UCSM INGENIERIA BIOTECNOLÓGICA

PRÁCTICA# 6
Determinación Cualitativa de Clorofila a y b por Cromatografía en Capa Fina

Introducción:
Los pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son moléculas químicas
que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento
depende de la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexión de otras.
El color verde de las plantas esta dado por la clorofila, que se encarga de absorber la luz
necesaria para realizar la fotosíntesis. Existen 4 tipos de clorofila: a (más abundante), b (pigmento
accesorio), c y d. Los dos tipos de clorofila más importantes son la a y la b, la diferencia entre ellas
consta en que la clorofila a tiene un grupo –CH3 en el anillo II, mientras que la clorofila b tiene un
grupo –CHO en esa misma posición. La clorofila c y d son propias de algas y bacterias. Además,
existen otros pigmentos presentes en las plantas como por ejemplo los carotenoides que actúan
como pigmentos accesorios en el proceso de la fotosíntesis. Estos le confieren la coloración amarilla
y roja a las platas.
Unas de las técnicas para determinar la presencia de clorofila a y b en plantas es la
cromatografía en capa fina.

Fundamento:
Los pigmentos vegetales pueden ser separados utilizando la técnica de cromatografía en
capa fina. Dependiendo de la naturaleza de los pigmentos, el grado diferente de solubilidad en los
disolventes de la fase móvil va a ser distinto, esto permite su separación cuando la misma asciende
a través de la placa cromatográfica. Los pigmentos más solubles en la fase móvil ascenderán más
rápido que aquellos que poseen una solubilidad menor. Sobre la fase estacionaria se observarán
varias bandas de distintos colores y grosores, dependiendo del tipo y abundancia del pigmento en
el material vegetal.
Los pigmentos clorofílicos son insolubles en agua, pero sí son solubles en solventes
orgánicos. A los solventes que extraen simultáneamente los pigmentos del material vegetal se les
denomina extractores. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y a
éstos se les llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo.

Objetivos:
1. Utilizar la técnica de cromatografía en capa fina para separar pigmentos vegetales.
2. Comprender el fundamento de la separación de compuestos de una mezcla por medio de
la técnica de cromatografía en capa fina.
Materiales:
 Espinaca
 Hojas de una planta (nombre común y científico conocido)
 Placa de aluminio 7 x 7 cm recubiertas de sílica gel para cromatografía de capa fina
 Cámara cromatográfica
 Capilares sin heparina adelgazados
 Regla de 30 cm
 Lápiz o portaminas
 Mortero con pistilo
 Probeta 50 y 100 ml

Reactivos:
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 Éter de petróleo
 Ciclohexano
 Acetato de etilo
 Acetona
 Etanol
 Sulfato de magnesio anhidro
Procedimiento:

 Preparación muestra
1. Triturar 1.5 g de muestra con 0.5 g de sulfato de magnesio anhidro y 1.0 g de arena durante
10 minutos aproximadamente.
2. Transferir el material triturado a un tubo de ensayo que contenga acetona, la cual debe de
cubrir todo el material agregado, y agitar.
3. Dejar reposar por 10 minutos y transferir la acetona a un vial para almacenar.

 Preparación Fase Móvil

1. Preparar 50 ml de fase móvil: éter de petróleo/ciclohexano/acetato de etilo/acetona/etanol
30:8:5:5:2
2. Saturar la cámara cromatografica durante 20 minutos con la fase móvil preparada.

 Preparación Fase Estacionaria

1. Sobre una placa previamente preparada recubierta con sílica gel trazar con un lápiz una
recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de éste de 1 cm. Realizar este
procedimiento con cuidado para no destruir el material.
2. Sobre esta línea colocar los puntos de referencia necesarios para llevar a cabo el análisis.

 Desarrollo de la Cromatografía:
1. Llevar a cabo la técnica correspondiente al sembrado en la página de la sección de técnicas
complementarias al inicio de este manual.
2. Introducir la placa a la cámara cromatografica y tapar
3. Dejar correr la fase móvil hasta que el frente llegue a 1 cm del borde superior de la placa.
4. Sacar el papel de la cámara y trazar con lápiz una línea sobre el frente.
5. Marque con lápiz las manchas de las muestras.
Resultados:
1. Calcular los factores de retención.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la polaridad de los solventes utilizados?
2. ¿Cuáles son los principales pigmentos extraídos y cómo se ubican en el cromatograma?
3. ¿Por qué algunos pigmentos recorren más distancia de la fase estacionaria que otros?

Bibliografía:

1. Quach, H. et al. An Improved Method for the Extration and Thin-Layer Cromatography of
Clorophyll a and b from Spinach. Journal of Chemical Education. Vol. 81, No. 3. Marzo 2011.
2. Castrejón, E, et al. Extracción y Separación de Pigmentos Vegetales. Universidad del Valle
de México.