UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E

INGENIERIA

GUÍA COMPONENTE PRÁCTICO

201504 – MICROBIOLOGÍA

San Juan de Pasto

Mayo de 2019
1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

La primera versión de las guías que se proponen para el componente

práctico del curso de Microbiología, fueron diseñadas en el año 2004 por
la Dra. Carmen Eugenia Piña López, docente de la UNAD.

El contenido didáctico de este componente práctico ha sido apoyado por

las Dras. Angélica Yara y Rocío Gómez y ha tenido actualizaciones a partir
de su creación desarrolladas por la Ing. Marta Cecilia Vinasco Guzmán,
tutora del CEAD Pitalito, y por la Dra. Yurby Salazar docente de la UNAD,
quienes han apoyado el proceso de revisión de estilo e hizo aportes
disciplinares, didácticos y pedagógicos.

La última versión de este componente práctico ha sido revisado y

actualizado por Mery Liliana López Martínez, Docente Asistente de la
UNAD en el CCAV de Pasto, quien actualmente se desempeña como
directora nacional del curso de Microbiología.
 2. CARACTERÍSTICAS GENERALES

La microbiología estudia los microorganismos u

organismos generalmente microscópicos, aunque
algunos pueden ser observados a simple vista.
Introducción
Su estudio comprende la identificación y
clasificación de los microorganismos, su origen y
evolución, la dinámica del crecimiento, el rol
interactivo de los microorganismos con el sistema
inmunológico, las enfermedades que pueden
producir y su importancia en la producción
industrial.
El curso de Microbiología hace parte del Campo de
Formación Disciplinar Común, constituyéndose en
herramienta fundamental de los procesos de
Justificación desarrollo científico y que posibilitan la inserción
de nuestro país en las dinámicas globales del
desarrollo. Por lo tanto, su objetivo primordial es
comprender y reconocer la importancia de los
microorganismos en la vida del planeta, conocer
su morfología, fisiología, bioquímica, distribución
y sus efectos beneficiosos y/o perjudiciales para
el hombre.

Propósitos:
✓ Explicar la morfología, fisiología y genética de
los microorganismos procariotas, mediante la
Intencionalidades revisión de contenidos y la interpretación de
formativas comparaciones teóricas entre grupos bacterianos.

✓ Explicar la morfología y fisiología de los hongos,

parásitos, virus y algas mediante comparaciones
teóricas de sus características y el reconocimiento
de aspectos diferenciadores y el rol de cada
organismo en el mundo vivo.
✓ Interpretar los diferentes parámetros físicos y
químicos que afectan y controlan el crecimiento
de los microorganismos mediante la
implementación de métodos y protocolos de
cultivo, aislamiento e identificación de
microorganismos con diferentes fines.

Metas:
Desarrollar la totalidad de las prácticas que se
presentan en esta guía.
Competencias:

✓ El estudiante comprende la estructura celular,

morfología, fisiología y genética bacteriana
mediante la comparación estructural y fisiológica
entre grupos bacterianos.

✓ El estudiante comprende la estructura de

hongos, parásitos, virus y algas, mediante la
comparación de sus características morfológicas,
fisiológicas, formas de reproducción y el
reconocimiento de aspectos diferenciadores y el
rol de estos en el mundo vivo.

✓ El estudiante identifica los conceptos de

crecimiento microbiano, factores y control del
crecimiento mediante la implementación de
métodos y protocolos de cultivo, aislamiento e
identificación de microorganismos con fines
académicos, industriales y biotecnológicos.
 Práctica 1: Normas generales de bioseguridad.
Práctica 2: Preparación de medios de cultivo.
Práctica 3: Microorganismos del ambiente.
Práctica 4: Técnicas de Tinción
Denominación de Práctica 5: Siembra de microorganismos
practicas
Práctica 6: Factores que afectan el crecimiento de
los microorganismos.
Práctica 7: Pruebas bioquímicas en algunas
bacterias
Práctica 8: Control de microorganismos por medio
de factores físicos y químicos.

Hora laboratorio 16

Puntaje 140 puntos

 3. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS

PRACTICA No. 1 – NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

Propósito:
Conocer los principales equipos con los cuales se trabaja en un laboratorio
de microbiología y conocer y aplicar las normas de bioseguridad que se
deben tener en un laboratorio.
Objetivo:
Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el
laboratorio.
Fundamentación Teórica
La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas encaminadas a
reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas, las plagas
de cuarentena, las especies exóticas invasoras, organismos vivos
modificados.
Cuando se trabaja en laboratorio con microorganismos se deben poner en
práctica varias normas de bioseguridad para evitar accidentes y adquirir
enfermedades.
Descripción de la práctica
A continuación encuentra las normas de bioseguridad básicas de cualquier
laboratorio y los cuidados que se deben tener al lavar material del vidrio.
Por favor realice una buena lectura pero principalmente ponga en práctica
todas las recomendaciones.
Normas generales de bioseguridad.
✓ Mantener una actitud responsable, no se permite hacer bromas,
jugar, correr o gritar.
✓ No se permite el ingreso de personas ajenas al laboratorio y/o que
no porten sus implementos de bioseguridad adecuados.
✓ No se permitirá el ingreso de personas bajo efectos de bebidas
alcohólicas o sustancias psicoactivas.
✓ Para el ingreso a los laboratorios, préstamo de material o equipo
se debe presentar el carnet vigente.
✓ Todas las superficies de trabajos se limpiaran y desinfectaran
diariamente y siempre que se produzca un derrame.
✓ Usar bata de manga larga con puños, la cual debe estar
completamente cerrada.
✓ Usar guantes de nitrilo, tapabocas, gorro, gafas de seguridad y
todos los elementos de seguridad solicitados dependiendo del
riesgo.
✓ Evitar tocar sus ojos o piel con las manos enguantadas.
✓ Usar cabello recogido, calzado cerrado y bajo, no usar falda, joyas,
manillas, reloj o elementos que puedan entorpecer la manipulación
de los materiales o equipos.
✓ Bajo ninguna circunstancia se permitirá comer, beber o fumar en el
laboratorio.
✓ Bajo ninguna circunstancia, se debe tocar, oler o probar las
sustancias químicas o biológicas utilizadas en el desarrollo de las
prácticas.
✓ No trabajar nunca solo en el laboratorio.
✓ No pipetear sustancias con la boca.
✓ Cuando en el desarrollo de las prácticas se utilice ácido y agua en
diluciones, agregue el ácido sobre el agua.
✓ No devolver reactivos a los frascos, así no hayan sido utilizados.
✓ Siga fielmente todas las recomendaciones dadas por el docente
responsable del laboratorio.
✓ Al calentar los tubos de ensayo en el mechero dirija la boca donde
nadie corra peligro de quemarse.
✓ Los residuos y muestras de procedimientos de microbiología que
van a ser incinerados fuera del laboratorio deber ser sometidos a
desactivación en autoclave.
✓ Como norma general no se podrá verter ninguna sustancia peligrosa
para el medio ambiente por el desagüe.
 ✓ Al culminar el trabajo, dejar limpio y ordenado el mesón, devolver
los elementos y materiales perfectamente limpios, asegúrese de
dejar cerrado el gas, agua y lavarse las manos.
✓ Para la eliminación de los residuos se deben utilizar los recipientes
destinados para este fin siguiendo las indicaciones del docente
responsable del laboratorio.
✓ Cualquier accidente por pequeño que sea debe comunicarse al
docente responsable del laboratorio.
✓ Trabajo con material de vidrio
✓ No se debe calentar recipientes de vidrio común.
✓ No calentar directamente al mechero de gas ni colocar recipientes
de vidrio vacíos o húmedos por fuera en la parrilla eléctrica.
✓ Cuando utilice cubreobjetos, se deben revisar los mesones y evitar
que queden sobre ellos.
✓ Comprobar la temperatura del material de vidrio.
✓ No forzar el cierre del material.
✓ Comprobar cuidadosamente la temperatura de los recipientes que
hayan estado sometidos a calor antes de tomarlos directamente con
las manos.
✓ No lavar los elementos de vidrio de laboratorio con medios
abrasivos que al rayar la superficie debilitan el vidrio.
✓ Al lavar el material utilice guantes y gafas de seguridad y no deje
residuos.
✓ Al lavar la vidriería de laboratorios no se debe someter a cambios
brusco de temperatura.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Folleto de normas de bioseguridad, folleto de disposición de residuos
sólidos.

Realice el informe según las orientaciones que le suministre su

tutor de laboratorio.
 PRACTICA No. 2 – PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Propósito:
Conocer los principales medios de cultivo, la forma de preparación y
presentación.
Objetivo:
Aprender la preparación y manipulación de los medios de cultivo.
Fundamentación Teórica
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para
el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá
de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales
varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes
que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos
muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas,
suero o sangre para crecer.
Descripción de la práctica
Revise las etiquetas de los recipientes de diferentes medios de cultivo,
anote el nombre, la composición y forma de preparación.
En las instrucciones de forma de preparación le dicen la cantidad en
gramos de medio deshidratado que se necesitan para disolver en un litro
de agua. En muchas ocasiones no es necesario preparar un litro de medio,
por lo tanto mediante un cálculo matemático sencillo ustedes pueden
preparar una cantidad menor.
Supongamos que desean preparar 325 mililitros de medio de cultivo, al
leer las instrucciones de preparación en la etiqueta dice que para preparar
1 litro (1000 ml) de medio se necesitan 20 gramos medio deshidratado.
Para hacer el cálculo se realiza un regla de tres simple:
 20 gr. 1000 ml X= (20 gr.x 325ml)/1000= 6.5 gr.
X gr. 325ml

Esto quiere decir que se necesitan 6,5 gramos de medio deshidratado

para preparar 325 ml de medio de cultivo. Para preparar el medio se hace
el siguiente procedimiento:
Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua
destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada
coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua
destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe
ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los
6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el erlenmeyer y
posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el
agitador.
A continuación lleve la preparación a disolver en la plancha de
calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio
hasta que ebulla para lograr la disolución total del Agar.
Tape la boca del erlenmeyer papel aluminio. Si las normas de preparación
no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave, a 121
grados centígrados, durante 15 minutos.
Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45°C.
Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri,
previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la placa
se eliminan “abanicando” brevemente la superficie con la llama no
luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique.
Los medios de cultivo líquidos se preparan de la misma forma y se sirven
en tubos con tapa rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a
esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios
directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada.
Finalmente tenga en cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo,
solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos
deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar
inclinado.
Tome un medio de cultivo al azar y realice los cálculos para preparar
volúmenes de 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml.
Experimentalmente prepare 20 ml de medio de cultivo sólido y sírvalo en
2 cajas de Petri
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Recipientes con diferentes medios de cultivo, Elenmeyer, Probeta, Agua
destilada, Cajas de petri, balanza, papel aluminio, estufa, autoclave,
cámara de flujo.
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
tutor de laboratorio.
 PRACTICA No. 3 – MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE

Propósito:
Cultivar microorganismos de diferentes ambientes y realizar una
descripción macroscópica de las colinas que crezcan.
Objetivos:
Explicar cómo se puede demostrar la presencia de microorganismos en
diferentes sitios.
Describir las características macroscópicas de las colonias bacterianas.
Fundamentación Teórica
En esta práctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en el
ambiente que nos rodea. Con este fin se toman muestras de diferentes
sitios y se las siembra en un medio de cultivo que contiene las sustancias
nutritivas que las bacterias necesitan para desarrollarse, se las lleva a
incubar a la temperatura apropiada y se las deja el tiempo necesario para
que crezcan y se puedan observar las colonias a simple vista y así
determinar las características macroscópicas de esas colonias.
Descripción de la práctica
Marcar cada caja de Petri que se va a utilizar con los siguientes datos:
Nombre, Sitio del cual se tomó la muestra, Fecha de la práctica.
Tome cajas de Petri que contengan agar nutritivo y tome muestras de los
diferentes sitios que se relacionan a continuación:
✓ Deje una caja de Petri abierta durante 30 minutos en el sitio del
laboratorio que desee.
✓ Pase un copito sobre la superficie del mesón en el cual está
trabajando y siembre en una caja de Petri.
✓ Pase sus dedos por el cabello y rasque suavemente para que el
producto que salga caiga sobre la caja de Petri.
✓ Toque con sus dedos la superficie de una caja de Petri.
✓ Tosa o estornude sobre una caja de Petri.
 ✓ Introduzca un copito en su oído y siembre en una caja de Petri.
✓ Siembre una muestra tomándola del sitio que desee.
✓ Todas las cajas llévelas a incubar durante 24-48 horas a 37
Grados.

Para sembrar hongos tome 2 cajas de Petri que contengan Agar PDA,
destápelas y déjelas al aire libre durante 30 minutos en el sitio que desee
y luego tápelas. Déjelas a temperatura ambiente y en las oscuridad
durante 48- 72 horas.
Resultados
Observe las colonias y basándose en la figura 1, llene los datos de la tabla
describiendo las características de las colonias y la cantidad de
crecimiento (mucho, abundante, regular, poco). Describa 2 colonias de
cada caja teniendo en cuenta las siguientes características:
Tamaño
Forma: circular, irregular, extendida
Color: pigmentada, incolora
Textura: Granular, friable, húmeda, seca, membranosa.
Superficie: suave, áspera, rugosa, opaca, resbalosa.
Elevación: Plana, convexa, Umblicada.
Borde: irregular, aserrado, discreto, regular, entero ondulado,
Olor: inodora, aromática desagradable.

TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS

SITIO DE TOMA DE CANTIDAD DE CARACTERÍSTICAS

LAS MUESTRAS CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS

Superficie del mesón

Cabello……..
 FIGURA 1. FORMA, ELEVACIÓN Y BORDE DE LAS COLONIAS
MICROBIANAS

Fuente: Valencia (2004) Manual de prácticas de microbiología básica. Colección Notas

de Clase. Editorial UNIBIBLIOS. Universidad Nacional de Colombia.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Para un grupo:
7 Cajas de Petri con agar nutritivo
2 Cajas de Petri con agar PDA
Incubadora
Hisopos
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
tutor de laboratorio.
 PRACTICA No. 4 – SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

Propósito:
Conocer y aplicar las diferentes técnicas de siembra que existen.
Objetivo:
Determinar las condiciones necesarias para realizar la siembra de
microorganismos
Reconocer los distintos sistemas de siembra y su utilidad.
Fundamentación Teórica
Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para
obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la
muestra sobre caja de Petri, que contiene un medio compuesto por las
sustancias que necesitan los microorganismos para crecer. A veces se
añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el
crecimiento de otras bacterias que podrían contaminar el cultivo. La
siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos
de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los microorganismos.
Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el
medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma,
tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas.
También se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas
bioquímicas o de otro tipo para lograr su identificación. Algunas bacterias
son muy difíciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y
algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar.
Descripción de la práctica
1. Siembra de medio líquido a medio líquido
Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de
siembra utilizado y la fecha.
Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje
siempre al lado de él.
Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar.
Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo,
flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y
tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo,
tápelo y déjelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en
el cual va a colocar la muestra, destápelo, flameando la boca el tubo con
el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida.
Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo
las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape.
Esterilice el asa en el mechero después de usarla.
Incube los tubos a 37ºC por 24 horas.
Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda
transparente
2. Siembra de medio líquido a sólido
Proceda en la misma forma que en la siembra anterior e introduzca el
inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento
y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida.
3. Siembra de medio sólido a sólido
Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el
asa de argolla.
Los medios sólidos contienen agar en proporción de 1.5 a 2.0% y se
emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden
inocular mediante varios métodos: como estrías, agotamiento y rejilla con
el fin de lograr un cultivo puro.
a. Siembra por agotamiento
Tome una placa de agar, divida la base de la caja de Petri en cuartos y
márquelos con los números 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el
número 1, realice estrías hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire
la caja hasta el número 2, tome las dos últimas estrías y siga estriando
hasta el número 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no
tocar las estrías ya hechas.
b. Siembra por estrías
Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto número uno,
realice estrías hasta el número 2. Esterilice el asa, tome las dos últimas
estrías y extiéndalas hasta el número 3, tome las dos últimas estrías y
extiéndalas hasta el número 4 y así sucesivamente hasta llegar al número
6.
4. Siembra en agar inclinado
Esta se realiza por estría. Extienda el inoculo sobre el agar inclinado
deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag.
No olvide flamear la boca del tubo antes y después de la siembra.
Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formación de una
película o por el crecimiento de colonias en la superficie.
5. Siembra en profundidad
Marque la caja de Petri estéril con el número de grupo, la fecha y siembra
en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero.
Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de
Pasteur plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de
Petri estéril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox.
Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego
realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas
del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en
forma de 8. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias
en todo el agar para facilitar su posterior recuento.
Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar,
márquelos con el número de grupo, la fecha. Luego incube 37º c por 48
horas.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Para un grupo:
1 Tubo de ensayo con caldo nutritivo y S. aureus en crecimiento
1 Tubo de ensayo con caldo nutritivo
1 Tubo de ensayo con agar nutritivo
1 Caja de Petri con agar nutritivo y S. aureus en crecimiento
2 Cajas de Petri con agar nutritivo
1 Tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado
1 Caja de Petri estéril sin agar
10 ml de Agar nutritivo caliente
Mecheros
Incubadora
Asas de punta recta y argolla
Pipetas Pasteur
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
tutor de laboratorio.
 PRACTICA No. 5 – TÉCNICAS DE TINCIÓN
Propósito:
Realizar diferentes tipos de tinciones para identifcar microorganismos.
Objetivo:
Preparar frotis de bacterias para observaciones microscópicas
Observar las bacterias teñidas al microscopio y clasificarlas por su forma
y su reacción a la coloración de Gram.
Fundamentación Teórica
La observación microscópica de las bacterias se facilita cuando han sido
coloreadas. Se acostumbra fijar las bacterias en la lámina portaobjetos
para poder teñirlas con facilidad.
La fijación puede hacerse con solventes o con calor. En cualquier caso se
trata e deshidratar la célula y coagularla con proteínas.
Las coloraciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante o
compuestas cuando se utilizan 2 ó más colorantes. También se puede
hacer una coloración negativa en la cual se tiñe el fondo, además de la
bacteria, para poder observar la cápsula.
Descripción de la práctica
1. Coloración Simple
Para la coloración simple se utiliza azul de metileno y se trabaja con
Staphylococcus aureus. Se toma una pequeña muestra del
microorganismo y se fija con calor, posteriormente se añade una gota
pequeña de azul de metileno, se coloca la laminilla o cubre objetos y se
observa al microscopio en un aumento de 100x.
2. Tinción de Gram
La tinción de Gram se realiza en cultivos de Staphylococcus aureus, y
Escherichia coli.
La tinción de Gram. Es una coloración compuesta porque en ella se utilizan
2 colorantes, uno primario: cristal violeta o violeta de genciana y uno de
contraste, safranina o fucsina de Gram. Es una tinción diferencial porque
según la composición química de la pared celular las bacterias quedan
teñidas con el cristal violeta o la safranina, como mordiente o sustancia
fijadora del color se utiliza lugol.
El agente diferenciador, es decir, el que actúa de modo diferente sobre la
pared celular de las Gram. Positivas y las Gram negativas es la solución
alcohol cetona ó alcohol- ácido.
Los pasos de la tinción de gran son los siguientes:
✓ Fijar la muestra al calor
✓ Añadir el violeta de genciana o cristal violeta y dejarlo actuar
durante 1minuto
✓ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
✓ Añadir lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto
✓ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
✓ Añadir alcohol- ácido y dejarlo actuar durante 15 segundos y lavar
rápidamente con agua
✓ Añadir fucsina y dejar actuar durante 1 minutos
✓ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
✓ Secar al aire libre o con una toalla absorbente según las
indicaciones del profesor
✓ Observar en el microscopio a un aumento de 100x.

Observe todas las bacterias con las diferentes coloraciones, determine su

morfología y trate de identificar sus partes, determine si son bacterias
Gram. Positivas ó bacterias gran negativas. Dibuje lo observado.
3. Coloración de Hongos.
Observe la morfología del hongo del pan Rhizopus sp y Penicillium sp.
Examine el hongo a simple vista, fíjese en el color, consistencia, textura
y apariencia general.
Tome con un asa una muestra de hifas y colóquela en portaobjetos, tíñala
con azul de lactofenol y observe al microscopio. Dibuje lo observado y
describa.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Para un grupo:
Cajas de Petri con Agar nutritivo y cultivos de E. coli y S. aureus.
Rhizopus sp. Cultivo en agar sabouraud
Penicillium sp. Cultivo en agar sabouraud
Porta Objetos
Cubre Objetos
1 Microscopios
2 ml de violeta de genciana o cristal violeta
2 ml de lugol
2 ml de alcohol- ácido
2 ml de fucsina
2 ml de azul de metileno
2 ml de azul de Lactofenol
1 microscopio
Mechero
Pinzas
Aceite de Inmersión
Asas

Realice el informe según las orientaciones que le suministre su

tutor de laboratorio.
PRACTICA No. 6 – FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE
LOS MICROORGANISMOS

Propósito: Que el estudiante conozca los aspectos físicos que afectan el

crecimiento microbiano

Objetivo:
Evaluar el efecto de los factores intrínsecos y extrínsecos sobre el
crecimiento bacteriano.

Conocer técnicas de identificación de microorganismos basados en su

capacidad metabólica.

Fundamentación Teórica
Los aspectos físicos que influyen de manera determinante en el
crecimiento microbiano son: la temperatura, el pH y la presión osmótica.
Los químicos son: el agua, las fuentes de carbono y de nitrógeno, los
minerales, el oxígeno y los factores orgánicos del propio microorganismo.
Descripción de la práctica
Procedimiento:
A. Influencia de la temperatura
✓ Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos:

Tubo 1: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 4ºC Nevera

Tubo 2: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 20ºC Ambiente
Tubo 3: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 37ºC Incubadora
✓ Esterilice el asa recta o curva y déjela enfriar
✓ Recoja con el asa estéril la bacteria indicada y siembre en los tubos
marcados.
✓ Esterilice el asa.
Separe los tubos de nevera y temperatura ambiente, entréguelos al
coordinador del laboratorio para que los incube a 4ºc y 18ºc.
Los otros tubos envuélvalos en cinta de enmascarar, márquelos con el
número del grupo y entréguelos al coordinador para incubarlos a 37ºC
Cumplido el tiempo de incubación observe en cada tubo la presencia de
crecimiento en este caso la bacteria. Establezca que tipo de bacteria es
de acuerdo a sus rangos óptimos de adaptación a la temperatura
B. Influencia del pH
✓ Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos:

Tubo 1 pH 3.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 3.0

Tubo 2 pH 7.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 7.0
Tubo 3 pH 11.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 11.0
✓ Esterilice el asa recta o curva y déjela enfriar.
✓ Recoja con el asa estéril la bacteria indicada y siembre en los tubos
marcados.
✓ Esterilice el asa.

Incube los tres tubos a temperatura de 37 ºC por 24 a 48 horas.

Cumplido el tiempo de incubación observe la presencia de turbidez en los
tubos, lo cual indica que hay crecimiento. Cuál fue el pH óptimo para el
crecimiento de la bacteria en estudio.
C. Influencia de la Tensión de oxígeno
Marque los tubos de la siguiente manera:
Tubo de Tioglicolato: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y tioglicolato y
microaerofilo (recuerde que el tioglicolato se usa para el cultivo y
aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos de microorganismos
microaerofilos
Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, No. del grupo, fecha, No. de
bacteria y aerobio.
Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y anaerobio.
✓ Esterilice el asa recta o curva y déjela enfriar
✓ Recoja con el asa estéril la bacteria indicada y siembre en los tubos
marcados.
✓ Esterilice el asa.
✓ Adicione 2 ml de aceite mineral estéril a los tubos de tioglicolato y al
aerobio para crear un ambiente de anaerobiosis.
✓ Incube los tubos a 37ºC por 24 a 48 horas.
✓ Cumplido el tiempo de incubación observe la presencia de crecimiento
en los tubos. Determine en qué ambiente creció la bacteria.

Procedimiento para la lectura (Consignar estas observaciones en su

informe de práctica)
✓ Solicite los tubos de temperatura ambiente, nevera e incubadora al
coordinador de laboratorio.
✓ Colóquelos en orden por temperatura, pH, y disponibilidad de oxígeno.
✓ Observe si se presenta crecimiento (turbidez) y si el crecimiento es
escaso, moderado o abundante.
✓ Anote sus observaciones y si el crecimiento microbiano es igual o
diferente para las diversas condiciones de pH, temperatura y Tensión de
oxígeno.

De acuerdo con lo analizado clasifique el microorganismo según su

necesidad de oxígeno en aerobio, anaerobio, micro – aerofílico, anaerobio
facultativo. Según la temperatura óptima de crecimiento en psicrófilo,
mesófilo o termófilo y cuál es el pH ideal para su óptimo desarrollo.

✓ ¿Cuál es la utilidad de la anterior evaluación?

✓ ¿Qué factores intrínsecos y extrínsecos afectan el crecimiento de los
microorganismos?
✓ Una vez termine sus observaciones, envuelva los tubos en cinta de
enmascarar, entréguelos al grupo encargado de la esterilización

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Tubos con caldo nutritivo estéril, tubo con Tioglicolato, 1 tubo con caldo
nutritivo pH 3.0, 1 tubo con caldo nutritivo pH 7.0, 1 tubo con caldo
nutritivo pH 11.0, aceite mineral estéril, asas bacteriológicas, pipeta
estéril, gradilla, incubadora, nevera, tubo con cepa bacteriana, mechero
Bunsen.

Realice el informe según las orientaciones que le suministre su

tutor de laboratorio.
 PRACTICA No. 7 – PRUEBAS BIOQUÍMICAS EN ALGUNAS
BACTERIAS

Propósito: El estudiante comprende las estrategias metabólicas de los

microorganismos.

Objetivo:
Conocer técnicas de identificación de microorganismos basados en su
capacidad metabólica.

Utilizar los agares para el aislamiento microbiano

Fundamentación Teórica
El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un
microorganismo obtiene la energía y los nutrientes (carbono, por
ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos
utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las
especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias. Las
características metabólicas específicas de un microorganismo constituyen
el principal criterio para determinar su papel ecológico, su responsabilidad
en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales.
Descripción de la práctica
Para iniciar el desarrollo de la práctica debe previamente realizar un
estudio atento de la teoría sobre: Medios de cultivo, realice una revisión
de los fundamentos, forma de actuación e interpretación de los siguientes
medios de cultivo: Lisina hierro agar, Triple azúcar hierro, Citrato de
Simmons agar, SIM, Caldo Lactosado bilis verde brillante, Eosina azul de
Metileno agar, Agar Salmonella Shigella, sus componentes, inhibidores,
indicadores de pH.
✓ Realice una descripción de todos los medios de cultivo antes de ser
inoculados.
✓ Para iniciar el proceso de identificación de cultivo que le correspondió,
realice una tinción de Gram de la bacteria entregada, observe al
microscopio e identifique la morfología bacteriana
✓ Marque muy bien todos los medios con el No. de la cepa, No. del grupo
y nombre del medio de cultivo, luego proceda a inocular todos los medios
como se describe a continuación:
✓ Esterilice el asa, déjela enfriar para luego tome un poco de la muestra
de bacterias y luego inocule los medios de la siguiente manera:
✓ Tubos con agar inclinado TSI, LIA, CIT realice una punción en el fondo
del tubo y una estría en la superficie.
✓ Tubo con medio semisólido agar SIM: se inocula con una punción hasta
el fondo del tubo.
✓ Tubos con medio líquido BRILLA, CN: tome un poco de la muestra y
suspéndala directamente en el caldo, homogenice.
✓ Cajas de agar nutritivo AN, EMB, SS: utilice el sistema de siembra de
rejilla para obtener unidades formadoras e colonias individuales. .
✓ Una los tubos y cajas con cinta de enmascarar, márquelos con el
número del grupo y llévelas a incubar a 37 ºC durante 24 a 48 horas.
✓ Cumplido el tiempo de incubación observe los resultados obtenidos,
interprete los resultados.

El agar LIA se debe leer en la superficie y el fondo del tubo. En el medio

se evalúa la decarboxilación de lisina que se evidencia en el fondo del
tubo por el viraje a violeta del indicador púrpura de metacresol. También
se evalúa la desaminación de la lisina la cual ocurre en la parte superior
del tubo y se evidencia con un color violeta-rojizo. La Fermentación de la
glucosa produce acidificación del medio y un cambio de color del indicador
de violeta a amarillo. Eventualmente se puede observar la Producción de
ácido sulfhídrico (H2S) por la presencia de color negro.
El agar Citrato Si se utiliza el citrato como fuente de carbono, se
incrementa el pH del medio y el indicador vira de verde a azul. Cuando
no se utiliza el citrato, el indicador de pH azul de bromotimol permanece
de color verde
El agar TSI En el tubo TSI debe leerse siempre la superficie y el fondo. La
fermentación de glucosa se observa en el fondo del tubo por el cambio de
color del indicador de rojo a amarillo. También puede observarse la
fermentación de lactosa y sacarosa en la superficie del tubo, por el cambio
del indicador de rojo a amarillo. La producción de H2S se observa por la
aparición de un precipitado negro, debido a las sales de hierro presentes
Agar Sim La motilidad se observa por la turbidez difusa del medio de
cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza
por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicho canal. En
este medio también puede observarse la formación de H2S por el
ennegrecimiento del medio.
Caldo Brilla Se observa la fermentación de la lactosa con formación de
gas, en las campanas de Durham. Para la determinación del Número Más
Probable de microorganismos, se observan cada uno de los tubos que
tienen presencia de gas y el número de estos se relaciona en la tabla del
Número Más Probable.
En el caldo nutritivo se realiza la prueba de Indol la cual determina la
producción de Triptofanasa por el microorganismo. Cumplido el tiempo de
incubación agregar 1 ml del reactivo de Kovacs sobre el caldo de cultivo.
Cuando hay moléculas de Indol libre se produce un anillo de color rojo en
la superficie del medio de cultivo.
En el Agar McConkey las bacterias que degradan lactosa producen ácidos
orgánicos, formando colonias color rojo con un halo turbio debido al
descenso de pH provocado por los ácidos biliares. Las bacterias que no
fermentan lactosa, no bajan el pH, por lo tanto se observan colonias
incoloras.
En el Agar Eosina – azul de metileno- lactosa-sacarosa, Las bacterias
fermentadoras forman colonias de color rojo o negras brillantes. Las
bacterias No fermentadoras producen colonias incoloras. Las bacterias
Gram positivas, especialmente, resultan inhibidas en su crecimiento, por
los colorantes presentes en el medio EMB.
En el agar SS (Salmonella - Shiguella) . Las colonias de gérmenes Lactosa
– positivos son rosadas hasta rojas las colonias de gérmenes lactosa –
negativos son incoloras. Las colonias de microorganismos formadores de
H2S presentan un centro negro.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Tubos con los siguientes medios de cultivo inclinados estériles
• Lisina Hierro Agar LIA
• Triple azúcar hierro TSI
• Citrato CIT
• SIM
Tubos con los siguientes medios líquidos estériles
• Caldo lactosado BRILLA con campana de Durham
• Caldo nutritivo CN
Cajas de petri con los siguientes medios estériles
• Agar nutritivo AN
• Eosina azul de metileno agar EMB
• S.S. agar SS
Microscopio, asas bacteriológicas, mechero de bunsen, incubadora,
bacterias
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
tutor de laboratorio.
PRACTICA No. 8 – CONTROL DE MICROORGANISMO POR MEDIO
DE FACTORES FISICOS Y QUIMICOS

Propósito:
Se va a demostrar en la siguiente serie de experimentos que los métodos
que se utilizan para eliminar los microorganismos no son igualmente
efectivos de igual forma se va a comparar la efectividad de varios
desinfectantes que se utilizan comúnmente.
Objetivo:
Explicar la diferencia entre los resultados obtenidos al utilizar diferentes
métodos de esterilización de bacterias.
Explicar cómo se hace un ensayo comparativo de la eficiencia de varios
desinfectantes.
Fundamentación Teórica
Se define esterilidad a la condición de ausencia de cualquier
microorganismo. Significa destrucción de toda forma de vida microbiana
incluyendo esporas. Los métodos de esterilización más usados en el
laboratorio son calor seco, calor húmedo, flameado, utilización de
soluciones químicas.
La desinfección se refiere a la reducción de los organismos patógenos
(organismos que ocasionan enfermedades). Los desinfectantes de
acuerdo a su composición química se clasifican en: Fenoles, Hipocloritos
(cloro), Yodoformos (yodo Povidona), Amonio Cuaternario,
Formaldehídos, Peróxidos. Los desinfectantes pueden ser de bajo nivel,
de nivel intermedio o de alto nivel.
Los desinfectantes de bajo nivel (Fenoles, amonio cuaternario) pueden
destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, tanto
grampositivas como gramnegativas, algunos virus (virus con envoltura
lípidica) y hongos (levaduras), pero no Mycobacterium spp, ni las esporas
bacterianas.
Los desinfectantes de nivel intermedio consiguen inactivar todas las
formas bacterianas vegetativas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis,
la mayoría de los virus (virus con y sin envoltura) y hongos filamentosos,
pero no destruyen necesariamente las esporas bacterianas.
En cambio, los desinfectantes de alto nivel (formaldehídos, peróxidos,
hipocloritos) consiguen destruir todos los microorganismos, excepto
algunas esporas bacterianas.
Descripción de la práctica
1. Primero se va a determinar el efecto de la esterilización sobre las
bacterias:
✓ Marque 4 tubos de ensayo estériles del 1 al 4
✓ Marque 4 tubos de ensayo con caldo nutritivo del 1 al 4
✓ Los números del 1 al 4 corresponden a los siguiente:

1. Autoclave (15 minutos)

2. Agua hirviendo (30 minutos)
3. Agua a 60oC (Una hora)
4. No tiene tratamiento

✓ Coloque 1 ml del cultivo de E. coli en cada uno de los tubos de ensayo

vacíos y llévelos al tratamiento indicado anteriormente.
✓ Una vez terminado el tratamiento térmico, siembre una asada de cada
uno de los tubos sometidos a la acción del calor y el control en los tubos
correspondientes con caldo nutritivo.
✓ Llévelos a los tubos inoculados a la incubadora a 37o C por 24 horas
✓ Anote los resultados en la tabla 1
 TABLA 1

TRATAMIENTO CRECIMIENTO
Control
Autoclave
Agua hirviendo durante 30´
Agua a 60 grados por una hora

El signo + indica crecimiento y el – que no hubo crecimiento.

2. Acción de los desinfectantes sobre las bacterias

✓ Tome una serie de desinfectantes y coloque 5 ml. en un tubo de ensayo
✓ Por cada desinfectante que utilice marque 4 cajas de petri con agar
nutritivo así: 15, 30, 45 y 60 segundos
✓ Añada 1 ml. de cultivo de Staphylococcus aureus a cada uno de los
tubos con desinfectante
✓ De acuerda los tiempo marcados en la caja de agar nutritivo vaya
tomando una muestra de cada uno de los tubos de desinfectante más
bacteria y siémbrela en la caja de agar nutritivo correspondiente.
✓ Incube la caja a 37 o C por 24 horas
✓ Anote los resultados obtenidos en la tabla 2

TABLA 2
Desinfectante
15 30 45 60
Segundos Segundos Segundos Segundos

Tiempo
FENOL
HIPOCLORITO
HIDROXIDO DE
SODIO
ALCOHOL
ISODINE
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Cultivos de Staphylococcus aureus, y Escherichia coli. en caldo nutritivo
Pipetas
Tubos de ensayo estériles
Tubos de ensayo con caldo nutritivo
Cajas de petri con Agar nutritivo
Hidróxido de sodio al 2%
Fenol al 1%
Solución de hipoclorito de sodio 2ppm
Alcohol antiséptico
Isodine
Autoclave
Baño de agua a 60oC
Baño de agua hirviendo

Realice el informe según las orientaciones que le suministre su

tutor de laboratorio.
 4. FUENTES DOCUMENTALES

✓ APHA, AWWA. WPCF. 1989. Standar Methods for the examination of

water and wasterwater.

✓ GARCES, Emira. 2003. Morfología y Clasificación de los hongos. Notas

de clase Universidad Nacional de Colombia. Editorial UNIBIBLIOS.

✓ GRANT Y LONG. 1999. Microbiología Ambiental. Editorial Acriba.

España.

✓ MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M. Y PARKER,J. 2003. Brock: Biología

de los Microorganismos, Prentice Hall.

✓ MONTOYA, Olga Ines. 2004. Manual de Microbiología. Universidad

Nacional de Colombia Sede Medellín.

✓ SALDARRIAGA, Yamilé y PINEDA, Fabio. 2001. Manual de Micología

Aplicada. Editorial Universidad de Antioquia.

✓ SANCHES, Marina, MARMOLEJO, Fernando y BRAVO, Nelson. 2000.

Microbiología Aspectos Fundamentales. Universidad Nacional de
Colombia, sede Palmira. Feriva S.A.

✓ VALENCIA. Hernando. 2004. Manual de Prácticas de microbiología

básica. Notas de clase Universidad Nacional de Colombia. Editorial
UNIBIBLIOS.