02.03.

2017

RMN- rezonanța magnetică nucleară

În cazul nucleelor atomice cu moment magnetic se poate produce o absorbtie de

energie prin rezonanță sub acțiunea unei unde electromagnetice exterioare –prin tranzcția de
la o orientare permisă la alta a spinului nuclear.

În acest caz frecvențele de rezonanță se află în cadrul undelor metrice curente în radio
tehnică. Astfel, în cazul protonului folosind un câmp magnetic de 10 la putere a 4 gaus- se
găsește o lungime de undă de aprox 7 m. Dispozitivul utilizat poate fi schițat în felul următor

(img telefon)

Câmpul constant este furnizat de cele două piese polare, adică N-S, situate în planul
figurii. Bobina transmițătoare este perpendiculară pe planul figurii împărțită în două jumătăți
și între ele se introduce eprubeta cu substanța de cercetat. Bobina receptoare are spirala
înfășurată în prejurul eprubetei, de obicei circuitul transmițător este acordat pentru o anumită
frecvență și se modifică intensitatea câmpului magnetic. Când este satisfăcută condiția de
rezonanță sistemul receptor înregistrează un semnal. Poziția liniilor de rezonanță se poate
exprima fie în unități de frecvență, fie în unități de câmp.

Intesitatea integrală a semnalului, adică aria de sub curbă, este direct proporțională cu
numărul de nuclee prezente. Deci metoda se pretează și dozări cantitative. Fiecare specie
nucleară care posedă moment magnetic poate fi studiată și caracterizată în mod independent.
Nucleele pare ca C12 C14 O16 O18 SI28 S32 sunt lipsite de moment magnetic și nu dau
semnal RMN . Cele mai importante sub aspect analitic sub nucleele cu spinul 1 pe 2, în
primul rând H1, apoi F =19 P=31 C=13 N=15 Ne-23 Al-27 Si-29. La toate aceste nuclee
există două orientări posibile ale momentului magnetic nuclear rezultând deci două nivele
energetice între care poate avea loc tranzicția.

Dacă nucleele ar fi izolate linia de rezonanță a fiecărei specii nucleare ar fi invariabil

aceeași, nucleele aparțin însă unor atomi agajați într-o moleculă. Acest anturaj chimic
modifică energia de interacțiune cu câmpul deoarece mișcare electronilor din moleculă este
influențată de câmpul magnetic exterior, în molecule fiind induse momente magnetice care
stau la baza susceptibilității diamagnetice a substanței. Aceste momente creează un câmp
magnetic local care micșorează intensitatea câmpului magnetic aplicat, având deci un efect de
ecranare. Valoarea constantei de ecranare depinde de anturajul chimic de tipul legăturilor în
care este angajat atomul de natura atomilor vecini și chiar a celor mai îndepărtați.

Atomi de H pot da semnale diferite în funcție de anturajul lor chimic, de exemplu:

OH-CH2-CH3- în care sunt trei feluri de atom de H . H grupei metil , cel al grupei metilen și
H din grupa hidroxil. Spectrul RMN are intensitățile integrale, adică aria de sub curbă în rap
cu 1 la 2 la 3 corespunzând celor 1 , 2 respectiv 3 H echivalenți.

Rezonanța magnetică nucleară a devenit o tehnică de analiză în chimia organică încă

din anii 50 ai secolului trecut când au apărut primele aparate comerciale și când a fost utilizată

1
pentru determinarea structurii moleculelor organice. Inițial a fost posibilă numai spectroscopia
RMN pentru protoni care a permis detecția și diferențierea atomilor de H din moleculă în
funcție de vecinătățile lor particulare. Odată cu dezvoltarea metodelor instrumentale a devenit
posibilă detecția a numeroși alți nuclei. Un timp tehnica a fost limitată la analiza probelor
lichide sau a probelor solide dizolvate într-un solvent adecvat, decit tot lichide- dar odată cu
apariția tehnicii CP/MAS ( cross polarisecen/ magic angle spining) au devenit posibilă analiza
probelor solide cum ar fi lemn, cărbune, sticlă și oxizi metalici. Materialele organice care
trebuiesc analizate sunt de natură foarte diferită incluzând grăsimi, ceruri, rășini, coloranți,
adezivi, hidrați de carbon, proteine, materialele celulozice și bituminoase. Toate aceste
materiale sunt supuse procesului de degradare care le modifică proprietățile inițiale, iar aceste
modificări pot și trebuie puse în evidență de tehnicile analitice.

Materialele organice sunt analizate prin spectrofometrie infraroșu sau ultraviolet ,

cromatografie de gaz sau de lichid, analiză de amino acizi, etc. Metode ce pot fi utilizate
individual sau în combinații la care RMN vine să se asocieze ca o analiză complementară.
Ceea ce o distinge de celelalte metode este faptul că RMN dă o amprentă pentru fiecare tip de
nucleu examinat. Ca avantaje mai putem menționa faptul că toate componentele unei
substanțe organice pot fi analizate concomitent. Odată obținute și interpretate rezultatele de
RMN se pot lua decizii pentru selecția altor metode de analiză ce trebuiesc aplicate pentru a
completa informațiile.

RMN este considerată singura tehnica analitică ce poate da informații cantitative

asupra nivelelor relative ale compușilor chiar a celor ce nu pot fi extrași prin solvenți. Profilul
tipurilor de C din spectrul RMN al C13 furnizează același timp de informații pentru
materialele organice, ca și analiza elementală pentru materialele anorganice. Ca orice metodă
analitică spectrometria RMN are și dezavantaje – fața de cromatografia de caz are o
sensibilitate și putere de rezoluție mai mică atunci când e vorba de mixturi complexe.

În cazul în care probele de analizat sunt în cantitate mică determinările cantitative ale
componentelor individuale pot fi dificile, față de spectrometria de masă indicațiile despre
greutatea moleculară a substanțelor organice sunt obținute în mod indirect prin deducție din
relațiile cu ceilalți componenți. Aparatura este relativ greu accesibilă și interpretarea
spectrelor presupune o oarecare experiență. Spectrul RMN se prezintă ca un grafic al
intensității absorbției semnalului de radio frecvență ( proporțional cu numărul de nuclei
implicați ) funcție de frecvența radiației absorbite ( care depinde de vecinătățile din punct de
vedere chimic ale nucleelor ). Utilizând corelații empirice între deplasarea chimică delta și
anturajul chimic pot fi obținute informații structurale detaliate asupra compușilor. În cazul
amestecurilor aria picurilor de absorție atribuite diferiților componenți permite determinarea
proporțiilor relative a fiecărui component.

Pentru spectrele RMN are protonilor se folosesc drept solvenți tetraclorura de C sau
solvenți deuterați, cum ar fi apa grea , pentru a se evita interferența cu protonii solvitului,
pentru a obține un spectru RMN de protoni sunt sificiente 0,5 miligrame de proba. Cantitatea
minimă de probă necesară fiind dependentă de greutatea moleculară a compușilor și de
câmpul de operare a instrumentului. Pentru spectrul RMN al C13 se folosește cca. un

2
miligram de compus dar un spectru rezonabil se obține în cca. 24 de ore față de 10 min cât
reprezintă timpul de analiză pentru protoni.

Pentru probele solide sunt necesare între 50- 250 de miligrame de material, dacă sunt
studiați nuclee relativ ambundenți ca sodiu, P sau Al- cantități mai mici de material pot da
spectre satisfăcătoare. Deși nu se pierde probă în timpul analizei, proba trebuie dizolvată sau
mojarată dar proba poate fi folosită în analize ulterioare pentru obținerea de informații
complementare.

Una din primele aplicații RMN asupra C 13, în analiza materialelor organice a fost
determinarea compoziției a 4 sigilii de document. Scopul a fost de a caracteriza componentele
chimice prezente în aceste sigilii care au fost păstrate în colecții engleze din perioada
medievală, în scopul de utiliza materiale de compoziție similară în procesul de restaurare. Au
fost alese 4 sigilii: 2 din secolul XII , 1 din secolul XIX și de proveniență necunoscută.
Spectrele materialelor solubile în cloroform din primele 2 și cel de al patrulea au fost
asemănătoare cu cele obținute pentru ceară- atât modernă, cât și veche. Aceasta este o
confirmare a faptului că ceara prezintă o stabilitate pe termen lung atât din vedere chimic, cât
și microbiologic.

Al treilea sigiliu din perioada lui Iuliam al 4-lea (1830-1837) a arătat numai urme de
ceară, în timp ce cantitatea de ceară avea o asemănare spectrală cu colofoniu. Spectroscopia
RMN poate diferenția rășinile în funcție de proveniență putând distige între damar și mastic și
șelac sau lacuri japoneze. Prin studii asupra probelor solide s-a putut face o distincție clară
între lacuri chinezești utilizate în antichitate și cele obținute în secolele 19 și 20- informație ce
nu poate obținute prin alte tehnici.

O altă plicație este studiul penetrării soluțiilor apoase în funcție de spațiu și timp în
materialele poroase prin numeroase motive. Apa poate activa sărurile solide, poate degrada
lianții și altera unii pigmenți. Poate crea condiții favorabile pentru dezvoltarea agenților
biologici, poate facilita absorbția cazelor poluante și a particulelor din atmosferă și poate
degrada structurile poroase prin îngheț. Tomografia RMN permite obținerea de informații
structarale în mod nedisctructiv cu o rezoluție de 01 milimetri privind penetrarea apei în
marmură, mortare și pietre poroase. Unul din aspectele cele mai relevante ale studiului
parametrilor de relaxare este posibiliatea obținerii de imaginii tomografice are distribuției
spațiale ale protonilor. S-a obținut de către câțiva cercetători italieni din Roma și Florența
imaginii ale distribuției apei- în probe de marmură de carrara, travertin și mortar- folosindu-se
parametri adecvați s-a obținut și o hartă a distrubuțiilor și măririi porilor. Tot prin această
metodă se poate urmări și penetrabilitatea și modul de distribuție în volum a unor substanțe
protectoare sau a unor consolidanți utilizați în mod curent în restauarare cu condiția ca aceștia
să fie hidrosolubili.

3
 16. 03.2016

Aplicații RMN

30.03.2017

Identificarea proteinelor prin tehnici proteonice

Liantii proteici pot fi: cleiul, ou sau cazeina.

Protoemica este stiinta care studiaza proteine in sensul larg al cuvantului. In special
strcutura si functiile acestora. Termenul a fost creat prin analogie cu genomix( știința care
studiază genele), dar este considerată ca pasul următor în biologia moleculară. În timp ce
genomul este o entitate constantă în toate celule organismului (genomul –totalitate
cromozomilor), proteomul diferă de la o celulă la alta și este în schimbare continuă prin
interacția cu genomul și mediul abiant. Un organism va avea structuri proteice radical diferite
–în diferit părți ale corpului, în diferite stadii de dezvoltare și diferitele condiții ambientale.

Proteinele sunt lanțuri de aminoacizi construite din aproximatix 20 de L- alfa

aminoacizi. L- se referă la direcția de rotație a planului luminii polarizate și anume levogir
(rotesc spre stânga) sau dextogir (spre dreapta). Alfa- se referă la modul de legare ai atomilor
de C.

Structura unui alfa aminoacid constă dintr-un rezidu R care diferențiază aminoacizii
între ei, o strucutura de acid și o structură amino comune tuturor aminoacizilor. Legăturile
dintre aminoacizi se fac în felul următor (caiet).

Lanțurile de aminoacizi se pliază într-o structură unică tridimensională determinată de

legăturile ce se formează între aminoacizii din secvențele fiecărui lanț. Pentru lanțuri de mai
puțin de 40 de aminoacizi se folosește termenul de peptide. Proteinele pot ajunge până la
câteva mii de aminoacizi în structurile multifucționale. Media însa este de 300 de aminoacizi.
Există 4 forme distincte ale structurii proteinelor: structura primară reprezentată prin secvența
de aminoacizi, structura secundară cu doua tipuri de substraturi ( alfa helix și foaia pliată beta)
sau segmente de lanțuri care nu au formă stabilă. Structura terțiară, și anume forma care
cuprinde relația spațială dintre diversele structuri secundare ale unui lanț proteic. Și în final
structura cuaternară care reprezintă forma sau structura rezultată din unirea mai multor
molecule proteice numite subunități proteice părți ale unor asocieri cu funcții complexe, de
exemplu: emoglobina ( se află în sânge) (poză telefon).

4
 Identificare constituienților organici din picturi și în special a lianților proteici este o
sarcină dificilă pentru chimiști din următoarele motive:

1. Proteinele îmbătrânite sunt denaturate și greu solubile în apă și solvenți organici

2. În straturile picturale pot exista simultan mai multe substanțe organice atât naturale
cât și sintetice
3. Pot exista compuși de degradare formați ca rezultat al procesului de îmbătrânire, al
tratamentelor de restaurare sau al poluării
4. Probele ce pot fi recoltate pentru analize ( cu mase în jur de un miligram) conțin
cel mult 0,1 miligrame de proteine.

Cele mai cunoscute tehnici de identificare al proteinelor și al produșilor de degradare

al acestora sunt metodele cromatografice. Alte tehnici sunt tehnicile microchimice și

spectroscopice. Tehnicile microchimice permit examinare secțiunilor subțiri, dar o
specificitate redusă.

Spectrometria FTIR, în special combinată cu microscopia permite recunoaștere

prezenței materialelor proteice prin metode nedistructive. În cazul amestecurilor complexe
interpretarea spectrelor FTIR poate fi extrem de dificilă, iar distincția dintre ou, clei și
proteine lactice paote fi rareori realizată. Analiza termică diferențială nu poate decât să pună
în evidență prezența unui material proteic, fără a permite identificarea acestuia.

5
 Tehnicile imunologice au fost aplicate într-o oarecare măsură dar adaptarea lor la
determinarea proteinelor din operele de artă este încă departe de a fi pe deplin realizată.

În domeniul medical au fost puse la punct tehnici specifice, cum ar fi: electroforeza (
este un fel de cromatografie în câmp electric) capilară, hplc ( lc- liqued cromatographi – hp-
high precizen) cu spectrometrie de masă bazată pe timpul de zbor – ESITOF-MS – esi-
electron spray ionisation, tof- type of fly, ms- mass spectrometry

-MALDI-MS – matrix assisted, l-laser , d- desorbtion, i-ionisation.

Tehnici ce pot fi utilizate cu succes în studiul lianților din pictură și a proceselor lor de
degradare.

Diferite tipuri de cromatografie pot fi folosite pentru identificarea lianților proteici,

cum ar fi cromatografia pe hârtie și cromatografia în strat subțire. Rezultate mai concludente
pot fi obținute prin cromatografie gazoasă hplc cu fază inversă și derivatizare pe icoană sau
cromatografie de schimb ionic. Aceste tehnici permit identificarea în probe mici a tipului de
material proteic utilizat chiar în amestecuri cu alte materiale organice. Ca regulă generală-
datorită posibililor interferențe între diversele materiale prezente simultan în probe lianții sunt
cel mai bine identificați printr-o combinație de doua sau mai multe tehnici analitice de
preferință complementare. Deoarece materialul de anliză este distrus, dar probele sunt
suficient de mici ținând seama de sensibilitatea tehnicilor analiza de acest tip esste considerată
microinvazivă. Cuplarea gc ( cromatografie de gaze si hplc ) și mase ca sistem de detecție
permite obținerea de informații structurale cu privire la componentele necunoscute sau mai
puțin obișnuite. Un avantaj al detectoarelor pe bază de spectrometrie de masă este că poate
recunoaște substanțe marcate cu izotopi stabili. Aceasta înseamnă ca astfel de compuși pot fi
utilizați ca standard de interne pentru cuantificare.

6
Spectrometria de masă (schiță-poză telefon)

Dispozitivul de intrare ( in..) transferă proba în zona de presiune scăzută a

spectrometrului de masă. În zona sursei moleculele neutre ale probei sunt ionizate și apoi
accelerate în analizorul de masă, în această secțiune sunt separați ionii în spațiu sau în timp în
funcție de raportul masa supra sarcină. După ce ionii sunt separați, ei sunt detectați iar
semnalul este transmis la un sistem de analiză a datelor.

Cromatografia gazoasă.

Cromatografia gazoasă este probabil cea mai utilizată tehnică pentru introducere
probelor într-un spectrometru de masă. Amestecurile complexe sunt separate prin
cromatografie gazoasă, iar spectrometria de masă este utilizată pentru identificarea cantitativă
a componentelor individuale.

Cromatografia lighida

Dispozitivele de intrare ale cromatografiei lichide sunt utilizate pentru introducerea

compunentelor labile (instabil) termic nu foarte ușor de separat prin cromatografie...

7
 Introducerea directă a probei (dip)

Dip este larg utilizată pentru introducerea lichidelor și solidelor cu presiune scăzută de
vaporizare. Proba este încărcata intr-un tub capilar scurt situat la capătul unui manșon
încălzit. Acest manșon este apoi înserat intr-un dispozitiv cu vacuum astfel incat proba se afla
în interiorul zonei. După ce proba este așezată pe poziție se ridica temperatura din tubul
capilar pentru a o vaporiza. Asupra probei se aplica temperaturi mai mari decât sunt posibile
cu un dispozitiv de intrare de vaporizare directă. În plus proba se afla sub vacuum și imediat
în apropierea sursei fiind astfel necesare temperaturi scăzute pentru analize.

Dip este importanta pentru analizarea componentelor sensibile la temperatura.

Ionizarea directă a probei .

Unele componente le descompun prin încălzire sau o presiune de vaporizare nesimnificativa

Acestea pot fi introduse în spectrometrie de masa prin ionizarea directă din starea
condensată. Aceste tehnici de ionizare directă sunt folosite pentru cromatografia lichidă
cuplată cu spectrometria de masă, Spectrometria de masa cu descărcare larg, bombardamentul
atomic rapid și pentru ablația cu laser .

Dezvoltarea tehnicilor noi de ionizare reprezintă o arie de cercetare activă, aceste

tehnici evoluând rapid. Bombardamentul atomic rapid in acronim Fab – și spectrometria de
masă a ionilor secundari in acronim sims. Fab si Sims utilizează atomi de mare energie pentru
pulverizarea si ionizarea probei intr un singur pas. Prin aceste tehnici un fascicol de atomi din
gaze rare neutre ( in cazul Fab ) sau ioni ( in cazul sims) este focalizat asupra probei lichide
sau solide. Impactul acestui fascicol de energie mare face că moleculele de analizat sa se
pulverizeze in stare gazoasă și în același timp să se ionizeze. Mecanismul exact al acestui
proces nu este pe deplin cunoscut, dar aceste tehnici funcționează perfect pentru componente
cu mase moleculare de până la câteva mii de daltoni ( u a m ). Deoarece nu este necesara
încălzirea probei tehnicile de pulverizare, in special fab sunt utile pentru studierea
componentelor labile tehnic care se descompun in sistemele de intrare convenționale. (Poza
telefon )

8
 Diferența cea mai semnificativă dintre Fab si Sims consta in prepararea probei , in Fab
produsul de analizat este dizolvat intr o matrice lichida. O picătură de proba combinata cu
matriciale amestecului este așezată la capătul de inserție a probei și introdusă în zona sursei.
Fab este focalizat asupra acestei picături pentru a produce ionii de analizat. De obicei pentru
matrice de folosește glicerina sau lichide similare cu presiune scăzută de vaporizare.

27.04.

Ideal soluția de analiză este solubilă în matricea lichidă și la suprafața picăturii se

formează un strat monomolecular a soluției de analizat. Conform unei teorii acest strat
monomolecular concentrează produsul de analizat în timp ce proba dizolvată reprezintă un
rezervor pentru reumplerea stratului monomolecular, atunci când soluția de analizat este
consumată. Fără această reumplere constantă fascicolul ionizator va consuma repede produsul
de analizat, iar semnalul este dificil de observat.

Sims este folosit pentru studierea probelor solide. Nu este utilizată o matrice, iar fascicolul
ionizant este îndreptat direct spre probă. Deși această condiție face dificilă luarea de probe ,
sims este folositoare pentru studierea chimiei suprafeței. Prin scanarea cu fascicol de ionizare
strâns concentrat pe suprafață se obțin hărți chimice de mare rezoluție, iar prin sondarea unei
singure locații se obțin profilele de adâncime.

Deși sims este o tehnică foarte sensibilă și revelatoare pentru analiza straturilor de
suprafață și a materialelor- rezultatele cantitative sunt dificil de obținut.

9
 MALDI- matrix assisted laser desorbtion/ ionization

Este utilizat pentru analizare unor molecule foarte mari. Prin această tehnică se
ionizează direct și se vaporizează produsul de analizat din starea condensată (solidă). Maldi
este deseori utilizat pentru analiza asupra polimerilor sintetici și naturali, proteinelor și
peptidelor (lanțuri scurte de AMINOACIZI).

Sunt posibile analize asupra componentelor cu mase moleculare de până la 200 de mii
de daltoni (masa atomului de H, a 12 parte din izotopul..) și această limită a masei este în
continuu creștere. În MALDI atât desorbția cât și ionizarea sunt induse printr-un singur puls
laser.

Proba este preparată prin amestecarea produsului de analizat cu o componentă matrice

aleasă pentru absorbția lungimii de undă a laserului. Aceasta este plasată pe ajutajul (micsorea
diamentrului unui cilindru sub forma un unghi de con ) probei. Un dispozitiv cu vacuum este
utilizat pentru introducerea probei în regiunea sursei a spectrometrului de masă. Un fascicol
laser este apoi focalizat pe acest amestec uscat, iar energia din pulsul laser este absorbită de
matrice. Această energie ejectează ionii de la suprafața materialului de analizat obținându-se
astfel un spectru de masă pentru fiecare puls laser.

Cu alte tehnici de ionizare cu laser produsul de analizat trebuie să absoarbă lungimea

de undă a laserului. Spectrul MALDI tipic include ionul molecular câțiva ionii cu sarcini
multiple și foarte puține fragmente. Caracterizarea materialelor polimerice este esențială
pentru promovarea si elicidarea proprietăților și morfologiei polimerilor. Caracterizarea
presupune în principal:

1. Analizarea masei moleculare folosind cromatografia( separarea componentelor dintr-

un amestec în funcție de afinitatea produselor) de permeabilitate în gel sau împrăștiere
luminii, sau osmometria, sau vâscozimetria ( se măsoară în poise) ( acea proprietate a
fluidelor....care face sa apară ...)
2. Determinarea secvențelor unităților repetabile folosind spectrometria RMN
3. Analiza grupărilor finale folosindu-se titrarea- spectrometria RMN și FTIR -(biuretă-
un măsurător exact de volume)
4. Examinarea purității folosindu-se spectrometria RMN ,analiza elementară si
spectrometria FTIR

MALDI TOF permite determinarea cu acuratețe a maselor molare ordonarea unităților ce

se repetă și idenntificare aditivilor din polimeri și a impurităților.

Devierea în câmp magnetic

Primul scpectrometru de masă construit de JJ.THOMPSON în 1897 a folosit un

magnet pentru a măsura valoarea m pe sarcină a unui electron. Instrumentele pe baza de camp
magnetic au rezoluție mai mare și un domeniu de masă mai mare decât instrumentele pe bază
de cuadrupol, dar necesită pompe de vid mai mari și sunt mai puțin rapide. Raportul m pe d –

10
poate fi extins până la valoarea de 30 de mii. Instrumentele pe bază de câmp magnetic sunt
adesea utilizate în serie cu un câmp electric pentru o rezoluție mai bună și determinări de
spectrometrie de masă cu acceleratori de particule. (poza) .

Impulsul este m ori v. Ionii cu un impuls mai mare se vor misca pe un cerc de rază mai
mare.

Pentru o rază un câmp magnetic și o accelerație date ecuația care ne este dată de m pe
z va avea o singură valoare. Ceilalți ionii cu m pe z diferiti . vor parcurge raze diferite în
câmpul magnetic.

Instrumentele moderne au un set de fante la o rază fixă pentru a se transmite un singur

raport m pe z la detector. Spectrul de masă este determinat prin modificarea câmpului
magnetic sau accelerației pentru a se determina ionii de diferite mase specifice.

TIMPUL DE ZBOR (TOF)

Analizoarele de masă TOF separă ionii în timp ce aceștia traversează un tunel de zbor.
Acesta este un spectrometru de masă foarte simplu care utilizează tensiuni, diferențe de
potențial fixe care nu au nevoie de un câmp magnetic. Singurul incovenient este că
instrumentelor de tof- au rezoluție de masă slabă mai mică de 500- în schimb aceste
instrumente au mare eficiență de trasmitere – nu au limită superioară pentru m pe z, au limite
de detecție foarte scăzute și viteze de scanare rapide. În sursa analizatorului TOF se formează
un pachet de ionii prin impulsul de ionizare foarte rapid (nanosecunde) acești ioni sunt
accelerați într-un tunel de zbor printr-un câmp electric 2-25 kV aplicat între sursa de ionii și
rețeaua de accelerație. Deoarece ionii sunt accelerație pe aceeași distanță cu aceeași forță au
toți aceeași energie cinetică. Deoarece viteza V depinde de energia cinetică și de masă ionii
mai ușori vor trece mai repede.

Ec= mv2 pe 2

v=radical din 2V ori e supra m/z

2V- „V” tensiiunea de accelerare

pH –log cu sens schimbat a concentrațiilor ionilor de H

- Log cu baza 10-

- 0-7 –acid
- 7 netru- deoarece în apa pură gradul de disociere este 10 la puterea -7.
Concentrațiilor ionilor de H în apa pură este de 10 la -7
- Daca am un mediu acid- soluție

11
 11. Mai. 2017

După accelerarea ionilor aceștia intră 1-2 m în tunelul de zbor, ionii trec prin această
regiune liberă la viteza dobandită prin accelerație, la capătul tunelului de zbor îi lovesc un
detector. Diferența de timpt termin de la formarea ionilor până când aceștia ating detectorul
depinde de lungime domeniului pe care aceștia îl parcurg L, de sarcina specifică a ionului și
de accelerația din sursă. Timpul t= L supra radical 2V ori e = radical m/z

Această ecuație arată că ionii cu reaportul m/z vor atinge primii detectorul, spectrul de
masă este obținut prin măsurarea semnalului detectorului în funcție de timp penru fiecare
impuls al ionului produs în domeniul sursei. Deoarece sunt detectați toți ionii, instrumentele
teof au eficiență de transmisie foarte mare care mărește nivelul S/M (semnal /zgomot).
Componenta finală a unui spectrometru de masă este sistemul de achiziție și prelucrare a
datelor. Acesta a evaluat de la plăcile fotografice și de la receptorul cu bandă subțire la
sisteme de achiziție și prelucrare a datelor care controlează instrumentul înregistrează sute de
spectre pe minut și caută prin zeci de mii de spectre de referință pentru a indentifica unul
necunoscut. Pentru atribuirea valorilor diferite atomilor și moleculelor se presupun valori
întregi pentru masele izotopice. Măsurătorile precise arată că această presupunere nu este
reală deoarece forțele nucleare care unesc componentele unui nucleu sunt variabile masa
exactă a unui izotop dat deviază de la întregul său nominal cu câteva zecimale. Astfel
considerând masa izotopică a carbonului 12 de 12,0000 atunci O 16 este 15,9949 u.a.m sau
dalton în loc de 16, iar azotul 14 este 14,0031 u.a.m în loc de 14.

Prin proiectarea spectrometrelor de masă care să poată determina raportul m/z cu acuratețe
pâna la 4 zecimale este posibil să se distingă formule diferite cu aceeași masă nominală.
Tabelele cu valorile specificce ale masei unei molecule sau ioni sunt disponibile în biblioteci.
Deoarece o masă nominală dată poate corespunde mai multor formule listele acestor
posibilități sunt în special folositoare atunci când se evaluează spectrul unei componente
necunoscute. Pentru acest scop sunt disponibile tabelele compoziției și în particular un
progam pentru calculul posibelor combinații ale H, carbonului, azotului și O prin care se
obține masa nominală specifică

Aplicații

Operele de arte au rezistat în timp chiar daca erau executate din materiale cu
componente organice ușor degradabile. Toate picturile conțin aceleași componente de bază,
pigmenți și lianți. Componenta pe care noi o percepem sub forma culorii este pigmentul. De
cele mai multe ori o pudră fina din material anorganic, pigmentul este dispersat într-un liant
care îi permite întinderea și care leagă granulele de pigment idividuale la suprafața la care se
va aplica pictura.

Liantul prezent în stratul pictural reprezintă cel mai important component organic
utilizat. De-a lungul sec s-au testat mulți lianți întrebuințați individual, amestecați între ei sau

12
cu uleiuri sau alte materiale anorganice. Cantitățile mici de probe și complexitatea lor
determină tehnicile analitice pentru identificarea proteinelor din lianți.

Primul set de tehnici utilizat se bazează pe detectarea proteinei cu coloranți organici

cum ar fi metoda pe bază de naftol albastru-negru sau cu metode pe bază de inodetecție, dar
aceasta din urmă a fost rareori utilizată pentru picturile vechi. Un alt set de tehnici utilizate se
bazează pe cromatografie și mai precis pe identificarea aminoacizilor care rezultă din
hidroliza proteinelor prezente în probă. Aminoacizii au fost identificați în trecut prin
cromatografia în strat subțire dar aceasta nu oferă precizia necesară pentru monitorizarea
aminoacizilor în vederea stabilirii exact a materialelor proteice.

Una din primele tehnici analitice utilizate pentru analizele cantitative ale
aminoacizilor a fost cromatografia gazoasă care rămâne cea mai folosită tehnică pentru
identificarea proteinelor din lianții picturei. Pentru studii comparate a apărut nevoia utilizării
picturii etalon îmbătrânite artificial. Alte studii au demonstrat posibilitatea utilizării
cromatografiei gazoase cu piroliză cuplată cu spectrometria de masă pentru identificarea
lianților proteici dar compararea spectrului probei analizate cu spectrul etalonului pictural este
în general o sarcină dificilă-deoarece proba se deteriorează semnificativ prin piroliză (rupere
în părți componente sub acțiunea căldurii). În final pentru analizarea cantitativă a
aminoacizilor din operele de artă s-a utilizat un sistem de cromatografie lichidă de înaltă
performanță cuplat cu spectrometrie UV- vi- dar rezultatele depind în funcție de cantitatea de
probă.

Un ultim set de tehnici întrebuințate pentru analiza lianților sunt spectroscopia în

ultraroșu si Raman. Dar aceste metode analize nedistructive dau informații cantitative și
structurale foarte reduse și nu sunt suficient de distinte pentru a permite identificarea precisă a
proteinelor.

O altă metodă se referă la identificarea proteinelor din probele operelor de artă prin
nanocromatografie și spectrometri de masă cu accelerator de particule. Mai întâi s-au studiat
condițiile necesare extragerii proteinelor din lianții mediului cultural fără hridroliza
proteinelor în aminoacizi. S-au experimentat mai multe soluții de extragere pentru obținere
modelelor picturale: 1- o proteină din ou

2- toate proteinele din ou. Eficiența proceselor de extragere a fost evaluată în

spectrometria de masă Maldy Tof- apoi s-a trecut la identificarea proteinelor extrase; s-a
decis optimizarea și adaptarea pașilor diferiți pentru analizele proteice ( hidroliza enzimatică,
purificarea peptidelor, analiza prin spectrometrie de masă cu accelerator de particule și
interogarea bazelor de date ale proteinelor) asupra unei cantități foarte mici de material
analizat- aproximativ 10 micrograme dintr-o probă. Această metodologie a fost aplicată cu
succes pe două picturi din renaștere și anume cripticul lui Benedetto Bonfigli cu Fercioara cu
Pruncul, Sf. Ioan Botezătorul și Sf. Sebastian ( Școala Italiană –sec XV) și pictura lui.....
Fecioara cu pruncul ( Școala Italiană –sec xv).

13
 Ținând seama că proteinele sunt puternic denaturate datorită trecerii timpului există
două dificultăți majore în oțtinerea de rezultate concludente- 1. Găsirea metodei de extracție a
proteinelor din liant fără a fi hidrolizate în aminoacizi

2. Aplicarea unei metode de analize ținând cont de cantitatea mică de probă

disponibilă/ În acest scop au fost făcute experimente pe modele care au fost utilizate
proteinele din ou în vederea evaluarii eficienței...si a posibilităților de idenficare a proteinelor
extrase dintr-un mediu complex. A fost utilizat și albul de plumb în amestec cu ulei de in ,
ovualbumina și ou integral.

Metoda care a fost în final selectată cuprindea o soluție apoasă acidificată cu acid
trifloroacetiv 1% în care a fost introdusă proba mojarată împreună cu o rășină sintetică.
Rășina are rolul de a permite mujararea în particule fine și de a minimiza pierderea de probă.

Pentru exemplificare a fost obținut un spectru Maldi tof al albuminei comerciale

înainte de incluziunea în pictura de probă.

( poză)

Deci proba de ovialbumină spre deosebire de cea comercială este legată de alte proteine din
albușul de ou.

( poză)

Acest sistem permite experimente de ..cu peptide separate anterior în funcție de

hridrofobicitatea lor. În cazul picturii lui Benedetto Bonfili s-a luat o proba de 10 micrograme
din cotul stâng al Sf. Sebastian. Proba a fost tratată cu soluție de acid trifloriacetic amestecată
cu o rășină pentru mojarare și hridrolizată enzimatic. Spectrele au permis identificarea
ovuplasferinei și a unor fragmente peptidice . celelalte secvențe au fost atribuite celorlalte
proteine din albușul de ou.

25. mai. 2017

În cazul picturii lui...proba a fost obținută din veșmântul fecioarei, spectrul a permis
identificare peptidei ovialbumină. Numărul de peptide de ovialbuminice identificate este
relativ scăzut. Ținându-se seama de faptul că această proteină este componentul major al
albușului de ou, se pare că acest lucru se datorează faptului că proteina a fost puternic
implicată în procesul de polimerizare ( legarea într-un lanț a monomerilor),

Global numărul de peptide identificate în pictura lui Nicolo de Pietre Ge... este mai
mic decât cel identificat în cripticul lui Benedetto Bongli. Totuși analiza acestei picturi
permite identificare proteinelor din albușul de ou ( doua peptide de ovialbumină și 3 de
ovotransferină= este o enzimă) și din gălbenușul de ou peptida vitollogenină. Deși acești
consituienți corespund rețelor tradiționale italiene folosite în această perioadă- prezența
albușului de ou este în mod special interesantă, nu numai pentru că este rareori raportată în
vechile manuscrise dar și pentru că în acest caz testele preliminare histochimice(histologia –
este știința care se ocupă de țesuturi) și de încălzire au arătat prezența uleiului. Astfel în

14
liantul folosit de B.b și N.. a fost mai complet decât simpla tempera ( conținând numai
gălbenuș de ou), de oarece este o mixtură de albuș, gălbenuș și ulei. Acești artiști au ales o
emulsie de ulei și ou integral, numită adesea tempera grasa pentru a se obțiune efecte
cromatice speciale cum ar fi efectele de strălucire și umezitate. Rezultatele au fost obținute
prin combinare strategiilor clasice proteonice cu utilizarea spectrometrelor de masă de putere
mare.

Strategia poate fi aplicată și la studiul dietelor umane de-a lungul timpului și

înțelegerea originilor și obiceiurilor culinare folosindu-se proteine identificate în vasele
arheologice.

Pentru studierea structurii tridimensionale a proteinelor, primul pas în difracția de raze

X constă în cristalizarea acestora. Pentru ca proteinele să devină cristale se folosește o
substanță numită nuclean care determină proteinele să formeze o rețea cristalină. Materialele
care joacă rol de nuclean sunt materiale cu structură poroasă care fixează moleculele de
proteină și le facilizează cristalizarea. Un astfel de nuclean este bio-Gas , un material poros cu
pori de diferite dimensiuni care pot lega diferite tipuri de proteine, acest material are avantajul
că poate juca rolul de nuclean pentru mai multe tipuri de materiale. O dată adusă în stare
cristalină difracția de raze X permite atât identificarea cât și definirea structurii proteinelor
studiate prin această metodă cvazinedistuctivă.

15
TOF-sims-------anul 3- time of fly-

16