Objetivo

 Establecer un protocolo de conservación de cepas microbianas considerando

el tipo de microorganismo, equipo y reactivos disponibles.

Introducción

Los métodos de conservación para microorganismos se agrupan atendiendo a los

factores tiempo y características fisiológicas de la cepa en tres grandes grupos:

Métodos a largo y corto plazo y métodos alternativos (R. Games. 2008).

 Métodos de conservación a largo plazo:

Conservación por congelación.

Conservación por liofilización.

 Métodos de conservación a corto plazo:

Conservación por transferencia periódica o subcultivo.

Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.

Cada uno de ellos inhibe el crecimiento de los microorganismos, aunque estos al

ser utilizados otra vez vuelven a funcionar como antes (R. Games. 2008).

Conservación por congelación:

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y

se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua
se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no
hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se
recuperan subiendo la temperatura (R. Games. 2008).

Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene
el inconveniente de requerir aparatos especiales, y además existe el peligro de que
algún fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante
el almacenamiento. También resulta ser el método más molesto para realizar el
envío de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de
las células conservadas por este método son los siguientes (R. Games. 2008).

Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras
del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de
organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que los prepare para la
resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede
en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e incluso
en algunos más sencillos.

Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de

congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en
general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la
congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene
poner las células a 37ºC.

Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es

guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas,
sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de –195ºC, o bien en
la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –140ºC. En el
mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los más
aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC. Aquellos que
sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y –40ºC, como ocurre con la mayoría, no
son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de
solutos que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja.

El daño que se produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay
frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se añade un crioprotector no
iónico, como por ejemplo, el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce
y se evita el aumento de la concentración iónica.15 Para la conservación en
armarios congeladores, las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico
esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente),
preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su
totalidad un tubo para cada ocasión. De esta manera se evita que las cepas se
congelen y se descongelen varias veces.

Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se

pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen
muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se
utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%. También
se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como
glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye el tipo de
microorganismo que se quiera conservar.

Materiales y métodos

Materiales Reactivos Equipos

2 mecheros Agar infusión cerebro – Incubadora
corazón (ICC)
1 asa bacteriológica Cepa del Plancha de calentamiento
microorganismo a
utilizar
2 cajas Petri Agar bacteriológico Autoclave
Vaso de precipitado de Congelador
200 ml
Termómetro Ultracongelador
1 matraz Erlenmeyer Micropipeta
Campana de flujo laminar

Metodología

a) Determinación de la viabilidad celular de la cepa

 Seleccionar del Posteriormente,
Colocar la cepa
congelador a -20°C cuando la cepa
en un baño de
el criovial se haya
hielo hasta que
almacenado que descongelado,
se descongele
contenga al colocarla en un
de forma
microorganismo baño de 37° C
gradual.
con el que se por 5 minutos.
desee trabajar.

Preparar agar
infusión cerebro –
corazón con agar
bacteriológico Asperjar el vial con
Tomar una asada para su alcohol al 70% y
del criovial y solidificación y colocarlo en la
sembrar por estría esterilizar en campana de flujo
en 2 cajas de agar autoclave a 121° laminar previamente
infusión cerebro – C durante 15 descontaminada
corazón. minutos. con alcohol al 70%

Después del De no haber

Incubar a 37° C
proceso de contaminación,
de 24 a 48
incubación, se almacena la
horas.
realizar una cepa a 4 ° C
tinción gram para hasta su uso.
observar posibles
contaminaciones.

b) Activación de la cepa de elección

Preparar caldo de Limpiar y Tomar del cepario

infusión cerebro - desinfectar la a 4°C la cepa y
corazón y campana de sembrar una asada
colocarlo en tubos flujo laminar en un tubo con
para esterilizar en con alcohol al caldo ICC
autoclave a 121 ° 70% previamente estéril.
C durante 15
minutos.
 Incubar a 37° C
de 18 a 24
horas

c) Creación de un cepario a corto plazo

Sacar los tubos de la

incubadora y con ayuda
de un asa Incubar a 37° Almacenar el
bacteriológica tomar C de 18 a 24 tubo a 4° C
una asada y sembrar horas. hasta su uso.
por estría en agar ICC
en pico de flauta.

d) Creación de un cepario a largo plazo

Posteriormente, en un
Sacar el tubo criovial, con ayuda de
que se Limpiar y
esterilizar la la micropipeta, colocar
almacenó a 4 ° 200 microlitros de
C del campana de
flujo laminar glicerol estéril y agregar
congelador 800 microlitros de la
cepa activa del tubo.

Homogenizar con la
Almacenar en el micropipeta, etiquetar
ultracongelador a con datos personales y
– 20 ° C hasta su fecha y congelar a -20°
uso. C en el
ultracongelador.
Resultados

Cepa recuperada de
Escherichia coli ATCC 29022.

Prueba de viabilidad: La cepa se encuentra con un más del 90% de viabilidad.

Prueba de pureza: El cultivo es no axénico.

Discusiones
Ventajas de conservación por congelación:

 En un estudio reciente (Hernández & Loaiza. 2014) se dice que el proceso

de congelación garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células
por un período considerable de tiempo.
 El uso de crioprotectores, en este caso el glicerol, que es fácil de conseguir.
 Este proceso de congelación es mucho más económico que la liofilización.

Desventajas de conservación por congelación:

 En un estudio reciente (Hernández & Loaiza, 2014) se dice que este proceso
se debe de controlar la velocidad de congelación de los microorganismos
para mantener su viabilidad y para que la cepa no sufra daños irreparables.
 Es difícil de transportar.
 Si la temperatura aumenta o disminuye repentinamente los microorganismos
pueden morir o bien se puede contaminar nuestra cepa.
Prueba de pureza: El cultivo se considera no axénico ya que al realizar la tinción
gram no se observaron los bacilos rosas característicos de nuestro microorganismo
Escherichia coli como se muestra en la figura 1.1.

Figura 1.1 tinción gram.

Conclusión

La conservación de los microorganismos es un tema de gran importancia para

mantenimiento de cepas microbianas, sin que estas alteren sus características
típicas (genéticas), ni pierdan la viabilidad y conserven su pureza durante largos
periodos de tiempo; por esto se han desarrollado diferentes métodos que permitan
conservar los microorganismos, para luego ser empleados en futuras
investigaciones. El hecho de conservar cepas sirve de ayuda para investigaciones
y practicas con la misma con la finalidad de conservar el cultivo axénico ya que esto
ayuda a que el microorganismo sea capaz de producir más células hijas con la mima
información genética.

La recuperación de cepas no es un procedimiento difícil al contrario es muy sencillo,

la conservación por congelación es un método muy utilizado ya que no es muy
costoso comparado a la conservación por liofilización.

Bibliografía
Hernández D. & Loaiza A. (2014), UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA.
Recuperado el 29 de octubre de 2019 de
http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/handle/11059/4316/57192H557.pdf?
sequence=1&isAllowed=y

Games R. (2008), Métodos generales de conservación de cepas. Recuperado 3

noviembre 2019 de
https://www.researchgate.net/publication/262724715_Metodos_generales_de_con
servacion_de_microorganismos