonó el gen asociado al síndrome del
posición relativa de los diferentes genes en el brazo corto del cromosoma 11. cromosoma X frágil y se identificó a la mutación como la amplificación de una
secuencia repetida de tnnucleótidos, algo que nunca antes se había visto o
asociado como un mecanismo causante de la enfermedad. Afortunadamente,
esta mutación se puede detectar a nivel molecular, y se ha desarrollado un
análisis clínico, altamente competente, que permite la detección directa de la
sugería que pudiera haber otra causa que originara estos desórdenes. Ahora
mutación del síndrome del cromosoma X frágil (Rousseau. 1991; Verkerk.
se sabe que el SPW y el SA son ejemplos de impresión genética y que el pro-
1991).
ceso de la mutación que origina las enfermedades es mucho más complejo
que una simple deleción del ADN (Nicholls, 1989; Robinson, 1991) (véase el
Cap. 66 donde se explica la detección molecular y de impresión de los genes Síndromes de rotura
impresos).
Los síndromes de rotura cromosómicos (Tabla 62-7) son un conjunto de
El síndrome de Williams ha sido asociado a una deleción del gen de elas-
desórdenes recesivos autosómicos que se agruparon juntos al principio a
lina (ELN) del brazo largo proximal del cromosoma 7 (7q11.23). Este desor-
causa de que los resultados tenían en común la fragilidad o inestabilidad cro-
den se caracteriza por anomalías cardíacas, hipertensión, voz ronca, enveje-
mosómica (Ariett. 1978). Por esta razón, los análisis citogenéticos fueron de
cimiento prematuro de la piel y anomalías en el comportamiento. La ausencia
gran ayuda para los diagnósticos. Los estudios moleculares han demostrado
de elastina explica muchas de las anomalías físicas asociadas a este síndro-
una causa común adicional entre estos desórdenes, y es que la mutación en
me, ya que se sabe que es una proteína importante que da elasticidad a teji-
cada uno de ellos origina un defecto en los mecanismos de reparación del
dos, como los del corazón, vasos sanguíneos, piel y cuerdas vocales. Sin
ADN de las células. Esto ayudó a explicar otras características de los síndro-
embargo, los problemas de conducta no se pueden atribuir a la falta de elas-
mes, ya que la incapacidad para reparar el ADN puede llevar a 1) la rotura o
tina, por eso actualmente se cree que el síndrome de Williams es, en realidad,
al aumento de la recombinación, que se puede caracterizar por medio de
un síndrome de genes contiguos y que la variabilidad del fenotipo está rela-
la inestabilidad cromosómica, y 2) a mutaciones adicionales y defectos en la
cionada con el número de genes adyacentes que se delecionan en combina-
secuencia del ADN, que pueden originar el cáncer. Con un mejor conoci-
ción con el gen ELN.
miento de la mutación específica, la terapia génica para el tratamiento se con-
El síndrome de WAGR (tumor de Wlms, aniridia. defectos genitourinarios, vierte en una posibilidad.
y retraso mental) es un síndrome de genes contiguos muy bien caracterizado
y está localizado en el brazo corto del cromosoma 11 (11 p13). Excepto por los
defectos genitourinarios, que parecen ser debidos a una mutación variante en
el locus del tumor de Wilms. cada una de las otras tres anomalías han sido
asociadas a un gen específico, y éstos están ordenados en tándem en el
brazo corto del cromosoma 11 (Fig. 62-25). El fenotipo de un individuo afec-
tado variará dependiendo del tamaño de la deleción. Estadísticamente, alre-
dedor de uno de cada tres niños diagnosticados de aniridia desarrollarán
también el tumor de Wilms. Por el contrarío, sólo 1 de cada 50 pacientes con
tumor de Wilms tiene aniridia. Con deleciones más grandes, también se pue-
den ver defectos genitourinarios y retraso mental.
El síndrome velocardioíacial es. posiblemente, el síndrome de microdele-
ción más común en los humanos, pero, muy a menudo, pasa desapercibido,
debido al amplio espectro de los rasgos clínicos y a que puede presentarse
de forma bastante leve. Este desorden se diagnostica, normalmente, en niños
lactantes, debido a las dificultades que tienen para alimentarse, a los detec-
tas cardiacos y a las dismorfologías faciales características. Cuando el indivi-
duo crece, se advierten discapacidades en el aprendizaje, poca estatura y
pérdida de audición conductiva. Es interesante hacer notar que entre un 10%
y un 15% de estos pacientes tienen un progenitor afectado, pero mucho más \
levemente, por la misma deleción. Se cree que la deleción 3 Mb del brazo Figura 62-26. Cromosoma X frágil. Ideograma del cromosoma X frágil (izquierda)
largo proximal del cromosoma 22 (22q11.2q11.2) se debe a la recombinación y un par de cromosomas con bandeo-G representativos que muestran, a la dere-
cha, al cromosoma X frágil.
Tabla 62-7 Síndromes de rotura cromosomica
Manifestaciones Defecto de reparación
Trastorno Características clínicas Locus gènico citogenétícas Tipo de cáncer del ADN Miscelánea
Anemia de Fanconi (AF) Pancitopenia, retraso en el 1. Grupo A— I6q24.3 Aumento de roturas cromosómicas Aumento del riesgo de LMA Terapia actual
crecimiento pre o posnatal, 2. Grupo C—9q22.3 detectadas mediante tratamiento y fallo progresivo de la trasplante de
hipopiasia o falta de dedos 3. Grupo D—3p22-p26 con MMC y DEB médula ósea medula ósea
pulgares, posibilidad de 4. Grupo E—6p21-p22
deformación en ios brazos, 5. Grupos B E H
pigmentación oscura de la piel sin mapa
Sindrome de Bloom (BLM) Retraso en el crecimienio. I5q26 1 Aumento de CCH en respuesta a Actividad anormal de la Alta frecuencia
erupción en la piel en forma los rayos ultravioleta o ADN ligasa I en la población
de mariposa, posiblemente incorporación de BrdU ludía ashkenazi:
maligna 1/110 es portadora
de esa frecuencia
Ataxia telangiectasia (AT) Ataxia con degeneración del 11q22.3 Aumento de las roturas Vanas leucemias y
SNC, telangiectasia en la cara, espontáneas, aumento de tumores sólidos
deficiencia de inmunidad celular, anillos tnrradiaies y
degenerativo, retraso en el translocaciones, especialmente
crecimiento en el cromosoma 7 y en el 14
inducidas con bleomicma o con
radiaciones ionizantes
Xeroderma pigmentos (XP) Sensibilidad a los rayos solares, incidencia: 1 en 250 000 Aumento del CCH y Aumento en la incidencia i Falta de escisión de los
anomalías neurologicas. 1. A-9q22.3 reordenamiento cromosomico de cancer de piel los dímeros de timina
ataxia y espasticidad 2. C-653p25 en respuesta a los rayos 2. Defecto en la reparación
3. D—19q13.2-ql3.3 ultravioletas posreplicación
4. E—11p11.1-p12
5. F-16p13.1-13.2,
16p13.13-p13.3
5. G—13q33
Síndrome de Cockayne Enanismo, envejecimiento Cromosoma 5 Sensibilidad a los rayos Aumento en la incidencia Posible deficiencia de
prematuro, microcefalia, déficit ultravioletas de cáncer de piel ADN ligasa o defecto de
neurològico, degeneración de la reparación de la
la pigmentación, sordera, transcripción asociada
sensibilidad a la luz del sol. RM emparejada
MMC • mitomicma C: DEB = diepoxybutano: CCH = camOio de la cromdtida hermana: SNC = sistema nervioso central. RM • retraso mental: BrdU = bromodesoxiuridma: LMA = leucemia mieloide aguda
 CAPÍTULO 62 • APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
RESUMEN
La citogenética es una ciencia de laboratorio de trabajo intensivo, relativa-
mente antigua, que todavía se ejecuta de la misma manera en la que siem-
pre se ha hecho, a pesar de que la llegada de los sistemas asistidos por orde-
nador para hacer cariotipos y el recolector robótico han añadido un elemen-
to de tecnología avanzada al laboratorio. Aunque una vez se vaticinó que los
diagnósticos moleculares eliminarían a la citogenética. eso no ha ocurrido, ya
que la citogenética es aún el único ensayo clínico que puede proporcionar
una visión general rápida de todo el genoma humano. En lugar de ser reem-
plazada, la citogenética ha cambiado con los tiempos para hacer (rente a los
retos de las enfermedades que se han identificado recientemente y de las
nuevas tecnologías. La utilización de la HISF ha rellenado el hueco entre la
citogenética y los diagnósticos moleculares de tal manera que los dos cam-
pos proporcionan información complementaria para muchos casos. La cito-
genética continúa siendo importante en la valoración de las anomalías cro-
mosómicas estructurales y numéricas, y es el estándar oro para diagnosticar
muchos desórdenes. Su lugar en la medicina de laboratorio clínica está ase-
gurado (por lo menos hasta el momento en el que el escáner tipo "Star Trek"
está disponible).
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 C A P Í T U L O 63

Organizando un laboratorio
de diagnóstico molecular
Andrea Ferreira-Gonzalez, Ph.D.
David S. Wilkinson, M.D., Ph.D.
Carleton T. Garrett, M.D., Ph.D.

INSTALACIONES DEL LABORATORIO 1333 VALIDACIÓN ANALÍTICA Y CLÍNICA DE

Diseño del laboratorio LAS PRUEBAS MOLECULARES 1339

Métodos de ayuda en el control de contaminación Reactivos específicos del sustrato

Limitaciones especiales en relación
EQUIPAMIENTO 1335 con las pruebas genéticas
PERSONAL DE LABORATORIO 1335
CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD
Director del laboratorio
DE LA CALIDAD 1341
Supervisor técnico
Control de calidad en el proceso de las pruebas
Técnicos médicos y técnicos en biología molecular
Control de calidad del equipo de laboratorio
Residentes, becanos y estudiantes graduados
Elementos del programa de
Adiestramiento y acreditación seguridad de la calidad

FORMATOS DE PRUEBAS CLÍNICAS 1337 ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO 1342

Pruebas de desarrollo propio Pruebas de los laboratorios clínicos
Métodos manuales basados en equipos Pruebas forenses de identidad
Sistemas automatizados basados en equipos humana y de paternidad
para pruebas moleculares
CONCLUSIÓN 1343
SELECCIÓN DE PRUEBAS 1337
BIBLIOGRAFÍA 1343
Codificación CPT e ICD-9
Patentes

Durante la última década se ha adquirido una enorme cantidad de conoci-
mientos con respecto a los genes y a sus funciones en las enfermedades
humanas. Esle conocimiento nos ha permitido una mejor comprensión del pro-
ceso de muchas enfermedades. Como consecuencia, las enfermedades se
definen cada vez más en términos de su patogenia molecular. Esto ha condu-
cido al desarrollo de nuevos métodos clínicos moleculares para su utilización
en el diagnóstico, pronóstico, selección de modalidades terapéuticas y vigilan-
cia de las enfermedades (Ferreira-González, 1996; Fredericks. 1999; Hodinka,
1998; Hruban. 1998; Sawyers, 1999; Tsongalis. 1999). Los métodos clínicos
moleculares representan una serie de técnicas y reactivos en los que el principal
analizado es el ácido nucleico. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido deoxim-
bonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Existen múltiples aplicaciones de
esta tecnología a diferentes áreas del laboratorio clínico. Una de las principales
ventajas de utilizar ácidos nucleicos como sustrato analizado es que representa
el marcador natural más especifico de todos los organismos vivientes, esto es.
el orden de los nucleótidos que comprenden el genoma de un organismo. El
número de disposiciones diferentes de los cuatro diferentes nucleótidos, que
puede estar presente en una molécula de ADN que sólo es tan grande como el
virus de menor tamaño, es muchas veces superior al número total de los dife-
rentes tipos de organismos vivos de esle planeta. Así. la secuencia del ADN de
cada organismo vivo contiene una información peculiar que se puede utilizar
para su identificación. Además, los cambios en las secuencias del ADN son la
causa de enfermedades genéticas y malignas; por tanto, proporcionan una infor-
mación diagnóstica y pronostica muy importante Hasta hace poco, los principa-
les métodos de laboratorio para detectar diferencias en la secuencia de los áci-
dos nucleicos no habían sido lo suficientemente sencillos o fiables como para uti-
lizarlos en el laboratorio clínico. Los avances recientes en la tecnología y en la
instrumentación, asi como los esfuerzos para su normalización, han podido ven-
cer muchas de estas limitaciones.
INSTALACIONES DEL LABORATORIO
La potencia del diagnóstico molecular se deriva de la exquisita sensibilidad
y especificidad proporcionada por el uso de ácidos nucleicos como sustrato
analizado. La alta sensibilidad se deriva de la amplificación m vitro de secuen-
cias especificas diana de ácidos nucleicos presentes en la muestra proce-
dente del paciente. La amplificación in vitro crea millones o billones de copias
de la secuencia blanco y permite asi detectar hasta una única molécula dia-
na en el espécimen del paciente. Al mismo liempo, sin embargo, esta alta sen-
sibilidad presenta importantes desafios para el uso de esta tecnología. Asi,
una de las principales ventajas de esta tecnología es también una de sus prin-
cipales limitaciones. El cierre y apertura de los tubos de la microcenlrilugado-
ra que contienen productos amplificados pueden producir microgotas en for-
ma de aerosol que pueden transportar entre 10 y 100 copias de la secuencia
diana amplificada. Estas microgotas pueden posteriormente depositarse en
 1334 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
los puntos de trabajo, instrumentos, mobiliario, suelo, polvo, pelos, piel ex-
puesta: virtualmente cualquier superficie. Otra importante fuente de contami-
nación puede ser el propio ácido nucleico diana. Los métodos de manejo de
las muestras siempre deben estar protegidos contra la contaminación cruza-
da de las muestras de los pacientes. La contaminación por el propio ácido
nucleico diana nativo puede ser también el resultado del procesado de mues-
tras de pacientes en un ambiente en el que el ácido nucleico diana sea ampli-
ficado biológicamente bien por clonación o cultivando la célula o los microor-
ganismos que lo contienen. Así, es necesario diseñar cuidadosamente las
instalaciones del laboratorio de diagnóstico molecular para asegurar que hay
un espacio suficiente y adecuado para el personal y el equipo, y también para
minimizar el potencial problema de la contaminación de especímenes con áci-
do nucleico diana natural y/o ácido nucleico procedente de una amplificación
m v//ra(Porter-Jordan. 1990).
Diseño del laboratorio
El espacio de laboratorio debe diseñarse para minimizar el riesgo de con-
taminación y maximizar el flujo de trabajo. El uso de barreras de contención
mediante la utilización de áreas de trabajo separadas físicamente para el pre-
parado de reactivos, acceso de muestras, extracción de ácidos nucleicos y
análisis del material amplificado es altamente deseable. Un laboratorio ideal
está compuesto de tres habitaciones completamente independientes. Dos de
estas habitaciones se consideran habitaciones limpias, dado que todas las
tareas y ocupaciones antes de la amplificación in vitro se realizan en estos
cuartos. Estos cuartos se llaman habitaciones de preampliíicación. El tercer
cuarto se considera un cuarto sucio, dado que se dedica a la amplificación in
vitro y al análisis del material amplificado. Esta habitación se llama la habita-
ción postamplificación. Los sistemas de tratamiento del aire de cada uno de
estos cuartos deben ser completamente independientes uno de otro. Si ello
no es posible, el laboratorio de preampliíicación debe localizarse lo más pró-
ximo posible a la fuente del aire. Si ello es posible, los laboratorios de pre-
ampliíicación deben estar dotados de filtros electrostáticos de aire instalados
en la entrada de aire a cada laboratorio. Estos filtros deben vigilarse de forma
periódica, incorporando el cambio y limpieza de los filtros de aire en el pro-
grama de control de calidad del laboratorio. Ademas de los filtros de aire, los
laboratorios de preamplificación deben estar a presión positiva de aire. Esto
impedirá la entrada de cualquier contaminante aéreo en el laboratorio de pre-
amplificación cuando se abra la puerta. El laboratorio de postamplificación
debe estar a presión de aire negativa para impedir la salida de cualquier par-
tícula de este laboratorio, con la consiguiente contaminación del ambiente cir-
cundante. La construcción de una antesala en cada laboratorio es una forma
barata de crear una presión diferencial en el laboratorio. Una antesala a pre-
sión positiva para el laboratorio de preamplificación se puede crear utilizando
un ventilador en el techo de la antesala que extraiga el área de dentro del
laboratorio y lo empuje hacia la antesala. Esta antesala a presión positiva tie-
ne a grandes rasgos la misma función que tener todo el laboratorio bajo pre-
sión positiva. De lorma parecida, se puede construir fácilmente una antesala
a presión negativa para la habitación de postamplificación haciendo que la
turbina extraiga el aire de la antesala y lo sople hacia dentro del laboratorio.
Esta antesala debe disponer de un método de sellado alrededor de la puerta
que separe la antesala del laboratorio para evitar que el aire que está dentro
del laboratorio vuelva a salir hacia la antesala. Un punto importante es que la
puerta que conduce hacia la antesala desde fuera y la puerta que comunica
con el interior del laboratorio nunca deben abrirse a la vez. Un método de
seguridad adicional es añadir un suelo adherente en la entrada de cada ante-
sala o laboratorio. El tamaño de la antesala lo determina las actividades que
se llevarán a cabo en la misma. Las antesalas deben tener suficiente espacio
como para permitir que por lo menos dos individuos entren o salgan del labo-
ratorio y se cambien las ropas de laboratorio a la vez. Además, si se utilizan
batas, gorros y cubrezapatos desechables especiales para el laboratorio, se
necesitará espacio para su almacenamiento.
En cada uno de los tres laboratorios se llevan a cabo diferentes activida-
des. La amplificación m vitro nunca se lleva a cabo en los dos laboratorios de
preamplificación. Uno de estos últimos se dedica a la preparación de reacti-
vos, y el otro al acceso y procesado de especímenes y al preparado de la
reacción. En caso de que el espacio sea limitado, las dos habitaciones de pre-
amplificación se pueden combinar en un solo laboratorio. Se recomienda alta-
mente el uso de campanas de "aire muerto" para el preparado de reactivos y
organización de las reacciones, lo cual es aún más crítico en el caso de que
ambos laboratorios deban estar combinados. Las campanas de aire muerto
proporcionan un medio altamente controlado donde se pueden llevar a cabo
el preparado de reactivos y reacciones. Es importante intentar localizar esta
zona en una sección de laboratorio que tenga poco tráfico. No se deben intro-
ducir ARN, ADN o especímenes de pacientes tanto genómicos como plásmi-
dos dentro de la caja de aire muerto donde se realiza la preparación de los
reactivos. Esta caja de aire muerto debe estar provisla de una luz ultravioleta
para colaborar a esterilizar las superficies interiores. Las superficies de las
cajas de aire muerto también se deben tratar con una solución recién prepa-
rada de hipoclorilo sódico al 10% (lejía) y posteriormente con una solución de
etanol al 75% después de trabajar en la zona. Estas áreas deberían contener
un equipo e instrumentación específicos que no se deben compartir con nin-
guna otra área Esto debería comprender las pipetas, el agitador, las puntas,
los tubos y otro instrumental similar. Se debe utilizar un traje y guantes espe-
cíficos de laboratorio antes de trabajar en esta zona.
La segunda área o habitación limpia dentro del laboratorio de preamplifica-
ción es donde se lleva a cabo el acceso de los especímenes, su procesado y
la adición de ácido nucleico a los tubos de reacción adecuados. Esta área
debe estar provista con por lo menos un gabinete de bioseguridad ambiental
para procesado de muestras y extracción de ácidos nucleicos además del
equipo de laboratorio especifico, que sólo se debe utilizar para estos fines.
Debería disponerse de otra cabina de bioseguridad medioambiental comple-
tamente separada si en este laboratorio se lleva a cabo cualquier tipo de cul-
tivo tisular, y debería existir equipo de laboratorio separado dedicado a esta
labor. Si en el laboratorio se utilizan extracciones de ácidos orgánicos nuclei-
cos, se debería disponer de una cabina de seguridad química para manejar
los pasos que comprenden lenol y cloroformo durante el proceso de extrac-
ción. Si se llevan a cabo extracciones tanto de ARN como de ADN en el mis-
mo laboratorio de preampliíicación. se deberían realizar estos procedimientos
en áreas separadas del laboratorio y tener instrumentos específicos para
cada uno. así como pipetas y puntas para cada método. En circunstancias
donde hay problemas de espacio y no es posible dedicar dos áreas comple-
tamente separadas, la extracción del ADN y del ARN debe llevarse a cabo en
momentos diferentes o en días diferentes después de limpiar a fondo las áre-
as antes de trabajar. Como ya se ha descrito, todas las áreas deberian lim-
piarse con una solución al 10% de hipoclorito sódico preparado en el día y con
una solución de etanol al 75%.
El laboratorio de postamplificación es donde se realiza la amplilicación in
vitro y el análisis de ácido nucleico. Los instrumentos que se utilizan en este
laboratorio no se deben compartir con las áreas de preamplificación Si se uti-
lizan termocicladores para la amplificación in vitro de los ácidos nucleicos,
se recomienda que se coloquen en este laboratorio. Si los termocicladores se
colocan en el laboratorio de preamplificación. bajo ninguna circunstancia se de-
ben abrir los tubos de reacción después de la amplificación en este cuarto.
Además, los termocicladores deben enchufarse en líneas específicas con su
propio disyuntor de circuito para evitar cualquier fluctuación en la electricidad
que pudiera afectar a su funcionamiento. Normalmente, este laboratorio nece-
sitará de más espacio que los laboratorios de preamplificación debido a los
requerimientos de espacio de la instrumentación y de los métodos de análisis
del producto amplificado. La electroforesis en gel. por ejemplo, utiliza con fre-
cuencia una cantidad significativa de espacio. Se recomienda disponer de
una cabina de seguridad biológica y de una incubadora por agitación si se van
a llevar a cabo métodos de clonación. También es altamente deseable dispo-
ner de un cuarto oscuro con una procesadora automática de radiografías y un
congelador. Sin embargo, es preferible colocar el cuarto oscuro fuera del labo-
ratorio de postamplificación, de manera que se pueda tener acceso al mismo
sin tener que entrar en el laboratorio de postamplilicación.
Métodos de ayuda en el control de contaminación
La introducción de prácticas sencillas en las actividades ordinarias puede
ser útil en el control de la contaminación, tanto de las muestras como de la
amplificación. Se debe seguir estrictamente un flujo de trabajo unidireccional
en el que el personal lleve a cabo sus tareas primero en los cuartos limpios,
y sólo después de completar su trabajo se muevan a la habitación de postam-
plificación. Ningún personal que haya trabajado en el laboratorio de postamplifi-
 CAPÍTULO 63 • ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR 1335

cación debe volver al área de preamplificación antes de ducharse y cambiar- les a través de laboratorio y de vuelta hacia el área administraliva. Es impor-
se de ropa. Se recomienda el uso de batas de laboratorio, gorros y cubreza- tante que el servidor de la red se someta diariamente a copias de seguridad.
patos de un solo uso. Si se utilizan batas de laboratorio de tela, es necesario
tener batas de laboratorio especiales para cada laboratorio, que deben man-
EQUIPAMIENTO
tenerse dentro de cada laboratorio y no se debe utilizar en las áreas externas.
El uso de batas con diterentes colores para cada zona es una forma de recor-
dar al personal el estricto flujo de trabajo. Otro factor importante en el flujo de El equipamiento de laboratorio necesario para llevar a cabo con éxito las
trabajo del laboratorio es la limpieza. El método más seguro es hacer que el actuales pruebas diagnósticas moleculares puede incluir instrumentación que
personal del laboratorio guarde en bolsas la ropa sucia de cada laboratorio y no se suele encontrar en el típico laboratorio clínico. Incluso donde hay una
lo coloque fuera del mismo para ser llevado a la lavandería. Si el personal de superposición, es importante que el laboratorio de diagnostico molecular con-
lavandería entra en los laboratorios, debe recibir las instrucciones de quitar tenga su propio equipo a fines de control de la contaminación. En la Tabla 63-1
primero la ropa sucia del cuarto de preamplificación, después del espacio de se proporciona una extensa lista de equipo de laboratorio junto con sus pre-
oficinas y después de la sala de postamplificación. cios aproximados. Algún equipo adicional especializado no incluido en esta
lista, que pudiera ser útil dependiendo de la perspectiva del menú de pruebas,
No se recomienda proteger los mostradores de trabajo con papel absor-
comprende un secuenciador automático de ADN (45.000-125.000 dólares),
bente que lleve plástico detrás, dado que el papel puede recoger polvo y, con
un termociclador en tiempo real de la reacción de polimerasa en cadena
él, material amplificado si no se cambia a menudo. Si se utiliza, este tipo
(PCR) (45.000-95.000 dólares), instrumentos de electroforesis capilar (50.000
de papel debe descartarse de forma inmediata después de cada uso. El uso de
dólares) e instrumentación para la cromatografía líquida de alta resolución
lejía parece ser el método más aceptado de descontaminar superficies. La
(20.000-40.000 dólares).
descontaminación de los mostradores, equipos de laboratorio y muebles debe
llevarse a cabo enjuagándolos con una solución fresca de lejía al 10% y des-
pués con una solución de etanol al 75%, o incluso con agua para diluir la lejía PERSONAL DE LABORATORIO
que podría corroer las superficies. Todas las puntas de pipeta deben contener
un filtro hidrófobo para evitar cualquier contaminación de la punta de la pipe-
Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnostico molecular se clasi-
ta con las plantillas o con el material amplificado. La evaluación de la hidrofo-
fican como laboratorios de pruebas de alta complejidad según la enmienda de
bicidad puede conseguirse haciendo que la pipeta aspire por encima de su
límite superior una solución coloreada, para determinar entonces si la punta
de la pipeta se ha teñido. Las puntas de pipeta deben desecharse en bolsas , ,
de plástico sellables, asegurándose de que las bolsas están completamente Tabla 63-1 Necesidades y c o s t e s a p r o x i m a d o s de equipamiento
selladas antes de desecharlas. Los guantes se deben cambiar de forma perió- Descripción Cantidad Coste'
dica o tan pronto como se sospeche cualquier contaminación.
Termociclador de ADN 2 17 000$
Otro método de prevenir la contaminación por amplicones es tratarlos quí- Campanas de flujo laminar 2 8 000$
micamente de manera que no sean capaces de soportar amplificación inclu- Refrigerador/congelador 2 1.600$
so si se transfieren de forma accidental a otra muestra. La contaminación por Congelador sin escarcha manual de 20"C 2 900$
amplicones se identifica por la presencia de señal positiva en un control nega- Congelador a 70"C ' 7000$
tivo. El amplicón se puede destruir por vanos métodos. El método más utili- Microcentrifuga de cabeza angular. 14 OOO rpm 2 3.200$
zado es por el uso de irradiación UV. El tratamiento con UV del ADN induce Microcentrifuga horizontal. 14.000 rpm 1 2.500$
el entrecruzamiento de las dos cadenas por formación de dimeros de timidi- j Placa lavadora de micropocillos • 6.500$
na. Este ADN entrecruzado ya no sirve como una plantilla eficaz. Una desven- Lector de placa de micropocillos 1 7.500$
taja del tratamiento con UV es que es más eficaz cuando el amplicón es de Balanzas electrónicas :> 2.000$
Medidor de pH :> 1.000$
más de 700 nucleótidos de largo, y muchas pruebas comerciales utilizan am-
Agitador/calentador de placas 2 500$
plicones de tamaño más pequeño. Otro método para inaclivar o esterilizar
! Baño de agua I 2.000$
amplicones es por medio de la incorporación de trifosfato de desoxiuridina en
Alimentador de electioloresis 3 2.000$
vez de trifosfato de desoxitimidina en el amplicón durante la amplificación j Apáralos de electroforesis mmi-PAGE 8 3.200$
(Udaykumar, 1993). En este método se incorpora al amplicón trifosfato de Torres de moldeado de geles mini-PAGE 2 990$
desoxiuridina en vez de timidina. Después de la amplificación, si este ampli- Sistema de fotodocumentación i 9 000$
cón que contiene uracilo se transfiere accidentalmente a otra muestra, el tra- Aparatos de electroforesis en gel de agarosa 4 1.600$
tamiento de la muestra antes de la amplificación con uracil-rV-glucosilasa Procesador automático de placas radiográficas i 3.800$
(UNG) dará lugar a la destrucción del amplicón que contiene uracilo. El ampli- l Placas para aulorradiogratia (17 x 14 pulgadas) 4 1.600$
cón que contiene uracilo es un sustrato para el UNG, mientras que el ADN | Placas de autorradiografia (8x10 pulgadas) 4 800$
nativo que contiene timidina no lo es. El UNG elimina los residuos de uracilo | Micropipetas normalizadas (tres tamaños) 18 3.780$
del amplicón mientras que inicialmente deja intacta la estructura de fosfo- Sistema do verificación de temperatura
diésler del amplicón. Sin embargo, durante el primer paso de desnaturaliza- para el termociclador 1 1.400$
ción del método de amplificación, las uniones foslodiésler se rompen en los Estación de trabajo de PCR 1 1.500$
Mezcladores por agitación 3 750$
puntos donde se localizaron los residuos de uracilo. El amplicón fragmentado
Sistema de pipetas neumáticas 4 800$
ya no es por tanto capaz de actual como plantilla. El uso de UTP y de UNG
ha demostrado ser eficaz si el amplicón que contiene uracilo no supera las
Contador radiactivo 1 2.500$
7
Espectrofotómetro UV i 8.000$
10M0 copias por reacción (Espy. 1993). También se han utilizado los isop- Contador Geiger 1 485$
soralenos con cierto éxito. Después de la amplificación, la exposición a la luz Aparato secuenciador de ADN 2 1 600$
UV de onda larga produce uniones entre los isopsoralenos y la citosina que Alimentador para el secuenciador de ADN 1 2 000$
existe en el material amplificado, haciendo ineficaz al amplicón como plantilla Hornos de hibridación 2 4 000$
para la amplificación (Jinno, 1990). Computadoras y programas • IA 10000$
Centrifuga refrigerada de sobremesa 1 6 000$
La transferencia de papel entre los laboratorios y la parte administrativa Incubadora i 1 000$
constituye una preocupación. Esto debe reducirse tanto como sea posible, en Baño de agua en seco 4 800$
especial para el papel de trabajo utilizado en el laboratorio de postamplifica- Microcentrifuga refrigerada 1 2800$
ción. Es muy recomendable la instalación de una red de ordenadores en el TOTAL 128.105S
laboratorio con un cierto número de terminales en los diterentes laboratorios
|^ "Los precios son sólo aproximados
y en las áreas administrativas para reducir o eliminar el movimiento de pape-
 1336 SECCIÓN V I I • PATOLOGÌA MOLECULAR
mejora de laboratorios clínicos de 1998 (CLIA'88) (Bachner. 1988: CLIA'88.1992).
Esta ley impone unos requerimientos específicos de educación y entrena-
miento para el personal que trabaja en estos laboratorios. Además, es impor-
tante tener en mente que estas pruebas no sólo son más complejas que las
pruebas habituales de laboratorio, sino que también algunas de ellas se han
desarrollado dentro de los mismos. Es más. eslas pruebas se modifican cons-
tantemente para mejorar factores como la especificidad, la sensibilidad, el
tiempo de realización y el flujo de trabajo como resultado de la introducción
de nuevas tecnologías.
Director del laboratorio
Según CLIA'88. los directores de laboratorio de laboratorios de pruebas de
alta complejidad deben ser bien un MD o un DO con experiencia en patología
clínica o anatómica, un MD o DO con dos años de experiencia en dirección o
supervisión de un laboratorio de pruebas de alta complejidad, o bien disponer
de un grado doctoral en alguna de las ciencias biológicas y tener dos años de
experiencia supervisando un laboratorio de alta complejidad.
Las responsabilidades del director de laboratorio son la selección de prue-
bas, su implementación y la resolución de dificultades técnicas. El director de
laboratorio es también el responsable del desarrollo de programas de labora-
torio para la validación clínica y analítica de las nuevas pruebas moleculares
y el desarrollo de guías y métodos de acción que aseguren la realización fia-
ble de las pruebas clínicas. Además, el director de laboratorio debe ser res-
ponsable del desarrollo, implementación y revisión del control de calidad y de
los programas de calidad del laboratorio.
Supervisor técnico
Según CLIA'88. un supervisor técnico debe cumplir uno de los siguientes
criterios para calificarse para este puesto. El individuo debe poseer bien un
MD o DO con un año de experiencia en un laboratorio de pruebas de alta
complejidad, un grado de maestro con dos años de experiencia o un grado
intermedio con cuatro años de experiencia.
Técnicos médicos y
técnicos en biología molecular
Los técnicos médicos y técnicos en biología molecular son los responsa-
bles de las tareas necesarias para las operaciones diarias de la agenda de
pruebas de laboratorio. Son los individuos responsables del acceso y proce-
sado de los especímenes, de llevar a cabo diariamente las pruebas, mante-
ner los registros adecuados de pruebas y control de calidad, adherirse a los
procedimientos escritos y a las políticas de control de calidad, identificar pro-
blemas y documentar el mantenimiento de los equipos. El mantenimiento de
registros de los métodos de laboratorio está complicado por el hecho de que
los métodos desarrollados en el propio laboratorio se modifican constante-
mente para mejorar el proceso de las pruebas. Además, algunos instrumen-
tos de laboratorio se usan solamente para las pruebas de diagnóstico mole-
cular y existe poca experiencia del laboratorio clínico con ellas. Debido a
estos factores, es importante que el personal técnico, y en particular el per-
sonal técnico superior, tenga un alto sentido de entrega profesional y que
muestre un constante interés y esfuerzo en mejorar su educación y adiestra-
miento Es también importante que adquieran todas las habilidades avanza-
das de laboratorio que sea posible y que reciban un adiestramiento cruzado
en la mayoría o todas las diferentes pruebas que se usen en el laboratorio. Es
crucial para el personal técnico comprender plenamente las bases científicas
de la metodología y las aplicaciones e implicaciones clínicas de las diferentes
pruebas moleculares.
Residentes, becarios y estudiantes graduados
La captación de residentes, becarios y estudiantes de últimos años puede
contribuir de forma significativa al éxito de un laboratorio de diagnóstico
molecular. El valor de estos individuos proviene de su alto nivel de entrega
profesional y de su visión acerca de la utilidad clínica de las pruebas indivi-
duales. Si tales individuos disponen de tiempo para trabajar en el laboratorio
de diagnóstico molecular, con frecuencia son capaces de desarrollar y vali-
dar rápidamente un nuevo método de diagnóstico molecular. A cambio, estos
individuos ganan experiencia en un área de la medicina de laboratorio de
rápido crecimiento, y esto les puede proporcionar una ventaja cuando bus-
quen empleo en el futuro. Como parte de su adiestramiento en diagnóstico
molecular, es importante para los residentes, becarios y estudiantes ganar
experiencia en cada una de las diferentes áreas de pruebas, incluyendo las
enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas y cáncer. El adiestra-
miento debe incluir los principios básicos de biología molecular: experiencia
manual en optimizar, validar y llevar a cabo pruebas de diagnóstico molecu-
lar, en interpretación de resultados de las pruebas y en preparación de infor-
mes para su revisión. Los directores de laboratorio deben familiarizar a aque-
llos que se están adiestrando con los diferentes temas de tratamientos del
laboratorio.
Adiestramiento y acreditación
La certificación del nivel doctoral del personal que trabaja en los laborato-
rios de diagnóstico molecular puede seguir varias rutas diferentes depen-
diendo del tipo de grado doctoral, así como de otra experiencia en el adies-
tramiento. Una vía abierta a los individuos que tienen bien un grado de
licenciatura o que ya son doctores lo proporciona el Consejo Americano de
Genética Médica (ABMG), que está destinado a individuos que proporcionan
servicios en genética médica. El Consejo Americano de Genética Médica es
un miembro del consejo americano de especialidades médicas, que es la orga-
nización "madre" de estas sociedades y que proporciona certificados en pato-
logia, pediatría, medicina interna, cirugía y aproximadamente otras 20 espe-
cialidades médicas. La certificación en genética consiste en un examen
general seguido de un examen de subespecialidad en genética clínica, gené-
tica médica, citogenética clínica, genética clínica bioquímica o genética clíni-
ca molecular. Para ser candidato a un certificado por el ABMG. un individuo
debe cumplir los criterios en el área de la certificación deseada. Para la certi-
ficación en genética clínica molecular, el candidato debe poseer un grado doc-
toral adecuado y haber completado dos años de adiestramiento en un progra-
ma acreditado. El candidato debe presentar un libro de trabajo de 150 casos
clínicos moleculares, haber completado una prueba en genética clínica mole-
cular y tener una lisia de competencia en varios métodos firmada por el direc-
tor del laboratorio en donde se ha invertido la milad del tiempo del adiestra-
miento. El examen se ofrece cada tres años
Recientemente, el Consejo Americano de Especialidades Médicas aprobó la
solicitud de la Sociedad Americana de Patología y de la Sociedad Amencana
de Genética Médica con respecto a crear un certificado conjunto de su espe-
cialidad en patología genética molecular. Los candidatos para este certificado
deben tener un grado de MD o de DO, haber sido certificados por sus respec-
tivos consejos, tener una licencia en vigor sin restricciones para practicar la
medicina o la osteopatia en EE.UU. y haber completado un año de adiestra-
miento en un programa acreditado. Al día de hoy todavía no hay programas
acreditados, pero se ha anticipado que la primera aprobación de un programa
de adiestramiento tendrá lugar aproximadamente en junio de 2000, con la
aceptación de los primeros candidatos tan pronto como en julio de 2001. Se
espera que el examen de candidatos para el certificado de la subespecialidad
en patología genética molecular tenga lugar en el año 2002. Las normas de
adiestramiento en patología genética molecular están siendo todavía definidas
por las diferentes organizaciones que participan en el certificado.
Además del programa de certificación anterior, el Consejo Americano de
Bioquímica Clínica (ABCC) ha aprobado un programa de certificación en
diagnóstico molecular que será ofrecido por primera vez en junio de 2000.
La ABCC es una corporación independiente, sin ánimo de lucro, que certifi-
ca a profesionales con nivel de doctor en bioquímica clínica y bioquímica
toxicológica. Las normas y regulaciones de la ABCC para certificar en diag-
nóstico molecular se han establecido recientemente. Antes de la admisión
al examen, el solicitante debe tener algún certificado en cualquiera de los
siguientes consejos: ABCC. Sociedad Americana de Microbiología Médica,
Sociedad Americana de Patología, Sociedad Americana de Inmunología de
Laboratorio Médico. Sociedad Americana de Bioanálisis o Sociedad Ameri-
cana de Histocompatibilidad e Inmunogenética. Los solicitantes deben cum-
plir unos requisitos de experiencia y de formación además de proporcionar
tres cartas de recomendación que certifiquen la experiencia profesional del
solicitante, su duración de experiencia en ese campo, y asi sucesivamente.
El examen se realizará dos veces al año.
 CAPÍTULO 63 • ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
El certificado de subespecialidad en diagnóstico molecular está siendo
ofrecido a individuos con nivel no doctoral, incluyendo técnicos médicos y
técnicos de biología molecular a través de la Agencia Nacional de Creden-
ciales para el Personal de Laboratorio (NCA). La NCA es una organización
no lucrativa y no gubernamental que lleva a cabo el certificado del personal
de laboratorio. Los técnicos médicos y los técnicos en biología molecular
quedan certificados como especialistas de laboratorio en biología molecular
[LSp (MB)]. Existen tres vías para llegar al examen de la NCA. En una, los
candidatos deben haber completado un mínimo de experiencia de trabajo de
doce meses en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servi-
cios. Otra vía es haber completado un programa de licenciatura o poslicen-
ciatura en biología molecular patrocinado por una institución o universidad
acreditadas, que incluya seis meses de experiencia de trabajo en un labora-
torio de diagnóstico molecular con todos los servicios. La última vía es ser un
científico de laboratorio clínico certificado o equivalente y completar un pro-
grama de certificación poslicenciatura en biología molecular patrocinado por
una facultad o universidad acreditadas y completar un equivalente de seis
meses de experiencia a tiempo completo en un laboratorio de biología mole-
cular con todos los servicios. Este examen se ofrece dos veces al año en
más de 80 centros a través del país e incluso en centros extranjeros selec-
cionados. Es probablemente deseable que todos los técnicos que trabajen
en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios, en parti-
cular el personal técnico superior, dispongan de acreditación en diagnóstico
molecular.
FORMATOS DE PRUEBAS CLÍNICAS
Existen dos principales formatos de pruebas utilizados en la mayoría de los
laboratorios que realizan pruebas de diagnóstico molecular. Los dos formatos
son las pruebas propias desarrolladas por cada laboratorio, conocidas tam-
bién como ensayos de recela propia, y los basados en reactivos proporcio-
nados en forma de equipo por los fabricantes de sistemas médicos.
Pruebas de desarrollo propio
Las pruebas de desarrollo propio son aquellos análisis que se han des-
arrollado y validado por completo en el laboratorio que las lleva a cabo. Por lo
general, estos análisis utilizan una combinación de reactivos que se compran
por separado de diferentes fabricantes. Cada laboratorio determina las carac-
terísticas de realización del análisis para un estudio clínico y para una pobla-
ción en particular de pacientes. La validación analítica y clínica de la totalidad
del proceso es responsabilidad de cada laboratorio.
Métodos manuales basados en equipos
Con respecto a los métodos manuales basados en equipos, el fabricante
del sistema médico puede proporcionar todos los reactivos necesarios para
llevar a cabo la prueba, o simplemente proporcionar reactivos de calidad con-
trolada para llevar a cabo cualquier paso particular de la prueba. Un ejemplo
del primer grupo es el equipo para controlar la carga viral en pacientes infec-
tados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Estos equipos pro-
porcionan reactivos necesarios para todos los pasos del proceso de la prue-
ba, incluyendo el aislamiento de los ácidos nucleicos, la amplificación y la
detección. Incluyen también información con respecto a la sensibilidad, espe-
cificidad y limites de tolerancia para cada proceso clínico en particular. Estos
equipos pueden estar etiquetados por el fabricante como aprobados por la
Food and Drug Administralion (FDA), como despachados por la FDA, sola-
mente para uso de investigación o para fines científicos. La validación analí-
tica y clínica de estos equipos por los diferentes laboratorios es diferente
dependiendo del etiquetado. Los métodos de validación serán analizados en
una sección posterior.
Un ejemplo de la segunda categoría de métodos basados en equipos son
aquellos disponibles comercialmente para la extracción de ácidos nucleicos,
reactivos de amplificación que comprenden controles y sistemas de detección
para ácidos nucleicos amplificados m vilro. En algunos casos un laboratorio
desarrollará una prueba molecular combinando dos o más equipos de fabri-
cantes iguales o incluso diferentes. La validación analítica y clínica de cada
1337
paso de la totalidad del método es la responsabilidad del laboratorio que ofre-
ce el test y se comenta más adelante en otra sección
Sistemas automatizados basados en equipos
para pruebas moleculares
La disponibilidad de sistemas automatizados para desempeñar pruebas
moleculares va en aumento. Estos instrumentos pueden desempeñar funcio-
nes únicas o múltiples en relación con las pruebas moleculares. El ejemplo
típico de un instrumento automatizado de función única es un termociclador,
que lleva a cabo todos los pasos necesarios para la amplificación de los áci-
dos nucleicos. Otros instrumentos automatizados de función única compren-
den los extractores de ácidos nucleicos, los sistemas automáticos para la
preparación y dosificación de reactivos y los secuenciadores automáticos de
ADN. Más recientemente se han desarrollado también instrumentos automá-
ticos que realizan más de una función. Un sistema automático introducido por
sistemas moleculares Roche es el analizador COBAS Amplicor. Este instru-
mento contiene un termociclador, un brazo robótico cartesiano en tres dimen-
siones, bloques de calentamiento, estaciones de lavado e incluso un lector de
colorimetría. Se ha previsto que en un futuro próximo estén disponibles ins-
trumentos completamente automatizados que incluyan estas tres funciones,
así como la extracción automática de ácidos nucleicos.
SELECCIÓN DE PRUEBAS
El objetivo principal del laboratorio de diagnóstico molecular es proporcio-
nar de forma fiable y en tiempo adecuado resultados de pruebas referentes a
muestras que parecen ser importantes para la atención de los pacientes.
Cuando se considera qué pruebas se deben ofrecer, se deben tener en men-
te algunas consideraciones clave. Es importante que cualquier nueva prueba
mejore de alguna forma el tratamiento de los pacientes, y que esto sea ade-
más eficaz con respecto al coste. Una nueva prueba puede proporcionar un
método más barato o más eficaz para diagnosticar o controlar una enferme-
dad. Es importante que las decisiones referentes a elegir pruebas se basen
no solamente en el coste de realizar la prueba sino también en cómo la nue-
va prueba pueda afectar de forma global a los cuidados y atenciones del
paciente. Hay algunas circunstancias donde las pruebas moleculares puede
que parezcan aumentar el coste del tratamiento de los pacientes añadiendo
una prueba nueva a la batería ya existente de análisis para un proceso clíni-
co particular. Sin embargo, al introducir la nueva prueba, el tratamiento de los
pacientes podría ser más eficaz. Por ejemplo, la introducción de las pruebas
de carga viral para el VIH-1 para controlar la progresión de la enfermedad y
la eficacia del tratamiento farmacológico en individuos infectados por VIH-1
han colaborado de forma significativa al tratamiento de estos pacientes. Un
gran número de pacientes inleclados por el VIH-1 están siendo tratados
actualmente con una combinación de entre dos y cinco fármacos diferentes,
que incluyen inhibidores de las proteasas y fármacos no-nucleosidicos. que
han resultado ser muy eficaces en reducir la morbilidad y la mortalidad en un
gran número de pacientes infectados por VIH-1. Sin embargo, estos fármacos
son muy caros, por lo que es importante tener medios eficaces de controlar
su efectividad si deben proporcionar el máximo beneficio al paciente. Sin
pruebas de carga viral los clínicos deberían basarse en recuentos de CD4 y
en los síntomas clínicos, que pueden ser en ambos casos marcadores poco
sensibles de efectividad farmacológica hasta que uno se encuentra en las últi-
mas fases de la enfermedad por VIH (Ferreira-González, 1995).
El ejemplo anterior muestra el impacto sobre el tratamiento de los pacien-
tes y la introducción de una nueva prueba, pero hay otros ejemplos en los que
la rentabilidad se ve favorecida sustituyendo pruebas ya existentes de labo-
ratorio. Esto puede producirse si la prueba molecular proporciona una mejor
sensibilidad o especificidad, o un tiempo de realización reducido que impacte
directamente sobre el tratamiento del paciente. Por ejemplo, el tratamiento de
pacientes con una posible infección por Mycobacterium tuberculosis necesita
que sean tratados con fármacos que tengan una potencial toxicidad hepática
y que sean aislados hasta que se confirme en el laboratorio el diagnostico de
presunción. La prueba habitual de laboratorio de examinar directamente un
espécimen del paciente buscando la presencia de Mycobacterium tubérculo-
 1338 SECCIÓN V I I • PAIOIOGÍA MOLECULAR
sis carece de sensibilidad pero es extremadamente rápida Por otro lado, el
cultivo es exquisitamente sensible, pero puede tardar hasta seis semanas en
proporcionar resultados. A la vista de este dilema, una prueba molecular que
permita un diagnóstico más rápido con un mayor grado de sensibilidad y
especificidad permitiría interrumpir un tratamiento farmacológico y un aisla-
miento en aquellos pacientes que no tienen la enfermedad, reduciendo así los
costes para el paciente y mejorando la atención médica.
La identificación de las pruebas que se deben ofrecer en un centro médico
es sobre todo la responsabilidad de los directores médico y técnico del labo-
ratorio de diagnóstico molecular. A veces se puede ayudar en este aspecto
revisando la lista de pruebas que el cenlro médico realiza fuera del mismo. En
otros casos, individuos clave como clínicos y patólogos pueden ser una fuen-
te valiosa para identificar las necesidades de un centro médico en particular.
Es importante para los directores de laboratorio identificar claramente un área
donde exista una necesidad percibida de mejorar las herramientas disponi-
bles para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Durante el proceso
de selección de pruebas, se debe llevar a cabo un ajuste real de las capaci-
dades técnicas dentro del laboratorio con las necesidades del mundo clínico
real en cuanto a volumen de las pruebas, tiempo de realización necesario y
costes asociados para llevar a cabo el análisis. Una vez que se ha identifica-
do un análisis en particular, se deben abordar los diferentes sistemas para lle-
var a cabo el análisis. Por ejemplo, se puede utilizar la hibridización de tipo
Southern blot, métodos de amplificación in vitro de ácidos nucleicos o incluso
análisis citogenético o de fluorescencia de hibridación in situ (HISF) para rea-
lizar algunos análisis. Asi. es importante tener en cuenta la condición clínica
y las ventajas e inconvenientes de cada uno de los diferentes sistemas para
diagnosticar un proceso clínico en particular cuando se hace la elección final.
El establecimiento de un periodo de pruebas para evaluar la utilidad clínica de
una prueba en particular es una importante herramienta. Sí se diseña con cui-
dado, este período permitirá al laboratorio trabajar directamente con el usua-
rio final de la prueba y proporcionar una vía para que estos individuos com-
prendan la utilidad clínica de la prueba y sus limitaciones. Es importante
definir con claridad las medidas que se puedan evaluar al final del periodo del
estudio clínico y que dará lugar en última instancia a la realización o exclusión
de la prueba.
Codificación CPT e ICD-9
La facturación de las pruebas de diagnóstico molecular siguen el mismo
procedimiento que cualquier otra prueba de laboratorio. Por lo general, se
necesitan un código de terminología de procedimiento de facturación (CPT) y
un código diagnóstico de la clasificación internacional de enfermedades (ICD-
9). Más allá de esto, el procedimiento es por lo general específico de cada
centro, basándose en los métodos de facturación manual e informatizada que
tengan lugar en la institución. Es importante determinar por anticipado la
documentación necesaria y los accesos informáticos imprescindibles para ge-
Tabla 63-2 Facturación de diagnóstico molecular
Nombre de la prueba Código CPT Número de veces que se factura el código CPT
Factor V Leiden por 83890
PCR-RFLP
83898
83892
83894
83912
t(9:22) por RT-PCR 83890
83902
83898
83894
83912
VIH-1 carga viral 87536
CMV carga viral 87497
VHC carga viral 87522
nerar una factura. Hasta hace poco sólo existía un nUmero limitado de códi-
gos CPT para las pruebas de diagnóstico molecular. Los códigos originales
identificaban métodos generales que comprendían partes de un estudio mole-
cular, como la extracción de ácidos nucleicos, la digestión enzimática, la
amplificación in vitro, y así sucesivamente. Más recientemente, se ha añadi-
do un número de nuevos códigos CPT especilicos de prueba". Sesenta de
estos nuevos códigos son códigos específicos de reactivos utilizados para las
pruebas moleculares microbiólogos. Los códigos específicos de análisis,
como el que se utiliza para la detección del VIH mediante PCR, están dise-
ñados para incorporar todos los pasos, procedimientos y reactivos utilizados
en el análisis. También hay diferentes códigos CPT para la detección del mis-
mo microorganismo utilizando diferentes métodos. Por ejemplo, la delección
mediante una técnica de sonda directa frente a la detección mediante ampli-
ficación in vitro o la cuantificación del organismo necesitan cada uno un códi-
go CPT dilerente. Para las pruebas moleculares sin un código CPT específi-
co del análisis sigue siendo necesario utilizar una combinación de códigos
generales CPT de procedimiento. En la Tabla 63-2 se listan ejemplos de cómo
se pueden facturar pruebas con códigos CPT especilicos del análisis y prue-
bas que todavía necesitan una combinación de códigos generales CPT de
procedimiento.
Los niveles de reembolso para cualquier prueba individual están estableci-
dos por los terceros pagadores y pueden tener poca relación con el coste real
de llevar a cabo la prueba. En general, los terceros pagadores tienden a esta-
blecer niveles de reembolso de acuerdo con las tarifas establecidas por Medi-
care y por Medicaid. Para la facturación de estas pruebas no se necesita la
aprobación de la FDA Recientemente, la FDA ha ordenado que para las prue-
bas no aprobadas por la FDA, donde se utilizan reactivos específicos del aná-
lisis, y que incluyen esencialmente todas las pruebas moleculares, se debe
añadir al informe una nota que indique que la prueba se desarrolló, que sus
características de capacidad se han determinado en el laboratorio y que esta
prueba no ha sido ni prohibida ni aprobada por la FDA. Algunos terceros
pagadores pueden negarse al reembolso de las pruebas que llevan una nota
de este estilo, dado que creen que el coste de llevar a cabo tales pruebas
debe ser soportado mediante ayudas de investigación, incluso aunque las
características y la utilidad clínica de la prueba hayan sido validadas por el
laboratorio.
Patentes
La inmensa mayoría de los sistemas de amplilicación in vitro son procesos
patentados, y se debe obtener una licencia formal para el uso de estos pro-
cedimientos, o el laboratorio que los use será susceptible de ser perseguido
por inlracción de patente. De forma tradicional, la licencia se obtiene para un
procedimiento en particular adquiriendo un conjunto de reactivos, aprobado
por la FDA y vendido por un fabricante que tiene la patente del proceso de
amplificación. Este abordaje es muy limitado para las pruebas de diagnóstico
Nombre o procedimiento de la prueba
1 Aislamiento de ácidos nucleicos
Amplilicación con sonda
I Digestión enzimática
- Electroloresis en gel
• Interpretación e informe
1 Aislamiento de ácidos nucleicos
2 Transcripción inversa
2 Amplificación con sonda
1 t Electroforesis en gel
1 Interpretación e informe
1 VIH cuantitativo
1 CMV cuantitativo
• VHC cuantitativo
 CAPÍTULO 63 • ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
molecular, dado que existe un número muy limitado de pruebas que hayan
sido aprobadas por la FDA. Asi. un laboratorio que utilice un proceso particu-
lar patentado para pruebas clínicas debe primero negociar una licencia con el
propietario de la patente. Es muy importante darse cuenta de que. depen-
diendo de la complepdad de la institución que busca el acuerdo y de la com-
plejidad del propio acuerdo, este proceso puede tardar entre tres meses y un
año para obtener una licencia que permita llevar a cabo y facturar el procedi-
miento con fines clínicos.
Se deben tener unas consideraciones prácticamente idénticas con respec-
to al uso de información de secuencias necesarias para diseñar un estudio
molecular. El uso para fines clínicos de información de secuencias para
muchos genes de nuevo descubrimiento está frecuentemente patentado por
los descubridores del gen, y el uso de la información de la secuencia sin una
licencia incurre en las mismas responsabilidades de infracción de patentes.
Por desgracia, dado el actual medio y la diversidad de las fuentes de infor-
mación de secuencias, no está siempre claro si la secuencia se ha patentado
o quién es el propietario de la patente. Es recomendable, antes de llevar a
cabo desarrollos de cualquier prueba basada en secuencias publicadas y
donde se está pensando destinar una gran cantidad de recursos, verificar con
los investigadores que primero descubrieron la secuencia el estado real de las
patentes.
VALIDACIÓN ANALÍTICA Y
CLÍNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES
La implementación de una nueva prueba clínica necesita que sea validada
tanto analítica como clínicamente. Durante la validación analítica se determi-
nan la sensibilidad analítica, la especificidad, la precisión y. para los estudios
cuantitativos, la linealidad del método. La sensibilidad analítica de la prueba
es una medida del limite inferior de detección del método en el sustrato dia-
na. La especificidad analítica mide el grado en el que la prueba reacciona de
forma cruzada con ácidos nucleicos que no son la secuencia diana pretendi-
da. La validación clínica se centra en determinar la utilidad clínica de una
prueba positiva o negativa en una enfermedad especifica. Es importante
cuando se lleva a cabo la validación clínica examinar una muestra transver-
sal completa de los individuos que serán parte de la población en la que se
va a utilizar la prueba.
La CLIA'88 define importantes diferencias entre la implementación de una
prueba aprobada por la FDA y una que no lo esté. Los laboratorios que imple-
mentan una prueba aprobada por la FDA sólo necesitan verificar las caracte-
rísticas de capacidad de la prueba para las indicaciones en poblaciones pare-
cidas a aquellas para las que ha establecido el fabricante. Por otro lado, la
implementación de pruebas desarrolladas en el laboratorio necesitan una
extensa documentación de la capacidad de la prueba, además de los perti-
nentes programas de control de calidad, para asegurar la capacidad diaria de
la prueba (Ferreira-González, 1997).
El primer paso para introducir un análisis molecular propio es optimizar cada
paso del proceso analítico, lo cual incluye la extracción de ácidos nucleicos,
amplificación, detección, cálculos e interpretación de resultados. Cuando se
optimizan por separado cada una de las fases, es importante darse cuenta de
que en la mayoría de los casos será necesario volver a optimizar cuando todas
las lases se realizan de forma conjunta. Después de optimizar el análisis, es
importante valorar el impacto sobre las características de los resultados del
método de las diferentes variables preanalíticas. como la clase de espécimen,
el transporte, el manejo y la conservación de la muestra y las sustancias que
interfieren, como lipidos, hemoglobina, bilirrubina y así sucesivamente.
Después de la optimización, los laboratorios deben llevar a cabo una vali-
dación analítica del método. Esto puede ser difícil debido a la falta de nor-
malización, paulas y materiales normalizados de referencia para un gran
número de ácidos nucleicos diana. Esto impacta de lorma negativa sobre la
capacidad de un laboratorio para determinar la sensibilidad y precisión del
método. Diferentes organizaciones nacionales e internacionales están dan-
do pasos para desarrollar estándares, pautas y materiales normalizados de
referencia. Diferentes sociedades profesionales, agencias federales y orga-
nizaciones sin ánimo de lucro han desarrollado pautas y normativas para los
diagnósticos moleculares (Tabla 63-3). Con respecto a los materiales norma-
133?
lizados de referencia, el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST)
ha desarrollado uno de los primeros materiales normalizados de referencia
de ácidos nucleicos para las pruebas de identidad humana Más reciente-
mente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) introdujo un material nor-
malizado de referencia para la hepatitis C para la validación de pruebas de
ácidos nucleicos (NAT) para el estudio de sangre y productos sanguíneos.
Están disponibles en el comercio paneles de referencia calibrados con res-
pecto al material de referencia normalizado de la OMS (Boston Biomedica
Inc, Boston, MA). Además, se ha hecho un esfuerzo para desarrollar reacti-
vos de referencia para el VIH-1 tanto por la FDA como por otras diferentes
compañías.
En ausencia de materiales normalizados de referencia, los laboratorios
deben desarrollar su propio material de referencia para sus estudios de valo-
ración analítica y para la posterior vigilancia de los resultados de la prueba.
La creación de un material de referencia propio comprende el uso de méto-
dos establecidos de forma independiente para determinar la concentración de
ácidos nucleicos diana. De forma alternativa, los laboratorios pueden llevar a
cabo estudios que comparen sus resultados con otros métodos ya estableci-
dos. Por ejemplo, las muestras se pueden dividir para un estudio de compa-
ración con otro laboratorio que lleve a cabo una prueba molecular parecida.
Las muestras utilizadas para la validación analítica pueden ser de disposición
propia o puede ser necesario obtenerlas de una fuente externa, como de un
laboratorio colaborador, una agencia gubernamental (centros para el control y
prevención de enfermedades [CDC], FDA o el Instituto Nacional de la Salud
[NIH]) o incluso de un suministrador comercial.
Una vez que se ha organizado un grupo adecuado de muestras, la valida-
ción analítica sigue las normas habituales utilizadas en otra clase de pruebas.
La determinación de la sensibilidad y linealidad analítica se puede abordar lle-
vando a cabo diluciones seriadas de muestras positivas para la diana que han
sido estudiadas ya mediante otro método, o analizando especímenes diana-
negativos a los que se han añadido ácidos nucleicos diana purificados, micro-
organismos u otras células. La precisión de la prueba se valora haciendo
determinaciones en un número de muestras de pacientes muchas veces en
el mismo lote o en diferentes lotes a lo largo de varios días. Las muestras uti-
lizadas para los estudios de precisión deberían abarcar el rango lineal diná-
mico de la prueba. Al igual que la precisión, la validación de la linealidad pue-
de llevarse a cabo utilizando diluciones seriadas de un espécimen positivo en
un espécimen negativo. La valoración de variables preanalíticas. como lipi-
dos. hemoglobina, bilirrubina. fármacos terapéuticos y anticoagulantes pre-
sentes en el espécimen, puede realizarse añadiendo estas sustancias a
especímenes negativos a los que se ha añadido una cantidad conocida de
microorganismos, células o "diana" purificada (Lion. 1996).
La validación clínica requiere la determinación de dos probabilidades: la pri-
mera, la probabilidad de que si la muestra procede de un paciente con la
enfermedad la prueba sea positiva (sensibilidad clínica); y segundo, la proba-
bilidad de que si la muestra proviene de un paciente que no tiene la enferme-
dad la prueba sea negativa (especificidad clínica). La evaluación de la sensi-
bilidad clínica necesita pruebas de una cantidad adecuada de muestras de
pacientes que hayan sido diagnosticados de la enlermedad La especificidad
clínica se determina analizando muestras de pacientes diagnosticados con
una enfermedad diferente que pudiera confundirse con la enlermedad indica-
da y que aparezca en el diagnóstico diferencial. Basándose de forma conjun-
ta en la especificidad y sensibilidad clínica de la prueba, junto con el conoci-
miento de la prevalencia de la enfermedad, se pueden calcular los valores
predictivos positivos y negativos de la prueba y evaluar la probable utilidad
clínica del análisis.
Desde el punto de vista práctico, la mayoría de los estudios de validación
clínica son llevados a cabo comparando la sensibilidad y especificidad clínica
del nuevo método frente a un grupo de muestras procedentes de la población
objetivo que han sido estudiados mediante un "estándar oro" con respecto al
sustrato analítico en cuestión. En algunos casos, las pruebas moleculares
han parecido ser más sensibles y/o específicas que las actuales pruebas
"estándar oro". La resolución de discrepancias entre la nueva prueba y la que
se usa actualmente como método "estándar oro" puede en un cierto número
de casos dar lugar a dilemas que necesitan la utilización de un método mole-
cular diferente para resolver las discrepancias. Recientemente, la Association
lor Molecular Pathology publicó un programa detallado de implementación
 1340 SECCIÓN VII PATOLOGÍA MOLECULAR

Tabla 63-3 Guías y estándares de las pruebas de diagnóstico molecular

Organización N o r m a s o estándares Dirección

NCCLS MM1-P Meiodos de diagnóstico molecular para enfermedades genéticas NCCLS 940
M M 2 - A Análisis de redisposiciún de genes de mmunoglobulinas y West Valley Rd.
receptores de células T Suile 1400
M M 3 - A Métodos de diagnóstico molecular para enfermedades infecciosas Wayne. PA
M M - 5 Análisis de amplificación de ácidos nucleicos para hematología 19087-1898
molecular Wayne. PA
M M - 6 Diagnóstico molecular cuantitativo para enfermedades infecciosas www nccls.org
M M - 7 Hibrídización in situ fluorescente para genética médica
M M - 8 Medida e interpretación de repeticiones de trinucleOtidos

ACMG Política de normas de estándares y pautas para los laboratorios de

genética clínica ABMG/ABGC/ACMG.
Hibridización in situ fluorescente de mterfaz prenatal Administrative office.
Declaración de la ACMG sobre detección de marcadores múltiples en 9650 Rockville Pike.
mujeres de 35 años y mayores Bethesda. MD
Síndrome de X frágil: pruebas de diagnóstico y portadores 20814-3998
Normas de almacenamiento y uso de materiales genéticos
Normas sobre detección de marcadores múltiples en mujeres gestantes
Normas sobre el uso de pruebas de apolipoproteína E para la enfermedad
de Alzheimer Puntos a considerar: éticos, legales e implicaciones
psicosociales de las pruebas genéticas en niños y adolescentes
Pruebas diagnósticas para los síndromes de Angelman y de Prader-Willi
Declaración sobre detección poblacional para la mutación BRCA-1 en
muieres judias ashkenazi
Principios de detección: comunicado del subcomité sobre la detección del
comilé de practica clínica de la Sociedad Americana de Genética Médica
Comunicado sobre pruebas en portadores de la enfermedad de Canavan
Declaración sobre pruebas genéticas para la fibrosis quistica

ASHI Normas para la histocompatibilidad molecular y pruebas ¡nmunogenéticas ASHI PO Box 15804
Lenexa. KS
66285-5804

NIII-DOI Grupo de trabajo de pruebas genéticas que promueve unas pruebas www nhgri.nih.gov/ELSI/TFGT-linal
genéticas seguras y efectivas en Estados Unidos: comunicado final
del grupo de trabajo sobre pruebas genéticas

FDA Días para la industria sobre la manufactura y valoración clinica de pruebas

m vitro para detectar in vitro secuencias de acido nucleico del VIH-1 www.fda.gov/cber/gdlns/nashivpdf
Borrador de la gula para la industria y/o personal inspector de la FDA.
normas previas a la comercialización para análisis en relación con www.fda.gov/cdrh/ode/1353pdl
el virus de la hepatitis C (VHC) que están indicadas para el diagnóstico
o monitorización de la infección por VHC o enfermedades asociadas:
borrador de guias

AMP Recomendaciones para desarrollo y operatividad doméstica de pruebas

de diagnóstico molecular Am J Clin Pathol
1999. 111 449
Technical Working Group Guías para un control de mantenimiento de calidad para el Crime laboratory Digest 1991; 18 44
on DNA Analysis Methods análisis de ADN

para la introducción de la nueva prueba molecular (recomendaciones de 1999
de la AMP). La Tabla 63-4 proporciona una lista de tareas para llevar a cabo
el proceso de pruebas clínicas.
Reactivos específicos del sustrato
El término reactivo analítico del sustrato (ASR) fue desarrollado por la
FDA para referirse a los reactivos utilizados en las pruebas clínicas que
confieren especificidad para detectar el sustrato objetivo. La FDA define los
ASR como "anticuerpos, monoclonales y policlonales. receptores especili-
cos. proteínas, lígandos. secuencias de ácidos nucleicos y reactivos simila-
res que por medio de unión especifica o reacción química con sustancias
de un espécimen están diseñados para su uso en una aplicación diagnós-
tica para la identificación y cuantificación de una sustancia química indivi-
dual o ligando en especímenes biológicos". Las sondas y cebadores utili-
zados para detectar ADN o ARN objetivos se consideran ASR. A fecha de
noviembre de 1998, los laboratorios clínicos que utilizan métodos de tec-
nología propia que contienen ASR deben cumplir la normativa final de la
FDA acerca de ASR publicados en el Registro Federal. Como parte de esta
norma final, los laboratorios son requeridos para incluir una advertencia
específica en sus informes afirmando que "Esta prueba ha sido desarrolla-
da y sus características de capacidad determinadas por (nombre del labo-
ratorio). No ha sido aprobada por la administración de fármacos y alimen-
tos de Estados Unidos". Pero, al mismo tiempo, la FDA ha permitido a los
laboratorios que añadan a esta coletilla que la prueba que utiliza ASR no
precisa la aprobación de la FDA, que la prueba se utiliza con fines clínicos
y que el laboratorio ha sido certificado por la CLIA'88 para llevar a cabo
pruebas de alta complejidad.
Además de la definición de los ASR, la FDA ha propuesto un coniunto de
controles y restricciones que deben aplicarse a su uso para asegurar su
calidad y uniformidad, y para aclarar que los laboratorios que desarrollan
ensayos propios son los responsables de vigilar las capacidades de la prue-
 CAPITULO 63 • ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
ba. De forma interesante, estos controles se aplican tanto a los laboratorios
que desarrollan ensayos propios que utilizan ASR como a los fabricantes de
los reactivos para estos ensayos. Se solicita a los laboratorios que cumplan
Tabla 63-4 Llevando a c a b o el proceso d e p r u e b a s clínicas
Actividad Consideraciones
Preparación Trabajar en el ambiente más limpio
de los reactivos Almacenar las soluciones de trabajo
en alícuotas de un solo uso.
Realizar control de calidad en cada
nuevo grupo de reactivos antes de
su uso en pruebas clínicas Utilizar
una muestra con un bajo número de
copias para valorar la sensibilidad
4. Preparación de las mezclas patrón
para reducir errores y variabilidad.
Recogida I Establecer unos limites de tolerancia
aceptables para cada tipo de
de especímenes
espécimen que se deba analizar
(temperatura de almacenamiento,
tiempo de transporte,
anticoagulanles, etc.)
2. Distribuir protocolos para un
adecuado manejo de las muestras
a todos los usuarios potenciales.
3. Recoger información clínica y
analítica en formularios
Procesado 1. Los especímenes deben ser
de los especímenes recibidos y almacenados en el
laboratorio de preamplificación
(limpio).
2. Desarrollar pautas para asegurarse
contra la mezcla de muestras y
para mantener la integridad de la
secuencia objetivo
Análisis del espécimen
a Método 1. Valorar los métodos de extracción
de extracción buscando la presencia de
inhibidores y tactores que
disminuyen el rendimiento del
objetivo
Control interno añadido a la muestra
en el momento de la extracción
para buscar falsos negativos
debidos a inhibidores o determinar
esta tasa por algún otro método Si
no se va a evaluar un control
interno con cada muestra de un
paciente, entonces la tasa de
falsos negativos deberia figurar en
el informe en una nota, en caso de
que el resultado sea negativo.
b Organización Optimizar las concentraciones de
del mCtodo, cebadores MgCl.., dNTP; volumen;
amplificación condiciones del ciclado y del
sistema de detección.
y detección
2. Desarrollar pautas para reducir al
minimo la posibilidad de
contaminación por el ácido nucleico
plantilla o el amplicón (véanse
secciones del control de calidad)
Los controles deben procesarse de
la misma forma que las muestras
de los pacientes
Desarrollar pautas para organizar el
análisis y evitar la contaminación
cruzada de la muestra y los
controles.
Desarrollar guias para la
Interpretación e informe 1
interpretación y los informes
2. La interpretación debo ser realizada
por lo menos por dos individuos y
de forma independiente.
Desarrollar pautas para la distribución
de los informes.
1341
los requisitos de certificación de alta complejidad de la CLIA'88 y que deter-
minen las características de los métodos propios siguiendo las regulaciones
de CLIA'88 Los fabricantes de ASR son requeridos para registrarse ante la
FDA, para seguir las normas de buena manufactura y para que restrinjan la
venta de esta clase de reactivo a los laboratorios certificados bajo la
CLIA'88 para pruebas de alta complejidad. Además, los fabricantes son res-
ponsables de comunicar a la FDA cualquier efecto adverso debido a fallos
en el proceso de manufactura.
Limitaciones especiales en relación con las pruebas
genéticas
Las pruebas genéticas se llevan a cabo para el diagnóstico y/o valorar el
pronóstico de trastornos de expresión fenotípica. para el diagnóstico prena-
tal de enfermedades genéticas, determinación del estado de portador, y para
realizar pruebas predictivas que valoren la probabilidad del futuro desarrollo
del trastorno genético. Cuando se ofrecen pruebas genéticas se debe con-
siderar un cierto número de limitaciones. La primera es que una prueba
pudiera no detectar todas las posibles mutaciones que puedan estar pre-
sentes en un gen en particular que produce una enfermedad. Entre ejemplos
de esto figuran el vasto número de mutaciones que se han identificado en el
gen de la fibrosis quística y los dos genes principales para el cáncer de
mama. Así. una prueba negativa pudiera no asegurar completamente que la
persona examinada no transporta una mutación en un gen en particular. Al
mismo tiempo, una prueba positiva puede comportar diferentes riesgos para
el paciente en relación con diferentes frecuencias de penetración del tras-
torno en los distintos pacientes. Debido a la potencial complejidad con res-
pecto a la interpretación de resultados de pruebas genéticas, es recomen-
dable que un laboratorio que considere ofertar pruebas genéticas coordine
estrechamente el desarrollo y la oferta de la prueba con el personal profe-
sional clínico que utilizará los resultados de las pruebas para el cuidado de
los pacientes.
Una consideración añadida en relación con las pruebas genéticas son los
esfuerzos a niveles tanto estatal como federal para imponer restricciones
especiales en la realización de las pruebas genéticas. Esto ha sido expresa-
do de la manera más frecuente con la proposición de normas que necesiten
un especial consentimiento informado de los pacientes antes de que su mues-
tra pueda utilizarse en cualquier prueba que estudie directamente el ADN del
paciente en busca de mutaciones o polimorfismos genéticos. Es mas. estas
normas propuestas podrían restringir el uso de todas las muestras de cual-
quier tipo para la investigación o para controles de pruebas clínicas a menos
que se haya obtenido un consentimiento informado especifico para tal uso de
lo que quede de las muestras de los pacientes. Esto hace preciso que los
laboratorios que se propongan ofrecer pruebas de consejo genético estudien
los requerimientos reguladores actuales de las autoridades tanto federales
como estatales y de las sociedades profesionales pertinentes.
CONTROL DE CALIDAD
Y SEGURIDAD DE LA CALIDAD
Control de calidad en el proceso de las pruebas
El establecimiento de pruebas de diagnóstico molecular, en particular de los
métodos de amplificación, necesita una especial consideración de cada fase
del proceso, incluyendo la preparación de reactivos, la recogida de muestras,
la separación de las mismas, la realización real del método y la comunica-
ción de los resultados. Un método de laboratorio bien elaborado y correcta-
mente escrito es un factor clave para asegurar que el método es reproduci-
ble. Es una de las ayudas más importantes durante el adiestramiento
práctico del nuevo personal o cuando el método no se lleva a cabo con
mucha frecuencia. El protocolo del método debe escribirse siguiendo guias
especificas del Comité Nacional de Normalización de Laboratorios Clinicos
(NCCLS). como figura en sus guías GP-A2 para escribir un manual de pro-
cedimiento técnico de laboratorio clínico.
Para la interpretación de los resultados es vital una cuidadosa selección de
controles. Se utilizan varios tipos de controles durante la ejecución de un
 1342 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
método para asegurar que un método específico funciona de manera ade-
cuada. La CLIA'88 precisa controles positivos y negativos que deben llevarse
a cabo en cada prueba clínica. El no ser capaz de obtener el resultado correc-
to para cualquiera de los controles invalida la prueba y necesita que se vuel-
van a estudiar todas las muestras. Siempre que ello sea posible, los contro-
les positivos y negativos deberían parecerse al espécimen del paciente. Es
más. un control positivo debería contener la secuencia diana de ácidos nuclei-
cos a una concentración clínicamente relevante en un trasfondo de secuen-
cias negativas de ácidos nucleicos diana. El control negativo debe contener
secuencias de ácidos nucleicos que se espere estén presentes en una mues-
tra negativa. Además de los controles positivos y negativos, en cada análisis
debería incluirse un control "blanco" que contenga todos los componentes de
la mezcla de reacción a excepción de ácidos nucleicos. En circunstancias
donde un resultado negativo influya de forma significativa sobre el diagnósti-
co, se debe incluir un control positivo interno. De otra forma, cuando se obten-
ga un resultado negativo, no estará claro si la ausencia de un amplicón se de-
be a la ausencia de la secuencia diana en la muestra del paciente o si se debe
a la presencia de inhibidores que supriman la reacción de amplificación. Este
control positivo interno puede ser otro gen que siempre esté presente en cada
espécimen de ADN o ARN purificado del huésped. De forma alternativa, po-
dría ser una secuencia incluida dentro de la muestra de lorma específica para
evaluar la inhibición del método. Estos controles positivos internos son muy
útiles para valorar la presencia de ácido nucleico amplíficable. la ausencia de
inhibidores y si las reacciones de detección y amplificación se llevan a cabo
de acuerdo con las normas.
El añadir controles para juzgar la sensibilidad de la reacción también es
importante. Se construyen tres o más diluciones en las que no se pueda
detectar la dilución más baja. Esle control es muy útil para vigilar no sólo la
realización de la prueba a lo largo del tiempo sino también la presencia de
niveles bajos de contaminación del amplicón.
Es importante que los métodos de desarrollo propio implementen un pro-
grama de control de calidad para valorar la potencia, la pureza y la capaci-
dad de cada reactivo crítico utilizado en el proceso del análisis. Cada reac-
tivo critico debe estudiarse antes de ser utilizado para pruebas clínicas. Se
deben establecer límites de tolerancia para cada reaclivo crítico, Siempre
que ello sea posible, se deben establecer los niveles de tolerancia utilizan-
do una medida cuantitativa para evitar una valoración sujetiva de la cali-
dad del reactivo critico.
Control de calidad del equipo de laboratorio
Todo el equipo utilizado en los laboratorios de diagnóstico molecular debe
tener un método escrito de control de calidad que describa para cada parte
del equipo los métodos de mantenimiento con sus registros asi como sus
calibraciones. El método de control de calidad debe estar escrito de acuer-
do con las normas publicadas por la NCCLS. Al igual que con otro equipo
de laboratorio clínico, los límites de tolerancia para juzgar la adecuación de
su funcionamiento y calibración clínica, que se debe utilizar durante las
pruebas clínicas, también deben estar claramente definidos y vigilados de
manera periódica. Cuando las verificaciones de capacidad o calibración
caen fuera de los limites de tolerancia definidos para cualquier equipo en
particular, el instrumento debe quedar inmediatamente fuera de servicio
para reparación. Después de la reparación, el equipo debe ser calibrado
antes de volverlo a utilizar. Como parte del programa del control de calidad
desarrollado en cada laboratorio, todo el equipamiento, revisiones, calibra-
ciones y reparación de cada parte del equipo deben estar documentados y
guardados de acuerdo con la política del laboratorio de retención de docu-
mentos.
Los termocicladores son un elemento crucial en cualquier laboratorio de
diagnóstico molecular que realiza amplificación in vitro. Cualquier cambio en
la capacidad de los termocicladores tiene un impacto directo en la precisión y
sensibilidad del método que se lleva a cabo con ese aparato. Al igual que con
cualquier otro instrumento, el mantenimiento, el control de calidad y el cali-
brado de los termocicladores deben seguir las recomendaciones del fabri-
cante. De forma breve, y como parte de la vigilancia del funcionamiento de los fines de investigación solamente, o que la prueba sea gratuita CLIA'88 pro-
termocicladores, la determinación y documentación del tiempo de ciclado, la
verificación del punto de error y cualquier mensaje de error deberían también
quedar registrados. Los tiempos de ciclado entre diferentes lotes no deberían
diferir en más de un par de minutos. Las fluctuaciones en los tiempos de cicla-
do son un aviso de que el termociclador necesita ser ajustado y restaurado a
su situación original. Además, el funcionamiento de las neveras y calentado-
res junto con la uniformidad del bloque de temperatura también se deben veri-
ficar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La verificación de la
uniformidad del bloque de temperatura se debe llevar a cabo utilizando un
termopar con una sonda térmica.
Otros elementos importantes del equipo que se utiliza en práclicamenle
cualquier fase del análisis son las pipetas. Se debe poner un énfasis especial
en su control de calidad y en su mantenimiento, dado que pueden ser una
importante fuente de error. Todo el resto de equipo debe ser igualmente con-
trolado y mantenido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Siempre que ello sea posible, el calibrado del equipo se debe llevar a cabo
utilizando normas certificadas o materiales de referencia certificados.
Elementos del programa de seguridad de la calidad
Todos los laboratorios de diagnóstico molecular deben desarrollar un pro-
grama de seguridad de la calidad exlenso y por escrito. El objetivo del progra-
ma de seguridad de la calidad es vigilar y valorar, de lorma objetiva y siste-
mática, la calidad y adecuación de los resultados de las pruebas. El programa
de seguridad de calidad (QA) debe tratar cada una de las lacetas del proce-
so de la prueba, desde la fase preanalitica hasta la fase analítica y postana-
lítica del proceso. El programa debe incluir unas políticas y documentación
escritas de la educación y el adiestramiento del personal, educación médica
continuada, pruebas de eficiencia, inspecciones internas y externas, inclu-
yendo la documentación o acciones correctoras de las deficiencias ciladas.
programas de control de calidad para las pruebas clínicas, luncionamiento del
equipo y seguridad.
El programa QA vigila los aspectos de pruebas clínicas que no inciden
directamente en la validación analítica de los resultados de las pruebas y que
no son asi por lo general parte del programa del control de calidad. Algunos
de estos parámetros son el tiempo mensual de rotación, las revisiones men-
suales de los resultados anormales y normales, el desarrollo de criterios de
exclusión de muestras, la revisión del registro de especímenes rechazados y
los indicadores de calidad de las pruebas. Además, y como ya se ha mencio-
nado, el laboratorio debe participar en programas de estudio de eficiencia.
Hay un cierto nUmero de pruebas para las que las diferentes asociaciones
profesionales han desarrollado programas de eficiencia. La Coitege ot Amen-
can Pathologists ofrece diferentes programas independientes y combinados
para el diagnóstico molecular en enfermedades infecciosas, oncología y
genética. El programa de eficiencia en genética se ofrece en colaboración con
la American Cotlege of Medical Genetics. Recientemente, el CDC ha hecho
disponible un programa de evaluación de resultados para Mycobacterium
tuberculosis y para el VIH-1. Para aquellas pruebas en donde no se ofrece un
programa oficial de eficiencia, se recomienda altamente que se establezcan
programas informales de eficiencia por medio del intercambio de muestras
entre los laboratorios que ofrecen los mismos sen/icios.
ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO
Pruebas de laboratorios clínicos
Los laboratorios que realizan pruebas en especímenes humanos con fines
de diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad están sujetos a
las regulaciones federales impuestas por CLIA'88. CLIA'88 establece norma-
tivas diseñadas para mejorar la calidad en los laboratorios y expande la
supervisión federal a prácticamente cualquier laboratorio clínico en EE.UU. Es
importante señalar que los laboratorios que llevan a cabo investigaciones no
están sujetos a la CLIA'88 a menos que el laboratorio de investigación expida
resultados específicos a los individuos analizados, a sus familiares y a los
médicos que los tratan. Esto se aplica incluso si en el informe final hay cole-
tillas que establezcan que los resultados de las pruebas deben utilizarse con
porciona normativas específicas que se aplican a lodas las áreas del proceso
de la prueba, adiestramiento del personal, pruebas de eficiencia, control de
calidad y aseguramiento de la calidad. La legislación y sus regulaciones aso-
 CAPÍTULO 63 • ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
ciadas establecen un sistema de registro, así como sanciones y métodos di-
suasorios para asegurarse de que se mantienen las normativas establecidas
por las normas federales. Las regulaciones para implementar CLIA'88 fueron
desarrolladas por el departamento de salud y servicios humanos (HHS) a tra-
vés del servicio de salud pública. Se ha asignado al CDC la tarea de clasifi-
car la complejidad de varias pruebas para sustratos analíticos y para supervi-
sar la implementación de normativas. Recientemente, esta responsabilidad se
ha transiendo a la FDA. La FDA estaba encargada de revisar y garantizar la
seguridad y eficacia de las pruebas, y la administración de finanzas sanitarias
se destinaba a recoger tasas, expedir permisos, investigar a los laboratorios
e iniciar acciones punitivas cuando era necesario. Bajo CLIA'88. las pruebas
se han dividido como obsoletas, de microscopia, de moderada complejidad y
de alta complejidad. La clasificación de las pruebas en pruebas de compleji-
dad moderada y elevada se desarrolló asignando una puntuación numérica a
cada prueba Una prueba se considera como de complejidad moderada
cuando recibe una puntuación de 13 o menos. Cualquier puntuación superior
se considera como altamente compleja. El sistema de puntuación tiene en
cuenta algunos de los siguientes criterios: conocimientos necesarios para lle-
var a cabo la prueba, adiestramiento y experiencia, disponibilidad de calibra-
ciones, control de calidad, pruebas de eficiencia, características operativas,
grado de interpretación y JUICIO, y asi sucesivamente.
Las pruebas de diagnóstico molecular se consideran pruebas de alta
complejidad y. como tales, los laboratorios que llevan a cabo estas pruebas
deben buscar la acreditación del HHS. El HHS ha otorgado a la College ol
American Pathologisls un nivel adecuado como agencia de refuerzo con res-
pecto a estas normas aceptando el programa de acreditación de la sociedad
como equivalente o más estricto en áreas de control y aseguramiento de cali-
dad que las normativas descritas en CLIA'88. Otras organizaciones, que tam-
bién han recibido un nivel similar, incluyen la comisión sobre acreditación de
laboratorios, la comisión conjunta de acreditación de organizaciones sanita-
rias, la Asociación Americana de Osteopatía, la Asociación Americana de
Bancos de Sangre (AABB) y la Sociedad Americana de Inmunogenética e
Histocompatibilidad. Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnós-
tico molecular buscan en general la acreditación a través del programa de
acreditación CAP o de alguna de las demás organizaciones como un medio
para cumplir las normativas reguladoras ya descritas. El CAP introdujo en
1993 una lista de patología molecular que ha sido puesta anualmente al día
desde entonces. Además, la lista de revisión de patología molecular consti-
tuye un buen recurso cuando se está desarrollando un laboratorio de diag-
nóstico molecular con respecto al desarrollo de control de calidad, progra-
mas de aseguramiento de calidad, requisitos de los especímenes, misión de
informes y temas similares.
Pruebas forenses de identidad humana
y de paternidad
Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de identidad con ADN o estu-
dios forenses con ADN también deben estar acreditados para estos fines.
Un medio de obtener la acreditación es a través de un programa ofrecido por
la Sociedad Americana de Directores de Laboratorios Forenses (ASCLD)
ASCLD ofrece un programa de acreditación de laboratorios criminales. Esta
acreditación es un programa voluntario en el que puede participar cualquier
laboratorio forense que realice análisis con ADN para demostrar que sus pro-
cedimientos, operaciones, personal, métodos, equipo, plan de seguridad físi-
ca y métodos de seguridad cumplen con las normas propuestas por el grupo
técnico de trabajo sobre métodos de análisis de ADN (TWGDAM). El Centro
Nacional de Tecnología en Ciencia Forense (NFSTC) ofrece ayuda a los labo-
ratorios forenses que se están preparando para la acreditación ASCLD/Lab
.además de proporcionar certificados a los laboratorios de ADN que cumplen
con las guias de la TWGDAM. Además, la Asociación Americana de Bancos
de Sangre ha desarrollado pautas para las pruebas de paternidad que utilizan
ADN y ofrece a través de su organización acreditaciones adecuadas. El pro-
grama de acreditación en pruebas de paternidad se basa en normas para rea-
lizar las pruebas de paternidad y cuida de la acreditación y valoración de los
laboratorios que realizan estas pruebas. Hay más de 40 laboratorios acredi-
tados por la AABB para pruebas de paternidad. Esta acreditación ayuda a los
laboratorios a conseguir un control de calidad.
1343
CONCLUSIÓN
Los mayores conocimientos y las mejoras en la tecnología han facilitado
el rápido desarrollo de nuevas pruebas moleculares que ya se han hecho
habituales en la práctica médica (p. ej.. carga viral del VIH-1. pruebas de
ADN para enfermedades genéticas). La secuenciación del genoma huma-
no, que llegó a ser una prioridad nacional con la creación del Proyecto
Genoma Humano de fundación general, se anticipa que estará completa
para el año 2002 ó 2003. Más recientemente, diferentes compañías priva-
das (Ciencias del Genoma Humano, Millenium Pharmaceuticals, Incyte
Pharmaceuticals y Celera Genomics) se han unido a los esfuerzos de se-
cuenciar el genoma humano. Además, la creciente disponibilidad de tecno-
logía fiable de alto nivel, como los secuenciadores automáticos de ADN, la
PCR en tiempo real y los chips de ADN (Kunan. 1999). y asi sucesivamen-
te, debería afectar de forma drástica a las pruebas de diagnóstico molecu-
lar, proporcionando una tecnología más sólida, un menor tiempo de ciclado
y una reducción de los costes. Las ciencias clínicas y básicas se combinan
para identificar nuevos marcadores moleculares que se puedan utilizar para
el diagnóstico de enfermedades infecciosas, genéticas y neoplasias, asi
como para la ciencia forense y la tipificación de tejidos. Analizando cambios
sutiles en los genes y/o la expresión de los mismos cuando una célula se
infecta por un virus o se transforma, es posible ganar una información
importante no solamente para ayudar al diagnóstico sino también para el
pronóstico o incluso vigilar la progresión de la enfermedad. Los actuales
esfuerzos en la estadificación molecular de las neoplasias tanto sólidas
como hematopoyéticas apuntan en esta dirección. Además, el nuevo cam-
po de la farmacogenómica. que busca interpretar la influencia del polimor-
fismo genético sobre la eficacia y/o efectos secundarios de los agentes tera-
péuticos, tendrá un tremendo impacto en la futura atención sanitaria. El
diagnóstico molecular esta todavía en su infancia. El crecimiento y los cam-
bios en este campo serán una característica habitual en las pruebas clíni-
cas y en un futuro previsible.
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 C A P Í T U L O 64

Oncoproteins y detección tumoral precoz

• Matthew R. Pincus, M.D., Ph.D.
• Paul W. Brandt-Rauf, M.D., Ph.D., D.P.H.
• William Koslosky, M.D.
• William Appruzzse, Ph.D.

BIOLOGÍA CELULAR Y MITOGÉNESIS 1344 EVALUACIÓN Y CONCLUSIONES 1351

Marcadores tumorales Eficacia diagnóstica de las oncoproteínas del suero
Orígenes de los tumores malignos
ONCOPROTEÍNAS EN LA DETECCIÓN TUMORAL 1345
Tamaño tumoral y niveles de oncoproteína
Factores de crecimiento
Receptores de factores de crecimiento
Proteínas G BIBLIOGRAFÍA 1353

Oncoproteínas nucleares
Detección de tumores mediante la medición de la proteína p53
Anticuerpos anti-p53 circulantes en la detección tumoral

un proceso de pasos múltiples que comienza en la membrana celular como

BIOLOGÍA CELULAR Y MITOGÉNESIS resultado de la activación de un receptor de factor de crecimiento, que activa
entonces a otras proteínas citosólicas y de membrana y a moléculas segun-
das mensajeras que transducen la "señal" mitogénica hacia el núcleo.
Marcadores tumorales Vías de transducción de señales. Se han podido aclarar algunos
pasos en la "via de transducción de señales" implicados en la transducción de
El control del proceso de la división celular en las células eucarióticas. en la señal iniciada por el factor de crecimiento y que va hasta el núcleo, pero
especial en las formas superiores de vida, es vital para los procesos de proli- muchos otros pasos no están completamente aclarados. Una vía bien esta-
feración y diferenciación celulares. El delicado equilibrio entre estos dos pro- blecida se resume en la Figura 64-1 para la vía señalizadora mitogénica indu-
cesos está regulado por numerosas proteínas que interactúan en la célula cida por el oncogén ras. Esta figura muestra que cuando un receptor de fac-
para asegurarse de que éste se mantiene. Casi todas estas proteínas, mu- tor de crecimiento se activa por su factor de crecimiento, activa a su vez
chas de las cuales son críticas en la regulación del ciclo celular, están codifi- varías proteínas intermediarias (grb-2 y SOS) que activan la importante pro-
cadas por oncogenes. Las mutaciones en los oncogenes pueden resultar en teína G (esto es, la proteína ligadora de GTP) lamada ras-p21. Esta proteina
la producción de proteínas que, o bien se activan de forma permanente para de 21 kDa unida a la membrana, que contiene 189 aminoácidos, se activa
estimular el crecimiento celular y su proliferación (como la proteína p21 codi- cuando la proteína SOS la induce para ligar GTP en lugar de GDP. En su esta-
ficada por el gen ras), o quedan inactivas para inhibir la proliferación celular do activado (unida a GTP) ras-p21 activa directamente a ras (Moodie. 1993:
(como la proteína p53). Ambos sucesos dan lugar a células tumorales malig- Slokoe, 1994), que a su vez inducen una cascada secuencial de proleincina-
nas. El conocimiento no sólo de la existencia de estos oncogenes y de las sas: esto es, MAP cinasa (MEQ) y la cínasa activada por mitógenos (MAP)
oncoproteínas codificadas por ellos, sino también de los mecanismos median- codificada por el gen ERK, como se muestra en la Figura 64-1. La MAP cina-
te los cuales ejercen sus efectos, ha dado lugar a unas nuevas series de aná- sa activa directamente los factores de transcripción nuclear, siendo ios uno de
lisis altamente sensitivos, tanto de los oncogenes mutados como de sus pro- ellos. Esta importante proteína forma un complejo heterodimérico con otro
teínas mutantes codificadas. Los métodos que utilizan la amplificación, como factor de transcripción nuclear, jun. que se activa directamente por la cinasa,
la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para los oncogenes mutados, se ¡un cinasa (jnk). El complejo los-jun. lamado también AP1, se une a las regio-
exponen en otro punto de este texto. En este capítulo veremos cómo la detec- nes específicas del ADN genómico, induciendo la transcripción de proteínas
ción de estas proteínas oncogénicas, u oncoproteínas. que se encuentran en mitogénicas tales como las ciclinas. De forma interesante, la transcripción de
el suero de los pacientes con tumores malignos, permite diagnosticar un estas proteínas se bloquea por la proteína antioncogén p53 (Fig. 64-1), que a
tumor maligno, a menudo en una fase precoz del desarrollo tumoral. Debido su vez induce la transcripción de proteínas antimitóticas tales como baxy waf.
a que el hallazgo de niveles elevados de cualquiera de estas oncoproteínas o que inducen la apoptosis.
formas mutadas de estas proteínas en el suero de un ser humano indica la
En la Figura 64-1 se presentan también otras diferentes proteínas nuclea-
presencia probable de un tumor maligno, nos referiremos en esta capítulo a
res importantes codificadas por oncogenes tales como myc. una proteína de
estas proteínas como marcadores tumorales.
64 kDa que se sobreexpresa en el linfoma de Burkitt. Este oncogén proteíni-
La oncogenesis, el proceso por el que las células normales se convierten co no está directamente en la vía ras de transducción de señal. De forma inte-
en malignas, comprende múltiples pasos, que se pueden clasificar grosso resante, hay líneas celulares que. cuando se transfectan bien con el oncogén
modo como iniciación tumoral y promoción tumoral. La propia mitogénesis es ras o con el oncogén myc. no sufren transformación celular, pero cuando se
 CAPÍTULO 64 • ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ 1345

Figura 64-1. Esquema de algunos de los componentes conocidos de la vía de

transducción de señales ras empezando (arriba, a la izquierda) cuando un fac-
lot de crecimiento se une a su receptor celular. El resto de los acontecimientos
se explican en el texto. Abreviaturas: grb-2 = proteína adaptadora que une a la
vez p2l y la proteina o tactor de intercambio de nucleótidos de guanina. SOS:
proteína ras-p2i. definida en el texto: PLC = fosfolipasa C; DAG = diacil glice-
rol: PKC = proteina cinasa C; IP3 = mositol trifosfato: rat-\ = proteína codifica-
da por el oncogén p74. que funciona como cinasa que fosforila otra cinasa de
peso molecular 43 kDa. lamada MAP-2 cinasa cinasa. MEK. o MAP-KK en la
ligura: MAP-2 kinasa = proteina cinasa activada por mitógenos o proteína cina-
sa-2 asociada a los microtúbulos (MAP-2K en la figura); GAP = proteína acti-
vadora de GTPasa [GAP], que promueve la hidrólisis del GTP a GDP unido a
p2l : myc. tos y ¡un = oncogenes nucleares que codifican proteínas nucleares;
NMP = proteínas de la matriz nuclear

transfectan a la vez con ambos oncogenes. experimentan transformación Bioscience (Houston. TX) y Matritech (Newton. MA) Diferentes estudios utili-
celular. Estos resultados indican que ras y myp pueden ser interdependientes, zan también la técnica de Western Blot o de Inmunoblot. como se ha descrito
y son un excelente ejemplo prototipico de la naturaleza multifásica de la onco- en otro capítulo de este libro.
genesis. Numerosos estudios han documentado alteraciones en los oncogenes, on-
Una característica central de los fenómenos de transducción de señal que coproteínas o expresión de factores de crecimiento en lo que se refiere tanto
se resumen en la Figura 64-1 es que las cascadas de activación están orde- a ácido ribonucleico mensajero (ARNm) o proteínas, en tejido tumoral en com-
nadas y se encuentran bajo un estricto control regulador. Asi. por ejemplo,
mientras SOS activa a ras-p21. la proteína activadora de GTPasa (GAP) in-
duce la hidrólisis del GTP unido a ras-p21, dando lugar a su inactivación Tabla 64-1 M e c a n i s m o s para la inducción de la carcinogenesis
(Fig. 64-1). El MEK activado regula a la baja a SOS, disminuyendo el inter- por e l e m e n t o s de la vía mitogénica
cambio GDP; GTP por ras-p21 (Holt. 1996).
Elemento de la via Mecanismo de acción
Si una o más proteínas de vías como la que se muestra en la Figura 64-1
mutan de manera que no se puedan regular a la baja, es posible que se pro- 1 Factores a) Sobreproducción desde la célula y
de crecimiento hacia sus proximidades
duzca una señal mitogénica continua que en última instancia de lugar a neo- b) Interacción con factores de
plasia. Cuantas más mutaciones de este tipo se produzcan, mas probable es crecimiento con receptores de
que la célula sufra una transformación maligna. Así, lesiones progresivas en la elevada afinidad
via mitogénica pueden corresponder con las múltiples fases de la carcinoge- 2. Receptores a) Sobreexpresión que conduce a
nesis. de factores elevadas concentraciones de
La Tabla 64-1 resume los mecanismos por los que cada tipo de elemento de crecimiento dimeros
de transducción de señal ha resultado inducir la transformación celular, empe- b) Pérdida del dominio extracelular que
da lugar a una dimerizacíón
zando por los factores de crecimiento, progresando a los receptores de factor permanente del receptor del
de crecimiento, después a las proteínas G y a las cascadas de cinasas. y final- factor de crecimiento y a una
mente a las proteínas nucleares. Estos mecanismos se explican con más de- producción continua de señales
talle en cada sección de este capitulo destinada a estas diferentes proteínas c) Sustituciones de aminoácidos en el
de transducción de señal. dominio transmembranoso que
dan lugar a una dimerización
permanente
ONCOPROTEÍNAS EN LA DETECCIÓN TUMORAL 3 Proteínas cilosólicas a) Sobreexpresión de proteina normal
proteínas G b) Sustituciones de aminoácidos que
y cinasas cambian de forma permanente su
La detección de proteínas muladas de Iransducción de señal o de niveles
conformación a una lorma activada
elevados de proteínas de tipo "salvaie' en el suero o en los líquidos corpora- c) Mutaciones que eliminan dominios
les es altamente sugerente de neoplasia: por tanto, se dispone ahora de mu- reguladores de las cinasas
chos análisis para diferentes oncoproteínas en forma de kit. incluyendo deter- I 4 Oncoproteínas a) Sobreexpresión de las proteínas de
minaciones de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) para los factores de nucleares transcripción y replicación
crecimiento como el factor-» transformador de crecimiento (TGF-a) y factor b) Mutaciones de proteínas
de crecimiento fibrobláslico (FGF). las proteínas EGFr y neu/HER-2. ras-p-21 antioncogénicas que las mactivan
del receptor de factor de crecimiento y las proteínas nucleares p53. myc y c) Mutaciones que eliminan dominios
NMP22 de compañías tales como Oncogene Science (Uniondale. NY). Tritón requladores
 1346 SECCIÓN VII • PATOLOGÌA MOLECULAR
paración con el tejido normal (Pimentel. 1989: Brandt-Rauf. 1998). Diferentes
estudios han estudiado las oncoproteinas o la expresión de factor de creci-
miento en líquidos biológicos tales como orina o derrames, y han demostra-
do la posibilidad de utilizar estos péptidos y proteínas como marcadores para
la presencia de neoplasia (Niman. 1985; Yeh. 1989). Los siguientes estudios
han confirmado estos hallazgos iniciales, dando lugar al uso clínico de estos
marcadores para detectar la presencia de tumores malignos. El enfoque de
este capítulo se centrará por tanto en la identificación de diferentes onco-
proteinas y factores de crecimiento en el suero, plasma u orina de pacientes
con cáncer o con riesgo de desarrollar un cáncer.
En la Tabla 64-2 se presenta un resumen de algunos de los muchos (más
de 50) oncogenes conocidos y sus funciones en la célula. Aquellos de la Tabla
64-2 para los que se dispone de algún método comercial se marcan con un
asterisco.
Factores de crecimiento
Dado que varios factores de crecimiento parecen tener una función en la
proliferación celular durante la tumorogénesis. y dado que los factores de cre-
cimiento son segregados de forma activa al medio extracelular. son poten-
cialmente objetivos atractivos para su detección en la sangre durante el desa-
rrollo del cáncer. Hasta la fecha, son vanos los esludios que han sido capaces
de demostrar diferencias en los niveles sanguíneos de factores de crecimien-
to entre los pacientes con cáncer y los pacientes control que no lo tienen.
Factor transformador de crecimiento (TGF) a y 13. TGF-u es un poli-
péptido con 50 aminoácidos que se une al receptor EGF. que se dimeriza tras
unirse con EGF. TFG-|i es una familia de proteínas etiquetadas desde |S.
hasta |i . TGF-|Í, es un homodimero de dos subunidades de 12 kDa unidas
s tes que tenían una historia de asbestosis y que posteriormente desarrollaron
por puentes disulfuro. Mientras que TGF-p" ha resultado ser elaborado por
muchos tipos diferentes de tumores humanos malignos, se han encontrado
niveles séricos elevados de este factor de crecimiento de forma predominan-
te en tumores hepáticos y de vejiga. Curiosamente, se ha encontrado que
TGF-|) inhibe la mitosis de ciertas lineas celulares especificas en cultivo, tales
como las células epiteliales bronquiales del visón. Asi. el suero de los pacien-
tes que tienen tumores que elaboran este factor de crecimiento se puede ana-
lizar en su busca midiendo el grado de inhibición de crecimiento celular.
La actividad TGF-ji. determinada por medio de esta técnica, ha resultado
estar notablemente elevada en pacientes con carcinoma hepatocelular pero
no en pacientes control de la misma edad (Shirai, 1992). En el suero de los
pacientes que se han sometido a una resección quirúrgica de estos tumores,
la actividad de TGF-ji es escasamente detectable, sugiriendo que el tumor
era la fuente de los niveles elevados del factor de crecimiento del suero. De
forma interesante, en muchos pacientes con carcinoma hepatocelular se ha
observado que TGF-|i está elevado en orina (Tsai. 1997).
El uso de un ELISA con un anticuerpo monoclonal dirigido contra TGF-|j.
ha revelado que TGF-p\ está elevado en una gran proporción de pacientes
con un cáncer de vejiga invasivo pero no en pacientes con tumores de vejiga
no invasivos ni en pacientes sin cáncer (Klocker, 1994). Recientemente, se ha
descrito un nuevo marcador tumoral para el cáncer de vejiga que parece ser
más exacto para detectar los cánceres de vejiga tanto invasivos como no
invasivos, y que es la proteína de matriz nuclear NMP22. detectada en orina
y de la que se habla más adelante.
Asi, los estudios séricos en busca de TGF-|i son muy utiles para diagnos-
ticar y hacer seguimiento de carcinomas hepatocelulares. Son menos útiles
para el diagnóstico de carcinoma de vejiga aunque, para el cáncer de vejiga
invasivo, este factor de crecimiento tiene una elevada sensibilidad y especifi-
cidad.
TGF-u ha resultado estar elevado en un gran número de pacientes con tu-
mores de células epiteliales (Chakrabarty, 1994: Katoh, 1990), de forma pre-
dominante en mama (casi el 100%), pulmón, estómago, colon e higado. A di-
ferencia de ellos, los individuos normales tienen unos niveles séricos muy
baios. En lo que se refiere al higado. TGF-u ha resultado estar elevado en el
suero de pacientes con carcinoma hepatocelular. pero no en pacientes con
cirrosis. Los niveles elevados se redujeron en los pacientes que se habian tra-
tado por un carcinoma hepatocelular (Tomiya. 1996).
Estudios recientes confirman que TGF-u es un predictor eficaz de la pro-
ducción de tumores malignos en una fase precoz. Por ejemplo, de 36 pacien-
un cáncer, sobre todo un adenocarcinoma o un carcinoma pulmonar de célu-
las escamosas, más de un tercio resultaron ser seropositives para TGF-u. Las
muestras sanguíneas de todos estos pacientes se recogieron y después se
guardaron en el momento del diagnóstico de la asbestosis y antes del diag-
nóstico de un tumor maligno. De forma significativa, todos salvo uno de estos
pacientes seropositives resultaron tener niveles elevados de TGF-u en la
sangre almacenada (Brandt-Rauf. 1998).
TGF-u parece ser así un excelente marcador para la presencia de tumo-
res malignos. A diferencia del caso de TGF-p. estas elevaciones no son
tumor-específicas. Aun así. parece claro que TGF-u es extremadamente útil
como herramienta de detección en pacientes en los que se busca un lumor
maligno.
 CAPÍTULO 64 • ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
Factores de crecimiento derivados de las plaquetas. El factor de
crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, una proteína de un peso mole-
cular de 28 kDa, exisle como un dímero de cadenas A y B. en forma de díme-
ros A-A. A-B o B-B. Cada cadena se puede glucosilar aumentando su masa
molecular hasta 30 kDa. Este factor de crecimiento, que se aisló originalmen-
te de plaquetas, se une a un receptor de factor de crecimiento transmembra-
noso. La cadena B se codifica por el oncogén sis. Se ha encontrado que es
un potente mitógeno en lineas celulares linfoides. mieloides y de fibroblastos.
También se ha estudiado en la sangre de pacientes con cáncer. De forma glo-
bal, este factor de crecimiento ha resultado estar elevado de forma significa-
tiva en más de un 15% de pacientes con carcinomas, sarcomas y linfomas.
pero en ninguno de los individuos normales. En pacientes con cáncer de ma-
ma exisle una excelente correlación entre la fase del tumor y el nivel sérico
del factor de crecimiento (Ariad. 1991). Los niveles más elevados predijeron
supervivencias más cortas.
Factor de crecimiento fibroblástico básico. El factor básico de cre-
cimiento fibroblástico (bFGF) es una proteína que contiene 155 aminoáci-
dos. Es un factor de crecimiento para las células mesenquimales, pero
también tiene concentraciones relativamente elevadas en el sistema ner-
vioso central (SNC). De forma notable, se ha encontrado que bFGF está
presente en altas concentraciones en el suero de pacientes con tumores
de células epiteliales. De entre estos tumores, llama la atención el carci-
noma de células renales. Más de un 50% de pacientes con esta enferme-
dad tienen niveles séricos muy elevados de bFGF (Fujimoto. 1991; li. 1993),
bien se mida mediante ELISA o mediante métodos potenciados de quimio-
luminíscencia. Este factor de crecimiento está también elevado en el suero
de más del 50% de pacientes con tumores del SNC. en el 90% de pacien-
tes con cánceres de pulmón (li. 1993) y en alrededor del 60% de pacientes
con linfomas (Kurobe, 1993). No está elevado, sin embargo, en el suero de
grandes poblaciones de individuos normales (control). Recientemente, los
niveles séricos elevados de bFGF han resultado ser un buen factor pro
nóstico en pacientes con carcinomas de pulmón de células no pequeñas
(Brattstrom, 1998).
As. TGF-u y TGF-|i. PDGF y bFGF parecen todos ellos estar elevados en
el suero de un número significativo de pacientes con tumores de células epi-
teliales, aunque no son completamente tumor-específicos. TGF-« tiene una
cierta especificidad para el cáncer de mama y TGF-|5 para el carcinoma hepa-
tocelular. bFGF se eleva en diferentes tumores malignos, incluyendo tumores
de células no epiteliales, como los tumores del SNC y los linfomas. PDGF
muestra poca especificidad en cuanto al tipo del tumor, pero sus niveles ele-
vados en el suero indican la presencia de tumor maligno.
Factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento hepato-
citario. Se ha observado que el factor de crecimiento epidérmico está eleva-
do en el suero de algunos pacientes con cáncer de estómago (Pawlikowski.
1989) y cáncer de lengua (Bhatavdekar. 1993), pero ha resultado estar nor-
mal o disminuido en otros tumores (Nedvidkova, 1992). Se han descrito nive-
les séricos elevados de tactor de crecimiento hepatocitano en pacientes con
carcinoma hepatocelular. Sin embargo, este factor de crecimiento parece ser
único en cuanto a que se encuentran también niveles elevados en enferme-
dades hepáticas no malignas (Hioki. 1993), disminuyendo su utilidad como
marcador tumoral.
Receptores de factores de crecimiento
En cuanto a los receptores de factores de crecimiento, existen varios me-
canismos por los que puede iniciarse una mitogénesis incontrolada. Estos
mecanismos se resumen en la Figura 64-2. Tanto para el receptor EGF como
para la proleina del receptor del factor de crecimiento pl85. codificada por el
oncogén neu (HER-2), y que se asocia intensamente con el cáncer de mama
(Slamon. 1989), el receptor dimeriza y activa las tirosmas cinasas que están
involucradas en la fosforilación de proteínas que transducen la señal mitogé-
nica hasta el núcleo. Existen tres mecanismos patológicos conocidos que
pueden dar lugar a una dimerización del receptor anormalmente prolongada
y que produce una señal continua mitogénica. Estos mecanismos son la pér-
dida del dominio de unión extracelular (ECD); las mutaciones en el dominio
transmembranoso que promueve la dimerización (Brandt-Rauf, 1990) y la so-
breexpresión del receptor.
1347
Los receptores transmembranosos del factor de crecimiento codificados
por la familia erbB de oncogenes (por ejemplo, erbS. que codifica el recep-
tor EGF, también llamado EGFr. y neuvHER-2 [erbB-2]), son objetivos particu-
larmente atractivos para la detección en sangre durante el desarrollo del cán-
cer, ya que se ha observado que. en los tumores humanos inducidos por
estos receptores, el mecanismo parece ser la proteólisis del dominio extrace-
lular de unión con el receptor (Figura 64-2, tercera ilustración). Los dominios
extracelulares liberados, llamados ECD, entran entonces en la circulación y
se pueden detectar lácilmente en el suero utilizando técnicas convencionales
de inmunoanálisis (Brandt-Rauf, 1994a. 1994b. 1998)
Receptor EGF (EGFr). En pacientes con asbestosis se han estudiado
las elevaciones de los niveles circulantes del ECD de este receptor de fac-
tor de crecimiento (Brandt-Rauf, 1992). que se sabe predispone a tumores
malignos. Se ha encontrado que en estos pacientes, aquellos con niveles
séricos de ECD de 636 fmol'ml o más altos, o bien tienen un tumor malig-
no asociado al asbesto (carcinoma de pulmón o mesíotelioma). o bien pos-
teriormente desarrollan un tumor de esta clase. Se ha observado que mu-
chos individuos normales tienen unos niveles séricos de ECD mucho más
bajos. Así. EGFr parece ser un excelente marcador para los tumores indu-
cidos por el asbesto, Estos resultados tienen también interés porque sugie-
ren que el electo principal del asbesto como carcinógeno es producir muta-
ciones en el gen EGFr.
Receptor neu HER-2. Debido a la asociación firmemente documentada
entre el cáncer de mama y las mutaciones en el gen neu'HER-2. muchos
estudios han examinado el p185 erbB-2 ECD en la sangre de pacientes con
cáncer, en particular cáncer de mama. En estudios previos sobre la sobreex-
presión inducida por el oncogén neu de la proteina pl85 (Slamon. 1989). se
encontró que el nivel de expresión del oncogén neu en el tejido de biopsias
de cáncer de mama se correlacionaba con la extensión del tumor, siendo el
mejor indicador pronóstico de tasas de supervivencia, excediendo la exten-
sión de la afectación de ganglios linfáticos como indicador pronóstico.
Los resultados de la cuantificación del p185 ECD en el suero de pacientes
con cáncer de mama corren paralelos con los resultados genéticos previos
Entre un 25% y un 50% de los pacientes con un cáncer de mama en estadios
III o IV tienen niveles elevados de p185 ECD en su suero (entre 40 y 190 ve-
ces más altos que en el suero de los individuos control normales (Morí, 1990:
Carney, 1991: Kath, 1993). En los pacientes de los que se dispone de un ma-
terial de biopsia tumoral. hay una excelente correlación entre los niveles séri-
cos de ECD y la expresión a nivel lisular (Breuer. 1993.1994). Exisle también
una excelente correlación entre los niveles séricos de ECD y la recurrencia de
la enfermedad (Brandt-Rauf, 1998), Los niveles de ECD en el suero también
han resultado ser un excelente indicador pronóstico para el cáncer de mama
(Molina, 1996).
Dado que los niveles séricos de p185 ECD se correlacionan con la carga
y con la fase del tumor, la detección del cáncer de mama incipiente, utilizan-
do los niveles séricos de p185 ECD. es menos eficaz para estos pacientes.
De forma global, la tasa de delección de los tumores mamarios en estadios
I y II utilizando los niveles séricos de ECD, basados en técnicas ELISA con-
vencionales, oscila entre un 10% y un 15%. Sin embargo, el uso de un méto-
do ELISA sensible para el p185 ECD en pacientes con cáncer de mama dio
lugar al descubrimiento de un carcinoma in situ en un 43% de los pacientes
con esta enfermedad (Breuer, 1993). Este último resultado indica que el uso
de análisis más sensibles para p185 ECD identifica un aumento significativo
en el número de pacientes con carcinoma in situ (esto es, en una fase precoz
de su desarrollo).
Neoplasias pulmonares, pl 85 ECD está también elevado en un alto por-
centaje de pacientes con cáncer de pulmón. Las elevaciones de los niveles
séricos de EGFr para la detección tumoral precoz se han empleado para estu-
diar a pacientes con una predisposición conocida, como los que tienen neu-
moconiosis, a desarrollar estos tumores. En el 70% de los pacientes con neu-
moconiosis, se han encontrado niveles séricos elevados de p185 ECD antes
del desarrollo manifiesto del tumor maligno. En casi el 100% de los pacientes
con este factor predisponente que tienen cáncer de pulmón, el p 185 ECD del
suero está bastante elevado (Brandt-Rauf, 1994a). Claramente, esta proteina
es un indicador muy sensible de cáncer de pulmón. Por el contrario, no se han
encontrado elevaciones de pl 85 ECD en el suero de muchos individuos nor-
males.
 1348 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 64-2. Mecanismos de la producción continua de señales mitogémeas por parte de los receptores de factores de crecimiento. El esquema 1 muestra que estos
receptores tienen tres dominios: un dominio extracelular, donde se une el factor de crecimiento (ECD): un dominio transmembranoso (TMD| y un dominio intracitoplásmi-
co (ICD). Un lactor de crecimiento. GF. se une al receptor haciendo que se dimerice. poniendo en marcha una cascada de fenómenos mtracelulares que se transducen
hasta el núcleo (N). descrito en la Figura 64-1. Hay tres formas conocidas por las que se puede producir una señal celular continua a partir del receptor de factor de cre-
cimiento, dando lugar a una transformación maligna de las células.
El esquema 2 muestra el primero de ellos: sobreexpresión del receptor que da lugar a muchos procesos de activación y a señales continuas hacia el núcleo.
El esquema 3 muestra el segundo mecanismo, donde ECD o bien está ausente o bien es eliminado por proleasas intracelulares, dando lugar a una dimerización espontánea.
El esquema 4 muestra el tercer mecanismo, en el que una mutación del gen del receptor del lactor de crecimiento da lugar a una sustitución de aminoácidos (X en la
Figura) en el dominio transmembranoso. dando lugar a la formación de hélices-ix que se asocian (Brandt-Rauf, 1990) y dando lugar a una dimerización espontánea que
puede lener lugar en ausencia o presencia del ligando.

Carcinomas hepatocelulares. Se ha observado previamente que el fac-
tor de crecimiento TGF-p' puede ser un buen marcador del carcinoma hepa-
tocelular. Hay ahora fuertes indicios de que p185 ECD es también un marca-
dor sensible para esta enfermedad. Se ha encontrado que el p185 ECD del
suero está elevado en casi un 100% en los individuos de raza oriental que tie-
nen factores de riesgo conocidos de desarrollar esta enfermedad (Luo, 1 9 9 3 :
Yu, 1994). Sin embargo, no se han observado elevaciones en individuos nor-
males de edad y raza similares o en aquellos con factores de riesgo de tipo
exposición para esta enfermedad pero que no desarrollaron posteriormente
cáncer.
erbB-2 (p185) ECD en otros tumores. Se han encontrado también ele-
vaciones en los niveles séricos de erbB-2 ECD en pacientes con cánceres
colorrectales. pancreáticos, prostéticos, hepáticos y ováricos (Wu, 1993) con
frecuencias de detección más bajas (del 15% al 20%). En estos casos se ha
encontrado una excelente correlación entre los niveles séricos y los niveles ti-
sulares. Hay una correlación directa entre los niveles séricos del p185 ECD y
 CAPÍTULO 64 • ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
el tamaño del tumor para los adenomas premaligos de colon (Brandt-Rauf.
1994b). Dado que las neoplasias de colon progresan por lo general a través
de fases bien definidas desde adenoma a carcinoma, aumentando el poten-
cial maligno de los adenomas con el tamaño, los niveles séricos de erbB-2
ECD pueden ser útiles para el seguimiento de esta progresión.
Proteínas G
Como ocurre con los receptores de tactor de crecimiento, las proteínas
señalizadoras que se producen aguas abajo de los receptores de crecimien-
to se hacen oncogénicas sobre todo por la sobreexpresión y sustituciones de
aminoácidos en posiciones críticas en sus cadenas polipeptídicas. Con me-
nos frecuencia, y para algunas proteínas, como raí (Figura 64-1; Tabla 64-2),
la pérdida de los dominios de regulación también puede conducir a la onco-
genesis. Las sustituciones de aminoácidos en las proteínas transductoras de
señal hacen que estas proteínas sufran cambios de conformación que pue-
den dar lugar a que queden activadas de forma permanente para estimular la
división celular (Pincus, 1992,1999).
Este mecanismo se ha documentado bien para la proleína p21 codificada
por el oncogén ras. en el que las sustituciones de la mayoría de los aminoá-
cidos por glicina 12 o glutamina 61 dan lugar a una proteína oncogénica.
Muchas proteínas p21 con tal sustitución han sido clonadas y microinyecta-
das directamente en células normales de cultivo tales como las células NIH
3T3 (Barbacid. 1987). Las células sufren una transformación maligna que
dura hasta que se melaboliza la proteína mulante añadida y se elimina de las
células. Las tormas mulantes oncogénicas del gen ras y de su proteína p2i
codificada se han encontrado en aproximadamente uno de cada tres tumo-
res de células epiteliales humanos habituales, en más de un 90% de los tu-
mores pancreáticos humanos y en un 75% de los cánceres de colon huma-
nos (Almoguerra, 1988; Forester. 1987).
Una de las consecuencias de las sustituciones de aminoácidos en p21 y
presumiblemente en otras proteínas transductoras de señal es la activación
anómala de vías alternativas y no reguladas de transducción de señal. La pro-
teina oncogénica ras-p21 (p21 * en la Figura 64-1) ha resultado unirse direc-
tamente a ¡un, el tactor de transcripción nuclear y su cinasa activadora. ¡un
cinasa (JNK). Este proceso de unión da lugar a la activación directa de es-
tas proteínas nucleares inductoras de transcripción, cortocircuitanto así los
controles celulares normales. Esta derivación o via en cortocircuito se mues-
tra en la parte derecha de la Figura 64-1 para p21' (Adler. 1995: Amar. 1997).
Además, la proteína oncogénica ras-p21 activa la proteína cinasa C (Pincus.
1992), como se ilustra en la Figura 64-1.
Como se mencionó previamente, las proteínas p21 codilicadas por el onco-
gén ras son proteínas G asociadas a las membranas de 21 kDa que se han
implicado en el proceso de transducción de señales de crecimiento desde la
membrana celular a las cinasas del citoplasma. Los cambios cualitativos (por
ejemplo, mutaciones puntuales) y cuantitativas (por ejemplo, sobreexpresión i
en p21 han sido identificadas como contribuidoras a la carcinogenesis huma-
na (Barbacid. 1987). Gracias a mecanismos aún sin definir, las proteínas p21
ganan acceso al ambiente extracelular. Así, las mayores cantidades de p2l o
las formas muladas de lorma puntual de p21 pueden detectarse mediante
inmunoblot con anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de células cul-
tivadas que se sabe sobreexpresan p21 o que expresan p21 mulante, respec-
tivamente (Brandt-Rauf, 1991).
De forma análoga, realizando inmunoblot en ratones con tumores que so-
breexpresan p21 o que expresan un p21 mutante se encuentran mayores
cantidades de p2i o formas muíanles de p21 en su suero, respectivamente
(Hamer. 1991). Estos resultados sugieren que es posible realizar la detección
de un aumento en p2l o encontrar p21 mutante en sangre de seres humanos.
Debido a su papel central en la transducción de señales mitogénicas. se
podría esperar encontrar proteína p2l mulada y'o sobreexpresada en una
amplia variedad de tumores humanos. De hecho, se ha identificado un p2l
sérico elevado en el suero de hasta un 68% de los pacientes con muchos cán-
ceres diferentes, incluyendo cánceres de mama, próstata, colon, pulmón e hi-
gado. Por otro lado, sólo un pequeño porcentaje de individuos normales han
resultado tener niveles séricos detectables (Weissfeld, 1994).
En cánceres humanos de páncreas y colon se ha encontrado una inciden-
cia muy alta de ocurrencia de formas oncogénicas del gen K-ras. Nuevos aná-
1349
lisis basados en la PCR han detectado en oncogén ras en las heces de un al-
to porcentaje de pacientes con cáncer de colon. Se han encontrado resulta-
dos igualmente aleccionadores utilizando el esputo de pacientes con cáncer
de pulmón. Se han obtenido ahora resultados paralelos utilizando ELISA para
la proteina p21 utilizando el suero de pacientes con carcinomas de colon y de
pulmón. Se han encontrado niveles elevados (cinco veces superiores al del
control) de p21 sérico en hasta un 83% de pacientes con cancer de pulmón,
mientras que en los sueros de individuos normales sólo se han encontrado
niveles bajos (Brandt-Rauf. 1991. 1998) Además, se han realizado estudios
en los que se ha llevado a cabo una PCR para genes mutantes k-ras con
cambios de bases en los codones 12 y 13. de forma simultánea en el tejido
tumoral y en el suero de pacientes con diferentes fases de cáncer colorrectal
(De Kok. 1997). En más de un 90% de los pacientes con genes ras mulantes
específicos encontrados en tejidos tumorales, se descubrió el mismo gen mu-
lado ras en sus sueros, de forma indiferente de la fase del tumor
Previamente, cuando se habló de la proteína p185 codificada por el onco-
gén neu, se hizo notar que se habían encontrado elevaciones en los n veles
séricos de esta proteina en pacientes con neumoconiosis que progresaron
después hasta desarrollar tumores malignos sintomáticos. Un estudio similar
en los niveles séricos de p2l se ha llevado a cabo en pacientes con neumo-
coniosis. Para los pacientes con esla predisposición, en un 39% se ha en-
contrado mediante inmunoblot (Western blot) que tenían niveles séricos ele-
vados de la proteina p21. Casi todos estos pacientes desarrollaron un tumor
de pulmón maligno después de haberse observado elevaciones de la prote-
ina p21. Así, y al igual que p185 ECD, el p21 sérico elevado es un marcador
biológico precoz de enfermedad maligna en pacientes con una predisposi-
ción conocida.
Los estudios precedentes están relacionados con la detección de niveles
séricos elevados de p2l como indicadores de tumores malignos. Como se ha
observado antes, un importante mecanismo de la oncogenesis inducida por la
proteína ras-p2l son las sustituciones de aminoácidos en su secuencia que
dan lugar a su activación permanente. La identificación de genes ras mutan-
tes mediante PCR y secuenciación directa del ADN aislado del suero o plas-
ma en tres pacientes con cáncer de páncreas ya se ha descrito (Sorenson.
1994). pero, hasta hace poco, no se habia comunicado la detección directa
de proteínas p2l mutantes en sangre humana (De Kok. 1997). Actualmente,
sin embargo, las sustituciones oncogénicas de aminoácidos en la proteína
p21 se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales que
reconocen sustituciones oncogénicas especificas.
Se ha encontrado p21 mutado en el suero de pacientes con una historia
conocida de exposición a cloruro de vinilo. un carcinógeno. Este produelo quí-
mico ha resultado predisponer a las personas a desarrollar angiosarcomas.
Los estudios tisulares de estos angiosarcomas revelan que en las células
tumorales un gen ras mutante coditica ácido aspártico en lugar de la glicina
que está normalmente en la posición 13 en la cadena polipeplidica. Un anti-
cuerpo monoclonal que reconoce la forma Aspl3 de la proteina p21 ha podi-
do desarrollarse (Oncogene Science). Esta proteína p2l mutante ha sido
identificada en el suero del 80% de pacientes con angiosarcomas hepáticos
inducidos por cloruro de polivinilo. pero no en individuos normales (DeVivo,
1994). Es más. existe una correlación directa entre el grado de exposición de
los pacientes al cloruro de vmilo y la probabilidad de descubrir en su suero la
forma oncogénica de la proteína.
Se han obtenido otros anticuerpos monoclonales anti-p21 mutantes alta-
mente específicos que reconocen sustituciones especílicas de aminoácidos en
las posiciones 12. 13, 59 y 61. El uso de estos anticuerpos en el suero de
pacientes con factores de riesgo conocidos de desarrollar cáncer parece ser
muy prometedor para la detección precoz de los tumores.
Oncoproteínas nucleares
Como ya se ha mencionado, dos importantes proteínas nucleares que pa-
recen tener funciones críticas en la regulación del crecimiento celular y la divi-
sión celular son la proteina p53 que suprime el gen tumoral y la proteina
p62'64 codificada por el oncogén c-m/epara la que se han desarrollado análi-
sis en suero. Además, las proteínas de matriz o esqueleto nuclear son los ob-
jetivos de las cinasas transductoras de señal tales como la cinasa MAP, se-
gún se indica en la Figura 64-1.
 1350 SECCIÓN V I I • PATOLOGIA MOLECULAR
Proteina p53. Se sabe que esta proteina funciona como un homotetrá-
mero y, de esta forma, se une a secuencias especificas del ADN. El efecto
es reprimir el proceso de la mitosis. Así. p53 es una proteína antíoncogén.
Se pueden producir mutaciones en p53 que lo ¡nactiven. Esta inactivación
puede por sí misma ser oncogénica debido a que se elimina el control vital
que esta proteína ejerce sobre la mitogénesis. Entre las mutaciones inacti-
vantes están las deleciones de todo el gen, como se ha encontrado en un nú-
mero de cánceres de colon. Las mutaciones del gen p53 pueden producir
sustituciones de aminoácidos en la proteína que, como en la proteína p21,
dan lugar a cambios de conformación en la proteína que resultan en su inca-
pacidad para llevar a cabo su función antioncogénica en la célula (Brandt-
Rauf, 1996).
Se han identificado muchas diferentes mutaciones puntuales en p53 en tu-
mores humanos (Soussi, 1994). El efecto de estas mutaciones es la pérdida
de la función inhibitoria del crecimiento normal de p53 y. al mismo tiempo,
algunas de estas mutaciones dan lugar a proteínas p53 con unas vidas me-
dias considerablemente aumentadas, de manera que las proteínas muladas
se acumulan en las células transformadas (Soussi, 1994).
La oncoproteína c-myc se activa para dar lugar a la transformación celular
mediante sobreexpresión, de manera que, además, se acumula en las célu-
las transformadas (Field. 1990). Así, tanto para p53 como para myc p62<64.
se pueden detectar aumentos en los niveles de estas proteínas en células
transformadas y en tumores humanos (Soussi. 1994: Field, 1990). Esta so-
breexpresión da lugar aparentemente a una salida de las proteínas hacia el
ambiente extracelular. Estas proteínas pueden por tanto no solamente detec-
tarse en el suero y otros líquidos corporales, sino que estas proteínas nor-
malmente secuestradas se reconocen como extrañas, de manera que algu-
nos pacientes con cáncer desarrollan anticuerpos frente a myc p53 o p62<64.
Por tanto, las concentraciones elevadas de p53 o p62/64 o de anticuerpos
frente a estas proteínas en sangre periférica son excelentes marcadores para
el estudio de la carcinogénesis humana.
Detección de tumores malignos mediante análisis
de la proteína p53
Carcinoma hepatocelular. Se han encontrado niveles aumentados de
p53 mutante mediante ELISA (más de 0,3 ng/ml, en límite superior en 100 in-
dividuos normales) en los sueros de un 20% de pacientes con carcinoma he-
patocelular y en el 30% de pacientes con cirrosis, un grupo que se sabe tiene
un mayor riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular (Virji. 1992). Dado
que los pacientes con cirrosis tienen niveles elevados de p53 en su suero y
un factor de riesgo conocido para desarrollar carcinoma hepatocelular, los
niveles elevados de p53 pueden ser un indicador precoz de tumorogénesis.
Cáncer de mama y pulmón. Se han realizado pocos estudios de p53
como marcador tumoral en el suero de pacientes con cáncer de mama y de
pulmón. Se han comunicado niveles séricos elevados de p53 mutante. de-
terminados mediante ELISA en el 8% de pacientes con cáncer de mama,
disminuyendo los niveles con la resección quirúrgica de los tumores (Rosa-
nelli. 1993), indicando que los tumores eran la fuente del p53 elevado. No
se han observado elevaciones de proteína p53 en el suero de un individuo
normal.
Para el cáncer de pulmón, se han observado elevaciones séricas de los
niveles de p53 mutante, determinados mediante ELISA y mediante inmuno-
blot en hasta un 34% de pacientes con cáncer de pulmón, pero no en indivi-
duos normales (Fontanini, 1994). En estos pacientes, la tinción inmunohisto-
química de biopsias tisulares obtenidas posteriormente mostraron niveles
elevados de p53, correlacionándose con los hallazgos séricos.
Cáncer de colon. Un mecanismo que se cree es importante en el desarro-
llo de los carcinomas de colon es la deleción del gen p53 normal o las muta-
ciones de este gen que dan lugar a una proteína antioncogénica no funcionan-
te. Se han encontrado elevaciones en los niveles séricos de p53. determinados
mediante ELISA, en aproximadamente uno de cada cinco pacientes con carci-
noma de colon y en aproximadamente uno de cada diez pacientes con adeno-
mas de colon. Los individuos normales fueron negativos para la proteína sérica
p53. Estos resultados tienen una sensibilidad relativamente baja de este mar-
cador para el cáncer de colon, posiblemente debido a que la delección del gen
p53 se produce en un elevado porcentaje de los tumores estudiados.
Anticuerpos circulantes anti-p53 en la detección
tumoral
Se han descrito anticuerpos séricos frente a p53 como un hecho frecuente
en pacientes con varios tipos de cáncer. La producción de anticuerpos frente
a p53 y otras oncoproteínas se ha atribuido a su acumulación en células
necróticas y a su consiguiente liberación hacia la circulación, donde se reco-
nocen como sustancias extrañas. Para p53. hay todavía otra causa para el
desarrollo de anticuerpos frente a p53 oncogénico. Al igual que ras-p21 onco-
génico. las proteínas p53 mutantes que contienen sustituciones de un único
aminoácido en posiciones críticas de la cadena polipeptídica pueden volver-
las oncogénicas. Estas sustituciones de aminoácidos inducen cambios impor-
tantes en la conformación de la proteína p53 (Adler. 1998; Brandt-Rauf, 1996).
Entre estos cambios figura la exposición de determinantes antigénicos espe-
cíficos que normalmente no quedan expuestos. Si la proteina difunde hacia la
circulación, es frecuente que se desarrollen anticuerpos contra estos deter-
minantes.
En diferentes estudios importantes (incluyendo un gran estudio de 1.392
pacientes con cáncer), se encontraron elevaciones en los niveles séricos de
anticuerpos anti-p53 en pacientes con cáncer de ovario y de colon (15%);
cáncer de pulmón, incluyendo tumores de células pequeñas (hasta un 25%),
y cáncer de mama, incluyendo carcinomas intraductales (hasta un 15%). Los
individuos normales no tenían niveles séricos elevados de estos anticuerpos
(Angelopolou, 1994). En un número significativo de pacientes en los que se
ha seguido la presencia de anticuerpos anti-p53 en su suero, la aparición de
estos anticuerpos ha resultado preceder al desarrollo de tumores malignos.
Se encontraron también anticuerpos anti-p53 en más de un 20% de pacien-
tes con cáncer de vejiga (la mayoría en lases más avanzadas), en una alta
proporción de pacientes con carcinomas de páncreas y hepatocelulares, y en
linfomas infantiles.
Los estudios de seguimiento continuado de anticuerpos anti-p53 en pacien-
tes con diferentes cánceres revelan que hasta la mitad de los pacientes con
carcinoma hepatocelular. independientemente de su tamaño, tienen niveles
séricos notablemente elevados de antí-p53 (Ryder. 1996). Estos niveles ele-
vados se correlacionan con la elevación conocida de p53 en el suero de pa-
cientes con esta clase de cáncer, según se comentó antes. Es más. los anti-
cuerpos anti-p53 se han encontrado en el suero de pacientes con lesiones
orales, y muchos de estos pacientes resultaron tener lesiones premalígnas
(Kaur, 1997), indicando que los anticuerpos anti-p53 son marcadores para la
detección precoz del cáncer oral. Se ha encontrado también anti-p53 elevado
en más de un 50% de los pacientes con carcinoma de células escamosas del
esófago (Shimada. 1998).
En un reciente estudio prospectivo muy extenso de pacientes con cáncer de
pulmón, se encontraron niveles séricos de anti-p53 en el 100% de los pacien-
tes con carcinomas de células grandes, en un 28% de los adenocarcinomas,
en un 55% de carcinomas de células escamosas y en un 71% de carcinomas
de células pequeñas (Segawa. 1998). Estos resultados demuestran que los
niveles séricos elevados de anti-p53 tienen especificidad para tipo tumoral
para el carcinoma del pulmón, mostrando tasas elevadas de positividad para
los carcinomas pulmonares de células grandes y de células pequeñas.
Proteínas codificadas por el oncogén myc en detección de tumo-
res. El gen myc codifica una proteína con una masa molecular de 64 kDa
cuya función es en gran medida desconocida. Existe una fuerte evidencia con
respecto a que es un factor de transcripción que. cuando se activa, desrepri-
me la expresión de otros genes que codifican proteínas que participan en la
replicación. Este oncogén está sobreexpresado en un número de tumores, in-
cluyendo el linfoma de Burkitt, donde el gen myc del cromosoma 8 se trasto-
ca a una larga región terminal parecida a la de las repeticiones en una región
codificadora de ¡nmunoglobulinas del cromosoma 14. Las regiones con repe-
ticiones terminales largas permiten la expresión constitutiva de genes que son
adyacentes a las mismas.
Las proteínas en relación con c-myc y los anticuerpos trente a la proteína
c-myc han sido identificadas, al igual que p53 y sus correspondientes anti-
cuerpos, en el suero de pacientes con cáncer. La detección de esta proteína
de 62.64 kDa está dificultada por su corta vida media en el suero. Sin embar-
go, es posible detectar una proteína específica p40 relacionada con c-myc en
el suero de estos pacientes, utilizando inmunoblot. Las frecuencias más altas
 CAPÍTULO 64 • ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
de encontrar proteina mycen el suero humano están en el cáncer de colon y de
mama (aproximadamente el 20%). El tratamiento de estas dos clases de cáncer
da lugar a una notable disminución en los niveles séricos de esta proteína. Las
recurrencias originan niveles elevados: por tanto, la proteína c-myc es útil para
el seguimiento del curso de los tumores malignos. No se ha detectado en el
suero de individuos normales
Anticuerpos séricos antiproteina c-myc en la detección de tumo-
res. Se han encontrado niveles séricos elevados de anticuerpos anti-c-myc
en el suero de pacientes con cáncer de colon y de recto (55% al 65%) y en
el suero de pacientes tanto con leucemias mieloides como con linfoma de
Burkitt. Se han descrito incidencias más bajas de anticuerpos elevados en
pacientes con cáncer de mama (aproximadamente un 10%) y cáncer de ova-
rio (10%). No se han encontrado anticuerpos anti-c-myc en el suero de indi-
viduos normales.
Detección del cáncer de vejiga mediante las proteínas de matriz
nuclear. Como se puede ver en la Figura 64-1, uno de los objetivos de las
proteínas codificadas por oncogenes son las proteínas de la matriz nuclear
(NMP). conocidas también como proteínas del esqueleto nuclear y proteínas
del aparato mitótico nuclear. Estas proteínas de 236 kDa son vitales para la
correcta formación del huso mitótico. Contienen una cabeza globular y una
cola separada por un dominio central en forma de bastón de hélice-r/. con-
sistente en repeticiones de secuencias de siete elementos. Estas proteínas
varían según el tipo celular, la fase de diferenciación y el ciclo de la célula. De
forma crucial, se ha identificado un número de NMP asociadas a tumores,
específicas cada una de ellas para uno de cinco tipos tumorales (vejiga, prós-
tata, mama, colon y hueso). El mejor estudiado es uno que está luertemente
asociado con el carcinoma de células transicionales de la vejiga (TCC).
NMP22. que funciona como una proteína del aparato mitótico nuclear, y que
participa en la separación de los cromosomas durante la mitosis (Hughes.
1999). La cantidad de esta proteína en las células epiteliales transicionales
malignas es entre 10 y 20 veces superior a la de las células normales.
Se han desarrollado anticuerpos específicos para esta NMP. que se utilizan
ahora en un ELISA comercial en la orina (Matritech. Newton. MA). La base del
análisis es que. dado que las células uroteliales malignas se desprenden
hacia la orina, y que este NMT es específico de las células cancerosas de veji-
ga, la elevación de esta proteína en orina puede detectarse en pacientes con
cáncer de vejiga. Múltiples estudios de pacientes que tienen cáncer de vejiga
en diferentes estadios revelan que la sensibilidad es próxima a un 90% en el
cáncer maligno e invasivo y un 75% en el carcinoma in situ. Este último resul-
tado es muy alentador, dado que esta lase es la fase más precoz detectable.
Para los carcinomas no invasivos papilares y malignos, la sensibilidad es del
62%. La especificidad global para este marcador es superior a un 90%.
La comparación de la sensibilidad del NMP22 ELISA con la citología mues-
tra que los dos métodos tienen una sensibilidad de un 83% para el carcinoma
invasivo, pero para el grado I TCC. NMP22 tiene una sensibilidad del 61%.
mientras que para la citología aislada es de un 17% (Landman, 1998). Para
los cánceres de grado II y III. el NMP22 ELISA es más sensible, con un 78%
y un 93%, en comparación con la sensibilidad de las citologías de un 50% y
87%, respectivamente (Landman. 1998).
Estos resultados sugieren que el NMP22 ELISA puede ser altamente eficaz
como una herramienta de detección no invasiva para TCC. En la actualidad,
este método ha sido aprobado por la FDA como prueba de seguimiento para
TCC en pacientes que han sido tratados para esta enfermedad. Se han lleva-
do a cabo estudios clínicos en los que se realizó un NMP22 ELISA en la orina
de pacientes que han sido tratados para TCC. entre 20 y 60 días después del
tratamiento, y que fueron después sometidos a una cistoscopia entre dos y seis
meses después del tratamiento. Utilizando un punto de corte de 10 U/ml, un
86% de los pacientes con valores de NMP22 negativos (menos de 10 U/ml)
resultaron tener cistoscopias negativas, y un 71% de los pacientes con valores
superiores a 10 U'ml resultaron tener hallazgos positivos en la cistoscopia. A
la vista del parecido de estas cifras con las obtenidas utilizando la citología pa-
ra detectar nueva aparición de TCC. parece razonable concluir que el NMP22
ELISA podría constituir una prueba de detección eficaz para el TCC. Hace po-
co, de hecho, la prueba ha sido aprobada por la FDA para su uso como herra-
mienta de detección. El uso de esta metodología puede obviar la necesidad de
llevar a cabo cistoscopias en muchos pacientes que están seguidos por reci-
divas tumorales (Miyanaga. 1997).
1351
EVALUACIÓN Y CONCLUSIONES
Existen unas vías bien delinidas para la transducción de señales mitogéni-
cas entre la membrana y el núcleo de las células. Estas vias constan sobre
todo de proteinas. cuyas mutaciones o sobreexpresiones pueden dar lugar a
unas señales mitogénicas no controladas y a cáncer.
Eficacia diagnóstica de las oncoproteínas del suero
Los resultados de los análisis para las diferentes oncoproteínas que se co
mentaron antes en suero y en orina (NMP-22) se resumen en la Figura 64-3
en lo que se refiere a algunos de los tumores más (recuentes de células epi
teliales. También se muestran, junto con el carcinoma hepatocelular. los resul-
tados correspondientes a los angiosarcomas hepáticos. Los resultados de las
determinaciones de las concentraciones de oncoproteínas en los líquidos cor-
porales para grupos control de la misma edad y sexo se muestran como las
áreas blancas en los gráficos de barras de esta figura. De la Figura 64-3 pare-
ce claro que. de las proteínas estudiadas hasta ahora, se producen altas tasas
de positividad en ciertos cánceres, mientras que los grupos control muestran
unas tasas de positividad muy bajas. De forma interesante, y dado que las on-
coproteínas estudiadas provienen de vias de transducción de señal que parti-
cipan en muchos tipos celulares diferentes, parece haber una cierta especifici-
dad de oncoproteínas peculiares para ciertos tipos de cáncer.
Por ejemplo, el factor de crecimiento TGF-a está elevado en un gran nú-
mero de tumores de mama: FGF está elevado en una alta proporción de cán-
ceres de pulmón: la proteína p185 ECD (neu) está elevada en el suero de mu-
chos pacientes con carcinomas hepatocelulares y cánceres de pulmón y en
las fases más avanzadas del cáncer de mama; la proteína C21 se eleva en
carcinomas hepatocelulares, angiosarcomas hepáticos y tumores pulmona-
res; c53 está elevada en los cánceres de pulmón, y el anticuerpo anti-myc es-
tá elevado en los cánceres de colon. Para estas proteínas la sensibilidad en
cuanto a detección de enfermedad es elevada y excede la de cualquiera de
los antigenos oncofetales. Asimismo, la frecuencia con la que se producen
estos factores de crecimiento u oncoproteínas es muy baja en el suero de los
individuos que no tienen cáncer en cada uno de los estudios llevados a cabo
hasta la fecha en varios miles de pacientes. Por tanto, la especificidad al uti-
lizar factores de crecimiento y oncoproteínas como marcadores tumorales es
también relativamente elevada. Esta conclusión no implica que la ausencia de
una determinada oncoproteína en el suero de un paciente implique la ausen-
cia de un tumor maligno. Debido a la naturaleza en casos múltiples de la car-
cinogenesis, puede haber muchas oncoproteínas potencialmente anómalas.
Cualquier otro grupo de oirás oncoproteínas puede también estar presente en
el suero del paciente.
De hecho, la Figura 64-3 indica también que la Irecuencia de detección de
ciertas oncoproteínas en el suero de pacientes que tienen un tipo determina-
do de tumor puede ser relativamente baja. Por ejemplo, como se ve en la
Figura 64-3A se ha encontrado c-myc elevado en el suero de aproximada-
mente un 8% de pacientes con cáncer de mama: se ha encontrado la proteí-
na p185 ECD (neu) en hasta un 25% de pacientes con cáncer de mama. Las
bajas tasas de detección de estas oncoproteínas en estos tipos tumorales son
el resultado del gran número de posibles pasos en la vía donde se producen
proteinas aberrantes o factores de crecimiento. Así. los tumores que se pro-
ducen en un tejido determinado pueden tener una multiplicidad de causas
diferentes, dando lugar a la producción de diferentes proteinas aberrantes en
la cadena. Por tanto, el siguiente paso al utilizar estos marcadores oncoproteí-
nicos en el diagnóstico precoz del cáncer es buscar múltiples marcadores en
el suero de un paciente determinado. El descubrimiento de por lo menos un
componente aberrante de la via de transducción de señales se considera mu-
cho más probable.
Orígenes de los tumores malignos
La Figura 64-3 indica que el descubrimiento de un nivel elevado de una
oncoproteína en el suero de un paciente no proporciona por lo general una
información concluyeme con respecto al origen del tumor maligno. Por ejem-
plo, aunque se ha encontrado ras-p21 elevado, y con cierta especificidad, en
angiosarcomas hepáticos, de colon y de pulmón: y neuHER-2 (c-ert>2) p185
 1352 SECCIÓN VII • PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 64-3. Gráfico de barras con el resumen de resultados de los análisis del suero para diferentes componentes de oncoproteínas de las vías mitogenicas de seña-
lización para seis tipos tumorales: pulmón, mama, colon, vejiga e hígado: carcinoma hepatocelular y angiosarcoma hepatocelular. Para cada tipo de tumor, se muestra
la incidencia de detección en las ordenadas y en forma de porcentaje, y la oncoproteína se lista en la abscisa. En el tope de cada gráfico de barras se muestra la frecuen-
cia de elevación de la oncoproteína en los grupos control como un área blanca dentro del grálico de barras. Para la mayoría de los gráficos de barras, esta frecuencia
es cero, de manera que no aparece zona blanca. (TGF-ot. TGF-|i, FGF, PDGF y EGF = factor transformador de crecimiento u. factor transformador de crecimiento |3.
(actor de crecimiento fibroblástico. factor de crecimiento derivado de las plaquetas y lactor de crecimiento epidérmico, respectivamente: erbB = receptor del factor de cre-
cimiento epidérmico [EGF]; neu = proleina p185 que es parecida a la proteína erbfl y que también se llama erbB-2 y HER-2; ras = proteina p21; NMP22 = proteína de
matriz nuclear que se eleva en el suero en los carcinomas de células transicionales del tracto urotelial; p53 = proteína anli-oncogén: anti-p53 = anticuerpo anti-p53; myc
= oncogén nuclear que codifica la proteina myc. y anti-myc = anticuerpo frente a la proteína myc.)

ECD elevado en cánceres de colon, pulmón y mama, la elevación de una de
estas oncoproteínas en el suero de un paciente no permite identificar con exac-
titud el tejido de origen del tumor maligno. Dado que la vía de transducción de
señales en la mayoría de las células es muy parecida a la de otras, una eleva-
ción en cualquier oncoproteína puede significar que exisle un tumor maligno en
uno de muchos lipos celulares diferentes.
Además, quedan aún por realizar muchos estudios de las correlaciones
que hay entre la presencia de tumores y los niveles séricos de oncoproteínas.
Por ejemplo, no hay datos publicados acerca de la producción de formas
detectables de proteína mutante p2l en el suero de pacientes con carcinoma
pancreático con grupos control formados por individuos de edad y sexo simi-
lares y con grupos que contengan pacientes con pancreatitis pero sin tumo-
res. Este es un estudio necesario, dado que un 90% de los cánceres de pán-
creas expresan ras-p21 oncogénico (Almoguerra. 1988).
Una forma de utilizar las oncoproteínas del suero para detectar tumores
especilicos en una fase precoz de la progresión del tumor es en poblacio-
nes que se sabe están en riesgo de desarrollar cánceres especilicos debido
a una historia de exposición a carcinógenos o mulágenos. como se produce
en la exposición ocupacional o por procesos médicos preexistentes, obser-
vado en la exposición al cloruro de vinilo que se asocia con el angiosarco-
ma hepático y en las neumoconiosis que se asocian con cáncer de pulmón.
Ambos procesos se asocian con niveles séricos elevados de proteína ras-
p21: la última condición se asocia también con niveles séricos elevados de
neup185.
 CAPÍTULO 64 • ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
Otra lorma de utilizar las oncoproteínas séricas para detectar cánceres pre-
coces es analizar la expresión de una amplia variedad de oncoproteínas en el
suero del paciente. Si por lo menos se encuentra un resultado positivo, el pacien-
te puede seguirse en busca de síntomas del desarrollo de un tumor.
Tamaño del tumor y niveles de oncoproteína
En la actualidad, hay poca información acerca del tamaño mínimo de un
tumor que da lugar a elevaciones séricas de oncoproteínas. Sin embargo,
hay indicadores de que pequeñas lesiones pueden dar lugar a niveles signi-
ficativos de ciertas oncoproteinas. Primero, en un número significativo de pa-
cientes con factores de nesgo conocidos para el cáncer, las oncoproteínas
se descubrieron en su suero antes del desarrollo de un cáncer detectable.
Asi. en pacientes con asbestosis. el ECD de la proteína p185 erbB se elevó
antes del diagnóstico de los tumores pulmonares. La sobreexpresión del ECD
p185 se produjo en un número de pacientes antes del desarrollo de un cán-
cer de mama. Los pacientes orientales que tenian niveles séricos elevados de
pl 85 ECD desarrollaron después carcinomas hepalocelulares. Los pacientes
con neumoconiosis resultaron tener niveles elevados de pl 85 ECD yo prote-
ina p121 y desarrollaron posteriormente carcinomas pulmonares. Se descu-
brieron proteínas mulantes (Asp13-) p21 en el suero de un porcentaje muy
elevado de pacientes con exposición al cloruro de vinilo que. nuevamente,
desarrollaron después angiosarcomas. Los anticuerpos anti-p53 se encontra-
ron en el suero de individuos que posteriormente desarrollaron angiosarco-
mas o cánceres de pulmón. Todos estos estudios sugieren que lesiones
malignas que son indetectables por técnicas convencionales pueden detec-
tarse midiendo los niveles séricos de oncoproteinas. en especial en pacientes
con exposición conocida o (actores de riesgo de desarrollar un cáncer.
Segundo, parece existir una buena correlación en algunos pacientes entre
los niveles séricos de marcadores oncoproteinicos y el tamaño del tumor y/o
el nivel de expresión del marcador en el propio tejido tumoral. A este respec
to, algunos adenomas pequeños (menores de 1 cm) han resultado dar lugar
a niveles elevados de p185 ECD o ras-p21 en el suero de estos pacientes.
Tanto para la proteina ras-p21 como para erb8-2-p185 ECD, existe una exce-
lente correlación entre los niveles séricos de estos marcadores y el estado clí-
nico pre y poslratamiento del paciente. Aun asi. quedan por realizar estudios
de correlación entre el tamaño del tumor y los niveles séricos de oncoproteí-
nas. Un factor de confusión puede ser que un tumor pequeño puede produ-
cir grandes cantidades del marcador, mientras que tumores de mayor tamaño
pueden producir cantidades más pequeñas.
A este respecto, las oncoproteínas se elevan en una alta proporción de car-
cinomas in situ. como lo manifiestan los niveles séricos elevados de proteina
neu p185 en el cáncer de mama incipiente y del NMP22 en el carcinoma in situ
de la vejiga. De forma peculiar, los niveles séricos de la oncoproteína neu están
elevados en números más pequeños de cánceres de mama en fases I y II.
A pesar de las advertencias anteriores sobre la interpretación de las eleva-
ciones de los niveles séricos de oncoproteínas o de la detección de formas
anómalas de estas proteínas en el suero y de la necesidad de realizar más
estudios de correlación, los análisis de la presencia de oncoproteinas en el
suero muestran unas excepcionales posibilidades para la detección de tumo-
res malignos en una fase precoz y para el control de su progresión, respues-
ta al tratamiento, remisión y recidiva.
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Técnicas moleculares en el diagnóstico
de neoplasias hematopoyéiicas
David S. Viswanatha, M.D.
Richard S. Larson, M.D., Ph.D.
PERSPECTIVA HISTÓRICA 1355
TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS
EN EL DIAGNÓSTICO DE LEUCEMIA 1356
Leucemia mieloide crónica
Leucemia linfobláslica aguda
Leucemia mieloide aguda
TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS
EN EL DIAGNÓSTICO DE LINFOMAS 1359
Bases para el análisis molecular genético en los
trastornos linfoides
Análisis de la reorganización genética de los
receptores antigénicos para la determinación
de la clonalidad
Significado y detección molecular de traslocaciones
comunes cromosómicas asociadas
al linfoma
PERSPECTIVA HISTÓRICA
Las técnicas utilizadas en el diagnóstico de neoplasias hematolinfoides com-
prenden la valoración morfológica, tinciones citoquimicas. análisis de citometria
de flujo y análisis cariotipico. Aunque no todas estas técnicas son necesarias en
cada uno de los casos, el uso adecuado de estas tecnologías ha dado lugar a
una mejora en la precisión diagnóstica. Aún asi. recientemente se han desarro-
llado técnicas moleculares más sensibles que pueden detectar alteraciones
genéticas en las células leucémicas y del linfoma, proporcionando una especi-
ficidad y sensibilidad aún mayores en el diagnóstico. Estas técnicas en continua
mejoría han hecho que se comprenda la amplia heterogeneidad clínica y bioló-
gica de las neoplasias hematopoyéticas tales como leucemias y linlomas. Ade-
más, una gran selección de agentes quimioterapéuticos. así como el trasplante
de médula ósea, están ahora disponibles para el tratamiento de las leucemias
y los Imfomas A la vista de una mayor comprensión de la diversidad clínica y
biológica de estas neoplasias junto con mayores opciones terapéuticas, la se-
lección de la terapia óptima y el momento de administrarla pueden ser compli-
cados. Sin embargo, estudios recientes que utilizan estas nuevas tecnologías
moleculares han empezado a solucionar este dilema.
El análisis de los tumores hematopoyéticos en busca de la presencia de
traslocaciones de los cromosomas se ha limitado siempre a técnicas menos
sensibles y que consumen más tiempo, como las técnicas citogenéticas y de
Southern Blot. Los análisis basados en la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) del ácido desoxiribonucleico (ADN) se desarrollaron originalmente
como una alternativa, y han aumentado de forma drástica la sensibilidad de
detección proporcionando una amplificación exponencial de fragmentos de
ADN. Estas técnicas ADN-PCR se han adaptado a los tejidos tanto frescos
CAPÍTULO 65
USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA
EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL 1367
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN EL DIAGNÓSTICO
Y CONTROL DE LOS TUMORES MALIGNOS
HEMATOLINFOIDES 1368
BIBLIOGRAFÍA 1368
como fijados con parafina. De esta forma, se pueden detectar inmunoglobu-
linas y redisposiciones de genes de los receptores de células T y algunas
traslocaciones cromosómicas en las células de linfoma. Sin embargo, la ma-
yoría de las traslocaciones cromosómicas de las células leucémicas no se
pudieron delectar inicialmente utilizando esta técnica debido a las grandes
distancias genómicas a lo largo de las cuales se producen los puntos de rotu-
ra de los cromosomas. La llegada de la reacción de la transcnptasa inversa
de polimerasa en cadena (RT-PCR) ha permitido la detección de fragmentos
de ácido ribonucleico (ARN). Asi. los productos de fusión del ARNm transcri-
bidos desde las traslocaciones cromosómicas pueden ahora detectarse en
tejidos no fijados. Actualmente la RT-PCR se usa de forma sistemática para
detectar un gran número de traslocaciones en la leucemia linfobláslica y mie-
loblástica aguda.
Las técnicas moleculares tienen una importante función en la valoración
diagnóstica de los pacientes con neoplasias hematopoyéticas. Estas tecno-
logías comprenden el análisis medíanle Southern Blot y métodos basados
en PCR para detectar traslocaciones cromosómicas específicas. Estas téc-
nicas proporcionan una mayor sensibilidad diagnóstica y tienen unas impli-
caciones pronosticas y terapéuticas esenciales. Este capitulo trata las téc-
nicas moleculares diagnósticas que tienen utilidad clínica en el diagnóstico
de Imloma y leucemia. Un punto importante que no se puede enfatizar en
exceso en la interpretación de los estudios moleculares es que el análisis
de las pruebas moleculares, en un grado muy elevado, es un arte de mor-
fología. La interpretación exacta y completa de los resultados moleculares
se hace mejor en el contexto de los hallazgos histológicos (esto es. cuanto
más se sabe acerca de la morfología de las células, el contexto clínico y
otros estudios complementarios, menos probable es que se cometa un
error).
 1356 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS
EN EL DIAGNÓSTICO DE LEUCEMIA
Las leucemias agudas y crónicas representan expansiones clónales de
precursores de células neoplásicas. Las leucemias agudas se dividen en dos
grupos principales de acuerdo con una limitada diferenciación linfocitaria o
mieloide de las células precursoras: leucemia aguda linfoblástica (LAL) y leu-
cemia aguda mieloblástica (LAM). También existen la leucemia linfocítica cró-
nica (LLC) y la leucemia mieloide crónica (LMC). Dado que las características
biológicas, diagnósticas y clínicas de la LLC se superponen con los linfomas
Imfocilicos de células pequeñas, la utilidad de las técnicas de diagnóstico
molecular en casos de LLC se tratan en la sección de linfomas.
La presencia de traslocaciones cromosómicas especificas y no aleatorias
en la leucemia aguda y crónica es importante para el diagnóstico y el pro-
nóstico (Rubnitz. 1999: Melnick. 1999: Morgan. 1998: Larson. 1996). Las téc-
nicas de diagnóstico molecular se usan sobre lodo para detectar estas tras-
locaciones en muestras diagnósticas y para la detección de enfermedad
residual mínima (Tablas 65-1 y 65-2). A diferencia de muchas de las traslo-
caciones cromosómicas de los linfomas. las regiones de rotura entre dos
genes que se transponen son grandes. Esta diferencia impide el uso de téc-
nicas de PCR basadas en el ADN para la detección de estas traslocaciones
en la mayoría de los casos de leucemia. Una excepción notable a esta regla
son las técnicas de ADN-PCR de larga distancia que ya se han descrito,
pero que todavía no se usan de forma sistemática en los laboratorios diag-
nósticos. Aun asi, en la mayoría de los casos de leucemia con traslocacio-
nes cromosómicas, se lorma un ARNm de transcripción quimérico que se
puede detectar mediante RT-PCR. Como el ARN no es por lo general esta-
ble en tejidos lijados con paralina, la RT-PCR se lleva a cabo en tejido fres-
co y no fijado.
Leucemia mieloide crónica
Diagnóstico
La LMC es un trastorno clonal de las células madre que se caracteriza por
una proliferación aumentada de elementos mieloides en todas las fases de dife-
renciación. El diagnóstico de LMC se basa en el examen microscópico de un
frolis de sangre periférica y de la biopsia de médula. La documentación de una
traslocación característica entre los cromosomas 9 y 22. t(9:22) (p34.l :q11.21)
(cromosoma Filadelfia [Ph]) confirma el diagnóstico. La traslocación recíproca
coloca el proto-oncogén ABL en el cromosoma 9 y próximo al gen BCR en el
cromosoma 22 (Figura 65-1 A) (Kurzrock, 1988: First International Workshop.
1978; Heislerkamp, 1988:Tymmons. 1989; Chissoe. 1995: Papayannopoulou.
1977). Esta alteración genética da lugar a la formación de una proteina quimé-
rica. BCR-ABL. El producto de la fusión se expresa por lo general como una
proteina quimérica de un peso molecular de 210.000 Da (p210) (Wada, 1995:
Guo, 1991: Gorska-Flipol. 1990). P210 actúa liberando los controles de la pro-
liferación de células madre o bloqueando la muerte celular programada, de
forma que conduce a la proliferación de este clon. Más recientemente se han
descrito puntos de rotura adicionales BCR-ABL y nuevas proteínas de fusión
(Wada. 1995). En una pequeña proporción de pacientes con LMC. también se
ha visto que se producen traslocaciones complejas, en las que participan de
forma universal el cromosoma 22 y. por lo general, el cromosoma 9 (Champlin.
1985; Bernstein, 1999: Kurzrock. 1988: First International Workshop. 1978). El
conocimiento de estos últimos hallazgos es crítico para la interpretación de las
pruebas moleculares para la presencia de t(9:22) (McCIure. 1994).
Los pacientes con LMC y con un cromosoma Ph clásico demostrable me-
diante citogenética tienen una fusión molecular de los genes BCR-ABL. Esta
traslocación cromosómica puede también ponerse de manifiesto mediante
análisis Southern Blot (Kurzrock. 1988) o bien detectarse el producto de la
transcripción del ARNm de fusión mediante RT-PCR (Milelman. 1993).
Aunque el Soulhem Blot y RT-PCR pueden no detectar traslocaciones com-
plejas, Southern Blot detecta una traslocación en una pequeña minoría de
casos de LMC descritos como falsos negativos utilizando técnicas citogenéti-
cas (Kantarjian. 1990: Martiat. 1991). Las características clínicas y hematoló-
gicas de esta pequeña cohorte de casos que son falsamente normales desde
el punto de vista del cariolipo. pero que tienen redisposiciones BCR detecta-
das mediante Southern Blot. son comparables con los casos que tienen unos
cromosomas Ph muy claros en el cariolipo. Utilizando tanto técnicas molecu-
lares como cilogenéticas. se puede poner de manifiesto Ph en un 99% de los
casos. El 1% restante ha sido llamado LMC Ph (-) o alípica por algunos auto-
res. Sin embargo, es probable que represente otro tipo de trastorno mielo-
proliferativo crónico, de manera que no es sorprendente que tengan un com-
portamiento más agresivo que LMC.
RT-PCR detecta productos de diferente longitud que responden a proteínas
quiméricas BCR-ABL de 190 kDa. 210 kDa y 230 kDa (Figura 65-1/4) (Kurz-
rock, 1978: Wada. 1995: Guo. 1991) Gorska-Flipot, 1990). Los puntos de rotu-
ra detectados medíante RT-PCR pueden ser útiles para distinguir LAL. LMC.
LAM y la leucemia neutrofílica crónica (véase más adelante en Leucemia lin-
foblástica aguda y Leucemia mieloide crónica). En la gran mayoría de LMC de
adultos y prácticamente todos los casos de los niños, está presente un pro-
ducto de fusión p210 (Figura 65-1A 6). Los casos de LAL Ph (+) se asocian
con la proteína p190. aunque se han descrito casos raros de LMC y LAM con
la proteína de fusión más pequeña. En casos de leucemia neutrófila crónica
está presente una gran proteína de fusión p230. La p230 se ha comunicado
también en casos de LMC, pero la revisión retrospectiva de estos casos su-
giere que pueden en realidad ser CNL.
Hay también dos tipos de transcripción p210. b2a2 y b3a2 (Shtalid. 1988:
Kurzrock. 1990). Aunque las diferencias definitivas pronosticas entre estos
grupos son controvertidas, los pacientes con transcripción b3a2 son más pro-
pensos a tener recuentos plaquetanos elevados. Además, la frecuencia rela-
tiva de b2a2 y b3a2 es diferente en la LMC de la niñez y de la vida adulta,
teniendo b3a2 dos tercios de los adultos y teniendo transcripciones de b2a2
una abrumadora mayoría de niños con LMC.
Detección de la progresión de la enfermedad en la LMC
La progresión de la LMC a la fase acelerada o blástica (esto es. lase ter-
minal) se asocia con la adquisición de anomalías adicionales genéticas y
cromosómicas (Mitelman, 1993: Morris. 1990: Serra. 1993). La inestabilidad
cromosómica del clon maligno es una característica fundamental de la pro-
gresión de la enfermedad en la LMC. El t(9:22) sigue siendo la única anoma-
lía de los cromosomas durante la fase crónica, y su expresión continúa duran-
te la crisis blástica. Sin embargo, del 70% al 80% de los pacientes desarrollan
anomalías cromosómicas adicionales. A veces, estas anomalías de los cro-
mosomas se pueden detectar en el tejido extramedular antes de las manifes-
taciones clínicas y hematológicas de la crisis blástica. Los cambios cromosó-
micos secundarios se han comunicado en más de 1.500 pacientes con LMC.
Aunque no existe una única vía a la progresión, la anomalía cromosómica
adquirida más común es la adquisición de otro cromosoma Ph. Las anomalí-
as que afectan a los cromosomas 8.17.19 y 22 son las siguientes más comu-
nes afectadas en la progresión de la enfermedad
Dos pruebas moleculares que delectan el tamaño o cantidad del producto
de la transcripción del ARNm BCR-ABL pueden ser útiles para evaluar la trans-
formación de LMC: la PCR cuantitativa y el tamaño del producto del gen BCR-
ABL (Serra. 1993; Lion, 1994: Preudhomme. 1999). Se han detectado dos
tamaños de proleina de lusión BCR-ABL que corresponden a proteínas con
pesos moleculares de 190 kDa y 210 kDa. Por lo general, los casos de trans-
formación blástica en la LMC expresan la forma de 210 kDa. mientras que los
nuevos casos de LAL con un cromosoma Ph expresan la forma de 190 kDa.
Debido a que algunos casos de transformación blástica de LMC se presentan
sm una fase crónica previamente diagnosticada, la LMC subyacente se suge-
rirá por la presencia de un producto p210. Además, la presencia de una forma
de 190 kDa en conjunción con un producto de 210 kDa sugieren la evolución
a una fase terminal. Aunque éste puede ser el caso, se pueden también gene-
rar niveles bajos de productos p190 por medio de una rotura alternativa de la
fusión de transcripción p210. y no indica de forma universal una transforma-
ción. En estos casos es crítica la correlación morfológica. La cantidad de men-
saje BCR-ABL se puede determinar mediante PCR cuantitativa. Aunque no se
utiliza mucho, esta prueba puede semi-cuantificar el nivel de transcripción de
ARNm BCR-ABL en pacientes con LMC. Aunque el nivel absoluto no es pre-
dictivo de una transformación, un aumento desde unos niveles básales pre-
viamente documentados para ese paciente puede predecir una inminente
transformación, por lo general en el plazo de seis meses.
 CAPÍTUIO 65 • TÉCNICAS MOLECULARES EN El DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS 1357

Cromosoma 9 Cromosoma 22 1(^:22) (q34;qll)

Q
i

Figura 65-1. A. Esquema de una fusión que afecta a los genes BCR y ABL. El pa-
nel superior muestra el fenómeno de traslocaoón de cromosomas t(9:22) (q34; ql 1).
que dan lugar a la formación de un gen de fusión BCR-ABL en el cromosoma 22q.
El panel inferior muestra la estructura molecular del oncogén BCR-ABL. la trans-
cripción quimérica del ARNm y la proteina de fusión bcr-abl. El tipo de fusión-rotu-
ra que se muestra (una región principal de rotura de BCR) se encuentra en la leu-
cemia mieloide crónica y en un subconjunto de leucemias linfoblásticas agudas con
positividad para el cromosoma Filadeltia. Como resultado de la fusión genética, el
híbrido de transcripción BCR-ABL contiene secuencias BCR 5 unidas a casi toda
la región que codifica la tirosina cinasa ABL. En este caso, se forma una proteína
BCR-ABL de 210 kDa con una sobreactividad constitutiva de tirosina cinasa. El
comportamiento aberrante de esta proteína híbrida parece contribuir a la génesis
de la leucemia induciendo una transducción de señal mitogénica no supervisada.
8. Análisis RT-PCR para detección de la fusión BCR-ABL Blot representativo de
productos PCR Después del aislamiento del ARN. se realizó una RT-PCR utili-
zando cebadores de oligonucleótidos que cubren la unión de fusión de la región
principal de roturas (MBR). Los productos PCR se transfirieron a una membrana de
nylon y se detectaron en esta situación con una oligosonda especifica de la unión
b3-a2. En las calles A, C y D: muestras de pacientes positivas para la fusión BCR-
ABL b3-a2: en las calles B y E: muestras de pacientes negativas para la fusión;
calle "—" : células control negativas: calle V : células positivas control para la
fusión b3-a2: calle Bl': control nulo (sin ARN).

Enfermedad residual y recidiva
después de la terapia
RT-PCR se ha aplicado también a la detección de enfermedad residual míni-
ma (MRD) (Tabla 65-1) (Siever. 1995). RT-PCR amplifica el ARNm quimérico
formado por la traslocación enlre el cromosoma 9 y 22 en la LMC. El produc-
to amplificado da lugar a una banda específica en la electroforesis en gel de
poliacrilamida o agarosa. La sensibilidad puede aumentarse aun más median
le análisis Southern Blot del gel utilizando una sonda de oligonucleótidos.
RT-PCR se puede hacer como una técnica de fase única o de incubación, ofre-
ciendo cada una ciertas ventajas frente al análisis cariotipico o el análisis Sou-
thern Blot. La PCR de fase única permite la detección de entre una de cada
10- a 10 células. La RT-PCR 'anidada' permite la detección de entre una de
5 r
cada 10 a 10 células. Ambos tipos de RT-PCR son especilicas. relativamen-
te baratas, útiles fuera del contexto de la investigación y rápidas, estando dis-
ponibles los geles entre 24 y 48 horas después de la obtención del espécimen.
 1358 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR

Tabla 65-1 C o m p a r a c i ó n de los m é t o d o s P C R para la seis meses que siguen a un trasplante son difíciles de interpretar por varias
identificación de leucemia residual razones. Se pueden obtener falsos negativos debido a la escasez o "parchea-
1 do" del material celular, y algunos pacientes tienen resultados positivos que
Anomalía
Ventajas Desventajas desaparecen después de seis meses.
cromosomica
1(15:17) La detección se
Leucemia linfoblástica aguda
correlaciona con
la recaída
RT-PCR para t(1;19) (q23;p13)
Supervivencia
prolongada en Se ha observado que las traslocaciones cromosómicas no aleatorias adqui-
pruebas negativas ridas que se asocian con las leucemias humanas son marcadores fiables de
t(8:21) No es prediclora
células leucémicas. En la leucemia linfoblástica aguda, las más comunes son
de recaída a menos que
sea cuantitativa t(1:19) (q23:p13) y t(12;21) (Tabla 65-2) (Amylon, 1997; Rubmtz, 1997; Privi-
inv(16) Se desconoce si predice tera. 1996; Hunger, 1998). El uso de la RT-PCR en casos de LAL con estas
la recaída traslocaciones puede proporcionar una información pronostica critica, así co-
Anomalías Se desconoce si predice mo el descubrimiento de enfermedad residual mínima.
11q23 la recaída
La t(1:19) Iq23:p13) es una traslocación frecuente en la LAL infantil (Hun-
t(9;22) La detección tardía La detección precoz
después de un cierto (<6 meses) no ger, 1998: Privítera. 1996.1994). Esta traslocación se produce en el 5% al 6%
periodo de tiempo se se correlaciona con de todas las LAL infantiles, pero también se produce en aproximadamente un
correlaciona con el la recaída de la LMC 25% de casos pre-B (positiva para inmunoglobulinas citoplásmicas). En gene-
riesgo de recaída ral, la 1(1:19) conduce a la fusión de E2A. y el gen que codifica la proteína
en la LMC hélice-asa-hélice (HLH) en el cromosoma 19. con PBX1. un "homeobox" que
t(i;i9) No predice la recaída a
contiene el gen en el cromosoma uno. El híbrido E2A-PBX-lse expresa como
menos que sea
cuantitativa un conjunto de proteínas quiméricas oncogénicas. En la mayoría de los
I(12;21) La detección se casos, los puntos de rotura genómicos de t( 1:19) se producen en un intrón
correlaciona con único de E2A y PBX1. dando lugar a ARNm quiméricos transcritos que mues-
el nesgo de recaída tran un punto de unión uniforme. La presencia de este punto de unión unifor-
TCR-/ Se desconoce si me permite la detección de la mayoría de los casos de LAL con t(1:l9) me-
igH predice la recaída
diante RT-PCR.
La t(1:19) se ha asociado con un mal pronóstico clínico, aunque la quimio-
RT-PCR tiene limitaciones en la LMC (Dhingra. 1992). La extrema sensibi- terapia intensificada parece ser eficaz para anular su impacto pronóstico ad-
lidad del método crea una cierta tasa de falsos positivos, sobre todo debido al verso, Por tanto, la detección de t(1 ;19) en un caso de LAL de estirpe B tiene
arrastre de productos de reacciones previas a las nuevas muestras. La tasa importancia pronostica y lerapéulica. A pesar de su importancia en los espe-
de falsos positivos es normalmente más alta con la RT-PCR "anidada" en rela- címenes diagnósticos, el análisis medíante PCR no cuantitativa para enfer-
ción con la de fase simple debido a la mayor sensibilidad de la RT-PCR ani- medad residual mínima al término del tratamiento de consolidación no pare-
dada. Además, los controles negativos son críticos en ambos tipos de análi- ce ser de valor clínico o pronóstico, debido a que no hay diferencia en la
sis RT-PCR. Los falsos negativos producidos por la degradación del ARN se supervivencia libre de incidencias de los casos positivos o negativos para
pueden excluir utilizando una secuencia control de ARNm en paralelo. Ade- PCR de las LAL en remisión (Tablas 65-1 y 65-2).
más, una pequeña minoría de los casos tienen puntos de rotura complejos
(<5%), dando lugar a falsos resultados negativos en la RT-PCR. Las técnicas
de PCR y de Southern Blot parecen tener una sensibilidad similar frente a lo- RT-PCR para t(12;21)
calizaciones atipicas de rotura: sin embargo, el análisis cariotípico probable- Investigaciones recientes han demostrado que una t(12;21) es la trasloca-
mente detecte estas traslocaciones poco habituales. ción cromosómica más frecuente en la LAL infantil, produciéndose en el 25%
Un alto riesgo de recidiva se ve anunciado por un RT-PCR positivo duran- de todos los casos (Rubnitz. 1997; Amylon. 1997;Hoshino. 1997: Uphofl, 1997).
te más de seis meses después de un trasplante de médula ósea (Hughes, Esta traslocación es "críptica", queriendo decir que por lo general no se detec-
1991; Van Rhee, 1994: Xu. 1994). Los resultados positivos o negativos en los ta mediante técnicas citogenéticas. pero que se detecta con frecuencia me-

Tabla 65-2 Traslocaciones recurrentes c o m u n e s y

Gen
Traslocación Enfermedad Mecanismo Detección Frecuencia (%) Sensibilidad"
de fusión
4
t(15;17)(q24;q22) LAM-M3 PML-RARct Proteina quimérica RT-PCR 5 1/10M0
I(8;21)(q22;q22) LAM-M2 AML l-ETO Proteína quimérica RT-PCR 10-15 VIOMO 6

invl6(p13;q22)o LAM-M4EO CBFji-MYH 1! Proteína quimérica RT-PCR SBH 10 1/10 -10 a ;

t(16;16)(p13;q22)
I(9;22)(q34.q11) LAL Ph' adulta y BCR-ABL Sobreexpresión RT-PCR SBH 20 (adulto) 1/W-10'
pediátrica de oncogén 5 (pediátrico)
t(1;19)(q23:p13.3) LAL pre-B pediátrica E2A-PBX1 Proteina quimérica RT-PCR. SBH 5 1/1OM0 f

t(12;21)(p13;q22) LAL pre-B pediátrica TEL-AML I Proteína quimérica RT-PCR 20-25 1/10 4

I(4;11)(q21:q23) LAL pre-B pediátrica MLL-AF4 Proteína quimérica RT-PCR. SBH 3-4' 1/10 4

("estirpe mixta")
Otras traslocaciones LAL. LAM y LAM MLUoliOS Proteína quimérica RT-PCR, SBH Variable' 1/10'
11(q23) secundaria adultas
y pediátricas
" "Sensibilidad", tal como se menciona, refleja el método de detección más sensible (por ejemplo. PCR).
' Casi un 80% de las LAL inlantiles.
!
Variable: el porcentaje depende del subtipo de leucemia
. !
 C A P Í T U L O 65 • TÉCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
diante RT-PCR. El 1(12:21) da lugar a una fusión en el dominio HLH del gen
TEL a los dominios de Iransactivación y unión al ADN del gen AML /. El gen TEL
es un miembro de la familia recientemente descrita ETS de factores de trans-
cripción, y el gen AML1 codifica la subunidad de unión al ADN (CBFot) del
complejo de transcripción del tactor de unión al "core". El gen TEL participa
también en otras traslocaciones poco habituales, incluyendo t(5;12). t(9;l2),
t(10;12) y t(12;22), que se encuentra sobre todo en trastornos mielodisplási-
cos y mieloprolilerativos. A diferencia de ello, el complejo del factor de
unión al core AML1 'CDFji es el objetivo más frecuente de las traslocacio-
nes cromosómicas en los casos nuevos de LAM. estando alterado en t(8:21)
e inv(16) en hasta un 30% de los casos. La función de la oncoproteína
TEUAML1 sigue siendo desconocida, pero datos recientes sugieren que
altera directamente la actividad transcripcional de AML1. necesaria para
una hematopoyesis normal.
Los estudios iniciales han indicado que la presencia de esta traslocación
identifica un subgrupo clínicamente diferente con un pronóstico favorable a
pesar de la ausencia de hiperploidia en estos pacientes (Tablas 65-1 y 65-
2) Cuando se estratifica de acuerdo con la edad, recuento leucocilario. cla-
sificación de riesgo y régimen terapéutico, los pacientes con redisposicio-
nes TEL tienen un pronóstico significativamente mejor que aquellos con una
línea germinal TEL. De hecho, el poder predictivo de la redisposición TEL
en la LAL pediátrica excede a todos los demás lactores de valoración de
riesgo. Las bases biológicas o moleculares para el buen pronóstico son des-
conocidas.
Leucemia mieloide aguda
Se ha utilizado RT-PCR en la LAM para la detección de anomalías 1(15:17),
1(8:21). inv(16). y Hq23 ¡Tablas 65-1 y 65-2). Los análisis basados en RT
PCR en la LAM tienen las mismas ventajas y limitaciones técnicas que en el
LMC: sin embargo, es importante evitar la tentación de aplicar los resultados
de un análisis especifico al grupo heterogéneo de la LAM como todo. La
importancia clínica de cada prueba debe determinarse individualmente como
se explica más adelante.
La característica traslocación tí 15:17) (q22:p21) está presente en casi to-
dos los pacientes con leucemia promielocítica aguda (sistema de clasificación
de leucemias franco-americano-británico [FAB] M3 LAM), constituyendo del
5% al 10% de todas las LAM (Miller. 1992). La traslocación entre un receptor
de ácido retinoico (RAR-a) en el cromosoma 17 con el gen de la leucemia
promielocítica (pml) en el cromosoma 15 da lugar en última instancia a una
proteina de fusión PMLRAR-rx. La proteina quimérica contribuye de forma
aparente a la génesis de la leucemia inhibiendo la diferenciación o promo-
viendo la supervivencia celular mediante la inhibición de la apoptosis. Los
análisis RT-PCR persistentemente positivos tienen una relación directa con la
recaída, distinguiendo a un pequeño grupo de pacientes en los que la recaí-
da es casi segura (RT-PCR-posilivos) de un grupo más grande en los que la
recidiva es poco probable (RT-PCR-negativos). Además, las pruebas a inter-
valos probablemente disminuyan los resultados clínicos ambiguos del grupo
negativo al identificar pacientes propensos a recaer antes de la aparición de
una enfermedad manifiesta.
La t(8;21) (q22;q22) se observa en el 6% al 18% de las LAM, con mayor
frecuencia en la LAM FAB-M2 (Nucifora, 1993a; Chang, 1993: Nucifora,
1993b) A diferencia de t(9;22) y t( 15:17). los investigadores han detectado de
forma persistente y repetitiva esta traslocación en pacientes con remisión de
larga duración. Así, a diferencia de p(15;17), en la LAM FAB-M2 la detección
de t(8:21) no predice una recidiva inminente; sin embargo, dado que la detec-
ción de la traslocación implica un peor pronóstico y probablemente un abor-
daje terapéutico diferente, el uso de la RT-PCR en la LAM (FAB-M2) es una
posible alternativa al análisis citogenético en el momento del diagnóstico y
terapia inicial.
La inv(16) (p13q22) está presente en el 2% al 8% de las AMP pediátricas,
con mayor frecuencia en asociación con una leucemia clasificada morfológi-
camente como FAB-M4Eo (Liu. 1993: Claxton, 1994). Las anomalías 11q23.
incluyendo t(4;11) son también comunes en LAM y en la LAL pediátricas (Ya-
mamoto, 1994). Inv(16) es un hallazgo favorable en la LAM. 1lq23 tiene un
mal pronóstico en la leucemia pediátrica y en la LAM secundaria del adulto.
La utilidad de 1lq23 y de inv(16) en la MRD no está bien estudiada hasta la
fecha.
1359
TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS
EN EL DIAGNÓSTICO DE LINFOMAS
Bases para el análisis genético molecular
en los trastornos linfoides
Los linfomas no-Hodgkin (LNH) y las leucemias linfáticas crónicas consti-
tuyen una enfermedad maligna relativamente común enlre los adultos, y la
incidencia de estos trastornos va en aumento (Ries. 1994). El abordaje ana-
tomopatólogo tradicional para el diagnóstico de LNH comprende el recono-
cimiento de las características células tumorales con microscopio óptico, por
lo general suplementado mediante estudios con marcadores inmunofenotípi-
cos. La aplicación de métodos de fenotipado cada vez más sofisticados, in-
cluyendo la citometría de flujo y la inmunoperoxidasa. ha mejorado de lorma
considerable nuestra precision diagnóstica y nuestra capacidad para subcla-
sificar los tumores linfoides. Un paradigma central en el diagnostico del linfo-
ma es la demostración de la clonalidad. que está relacionada con el estado
maligno. De nuevo, en muchos casos, la clonalidad se puede sugerir o esta-
blecer con ayuda de estudios de inmunofenotipado. mediante la demostración
de restricción de cadenas ligeras en el caso de las neoplasias de células B o
mediante expresión de antígenos aberrantes en la proliferación de células T.
Sin embargo, hay varios casos en los que los análisis previos pueden ser
insuficientes y la determinación de la clonalidad linfoide sigue siendo un méto-
do diagnóstico clave. En este contexto, la valoración molecular de las redis-
posiciones genéticas de los receptores clónales de antigenos ha sido extre-
madamente valiosa en ciedas situaciones técnicas, como muestras con
características fenotípicas poco definidas, biopsias tisulares pequeñas y teji-
dos impregnados con parafma. Los métodos habituales de detección de clo-
nalidad se emplean también ocasionalmente para distinguir los linternas de
células grandes de la enfermedad de Hodgkm. para asignar lineas celulares
en tumores hematopoyéticos no diferenciados (esto es. de células B frente a
células T) y para ayudar de forma general en el diagnóstico de los trastornos
linfoproliferativos de células T. Además, la determinación molecular de la clo-
nalidad es a menudo necesaria para resolver el diagnóstico definitivo de neo-
plasias linfoides con características que potencialmente se parecen a las
hyperplasias benignas (por ejemplo, linternas centrofoliculares. linfomas de ti-
po "MALT" y leucemia linfática de células T granulares grandes)
La identificación de anomalías recurrentes, genéticas y no aleatorias de
los linfomas, producidas la mayoría de las veces por fenómenos de traslo-
cación cromosómica. ha proporcionado otro conjunto adicional de herra-
mientas diagnósticas y perspectivas biológicas nuevas Los datos citogené-
ticos y de genética molecular de esta clase forman ahora una parle integral
de las clasificaciones actuales de los linternas (Hams. 1994). La correlación
de redistribuciones genéticas específicas con subtipos particulares de linte-
rna proporcionan no solamente unos marcadores moleculares alternativos
para la determinación de la clonalidad, sino que, de forma más significativa,
ayudan a clasificar de forma precisa la enfermedad. Según sigue aumentan-
do nuestro conocimiento de la biología de los linternas, el reconocimiento de
entidades específicas basadas en criterios genéticos moleculares probable-
mente lorme una faceta integral de los tralamientos "dirigidos al tumor".
La sección que sigue delalla los abordajes moleculares a la determinación
de la clonalidad de células B y T. la detección y significado de las traslocacio-
nes comunes recurrentes en los linfomas y la aplicación de técnicas molecu-
lares al seguimiento postratamiento de enfermedad mínima.
Análisis de las reorganizaciones de los genes
receptores de antígenos para la determinación
de la clonalidad
Mecanismo de las reorganizaciones de los genes
receptores de antigenos
Los genes de receptores antigénicos se redistribuyen precozmente en el
desarrollo de los linfocitos B y T en la médula ósea y en el timo, respectiva-
mente. El proceso de redistribución, o recombinación genética, afecta espe-
cialmente a la división y fusión de uno de los numerosos segmentos variables
(V) del gen con un exón de unión (J). En algunos puntos, y notablemente en
 1360 SECCIÓN V I I • PATOLOGÍA MOLECULAR
los receptores |5 de las inmunoglobulinas de cadenas pesadas y células T, se
interpone un segmento de diversidad (D) suplementario de los segmentos V-
y J-. El segmento ensamblado V-J o V-D-J se une después con la región cons-
tante (C) del gen receptor del antígeno para producir una secuencia codifica-
dora intacta capaz de traducirse en una proteína funcional del receptor de
antígenos (Sklar. 1992). Las células inmunes incapaces de producir proteínas
de receptor funcionales se destruyen mediante apoptosis. Para las células B
inmaduras, el gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas del cromo-
soma 14(q32) es el primero en someterse a una redistribución segmentaria,
que se sigue a su vez por el gen K de cadenas ligeras en 2(p12). Si este últi-
mo intento es no productivo en ambos alelos, se selecciona el locus X en
22(q11) (Sklar, 1992). Para las células T, el receptor de las células 8 (T6)
(14(q11)] y y (Ty) [7(p15]) inician este proceso en el timo; sin embargo, mu-
chas de estas redistribuciones de los genes 5 o y fracasan en la producción
de receptores proteínicos funcionales. Así. la redistribución continúa en los
locus TCR a y -p, localizados en los cromosomas 14(q11) y 7(q34). respecti-
vamente, generando un receptor Tctp en una gran mayoría (85% al 90%) de
las células T (Sklar, 1992). Como punto importante en relación con el análisis
molecular (más adelante), prácticamente todas las células maduras Tup si-
guen portando una redistribución del locus genéticos Ty.
Existe una enorme diversidad en los receptores de inmunoglobulinas y cé-
lulas T, que surgen del potencial de recombinación genética entre numerosos
segmentos de genes V-, (D-) y J- en estos puntos. Además, la actividad de la
enzima desoxmucleotidil-transferasa terminal (TdT) añade de forma aleatoria
bases de ácidos nucleicos a las uniones de los segmentos reorganizados de
los genes, aumentando aún más la diversidad de las secuencias. Como resul-
tado de todo este proceso, los linfocitos individuales B y T transportan redis-
tribuciones genéticas peculiares y expresan en su superficie celular molécu-
las inmunes de receptores de antígenos peculiares. En una expansión línfoide
policlonal, existe por lo general una distribución altamente variable de redis-
tribuciones genéticas de receptores antigénicos, mientras que en una pobla-
ción monoclonal es característica una redistribución única e idéntica en cada
célula. Este concepto se explota tanto en la hibridación Southern Blot (SBH)
como en los métodos de PCR. para distinguir las proliferaciones policlonales
("benignas") de las monoclonales ("tumorales").
Técnicas para detectar reorganizaciones de los genes
de receptores antigénicos
Hibridación Southern Blot. Las técnicas SBH se pueden considerar un
abordaje molecular a "gran escala", que comprende una digestión restringida
mediante endonucleasas de una muestra de ADN de alto peso molecular, se-
guida de separación de fragmentos, inmovilización sobre una membrana y de-
tección mediante una sonda radioisotópica específica de uno o más fragmen-
tos objetivo de ADN (relativamente grandes) (Willman. 1990; Cossman. 1988).
Esta técnica se describe con detalle en el Capítulo 59. De forma resumida, y
para una región estructuralmente no alterada (no reorganizada) del ADN obje-
tivo, el análisis por hibridación Southern mostrará un cierto patrón de tamaños
de fragmentos o de bandas, una configuración de línea germinal, basada en la
distribución de determinados puntos de restricción enzimática dentro del locus
en cuestión. Si esta región del ADN se redistribuye, como en el caso de los lo-
cus de receptores antigénicos de las células B y T, se producirá un patrón de
bandas diferente (como resultado de los cambios en las localizaciones en los
puntos de restricción enzimática de linea germinal), y estos cambios se pue-
den reconocer con facilidad mediante hibridación con una sonda especifica. La
sensibilidad de SBH es tal que por lo menos un 5% de una población de célu-
las deben contener la misma redistribución de linea no germinal para poder
detectarse. En una población linlocitaria policlonal, las células individuales D o
T son portadoras de redistribuciones peculiares de sus genes de receptores
antigénicos, y teóricamente se debería esperar que generen una "escalera" o
amplia distribución de las redistribuciones cuando se analiza mediante SBH y
con sondas adecuadas. Sin embargo, y en la práctica, en las proliferaciones
policlonales no se ve este patrón de redistribución, dado que incluso grupos
expandidos y altamente seleccionados de células línfoides reactivas no cons-
tituyen un 5% de las células totales en estas situaciones. Por contra, cada célu-
la de una población monoclonal contiene una redistribución de los genes re-
ceptores de antígenos idéntica, y la SBH identificará bandas reorganizadas y
claras (lineas no germinales) (Figura 65-24). La aplicación con éxito de las téc-
nicas SBH para detectar clonalidad linfoide depende de varios factores. Prime-
ro, el locus que se está estudiando debe ser anatómicamente favorable para
su estudio medíante digestión enzimática e hibridación con sondas. Ciertos lo-
cus, como el gen Ta, son muy grandes y difíciles de valorar de forma adecua-
da con una buena sensibilidad utilizando un número práctico de digestión enzi-
mática restringida y sondas. Por el contrario, el locus Ty, y tal y como se
explica más adelante, es relativamente pequeño y de diversidad limitada, dan-
do lugar a una escasa especificidad e impidiendo su uso en la SBH. Segundo,
las sondas deben estar disponibles con facilidad para su uso en el diagnóstico
clínico. Las sondas pueden producirse a partir de un fragmento de ADNc (com-
plementario) a la región que nos interesa o mediante clonación genómica. y en
el comercio existen varias de ellas. Por último, el método SBH precisa del uso
de un ADN no degradado, de alio peso molecular y procedente de fuentes (.Bu-
lares frescas o congeladas. Dado que para la digestión enzimática se utiliza
una cantidad uniforme de ADN (por ejemplo, 5 pg), se puede obtener una esti-
mación de la proporción de células clónales o de linea germinal en una mues-
tra dada.
Para la determinación de la clonalidad de células B mediante SBH, se han
utilizado tanto los genes de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas (IgH)
como los de las cadenas ligeras (K, X). El gen IgH se valora frecuentemente
mediante una sonda para la región J (Willman. 1990: Cossman. 1988). La re-
gión J de IgH es altamente informativa, dado que este locus es relativamente
compacto, se define con facilidad mediante digestión enzimática restringida y
siempre participa en los fenómenos de recombinación de las células B. El gen
de las cadenas ligeras ic ha sido también estudiado mediante análisis SBH.
con una sonda de la región J,, aunque una minoría de casos de linfoma
(aquellos con una recolocación de las cadenas ligeras X) pueden ser pasados
por alto debido a una delecíón específica del locus K (Medeiros. 1995). Las
redisposiciones del gen de las cadenas ligeras X puede valorarse con una
sonda de la región constante (C,); sin embargo, este locus es altamente poli-
mórfico con los estudios habituales de restricción enzimálica y los resultados
de las bandas son más difíciles de interpretar (Saueracker, 1992).
El locus (3 de las células T (T,J ha resultado ser el más útil para la delec-
ción de la clonalidad de las células T mediante SBH, y esta región comparte
características estructurales parecidas a las del gen IgH. La complejidad del
locus T se ve aumentada por la presencia de dos regiones D-, J- y C- dispo-
|(
nibles para la recombinación con el gran repertorio de segmentos de la región
V . Sin embargo, dado que las dos regiones C,, son de una secuencia casi
|t
idéntica, las redistribuciones del gen T, se pueden identificar mediante SBH
utilizando una sonda genómica C„ y digestión restrictiva adecuada del ADN
objetivo (Figura 65-2/4) (Medeiros, 1995). Se ha descrito también el uso de
sondas específicas de la región J para detectar clonalidad en el locus T,
|(
(Medeiros. 1995). El locus T-y (T.) es por lo general poco adecuado para el
análisis SBH debido al número relativamente pequeño de segmentos redistri-
buidos de las regiones V y J. Esta capacidad limitada para la recombinación
segmentaria crea un conjunto relativamente pequeño de redistribuciones fun-
cionales del gen T Así, en una población policlonal de células T. el SBH con
r
una sonda de región J, resuelve potencialmente varias bandas prominentes
además de los fragmentos esperados de linea germinal, a diferencia del aná-
lisis SDH del locus T.„ donde los clones reactivos benignos individuales no
pasan por encima del umbral de sensibilidad de detección (Cossman, 1988:
Medeiros, 1995). Esta situación conduce a la posibilidad de lamar errónea-
mente "seudoclonales" a las bandas de los procesos reactivos de células T y,
por el contrario, puede oscurecer la identificación de un auténtico gen mono-
clonal T.. en presencia de células benignas T coexistentes.
Reacción en cadena de polimerasa. Las recombmaciones de los genes
de los receptores de inmunoglobulinas y células T pueden identificarse tam-
bién por métodos PCR. A diferencia de SBH, que detecta alteraciones genó-
mícas estructurales relativamente grandes basándose en cambios en los pun-
tos de restricción enzimática, la PCR está diseñada para amplificar regiones
cortas de ADN correspondientes al área de fusión de segmentos del gen en
los genes recombmados del receptor de antigeno. Bajo condiciones estándar
de PCR. la configuración del gen de receptor de antígenos de línea germinal
se amplifica con una baja eficiencia, o no se amplifica en absoluto, debido a
las áreas de tamaño muy grande intervínientes de ADN entre los puntos de
cebado. Sin embargo, cuando los segmentos codificadores V-, (D-) y J se yux-
taponen en un gen recombinado, la amplificación de la región entre los ceba-
 CAPÍTULO 65 TÉCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS 1361

FR3-JH

Figura 65-2. A. Hibridación Southern Blot en el locus T|i. Se muestra un ganglio linfático benigno (L) ADN de linea germinal piacentana (P) y
un ganglio linfático afectado por un linloma de células T (A). Cada una de las muestras lúe digenda con los enzimas de restricción BamH1 (B),
EcoR1 (E) y Hindlll (H) como se indica. Después de una electroforesis en gel y la transferencia a una membrana de nylon, los fragmentos del
locus especifico T|i de cada digestión se detectan mediante hibridación con una sonda etiquetada de forma radioactiva y expuestos a una placa
radiográfica. Los patrones de bandas de línea germinal (no reorganizados) se presentan para las muestras L y P, y estas bandas se ven tam-
bién en la muestra del linfoma (A). Sin embargo, la muestra del linfoma (A) muestra además dos bandas concretas de línea no germinal, o reor-
ganizadas, tanto en las digestiones Bamhl como Hindlll (flechas). Dado que se utiliza la misma cantidad de ADN en cada canal, se puede esti-
mar la cantidad relativa de enlermedad clonal en la muestra del tumor Obsérvese la tenue banda de linea germinal en la muestra de nodulo
linfático benigno (L) en la digestión BamH1. indicando que aqui se usó una cantidad insuficiente de ADN. B. Esquema de la estructura parcial
del gen IgH y de la estrategia PCR para la detección de la reorganización del gen IgH Se indican las regiones determinantes complementarias
(CDR) y las regiones marco (FR) de la cadena pesada variable Ig funcional. Superpuestas están las regiones V-, D- y J-. ilustrando la relación
de los segmentos codificadores del gen con la estructura variable IgH de la cadena de anticuerpos. El segmento V_ codifica la mayoría de la
región variable en la molécula IgH. incluyendo la tercera región marco (FR-lll). El "CDR III" está formado por la unión de los segmentos indivi-
duales V . D y J y es una región altamente peculiar en la secuencia de cada célula B. La letra "n" indica focos de inserciones nucleótidas no
H H K

contempladas por la enzima TdT durante la recombmación VDJ. Para la detección mediante PCR de la clonalidad. el ob|etivo es CDR III. Con
la mayor frecuencia, esto se consigue mediante el uso de un FR III de consenso y un conjunto de cebadores J„ (y D). Los métodos alternati-
vos pueden incluir cebadores de consenso FR ll-JH (B y D) o una familia de cebadores FRI específicos de secuencia para la región V con un
cebador de consenso JH (A y D). La PCR de amplificación a través de la región de unión peculiar IgH produce una mancha o distribución de
producios en un proceso de células B policlonal. o un producto único de tamaño definido en una población monoclonal. C. Imagen representa-
tiva de la PCR FR lll-JH (CDR III) para la detección de las reorganizaciones del gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulmas (IgH).
Después de la amplificación de IgH CDR III mediante la reacción de polimerasa en cadena, los productos PCR se analizan en un gel de polia-
crilamida y se ven bajo luz UV tras su tinción con bromuro de etidio. Las calles etiquetadas A a C representan muestras de pacientes analiza-
das por duplicado La calle A del paciente muestra una banda claramente resuelta indicando una población monoclonal de células B A dife-
rencia de ello, la calle del paciente C muestra una macha dilusa de productos PCR. acordes con un proceso policlonal de células B La calle
del paciente B no muestra ningún producto de amplificación, indicando una ausencia de población significativa de células B en la muestra En
la última situación, se necesita la amplilicación de un ADN objetivo control interno no relacionado para excluir una mala calidad del ADN. Otras
calles: L. escalera de peso molecular (tamaño): calle *, control positivo de ADN: calle Bl. blanco (sin ADN).
 1362 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
dores ahora muy próximos se lleva a cabo muy fácilmente mediante PCR. Los
locus de más amplio uso para la determinación mediante PCR de la clonali-
dad linloide son los genes IgH y T .;
En la Figura 65-2B se muestra un esquema de la IgH PCR. Se han descrito
varios abordajes para la IgH PCR. La técnica que se aplica con más frecuen-
cia comprende la amplificación a través de la tercera región determinante com-
plementaria (CDR III) del gen reordenado IgH (Segal, 1994; Slack. 1993). El
IgH CDR III está formado por la fusión de los exones V-, D-. y J-. La región del
gen V„ comprende casi 200 segmentos diferentes que se pueden agrupar en
seis familias basándose en similandades de secuencia Las regiones D - y J -
H H
contienen aproximadamente 15 y 6 segmentos del gen, respectivamente. La
recombmación aleatoria de estos segmentos crea asi una diversidad IgH signi-
ficativa, aumentada aún más por la adición de nucleótidos funcionales sin plan-
tilla por la enzima TdT. Como resultado, el CDR III es completamente único en
cualquier célula B dada y puede utilizarse como un potente marcador de clo-
nalidad en las neoplasias de células B. Aunque el CDR III es extremadamente
variable entre los linlocilos B, los métodos de PCR de esta región están sim-
plificados por el uso de cebadores consensuados. El extremo 3 de la región
contigua V№ conocida como la región marco III (FR III). exhibe secuencias
nucleotidicas que están muy conservadas en la mayoría de los segmentos del
gen V . De lorma análoga, cada segmento J contiene regiones de secuencia
H H
idéntica de nucleótidos. Se pueden asi diseñar cebadores complementarios
PCR para FR III y J„ que flanquean el CDR III. En una proliferación policlonal
de células B. pueden esperarse muchos miles de redistribuciones individuales
CDR III. Dado que ninguna de estas poblaciones reactivas están normalmente
presentes por encima del umbral de sensibilidad del análisis PCR (aproxima-
damente un 1%). en la electroforesis con gel se observa un patrón muy débil
de bandas múltiples (Figura 65-2C). En un proceso monoclonal de células B
todas las células son portadoras de un CDR III idéntico que se amplifica de
forma preferencial durante la PCR. dando lugar a una llamativa banda clonal
durante el análisis con gel (Figura 65-2C). De forma ocasional, puede existir
una segunda banda, indicativa de redísposiciones bialélicas de IgH.
El locus T„ aunque no es muy adecuado para SBH. ha sido, sin embargo,
utilizado con éxito para la determinación de clonalidad de células T mediante
PCR (Slack. 1993: Wood. 1994). Las redistribuciones del gen Tyse producen
precozmente en los linfocitos T tímicos en desarrollo, y este evento genético
se retiene, aunque la inmensa mayoría de células T inmaduras continúan reor-
ganizando los locus Ta y T|i, y en última instancia desarrollan un fenotipo Ta(l
de receplor. El locus Ty proporciona así un marcador para valorar la clonalidad
cuando se sospecha una neoplasia de células T. El locus Ty comprende once
segmentos que codifican la región V, agrupados en cuatro lamilias basándose
en similaridades de secuencia. Existen cuatro segmentos funcionales de la
región J, incluyendo los exones conservados Jyl y Jy2. asi como los exones
Jpl y Jp2 (McCarthy, 1992). La PCR de T. también se basa en la naturaleza
peculiar de las redistribuciones luncionales en los linfocitos T individuales; la
técnica es a menudo informativa a pesar de la diversidad segmentaria limitada
de este locus, y teniendo en mente algunas limitaciones (analizadas en la pró-
xima sección). Se pueden utilizar cebadores consensuados complementarios
a las secuencias de homología compartida en los segmentos gamma V- y J-
para simplificar el procedimiento de la PCR. De forma similar al caso de la PCR
de IgH, los productos de amplificación de las células T policlonales tienden a
producir un patrón uniforme, mientras que la monoclonalidad se pone de mani-
fiesto en forma de una o dos bandas discretas.
Ventajas y limitaciones de SBH y PCR para la valoración de la clo-
nalidad linfoide. La decisión de utilizar PCR trente a SBH conlleva conocer
varios factores tales como la fuente tisular. el tipo de trastorno linfoproliferativo
que se estudia, la sensibilidad de cada uno de los métodos y las frecuencias de
falsos negativos y falsos positivos. En general, la técnica PCR ha ganado una
amplia popularidad para la determinación de la clonalidad. principalmente debi-
do a su relativa facilidad de llevarse a cabo y a su rapidez. El método SBH es.
por contra, muy laborioso, más caro, y necesita de entre dos y tres semanas
para completarse. Además, SBH se lleva a cabo por lo general con sondas eti-
quetadas con radiactividad. Otras desventajas de SBH son la necesidad de teji-
do fresco o congelado de buena calidad (para obtener un ADN de alto peso
molecular) y una sensibilidad relativamente baja, en la proximidad del 5%. La
PCR es ventajosa en cuanto a que su tiempo es en general de días, es más
barata y necesita una cantidad inicial de ADN mucho más pequeña (por ejem-
plo. 0.5 pg a 1 pg) en comparación con SBH. PCR tiene una sensibilidad nomi-
nal de un 1%. y esto puede extenderse aun más entre un 0.1% y un 0,001%,
mediante optimización en aplicaciones especiales tales como la detección de
linfoma o leucemia residuales. Además. PCR se puede llevar a cabo a partir de
fuentes tisulares parafinizadas, frescas o fijadas, aunque algunos fijadores (por
ejemplo. B5) o sustancias utilizadas por lo común en el procesado de los gan-
glios linfáticos o de la médula ósea pueden inhibir la PCR.
Aunque los métodos PCR son más "simplistas" en comparación, la técnica
es muy lábil frente a alteraciones "micromoleculares de las regiones objetivo
de los cebadores de oligonucleótidos. Así. el uso de cebadores de consenso
no amplificará redistribuciones poco comunes IgH o Tg que comprendan seg-
mentos del gen que carecen de las secuencias complementarias conserva-
das. Quizá de forma más significativa, las mutaciones de bases nucleotidicas
o las delecciones en el ADN plantilla pueden impedir una unión eficaz de las
secuencias de cebadores complementarias, dando lugar al fracaso de la
PCR Tales situaciones se producen en algunos tumores linfoides B que han
sufrido hipermutaciones somáticas de la región CDR III. Los ejemplos inclu-
yen los linfomas de células centrofoliculares, algunos linfomas de células
grandes y los linfomas con diferenciación plasmacitoide. en los que la deter-
minación de clonalidad puede variar de un 35% a un 60% utilizando PCR IgH
CDR III (Lombardo, 1996: Segal, 1995). La tasa de detección de clonalidad
en tumores de linfocitos B pequeños de origen no folicular (por ejemplo, linfo-
ma linfocítico pequeño, linfomas de células del manto) es. por contra, próxi-
ma al 100%. Las leucemias Imfoblásticas agudas de células B y los linfomas
pueden portar de forma ocasional una redistribución clonal aislada D-J. o
sufrir deleciones en la región V., del gen. impidiendo asi el éxito de los méto-
dos habituales de PCR CDR III (Height. 1996). Para valorar la clonalidad Cg
existe un problema más difícil. A pesar de la naturaleza funcional peculiar de
cada reorganización de los segmentos V-J de Tg. la diversidad limitada de es-
te locus puede dar lugar a amplicones PCR con un tamaño muy parecido e
incluso características secuenciales muy similares. Esto puede crear dificul-
tades para identificar una auténtica población clonal de células T cuando las
células T policlonales coexistentes son numerosas, dado que las secuencias
amplificadas similares pero no homologas pueden cear heterodúplex" con
los amplicones objetivo durante la electroforesis en gel. disminuyendo de
forma notable la capacidad para detectar una banda monoclonal.
Dadas estas limitaciones de la técnica PCR, la SBH puede todavía ser
necesaria para resolver un problema difícil de clonalidad en una proliferación
linfoide. Dado que SBH valora la estructura de regiones genómicas de mayor
tamaño, la técnica no es adecuada para aquellos temas mencionados antes
para la PCR. SBH está considerada el método de referencia para la determi-
nación de clonalidad en este contexto diagnóstico y. afortunadamente, dado
que la PCR es un método muy rápido, uno puede posteriormente revertir al
análisis SBH en caso de que los resultados de la PCR no sean determinan-
tes. Sin embargo, la necesidad de cantidades adecuadas de ADN de tejido
fresco o congelado en muchos casos no se pueden satisfacer, y esta limita-
ción debida a la muestra ha estimulado las mejoras en los análisis y técnicas
PCR. Por ejemplo, se han utilizado conjuntos alternativos de cebadores para
soslayar el fracaso de la amplificación debido a alteraciones en las regiones
CDR III o FR III que con una cierta frecuencia aparecen en la PCR del locus
IgH. Se pueden combinar un cebador de la región II marco (FR II) situado
aguas arriba de esta región de consenso o un número de cebadores VH
"específicos de la familia" FR I con el cebador de consenso JH (Figura 65-20)
(Ramasamy. 1992; Aubin. 1995: Deane, 1991). Estas maniobras sirven para
aumentar el éxito global de la detección de clonalidad desde aproximada-
mente un 65% (sólo con la PCR estándar IgH CDR III PCR) hasta aproxima-
damente un 90% a expensas de un mayor trabajo y complejidad. También se
han utilizado de forma efectiva cebadores de PCR específicos de familia"
para aumentar la detección de clonalidad en el locus Tg (Greiner, 1999). Los
cambios en el análisis de gel pueden también afectar de forma significativa la
resolución y. por tanto, la detección, de productos clónales de PCR. El uso de
geles de poliacrilamida es por lo general más informativo que los geles de aga-
rosa, y las modificaciones en la composición del gel pueden mejorar esto toda-
vía más. En el caso de la PCR Tg. la generación potencial de productos com-
petidores pero mespecílicos de tipo heterodúplex puede reducirse de forma
sustancial mediante vanos métodos preanalíticos y de electroforesis en gel.
favoreciendo así la detección de una auténtica población clonal (Bottaro.
 C A P Í T U L O 65 • T É C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
1994; Chhanabhai, 1997; Langerak. 1997). Por último, la demostración de tras-
locaciones cromosómicas recurrentes mediante técnicas de PCR. sobre todo
en un subconjunto de tumores de células B. proporciona otro marcador adi-
cional de clonalidad si la PCR inicial de redisposición de los receptores antigé-
nicos no tiene éxito; esto se trata en la sección siguiente.
Para resumir. PCR y SBH son técnicas clave y complementarias para la
determinación de la clonalidad en los trastornos línfoides de células B y T. En
general, los métodos PCR son a menudo considerados como "punteros",
reservándose la SBH para aquellos casos con un material adecuado y en los
que se considera que un resultado negativo de la PCR no está de acuerdo
con otros hallazgos clínicos o patológicos. A este respecto, es importante
tener en mente los conceptos de "tasa de detección" y "sensibilidad", en rela-
ción con la técnica PCR. La tasa de detección de la PCR IgH o Tg será depen-
diente de un número de factores previamente descritos, como el subtipo de
trastorno linfoproliferativo. el método PCR (cebadores únicos frente a múlti-
ples) y el tipo de análisis de gel empleado. La PCR no detectará las redistri-
buciones clónales en todos los casos de tumores línfoides malignos, y así el
conocimiento de la tasa global de detección de un cierto método PCR, o las
mejoras obtenidas mediante avances de esta técnica, es valioso para la inter-
pretación de resultados. Un ejemplo es el del linfoma folicular, que se asocia
normalmente con una tasa de detección clonal IgH de un 40% a un 60% uti-
lizando el método PCR IgH CDR III (Segal, 1995). Combinando la PCR IgH
con un análisis PCR para identificar las redistribuciones del gen BCL 2, se
pueden detectar hasta un 80% a un 85% de los casos (Segal, 1995). Por otro
lado, la capacidad de un método dado de PCR para resolver cantidades dimi-
nutas de un objetivo molecular, o su sensibilidad, se explota a menudo en cir-
cunstancias específicas tales como el seguimiento de la enfermedad residual
mínima (por ejemplo, linfoma o leucemia) durante o después del tratamiento.
La sensibilidad se mide por lo general de forma dilucional, y se optimiza a
menudo mediante secuenciación de la región recombinada funcional peculiar
del gen del receptor de antígenos clonal y diseñando cebadores "alelo"-espe-
cíficos del tumor o sondas para utilizarse en la vigilancia de muestras poste-
riores de un paciente dado. Es esencial, dado que los estudios moleculares
diagnósticos basados en PCR son capaces de conseguir elevados niveles de
sensibilidad, tener gran cuidado para minimizar y eliminar la posibilidad de
contaminación de muestras en el laboratorio; incluso una cantidad diminuta
de una plantilla contaminante extraña puede convertir un resultado PCR poli-
clonal auténtico en una interpretación falsamente positiva de monoclonalidad,
con las correspondientes consecuencias clínicas graves.
Significado y detección molecular de traslocaciones
cromosómicas comunes asociadas al linfoma
La comprensión de la biología de los linfomas no-Hodgkín se ha agrandado
de forma sustancial con la identificación de las traslocaciones cromosómicas
recurrentes que se asocian con neoplasias en concreto (Tabla 65-3). La identi-
ficación de estas anomalías genéticas no solamente es muy útil para el diag-
nóstico (establecimiento de clonalidad, clasificación de los linfomas), sino que a
Tabla 65-3 Traslocaciones c o m u n e s recurrentes en los linfomas n o - H o d g k i n
Gen
Traslocación Enfermedad de fusión
I(14:18)(q32;q21) FL BLC-2/JH
I(11:14)(pl3;q32) MCL BLC-t/JH
t(2;5)(p23;q35) ALCL-T o nulo NPM-ALK
3(q27)locus LCL, FL BCL -6/otros
I(8;14)(q24.q32) Burkilt c-MYC/lqH
t(9;14)(p13:q32) SLL-P(LPL) PAX5/JH
'La frecuencia indica los genes de lusión deteclados medíame métodos moleculares.
PCR = reacción en cadena de polimerasa; SBH = hibridación Southern Blot; LD-PCR = PCR Oe larga distancia; FL = linloma lolicular; MCL = linloma de células del
manto; ALCL = linfoma anaplásico de células grandes: LCL = linfoma de células grandes. SLL-P = linfoma Imlocitico pequeño-plasmaotoide (equivalente al linfoma
linfoplasmocitoide |LPLJ).
1363
menudo proporciona información pronostica, o un marcador para la detección
de enfermedad residual. En general, las traslocaciones cromosómicas en los
linfomas resultan de la fusión de dos locus genéticos, que se producen con más
frecuencia en el locus IgH del cromosoma 14(q32), En consecuencia, un proto-
oncogén que normalmente está altamente regulado se activa de forma consti-
tutiva, dando lugar a una marcada sobreexpresión de una proteína oncogénica.
En otros casos, por ejemplo, el t(2;5) en un linfoma anaplásico de células gran-
des, se produce un gen de fusión quimérico y se expresa como un ARNm híbri-
do y proteína. En cada caso, se cree que la interferencia con el crecimiento nor-
mal de las células línfoides. su homeostasis o su muerte (apoptosis) parece
tener un papel central en la génesis de los linfomas.
Anomalía t(14;18) (q32;q21)
La anomalía 1{14:18) es la traslocación más común de los linfomas de estir-
pe celular B. A nivel molecular, esta traslocación da lugar a la yuxtaposición del
gen BCL2 con la región J en el locus de las cadenas pesadas de inmunoblo-
bulina (J„) (Weiss, 1987; Cleary, 1985: Bakshi, 1985; Tsujimoto, 1985). Como
consecuencia, el gen BCL2 queda bajo el control del elemento potenciador de
IgH altamente activo, dando lugar a la sobreexpresión de la proteina bcl2. El
gen producto de BCL2 es una molécula antiapoptótica. capaz de abrogar el
proceso normal de la muerte celular programada y proteger a las células de
una variedad de eventos citotóxicos letales (Yang, 1996: Hockenberry. 1990).
Las redisposiciones del gen BCL2 se encuentran en hasta un 85% de los lin-
fomas de células foliculares centrales, aproximadamente en un 25% de los lin-
fomas de células B grandes, y raramente en otros trastornos Imfoproliferativos
B (Weiss, 1987: Horsman. 1995; Kouides. 1994). La estructura genómica par-
cial del locus del gen BCL2 se ilustra en la Figura 65-3A La mayor proporción
(60%) de puntos de rotura-fusión en el gen BCL2 se produce en un área muy
pequeña de aproximadamente 150 pares de bases (bp) en el segmento no
codificador 3' del exón 3, conocido como región principal de rotura (MBfl)
(Cleary, 1985). Se produce un menor número de roturas (15% al 20%) en una
segunda región más telomérica que se conoce como la región menor de acu-
mulo (mcr) (Ngan. 1989; Cleary. 1986). Raramente, una región 5' de BCL2
descrita como la "región acumulo variante" (VCR) se redispone en las leuce-
mias linfocíticas crónicas de células B: normalmente, el locus VCR está afec-
tado en traslocaciones con los genes de cadenas ligeras de las inmunoglobu-
linas (Dyer. 1994; Adachi, 1990).
Las reorganizaciones del gen BCL2 pueden detectarse mediante técnicas
SBH utilizando sondas clonadas de los locus MBR y mcr (mostrado de forma
esquemática en la Figura 65-3A). aunque esto suele ser un método laborioso
(Horsman, 1995). La hibridación fluorescente in situ (FISH) también ha resulta-
do eficaz en la identificación molecular citogenética del t(14:18) (Poetsch, 1996;
Taniwaki, 1995). Sin embargo, y como resultado del acumulo relativamente
agrupado de los puntos de rotura genómico en los locus MBR y mcr. se pueden
emplear métodos rápidos de PCR para detectar la mayoría de las fusiones
BCL2;J (Horsman. 1995; Uu, 1993; Ladanyi. 1992; Shibata, 1990; Pezella,
II
1989: Crescenzi, 1988: Lee, 1987). En la mayoría de las situaciones, la región
Mecanismo Detección Frecuencia*
Sobreexpresión de proteína PCR, SBH. 85%-90% de FL
anii-apoplótica LD-PCR 20%-30% LCL
Sobreexpresión de proteína de ciclo PCR. SBH 70%-100% MCL
celular (ciclma D1)
Sobreexpresión de oncogén; RT-PCR, SBH 30%-40% ALCL
proteina quimérica LD-PCR
Eslado prolongado de centro germinal PCR, SBH 30%-40% LCL
LD-PCR 5%-10% FL
Sobreexpresión de oncogén SBH, LD-PCR 100%
Sobreexpresión del factor de SBH 70%
transcripción de células B
 1364 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
interviniente de ADN genómico entre los cebadores opuestos es lo suficiente-
mente corta como para permitir una amplificación con éxito. Esta estrategia
se suele lograr utilizando cebadores oligonucleóticos MBR y mcr colocados
aguas arriba de las regiones de acúmulos. en combinación con un cebador J„
de consenso (Figura 65-3 A y B). De forma global, una técnica habitual PCR
como ésta puede identificar aproximadamente los dos tercios de todas las
fusiones del gen BCL2J., que surgen de t(l4:18) en los linfomas no-Hodgkin
(Horsman, 1995). A diferencia de SDH, PCR se puede realizar a partir de
material fijado y archivado, aunque el ADN extraído de fuentes embebidas en
parafina puede estar comprometido debido a un entrecruzamiento y degrada-
ción de las cadenas de alto peso molecular. Como resultado, la tasa de detec-
ción BCL2J para las fusiones de los locus tanto MBR como MCR es por lo
h
general más bajo en muestras de tejido incluidas en parafina en comparación
con las muestras de tejidos frescos o congelados. La aplicación de la técnica
de ADN PCR de larga distancia (LD-PCR) para identificar y caracterizar más
la anatomía molecular de las fusiones BCL2/J,. ha sido descrita recientemen-
te (Akasaka. 1998). Los análisis de los productos LD-PCR han revelado pun-
tos de rotura extendidos que se producen en la región lejana 3 MBR y tam-
bién 5' del locus mcr. correspondiendo en gran manera al resto de fusiones
BCL2:Ó„ que no se identifican mediante las técnicas PCR normales.
La identificación de las redisposiciones del gen BCL2 en las proliferaciones
linfoides neoplásicas es muy útil en diferentes contextos clínicos, incluyendo el
diagnóstico y la subclasificación de la enfermedad. Las redisposiciones clóna-
les de los genes de las inmunogtobulinas con frecuencia no se detectan con
las técnicas normales PCR IgH en los linfomas de células centrofoliculares
Figura 65-3. A. Esquema de la estrategia de detección para la reorganización del gen
BCL2. La estructura genomica parcial del gen 8CL2y su vecindad se muestran en la
tigura. La mayoría de los puntos de rotura se producen en la región pnncipal de rotu-
ras (MBR), localizada en el segmento 3' (no codificante) del exón III del BCL2(recua-
dro gris claro grande). Una minoría de las roturas BCL2se producen a más de 20 kb
aguas abajo del gen en la región menor de acúmutos (mcr). Los recuadros sombrea-
dos cortos ilustran el uso de sondas genómicas para la hibridación Southern Blot Las
flechas muestran los cebadores PCR BCL2 y muestran un método alternativo oe
detectar fusiones del gen SCÍ.2-J., (que no se muestran a escala correcta) Como
resultado del cúmulo de puntos de rotura en los puntos tanto BCL2 MBR como mcr,
se pueden utilizar cebadores de consenso BCL2 para cada región, combinados con
un cebador de secuencia de consenso J., para detectar la mayoría de las reorganiza-
ciones BCL2 que se producen en ios linlomas (véase los detalles en el texto) B,
Imagen representativa de una reorganización del gen BCL2 (lusón BCL2'V, delecta-
da mediante PCR. Las calles A y D representan alícuotas del ADN de la misma mues-
tra del paciente. Una alícuota (A) se ha analizado en busca de una reorganización del
locus BCL2 MBR, mientras que la otra (D) se ha estudiado en busca de una rotura-
fusión del locus SCL2 mcr. Las calles B y E muestran controles ADN-positivos para las
fusiones MBR-J,, y mcr-J„, respectivamente, y las calles C y F representan muestras
"en blanco" (sin ADN). Después de la amplificación PCR utilizando cebacores ade-
cuados MBR y mcr con un cebador de consenso J„ los productos PCR se analizaron
en un gel de agarosa. se transfirieron a membranas de nailon y se detectaron utili-
zando sondas de secuencia especificas de región MBR y BCR. El análisis muestra
claramente un producto de fusión MBR-J., en la muestra del paciente (calle A), confir-
mando la presencia molecular de la anomalía t(14:18). El producto PCR de la
muestra del paciente difiere en longitud en comparación con el control MBR-positivo
(calle B). indicando que los puntos de rotura en la neoplasia individual son únicos al
nivel ADN. (Tomado de vlswanatha DS Detection of trie 1(14:18) (q2l ;q32) associated
BCL-2'JH gene lusion in non-Hodgkms lymphoma. En Kiieen A [ed]: Molecular
Pathology Protocols Totowa, NJ. Humana Press [septiembre 2000]. con autorización.)
(FCC). tal y como se indicó previamente (Segal. 1995). Sin embargo, la ano-
malía BCL2/J,, es por lo general detectable mediante PCR en estos casos,
proporcionando un marcador alternativo clonal para distinguir el linfoma folicu-
lar de una hiperplasia folicular alípica o florida pero benigna. Como corolario,
el análisis PCR para la fusión BCL2J,. se puede utilizar para diferenciar subti-
pos de linfoma no-Hodgkin de bajo grado de patrones morfológicos potencial-
mente similares, como el linfoma folicular frente a los lirfomas del manto o del
tipo de zona marginal. Las redisposiciones de los genes BCL2 están muy pero
no absolutamente correlacionadas con la sobreexpresión de la proteína bcl2.
Por el contrario, es importante observar que muchos linlomas y leucemias de
células B se asocian con una expresión desregulada BCL2 en ausencia de
alteraciones genéticas estructurales, presumiblemente debido a mecanismos
epigenéticos. La sobreexpresión de la proteina bcl2 parece en parte estar por
debajo de la resistencia primaria del tumor a la quimioterapia (Gascoyne. 1997;
Hill, 1996: Hermine. 1996). El uso de las lusiones BCLZX, como marcadores
clónales específicos del paciente para la valoración cuantitativa de la enfer-
medad residual mínima ha sido descrito recientemente (Luthra, 1998a).
Anomalía t(11;14) (q13;q32)
La t(11 ;14) está muy asociada con los linlomas de células del manto (MCL),
aunque se ha encontrado raramente en casos de leucemia prolmfocítica, linfo-
ma espléníco con "linfocitos vellosos (SLVL) y LLC. El 1(11 ;14) coloca al locus
BCL1 adyacente al gen IgH, afectando casi siempre a la región J . El gen
M
de la ciclina D1 está localizado a una gran distancia telomérica de la mayoría
 C A P Í T U L O 65 • TÉCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y E T I C A S 1365

de puntos de rotura 11(q13)/flC¿. J. pero aun así es el blanco de desregulacio-
nes transcripcionales o del gen IgH en las fusiones SCL J'J . La ciclina D1 es
H ver las fusiones BCLhJ,. en MCL (Coignel. 19%: Vaandrager. 1996).
una proteína de la fase precoz del ciclo celular requerida normalmente para la
actividad de las cinasas 4 y 6 ciclina-dependientes (cdk4. tdk6). y este com-
plejo promueve la progresión a través de la transición G,/S del ciclo celular en
las células que proliferan. La sobreexpresión oncogénica del tipo D1 de cicli-
nas parece asi tener una importante función en el desarrollo de MCL. Aunque
los mecanismos moleculares de transformación mediante la ciclina D1 desre-
gulada no han sido bien aclarados hasta la fecha, este concepto se ve apoya-
do por el aumento de actividad mitótica y el comportamiento clínico más agre-
sivo de MCL. en comparación con otras neoplasias de Imfocitos pequeños B
(Campo, 1999: Weisenburger, 1999; Argatoff, 1997: Samaha, 1998). La identi-
ficación de t(H;14) o las reorganizaciones del gen BCL1 en la MCL es varia-
ble dependiente de la metodología empleada y oscila entre menos de un 50%
y un 100%. Independientemente, la expresión de la ciclina DI, bien mediante
análisis de ARNm o análisis de proteínas, está presente en más de un 90% de
los casos de MCL iRimokh. 1993: Oka. 1994; Bosch. 1994: De Boer. 1997;
Yang. 1994; Zukerberg. 1995: De Boer. 1995: Alkan. 1995: Vasef. 1997: Sos-
low. 1997). La estrecha correlación entre las anomalías SCLJ'ciclina D1 y las
formas de MCL forman una faceta clave en el diagnóstico de este linfoma.
El locus genético BCL í comprende una gran región de la banda cromosómi-
ca 11(q13) (Fig. 65-4). Aproximadamente la mitad de las roturas BCL1 se pro-
ducen en un área bien definida, conocida como la región del acumulo principal
de traslocaciones {MTC) (Williams, 1993a: Williams. 1991) El MTC está locali-
zado a casi 12C kilobases (kb) hacia el centrómero del gen de la ciclina DI. Se
han definido otros puntos de rotura mediante análisis Southern Blot que son o
bien más distales al MTC o localizadas en la región 5' inmediata del gen de la
ciclina D1 (Williams, 1991.1993b). El método SBH, utilizando una única son-
da de la región MTC, detectará casi todas las reorganizaciones de BCL1 del
punto de rotura MTC, que suponen el 50% de todos los casos (Williams. 1993a).
Con el uso de sondas genómicas múltiples, se puede también identificar el núme-
ro más pequeño de roturas que no están en relación con MTC. aumentando
la tasa de detección SBH hasta un 70% (Williams, 1991). Sin embargo, esta
complejidad técnica, asi como la falta de disponibilidad habitual de sondas
para múltiples regiones BCL 1. hace muy poco práctico SBH con fines diag-
nósticos sistemáticos. Se ha utilizado con éxito la técnica PCR para identificar
el subconiunto de fusiones BCL f/J que se producen en la estrechamente agru-
H
pada región MTC. dando lugar a una detección mediante PCR de las reorgani-
zaciones BCL1 de entre el 40% y el 50% (Pinyol. 1996). De forma notable, la
gran región de rotura formada por el locus BCL 1 presenta asi sustancíales difi
cultades para estos métodos de diagnóstico molecular. Los análisis basados en
FISH han emergido posteriormente como quizá la forma más completa de resol-
Clínicamente, MCL es una enfermedad agresiva, a pesar de tener la modo-
logia de un "indolente" linfoma de linfocitos B pequeños (Campo. 1999: Argatoff.
1997; Samaha. 1998). De acuerdo con ello, el establecimiento correcto de este
diagnóstico es critico para el pronóstico y la planificación del tratamiento.
Aunque la proteína ciclina D1 puede detectarse mediante técnicas inmunohis-
toquimicas (Yang, 1994; Zukerberg, 1995: De Boer, 1995: Alkan. 1995: Vasef.
1997; Soslow. 1997). los métodos genéticos moleculares para identificar las
anomalías del locus BCL1 continúan aplicándose ampliamente en esta situa-
ción diagnóstica. Entre las leucemias crónicas de células B, hay cada vez más
pruebas que indican que la expresión de la ciclina D1 en sí misma puede ser
un determinante independíente de mal pronóstico (Levy, 1999), independien-
temente de sus clasificaciones morfológicas específicas.
Anomalías que afectan al locus del gen 3(q27)
Recientemente se han identificado linfomas con aberraciones citogeneticas
del cromosoma 3(q27) y del gen BCL6. A diferencia de otras traslocaciones
asociadas a los linlomas. las fusiones del gen BCL6 pueden involucrar a un
gran número de genes compañeros, muchos de los cuales no están en relación
con los genes receptores de antigenos (Ohno, 1997: Chen. 1998; Ohshima.
1997). Un pequeño número de casos mostrará una clásica anomalía t(3;14)
¡q27;q32). que une al gen BCL6 con el locus IgH. mientras que otros pueden
involucrar a los genes de las cadenas ligeras de inmunoglobulina. La aparente
"promiscuidad' de las traslocaciones del gen BCL6 ha conducido al concepto
de sustitución promotora heteróloga como mecanismo de la desregulacion de
BCL6y la sobreproducción de la correspondiente proteina bcl6 (Chen. 1998).
La expresión de la proteina bcl6 se detecta en las células normales de los cen-
tros germinales. Modelos en ratón de "atontamiento" del gen BCL6 han mos-
trado que este gen es vital para la formación del centro germinal normal y para
las respuestas normales de anticuerpos dependientes de células T (Ye, 1997:
Dent, 1997). Además. BCL6 parece necesario para el control de las respues-
tas inflamatorias de tipo Th2 inducidas por citocmas mediante una regulación
normal a la baja de la expresión de una clase de moléculas transductoras de
señal (las proteínas Stat) (Ye, 1997: Dent, 1997).
De forma significativa, se han detectado reorganizaciones del gen BCL6en
los linfomas asociados a los centros germinales, principalmente los tipos de
células grandes (30% al 40%) o de células de los centros foliculares (10% al
15) (Ohno. 1997: Chen. 1998: Ohshima. 1997: Otsuki. 1995). Además, una gran
proporción de estos linfomas muestran hipermutaciones somáticas de la re-

Figura 65-4. Esquema del locus BCL1 y de la estrategia para detección mediante PCR de las reorganizaciones SCLí-IgH. La organización
del locus BCL1 se muestra en el panel superior, con su orientación centromérica Icen) y telomérica (tel) El gen de la ciclina D1 es el objeti-
vo de la desregulación por las reorganizaciones de la región BCL 1 en el linloma de células del manto (MCL), aunque la mayoría de las rotu-
ras ocurren muy centroméncas en relación con el propio gen. Los recuadros cortos en color rojo claro muestran dos sondas habituales para
la detección de las reorganizaciones de la región BCL1. La mayoría de las roturas BCL1 se producen en la región principal de acumulo de
traslocaciones (MTC). suponiendo aproximadamente un 50% de los casos en el MCL. La organización genómica de la región MTC de la fusión
BCL1-J., que surgen de t(H :14) se muestran en el panel interior. Las flechas verticales cortas moican el área de cúmulos de roturas MTC
Debido al acumulo relativamente denso en este punto PCR puede detectar la mayoría de las fusiones BCL1-J en relación con MTC (véase
h

el texto para detalles). Las localizaciones relativas de los cebadores para la PCR BC(.;-J„ están indicadas por flechas horizontales (las fle-
chas de gran tamaño indican un único cebador de consenso para la secuencia JH).
 1366 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
gión reguladora 5' de BCL6, de lorma independíenle de la presencia o ausen-
cia de anomalías estructurales delectables del gen (Migliazza. 1995). El sig-
nificado de la alteración mutacional sin reorganización genética está poco
claro, dado que las células normales de memoria B (con linea germinal
BCL6). muestran también este hallazgo, sugiriendo que las mutaciones somá-
ticas BCL6 se producen durante el proceso de activación normal de los cen-
tros germinales (Shen. 1998). Aun así. la sobreexpresión de la proteína bcl6
parece estar integralmente en relación con la patogénesis de los linlomas del
tipo centro germinal, y esta situación se puede inducir mediante la trasloca-
ción de BCL6. o mediante otros mecanismos sin una reorganización del pro-
pio gen BCL6 (Allman. 1996). De acuerdo con ello, la presencia de proteína
bcl6 se observa en la gran mayoría de linfomas de células grandes, linfomas
foliculares y linfomas de Burkitt (Onizuka. 1995: Carbone. 1997; Flenghi,
1996: Pittaluga. 1996: Falim. 1997; Cattoretti, 1995).
La detección de las reorganizaciones del gen BCL6 que se producen en los
casos traslocados se puede conseguir mediante varios métodos. Se ha utili-
zado ampliamente el análisis SBH. dado que la mayoría de estos casos
muestran un cúmulo de puntos de rotura que cubren la región próxima 5'. el
primer exón no codificante y el mtrón uno del gen BCL6 (Lo Coco. 1994; Oflit,
1994; Lee. 1987). Las aplicaciones más recientes comprenden PCR para
ADN de larga distancia [específicamente para la anomalía t(3:14)] y técnicas
FISH (Akasaka, 1996; Ueda, 1997). El significado clínico de las anomalías
BCL6 en el linfoma sigue hasta la fecha sin entenderse del todo. La desregu-
lación de BCL6 en el linloma indica un papel central en la patogénesis de la
enfermedad, presumiblemente por el atrapamiento de células linfoides en un
estado de centro germinal, creando así un ambiente para la producción de
otros desarreglos genéticos. Aunque la proteína BCÍ.6" está ampliamente
expresada en las neoplasias linfoides asociadas a los centros germinales, la
relevancia clínica del estado del gen BCL6 sigue siendo controvertida. Se ha
comunicado una mayor frecuencia de reorganizaciones del gen BCL6 en los
linfomas extranodales de células grandes (Liang, 1997: Offit. 1994), y un estu-
dio ha sugerido un mejor pronóstico para los linfomas de células grandes con
reorganización del gen BCL6 (Offit, 1994). Sin embargo, la resolución defini-
tiva del significado clínico de las anomalías del gen 8CL6en el linfoma sigue
necesitando estudios adicionales a gran escala.
Anomalías que afectan al locus del gen 8(q24)
La alteración genética del locus C-MYC se ha asociado clásicamente con
el linfoma de Burkitt (y con la leucemia Imfoblástica aguda, tipo LAL-L3): sin
embargo, este gen también se ha implicado en la patogénesis de tres tumo-
res, incluyendo las transformaciones de alto grado (secundarias) de linfomas
indolentes, linfomas asociados al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH),
y ocasionales trastornos linfoproliferativos agresivos postransplante. Con ma-
yor frecuencia, el gen C-MYC se trasloca al locus IgH por la anomalía t(8;14).
En otros casos. C-MYC se puede hacer adyacente a los genes de cadenas
ligeras K- [2(pl2)J o X [22(q11)) (Croce, 1985). En cada uno de estos casos,
C-MYC se coloca bajo la fuerte influencia transcripcional de potencíador de las
inmunoglobulmas. El C-MYC es normalmente un gen altamente regulado que
está involucrado en la respuesta nuclear "precoz" a las señales citoplasmicas
mductoras de crecimiento. El producto del gen C-MYC lorma un complejo que
se une al ADN con un compañero proteiníco. Max. para iniciar la transcripción
de varios genes situados aguas abajo y que son necesarios para su entrada
en el ciclo celular y en la proliferación celular (Blackwood, 1991). Max está a
su vez regulado por dimerización con otras proteínas tales como Mad. y estos
complejos alternados actúan para reprimir la actividad de transcripción (Ayer,
1993,1995; Zervos. 1993). Como resultado de la traslocación de C-MYCen el
linfoma, el control normal de C-MYC se ve abrogado por el gen IgH. Esto a su
vez da lugar a una sobreproducción no supervisada de c-Myc. dando lugar a
un aumento de los dimeros c-Myc Max y a la transactivación de múltiples
genes objetivo cognatos. resultando en última instancia en una proliferación
celular no controlada (Amati. 1993). Los linfomas de Burkitt y LAL-L3 figuran
entre las neoplasias humanas más agresivas y de división más rápida.
La anatomía molecular de los puntos de rotura de la región C-MYC ha sido
bien estudiada en el linfoma de Burkitt (BL) con el t(8:14) (Neri. 1988; Yano,
1992). En el BL endémico, los punios de rotura C-MYC se producen bastan-
te aguas arriba del gen y afectan principalmente al locus IgH JH en 14(q32).
A diferencia de ello, el tipo esporádico de BL demuestra roturas C-MYC den-
tro de la región 5' del gen, y se asocian tipicamente con fusión con la región
de cambio de inmunoglobulina. Estos datos indican que los fenómenos de
traslocación que afectan a C-MYC en estas variantes BL se producen en fa-
ses ligeramente diferentes en una célula B inmadura. Clínicamente, sin em-
bargo, estas diferencias parecen ser insignificantes. Las reorganizaciones del
locus C-MYC o la presencia de 1(8:14) pueden detectarse mediante análisis
SDH. FISH. o PCR de larga distancia (Falini. 1997; Cattoretti. 1995, Van Kne-
ken. 1992: Siebert. 1998; Akasaka, 1998). Prácticamente, sin embargo, la pre-
sentación clínica característica y las características patológicas de BL son con
mayor frecuencia suficientes para el diagnóstico, y la confirmación molecular
o citogenética de la afectación C-MYC sólo es necesaria para aquellos casos
con una enfermedad leucémica primaria (LAL-L3) o en casos con caracteris-
ticas no habituales. La presencia de reorganización del gen C-MYC en oíros
linlomas. como en el contexto de una transformación secundaria o inmuno-
deficiencia, es por lo general indicativa de un comportamiento biológico muy
agresivo.
Anomalía t(2;5) (p23;q35)
El linloma anaplásico de células grandes (ALCL) es un subtipo reciente-
mente reconocido de linfoma no-Hodgkm que puede presentarse como una
enfermedad cutánea primaria, o más comúnmente como una forma sistémica
que afecta a ganglios linfáticos, visceras y piel. Este tumor se clasificó con fre-
cuencia en el pasado como una enfermedad Hodgkin de deplecion linfocítica.
como una histiocitosis maligna, o incluso como una enlermedad maligna
metastásica. Una característica fenotipica en casi todos los casos de ALCL es
la presencia del antígeno CD30 ("Ki-1"). un marcador de aclivación y miem-
bro de la familia de los factores de necrosis tumoral (Smith. 1993). Normal-
mente. ALCL es de estirpe de células T. aunque algunos tumores no expre-
san marcadores de estirpe asociada a células B o T (células "nulas"). Una
minoría de tumores son fenotipica o genéticamente de tipo celular B. Se ha
generado un sustancial interés en ALCL con el hallazgo de una anomalía
recurrente 1(2:5) en una proporción significativa de casos de enfermedad sis-
témica (Rimokh. 1989: Masón, 1990: Kaneko, 1989). A nivel molecular, esta
traslocación yuxtapone el gen NPM con un nuevo gen lamado ALK (cinasa
anaplásica de linfoma). El producto normal del gen NPM. llamado nucleofos-
mina. es una fosfoproteína nuclear de expresión ubicua que se cree es impor-
tante en el ensamblaje de los ribosomas. El gen ALK codifica una tirosina
cinasa previamente desconocida que no se expresa normalmente en las cé-
lulas linfoides (Shiota, 1994a). Como resultado de la fusión del gen NPM-ALK.
la actividad de tirosina cinasa de ALK queda sin regular, contribuyendo de
lorma ostensible a la génesis de los linlomas. La fusión NPM-ALK difiere
estructuralmenle de otras fusiones genéticas asociadas a los linlomas, en
cuanto a que se produce una proteína y ARNm quiméricos. Aún asi, la sobre-
expresión del gen ALK restringido normalmente parece ser el principal meca-
nismo involucrado en la transformación.
Los puntos de rotura genómicos en casos de ALCL afectan de forma uni-
forme a las mismas regiones de intrones de ambos genes, dando lugar a la
generación de un ARNm de fusión constante NPM-ALK. Esta situación ha
permitido el uso de RT-PCR para detectar la transcripción de fusión con una
alta especificidad y sensibilidad (Elmberger, 1995: Wellmann. 1995: Ladanyi,
1994; Yee. 1996:Weiss. 1995; Downmg. 1995;Lamant. 1996). Además, y da-
do que los intrones afectados son relativamente cortos, también se ha emplea-
do con éxito el LD-PCR genómico para identificar la anomalía NPM-ALK (La-
danyi, 1996: Sarris. 1996: Lulhra. 1988b). Este último método necesita un ADN
de alto peso molecular, pero elimina la necesidad del aislamiento del ARN y de
la transcripción inversa. Otras técnicas, incluyendo el análisis mediante sondas
FISH y el SBH del locus NPM. también han sido descritas (Bullnch. 1994; Ma-
Ihew. 1997). Dado que la citogenética clásica es técnicamente exigente y que
se lleva a cabo con poca frecuencia en casos de ALCL, estos métodos mo-
leculares han servido para simplificar e incrementar la tasa de detección de
esta lesión genética.
Clínicamente, los primeros dalos con respecto a ALCL indicaron una rela-
ción entre la presencia de \{2:5)i NPM-ALK. la edad más joven, y un pronosti-
co favorable (Kadin. 1986: Nakamura. 1991; Bitter, 1990). De enlre subcon-
juntos sólidamente definidos de ALCL (esto es, CD30+, estirpe T, morfología
 C A P Í T U L O 65 • TÉCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
característica), la fusión NPM-ALK se detecta entre un 50% y un 60% de los
casos (Chan. 1999: Wellmann, 1995; Elmberger, 1995; Downing, 1995:
Lamant. 1996). Sin embargo, las estimaciones acerca de la frecuencia de
tí2:5i NPM-ALK en la ALCL han variado de forma considerable, debido a dife-
rencias en el método de detección y en la definición exacta de la enfermedad.
Por ejemplo, aunque la gran mayoría de los casos de ALCL positivos para
1(2:5). NPM-ALK son de fenotipo celular T o nulo", también se pueden encon-
trar casos ocasionales de estirpe B (Downing. 1995; Weisenburger, 1996:
Hutchinson. 1997). De forma análoga, el t(2;5) o la fusión NPM-ALK se ha
identificado en casos raros de ALCL que carece de la expresión de CD30
(Hutchinson. 1997) y de forma infrecuente entre linfomas de células grandes
de estirpe celular B o T sin características otológicas anaplásticas
(Benharroch, 1998). Se han conseguido avances en los esfuerzos para defi-
nir mejor un grupo clínicamente relevante de ALCL con la aplicación de anti-
cuerpos específicos que detectan el segmento ALK en la proteína de fusión
(Benharroch, 1998: Pittaluga, 1997: Nakagawa. 1997: Shiota, 1994b; Pileri,
1997; Pulford. 1997). La presencia de proteina ALK en la ALCL se correlacio-
na estrechamente con la fusión NPM-ALK Es más, las neoplasias ALK-posi-
tivas parecen asociarse con un resultado clínico muy favorable, en compara-
ción con aquellos tumores que carecen de esle marcador (Shiota. 1995:
Falini. 1999; Gascoyne, 1999). Dado que la detección de la fracción ALK se
puede conseguir por métodos inmunohisloquímicos, este método puede servir
como una alternativa uniforme y fácil en la evaluación molecular, y es capaz de
identificar casos raros de linfoma con sobreexpresión ALK debido a fenómenos
genéticos alternativos [por ejemplo. t(1:2) (q25:p23), Ínv(2)(p23)(q35)] (Masón,
1998: Wlodarska. 1998). Por último, la identificación de la anomalía genética
\{2.bv NPM-ALK. o la expresión de la proteina ALK, son útiles para distinguir
casos de ALCL de la enfermedad de Hodgkin, o de los tumores epiteliales indi-
ferenciados (Herbst, 1995; Elmberger, 1995; Wellmann. 1995: Ladanyi. 1994:
Yee, 1996: Weiss. 1995: Sarris. 1996). Sigue siendo controvertida la aparición
de \{2:5);NPM-ALK en la ALCL cutánea primaria (Wood. 1996; DeCoteau,
1996; Beylot-Barry. 1996).
USO DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA
EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL
La aparición de técnicas de biología molecular para la detección de redis-
posiciones de los genes receptores de antigenos y de las traslocaciones cro-
mosómicas ha proporcionado a su vez unas oportunidades específicas y
sensibles para medir el riesgo de enfermedad tumoral después de las inter-
venciones terapéuticas de las leucemias y de los linfomas. La valoración tra-
dicional en esta situación se ha limitado en gran manera al examen micros-
cópico de puntos tisulares tales como la médula ósea. Sin embargo, las
técnicas PCR se pueden optimizar para la resolución altamente sensible de
cantidades submicroscópicas de enfermedad hemalopoyética, normalmente
en las cifras de una célula anómala por cada 10-10 células benignas. La
aplicación de tecnologías basadas en la PCR para la detección de enferme-
dad residual mínima (MRD) ha permitido un seguimiento muy preciso de la
"emética" del tumor, además de presentar una pléyade de nuevas preguntas
y precauciones. Los marcadores MRD comprenden los genes de fusión aso-
ciados a la leucemia o al linfoma, con las reorganizaciones clónales de los
genes receptores de antigenos en los tumores línfoides. Para la detección de
MRD se han utilizado tanto técnicas ARN (RT) PCR como ADN-PCR. Las téc-
nicas pueden dar lugar a una medición cualitativa, estableciendo la presencia
o ausencia de un marcador en particular a cierto nivel "umbral" de sensibili-
dad, o pueden elaborarse para conseguir varios grados de cuantificación de
las moléculas diana.
El significado clínico de MRD en las leucemias ha llegado a ser un lema
importante y cada vez más estudiado. Entre las leucemias mieloides. muchos
subtipos están caracterizados por genes de fusión con asociacíón-traslo-
cación recurrente que sirven como marcadores peculiares moleculares de
enfermedad. Los ejemplos más comunes comprenden la leucemia promielo-
cítica aguda (LPA) con la anomalía 1(15; 17)'PML-flAflu, la leucemia mieloide
aguda con la fusión t(8;21 )/AM. 1-ETO. y la LMC. asociada con la anomalía
t(9;22);BCR-ABL. Los datos generados a partir de los estudios MRD en estas
leucemias han resultado ser intrigantes. Para los pacientes LPA, la demos-
1367
tración de transcripción residual de una fusión EML-RARu después del trata-
miento se ha asociado con un riesgo muy elevado de recidiva, normalmente
en el plazo de meses (Diverio, 1994,1998). A diferencia de ello, los pacientes
con una AML t(8;21 (-positiva pueden lograr remisiones clínicas muy durade-
ras, a pesar de la presencia de un ARNm de fusión АМ/Л-ErOdetectable a
bajos niveles. Además, la anomalía AML1-ETO puede detectarse en indivi-
duos tratados con éxito de forma independiente del tipo de terapia empleado
(quimioterapia o trasplante de médula ósea) (Kusec. 1994: Jurlander. 1996)
Por último, en el caso de LMC, va emergiendo un cuadro más complejo, es-
tando en relación la importancia pronostica del estado MRD con el intervalo
después del tratamiento (por lo general un trasplante de médula ósea). Los
pacientes LMC con una conversión "precoz" a un estado PCR positivo para
BCR-ABL (esto es. entre 6 y 12 meses), o aquellos que manifiestan una posi-
tividad persistente de la PCR a lo largo del tiempo, parecen tener un mayor
riesgo de recidiva en un estudio de gran tamaño: sin embargo, la previsión de
los casos individuales es difícil y se puede modificar por factores adicionales
en relación con el tratamiento (como el tipo de trasplante o la enfermedad de
injerto contra huésped) (Radich. 1995). A pesar de la variabilidad en el valor
prediclivo positivo para la recidiva de la enfermedad utilizando detección
molecular de MRD en estas diferentes leucemias mieloides, como regla gene-
ral, la positividad persistente de la PCR en mediciones seriadas se suele
correlacionar con un mayor riesgo de recidiva. Es importante tener en cuenta
que la ausencia de una enfermedad detectable mediante PCR se asocia fuer-
temente con un estado de remisión clínica.
En la leucemia linfoblástica aguda pediátrica existen cada vez más prue-
bas que sugieren que la vigilancia de la MRD puede tener un papel clave en
la identificación de pacientes con un elevado potencial de recaída. A diferen-
cia de las leucemias mieloides. las reorganizaciones tumor-especificas de
los genes de receptores de células T y de inmunoglobulinas (IgH) se han uti-
lizado como marcadores clónales de leucemia linfoblástica residual. La
enfermedad residual al final del tratamiento de inducción y a intervalos pos-
teriores ha resultado correlacionarse con un peor resultado en la mayoría de
los estudios (Evan, 1998; Gruhn, 1998; Wasserman, 1992: Nizet. 1991; Jac-
quy, 1997; Steenbergen, 1995: Goulden, 1998). Recientes esludios amplios
sobre la LAL pediátrica son significativos en este aspecto, demostrando que
los niveles de MRD leucémica equivalentes a aproximadamente una de cada
100 a 1.000 células son fuertemente predictivas de recidiva de la enfermedad
a final del tratamiento de inducción y también a intervalos posteriores (Cave.
1998: Van Dongen. 1998). Además, los análisis senados de PCR a intervalos
múltiples parecen añadir valor pronóstico, connotando la positividad persis-
tente de un mayor riesgo de recidiva. De nuevo, aquellos pacientes con una
PCR persistentemente negativa en todos los intervalos se asocian con un
estado de remisión continuada y un bajo riesgo de fracaso terapéutico. Ade-
más de estos hallazgos, otros investigadores, utilizando técnicas PCR alta-
mente sensibles, han sido capaces de demostrar niveles extremadamente
bajos de MRD persistente en pacientes que mantienen una remisión clínica al
final del tratamiento e incluso varios meses después (Roberts. 1997). Estos
datos sugieren en conjunto que las cantidades diminutas pero cuantiticables
de LAL residual en los pacientes pediátricos pueden ser una característica
constante a pesar de un tratamiento satisfactorio, pero el nivel relativo de
MRD y el comportamiento de las células leucémicas residuales están definiti-
vamente en correlación con el riesgo de un fracaso terapéui со.
La capacidad de resolver cantidades cada vez mas pequeñas de objetivos
moleculares genéticos especilicos ha proporcionado nuevas perspectivas a la
biología de la enfermedad, así como algunos potenciales fallos. La detección
de las transcripciones de la fusión t(8;21).'AM/.f-ETO o las redisposiciones
clónales de los genes receptores de antigenos en los supervivientes a largo
plazo de LAM y LAL pediátricas, respectivamente, indica claramente que las
células tumorales residuales pueden residir en un estado "durmiente' o no
proliferativo. La distinción de estas células de las células tumorales con más
agresividad biológica no es posible con estos análisis moleculares, y la infor-
mación clínica relevante puede ser poco concluyeme o verse oscurecida. Por
último, estudios recientes han demostrado la existencia en la sangre o en los
tejidos de individuos sanos de genes de fusión asociados a la traslocación de
leucemia o linfoma, sugiriendo que la recombinación genética aberrante de
bajo nivel puede ser un fenómeno relativamente común, Los ejemplos com-
prenden la detección del t(9;22)/8Cfi-,48L y de t(14;18)/8CL?-/(jH(Biernaux,
 1368 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
1995; Bose. 1998: Dolken, 1996; Limpens, 1991.1995). En cada uno de los ca-
sos, se han requerido análisis PCR altamente sensible para poner de mani-
fiesto estas anomalías, y las implicaciones para el seguimiento MRD des-
pués de la terapia y en algunos pacientes son claramente aparentes. Un
desalio clave para la valoración MRD es. por tanto, conseguir una sensibili-
dad técnica suficiente para conseguir datos pronósticos significativos, a la vez
que se minimiza el riesgo de resultados falsamente positivos que surjan de
contaminación de las muestras, o la potencial detección de eventos raros en
células "durmientes'.
Se hace asi cada vez más evidente que la utilidad de la PCR para el con-
trol MRD depende de varios factores, incluyendo el tipo (o biología) de la
enfermedad hematopoyética. el momento y la frecuencia de los controles,
los niveles de sensibilidad de los análisis que se usan y el efecto de las in-
tervenciones clínicas. Se necesita una extensa comprensión de estas inte-
rrelaciones para diseñar estudios MRD que tengan significado. Con este
fin. el desarrollo de PCR cuantitativa automatizada (Q-PCR) con una detec-
ción mediante fluorescencia de los productos de la PCR está proporcio-
nando rápidamente un medio de controlar potencialmente la MRD en "tiem-
po real" y con una destacable reproducibilidad y sensibilidad (Heid. 1996:
Gibson. 1999: Wittwer, 1997; Marcucci, 1998: Mensink, 1998; Pongers-Wil-
lemse. 1998). La aplicación sistemática de la Q-PCR automatizada prome-
te proporcionar un método más normalizado de medición de MRD para
reflejar la cinética de la actividad tumoral después del tratamiento. El reco-
nocimiento más precoz de la enfermedad en progresión podrá ser, por
tanlo. tratado de una forma expeditiva, antes de que se produzca una reci-
diva manifiesta.
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN EL DIAGNÓSTICO
Y CONTROL DE LAS ENFERMEDADES
HEMATOLINFOIDES MALIGNAS
En años recientes, han aparecido nuevas tecnologías que conducen a
una mayor sensibilidad diagnóstica y que tienen implicaciones pronosticas
y terapéuticas. En el futuro, dos tecnologías emergentes, los microestudios
con ADN y la PCR cuantitativa automática, prometen revolucionar los méto-
dos diagnósticos moleculares normales. Estas nuevas tecnologías prome-
ten la capacidad de estudiar la totalidad del genoma de una célula y cuan-
tificar la cantidad de transcripciones ARNm. También han contribuido a
pensar que todos los tumores podrán ser clasificados en última instancia
mediante hallazgos "moleculares" solamente. Sin embargo, en el corto pla-
zo en el que se introduzcan las nuevas tecnologías para el diagnóstico de
neoplasias hematopoyéticas y la detección de la enfermedad residual mini-
ma (MRD), su utilidad necesitará ser valorada en cuanto a su reproducibili-
dad y capacidad de definir de forma no ambigua el pronóstico del paciente
o las recidivas de una manera rápida y eficaz con respecto al coste. Las
técnicas moleculares que se tratan en este capítulo ofrecen estos beneficios
potenciales. Sin embargo, la interpretación de estas pruebas moleculares
se llevarán a cabo mejor en el contexto de la morfología y de las pruebas
complementarias.
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 C A P Í T U L O
Diagnóstico molecular de las
enfermedades genéticas
Wayne W. Grody, M.D., Ph.D.
Walter W. Noll, M.D.
ELECCIÓN DE TÉCNICAS 1373
ELECCIÓN DE APLICACIONES 1374
CONCEPTOS ESPECIALES ÚNICOS DE
LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENÉTICOS 1376
Heterogeneidad molecular
Penetrancia variable y expresividad
Entrecruzamiento
Disomia uniparental
Impronta
Anticipación
Influencias epigenéticas y herencia no mendeliana
Frecuencias alélicas y exploraciones masivas
de la población
La genética molecular diagnostica es una de las áreas más recientes y
revolucionanas de la medicina de laboratorio y mantiene la esperanza de con-
vertirse en la herramienta de diagnóstico y cribado más poderosa del siglo
XXI. Con el ritmo trepidante del descubrimiento de nuevos genes patológicos
bajo los auspicios del Proyecto Genoma Humano (Human Genome Project)
y el reconocimiento de que todas las enfermedades, incluyendo neoplasias y
enfermedades infecciosas, tienen algún componente genético, la utilidad de
esta subespecialidad sólo puede continuar expandiéndose. Por otra parte, su
capacidad única para diagnosticar enfermedad, tanto prenatal como presinto-
máticamente, le confiere un papel primario en la medicina preventiva, un foco
de urgencia en la era actual de contención en el coste de los cuidados médi-
cos. Además, la genética molecular diagnóstica conduce a la genética mole-
cular terapéutica, ya que. esencialmente, las mismas secuencias génicas nor-
males usadas para detectar defectos genéticos moleculares por hibridación
con ácido desoxirribonucleico (ADN) pueden ser usadas para corregir tales
defectos mediante terapia de sustitución génica. Puesto que esta última acti-
vidad incrementa su ámbito y rango de utilidad, llegará a estar incluso más
entrelazada con las actividades del laboratorio de diagnóstico molecular,
sobre el que recaerá la responsabilidad de la monitorización adecuada de la
inserción y expresión del gen sustituido.
Con todo, dicho progreso no se encuentra frenado por obstáculos apreciables.
Además de la considerable solisticación técnica y dificultad de estos procedi-
mientos, estos avances se ven envueltos inextricablemente con ciertos dilemas
éticos espinosos. La disección de la seña constitucional más fundamental de un
paciente y los defectos innatos contenidos en ella, aumenta la problemática acer-
ca de la discriminación genética, estigmatización, diferencias étnicas, privacidad,
consentimiento informado y confidencialidad. Ya que a nivel genético molecular
todo se convierte en una "condición preexistente", la misma definición de asegu-
rabilidad puede necesitar ser revisada; ya existen sujetos sanos que han perdido
la cobertura del seguro por haber encontrado ser portadores de una mutación,
incluso una recesiva (Billings, 1992). El descubrimiento de cualquier muta-
66
EJEMPLOS ESPECÍFICOS DE ENFERMEDAD 1377
Fibrosis quistica
Distrofia muscular de Duchenne
Anemia de células falciformes y otras hemoglobinopatías
Trombofilias hereditarias
Trastornos por expansión de repetición de trinucleótido
Síndromes de Prader-Willi y de Angelman
Cánceres familiares
Hemocromatosis
Trastornos del ADN mitocondrial
FUTURO DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR 1387
BIBLIOGRAFÍA 1388
ción hereditaria en un individuo tiene unas implicaciones más prolundas, que
sobrepasan al paciente mismo que solicito la prueba de ADN (el probando"),
extendiéndose al resto de miembros de la familia de esa persona, ninguno de tos
cuales pudo haber consentido la exploración o revelación de este tipo de infor-
mación. De hecho, con la nueva capacidad de las pruebas de ADN adquirida
gracias a las técnicas de amplificación, como la reacción en cadena por la poli-
merasa (PCR). es muy fácil realizar análisis genéticos sin el consentimiento del
paciente o incluso sin su conocimiento, ya que las pruebas se pueden hacer en
diminutas porciones de tejido o muestras de líquidos obtenidas para otros pro-
pósitos no relacionados. El diagnóstico prenatal y. por extensión, la detección
precoz preconcebida de portadores genéticos en las parejas, están al día en el
apasionado debate ético y religioso sobre el aborto. La terapia génica. a pesar
del consenso general de que debería dirigirse sólo a células diana somáticas,
más que a la linea germinal (e incluso este concepto está comenzado a cam-
biar), aumenta el espectro de la eugenesia entre los que no recuerdan épocas
pasadas en que tales conceptos no fueron sólo aceptados sino activamente
defendidos.
Gran parte de la genética molecular diagnóstica implica la evaluación del ries-
go de frecuencia o recurrencia de un trastorno en un individuo o familia. Por
razones que se describen más detalladamente en este capítulo, los resultados
obtenidos en la prueba a menudo no se expresan en términos de una concen-
tración numérica o una respuesta de si o no, sino como una probabilidad. El
modo exacto y significativo de abordar estas complejas dudas en pacientes e
incluso en los médicos solicitantes, puede ser muy difícil, si no imposible. Por
esta razón, y debido a las serias implicaciones éticas de estas pruebas, como se
describió antes, esta área de la medicina de laboratorio, quizá más que cualquier
otra, requiere una estrecha comunicación entre el laboratorio y el clínico solici-
tante o el consejero genético. De hecho, muchas de estas pruebas deberían rea-
lizarse únicamente a petición de un médico genetista o un consejero genético,
ya que son los especialistas mejor cualificados para evaluar la idoneidad de la
prueba y explicar los resultados al paciente. Una estrecha y oportuna comunica-
 C A P Í T U L O 66 • D I A G N Ò S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S
ción asegurará que los pacientes obtengan el mayor beneficio y el menor riesgo
de desvéntalas de esta poderosa tecnología.
ELECCIÓN DE TÉCNICAS
Con tantos genes, locus y mecanismos mutacionales conocidos de enfer-
medades genéticas, la genética molecular diagnóstica se beneficia de la amplia
gama disponible de técnicas modernas de biología molecular. Éstas incluyen
transferencia Southern (Southern blotting). transferencia en mancha (do/ blot-
ting). PCR. hibndación m situ con fluorescencia (FISH). secuenciación de ADN,
polimorfismo conformacional de ADN monocatenario y otras. La elección de la
técnica a usar en un caso particular dependerá, en gran medida, del conoci-
miento actual del gen o genes asociados con la enfermedad en cuestión y su
grado de heterogeneidad molecular. El primer criterio divide a casi todas las
enfermedades genéticas en dos categorías: aquellas en las que se ha aislado
el gen causante y aquellas en las que no. La primera categoría a menudo puede
abordarse mediante análisis direclo del gen o la mutación: la segunda sólo pue-
den enfocarse mediante análisis de ligamiento, utilizando marcadores de ADN
polimórfico cercanos en el mismo cromosoma, con tal de que se haya trazado
el mapa aproximado de la enfermedad. El segundo concepto, la heterogenei-
dad, se refiere al número de genes diferentes o a la variedad de mutaciones
dentro de un solo gen, que pueden causar la misma enfermedad. Cuanto mayor
es la heterogeneidad, la prueba de ADN se convierte en más difícil, laboriosa y
cara (y más compleja para informar los resultados). Las mutaciones responsa-
bles de algunos trastornos son tan numerosas y se extienden a través de genes
tan grandes que la detección directa no es factible, y se debe recurrir al análi-
sis de ligamiento aunque el gen causante haya sido identificado y clonado. En
otros trastornos, una o más mutaciones pueden ser tan frecuentes en determi-
nadas poblaciones étnicas que su detección precoz puede proporcionar una
prueba de suficiente rendimiento que justifique su enfoque directo, aunque se
ignoren bastantes mutaciones informadas menos frecuentes. Para hacer tales
pruebas practicas y con un coste razonable, se han ideado ciertas estrategias
de multiplexación para la detección simultánea de mutaciones, como se descri-
be a continuación. Con todo, el lector debería tener en cuenta que todo esto
implica cierto compromiso en cuanto a la sensibilidad total de la prueba.
Efectivamente, el campo de la genética molecular diagnóstica tolera, por nece-
sidad, ciertas pruebas de detección precoz con sensibilidades notablemente por
debajo de las que se considerarían aceptables en otros campos del laboratorio
clínico. La decisión de justo cuan bajo debería ser el valor discriminante acep-
table de sensibilidad, se convierte en gran medida en una decisión ética. La
mayoría de los genetistas han defendido que. al menos para las pruebas de
detección precoz, los beneficios potenciales para la salud pública de ofrecer
una prueba de sensibilidad subóptima superan los argumentos en contra de
negarla, con tal de que se proporcionase una suficiente educación y consejo a
los pacientes de modo que entiendan el riesgo residual inherente en un resul-
tado negativo de la prueba.
Los análisis directos de mutaciones se han simplificado de modo incalcu-
lable con la llegada de la PCR. Mediante la elección adecuada de cebadores
[primers), esta técnica permite al laboratorio acercarse a la mutación precisa
de interés o a un "punto caliente" (hot spot) dentro de un gen que contiene
varias secuencias de mutación posibles, usando cantidades muy pequeñas
de muestra. Es valiosa para la detección de mutaciones puntuales y micro-
deleciones que normalmente pasan inadvertidas en una técnica de transfe-
rencia Southern, a menos que se encuentren casualmente dentro de una
secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción que esté siendo uti-
lizada. Una vez que se amplifica la región que contiene la mutación sospe-
chada, se puede analizar mediante electroforesis en gel. secuenciación o
hibridación con sondas de ADN. Ante una delecíón que se sospecha reduce
la longitud del producto amplificado {amplicón), será suficiente la separación
molecular exacta de los productos de la PCR mediante electroforesis y tinción
con bromuro de etidio (Fig. 66-1), De un modo alternativo, si la delecíón o
mutación puntual rompe (o crea) una secuencia de escisión de una endonu-
cleasa. se puede detectar por análisis electroforético de los productos de la
PCR digeridos con esa enzima (Fig. 66-2). Otra opción es hibridar los pro-
ductos de la PCR con sondas oligonucleotídicas especificas de un alelo
(ASO), fragmentos cortos de ADN que son complementarios a cualquiera de
1373
Figura 66-1. Ejemplo de separación electrolorélica de productos de PCR para la
detección de mutación. En este caso, las muestras de ADN del paciente se ampli-
ficaron usando cebadores que llanquean el codón 508 del gen de la librosis quis-
tica íCFTR), produciendo un solo fragmento de 160 bp procedente de individuos
normales (caniles 1. 2. 4. 5 y 6). un solo fragmento de 157 bp procedente de un
paciente homocigoto para la delecíón trmucieolidica \F508 (carnl 7) y ambos frag-
mentos junto con una banda heterodúplex (H) procedentes de sujetos heteroago-
tos (carriles 3, 8 y 9).
las secuencias diana normales o mulantes. Si la hibridación, normalmente en
forma de transferencia en mancha, se realiza ba|o condiciones suficientemen-
te rigurosas, el ADN de la diana que contiene la mutación hibridará sólo con la
sonda mutante y viceversa para el ADN de la diana normal. Para un cribado
más eficiente pueden mezclarse juntas sondas para varias mutaciones poco
frecuentes (Fig. 66-3); mediante la "PCR multiplex", se pueden amplificar jun-
tos varios puntos calientes de la mutación. Como una variación de este enfo-
que, muchas sondas alélicas se pueden extender en un soporte sólido para su
posterior hibridación con el ADN de la muestra (o los productos amplilicados).
en forma de una "micromatriz" (microarray). Desde hace poco están disponi-
bles ciertos equipos de reactivos comerciales e instrumentos que detectan
mutaciones puntuales por hibridación diferencial con sondas/quencne/' o por
electroforesis capilar y otras técnicas sofisticadas.
Existen disponibles varias técnicas de cribado que exploran de un modo
más amplio varias mutaciones desconocidas de un gen patológico. El poli-
morfismo conformacional de ADN monocatenario (SSCP) y la electroforesis en
gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) pueden detectar teóricamente
mutaciones puntuales en cualquier secuencia dentro de un gen; los nucleóti-
dos sustituidos debido a una alteración de la topología, dan lugar a ADN
monocatenario y bicatenano incompatible. Estos métodos evitan la necesidad
de sondas ASO separadas y especificas para cada posible mutación, aunque
pueden realizarse sólo con limitaciones, ya que no son 100% sensibles, La
prueba de proteínas truncadas detecta mutaciones que originan la terminación
prematura del producto polipeptídico del gen; esto requiere un complicado
método de transcripción/traducción in vitro y solo encontrará mutaciones lina-
lizadoras" (y algunas variantes del marco de lectura [Irameshifts] y de la elimi-
nación de intrones [splicing]). mientras pasa por alto sustituciones comunes de
un solo nucleótido (mutaciones sustitutivas [missense]). La única técnica que
presenta un 100% de sensibilidad en la detección de todas las mutaciones
puntuales posibles, al menos en teoría, es la secuenciación completa del ADN
del gen. Desafortunadamente, con la tecnología actual, este enfoque sigue
siendo uno de los métodos más engorrosos y costosos para el uso clínico
habitual; además, se perderían mutaciones situadas fuera del gen estructural
(p. ej.. en intrones. promotores o regiones intensificadoras [enhancer]).
Los trastornos debidos a una expansión génica por una mutación de repeti-
ción trinucleotidica pueden diagnosticarse mediante transferencia Southern o
PCR y. en cualquier caso, por observación de un fragmento diana de ADN
mayor de lo normal. Los trastornos debidos a grandes deleciones se diagnos-
tican a menudo mediante transferencia Southern por observación de una pér-
dida o disminución en tamaño de un fragmento diana, aunque también puede
usarse la pérdida de un producto de PCR amplificado normalmente desde esa
zona o la aparición de un "fragmento de empalme" {"junction íragment). Los
trastornos debidos a grandes deleciones o inserciones, asi como las trasloca-
ciones, se pueden diagnosticar a nivel cromosómico mediante FISH.
 1374 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
Para esos trastornos con numerosas mutaciones desconocidas o en genes
desconocidos, es posible un diagnóstico predictivo mediante análisis de liga-
miento en ciertas familias. Debido a que los análisis requieren la realización
A D N d e numerosos A D N de un
pacientes mezclado solo paciente
Sonda ASO frente a una Sondas ASO mezcladas
sola mutación rara frente a múltiples
mutaciones raras
Figura 66-3. Estrategia para el cribado eficaz de múltiples mutaciones poco (re-
cuentes mediante transferencia en mancha usando sondas oligonucleotidicas espe-
cificas de un alelo (ASO). Numerosas muestras de ADN de pacientes se pudieron
mezclar en una sola mancha e hibridar con una sonda ASO: alternativamente, el
ADN de un solo paciente se puede hibridar con una mezcla de múltiples sondas
ASO poco frecuentes. En cualquier caso, la prueba será negativa la mayoría de las
veces, ya que las mutaciones son muy raras. Si es positiva, se requieren pruebas
adicionales para determinar qué paciente o sonda produjo la señal de hibridación.
Figura 66-2. Ejemplo esquemático de detección de una mu-
tación puntual mediante escisión diferencial con una enzima
de restricción. En este caso, la mutación de la anemia fal-
ciforme, sustitución de T en lugar de A en el codón 6 del
gen de la globina B, destruye una secuencia de escisión de
la Msíll: por tanto, la digestión del producto de PCR de la
región producirá dos fragmentos de ADN en individuos
normales y sólo uno en homocigotos HbS. La mutación del
primer nucleótido de este codón, encontrada en la enfer-
medad de la hemoglobina C, no elimina la secuencia de
reconocimiento de Msíll (ya que la enzima puede recono-
cer cualquier nucleótido en esta posición), no pudiéndose
detectar por este método.
de pruebas comparativas de otros afectados y de hermanos no afectados y
padres, no todas las familias serán accesibles o buscarán información para
esta evaluación.
También se requiere el conocimiento de marcadores de ADN polimórfico
estrechamente ligados, preferiblemente en los flancos o incluso intragénicos,
que pueden ser observados al cosegregarse de forma constante con cualquier
fenotipo, normal o patológico, dentro de la familia. Tradicionalmente. los marca-
dores usados han sido los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP) detectados mediante transferencia Southern. Más reciente-
mente, los polimorfismos microsatélite. secuencias de oligonucleotides en tán-
dem de longitud repetida variable, detectables mediante una PCR y una simple
electroforesis en gel, son preferidos debido a su abundancia a través del geno-
ma, la naturaleza multialélica de sus polimorfismos y la relativa facilidad de la
metodología de la prueba. Genes muy grandes, como los de la neurofibroma-
tosis y la distrofia muscular de Duchenne (DMD). tendrán normalmente micro-
satélites intragénicos a los que se puede acceder, minimizando las posibilida-
des de recombínación entre la mutación y el marcador.
Las técnicas de ligamiento son menos preferibles que los métodos de detec-
ción directa de mutación debido a la necesidad de analizar los múltiples miem-
bros de la familia y porque la recombinación meiótica entre el gen y el marca-
dor puede romper la fase aparente de ligamiento entre el padre y el
descendiente, conduciendo a la interpretación de los resultados como falsos
positivos o falsos negativos. Para cada centimorgan de distancia de mapa entre
los dos locus, se puede esperar un 1% de recombinación (1 cM = 1 millón de
pares de bases [bp]). Por ejemplo, en la Figura 66-4 se predijo que el feto esta-
ría afectado, ya que había heredado el mismo fragmento RFLP superior que el
hijo previamente afectado. Si la secuencia polimórfica de la endonucleasa de
restricción que está siendo analizado está a 5 cM de distancia del gen patoló-
gico, se puede concluir que el feto tiene un 95% de riesgo de estar afectado.
ELECCIÓN DE APLICACIONES
En cierto grado, la elección de la técnica dependerá también de la aplica-
ción (es decir, la razón por la que se realiza la prueba). En genética médica,
 CAPÍTULO 66 • DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS
Figura 66-4. Ejemplo de análisis de polimorfismos de la longitud de los Iragmentos
de restricción para el diagnóstico prenatal de un trastorno autosómico dominante.
En esta transferencia Southern, la banda superior procedente del padre es la única
que se segrega conjuntamente con el fenotipo patológico, como se observa en el
hijo afectado. Como también el feto (?) fia heredado esta banda, se predijo que
estaría afectado. El riesgo preciso depende de la distancia de mapa entre el gen
patológico y el marcador RFLP.
estas aplicaciones consisten en cinco áreas principales: cribado de portado-
res, detección precoz en recién nacidos, pruebas diagnósticas, análisis pre-
sintomáticos de ADN y diagnóstico prenatal. El cribado de portadores es el
término aplicado a la detección de mutaciones recesivas en sujetos sanos con
el propósito de consejo genético y planificación familiar. Esta aplicación se
subdivide en el cribado de individuos con antecedentes familiares del trastor-
no y el cribado, basado en la población, de gran número de individuos sin
antecedentes familiares pero que tienen nesgo de padecer el trastorno debi-
do a la prevalencia dentro de su grupo étnico o en la población general. En
cualquier caso, el propósito es identificar parejas de riesgo (es decir, tanto el
hombre como la mujer son heterocigotos para mutaciones dentro del gen), las
cuales tendrían entonces un 25% de posibilidad de tener un hijo afectado en
cada embarazo, aunque diferirán las estrategias de análisis de los dos gru-
pos. Obviamente, una persona cuyo hermano presenta el trastorno tiene
mucho mayor riesgo de ser un portador que alguien de la población general.
Esa persona puede, por lo tanto, autorizar más pruebas agresivas (p. ej., cri-
bado para un número mayor de mutaciones o incluso análisis de ligamiento)
más rentables que para un miembro de la población general. Por otra parte,
el acceso al ADN de un hermano afectado puede permitir la identificación
anterior de la mutación, la cual haría posteriormente mucho más fácil el aná-
lisis de otros miembros de la familia. Por el contrario, el cribado basado en la
población se esfuerza, de modo característico, en mantener el procedimiento
de la prueba tan rápido y barato como sea posible, centrándose quizá en
algunas de las mutaciones más prevalentes y sacrificando la sensibilidad de
la prueba por la rentabilidad y la conveniencia. Por supuesto, con anteceden-
tes familiares negativos no hay miembros de la familia afectados para poder
realizar una opción de análisis de ligamiento.
Al igual que el cribado de portadores basado en la población, la detección
precoz en recién nacidos intenta identificar defectos hereditarios relativamen-
te prevalentes (como las enfermedades genéticas) en distintos individuos
asintomáticos. De hecho, las dianas patológicas más importantes, como la
fenilcetonuria, galactosemia, anemia falciforme y fibrosis quística, son trastor-
nos autosómicos recesivos. En este caso, la meta es encontrar niños afecta-
1375
dos en edad temprana para poder iniciar el tratamiento (dietético o farmacéu-
tico) antes de que aparezcan daños irreversibles. Actualmente, se están
empleando métodos de genética molecular de este grupo, principalmente
como apoyo para la confirmación de resultados positivos obtenidos por méto-
dos bioquímicos o enzimáticos menos caros, aunque esta situación podría
invertirse en el futuro con métodos moleculares que puedan automatizarse.
Por definición, la prueba de diagnóstico genético se realiza en un suieto
sintomático. Debido a que las pruebas de ADN para patologías genéticas son
absolutamente específicas de la enfermedad y las mismas enfermedades
muy poco frecuentes, estos procedimientos no abarcan lo suficiente como
para usarse en un extensivo diagnóstico diferencial: los síntomas deben ser
lo suficientemente sugerentes del trastorno en cuestión como para justificar la
realización de la prueba. La prueba de ADN se debe sopesar frente a méto-
dos más tradicionales con respecto al coste, conveniencia y utilidad. Por
ejemplo, la electroforesis de hemoglobina puede ser mas conveniente y com-
pleta para clasificar una hemoglobinopatia sospechada que la prueba de ADN
específica para la mutación de la anemia falciforme. Por otra parte, la prueba
molecular puede ser más ventajosa para presentaciones clínicas precoces o
atípicas. Por ejemplo, la prueba molecular para mutaciones de la fibrosis quís-
tica se puede realizar en recién nacidos cuando el análisis tradicional de clo-
ruros en el sudor es impracticable o poco fiable. Las pruebas de ADN también
tienen la ventaja de trabajar bien en la autopsia, cuando los analitos bioquí-
micos clásicos no se pueden valorar.
Los análisis presintomáticos de ADN se aplican principalmente a trastornos
dominantes de inicio tardío, en los cuales los descendientes de un padre afec-
tado son conscientes de que tienen un 50% de riesgo de heredar la enferme-
dad y desean saber su estado antes del inicio clínico para informarse sobre
decisiones reproductoras y de empleo o iniciar intervenciones de vigilancia y/o
preventivas. Prototipos de trastornos de este grupo son la enfermedad de
Huntington y los síndromes hereditarios del cáncer, aunque también son rele-
vantes enfermedades como la neurofibromatosis, síndrome de Marfan, enfer-
medad del riñon poiiquístico en adultos y la esclerosis tuberosa. Este tipo de
prueba ha sido la más problemática de la genética molecular diagnóstica
desde el punto de vista psicosocial y ético, con un riesgo sustancial de graves
consecuencias adversas del informe de los resultados, incluyendo el suicidio.
Debido a esto, los protocolos de pruebas establecidos incluyen la condición del
consentimiento mlormado, la evaluación clínica simultánea, el consejo genéti-
co amplio antes y después de la prueba y el apoyo psicosocial {Huntington's
Disease Society ol America. 1989: American College ol Medical Genetics.
1999).
Finalmente, está la aplicación clínica más característica de la genética
médica: el diagnóstico prenatal o la detección de enfermedad en el feto. Salvo
algunas excepciones (como la hidropesía fetal de la |t-talasemia homocigota,
dwarfismo tanatofórico y la osteogenesis imperfecta de tipo I), la mayoría de
los trastornos mendelianos. especialmente los errores innatos del metabolis-
mo, no se expresan ni sintomática ni bioquímicamente en el feto; asi. el diag-
nóstico predictivo sólo puede realizarse a nivel del ADN. Incluso para los tras-
tornos que podrían detectarse bioquímicamente, el ADN a menudo se
muestra como un sustrato más accesible, desde el punto de vista obstétrico,
que los productos proteinicos o sustratos metabólicos afectados. Mientras
que los análisis moleculares pueden realizarse en cantidades muy pequeñas
de líquido amniótico o muestras de vellosidad coriómca obtenidas por méto-
dos habituales, incluso si se obtienen para otros propósitos, los análisis bio-
químicos requerirán una biopsia invasiva de tejido fetal profundo, a menos
que los productos proteinicos se expresen en fibroblastos (y asi, ammocitos).
Por ejemplo, el análisis de actividad de la (enilalanina-hidroxilasa para diag-
nosticar la fenilcetonuria requeriría biopsia de hígado fetal, y la cuantificación
de distrofina para el diagnóstico de la distrofia muscular de Duchenne reque-
riría biopsia de músculo fetal.
Es evidente que el objetivo fundamental del diagnóstico prenatal es la
identificación de un feto afectado de una manera oportuna para poder ofre-
cer una opción práctica de interrupción del embarazo a la pareja. Mientras
que algunos pueden argumentar una ventaja de la obtención de diagnósticos
prenatales para poder instaurar rápidamente una terapia en el nacimiento o
para la tranquilidad psicológica de una pareja si se observa que el feto no
está afectado, es difícil justificar el nesgo de aborto en la amniocentesis y la
obtención de muestras de vellosidad coriómca (CVS) realizadas para estos
 1376 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÌA MOLECULAR
propósitos. Para un feto afectado, a menos que se tenga la intención de ini-
ciar terapia en el útero, es perfectamente aceptable el tratamiento provisio-
nal en el nacimiento mientras se espera la prueba neonatal. Mientras que el
consejo genético prenatal no es siempre una normativa, con objeciones
morales y/o religiosas respecto al aborto, tanto el consejero clínico como la
prueba de ADN del laboratorio tienen un derecho legítimo y la responsabili-
dad para cuestionar la conveniencia de la petición de una prueba prenatal,
con su riesgo y coste acompañantes, en una pareja para quienes la interrup-
ción no es una opción (igual se aplicaría a las peticiones tardías de inte-
rrupción del embarazo). Debido a estos problemas, esta prueba prenatal
invasiva no se ofrece como una herramienta de cribado en la población
general a las mujeres sin historia familiar del trastorno en cuestión. El poder
de la PCR para permitir análisis genéticos de una sola célula ha abierto
recientemente el camino para el diagnóstico preimplante, enfocado normal-
mente a la realización de fecundación in vitro y microdisección de un solo
blastómero del embrión inicial (véase Cap. 21). Esta estrategia, ya aplicada
a casos seleccionados con riesgo de fibrosis quística (Handyside. 1992) y
otros trastornos, podría ofrecerse a algunas parejas de riesgo que no consi-
deran el aborto como una opción, aunque tengan sus propias objeciones éti-
cas (y económicas). A pesar de estos dilemas médicos y morales, la prueba
de genética molecular prenatal, realizada en circunstancias apropiadas, se
puede ofrecer a parejas de riesgo, muchas de las cuales han padecido ya el
trauma de tener al menos un descendiente afectado, uno de los servicios
más valiosos de toda la medicina clínica.
CONCEPTOS ESPECIALES ÚNICOS DE
LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENÉTICOS
Aunque las técnicas tratadas en este capítulo de análisis de ADN para el
diagnóstico de enfermedades genéticas son generalmente las mismas que
las usadas para el diagnóstico molecular del cáncer o enfermedades infec-
ciosas, su aplicación en aquéllas ha revelado ciertos fenómenos inusuales
que deben tenerse en cuenta cuando se está tratando con determinados tras-
tornos hereditarios. Algunos de estos conceptos se conocen desde la época
de Mendel, aunque ahora se comprenden a nivel de ADN; otros han surgido
más recientemente como subproductos inesperados de la disección molecu-
lar de los genes específicos de enfermedad.
Heterogeneidad molecular
Muy pocos trastornos genéticos se han asociado con una sola mutación
identificada de forma constante en todos los casos afectados (p. ej„ la muta-
ción sustilutiva en el codón 6 del gen de la (3-globina que causa la anemia fal-
cíforme). La gran mayoría de los trastornos genéticos se originan por más de
una, en ocasiones centenares de mutaciones diferentes dentro del gen pato-
lógico (ej., el gen CFTR de la librosis quística). incluso algunas veces por más
de un gen (ej., los genes TSC1 y TSC2 de la esclerosis tuberosa o los BRCA1
y BRCA2 del cáncer familiar de mama y ovario). Obviamente, la identificación
en tales trastornos de las mutaciones causantes es técnicamente mucho más
difícil, si no imposible. Una consecuencia de esta heterogeneidad molecular
es que no todas las mutaciones producirán enfermedades igual de graves;
algunas pueden causar sólo formas leves, incluso síndromes relacionados
con poco parecido con el fenotipo clásico. Toda esta variabilidad se añade a
la gran complejidad del consejo genético y de los análisis genéticos.
Penetrancia variable y expresividad
La penetrancia se refiere a la proporción de individuos que, habiendo here-
dado un gen patológico mutante, presentan el fenotipo patológico. Normal-
mente se aplica a trastornos dominantes, y puede producir en el árbol gene-
alógico de la enfermedad el aspecto llamativo de "salto generacional". Esto
puede complicar tanto el diagnóstico molecular como el consejo genético, ya
que podría no estar claro si el probando heredó la enfermedad de un padre o
en cambio, representa una nueva mutación en la familia. Ésta es una carac-
terística de trastornos genéticos relativamente comunes, como el síndrome de
Marfan y la neurofibromatosis; ambos genes se han identificado, pero en la
mayoría de los casos todavía no es tan fácil trabajar con la detección directa
de mutaciones que sustituya al análisis de ligamiento o a técnicas de explo-
ración de mutaciones.
La expresividad variable se refiere a la aparición de diferentes signos y sín-
tomas del trastorno en sujetos que heredan la misma mutación o mutaciones.
Al igual que la penetrancia, la expresividad variable probablemente sea un
reflejo de efectos génicos diferenciales dentro de orígenes genéticos distintos
(en otras palabras, la modulación de la expresión fenotípica mediante otros
genes no alélicos). Ésta también requiere averiguaciones y dificulta el conse-
jo; además, plantea cuestiones éticas en la consideración del aborto en enfer-
medades de gravedad variable e impredecible (como la fibrosis quística).
Entrecruzamiento
El fenómeno de recombinacíón meiótica entre cromosomas homólogos es,
además de la mutación aleatoria, la principal fuerza conductora después de
la diversidad genética y la evolución en los organismos de reproducción
sexual. Su importancia en la genética molecular diagnóstica radica en la rup-
tura del ligamiento entre un gen patológico y un marcador polimórfico cerca-
no, dando lugar al diagnóstico de falsos positivos o falsos negativos en los
trastornos analizados mediante pruebas de ligamiento. Como se explicó con
anterioridad, se puede minimizar el riesgo eligiendo marcadores más estre-
chamente ligados o en el flanco del gen patológico. Esto es más factible, por-
que el mapa del genoma humano presenta numerosos polimorfismos de
repeticiones cortas en tándem, a los que puede accederse fácilmente con
cebadores de PCR.
Disomía uniparental
Causa poco usual de trastorno recesivo de un solo gen. descubierta por pri-
mera vez en un paciente con fibrosis quística (CF). de cuyos padres sólo uno
era portador (Spence, 1988). Mediante haplotipado de ADN usando marca-
dores polimórficos, se demostró que el paciente había heredado dos copias
del cromosoma 7 del padre portador que contenia el gen mutante de la CF y
no el cromosoma 7 del otro padre. El fenómeno se ha observado en otros
casos de CF y también en enfermedades que implican a otros cromosomas.
Para algunas enfermedades, como los síndromes de Prader-Willi y de
Angelman (véase más adelante), la incidencia de disomía uniparental (UPD)
se aproxima a la de otros mecanismos clásicos de mutación de la patogéne-
sis molecular, justificando una prueba sistemática para este fenómeno.
Impronta
La impronta se refiere a la expresión diferente de un gen en un descendien-
te, dependiendo de si lo ha heredado de la madre o del padre; a veces depen-
de de otros factores epigenéticos (Hall, 1999). Algunos genes sólo se expresan
o se desconectan cuando proceden del ovocito y otros sólo cuando proceden
del espermatozoide. Si un individuo hereda el alelo normal a través de la línea
parental donde no se expresa, no puede contrarrestar una mutación recesiva
heredada del otro padre. El mecanismo molecular, al menos en algunos casos,
parece ser la metilación diferencial de regiones del cromosoma y elementos
reguladores. Ésta es la base tanto de los casos de delecíón como de UPD de
los síndromes de Prader-Willi y de Angelman (véase más adelante).
Anticipación
Este término se refiere al incremento progresivo en la gravedad y/o edad
de inicio de un trastorno genético en generaciones posteriores de una familia.
Se caracteriza por estar asociada con trastornos por repetición de trinucleoti-
de como la distrofia miotónica y el síndrome X frágil, en los cuales el aumen-
to de la gravedad puede correlacionarse con una mayor expansión de la
región de repetición. En la enfermedad anterior, los hijos nacidos de madres
afectadas son casos especialmente graves con inicio en la niñez o a edad
infantil, dando a entender también una influencia mediante impronta (López,
1994). Lo contrario se observa en la enfermedad de Huntington, donde la
expansión de repetición de un tríplete se produce con mayor probabilidad
cuando se hereda del padre. Menos frecuentemente, se ha observado el
fenómeno opuesto, la contracción. Por estas razones es tan importante para
el diagnóstico y el consejo genético en estos trastornos la separación mole-
cular exacta de los fragmentos de repetición de trinucleótido.
 C A P Í T U L O 66 • D I A G N Ó S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S 1377

Influencias epigenéticas y herencia no mendeliana una frecuencia de portadores tan elevada como de 1 de cada 30 en los ascen-
dientes caucásicos del norte de Europa (y de forma decreciente en el sur de
Los cambios epigenéticos son cambios hereditarios, pero potencialmente
Europa, hispanos, afroamericanos y asiáticos), existían suficientes motivos
reversibles, en la expresión génica que no representan un cambio en la secuen-
para estudiar familiares de pacientes e incluso a la población general con el fin
cia del ADN genómico de la célula. Los ejemplos más destacados de herencia
de identificar parejas con un riesgo de 1 de cada 4 de tener un hijo afectado
epigenética son las improntas genómicas (tratadas anteriormente) y la inactiva-
en cada embarazo. Pero ya que estos portadores son asintomáticos y tienen
ción del cromosoma X en mamíferos; ambas implican el silenciamiento trans-
niveles normales de cloruros en el sudor, se tuvo que esperar al aislamiento
cripcional de genes por metilación de citosinas en dinucleótidos CpG. El estado
del gen en 1989 (Riordan, 1989: Kerem. 1989) Algunos años antes se había
de metilación del ADN se mantiene posteriormente a la replicación del ADN
mapeado el cromosoma 7, permitiendo el diagnóstico prenatal mediante aná-
mediante metilasas. que también actúan sobre el ADN bcalenario hemimetila-
lisis de ligamiento en familias que buscaban información, realizando explora-
do para metilar la cadena de ADN recién sintetizada. El proceso se perpetúa
ciones masivas y analizando en otras familias, especialmente en las que no
indefinidamente en divisiones celulares sucesivas. Una evidencia reciente
presentaban antedecentes familiares del trastorno; esto sólo pudo considerar-
sugiere que la metilación de novo de los dobletes CpG puede tener lugar en los
se una vez que el gen se clonó y las mutaciones fueron identificadas.
promotores de algunos genes supresores de tumores, silenciando estos genes
y constituyendo esencialmente uno o ambos de los "impactos" en un gen supre- Sin embargo, el análisis del ADN para la CF ha estado lleno de problemas
sor de tumor que conduce al desarrollo del tumor (Jones. 1999). y controversias. El gen consta de alrededor de 250.000 bp y codifica una gran
proteína de canal iónico denominada regulador de la conductancia transmem-
Otra categoría de herencia epigenética menos aclarada implica la propie- brana de la fibrosis quística (CFTR) (Collins. 1992). Lo más notable es que el
dad de algunas proteínas para regular la conformación de proteínas recien espectro de mutaciones observadas es notablemente heterogéneo. Mientras
sintetizadas o ensambladas de forma autoperpetua. Los ejemplos más carac- que una deleción de tres nucleótidos del codón "508 de la fenilalanina (desig-
terísticos en mamíferos son las enfermedades por priones, responsables de nado como AF508) explica alrededor del 70% de las mutaciones en caucási-
la encefalopatía espongiforme ovina y la enfermedad de las vacas locas en cos (y significativamente menos en otros grupos étnicos), unas 800 mutacio-
animales y del curu y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos. La nes adicionales han sido informadas hasta ahora. La mayoría de ellas son tan
enfermedad se produce por la proteina prión, que tiene la misma secuencia poco frecuentes que no es factible ni rentable incluirlas en los paneles de prue-
de aminoácidos que una proteína normal pero está plegada con una confor- bas: sólo alrededor de siete (además de la \F508) explican más del 1% de las
mación anómala, y sirve aparentemente como una plantilla para la proteina mutaciones de CF en la mayoría de las poblaciones caucásicas (Tsui. 1992)
recién sintetizada de tal modo que perpetua la anomalía conformacional que (Tabla 66-1). La sensibilidad del cribado de portadores con paneles estándar
origina la enfermedad. de mutaciones de entre 6 y 25 alelos varía desde un 97% en judíos asquena-
zis (procedentes de Europa) (Abeliovich. 1992), un 75% a un 90% en caucá-
Frecuencias alélicas y exploraciones masivas sicos norteamericanos no asquenazis, alrededor del 60% en hispanoamerica-
de la población nos, el 50% en afroamericanos y menos del 10% en asiáticos (Ober, 1992;
Orozco, 1993; Curtis, 1993; Grebe, 1994; Macek, 1997). Tal sensibilidad varia-
Ya se ha hecho referencia a la aplicación de estudios de detección de por- ble y subóptima en una población étnicamente heterogénea como la de
tadores para mutaciones recesivas en grupos amplios de población. Para jus-
tificar el esfuerzo y el gasto requeridos al realizar una prueba de ADN en miles
o millones de personas desde el punto de vista de la sanidad pública, la inci-
Tabla 66-1 Algunas mutaciones predominantes d e fibrosis
dencia de esta enfermedad debe ser lo suficientemente alta en la población en quística
general o en el grupo étnico o racial objeto del estudio. La ley del equilibrio de
Hardy-Weinberg predice que la frecuencia del portador será mucho más alta Mutación Comentario
para cualquier enfermedad aulosómica recesiva de incidencia apreciable. La AF508 Deleción de 3 bp sm cambio del marco de
enfermedad diana candidata debe ser lo suficientemente grave y/o favorable a lectura del codón phe, la principal mutación
alguna intervención médica en base a su identificación. Diversos trastornos no de la CF presente hasta en un 70% de
parecen corresponderse con estos criterios. Mutaciones asociadas con hemo- portadores de algunas poblaciones
caucásicas
cromatosis hereditaria y resistencia a la proteina C activada (factor V Leiden)
G542X Mutación sin sentido, alrededor del 3% de
se encuentran en el 5% al 7% de la población caucásica, mientras que la fre-
portadores c a u c á s i c o s
cuencia de portadores para la mutación de la anemia falciforme se aproxima W1282X Mutación sin sentido, presente en alrededor
al 19% en la población de afroamericanos. Las mutaciones de la fibrosis quis- del 50% de portadores judíos asquenazis
tica. aunque de menor frecuencia, colocan a tal cantidad de parejas nortea- G551D Mutación sustituliva. alrededor del 3% de
mericanas en riesgo que también se ha propuesto en niveles superiores como portadores c a u c á s i c o s
N1303K Mutación sustituliva, 1-3% de portadores
un objetivo válido de cribado en la población (véase más adelante). Este des-
caucásicos y judíos asquenazis
plazamiento de la prueba de genética molecular fuera del campo de enferme- R553X Mutación sin sentido, alrededor del 1.5% de
dades raras y dentro del ámbito de estudios comunes tendrá un gran efecto en portadores c a u c á s i c o s
la medicina preventiva y la sanidad pública y conducirá a nuevos progresos en 3849 + 10kbC -*T Mutación de una secuencia de unión
la automatización de las pruebas de ADN en años venideros. exón-mtrón; 1.5 y 4%, respectivamente, de
portadores caucásicos y ludios asquenazis;
asociado con enfermedad pulmonar pero
con niveles normales de cloruros en sudor
EJEMPLOS ESPECÍFICOS DE ENFERMEDAD 3905insT Mutación inserción/cambio del marco de
lectura, alrededor del 1.5% de portadores
caucásicos
Fibrosis quística R117H Mutación sustituliva asociada con ausencia
congénita de los conductos deferentes.
Debido a la alta frecuencia de portadores en América del Norte y norte de frecuencia estimada del t%-5%
Europa, la naturaleza clínica grave, el patrón directo de herencia mendeliana 621 + IG -»T Mutación de una secuencia de unión exón-
(aulosómica recesiva) y a su gen bien estudiado aunque bastante complejo, la intrón, alrededor del 1.5% de portadores
CF ha surgido como un trastorno paradigmático para las pruebas de genética caucásicos
1717 - IG -»A Mutación de una secuencia de unión exón-
molecular a gran escala. Dentro de su ámbito se puede encontrar la gama com- intrón, alrededor del 1% de portadores
pleta de técnicas de genética molecular aplicables y un completo espectro de caucásicos
dilemas científicos y éticos que surgen de la variabilidad climca de la enferme- 3120 + IG ¿Ea Mutación de una secuencia de unión exón-
dad, la heterogeneidad molecular extrema de las mutaciones causantes y la lle- intrón encontrada en el 12% de pacientes
gada de nuevos tratamientos que incluyen la terapia de sustitución génica. Con afroamericanos
 1378 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
Estados Unidos y las dificultades que supone el consejo a pacientes en cuan-
to al riesgo residual de un análisis negativo en un portador, ha hecho que la
detección de portadores de mutaciones de la CF basada en la población sea
un tema polémico (Wilfond, 1990; Williamson, 1993: Grody, 1999). a pesar de
que una declaración consensuada recomienda que el estudio sea ofrecido a
todas las parejas embarazadas y a aquellas que tienen planes de hacerlo
(NIH, 1997). Aunque la mutación AF508 se puede detectar mediante migra-
ción diferencial en gel de poliacrilamida (Fig. 66-1) (Chong, 1990) y varias
mutaciones producen patrones característicos de digestión por endonuclea-
sas de restricción, el estudio de laboratorio para 30 o más mutaciones depen-
de de estrategias con sondas ASO mezcladas (como la ¡lustrada en la
Fig, 66-3) o transferencias en mancha inversas (en las cuales los productos de
PCR marcados del paciente se hibridan con una serie de sondas de oligonu-
cleótidos 'tipo salvaje" (wild-type) y mutantes inmovilizadas en un filtro (Che-
hab, 1992; Shuber, 1997). Hasta que existan avances tecnológicos en la
secuenciación rápida y barata del ADN, la hibridación en "micromatriz" y los
análisis de proteínas para la función del CFTR, la sensibilidad de la prueba
anteriormente citada probablemente seguirá siendo la misma. Esto representa
un problema especial para el consejo prenatal de parejas en las cuales la prue-
ba de un cónyuge es positiva y la del otro negativa. No se puede ofrecer nada
más en cuanto al diagnóstico prenatal, incluso si el cónyuge negativo es un
portador, o si él o ella tienen una mutación que no puede analizarse en el feto,
lo que aumenta la ansiedad con respecto al embarazo en curso. Se ha pro-
puesto evitar la cuestión en su conjunto adhiriéndose a un modelo de detección
precoz de la CF basado en la pareja, en el cual los resultados se informan
como negativos incluso si se observa que un cónyuge es portador (Wald.
1991); sin embargo, este enfoque aumenta las cuestiones éticas acerca de la
no revelación de información médica y otros asuntos (Miedzybrodzka, 1991).
Otro problema con el consejo genético de la CF es el de la variable grave-
dad clínica del trastorno y la discrepancia de correlaciones entre genotipo y
fenotipo. Más allá del hallazgo de que los homocigotos AF508 tienden a
padecer insuficiencia pancreática, se sabe poco acerca de la gravedad de la
enfermedad o complicaciones que puedan predecirse con fiabilidad a partir
del conocimiento de un individuo afectado con dos mutaciones (Cystic Fi-
brosis Genotype-Phenotype Consortium. 1993). Incluso los homocigotos para
AF508, considerada la mutación "grave" prototípica, pueden mostrar un
amplio rango en su grado de afectación pulmonar (Burke, 1992). Por el con-
trario, existen mutaciones que originan enfermedad pulmonar aun mante-
niendo niveles normales de cloruros en el sudor (Highsmíth, 1994); hay mu-
taciones y polimorfismos (como R117H y una extensión intrónica de
politimidina) que no siempre producen CF sino algo de infertilidad masculina
debido a la ausencia congenita de conductos deferentes (Gervais, 1993; An-
guiano, 1992). Junto con la probable llegada de terapias efectivas de sustitu-
ción génica para la CF (Wilson, 1993), estos factores justifican el consejo ge-
nético debido a la dificultad de los padres para tomar una decisión sobre el
trastorno. Dada la heterogeneidad molecular y clínica de la mayoría de tras-
tornos genéticos, probablemente estos problemas son la regla más que la
excepción en la genética molecular diagnóstica.
Distrofia muscular de Duchenne
Esta miopatía progresiva ligada al cromosoma X fue el primer trastorno
cuyo gen causante fue aislado mediante el proceso de "genética inversa"
(Rowland, 1988). Antes de su descubrimiento, las únicas pruebas que podían
ofrecerse a familias de riesgo eran la detección de algunos portadores feme-
ninos, aunque no todos, mediante el hallazgo de niveles séricos elevados de
creatina cinasa, seguido de la determinación prenatal del sexo con la opción
de interrumpir el embarazo en fetos masculinos (incluso aunque el 50% de
estos embarazos fuesen normales). El consejo genético se presta incluso a
mayor problemática porque alrededor de un tercio de los casos de DMD sur-
gen a partir de nuevas mutaciones.
Incluso después de su descubrimiento, su traslado a la aplicación clínica
no fue fácil debido a que el gen, denominado "distrofina", demostró ser más
grande aún que el descubierto, abarcando 2,5 millones de bp y compuesto de
79 exones (Ahn, 1993), El uso de sondas de ADNc de longitud completa o
parcial para detectar la variedad de deleciones que se producen en dos ter-
cios de los casos, fue un trabajo laborioso que llevó mucho tiempo (Darras,
1988: Prior, 1991). Sólo con la llegada de la PCR multiplex se desarrolló un
sistema para la identificación rápida y barata de más del 98% de deleciones
del gen y su localización en los exones específicos de éste (Beggs. 1990;
Multicenter Sludy Group, 1992). En este sistema se identifica una delecíón
por la ausencia de uno o más de los múltiples amplicones esperados en
geles de electroforesis teñidos con bromuro de etidio o en instrumentos de
electroforesis capilar (ya que una delecíón en el gen diana suprimirá la
secuencia o secuencias de hibridación de uno o más cebadores, causando
un fallo en la PCR) (Fig. 66-5), El mapeado de su estructura fina junto con
la secuenciación reveló importantes ideas sobre la patogénesis molecular
de la DMD y la variante alélica más leve, la distrofia muscular de Becker
(BMD). Mientras que ambas suelen estar causadas por grandes deleciones
en el gen. en la BMD se conserva, de modo característico, el marco de lec-
tura en el transcrito resultante, en tanto que las deleciones de la DMD pro-
ducen más a menudo mutaciones del marco de lectura y un producto pro-
teinico más truncado (Monaco. 1998).
El tercio restante de pacientes en los que no se han detectado deleciones
presenta normalmente mutaciones puntuales o microdeleciones/inserciones.
Debido al tamaño del gen. no es factible identificar estas lesiones directa-
mente, debiendo volver al análisis de ligamiento; también se ha estudiado el
gen por análisis conformacional (SSCO, DGGE) (Prior. 1993), Como en cual-
quier estrategia de ligamiento, esta aproximación es posible sólo en familias
que buscan información, en las cuales el ADN de un sujeto previamente
afectado está disponible para su estudio. Los protocolos iniciales dependie-
ron de marcadores RFLP que flanquean el gen de la distrofina (Williams,
1986); más recientemente, marcadores microsatélite intragénicos han per-
mitido el haplotipado más rápido y exacto del cromosoma basado en la PCR
(Beggs. 1990). Alternativamente, pueden realizarse estudios a nivel proteíni-
co mediante la observación de una distrofina disminuida o ausente en la
DMD y una distrofina de peso molecular anómala en la BMD, mediante trans-
ferencia Western (Western blot) o ¡nmunohistoquímica de biopsia de tejido
muscular (Hoffman, 1988). Este procedimiento tiene limitaciones para el
diagnóstico prenatal, para el cual se requeriría una biopsia de músculo fetal;
sin embargo, el método ha sido recientemente adaptado para amniocitos y
células de vellosidad coriónica, inducidas a diferenciarse hacia células mus-
culares mediante técnicas de transferencia génica (Sancho, 1993). El diag-
nóstico molecular de la DMD ha vuelto al punto de partida: la identificación
del gen sin conocer el producto proteinico ("genética inversa"), para la iden-
tificación y el uso diagnóstico del producto proteinico desde el conocimiento
del gen. Esta clase de evolución se puede esperar en el diagnóstico de labo-
1234512345
Figura 66-5. Análisis mediante PCR multiplex para deleciones del gen de la distro-
fina en la dislrolia muscular de Duchenne. Las muestras de ADN de cinco pacien-
tes se amplificaron simultáneamente con cinco pares de cebadores (mitad izquier-
da del gel) y nueve pares de cebadores (mitad derecha del gel) y los productos se
analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La ausencia de una
banda esperada de un producto de PCR es indicativa de una delecíón. El pacien-
te 2 carece de la banda superior en la plex-5 y de la segunda banda superior en la
plex-9: éstas corresponden, respectivamente, a deleciones en los exones 50 y 48
del gen de la distrofina. (La banda 4 de la plex-9 es tenue, pero está presente en
todas las muestras.) (Foto cortesía de Dra. Kathryn E. Kronquisl.)
 CAPÍTUIO 66 • DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS 1379

ratono de muchas enfermedades genéticas, ya que los estudios funcionales

del producto de un gen son, por definición, más completos que intentar loca-
lizar innumerables mutaciones individuales a nivel del ADN,

Anemia de células falciformes

y otras hemoglobinopatías
Debido a la larga historia de estudio de su producto proteinico, el diagnós-
tico de los defectos moleculares de los genes que codifican los polipéptidos
de la globina no se hizo mediante técnicas de "genética inversa"; o mejor
dicho, estos genes se clonaron por métodos clásicos, usando anticuerpos
antiglobina en la precipitación polisómica para aislar los ácidos ribonucleicos
mensaieros relevantes (ARNm). De esta manera, las mutaciones de la hemo-
globina y en particular la que causa la anemia falciforme. fueron de las pri-
meras en ser diagnosticadas a nivel de ADN. Una mutación puntual de la célu-
la falciforme se encuentra dentro (por tanto, destruyéndola) de una secuencia
de escisión para endonucleasas de restricción (Msfll o Ddel) en el codón 6 del
gen de la globina [J. proporcionando un método rápido de detección usando
transferencia Southern o digestión mediante enzimas de restricción de los
productos de PCR del gen de la globina [i (Hatcher, 1992) (Fig. 66-2). De for-
ma alternativa, las secuencias de hemoglobina S y hemoglobina A se pueden
distinguir mediante transferencia en mancha usando sondas de oligonucleoti-
des especificas de un alelo complementarias a la secuencia normal o mulan-
te (Conner, 1983). Estas técnicas se pueden usar para el diagnóstico, criba-
do de portadores o diagnóstico prenatal; en este último caso es obvia la
necesidad de una obtención invasiva de sangre letal y la electroforesis clási- Figura 66-6. Eiemplo de análisis electrolorético mediante PCR de la mutación del
ca de hemoglobinas. La prueba de ADN se vuelve importante para la confir- tactor V Leiden. Un fragmento amplificado por PCR del gen del factor V que apar-
mación de apoyo de los resultados positivos y ambiguos de los estudios, ca el codón 506 presentará dos secuencias de escisión para la enzima de restric-
ción Mnñ en el ADN normal, pero sólo una si contiene la mutación R506Q, que
incluso si se hacen por métodos bioquímicos, puesto que más estados han
destruye una de las secuencias. Los patrones resultantes de la digestión median-
iniciado los programas de detección precoz de las células falciformes en re-
te enzimas de restricción mostrarán, respectivamente, dos. tres o cuatro bandas,
cién nacidos. Una mutación diferente en el codón 6, que origina la enferme-
dependiendo de si la mutación es homocigota (carril derecho), esta ausente (carril
dad de la hemoglobina C, no suprime la secuencia de reconocimiento de la
izquierdo) o heterocigota (carril central). El fragmento más corto migra cerca de la
endonucleasa de restricción (porque se da en una posición de nucleótido fle- parte inferior de la foto del gel y suele ser difícil de ver.
xible para la enzima), por tanto puede distinguirse mediante sondas ASO
(Maggio, 1993). Se debe tener en cuenta que ninguno de estos métodos iden-
tificará los heterocigotos compuestos célula falciforme/(i-talasemia o hemo-
globina C/p-talasemia.
ción es sencillo porque, al igual que la mutación de las células falciformes.
Las talasemias engloban tanto alteraciones cualitativas como cuantitativas
ésta elimina una secuencia de escisión de una endonucleasa de restricción
en una o más cadenas de globina; su diagnóstico a nivel molecular es más
(Fig. 66-6); se han desarrollado métodos automáticos para mejorar el rendi-
complejo que el de la anemia lalciforme. La u-talasemia es la más sencilla,
miento de la prueba (Ryan, 1999).
ya que normalmente se origina por la deleción de uno o los dos genes a con-
De igual modo que para la CF, existen controversias sobre a qué pacientes
tiguos en uno o los dos cromosomas 16. Se puede detectar mediante trans-
se debe proponer el estudio. A pesar del elevado nesgo relativo, el riesgo abso-
ferencia Southern o PCR, permitiendo la diferenciación del portador imper-
luto conferido por esta mutación es más bajo, con una penetrancia para los sín-
ceptible (pérdida de un gen a), de la hidropesía fetal muy grave (pérdida de
tomas trombóticos de alrededor del 10% a lo largo de la vida. Por tanto, la
los cuatro genes) y de los dos estados intermedios (Oron-Karni. 1998). El
mayoría de portadores no serian candidatos a terapia anticoagulanle a pesar
diagnostico molecular de la |i-talasemia es bastante más complicado debido
del riesgo de hemorragia e idus; tampoco es seguro si tal estudio cambiaría el
a la gran variedad de secuencias promotoras, de terminación, de deleción, de
tratamiento del paciente de un modo significativo. Se ha propuesto realizar el
unión exón-intrón y mutaciones del marco de lectura que se han documenta-
estudio en sujetos con factores de riesgo ambientales conocidos que actúan de
do. Por esta razón, el análisis de ADN para este trastorno se ha limitado a
modo sinérgico con el riesgo del factor V de Leiden. como las mujeres que
algunos laboratorios especializados.
toman anticonceptivos orales. Aun aquí podría discutirse la obligación de dichas
mujeres con una prueba positiva a volver a métodos menos eficaces de control
Trombofilias hereditarias del embarazo que podrian causar más perjuicios que beneficios, aumentando
La fibrosis quística no es el único trastorno con una frecuencia de mutación la tasa de embarazos con sus propias complicaciones de vigilancia, algunas de
lo suficientemente alta como para justificar un cribado de la población usan- las cuales, de forma irónica, son de naturaleza trombótica (Kupferminc. 1999).
do métodos moleculares. Algunos genes, recientemente caracterizados, han Hoy en día, la mayoría de peticiones recibidas por los laboratorios de genética
revelado frecuencias de portadores de una magnitud superior a las de la CF. molecular para el análisis del factor V de Leiden son de pacientes que ya han
En este grupo se incluyen genes implicados en el sistema anticoagulante, que padecido un episodio de tromboembolismo inexplicable.
controlan la cascada de la coagulación. El más notable de tales alelos es la Junto con el factor V de Leiden. existen otras mutaciones hereditarias de
mutación del factor V de Leiden: se trata de un solo cambio nucleotídico que elevada frecuencia alélica que confieren riesgo trombótico. La variante
produce la sustitución de un aminoácido (R506Q) en la proteina del factor V 20210A de la protrombina. un cambio de un solo nucleótido en la región 3' no
de la coagulación, haciéndola resistente a la escisión por la proteína C acti- traducida del gen de la protrombina. origina unos niveles altos de protrombi-
vada (Bertina, 1994). El alelo es portado por el 5% al 7% de la población cau- na circulante y un fenotipo similar al del factor V de Leiden; se encuentra en
cásica y es responsable de más del 90% de resistencia clínica a la APC, el 1% al 2% de la población general (Poort. 1996). La variante 677C-*T de la
dando como resultado una tendencia al tromboembolismo venoso idiopático metilenoletrahidrofolato-reductasa, una enzima implicada en el metabolismo
(Ridker, 1997a). Se ha informado que produce un nesgo relativo de trombo- de la homocisteina, la portan el 30% al 40% de la población general y se aso-
sis siete veces superior al normal cuando se presenta en estado heterocigo- cia con niveles plasmáticos elevados de homocisteina y riesgo de trombosis
lo y alrededor de 80 veces en el estado homocigoto. El análisis de la muta- vascular (incluida la arteriopatia coronaria). Las mutaciones para cada uno de
 1380 S E C C I Ó N VII • PATOLOGÍA MOLECULAR
estos factores pueden actuar de forma sinérgica con las otras, de modo que
los pacientes que portan dos o incluso tres de estos defectos, incluyendo tam-
bién las deficiencias menos frecuentes de proteínas S y C, tienen mayor ries-
go (Halbmayer, 1999; Ridker, 1997b; Koeleman, 1994), Las pruebas de ADN
para varias de eslas mutaciones trombofílicas se pueden multiplexar en un
solo análisis (Hessner, 1999).
Trastornos por expansión de repetición
de trinucleótido
Un tipo importante de mutación patológica se reveló en 1991 con el des-
cubrimiento de que la atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X
(enfermedad de Kennedy, SBMA) y el síndrome X frágil (FRAXA) estaban
asociados, respectivamente, con la amplificación de secuencias inestables de
repetición de trinucleótido en el gen del receptor de andrógenos (AR) y el gen
FMR1 ("retraso mental del cromosoma X frágil"). Desde entonces, mutaciones
patológicas similares se han asociado con varios trastornos neurológicos y
musculares (resumidos en la Tabla 66-2), proporcionando una clasificación
molecular de las ataxias espinocerebelares (La Spada, 1994; Bates, 1994;
Reddy. 1997; Hardy, 1998; véase también Online Mendelian Inheritance in
Man [OfvllM], http;//www3.nebí.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html). En cada
uno de estos trastornos, el gen afectado contiene normalmente una secuen-
cia repetida de 3 bp. por ejemplo (CGG)„ en el gen FMR1, donde n es varia-
ble pero está claramente limitado en su intervalo. En el estado patológico, el
número de repeticiones del triplete se expande por encima del intervalo de
normalidad, a veces de forma marcada. Son varios los mecanismos median-
te los cuales estas secuencias de repetición expandidas originan enfermedad,
incluyendo el silenciamiento génico y el aumento de la función tóxica de pro-
teínas mulantes.
Actualmente hay una sola excepción a la "regla del triplete" para las expan-
siones de repetición patológicas: una nueva expansión de repetición de 12 bp
en dirección 5' de la secuencia de inicio de transcripción del gen de la cistati-
na B, asociada con una enfermedad autosómica recesiva poco frecuente, la
epilepsia mioclónica progresiva de tipo 1 (Larson. 1999).
Síndromes XA frágil y XE frágil
El FRAXA, la causa más común de retraso mental hereditario (1 de cada
1.250 hombres), es la segunda causa de retraso mental de moderado a grave
en hombres, tras el síndrome de Down. Los hombres afectados con este tras-
torno ligado al cromosoma X tienen también orejas grandes, cara alargada y
nariz prominente. Aproximadamente 1 de cada 2.500 mujeres son portadoras
heterocígotas de mutación para el FRAXA, y una tercera parte de éstas puede
presentar evidencias de una ligera disfunción mental. El sello citogenético del
FRAXA es una "zona frágil" en la región Xq27.3 del cromosoma X, causada
por un defecto en la condensación normal de la cromatina durante la mitosis.
Aunque el patrón hereditario de la enfermedad está claramente ligado al cro-
mosoma X. no se corresponde estrictamente con un patrón dominante o rece-
sivo de expresión génica. La principal característica anómala ha sido la pre-
sencia de hombres fenofipicamente normales ("hombres normales
transmisores") que son portadores obligados de la anomalía genética. Estos
hombres son hijos de portadores demostrados del FRAXA: pasan el estado
de portador a todas sus hijas y éstas a su vez transmiten la enfermedad com-
pletamente expresada a una alta proporción de sus hijos.
El descubrimiento en 1991 de la anomalía genética que produce el FRAXA
clarificó inmediatamente su patrón inusual de herencia (Fu, 1991). La región
5' no traducida del gen FMR1 situado en la posición Xq27.3 del cromosoma
X porta un triplete (CGG). repetido un número de veces variable. En sujetos
normales, n varía hasta 50, pero en individuos con FRAXA clínicamente apa-
rente, n es superior a 200 (denominada "mutación completa"). Tanto los hom-
bres como mujeres que portan un cromosoma X con n situado entre 50 y 200
(denominada "premutación") son fenotipicamente normales, pero tienen un
riesgo elevado de transmitir a sus hijos un alelo incluso de un tamaño mayor.
Esto se debe a la inestabilidad de los alelos con premutación y su tendencia
a aumentar en tamaño durante las divisiones celulares meióticas que se pro-
ducen en los gametos masculinos y femeninos. Los alelos de tamaño normal
son estables y se transmiten sin alteraciones. Parece que existe una mezcla
de alelos con pequeñas premutaciones en la población, posiblemente de ori-
gen ancestral, que tienen un riesgo elevado de sufrir expansiones adicionales
cada vez que se transmiten a otra generación. Como el alelo con premutación
aumenta en tamaño, se incrementa la probabilidad de que se expanda más
en la próxima generación. Curiosamente, la expansión a una mutación com-
pleta sólo sucede en la meiosis femenina, nunca en la masculina, lo cual se
corresponde con la observación de que las hijas de hombres normales trans-
misores son siempre fenotipicamente normales. La Figura 66-78 ilustra una
familia con FRAXA: un alelo con premutación se transmite de la primera a la
segunda generación, expandiéndose a una mutación completa en la tercera
generación.
Se está investigando el mecanismo por el cual la repetición expandida del
triplete en la región 5' no codificante del gen FMR1 produce el fenotipo
FRAXA. Debido al tamaño de las expansiones de repetición, existe una metí-
lación progresiva de la región reguladora del gen FMR1 y una expresión dis-
minuida de la proteina FMR-1. Esta proteina de unión al ARN se expresa
ampliamente durante el desarrollo del cerebro y de otros tejidos. Su pérdida
de expresión en el FRAXA puede alterar el desarrollo normal del cerebro y ori-
ginar retraso mental (La Spada, 1994). Un escaso número de pacientes con
síndrome X frágil típico no presentan expansión de repetición de tripletes o
hipermetilación génica, pero presentan mutaciones de inactivación que dan
lugar a la pérdida de expresión de la proteína FMR1. También se han descri-
to dos hermanos fenotipicamente normales con expansiones de repetición
completas del gen FMR1 y zonas frágiles visibles citogenéticamente. pero sin
hipermetilación génica y expresión normal de la proteína FMR1 (Smeets.
1995). Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la responsable de este
fenotipo patológico es la pérdida de expresión de la proteina FMR1.
Familias poco comunes con retraso mental ligado al cromosoma X y una
zona frágil demostrable citogenéticamente en la región cromosómica Xq27-
28, pero sin hipermetilación o expansión de repetición de (CGG)n en el gen
FMR1. condujeron al descubrimiento de una segunda zona frágil más distal
en la región Xq28 asociada con hipermetilación y expansión de repetición de
(GCC)„. Individuos con expansión de la repetición superior a 200 copias pade-
cen alteración mental leve. A diferencia del FRAXA. no existe una predisposi-
ción sexual aparente en la transmisión del FRAXE (Knight, 1994).
Se ha descrito otra zona frágil, aún menos frecuente, con expansión de
repetición de un trinucleótido en la región Xq28 distal al FRAXE, denominado
FRAXF. No está claro si el FRAXF está asociado con disfunción mental
(Ritchie, 1994).
Trastornos neurodegenerativos:
enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulboespinal
ligada al cromosoma X, ataxias espinocerebelares
y atrofia dentatorubral-palidoluisana
La enfermedad de Huntington (HD), la atrofia muscular bulboespinal ligada
al cromosoma X (SBMA), las ataxias espinocerebelares (SCA) tipos 1,2,3,6,
7 y 12 y la atrofia dentatorubral-palidoluisana (DRPLA) son enfermedades
autosómicas dominantes o ligadas al cromosoma X (SBMA), caracterizadas
por una degeneración neuronal selectiva en el sistema nervioso central
(SCN). En estos trastornos aparece una expansión de repetición del trinu-
cleótido (CAG)„ en la región codificante de un nuevo gen. que produce una
elongación anormal de una extensión de poliglutamina (La Spada, 1994). La
proteína anómala resultante forma inclusiones intranucleares en las neuro-
nas. Se postula que las secuencias expandidas de poliglutamina en estas pro-
teínas conducen a alteraciones en sus propiedades de unión y a un aumento
de su función que resulta tóxica para las neuronas de un modo selectivo. Se
han observado inclusiones intranucleares. producidas por estas proteínas
anómalas, en vanos de estos trastornos (Reddy, 1997; Rubinsztein, 1999).
Las repeticiones expandidas de los trastornos neurodegenerativos, así
como otros trastornos de repetición de tripletes, son inestables y tienden a in-
crementar su número en generaciones posteriores. Existe una correlación
positiva, aunque no absoluta, entre el número incrementado de repeticiones,
el inicio precoz de la enfermedad y la gravedad clínica. Al contrario que el sín-
drome X frágil y la distrofia miotónica, en los que los principales aumentos del
número de repeticiones suceden en la meiosis materna, la transmisión pater-
na produce las mayores expansiones en los trastornos neurodegenerativos.
1382 S E C C I Ó N VII • PATOLOGIA MOLECULAR

-o

Figura 6 6 - 7 . Detección de la expansión de repetición de (CGG|„ en el síndrome X frágil. A, Diagrama de alelos normales, con premutación y con muta-
ción completa en el locus del FRAXA. Cuando hay una expansión de la repetición a una mutación completa, la secuencia de la enzima de restricción
Eag I se metila y no se corta con la enzima. 6 , La familia de un paciente (cuadrado oscuro) con síndrome X frágil. Una transferencia Southern de ADN
digerido con EcoR \IEag I de cada individuo en el árbol genealógico se examinó con una sonda marcada de ADN que híbrida en 3' con la repetición.
Los tres sujetos de la parte derecha de la figura son normales (cuadrados y círculos claros). Obsérvese que cada uno de los dos hombres presenta una
sola banda de 2,8 kb, mientras que la mujer tiene ambas bandas, una de 2,8 y otra de 5.2 kb. Éste es el resultado esperado. La banda de 5,2 kb de la
mujer es el cromosoma X inactivo normal (y, por tanto, metilado) de cada una de sus células. El ADN de este cromosoma está metilado y no se corta
por Eag I. Sin embargo, la banda de 2,8 kb procede del cromosoma X activo no metilado (en este caso, Eag I cortará el ADN) de la mujer y de los hom-
bres. El hombre afectado presenta una gran banda aumentada, como consecuencia de una marcada expansión de repetición de trinucleótido además
de metilación en la secuencia de la enzima de restricción Eag I. Los tres individuos marcados por puntos negros son portadores de alelos con premu-
tación. En las mujeres, la distinción entre alelos normales y expandidos se observa más claramente en el ADN procedente de sus cromosomas X acti-
vos (no metilados). Aquí, hay bandas distintas de 2,8 kb y 3,0 kb. La resolución no es tan buena en la parte superior del gel y los alelos de 5,2 y 5.4 kb
apenas están separados. Obsérvese que en la muestra de sangre periférica procedente de la madre del paciente afectado, la inactivación del cromo-
soma X está sesgada con respecto a la expansión de repetición: una proporción mayor de cromosomas X normales de esta población celular se ha
inactivado aleatoriamente comparado con los cromosomas X que portan el alelo con premutación. C, Separación de repeticiones de trinucleótido por
electroforesis en gel posterior a la amplilicación del locus mediante PCR (Levinson, 1994). Los carriles del 1 al 6 representan seis individuos diferentes;
3?
el carril M contiene un marcador de tamaños. Los productos de PCR se marcaron mediante la incorporación de P-dCTP durante la reacción de ampli-
ficación y el gel seco se expuso sobre una película de radiografía. Las mujeres heterocigotas presentan dos alelos, los hombres y las mujeres homoci-
gotas muestran sólo un alelo. Las bandas múltiples producidas con cada alelo se deben al fenómeno de "slippage" ("deslizamiento") de la ADN-poli-
merasa durante la reacción de la PCR: la banda más intensa se toma como representativa del tamaño real del alelo. (C, Cortesía de Dra. Anre
Maddalena. Genetics & IVF Institute, Fairfax. VA.)
 C A P Í T U L O 66 • D I A G N Ó S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S
En consecuencia, los casos de inicio juvenil de HD, DRPLA y las SCA se
transmiten normalmente a través del padre (Reddy, 1997).
A diferencia de las SCA anteriormente descritas, la SCA 8 autosómica
dominante no se asocia con una expansión del fragmento de poliglutamina,
aunque si con una expansión de CTG no codificante (Koob, 1999), Ésta tam-
bién difiere de las otras SCA en su patrón de inestabilidad de repeticiones,
con expansiones predominantemente maternas, algunas muy grandes. En
este aspecto, la enfermedad se asemeja a la distrofia miotónica.
Distrofia miotónica
La distrofia miotónica (DM) es un trastorno multisistémico autosómico
dominante con un amplio rango de manifestaciones clínicas. En la infancia
tardía o edad adulta temprana, los pacientes clínicamente más característicos
desarrollan miotonía progresiva, debilidad y atrofia de los músculos distales
de las extremidades y cara. También es frecuente la aparición de: cataratas,
defectos en la conducción cardiaca y atrofia leslicular. La enfermedad puede
ser leve y consistir únicamente en cataratas que se desarrollan durante la
vejez, o ser tan grave que presenta al nacimiento una degeneración muscu-
lar marcada y retraso mental, seguido de muerte a edad temprana, A menu-
do se pueden observar todas las manifestaciones de la enfermedad en la
misma familia, sucediendo en un patrón denominado por los genetistas como
"anticipación": en generaciones posteriores, la enfermedad se hace más
grave y con su inicio a edad más temprana. La anticipación está presente en
todos los trastornos de repetición de trinucleótido, pero es más llamativa en la
DM, donde el fenotipo clínico puede progresar en tres generaciones desde
cataratas a enfermedad congénita grave.
La DM está causada por una expansión de repetición de (CTG),, en la re-
gión 3' no traducida del gen de la proteina cinasa miotonina en la región cro-
mosómica 19q13.3 (Mahadevan. 1992; Fu, 1992). En individuos normales,
esta repetición varia entre 5 y 35. y es genéticamente estable. Las repeticio-
nes CTG superiores a 50 son genéticamente inestables y propensas a la
expansión cuando se transmiten a generaciones posteriores. En el intervalo
de 50 a 100, estas repeticiones suelen ser asintomáticas o producir síntomas
mínimos. Cuando están presentes repeticiones mayores de 100, el fenotipo
típico de la DM es el más probable. Aunque existe una correlación entre la
longitud de las repeticiones y la gravedad clínica, el número de repeticiones
no es un indicador de pronóstico fiable en un caso individual. Las expansio-
nes extremas de 1.000 a 2.000 repeticiones observadas en la DM congénita
se dan sólo con la transmisión femenina de una repetición inestable; la DM
congénita siempre se hereda de la madre.
No se conoce el mecanismo por el cual las repeticiones expandidas de tri-
nucleótido del gen de la proteina cinasa miotonina produce el fenotipo DM. Ya
que la repetición no se localiza en la región codificante del gen. es posible que
la expresión proteínica esté alterada o que estén perturbadas las interaccio-
nes reguladoras del ARNm.
Ataxia de Friedreich
La ataxia de Friedreich (FRDA)
1383
rar alelos que difieran en tamaño por una sola unidad de repetición. Esto es
de particular importancia cuando se necesita diferenciar entre alelos estables
en el límite superior de tamaño y alelos con pequeñas premiaciones o pato-
lógicos. Sin embargo, cuando las expansiones de triplete son muy grandes,
como las manifestaciones completas de FRAXA o DM, puede ser imposible
amplificar mediante PCR el gran segmento expandido de ADN: en este caso,
se prefiere utilizar la transferencia Southern. La figura 66-7 ilustra el uso de
transferencia Southern y PCR para detectar mutaciones completas del
FRAXA y alelos del FRAXA con premutaciones.
Síndromes de Prader-Willi y de Angelman
Estos dos trastornos, cuyos genes están situados aproximadamente en
el mismo locus del cromosoma 15, casi siempre se estudian juntos, incluso
aunque sean causados por dos genes diferentes y no tengan fenotipica-
mente casi nada en común. El síndrome de Prader-Willi (PWS) se caracte-
riza por obesidad, retraso mental, hipoplasia genital y rasgos dísmórticos,
mientras que el síndrome de Angelman (AS) presenta ataxia, rostro similar
a una marioneta, retraso mental, sonrisa mantenida y crisis convulsivas.
Pero comparten un potente mecanismo de impronta que determina la mani-
festación de la enfermedad. Los dos trastornos suelen ser esporádicos. El
PWS. cuyo gen se desconoce, a menudo se origina por una delecíón en la
región 15q11-13 del cromosoma paterno: sólo el gen PWS paterno se ex-
presa, por lo que resulta patológico. Lo opuesto ocurre en el AS. causado
por la delecíón de un gen conocido (UBE3A). exclusivamente en el cromo-
soma heredado de la madre, que es el único alelo que se expresa (Knoll,
1989; Matsuura. 1997). Por otra parte, el síndrome de Prader-Willi puede
producirse por UPD en el cromosoma 15 materno, que porta sólo la copia
que no se expresa del gen; asimismo el síndrome de Angelman se origina
por UPD en el cromosoma 15 paterno. Estos tenómenos se pueden delec-
tar mediante FISH, haplotipado cromosómico con marcadores microsatélite
o transferencia Southern con enzimas de restricción sensibles a la mediación
que pueden distinguir la región crítica materna metilada de la región critica
paterna no metilada (Lerer, 1994). Más recientemente, se ha desarrollado un
sistema de PCR diferencial que amplifica cualquier alelo metilado o no meti-
lado cercano al gen SNRPN dentro de la región critica, basado en la resis-
tencia de las citosinas metiladas a la modificación química por bisulfito sódi-
co (Kosaki, 1997) (Fig. 66-8) Sin embargo, es importante tener en cuenta
que ni la transferencia Southern ni los métodos de PCR distinguirán entre
los mecanismos de delecíón o de UPD ni detectarán casos (más frecuente
en AS) debidos a mutaciones puntuales dentro del gen causante. Estos
métodos también distinguirán casos poco frecuentes de AS o PWS debidos
a defectos primarios de impronta (Burger. 1997). los cuales tendrían mayor
riesgo de recurrencia.
Cánceres familiares
En cierto sentido, todos los cánceres son trastornos genéticos causados
por mutaciones en genes que controlan la proliferación y diferenciación celu-