MÉTODOS DE ESTUDIO

El diagnóstico de la infección por VIH tiene distintos objetivos, uno de ellos es el diagnóstico
per se de personas que se sospechan pueden estar infectadas y requieren de atención
médica,
consejo no directivo y educación sanitaria respecto a su estado. Otro de los objetivos del
diagnóstico de VIH es la seguridad en las transfusiones, productos hemoderivados y
donaciones
de órganos. Finalmente, otros objetivos del diagnóstico de la infección por VIH, son
la aplicación de programas de vigilancia serológica de esta infección (estudios de incidencia
y prevalencia, tendencias en grupos poblacionales, etc.) o en programas de investigación
clínica, farmacológica, virológica e inmunológica.
El método más comúnmente empleado para el diagnóstico de laboratorio de la infección
por VIH se basa en técnicas serológicas que detectan anticuerpos del virus en el suero de
las
personas infectadas. En este sentido, se dispone de reactivos para pruebas que pueden ser
automatizadas, total o parcialmente, y aplicarse paralelamente a un gran número de
sueros.
Estas pruebas utilizadas para el diagnóstico de una persona individualizada, reciben el
nombre
de pruebas de diagnóstico de la infección por VIH, pero también pueden utilizarse como un
instrumento para desechar o rechazar productos sanguíneos o biológicos contaminados, en
cuyo caso se denominan de cribado. Conviene subrayar, que la estrategia a emplear en el
cribado rutinario es distinta a la utilizada para el diagnóstico individualizado de la infección
por VIH. De forma conceptual, se denominan pruebas diagnósticas a las que se emplean de
forma individualizada en el suero de una persona y pruebas de cribado (o tamizaje) cuando
se aplican a un conjunto de muestras y su finalidad no es la diagnóstica.
Ensayos serológicos de tamizaje
• Enzimoinmunoanálisis (EIA). La detección de anticuerpos anti-VIH con técnicas de EIA es
el método más empleado en la actualidad existiendo distintos principios en la detección de
los anticuerpos (ELISA indirecto, competitivo, “sandwich” y captura). La mayoría de los
ensayos aprobados emplean antígenos de VIH inmovilizados capaces de fijar anticuerpos
IgG a partir del suero de un paciente.
La sensibilidad del ELISA oscila entre un 93 a un 100%, pudiendo presentarse resultados
falsos negativos durante la infección primaria, en pacientes inmunosuprimidos, o por
errores de procesamiento (rotulado y manipulación). Por otro lado, la especificidad de
esta técnica es del 99%; los resultados falsos positivos se presentan por error humano o
enfermedades autoinmunes entre otras.
Los ensayos de primera generación utilizan lisado viral obtenido a partir de líneas celulares
de linfocitos T humanos. Poseen, sin embargo, una gran capacidad de captación de
cualquier tipo de anticuerpos anti-VIH presente en la muestra. Las pruebas de segunda y
tercera generación utilizan como Ag proteínas recombinantes (PR) o péptidos sintéticos
(PS). Son muy sensibles y los resultados son más reproducibles, al utilizar un antígeno más
normalizado y purificado. Actualmente, las pruebas de cuarta generación reconocen no
solo los anticuerpos señalados anteriormente sino también antígeno p24 viral, permitiendo
acortar el período ventana.
Existen reactivos comercializados con los antígenos y formatos citados para la detección
de anticuerpos anti-VIH-1 y anticuerpos anti-VIH-1 +2. Para la detección específica de
anticuerpos anti-VIH-2 solamente se dispone de EIA con péptidos sintéticos o lisado viral
y formato indirecto. La confirmación de infección por VIH-2 se realiza con Western Blot
y PCR específica.
• Aglutinación. Estas pruebas están basadas en la aglutinación de antígenos de VIH que
previamente han sido fijados a partículas capaces de aglutinarse en presencia de suero
que contenga anticuerpos anti-VIH.
Este tipo de pruebas comenzaron a desarrollarse a mediados de los años 80 como
alternativa
a los EIA. Pueden utilizar partículas de gelatina o partículas de látex, y como antígenos,
lisados virales, péptidos sintéticos o proteínas recombinantes. Son técnicas de manejo muy
sencillo, rápidas, de lectura visual, apenas requieren instrumentación y pueden adaptarse
a un gran número de sueros. Su sensibilidad parece comparable al EIA, pero su grado
de especificidad es mucho menor. Estas técnicas son las indicadas para ser utilizadas en
laboratorios con escasa dotación instrumental o con un manejo reducido en cuanto al
número de muestras.
• Pruebas de EIA de membrana (Dot-Blot). En estas pruebas los anticuerpos anti-VIH son
detectados mediante un método inmunoenzimático. El antígeno, compuesto por proteínas
recombinantes o péptidos sintéticos de uno o ambos virus, está fijado a tiras de
nitrocelulosa. La mayoría de las pruebas rápidas de detección de anticuerpos emplean
este principio. Tienen lectura visual y no requieren instrumentación; su sensibilidad y
especificidad aún no están suficientemente evaluadas. Su ventaja y principal indicación
es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus, y su mayor inconveniente
(en países como el nuestro) es su elevado costo.
• Pruebas fluorimétricas. Han sido las últimas en incorporarse a la oferta diagnóstica (a
partir
de 1990). Los antígenos específicos están ligados a micropartículas y el indicador de la
reacción es un fluorocromo que actúa como sustrato. La fluorescencia emitida durante
la reacción es medida por un fluorómetro. Tiene por tanto lectura objetiva y requiere un
nivel de instrumentación similar a las técnicas de EIA. Dada su reciente introducción
en el mercado, hay poca experiencia y aunque la posibilidad de automatización y el
procesamiento de gran número de muestras son muy ventajosas, es necesario estudiar su
sensibilidad y valorar el costo de su incorporación de forma rutinaria.

Pruebas de confirmación
Dada las implicancias clínicas y sociales de un resultado falso positivo, las pruebas
serológicas
deben ser confirmadas empleando técnicas con fundamentos distintos y más específicos.
Por lo general, se utilizan para la confirmación de sueros positivos, pero en determinados
casos pueden emplearse también para continuar el estudio en casos dudosos, dada su
mayor
sensibilidad en muchos casos.
Existen diferentes pruebas de confirmación, entre ellas, las más utilizadas son las basadas
en la inmunoelectrotransferencia o Western Blot (WB), la inmunofluorescencia indirecta
(IFI) y la radioinmunoprecipitación (RIPA).
• Western Blot: técnica de inmunoelectrotransferencia, permite una discriminación puntual
de anticuerpos frente a las distintas proteínas del virus. Las tiras de nitrocelulosa en las que
se han transferido los antígenos virales contienen, generalmente, casi todas las proteínas
estructurales del VIH y algunas proteínas precursoras de aquellas. La técnica consiste en
la incubación de una de esas tiras con el suero problema durante un tiempo que oscila
entre 2 a 4 horas y hasta 18 horas, tras lo cual se revela la presencia de anticuerpos frente
a las diferentes proteínas del virus mediante reacciones inmunoenzimáticas distintas,
dependiendo del fabricante. El resultado es la aparición de bandas coloreadas de mayor
o menor intensidad, en el lugar de la tira de nitrocelulosa en el que están situadas las
proteínas del VIH contra las cuales existen anticuerpos en el suero problema. Se
identificarán,
por su posición en la tira según peso molecular, comparándolas con el control
positivo, las bandas especificas de reactividad (gp160, gp120, p66, p55, p51, etc.).
Existen distintos criterios de positividad para el Western Blot. El propuesto por la OMS
resulta el más sensible cuando se manejan sueros de muy variada procedencia poblacional.
Adoptando este criterio un suero es considerado positivo cuando presenta reactividad
al menos frente a dos de los siguientes 3 antígenos virales: p24, gp120 y gp4l. El criterio
propuesto por el CDC (el utilizado en nuestro país) indica que un suero es positivo
cuando presenta reactividad frente a p24 más alguna de las glucoproteínas de superficie
(gp160/120, gp41). Los sueros negativos no deberán mostrar reactividad frente a ninguna
de las proteínas presentes en la tira. Finalmente los sueros se denominan indeterminados
por Western Blot cuando, existiendo reactividad frente a una o más proteínas, no cumple
el criterio de positividad adoptado (figura 7).
Con el Western Blot pueden darse falsos negativos, posibilidad que debe tenerse en
cuenta en individuos con factores de riesgo, o signos de infección por VIH, y en casos de
exposición reciente al virus. Se han descrito ensayos indeterminados por Western Blot
en personas con factor reumatoideo, lupus eritematoso sistémico (LES), bilirrubinemias
elevadas, anticuerpos contra el sistema HLA, en pacientes hemodializados, y otras causas.
En otros casos la indeterminación en el Western Blot de VIH-1 puede ser causada por
una infección causada por VIH-2 u otros retrovirus (VLTH-I, VLTH-II).
En aquellos sueros indeterminados, el seguimiento debe prolongarse durante al menos 6
meses para verificar si existe un cambio en el patrón de anticuerpos, hacia la positividad,
o por el contrario, hacia la desaparición de las bandas detectadas inicialmente. Las
personas
con resultados persistentemente indeterminados al cabo de 6 meses, en ausencia
de factores de riego, síntomas o hallazgos clínicos compatibles con la infección por VIH,
deben considerarse negativas para anticuerpos anti-VIH. Sin embargo, no deberían donar
sangre, plasma, semen u órganos y deberán ser informadas correctamente sobre el
significado de su situación.
• Inmunofluorescencia indirecta: la confirmación por esta técnica está basada en la demos
tración de anticuerpos frente a células infectadas por VIH, los resultados sólo pueden
expresarse como positivos o negativos. Como antígenos son empleados linfocitos humanos
infectados y fijados sobre portaobjetos. Las células infectadas expresan gran cantidad
de antígenos correspondientes a distintos momentos de la infección celular, por lo que
esta técnica detecta todo tipo de anticuerpos anti-VIH. Las diluciones seriadas del suero
problema nos permiten expresar los resultados indicando el título obtenido.
• Técnica de radioinmunoprecipitación: consiste en la demostración de la existencia de
anticuerpos
anti-VIH en el suero en estudio, que en presencia de proteínas vírales marcadas
radioactivamente conduce a la formación de innunocomplejos. Es la técnica de referencia.
La elaboración del antígeno requiere condiciones de alta seguridad, ya que se realiza
mediante
cultivo del virus en líneas celulares de linfocitos humanos y su posterior marcaje
radioactivo. Los complejos proteína viral-anticuerpo específico son separados por técnicas
electroforéticas según su peso molecular y se ponen en evidencia mediante la impresión
del marcaje radioactivo en una placa fotográfica. Se trata de una técnica muy compleja
y de difícil implementación.
• Detección de Ag p24: este antígeno puede detectarse en suero o plasma durante la fase
aguda
de la infección primaria por VIH y durante la fase SIDA. El antígeno p24 es detectable
solamente en el 4% de los adultos asintomáticos. En la población adulta es una técnica
de baja sensibilidad (hasta un 60%), y la presencia de p24 es indicativa de la replicación
activa del virus.
La detección de este antígeno puede utilizarse para el diagnóstico de infección por VIH
en lactantes nacidos de madres VIH positivas. La sensibilidad de esta técnica para esta
franja etaria varía entre un 50 a un 75%, siendo aun más baja para niños menores a 6
meses de vida.

• PCR: La amplificación genómica por reacción en cadena de la polimerasa, demuestra la

existencia de parte del genoma viral a partir de muestras de sangre periférica. Se trata de
una técnica de elevada sensibilidad y especificidad (95 y 98%, respectivamente) que
provee
un diagnóstico más rápido y precoz de la infección por VIH en determinadas situaciones:
recién nacidos de madres infectadas por VIH (sensibilidad: 75 a 97%), demostración de
infecciones por VIH-2 con serología no concluyente, detección de mutaciones específicas
asociadas a la resistencia a los antivíricos.
• Aislamiento viral: el aislamiento del VIH sigue siendo hoy en día una técnica de referencia,
su empleo queda restringido a laboratorios bien equipados. Supone el cultivo del virus a
partir de muestras clínicas que contengan partículas virales libres o células infectadas. El
aislamiento es obligado cuando se pretende establecer el fenotipo de VIH, la actividad
in vitro de antivirales y puede servir de referencia de la carga viral presente en la muestra
del paciente. Requiere el cocultivo de linfocitos de sangre periférica del paciente con
linfocitos de un donante no infectado, junto con la adición de IL-2 para favorecer el
crecimiento
de células T. El cultivo permite detectar incluso el virus latente. Es característico
la observación de formación de sincicios y citólisis.
• Detección y cuantificación de ARN viral: se trata de técnicas con una sensibilidad muy
alta a la hora de determinar infecciones agudas. Si bien no tienen indicaciones para su
uso como herramienta diagnóstica en la población adulta, son herramientas sumamente
útiles para el seguimiento del tratamiento antirretroviral, y para el diagnóstico en recién
nacidos de madres portadoras de VIH. Esto radica en que los recién nacidos presentan
en su sangre hasta los seis meses de vida IgG maternos, por lo que los ensayos serológicos
podrían arrojar falsos positivos. Por otra los títulos de IgM en esta población son sumamente
bajos.
El diagnóstico de neonatos y lactantes debe basarse en la detección de antígenos. En tal
sentido, los ensayos de PCR de ADN proviral y de cultivo de células mononucleares de
sangre
periférica son los métodos más sensibles para la determinación de la infección por VIH,
alcanzando un 50% durante el primer mes de vida y cerca del 100% en lactantes mayores
de
6 meses. Los resultados positivos deben confirmarse mediante un segundo ensayo (RT-
PCR),
realizado con una segunda muestra obtenida posteriormente

Figura 7. Ejemplo de un Western blot para un suero positivo (a). La segunda tira corresponde
a un individuo sano que exhibe una reacción débil para gp160 y para p24. La tira
C, corresponde a una segunda muestra tomada del mismo individuo, y muestra el mismo
patrón. Esto arroja un resultado indeterminado que debe seguir siendo evaluado hasta la
aparición de mas bandas, o la desaparición de las existentes.