Université Alger1/Faculté des Sciences/Département SNV Année : 2016-2017

Module : Biologie Cellulaire

 

TD N° 5 : TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES

Objectif :
 Connaître les étapes précédant l’immunohistochimie.
 Comprendre l’intérêt et le principe de l’immunofluorescence, l’immunohistochimie,
l’immunocytochimie et l’histoenzymologie.

1- Technique d’immunofluorescence : c'est une technique d'immunomarquage qui utilise des anticorps
spécifiques à la molécule d'intérêt ainsi que des fluorochromes. Un anticorps est une protéine complexe
utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière spécifique.
Un fluorochrome est une substance chimique capable d'émettre de la lumière fluorescente après excitation.

- Etapes : Pour détecter une substance X dans une cellule, on injecte à l'animal (ex. lapin) un antigène, celui-
ci réagit en fabriquant des anticorps anti X. Une molécule fluorochrome (ou fluorescéine) est directement
fixée sur l'anticorps formant un complexe (Anticorps anti X Fluorochrome). Le complexe se fixe sur la
substance X. L'observation sous UV au microscope à fluorescence ou confocale permet la localisation de
la substance X, grâce à la fluorescence émise par la fluorescéine. Cette technique peut être directe ou
indirecte (Fig.2).

2- Technique immunohistochimique : cette technique utilise la forte affinité antigène-anticorps pour

visualiser les molécules biologiques dans les tissus (Fig.1). Les anticorps dirigés contre la molécule étudiée
portent le nom d’anticorps primaire. Ils sont de deux types : polyclonaux reconnaissant divers épitopes
d’une molécule ou monoclonaux, hautement spécifiques, dirigés contre un seul épitope d’une molécule.
La détection du complexe antigène-anticorps nécessite l’utilisation d’un marqueur de l’anticorps (Enzyme)
qui va permettre sa visualisation (Fig.3).

- La méthode directe : dans cette méthode, la molécule recherchée est directement couplée à un anticorps
marqué. Cette technique est très peu utilisée car elle nécessite la purification des anticorps primaires (Fig.3).

- La méthode indirecte : le marqueur est couplé à un second anticorps ou anticorps secondaire qui est
spécifique des immunoglobulines de l’espèce productrice de l’anticorps primaire (Fig.4). C’est une
méthode qui utilise le complexe Avidine Biotine Peroxydase. L’anticorps secondaire est couplé à une
molécule de biotine. Un complexe Avidine Biotine Peroxydase préparé extemporanément doit être utilisé. La
présence de multiples sites de reconnaissance pour la biotine sur la molécule d’avidine va permettre sa
fixation sur l’anticorps secondaire biotinylé et par conséquent l’intensification du signal (Fig.5).

3- Technique immunocytochimique : cette technique est appliquée en utilisant des immunoglobulines

(IgG) marquées à l’or colloïdal, il s’agit d’une technique indirecte en deux temps : 1) Fixation de
l’anticorps primaire spécifique sur les sites antigéniques. 2) Révélation de cette fixation par l’anticorps
secondaire couplé à des particules d’or colloïdal, facilement identifiables au microscope électronique grâce
à leur haute densité aux électrons. Les avantages de l’or colloïdal en microscopie électronique sont les
suivants : pas de réactions non spécifiques, permet une approche quantitative des antigènes, permet
l’identification simultanée de plusieurs antigènes par l’emploi de particules d’or de tailles différentes.

4- Histoenzymologie : Le principe de cette technique repose sur la détection et la localisation de l’activité

des enzymes (et non les enzymes elles-mêmes) libres ou démasquables au niveau de la cellule, en mettant en
évidence le produit de leur action sur un substrat spécialement fourni. Certaines activités enzymatiques
peuvent être mises en évidence sur des coupes congelées ou parfois après inclusion dans la paraffine. La
coupe est incubée dans un substrat spécifique de l’activité enzymatique recherchée. La réaction libère un
produit (Fig.6) coloré, ou colorable (par histochimie), qui peut être visualisé au microscope optique.
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