Capitolul 3

Studiul fluidităţii lipozomilor cu DPPC şi al interacţiunii lor

cu acidul folic

3.1. Introducere

Acidul folic (FA) este o componentă bioactivă, care manifestă proprietăţi antioxidante
(Ibrahim et al., 2012), antinflamatorii (Title el al., 2006; McCArty et al., 2009; Kemse et al.,
2016) și antitumorale (Durda et al., 2012; Wien et al., 2012). FA este o moleculă de interes în
multe domenii, printre care domeniile farmaceutic și medical. Acest compus poate fi transportat
în organism cu ajutorul unor proteine transportoare, cum ar fi albumina serică (Chilom et al., in
press, 2018), dar şi legat sau capsulat în vezicule sferice artificiale, având una sau mai multe
straturi bilaterale lipidice - lipozomi (Hattori et al., 2014).
Dupâ cum s-a amintit anterior, cele mai utilizate lipide din lipozomi sunt fosfolipidele.
Compoziţia lipidică, mărimea, sarcina la suprafaţă sau metoda de preparare influenţează, în mod
semnificativ, proprietăţile lipozomilor (Akbarzadeh et al., 2013; Santhosh et al., 2014).
Lipozomii sunt utilizaţi într-o varietate de aplicaţii, de la administrarea de vaccinuri
(Gluck și Metcalfe, 2002; Verma, 2004; Zylberberg și Matosevic, 2016), enzime (Finkelstein și
Weissmann, 1978) sau medicamente (Bulbake et al., 2017), la utilizarea lor cosmetică (Blume,
2008; Hougeir și Kircik, 2012), datorită calităţilor lor hidratante.
Lipozomii din diferite formulări pot fi utilizaţi pentru a furniza molecule bioactive (de
exemplu, constituenţii alimentari bioactivi, principii active din medicamente) (Fan și Zhang,
2013) la locul de acţiune. Înainte de a utiliza lipozomii ca vezicule de transport pentru diferite
substanţe, inclusiv transportul constituenţilor bioactivi din plante, este necesar să se înţeleagă
mecanismul de interacţiune cu aceste componente, despre care se știe că provoacă modificări ale
arhitecturii şi fluidităţii membranelor lipozomale (Bonarska-Kujawa, 2011).
Pentru a studia proprietățile fizico-chimice ale lipozomilor aflaţi în interacțiune cu
molecule bioactive, s-au utilizat în mod obișnuit molecule fluorescente, cum ar fi Prodanul sau
Laurdanul (Parasassi et al., 1998). Parametrii care determină fluorescența Laurdanului reflectă

24
polaritatea mediului în care această moleculă se află și microeterogenitatea membranei). Unele
studii sugerează că FA poate determina o variație a mobilității moleculelor apei din membrane în
apropierea Laurdanlui, atât în faza de gel, cât și în faza de cristal lichid a lipidelor lipozomale
(Fiorini et al., 2008).
Prepararea lipozomilor cu liganzi activi pentru țintirea anumitor țesuturi este un domeniu
de interes în domeniul medical (Marqués-Gallego și Kroon, 2014). Formarea unui complex între
diferiți constituenți bioactivi din plante și hrană cu lipozomi a fost urmărită în literatura de
specialitate printr-o varietate de metode, inclusiv metode spectrofotometrice (Sengupta et al.,
2005; Abram et al., 2013; Selvaraj et al., 2015). Compoziția lipidică a lipozomilor influențează
interacțiunile cu moleculele bioactive și localizarea moleculei vis-à-vis de bistratul lipidic
(Selvaraj et al., 2015).
Studii privind modificări ale temperaturilor de tranziție a lipidelor și ale fluidităţii
membranei atunci când un constituent bioactiv interacționează cu lipozomii nu sunt foarte
întâlnite în literatură. Prin urmare, scopul acestei lucrări este de a investiga efectul FA asupra
proprietăților fizico-chimice ale lipozomilor cu DPPC. Rezultatele obţinute pot fi utile în studiile
ulterioare privind interacțiunile și transportul în celule a unor molecule bioactive din plante și
produse alimentare (nu numai FA).

3.2. Materiale şi metode

Acidul folic a fost achiziționat de la Fluka AG. Concentrația FA a fost măsurată pe baza
coeficientului de absorbție molar standard la 360 nm (ε = 23000 M -1 cm-1). Probele au fost
preparate în PBS, 10 mM, la pH 7,4.
Laurdanul (6-dodecanoil-2-dimetilaminonaftalină) a fost achiziționat de la Sigma.
Concentraţia de Laurdan folosită pentru monitorizarea fluidităţii membranelor model a fost de
100 nM.
Lipidele DPPC. Lipidul 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolină (DPPC) a fost
achiziționat de la Sigma. Concentraţia finală a lipidelor în lipozomi a fost de 50 µM.
Protocolul de preparare a lipozomilor cu DPPC. Lipozomii (LUV) cu DPPC au fost
preparaţi prin metoda extrudării. Pe scurt, au fost urmaţi paşii descrişi în cele ce urmează:

25
 s-a folosit o cantitate de lipide dizolvate în cloroform (12,5 mg/mL) pentru a se efectua
amestecarea și uscarea în flux de azot;
 pentru a obţine o suspensie de lipozomi multilamelari (MLV) a fost nevoie de un film de
lipide hidratat cu PBS, încălzit la o temperatură mai mare decât temperatura de tranziţie - Tm
și amestecat puternic;
 suspensia obţinută a fost supusă la 5 cicluri de îngheţ - dezgheţ, apoi extrudată (15 - 20 de
treceri), printr-un filtru de policarbonat cu dimensiunea porilor de 200 nm, într-un extruder
standard (Avanti Polar Lipids, Alabastre, Al, USA); extrudarea s-a efectuat la o temperatură
mai mare decât Tm;
 s-a obţinut o suspensie de lipozomi unilamerari (LUV).
Lipidele au avut o concentraţie în suspensia finală de 50 µM. Peste această suspensie de
lipozomi LUV a fost adăugat Laurdanul din stocul preparat în DMSO. Astfel, s-a obţinut un
raport molar de 500:1 pentru amestecul de lipid:fluorofor.
Spectroscopia de absorbţie în UV-Vis. Spectrele de absorbție, în UV-Vis, au fost
înregistrate cu un spectrofotometru de absorbţie în UV-Vis Jasco V770, în cuvă de cuarț de 10
mm x 10 mm, cu o viteză de scanare de 200 nm/min.
Fluorimetrie. Spectrele de fluorescență au fost înregistrate cu un fluorimetru FluoroMax
3 de la Horiba Jobin Yvon, New Jersey, NJ, SUA, echipat cu un termostat cu element Peltier.
Măsurătorile au fost efectuate într-o cuvă cu cuarț de 3 mL, cu drum optic de 1 cm, lungimea de
undă de excitaţie fiind de 378 nm. Fanta monocromatorului de excitaţie a fost de 3 nm.

3.3. Rezultate și discuţii

3.3.1. Modificări apărute în organizarea lipozomilor cu DPPC induse de

prezenţa acidului folic

Pentru a investiga modificările apărute în organizarea bistraturilor lipidice în urma

interacţiunii cu acidul folic, s-a apelat la două metode spectrale - spectroscopia de absorbţie în
UV-Vis şi fluorimetria.

26
 Într-o primă etapă, prin spectroscopie de absorbţie în UV-Vis, s-a evaluat efectul FA
asupra proprietăților de absorbție ale lipozomilor cu DPPC. Astfel, în Fig. 3.1, este prezentat
spectrul de absorbţie a acidului folic, FA. Se observă că FA prezintă un maxim de absorbţie la
280 nm.

Fig. 3.1. Spectrul de absorbţie a acidului folic (50 µM) în PBS, pH = 7.4.

Fig. 3.2. Spectrul de absorbţie a lipozomilor cu DPPC (50 µM) în PBS.

27
 În Fig. 3.2 este prezentat spectrul de absorbţie a lipozomilor cu DPPC în PBS. Se observă
că lipozomii cu DPPC au un maxim de absorbţie la 210 nm. Pentru a evalua impactul FA asupra
proprietăților de absorbție ale lipozomilor DPPC, a fost reprezentat spectrul diferenței dintre
absorbția lipozomilor în prezența FA și absorbția FA (Fig. 3.3). După cum se poate vedea,
prezența FA în suspensia de lipozomi cu DPPC a condus la o modificare importantă a spectrului
de absorbție a lipozomilor. Acest fapt sugerează că există un efect evident de rearanjare a
lipidelor lipozomale în prezenţa FA, care poate avea o influenţă mare asupra fluidităţii
membranelor lipozomale.

Fig. 3.3. Spectrele de absorbţie corespunzătoare lipozomilor cu DPPC și diferenţei dintre

absorbția lipozomilor în prezența FA și în absenţa FA, la 25 ºC.

Aceste modificări spectrale pot fi o indicație a faptului că organizarea lipidelor în fază

solidă sau gel (25 ⁰C), la valoari sub temperatura de topire a lipidelor DPPC
[https://avantilipids.com/tech-support/physical-properties/phase-transition -temps /] a fost
modificată prin introducerea FA în membranele lipozomale. FA poate interacționa cu lipozomii
cu DPPC, eventual, prin interacțiune cu suprafața externă a lor, fără a fi introdus în mediul apos
din interiorul lipozomilor. Aceste modificări în organizarea structurală a lipidelor DPPC, datorate

28
prezenței FA bioactiv, trebuie luate în considerare, deoarece pot avea efecte importante asupra
funcției membranei și a integrității acesteia.

3.3.2. Studiul efectului FA asupra fluidităţii lipozomilor cu DPPC

Pentru a investiga dacă există o interacțiune între FA și lipozomii cu DPPC, au fost

înregistrate spectrele de emisie a FA în absența și respectiv în prezența lipozomilor, la diferite
concentrații FA (10 µM - 50 µM) (Fig. 3.4). După cum se observă, există o creștere semnificativă
a intensității fluorescenței FA în prezența lipozimilor DPPC, la toate concentraţiile de FA
studiate. Este posibil ca, în prezența lipozomilor, zona fluorescentă a moleculei FA să devină mai
puțin accesibilă pentru moleculele de solvent. Acest fapt se datorează interacțiunii FA cu
lipozomii cu DPPC.

Fig 3.4. Spectrul de emisie fluorescentă a FA (10 - 50 µM) în absența (linii brute), respectiv în
prezența (linii continue) lipozomilor compuși din DPPC, măsurată la 25 °C.

Ca urmare a interacţiunii FA cu lipozomii cu DPPC, pot apărea modificări ale fluidităţii

lipidelor lipozomale. Aceste modificări pot fi urmărite cu ajutorul unor molecule fluorescente,
precum Laurdanul. Există două populaţii de Laurdan, ale căror spectre de emisie sunt centrate la
29
440 nm și 490 nm. Astfel, spectrele de emisie a Laurdanului pot fi descompuse în două benzi,
centrate în jurul acestor maxime (Bacalum et al., 2013; Zorila et al., 2016), abundența relativă a
acestora fiind extrem de dependentă de modul de asamblare a lipidelor în bistrat (De Vequi-
Suplicy et al., 2006). Efectele solventului asupra membranelor lipozomale pot fi cuantificate prin
calcularea valorilor polarizării generalizate (GP). Acestea au fost calculate pornind de la valorile
intensităților de emisie la 443 nm și 490 nm, folosind o ecuație (3.1) adaptată din ecuația
Parasassi (Parasassi et al., 1998):

(3.1)

unde I 443 și sunt intensitățiile medii ale emisiilor în lipozomii cu Laurdan, la aceste lungimi de
undă.

Fig 3.5. Spectrul de emisie fluorescentă a Laurdanului (100 nM) inserat în lipozomii compuși din
DPPC, în absența (linii continue), respectiv în prezența FA (linii intrerupte), măsurat la diferite
temperaturi.

În Fig. 3.5 se observă că, după 40 °C, emisia lipozomilor cu Laurdan, este deplasată cu
aproximativ 47 nm faţă de emisia de la 45 °C şi 60 °C. Aceasta se datorează schimbării fazei
membranei lipidice, de la faza de gel (corespunzătoare maximului de la 443 nm), la faza de fluid

30
(corespunzătoare maximului de la 490 nm). Profilul fluorescenței Laurdanului în lipozomii cu
DPPC este dependent de temperatură, după cum se observă din Fig 3.6A. Scăderea valorilor GP
pentru Laurdan de la 0,41 la -0,45 este o dovadă a tranziției de fază de la faza de solid/gel (la
temperaturi mai scăzute), la faza lichidă, dezordonată (la temperaturi mai ridicate).

Fig. 3.6 (A). Polarizarea generalizată (GP) a Laurdanului și (B) variația suprafeței relative (ΔSR) evaluată
între 20 °C și 60 °C, în lipozomii DPPC și în lipozomi, în prezența acidului folic (FA) (goluri pătrate).
Aceste tranziții sunt în concordanță cu literatura (Harris et al., 2002). Astfel, la
temperaturi mai mari decât Tm ale lipidelor DPPC, gradul de perturbare a stratul lipidic a crescut,
membrana devenind mai fluidă și mai expusă la solvent (Harris et al., 2002; Stott et al., 2008).
Acest lucru este în concordanță cu ideea interacțiunii dintre FA și stratul extern al lipozomilor,

31
evidențiată prin spectrele de fluorescență de la 25 °C (Fig 3.4). Scăderea bruscă a valorii GP a
fost obținută între 40 °C și 45 °C (Fig. 3.6A); temperatura de tranziție a lipidelor DPPC este de
41 °C.
Un alt parametru analizat a fost diferenta ariilor relative corespunzătoare celor două
populații ale Laurdanului, monitorizate la 443 nm și 490 nm. Acest parametru depinde de
schimbările de temperatură (Bacalum et al., 2013; Zorila et al., 2016). Variația populației de
Laurdan în funcție de temperatură (20 °C - 60 °C) este prezentattă în Fig 3.6B. Profilul acestei
variații este foarte similar cu profilul GP, ceea ce confirmă tendința membranei de a deveni rigidă
la temperatură scăzută și fluidă la temperatură înaltă, la care apare relaxarea solventului. Această
relaxare a solventului poate fi atribuită unui număr mare de molecule de solvent prezente pe
interfața membranei (Parassassi et al., 1998). Faptul că prezența FA nu modifică profilele GP și
ΔSR (Fig 3.6 A) este o indicație că fluiditatea acestor membrane lipozomale nu a fost afectată de
inserția parțială FA în stratul lipozomal exterior.

32