UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL E INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

PRACTICA DE LABORATORIO N° 05
“SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS”

Docente a cargo:
ING. MSC. SMITH TIMANA ROJAS
Asignatura:
COMPOSICION DE LOS ALIMENTOS
Integrantes:
ALBÁN VARGAS Ana Lucía
AQUINO GODOS Fiorella
CRUZ CRISANTO Anabel
DE LA CRUZ CASTILLO Job
DUEÑAS LABÁN Shirley
LANDACAY MOROCHO Mirtha

SEMESTRE 2019 - I
CICLO V

Castilla - Piura, Perú

2019
 Tabla de contenido
Tabla de contenido .................................................................................................................................. 2

I. OBJETIVO ..................................................................................................................................... 3

II. INTRODUCCION .......................................................................................................................... 3

III. MARCO TEORICO .................................................................................................................... 3

Factores que afectan la solubilidad proteica ....................................................................................... 3

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS ............................................................................. 5

V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS ....................................................................................... 5

Preparación de la solución rica en proteínas ....................................................................................... 5

Efecto del cambio de solventes (con acetona) .................................................................................... 6

Efecto del cambio de solventes (con metanol).................................................................................... 6

Efecto del cambio de temperatura (agua hirviendo) ........................................................................... 6

Efecto del cambio de temperatura (agua helada) ................................................................................ 6

Efecto del cambio de la concentración de sales .................................................................................. 7

1. Colocar 15 mL de la solución de proteínas en un vaso precipitado. ............................................... 7

2. Con una espátula o cuchara agregar poco a poco el cloruro de sodio y mezclar. ........................... 7

3. Continuar agregando cloruro de sodio hace observar algún cambio. ............................................. 7

4. Hacer las respectivas anotaciones de los cambios. ......................................................................... 7

VI. PREGUNTAS ............................................................................................................................. 7

1. ¿Qué tipo de proteína son la caseína y la albúmina estructural y funcionalmente? .................... 7

2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas? ...................................................... 8

3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína? ......................................................................... 11

4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales? ..................................... 12

5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas? .............................................. 13

VII. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 13

 I. OBJETIVO
 Identificar los factores que afectan la solubilidad de las proteínas al modificar las
condiciones del medio en que se encuentran.

II. INTRODUCCION
Las proteínas desempeñan una enorme variedad de funciones: transporte, almacenamiento,

organización, estructural de las células y los tejidos y como catalizadores (enzimas) que

promueven la enorme variedad de reacciones que forman el metabolismo. Cada tipo de célula

en todos los organismos posee varios miles de clases de proteínas para cumplir la gran variedad

de funciones para ello mantener la multiplicidad de sus funciones, las proteínas son moléculas

extremadamente complejas que tienen una estructura determinada formada por la secuencia

definida de aminoácidos. La proteína tiene una estructura tridimensional específica de

plegamientos de su cadena dicho estructura debe mantenerse para que la proteína ejerza su

función, esto implica que existen interacciones entre los aminoácidos que conforman las

harinas y las moléculas del medio (agua fundamentalmente), adquiriendo una conformación

natural máxima estabilidad la cual no debe perderse.

III. MARCO TEORICO

Factores que afectan la solubilidad proteica
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína son la fuerza iónica del medio

(concentración de sales), el pH, la temperatura y la constante dieléctrica del solvente

(polaridad).

Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores, la proteína responde con una intensidad

proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera

superficial o lo puede llegar a hacer tan intensamente que provoca una desnaturalización

irreversible.

Acetona
La adición de disolventes orgánicos como el etanol o la acetona, disminuye la permeabilidad

de cualquier medio acuoso. Aumentan asi las fuerzas electrostaticas intra e intermoleculares,

repulsivas y atractivas. Las interacciones intramoleculares electrostaticas repulsivas

promueven el desplegamiento de la molecula proteica. En el estado desplegado la

permeabilidad favorece la formacion de puentes de hidrogeno intermoleculares entre los grupos

péptidos expuestos y las interacciones electrostaticas intermoleculares entre grupos con carga

de signo opuesto. estas interacciones polares intermoleculares conducen a la precipitacion de

la proteina en los disolventes orgánicos.

Es por ello que al adicionar acetona a las 2 muestras se presentan precipitados más pesados y

más evidentes.

-Sulfato de amonio más evidentes. (NH4)2NO4

La precipitación salina de las proteínas es una técnica en donde se logra la precipitación de una

fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades

de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína- H2O porque

quita la capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la

precipitación de las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es

igual para todas las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y

purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa

sulfato de amonio para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000

ml. de agua a una temperatura de 20°C) y porque el ion sulfato divalente permite alcanzar altas

fuerzas iónicas. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de

proteínas, las cuales son precipitadas, pero no desnaturalizadas.

-Aumento de temperatura
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se

desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asímismo, un aumento

de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína,

de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la

agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Materiales:
- Plancha de calentamiento
- Goteros
- Vasos de precipitado de cristal
- Agitador
- Cuchara desechable
Insumos
- Huevo o clara de huevo
- Etanol o metanol
- Acetona
- Hielo
- Cloruro de sodio
- Agua
- Sulfato de sodio

V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS
Preparación de la solución rica en proteínas
1. Romper con cuidado por la mitad a un huevo fresco y separar la clara de la yema con
mucho cuidado de no mezclarlas.
2. Diluir una porción de clara con dos porciones de agua destilada y mezclar suavemente.
3. Esta solución será la que utilizará en el resto de los experimentos.
RESULTADO:

Observaciones: Evidencia:
Efecto del cambio de solventes (con acetona)
1. Colocar 15 mL de solución de proteínas en un vaso precipitado.

2. Dejar gotear lentamente acetona y agite suavemente hasta notar algún cambio

3. Anotar qué es lo que observa

Observaciones: Evidencia:

Efecto del cambio de solventes (con metanol)

1. Colocar 15 mL de solución de proteínas en un vaso precipitado.

2. Dejar gotear lentamente metanol y agite suavemente hasta notar algún cambio

3. Anotar qué es lo que observa

Observaciones: Evidencia:

Efecto del cambio de temperatura (agua hirviendo)

1. Poner a hervir agua en recipiente de un litro.

2. Colocar un vaso de vidrio 15 mL de solución de proteínas.

3. Introducir el vaso con agua hirviendo y dejar dos minutos.

4. Con mucho cuidado sacar el vaso y observar que sucedió con el huevo.

Observaciones: Evidencia:

Efecto del cambio de temperatura (agua helada)

1. Poner a helar agua en recipiente de un litro.

2. Colocar un vaso de vidrio 15 mL de solución de proteínas.

 3. Introducir el vaso con el agua helada y dejar dos minutos.

4. Con mucho cuidado sacar el vaso y observar que sucedió con el huevo.

Observaciones: Evidencia:

Efecto del cambio de la concentración de sales

1. Colocar 15 mL de la solución de proteínas en un vaso precipitado.

2. Con una espátula o cuchara agregar poco a poco el cloruro de sodio y mezclar.

3. Continuar agregando cloruro de sodio hace observar algún cambio.

4. Hacer las respectivas anotaciones de los cambios.

Observaciones: Evidencia:

VI. PREGUNTAS
1. ¿Qué tipo de proteína son la caseína y la albúmina estructural y funcionalmente?
LA CASEÍNA:

- A nivel estructural cuenta con pocos tramos con estructura secundaria

organizada, debido a la presencia de abundantes restos de prolina, y tener

unidos covalentemente grupos fosfato a algunos de los restos de serina, y

muy ocasionalmente a restos de treonina. La falta de organización de las

moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido

cristalizar para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria

y terciaria.
 - A nivel funcional: La caseína tiene propiedades anti-catabólicas. Es por eso

que muchos deportistas utilizan la caseína por la noche para evitar entrar en

estado catabólico, es decir, la pérdida muscular. Por ende se clasifica como

una enzima.

LA ALBÚMINA:

- A nivel estructural: Es una proteína globular de estructura terciaria, está constituida

por alrededor de 585 aminoácidos con 17 puentes de disulfuro.

- A nivel funcional: La albúmina por su función es una proteína de transporte.

2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?

Aislamiento de proteínas: La primera etapa en el aislamiento de una proteína es su

liberación de las células que la contienen. El método elegido depende de las características

mecánicas del tejido de procedencia, así como de la localización celular de la proteína de

interés. Como métodos de ruptura mecánica de las células vegetales para liberar sus

proteínas se pueden mencionar: 1) trituración con arena o alúmina, 2) trituración en

mezclador de alta velocidad, 3) homogeneizador a pistón, 4) prensa francesa, 5) sonicación

y 6)congelación con nitrógeno líquido y macerado.

La diversidad de proteínas involucradas en procesos de crecimiento, desarrollo y defensa

impide la formulación de un procedimiento de extracción universal que permita recuperar

todas las proteínas de un tejido vegetal. Sin embargo, la solubilidad de las proteínas de

plantas, que está relacionada con la localización intracelular, permite formular diferentes

métodos de extracción. Ellos incluyen:

1) extracción con buffer acuoso 2) extracción con detergentes 3) precipitación directa con
TCA 4) precipitación con acetona y 5) precipitación con TCA-acetona.
Para prevenir la proteólisis durante la extracción se debe utilizar alguno/s de los

procedimientos siguientes: 1) extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato),
2) extraer con TCA frío al 10 % (p/v), 3) adicionar un cóctel de inhibidores de peptidasas

al buffer de extracción, 4) trabajar a baja temperatura durante períodos cortos de tiempo, 5)

usar buffers de pH por encima o por debajo del óptimo, 6) adicionar agentes protectores

como dimetil sulfóxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores como

ditiotreitol (1mM), L-cisteína (5mM) o β-mercaptoetanol (1mM)) o 7) adicionar agentes

quelantes como EDTA (2 mM) o EGTA (2mM) para remover cationes bivalentes que son

cofactores de metalopeptidasas y de varias peptidasas serínicas.

Los compuestos fenólicos pueden inactivar las proteínas al formar puentes de hidrógeno

con los átomos de oxígeno de los enlaces peptídicos y también cuando los fenoles son

oxidados a quinonas pueden condensarse con los grupos -SH y -NH2 de las proteínas. Estas

interacciones químicas determinan la formación de dímeros y polímeros de proteína

entrecruzadas por polifenoles, afectando la calidad del patrón proteico observado en los

geles. Para evitar la acción de los compuestos fenólicos se pueden usar varias estrategias:

1) precipitar todas las proteínas triturando los tejidos en TCA frío (no permite medir

actividad biológica), 2) adicionar polivinilpirrolidona (PVP) que compleja los fenoles y

alcaloides, 3) en combinación con PVP, inactivar la fenoloxidasa con agentes reductores

como ascorbato, β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), dietilditiocarbamato de sodio,

metabisulfito de sodio o tiourea, 4) agregar EDTA que secuestra el cobre que es un cofactor

necesario para la expresión de la polifenoloxidasa, 5) usar un buffer de extracción de bajo

pH que ayuda a prevenir la formación de quinonas y favorece la unión de PVP a fenoles y

6) remover fenoles y alcaloides por gel filtración

Purificación de Proteínas: Las proteínas se purifican mediante procedimientos de

fraccionamiento. En una serie de etapas independientes, se aprovechan las diversas

propiedades fisicoquímicas de las proteínas que interesan para separarlas progresivamente

de otras proteínas y/o de las demás sustancias. Las características de las proteínas que se
emplean en los diversos procedimientos de separación son: solubilidad, carga iónica,

tamaño molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras moléculas

biológicas.

Solubilidad: Los múltiples grupos ácido-base de una proteína determinan que sus

propiedades de solubilidad dependan de la concentración de las sales disueltas, de la

polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura.

Separaciones cromatográficas: La fase móvil de una cromatografía consiste en una mezcla

de sustancias que se van a fraccionar disueltas en un líquido, que se hace fluir a través de

una columna de una matriz porosa, que constituye la fase estacionaria. Las interacciones

de los solutos individuales con la fase estacionaria determinan que cada componente migre

con velocidades diferentes y que la mezcla se separe en bandas de sustancias puras. Los

diversos métodos cromatográficos surgen de la interacción dominante entre la fase

estacionaria y las sustancias que están siendo separadas y son: cromatografía de

intercambio iónico, de adsorción, de exclusión molecular, de interacción hidrofóbica o de

afinidad.

Separaciones electroforéticas: La electroforesis es un método analítico de alto poder

resolutivo que permite la separación de moléculas biológicas cargadas por la combinación

de su migración en un campo eléctrico y el efecto de tamizado molecular a través de un gel

de corrida. Las proteínas, al ser moléculas anfotéricas polivalentes, migran en un campo

eléctrico de acuerdo con su carga neta, que a su vez depende de la carga macromolecular,

del tamaño y de la forma, como así también de las propiedades fisicoquímicas del medio

electroforético. La incorporación del detergente SDS a la solución proteica permite separar

todos los tipos de proteínas, incluyendo las insolubles en agua. El SDS se une a las regiones

hidrofóbicas de las moléculas proteicas haciendo que se desplieguen las cadenas

 polipeptídicas, liberándolas de sus asociaciones con otras moléculas proteicas o lipídicas.

En estas condiciones la electroforesis separa los polipéptidos en función de su tamaño, lo

que proporciona información sobre su peso molecular. Además, el agregado de un agente

reductor como el β-mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro que pudieran existir en las

proteínas, de modo que se pueden visualizar todos los polipéptidos constitutivos de las

moléculas poliméricas.

Detección inmunológica: La exposición de las proteínas presentes en una muestra a un

anticuerpo específico contra la proteína en estudio y el revelado con un anticuerpo contra

el primero acoplado a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina) o a un colorante

fluorescente, permite su identificación tanto en separaciones electroforéticas como en los

tejidos (inmunohistoquímica).

Las ventajas de estos métodos son las siguientes: a) no se necesitan reactivos radiactivos,

b) no se requieren precauciones especiales para mantener la conformación nativa de la

proteína y c) regiones de la proteína que están ocultas en la conformación nativa pueden

exponerse durante la electroforesis desnaturalizante, lo que permite usar anticuerpos

antipeptídicos.

3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?

El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala

al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el

punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0).

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el

comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos

ionizables en estas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.

 Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás

condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga

neta y cristali-zan en forma de sales insolubles a ese pH.

4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales?

Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas

globulares. A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas,

fenómeno que recibe el nombre de solubilidad por salado o salting in, en el que los

contraiones adicionales recubren con mayor eficacia las numerosas cargas iónicas de las

moléculas proteicas, con lo que se incrementa la solubilidad de las proteínas. Las sales de

los iones divalentes tales como el K2SO4 y el (NH4) SO4, son mucho más eficaces en la

solubilización de las proteínas que las sales de iones monovalentes tales como el NaCl y el

KCl. Este efecto lo observamos en el siguiente grafico que muestra la solubilidad de la

carboxihemoglobina en su punto isoeléctrico dependiendo de la fuerza iónica y del tipo de

ion. S y S’ representan respectivamente las solubilidades de la proteína en la disolución de

la sal y en el agua pura.

La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las proteínas está en

función de su fuerza iónica, que constituye una medida tanto de la concentración como del

número de las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal.

El efecto de solubilidad por salado está causado por cambios de la tendencia a la ionización,

de los grupos R disociables de la proteína. Por otra parte, a medida que la fuerza iónica

aumenta, la solubilidad de una proteína comienza a disminuir. A una fuerza iónica lo

suficientemente elevada, una proteína puede ser casi completamente precipitada de su

disolución, efecto llamado insolubilización por salado o salting out, que es el resultado de

la competencia por moléculas de solvatación entre los iones salinos agregados y los otros

solutos disueltos. Uno de los factores que explican este efecto es que la concentración
 elevada de la sal puede eliminar el agua de hidratación de las moléculas de proteína,

reduciendo entonces su solubilidad. La solubilización e insolubilización por salado, son

procedimientos importantes para la separación de mezclas de proteínas, ya que las

diferentes proteínas varían en su respuesta frente a la concentración de sales neutras. Las

proteínas precipitadas por salado retienen su conformación nativa y pueden disolverse de

nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalización. El sulfato amónico es el preferido

para precipitar las proteínas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que permite

alcanzar fuerzas iónicas muy elevadas.

5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas?

La adición de disolventes orgánicos neutros miscibles con el agua, particularmente etanol

o acetona, disminuye la solubilidad de la mayor parte de las proteínas globulares en el agua,

de tal manera que precipitan de su disolución. El estudio cuantitativo de este efecto muestra

que la solubilidad de una proteína a un pH y fuerza iónica determinados está en función de

la constante dieléctrica del medio. Puesto que el etanol posee una constante dieléctrica,

menor que la del agua su adición a una disolución acuosa de proteína incrementa la fuerza

de atracción entre las cargas opuestas, disminuyendo de este modo el grado de ionización

de los grupos R de la proteína. Como resultado, las moléculas de proteína tienden a

agregarse y precipitan.

VII. BIBLIOGRAFÍA
SITIOS WEB:

- https://espndeportes.espn.com/espn-run/nota/_/id/4794351/que-es-la-caseina
- https://www.ecured.cu/Case%C3%ADna
- https://es.slideshare.net/KarlozHernndez1/bioquimica-albumina
- http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/Documento+completo.pdf?
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- https://www.ecured.cu/Punto_isoel%C3%A9ctrico