UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA 

LA MOLINA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
 

 
Informe N°8 
Actividad enzimática 
 
 
INTEGRANTES: 
 
● 20150339- Carrillo Cruz, Bryan Abraham Jeicob 
● 20130991- Gonzales Montero, Jesús Andrée 
● 20161456- Quiñones Pastor, Marjhory Ayling 
 
PROFESOR:​ Roberto Ramos Chaupin 
MESA:​ N°6 
 
2019-II 
 1. INTRODUCCIÓN

Según Prescott (2002) las enzimas pueden definirse como proteínas catalíticas que
tienen una alta especificidad para la reacción catalizada y para las moléculas sobre
las que actúan. Las moléculas que reaccionan reciben el nombre de sustratos, y las
sustancias formadas se denominan productos.

A pesar del apabullante número y diversidad de enzimas presentes en las células,

pueden clasificarse en seis clases generales: Oxidorreductasas, transferasas,
hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Las enzimas suelen nombrarse en función
de los sustratos sobre los que actúan, y del tipo de reacción catalizada.

En el caso de los microorganismos en función a su metabolismo y factores

ambientales, estos producen enzimas de acuerdo a la disponibilidad de su material
genético y necesidades. El conocimiento de la actividad enzimática de los
microorganismos tiene un amplio uso en la industria en general, ya que en base a
esta se propicia su producción. En la presente práctica se evaluará la actividad
enzimática de amilasas, caseinasas, gelatinasas y lipasas en ​E. coli​, ​Bacillus sp​.,
Staphylococcus sp. De tal modo que mediante indicadores de color se pueda
apreciar la presencia de la correspondiente enzima en el agar almidón, caseína,
gelatina o grasa y en qué proporción se ha dado la degradación.
2. OBJETIVOS

- ​Determinar y reconocer cuáles microorganismos de los sembrados (​E.coli,​

Bacillus sp​., ​Staphylococcus sp.)​ degradan almidón, caseína, gelatina o lípidos.

- Comparar la actividad enzimática de los tres microorganismos sembrados

​

(​E.coli,​ ​Bacillus sp​., ​Staphylococcus sp.).

3. MARCO TEÓRICO( incompleto)

Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos.
Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una
reacción, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones
imposibles, sino que solamente aceleran las que espontáneamente podrían
producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar
reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión,
temperatura o pH.

La energía requerida para el mantenimiento de la vida y para la síntesis de los

componentes celulares es obtenida por la transformación ordenada de las
substancias que ingresaron a la célula. Éstas son modificadas por una serie de
reacciones enzimáticas sucesivas, a través de rutas metabólicas específicas.

Las vías metabólicas tienen las funciones de proveer los precursores para los
componentes celulares y obtener energía para los procesos de síntesis y otros que
requieran energía. Primero, los nutrientes son rotos en pequeños fragmentos
durante el catabolismo y luego convertidos por las reacciones del metabolismo
intermediario en ácidos orgánicos y ésteres de fosfato. La mayoría de los
compuestos de bajo peso molecular que representan las unidades para sintetizar la
célula, son aminoácidos, bases púricas y pirimidínicas, fosfatos de azúcares, ácidos
orgánicos y otros metabolitos, algunos producidos al final de largas cadenas de
reacciones. Estas sustancias sirven para la síntesis de las macromoléculas (ácidos
nucleicos, proteínas, materiales de reserva, constituyentes de la pared celular)
durante el anabolismo.

El almidón es el material de reserva que predomina en las plantas y comúnmente se

presenta en gránulos con una típica estructura en capas. Está compuesto de dos
glucanos: amilosa y amilopectina. La amilosa es soluble en agua caliente y se tiñe
de azul con una solución acuosa de yodo. Consiste de una cadena helicoidal no
ramificada de unas 200 - 500 unidades de D -glucosa con enlaces
1,4-a-glicosídicos. La amilopectina se hincha en agua caliente dando una pasta y
toma un color pardo violáceo con yodo. Es también un polímero 1,4-a-D-glucosa
que, como el glicógeno, está ramificado por enlaces 1,6-a-glucosídicos
aproximadamente cada 25 unidades de glucosa (8). Los almidones de distinto
origen difieren mucho en su ramificación, el número de unidades por cadena y los
residuos fosfato e iones calcio y magnesio que los acompañan. Hay tres tipos de
descomposición enzimática de los glucanos: fosforólisis, hidrólisis y
transglicosilación. La fosforólisis por la a-1,4-glucanfosforilasa sólo ocurre
intracelularmente. La transglicosilación es la formación de ciclodextrinas con 6-8
unidades de glucosa a partir del almidón, por acción de Bacillus macerans y otros
(4). El ataque extracelular del almidón es debido a la acción hidrolítica de las
amilasas

Degradación del almidón

4. MATERIALES
Medios de cultivo:
 Soluciones requeridas:

5. PROCEDIMIENTO
● Con un plumón marcador se dividió la base de la placa en cuatro
secciones.
● Luego, cada sección se enumeró como I, II, III y IV. Utilizando la aguja
de kolle (previamente esterilizada), se colocó una estría de cada
cultivo (Bacillus, E.coli, Staphylococcus) en un cuadrante, después se
invirtió las placas y se incubó a 37ºC por 24 horas.
 ➢ I: control
➢ II: E. coli
➢ III: Bacillus sp.
➢ IV: Staphylococcus sp.

Después de la incubación, se determinó los resultados de la prueba, de la siguiente

manera:

a) Hidrólisis del Almidón:

● Se cubrió la superficie de la placa con
solución Lugol.
● Observar halo de hidrólisis.
b) Hidrólisis de la caseína:
● Sólo se observa el halo de hidrólisis.
c) Hidrólisis de la gelatina:
● Se cubrió la superficie de la placa con HgCl​2
por 5 min.
● Observar halo de hidrólisis.
d) Hidrólisis de los lípidos:
● Se cubrió la superficie con CuSO​4 por
​ 5 min.
● Observar color verde azulado alrededor de
las colonias.
 6. RESULTADOS Y DISCUSIONES

CUADRO DE RESULTADOS

Microorganismo Agar almidón Agar caseína Agar gelatina Agar grasa

Bacillus​ sp +++ ++ - NO

E. coli - - - NO

Staphylococcus​ sp - +++ - SI

OBSERVACIÓN

Luego de la incubación, y después de cubrir la superficie de la placa con solución de lugol,

se pudo notar lo siguiente:

● El halo de hidrólisis era grande y transparente en el cuadrante que correspondía a la

​ os demás cuadrantes y el cuadrante control estaban de color
bacteria ​Bacillus sp. L
oscuro, lo que correspondía con zonas no hidrolizadas.

DISCUSIÓN

La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las bacterias, estas
deben descomponerla (hidrolizarla) en sustancias más simples y fácilmente asimilables. Un
gran número de bacterias son capaces de elaborar una enzima amilasa que hidroliza el
almidón con formación de maltosa. La maltosa puede ingresar a la célula para ser utilizada.
La enzima amilasa es también una enzima extracelular, por lo tanto, la demostración de la
hidrólisis del almidón puede hacerse tanto en medio líquido como en medio sólido.
En el medio sólido (sobre las placas) al agregar la solución de Lugol, se formará un color
azul si no hubo hidrólisis; la aparición de una zona clara alrededor de las colonias significa la
hidrólisis del almidón. Cuando la bacteria no hidroliza el almidón todo el medio permanece
azul. Para evidenciar la formación ácida será necesario agregar un indicador apropiado al
medio de cultivo (UNMSM, 2010).

El almidón reacciona químicamente con iodo para producir un color azul oscuro cuando las
moléculas de Iodo se insertan en los huecos de la molécula espiralada del almidón. Este
resultado es debido a que la molécula absorbe más luz visible excepto el azul, y si el
almidón se rompe en maltosa y glucosa, no se desarrolla ningún color debido a que
desaparece la espiral y no quedan los huecos para que entre el lodo, esta ausencia de color
es asociada con la hidrólisis de almidón. ​(Bailey; Scott, 2007)

La producción de amilasa es útil para diferenciar especies de Bacillus, de Streptococcus y

de Lactobacillus. ​(Rodríguez et al., 2012)

OBSERVACIÓN

● Las bacterias que mostraron actividad proteolítica fueron ​Staphylococcus y

Bacillus pues alrededor de sus colonias se pudo observar zonas claras lo cual
nos indica que hubo degradación de caseína, aunque más se pudo notar en la
primera bacteria mencionada. Mientras que las dos últimas bacterias no
presentaron actividad enzimática alguna.

DISCUSIÓN

Aquellas bacterias que pueden degradar caseína, necesitan de la caseasa, una exoenzima
hidrolizante. En otras palabras, la caseasa es una proteasa que rompe el enlace peptídico
CO-NH introduciendo agua a la molécula, liberando pequeñas cadenas de aminoácidos
llamados péptidos, los cuales luego serían disminuidos a aminoácidos libres para ser
utilizados por las células. Esta peptonización produce un aclaramiento en aquellas zonas de
proliferación de bacterias con caseasa en el momento de la reacción de revelado (Swamy,
2008).

poder observar la hidrolisis, se debe usar agentes desnaturalizantes de proteínas, el que se

usa comúnmente es el cloruro de mercurio, pero es toxico, por ello no lo podemos utilizar
libremente, es por ello que se utilizó el ácido acético, este ácido también es
desnaturalizante; al desnaturalizar a la proteína, ésta va a precipitar y alrededor se nota la
presencia de la hidrolisis (Olivas & Alarcón. 2004).

En cuanto a las bacterias que son capaces de producir proteasas extracelulares

encontramos a bacterias patogénicas como el Staphylococcus y Streptococcus, bacterias
acuáticas como las Pseudomonas y bacterias de suelo como los Bacillus y Clostridium
(Swamy, 2008). En nuestro caso, experimentamos con tres bacterias; Bacillus;
Staphylococcus y E. coli.

OBSERVACIÓN

En nuestra muestra lamentablemente no pudimos observar el halo de hidrólisis debido a

que tuvimos problemas en la inoculación y se terminó contaminando la muestra.

Este mismo problema tuvieron algunas mesas de trabajo. Sin embargo, pudimos corroborar
con resultados de otro laboratorio, lográndose ver con éxito el halo perteneciente a ​Bacillus.
DISCUSIÓN

Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en una
célula bacteriana; por lo tanto, para que una célula utilice las proteínas, primero deben ser
catabolizadas en componentes más pequeños. Las enzimas exocelulares de tipo
proteolítico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas
y este proceso se realiza en dos etapas.

Ciertas bacterias elaboran una enzima extracelular que tiene la propiedad de hidrolizar la
gelatina, esta enzima es conocida como Gelatinasa. La presencia de gelatinasa puede ser
demostrada inoculando un cultivo bacteriano en un medio conteniendo gelatina.

La presencia de líquido significa que la gelatina ha sido hidrolizada (liquefactada). Por el

contrario, si el medio permanece sólido es señal de que la bacteria no posee la enzima
gelatinasa. Este medio puede ser repartido en placas, 20 mL por placa y sembrado en
estrías, luego de la incubación se agrega el siguiente reactivo: Se cubre la placa con el
reactivo, cuando la gelatina no es hidrolizada, se formará un precipitado blanco muy opaco
(ausencia de hidrólisis), y cuando la gelatina es hidrolizada se formará un halo claro en el
contorno de la colonia sobre la estría (UNMSM, 2010).

Algunas bacterias con actividad proteolítica son: ​Peptostreptococcus anaerobius,​

Clostridium sticklandii​, ​Clostridium aminophilum​, ​Escherichia Coli y del genero gram (-)
patógeno ​Pseudomonas​ (Frioni, 2011).
OBSERVACIÓN

En este agar teníamos que observar el color que tomaba nuestra muestra a uno más
intenso o metálico por acción de lipasas; el cual se pudo realizar con éxito, sobretodo en
Staphylococcus.

DISCUSIÓN

El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio que contiene
triglicéridos, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como
nutrientes a los ácidos grasos mediante la lipólisis enzimática. Al medio de cultivo se le
añade un colorante, SO4Cu2, y al difundir las enzimas en el medio de cultivo sólido,
disminuye el pH debido a la acumulación de los ácidos grasos libres, y su color se vuelve
visualmente más brillante e intenso en aquellas zonas en donde se encuentran los ácidos
grasos libres. Las lipasas se definen como aquellas enzimas capaces de hidrolizar los
enlaces éster de los ácidos carboxílicos de sustratos insolubles.

El rol biológico de las lipasas consiste en iniciar el metabolismo de las grasas y aceites
reduciéndolos a ácidos grasos libres realmente metabolizables y glicerol. Los triglicéridos no
se absorben intactos dentro de la célula, así que la hidrólisis inicial ocurre extracelularmente.
Por esta razón, las lipasas microbianas generalmente son excretadas por la célula, y se
encuentran como enzimas extracelulares (Koneman, 2008).

Las bacterias que utilizamos para la determinación de enzimas lipolíticas fueron ​Bacillus​,
Staphylococcus y ​E. coli.​ ​En los cuales la mayoría presentó actividad enzimática, pero
sobretodo el cuadrante III.

7. CONCLUSIONES

-​ Tanto ​E.coli​ como ​Staphylococcus​ ​sp​. demostraron una actividad

​

enzimática nula para caseína y almidón siendo la única que actuó

Bacillus sp.​ Asimismo, en el agar grasa ​Staphylococcus sp​. Fue la
única cepa que demostró actividad lipásica.

-​ En el agar gelatina ​Bacillus sp​. fue la cepa con mayor actividad

​

catalítica siguiéndole ​E.coli​ y en menor proporción ​Staphylococcus

sp.

8. BIBLIOGRAFÍA

● UNMSM. 2010. Medios de Cultivo en Microbiología Manual de Laboratorio.

Consultado 28 oct. 2018. Disponible en
 http://microbiologiamedica.web16.top/medios/medios-comunes/medio-de-gel
atina
● (2007). En Bailey, & Scott, ​Diagnóstico Microbiológico (págs. 690-691).
Madrid: Editorial Médica Panamericana S.A.
● (2012). En E. Rodríguez Caballini, M. Gamboa Coronado, & F. Hernández
Chavarría, ​Bacteriología General (págs. 194-195). Costa Rica: Editorial
Universidad de Costa Rica.
● Swamy, PM. 2008. Laboratory manual on biotechnology. Rastogi
Publications.
● OLIVAS, E. y ALARCÓN L.R. 2004. Manual de prácticas de Microbiología
básica y Microbiología de Alimentos. Universidad autónoma de Ciudad
Juárez. 1ª reimpresión. México.
● Frioni, L. 2011. Microbiología: básica, ambiental y agrícola. 1ra ed. Buenos
Aires, Argentina, Orientación Gráfica Editora.
● Koneman, EW; Allen, S. 2008. Koneman. Diagnostico
Microbiologico/Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas En Color/Text and
Color Atlas. Ed. Médica Panamericana.
● Prescott, L. (2002). Microbiología. Madrid: The McGraw Hill Company
Inc.