DETECCIÓN DE VIBRIO SPP EN ALIMENTOS.

Entre los alimentos involucrados en ETA’s que están contaminados por V. cholerae resaltan
los moluscos bivalvos así como los crustáceos y los pescados frescos-refrigerados y
congelados. Estos productos pueden generar enfermedades a los consumidores debido a
que desde su origen están sometidos a contaminación microbiológica y química entre otras,
sumado a la forma de consumo que en muchos casos es cruda.

El cólera es una enfermedad relacionada con el abastecimiento de aguas con poca higiene,
o bien de los alimentos provenientes de aguas contaminadas con materia fecal y que se
consumen crudos. También puede aparecer V. cholerae O1 en moluscos bivalvos, crustáceos
o pescados que se obtienen de aguas no contaminadas en donde el microorganismo forma
parte de la microbiota autóctona.

La enfermedad del cólera fue descrita por primera ocasión por Pacini en 1854. Esta se
presenta por la ingesta de la bacteria viable, la cual se establece en el intestino delgado y
libera una toxina termolábil. La producción de esta toxina provoca diarrea acuosa causando
los síntomas característicos del cólera que pueden ser desde una diarrea acuosa ligera, hasta
una diarrea severa con aspecto de “agua de arroz”. El establecimiento de la enfermedad por
lo general es repentino, con periodos de incubación que varían entre las 6 h. y los 5 días.

Mediante estudios en personas voluntarias saludables, se ha demostrado que la dosis

infectiva necesaria para provocar la enfermedad es aproximadamente de un millón de
organismos, y se ha concluido que una vez adquirido el cólera la administración de tetraciclina
así como de antiácidos, mejora rápidamente el curso de la enfermedad.

El género Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos Gram-negativos, oxidasa positivos
(excepto las especies metschnikovii y gazogenes), anaerobios o anaerobios facultativos.
Muchas especies de Vibrio spp. son patógenas para humanos y están implicadas en
toxiinfecciones transmitidas por alimentos. La mayoría de los microorganismos que
pertenecen a este género no crecen en medios sin cloruro de sodio a excepción de V.
cholerae y V. mimicus, por lo tanto, debido a esta característica no es considerado un Vibrio
halofílico, aunque requieran trazas del ión sodio para su crecimiento.

Los microorganismos pertenecientes al género Vibrio que son causantes de enfermedades

gastrointestinales transmitidas por alimentos son V. parahaemolyticus y V. vulnificus. V.
parahaemolyticus es una bacteria halofílica encontradas normalmente con microbiota normal
de aguas y animales estuarios. El microorganismo tiene una distribución mundial en
ambientes estuarios y costeros, y se ha aislado de muchas especies de pescados, mariscos
y crustáceos. V. vulnificus es una bacteria halofílica encontrada en ambientes estuarios y es
fenotípicamente similar a V. parahaemolyticus. Esta bacteria causa enfermedades
transmitidas por alimentos y en heridas, cualquiera de éstas puede progresar rápidamente
hasta una septicemia mortal. Los moluscos bivalvos crudos son la principal fuente de
transmisión alimentaria del V. vulnificus.
Otros Vibrio spp. halofílicos, V. fluvialis, V. hollisae, V. alginolyticus, V. furnissii y V.
metschnikovii, se han asociado con gastroenteritis y están presentes en ambientes estuarios
junto con otras especies patógenas y no patógenas de Vibrio.

Fundamento del método de detección

Este método describe un esquema general que consiste en: Enriquecimiento a diferentes
temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se desee analizar, donde se pretende
incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos presentes en la
muestra. Aislamiento diferencial en medio sólido selectivo, el cual restringe el crecimiento de
otros géneros diferentes a Vibrio, permitiendo el reconocimiento de colonias sospechosas de
la especie Vibrio cholerae. Purificación: Las colonias características sospechosas de
pertenecer a la especie cholerae, se purifican en medios no selectivos. Identificación
bioquímica, que permite la identificación de los cultivos de V. cholerae. Pruebas serológicas,
que permitan la identificación de los cultivos de V. cholerae.

OBJETIVO
• Aplicar el método el procedimiento para la determinación de Vibrio ssp en alimentos
de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana.

MATERIALES Y EQUIPOS.
Ø Medio de preenriquecimiento de V. cholerae en:
Crustáceos frescos, refrigerados o congelados ***: 2 matraces Erlenmeyer de 500 mL con
225.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) (pH=8.5) (APA)
a. 4 tubos de 16x150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (APA)
Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS) ***
Agar de triptona 1% NaCl (T1N1)
Agar triple-azúcar-hierro (TSI)*** y/o agar de hierro Kligler inclinados (KIA)
3 tubos de 13x100 con 3.0 mL de agar arginina glucosa inclinados (AAG)
3 tubos de 13x100 con 3.0 mL de caldo triptona sin NaCl (T1N0) y/o 3 cajas con agar
gelatina al 0% de NaCl***
3 tubos de 13x100 con 3.5 mL de caldo triptona más 3% de NaCl (T1N3) y/o 3 cajas con
agar gelatina al 3% de NaCl***
3 tubos de 13x100 con 3.5 mL de caldo triptona más 6% de NaCl (T1N6) y/o 3 cajas con
agar gelatina al 6% de NaCl***
Opcional: además del TCBS, 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar modificado con celobiosa,
polimixina B y colistina (mCPC)
Reactivo de Kovac’s
Reactivo o discos para la prueba de la oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina; TMPD)
Colorantes necesarios para la tinción de Gram
Aceite mineral ó vaspar
Aceite de inmersión
Ø Equipos e instrumentos
Bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estéril
Mechero Bunsena. 1
Pipeta estéril con algodón de 1.0, 5.0 y 10.0 mL
Baño de agua a 35± 2 y 42 ± 1ºC Incubadora a 37 ± 2ºC
Incubadora a 42 ± 2ºC
Balanza granataria
Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.
Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro.
Asa bacteriológica de platino para efectuar la prueba de oxidasa
Tijeras y pinzas estériles

PROCEDIMIENTO
1. Enriquecimiento.
Tomar 25 g de la muestra y colocar 225 mL de APA. Homogeneizar en el stomacher
durante 2 minutos. La muestra debe provenir de al menos 10 crustaceos que en total
tengan un peso aproximado de 250 g.
Realizar al menos 3 diluciones y pre-incubar a 35-37°C/24h. Para productos congelados
incubar a 42 °C/24 h
2. Siembra
Después de la pre-incubación transferir el inóculo a una placa de agar TCBS y
optativamente mCPC:
i. El agar con tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) se incubará a 35-
37ºC durante 18 a 24 h.***
 ii. El agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC). La polimixina inhibe
al biotipo Clásico de V. cholerae se incubar durante 18 a 24 h a 39-40ºC.
3. Morfología colonial.
Revisar y examinar las placas a fin de determinar si se presentan las características
coloniales que a continuación se describen:
Las colonias V. cholerae en el agar TCBS son grandes, lisas, amarillas (positivas para la
fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes
translúcidos. Ver figura A

Figura. A.- Detección de Vibrio cholerae (izquierda) y Vibrio parahemolyticus (derecha)

NOTA: Las especies de Vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar
TCBS, en cambio las colonias de V. mimicus y parahemolytucus, que están estrechamente
relacionadas con V. cholerae, son verdes (sacarosa negativa). La mayoría de las demás
especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes.

Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae el contorno es púrpuras (negativas para la

fermentación de la celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas, con el
centro opaco y los bordes translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio no crecen
fácilmente en agar mCPC.

4. Selección
Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislarlas en:
i. Agar de triptona 1% NaCl (T1N1 o agar soya tripticasa con 2% de NaCl e
incubar a 35-37°C durante 12-18 h. Es necesario hacer un cultivo en un medio
no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias antes de las pruebas
bioquímicas, esto es, se puede inocular en:
 ii. Agar gelatina (GA) o agar gelatina sal (GS) en el segundo día. Los resultados
serán confiables si las placas de aislamiento y la observación microscópica
muestran que las colonias elegidas están puras.
5. Diferenciación
La fórmula para todos los medios de pruebas bioquímicas deberá contener por lo menos
un 2% de NaCl. Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten
efectuar una diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio,
Aeromonas, Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciación de las colonias
sospechosas se realiza por duplicado en:

6. Prueba de oxidasa.
Colocar un círculo de papel filtro en una caja de petri y humedecerlo con algunas gotas
de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.
Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar soya tripticasa con NaCl
al 2%, u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables (Inciso 4) y depositarlo
en el papel filtro anterior.

Figura B.- Prueba de oxidasa negativa (izquierdo) y prueba oxidasa positiva (derecho) en
especies Vibrio.

NOTA
Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o
azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidasas positivas
(excepto el V. metschnnikovii).
 7. Agar triple azúcar hierro (TSI)*** y Agar Kligler hierro (KIA)
Registrar las características del medio TSI y KIA antes de la inoculación (color del medio).
Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y
estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) y agar
de Kligler (KIA) inclinado.
Incubar el medio TSI y KIA a 35 ± 2ºC durante 18 a 24 h.

Figura C- Reacción esperada de Vibrio cholerae en agar hierro de tres azúcares TSI
(derecha) y agar de Kligler hierro

8. Agar arginina y glucosa (AAG)

Registrar las características del medio AAG antes de la inoculación (color del medio).
Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y
estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con medio AAG inclinado.
Incubar el medio AAG a 37°C durante 18 a 24 h.
9. Prueba de halofilia. ***
Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa
bacteriológica estéril y suspender el inóculo en un tubo con los siguientes medios:
• Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0)
• Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3)
• Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6).
Incubar los medios a 37°C durante 18 a 24 h.

NOTA
El V. cholerae y el V. mimicus crecerán en T1N0 y T1N3 y no crecen en T1N6.
Algunos géneros de bacterias que no son Vibrio y que presentan reacciones
similares a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La
mayoría de las especies de Vibrio spp. que incluyen algunos V. cholerae no O1,
crecen únicamente en T1N3 y no crecen en T1N6 ni en concentraciones mayores
de sal.
 10. Prueba de halofilia alternativa.
Alternativamente se realiza la prueba de halofilia en cajas de petri con los siguientes
medios de cultivo:
Agar gelatina (GA)
Agar gelatina con NaCl al 3% (GS 3%)
Agar gelatina con NaCl al 6% (GS 6%)
i. Dividir cada placa en ocho sectores. Tomar suavemente una porción del cultivo
desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriológica estéril e inocular en el
centro de cada sector una estría recta.
ii. Incubar a 35-37ºC durante 18 a 24 h.

Figura D.- Reacción positiva de la gelatinasa en Agar Gelatina con NaCl al 0% y 3% para
Vibrio cholerae.

NOTA
V. cholerae y V. mimicus crecen al 0% y al 3% de sal, rara vez al 6% de sal y no
crecen en concentraciones del 8% ni 10% de cloruro de sodio. Para leer la reacción
de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observar un halo opaco
alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos.

11. Prueba de oxidación-fermentación.

Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI*** o AAG con asa
bacteriológica estéril e inocular por picadura en un tubo con el medio Hugh-Leifson.
Añadir una capa de aceite mineral estéril a uno de los tubos para incubación en
anaerobiosis.
Incubar ambos tubos a 35-37ºC durante 18 a 24 h

NOTA
Las12.especies
Prueba serológica
de Vibrio de
sppaglutinación.
utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la
fermentación. Las especies de Pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado
y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio,
utilizan sólo la glucosa para la oxidación.
 Inocular los cultivos sospechosos presuntivos en agar tripticasa soya (TSA) e incubar a
35-37°C durante 16 a 24 h.
Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril (NaCl
0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSA.
Agregar a una de ellas una gota del suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Inaba
(factor AC) y mezclar con el canto del asa
Agitar inclinando la lámina hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.
Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
Realizar el mismo procedimiento con el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo
Ogawa (factor AB).

INTERPRETACION DE RESULTADOS

Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AAG, T1N0, T1N3, T1N6 o GA y
GS con 3% y 6% de NaCl, además del caldo glucosa de Hugh-Leifson. También se sugiere
realizar una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 h de incubación. La interpretación de
las pruebas bioquímicas para identificación de V. cholerae y otras especies bacterianas
afines se muestran en la figura J, K, L,M

Figura E.- Características de Vibrio spp en agar TSI, KIA y AAG.

Figura F.- Características diferenciales de especies y biotipos del género Vibrio

Figura G.- Características para la identificación de Vibrio cholerae

RESULTADOS
Reportar presencia o ausencia de Vibrio cholerae o la especie identificada en 25.0 ó 50.0 g
de alimento (según sea el caso) ó en 25.0 mL de agua o hielo.

ANEXOS

Figura H. Esquema de siembra y detección de Vibrio spp.

BIBLIOGRAFÍA

Nota: Este procedimiento fue obtenido de la referencia online:

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/patogNOMVibrio_17366.pdf, cuyas
referencias fueron:

Norma Oficial Mexicana NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca.

Pescados Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones sanitarias. México.

Norma Oficial Mexicana NOM-029-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca.

Crustáceos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. México.

Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca.

Moluscos Bivalvos Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones sanitarias. México.

Apéndice B. Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Agua

purificada envasada. Especificaciones sanitarias. México.
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington,
VA: AOAC.

Kaysner C. A., & De Paola A. Jr. (2001) “Vibrio”. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington.
405-420.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms

in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed