UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E
HISTOPATOLÓGICO

GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

PERÍODO ACADÉMICO OCTUBRE 2019 - MARZO 2020
ASIGNATURA ANÁLISIS CLÍNICO SEMESTRE: 6to PARALELO:
NOMBRE DEL DOCENTE MGS. ELENA BRITO
FECHA 22 de Octubre del 2019
NÚMERO DE PRÁCTICA 03 HORA: 18H00-21H00 DURACIÓN: HORAS
NOMBRE DE LOS GRUPO 2
ESTUDIANTES. ERIKA ESTHEFANIA ROMERO COLCHA
LUGAR DE LA PRÁCTICA LABORATORIO E200
TÍTULO DE LA UNIDAD UNIDAD 1
TEMA DE LA PRÁCTICA TÉCNICA DE ANÁLISIS

RESULTADO DE APRENDIZAJE.
Aplica conocimientos teórico-prácticos mediante procedimientos y técnicas manuales y/o automatizadas de
análisis de laboratorio en las diferentes áreas: Hematología, Bioquímica, Serología e Inmunología, Uroanálisis,
Microbiología, Parasitología, Toxicología, Terapia Transfusional, Citología y Técnicas Histológicas, Técnicas
forenses y Biología molecular en muestras biológicas para formar profesionales competitivos.

OBJETIVO GENERAL Conocer las diferentes técnicas de análisis cuantitativos

- Conocer el fundamento de las técnicas cinética multipunto
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Conocer el fundamento de las técnicas cinética punto final
FUNDAMENTO TEÓRICO:

Métodos cinéticos

Consisten en medir la absorbancia varias veces con intervalo de minutos. Permite comprobar que realmente estas
en la zona lineal de la curva, zona ideal para la determinación. Si se detectan desvíos de la linealidad se puede
despreciar alguna de las medidas finales de la absorbancia. En muchas reacciones enzimáticas participan como
cofactores los complejos NAD- NADH o NADP – NADPH y en esta participación se basan muchos métodos
analíticos

Método a punto final

Se ponen en contacto los reactivos que aportan al sustrato y la amuestra biológica que aporta el enzima y tras un
periodo de incubación que supere el periodo de retardo se mide la absorbancia. Al cabo de un tiempo establecido
se detiene la reacción y se vuelve a medir la absorbancia. No es frecuente este tipo de técnica al presentar los
inconvenientes de suponer que la reacción es lineal y la cinética de orden cero, para que la velocidad no dependa
de la concentración de sustrato, lo que no ocurre siempre. Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo
determinado y a una temperatura determinada para que se complete totalmente la reacción, de tal forma que la
sustancia que buscamos debe consumirse totalmente. Si no fuera así y quedase parte de la sustancia sin consumir,
al medir el producto, estaríamos midiendo menos cantidad de la que realmente hay. Por lo tanto se mide al final
de un tiempo fijo de incubación. La concentración de una sustancia es igual a la absorbancia por un factor llamado
“Factor de Calibración (K)”, que coincide con la pendiente de la recta de calibración

Un método frecuentemente usado para la corrección de la interferencia espectral es la medición de una típica
reacción de punto final, como lo es la reacción cinética de dos puntos. Si se monitorea la absorbancia de una
reacción colorimétrica no instantánea en función del tiempo, se observa una curva de reacción. Una reacción de
punto final se monitorea a un solo punto de tiempo, cuando la reacción casi se ha completado .Si no hay
interferencias espectrales, la curva de reacción debería pasar por el origen. Si existe este tipo de interferencia, la
curva será paralela a la original, pero sesgada hacia valores más elevados debido al color endógeno de la muestra.
Si se usa un blanco de muestra para restar el color endógeno, se obtendrá una línea idéntica a la de la muestra que
no contiene interferencias. En un ensayo cinético de dos puntos, la absorbancia es medida a dos puntos diferentes
de tiempo; cuando (1) el desarrollo final de color no ha ocurrido y de hecho puede ser pequeño y, (2) cuando la
respuesta de absorbancia versus tiempo es todavía lineal. La lectura inicial se toma realmente cuando casi no ha
ocurrido formación de color. De esta manera, cualquier absorbancia a este tiempo es principalmente ocasionada
por interferentes espectrales endógenos. Después de un tiempo corto se toma una segunda lectura cuando se ha
formado solamente una pequeña cantidad de color y la respuesta de absorbancia versus tiempo es todavía lineal
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.Esta absorbancia por lo tanto incluye la del color endógeno original y la del color producido debido a la reacción
analítica específica. Al substraer la primera lectura de la segunda, la delta de absorbancia calculada (DA) es
causada solamente por el color específico formado por la reacción analítica. En la curva estándar basada en los
análisis cinéticos se grafica el cambio en la absorbancia (DA) versus la concentración .En esta curva estándar la
presencia de un interferente coloreado, no reactivo, endógeno, no tiene efecto. Por consiguiente no se necesita
hacer una medición separada de blanco de muestra; una reacción cinética de dos puntos es por sí misma un blanco
cuando no hay cambio en la naturaleza del interferente durante la reacción. Esta es una técnica importante cuando
se están desarrollando análisis químicos automatizados en un gran número de muestras.

MATERIALES Y MÉTODOS
Equipos Materiales Reactivos
Espectrofotómetro Tubos de ensayos - Suero Colesterol
PROCEDIMIENTO / TÉCNICA:

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.

2. Pipetear en tubos de ensayo:

Blanco Muestra Estándar

Estándar - - 10 ul
Muestra - 10 ul -
Reactivo Trabajo 1ml 1 ml 1ml

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5
minutos a 37ºC.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.

RESULTADO (Gráficos, cálculos, etc.)

- Técnicas cinética multipunto

Disminución

Absorbancia 1 0,115 A1 - A2 = 0,115 - 0,081 = 0,035

Absorbancia 2 0,081 A2 – A3 = 0,081 - 0,074 = 0,007
Absorbancia 3 0,074 A3 – A4 = 0,074 - 0,060 = 0,014
Absorbancia 4 0,060
TOTAL 0,056 / 3 = 0, 018 * FACTOR

- Técnicas cinética punto final

Absorbancia estándar 0,231

Absorbancia muestra 0,241

Cálculo de la concentración del colesterol

AbsM 0,241
× [200] = × [200] = 208,65 mg/dl
AbsSt 0,231

Concentración colesterol = 208,65 mg/dl

OBSERVACIONES

- La técnica cinética multipunto consisten en medir la absorbancia varias veces con intervalo de minutos.
Permite comprobar que realmente estas en la zona lineal de la curva, zona ideal para la determinación. Si
se detectan desvíos de la linealidad se puede despreciar alguna de las medidas finales de la absorbancia.
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HISTOPATOLÓGICO

- Una reacción de punto final se monitorea a un solo punto de tiempo, cuando la reacción casi se ha
completado .Si no hay interferencias espectrales, la curva de reacción debería pasar por el origen. Si
existe este tipo de interferencia, la curva será paralela a la original, pero sesgada hacia valores más
elevados debido al color endógeno de la muestra.

CONCLUSIONES

- Se conoció el fundamento de las técnicas cinética Punto final o de equilibrio. Se incuba la muestra y el
reactivo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que se complete
totalmente la reacción, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse totalmente. Si no
fuera así y quedase parte de la sustancia sin consumir, al medir el producto, estaríamos midiendo menos
cantidad de la que realmente hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo de incubación.
- Se conoció el fundamento de las técnicas cinética multipunto o métodos cinéticos. En ellos se mide la
velocidad de la reacción mediante la medida de la variación de la Absorbancia en el tiempo y esto se
relaciona con la concentración. Es una medición continua, a diferencia de la del punto final, se mide en
tiempos regulares. Se puede medir la cantidad de sustrato no transformado ó la cantidad de producto
formado

RECOMENDACIONES

- Desarrollar la practica con todas las normas de bioseguridad y con el mayor cuidado posible
- Siempre validar los resultados que se obtiene en los análisis de las muestras, antes de enviarlos o
entregarlos, aunque en algunas ocasiones estos valores se encuentren elevados en sus niveles.

CUESTIONARIO:

1. Por qué se llama técnica cinética punto final

Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que
se complete totalmente la reacción, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse totalmente.
Si no fuera así y quedase parte de la sustancia sin consumir, al medir el producto, estaríamos midiendo menos
cantidad de la que realmente hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo de incubación.

2. En las técnicas cinéticas multipunto como se determina que la misma se encuentra fuera de la
linealidad
Cuando la absorbancia de una muestra es mayor a 0.1 se encuentra fuera de la linealidad

BIBLIOGRAFÍA

- Arderiu, X. F. (1997). Bioquímica clínica y patología molecular (Vol. 1). Reverte.

- Cosios, B., Verónica, C., & Arancibia Soria, M. Y. (2017). Desarrollo de un método para recuento de
Listeria monocytogenes utilizando turbidimetría (Bachelor's thesis, Universidad Técnica de Ambato.
Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica).
- Suberviolacañas, E. A. D. B. (2010). ASTSS Bioquímica: El Nuevo Ejercicio Erofesional.

RESPONSABLE DEL
DIRECTOR/A DE CARRERA DOCENTE LABORATORIO
Mgs. Ximena Robalino Mgs. Elena Brito Lic. Franklin Ramos