UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

EBC — Especialização em Biologia Cleular

Disciplina: Técnicas moleculares
Professor: Rogério Merces

Trabalho sobre: (Reação em cadeia da polimerase)

1. INTRODUÇÃO

Até o advento da PCR, a única maneira de purificar uma sequência de DNA era por
intermédio da amplificação biológica em células em cultura. Para a obtenção de uma
amostra de uma dada sequência de DNA suficientemente pura, era necessário cloná-la em
um vetor e fazer crescer esse vetor clonado em uma cultura de bactérias ou de leveduras.
(MICKLOS et al., 2005)
O desenvolvimento da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR, do
inglês, polymerase chain reaction) aumentou muito a eficiência de detecção de
polimorfismos no nível do DNA ou RNA, traduzida em redução do tempo de execução dos
experimentos, do seu custo e da sua complexidade. A concepção inicial da técnica foi de
Kary Mullis, um bioquímico que trabalhava com síntese química de oligonucleotídeos em
uma firma biotecnológica da Califórnia, a Cetus Corporation. O mais impressionante do
desenvolvimento dessa técnica, em 1985, é que todos os elementos necessários para a
sua execução já estavam disponíveis, havia muito tempo, dentro da área de Biologia
Molecular. (MATIOLI, 2004).

2. Use bibliografia pertinente para escrever 3 a 4 paragrafos sobre

cada tópico abaixo:

 Identificar o fundamento da técnica da PCR.

 Identificar elementos necessários à amplificação do DNA in vitro.

 Descrever as principais etapas da PCR.

 Comparar a replicação do DNA in vivo e in vitro.

 Analisar resultados experimentais a partir da interpretação de géis.

 Discutir a aplicação da PCR nas Ciências Biológicas.

3. ANÁLISE DE SITUAÇÕES

1) Talassemia 
As talassemias são um grupo heterogêneo de doenças da síntese de hemoglobina
no qual as mutações reduzem a síntese ou a estabilidade das cadeias  ou , causando a
- ou a -talassemia, respectivamente.
As formas mais comuns de -talassemia são o resultado de deleções. A disposição
das regiões de hemoglobina em tandem nos genes  e ao redor deles facilita o
desalinhamento devido ao pareamento homólogo e à subseqüente recombinação entre o
domínio do gene 1 em um cromossomo e a região correspondente ao gene 2 no outro
(NUSSBAUM et al., 2002).
Para a caracterização molecular da talassemia--23.7 são realizadas duas reações
para cada amostra de DNA, sendo uma reação com o par de primers (A+B) que amplifica
a região onde ocorreu deleção e a outra com o par (A+C) direcionado para a região
normal, como indicado na figura abaixo. É importante ressaltar que a reação com os
primers A+B é negativa em indivíduos normais, sem deleção, pois o fragmento a ser
formado é muito extenso.
A estratégia utilizada para a amplificação seletiva dos genes 2 e 1 e
determinação da talassemia  -2, deleção 3.7 kb, foi adaptada de BAYSAL & HUISMAN,
1994.

No gel abaixo, para cada amostra de DNA (1 a 11), foram realizadas duas reações
de PCR uma com os "primers" A+B e a outra com A+C, respectivamente.

M AB AC

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11

- Resultado de PCR para detecção de talassemia

. Amostras de DNA, duas reações com os
"primers" A+B e A+C. M = marcador de pares de
bases; AB e AC controles negativos; 1 – 11
amostras de DNA dos pacientes estudados.
Fotografia gentilmente cedida por Fábio Couto,
LPBM-CPqGM/FIOCRUZ, 2001.

 Analise o gel e identifique o genótipo de cada indivíduo com relação à

presença da deleção para talassemia-.

Hepatite C

O VHC é um vírus de RNA (VHC-RNA) hepatotrópico associado, com alto risco, a

cronificação, cirrose e carcinoma hepatocelular. Nos últimos anos, técnicas moleculares
para a detecção do VHC-RNA e para a genotipagem têm sido ferramentas indispensáveis
para a avaliação de pacientes com hepatite crônica.

 Analise o gel abaixo e identifique os indivíduos infectados com o VHC.

 Justifique a não utilização de marcadores de pares de bases nesse gel.

 N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17

Resultado de PCR para diagnóstico de HCV.

N = controle negativo da reação; 1-3; 5-17
amostras submetidas a teste; 4 controle de
paciente positivo para HCV diagnosticado por
ELISA. Fotografia gentilmente cedida por Luciano
Kalabric, LPBM – CPqGM/FIOCRUZ, 1999.