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INSTITUTO TECNOLOGICO DE ORIZABA

Manual De Prácticas Del Laboratorio De Ing. Ambiental

Referencia a la Norma ISO

“FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA”

METODOLOGÍA No. 5

FECHA DE REALIZACIÓN__________________

1. COMPETENCIA A DESARROLLAR

El alumno determinará la cinética de la reacción al cuantificar el sustrato y la


población microbiana en la cámara de Neubauer por medio de la fermentación
alcohólica. Aprenderá que el tiempo necesario para que se desarrolle la reacción,
observará cómo reaccionan las levaduras para producir alcohol.

2. FUNDAMENTO

La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y


algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azúcar en
alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación alcohólica, comienza después
de que la glucosa entra en la celda. La glucosa se degrada en un ácido pyruvic.
Este ácido pyruvic se convierte luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han
aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos
se emplea el mismo microorganismo que es: la levadura común o lo Saccharomyces
cerevisae.

Aunque la palabra fermentación se refirió originalmente al metabolismo anaeróbico


de los compuestos orgánicos mediante microorganismos o sus enzimas para dar
lugar a productos más simples que la materia prima. La definición actual es:
“Cualquier acción microbiana controlada por el hombre para obtener productos
útiles”. Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y
segregan algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre; estas
son las características en las que se ha basado el uso de los microorganismos como
productores de fermentación, la que de una manera esquemática se puede
representar así:

Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Adecuadas ---


Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelulares.
Elaboró: Revisó: Autorizó:
Liliana García Álvarez Q.F.B. Rául Pérez Avila Ing. Arturo Erick
Kevin Ángel González Q.F.B.Jorge Tomas Figueiras Carrillo
Falfán González Rodríguez
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La fermentación se puede clasificar de la siguiente manera:

 Fermentación con base al substrato. Proteínas, Grasas, Carbohidratos.


 Fermentación con base al producto. Alcohólica. Láctica, Acetonica, etc.

La fermentación alcohólica es el proceso por el que los azucares contenidos en el


mosto se convierten en alcohol etílico. Para llevar a cabo este proceso es necesaria
la presencia de levaduras, hongos microscópicos que se encuentran, de forma
natural en los hollejos (en la capa de polvillo blanco que recubre las uvas y que se
llama "pruina"). El oxígeno es el desencadenante inicial de la fermentación, ya que
las levaduras lo van a necesitar en su fase de crecimiento. Sin embargo, al final de
la fermentación conviene que la presencia de oxígeno sea pequeña para evitar la
pérdida de etanol y la aparición en su lugar de acético o acetilo.
El proceso, simplificado, de la fermentación es:

Azucares + levaduras ==> Alcohol etílico + CO2 + Calor + Otras sustancias

La fermentación alcohólica es un proceso exotérmico, es decir, se desprende


energía en forma de calor. Es necesario controlar este aumento de temperatura ya
que si ésta ascendiendo demasiado (25 - 30º) las levaduras comenzarían a morir
deteniéndose el proceso fermentativo. Otro producto resultante de la fermentación
es el anhídrido carbónico (CO2) en estado gaseoso, lo que provoca el burbujeo, la
ebullición y el aroma característico de una cuba de mosto en fermentación.

3. GENERALIDADES

Investigación bibliográfica correspondiente al tema, y todos los puntos necesarios


para el complemento del desarrollo de la práctica.

La humanidad emplea la fermentación alcohólica desde tiempos inmemoriales para


la elaboración de cerveza (empleando cereales) y del vino (empleando el fruto de la
vid: la uva en forma de mosto) fundamentalmente. Los griegos atribuían el
descubrimiento de la fermentación al dios Dionisio.

En Alemania (1837) descubren que las bacterias (organismos microscópicos


unicelulares) son la causa del proceso, pero no fue hasta que Eduard Buchner en
el año 879 a.C descubre que la enzima zimasa es la responsable final de la
fermentación alcohólica trabajo por el que recibe el Premio Nobel de Química. Con

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el advenimiento de los descubrimientos químicos en el año 1815 el investigador


francés Joseph Louis Gay-Lussac fue el primero en determinar una reacción de
fermentación obteniendo etanol a partir de glucosa, a pesar de este logro los
fundamentos de la fermentación alcohólica eran completamente
desconocidos. Louis Pasteur en el año 1875 demostró que la fermentación era un
proceso anaeróbico (en ausencia de oxígeno).

Los descubrimientos posteriores a partir del periodo que va desde mediados


del siglo XX hasta comienzos del siglo XXI se centran exclusivamente en la mejora
de los procesos de fermentación alcohólica y conciernen más a la optimización del
rendimiento industrial bien sea mediante una buena selección de cepas de
levaduras, de una temperatura de funcionamiento óptima, de cómo realizar
fermentación en un proceso continuo.

Puede obtenerse de diferentes materiales la fermentación alcohólica como, por


ejemplo:

 Materias sacaroideas como azúcar de caña, remolacha, melazas y jugos de


frutas.
 Materias que contienen almidón: cereales (maíz, cebada, avena, trigo, arroz,
sorgo, etc), así como papa, boniato, girasol, yuca, etc.
 Materiales celulósicos como madera y residuos de fabricación de pulpa de
papel.
 La principal materia prima es la melaza.

Condiciones requeridas para la fermentación alcohólica.

 Concentración de azúcares: 10 – 18 %
 pH entre 4 y 4,5
 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae
 Ausencia de O2 y presencia de fosfatos.
 Temperatura de fermentación: 15 – 25ºC, por encima de 30ºC se evapora el
alcohol.
 AZUCARES. Es la materia prima para las levaduras, la concentración del mosto
debe estar entre 14 a 20 grados brix.

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El oxígeno es el desencadenante inicial de la fermentación, ya que las levaduras lo


van a necesitar en su fase de crecimiento. Sin embargo al final de la fermentación
conviene que la presencia de oxígeno sea pequeña para evitar la pérdida
de etanol y la aparición en su lugar de ácido acético.

A lo largo de todo el proceso de fermentación, y en función de las condiciones


(cantidad de azúcar disponible, temperatura, oxigeno, etc.) cambia el tipo
de levadura que predomina pudiéndose distinguir varias fases en la fermentación:

 1ª fase (primeras 24 horas), predominan levaduras no esporogéneas, que


resisten un grado alcohólico 4-5. Son sensibles al anhídrido sulfuroso.
 2ª fase (2º-4º día), predomina el Sacharomyces cerevisiae que resiste hasta
un grado de alcohol entre 8 y 16. En esta fase es cuando se da la máxima
capacidad fermentativa
 3ª fase sigue actuando Sacharomyces Cerevisiae junto a Sacharomyces
Oviformis. También pueden existir otros microorganismos procedentes
principalmente de las bodegas y de los utensilios, suelen ser hongos entre
los que destacan Penicillium, Aspergilus, Oidium,

LEVADURAS

En la fermentación alcohólica, además de los microorganismos (levaduras), las


enzimas juegan un papel importante ya que sin estas no sería posible tan compleja
operación. Además de los microorganismos y enzimas se requiere que el medio
sobre el cual actúan tenga unas condiciones especiales como pH, temperatura,
concentración de nutrientes en el sustrato.

Levadura es el nombre genérico dado a un grupo de hongos Ascomicetes


pertenecientes al orden Endomicetales. Las levaduras son micro hongos que se
encuentran generalmente en forma de células únicas y que se reproducen mediante
gemación. La membrana celular consta de polisacáridos y muy poca quitina. Tienen
glucógeno como sustancia de reserva y contienen también numerosas vitaminas.
Provocan la fermentación alcohólica de las masas de harina y de los líquidos
azucarados, y muchas de ellas se utilizan para obtener bebidas y elaborar pan y
otros productos.

La levadura es una anaerobio facultativo: transformando azúcar a la misma


velocidad, la levadura aeróbica produce dióxido de carbono, agua y una producción
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relativamente alta de nueva levadura, mientras que la levadura crecida


anaeróbicamente tiene una velocidad relativamente lenta de crecimiento, que ahora
se acopla a una alta conversión de azúcar en alcohol y dióxido de carbono.

ESPECIES DE LEVADURAS ALCOHOLIZANTES

ESPECIE DE LEVADURA IMAGEN


Saccharomyces cerevisiae.

Se conoce como levadura silvestre, por lo que corresponde a una


especie no cultivada, Produce fermentación superficial.

Saccharomyces carisbergenis (s. uvarum)

Especie cultivada, seleccionada, realiza su actividad fermentativa en el


fondo de los recipientes. Se considera como la levadura autentica
cervecera

Saccharomyces pastorianus

Son células ovalas en forma de salchicha, su actividad fermentativa es


de fondo. No conveniente en la industria cervecera. Es resistente a
altas concentraciones de alcohol y anhídrido sulfuroso.

Tórulas

Se reproducen por gemación, de forma esférica u oval, de distintos


colores, su presencia en cervezas causa turbidez. No son
saccharomyces. Su actividad alcoholizante es escasa. Se encuentran
en gran cantidad en mostos de uvas atacadas por podredumbre.

Brettanomyces

Son asporògenas. Son células esféricas, ovales o alargadas, se


desarrollan lentamente formando cadenas de células Producen
acidez. Desprenden olor a extractos de malta. Fermentación tardía.

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4. MATERIAL

 Agitador  Porta y cubre objetos


 Termómetro  Papel pH
 Vaso de Precipitado  Cascarás de Piña o de otra
 4 Vasos de vidrio de boca chica fruta que indique el profesor
de 400 ml aprox.  Levadura
 Embudo  Azúcar (Panela)
 Papel filtro
5. EQUIPO

 Olla exprés
 Microscopio
 Balanza granataria
 Refractómetro
 Cámara de Neubauer

6. PROCEDIMIENTO

Teniendo los materiales a trabajar se mezclan el agua y azúcar, se agrega un gramo


de levadura y posteriormente se dejan reposar. Al recipiente se le debe poner un
tapón de algodón ya que la mezcla produce gases, a partir de este momento se
empezarán a tomar las lecturas con el refractómetro, pH, temperatura y se anotará
los cambios que tiene día con día.

NOTA: El profesor en clase dará las indicaciones necesarias para la realización de


la práctica.

Para Pasteurizar nuestra mezcla:

 Al tener todo contabilizado y verificar que el número de colonias no sea mayor


a 300, se procede a pasteurizar, se realiza de la siguiente forma:
 Se filtrará la mezcla fermentada
 Se deposita en cada uno de los frascos.
 En la olla exprés los colocamos en baño maría.
 Se debe medir la temperatura hasta alcanzar los 56 °C

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 A partir de ese momento se tomará el tiempo que tarda para alcanzar una
temperatura de 65°C

NOTA: El profesor explicará en clase la técnica para calcular el tiempo de reposo


mediante una tabla.

Calculado el tiempo necesario se deben tapar los frascos y se refrigeran para que
queden listos para su consumo.

7. PREGUNTAS

1.- ¿Cuáles son los errores más comunes que se cometen en la elaboración
de la fermentación?

 La concentración de azúcares en el medio; así, si las células se desplazan a


un medio de mayor presión osmótica pierden el agua del citoplasma de forma
casi instantánea.
 No incubar el tiempo necesario con las condiciones de temperatura
requeridas para el sustrato.
 Agregar medidas incorrectas de sustrato o de levadura.

2.-Menciona que productos se obtienen de la fermentación para el consumo


humano.

 Bebidas, en su mayor parte alcohólicas: vino, cerveza, cava,


sidra (fermentación del zumo de manzana), whisky, coñac, ron, aguardiente,
vodka (destilación del fermentado de cereales o jugo de
caña, amazaque (fermentación de arroz por aspergillus oryzae), té
kombucha (levaduras y bacterias que producen fermentación de infusión de
te). El té negro es té verde que ha sido sometido a fermentación.

 Alimentos: pan, tempeh (fermentación de semillas de soja),

 Condimentos: miso ( fermentación por aspergllus oryzae de un cereal, soja


u otra legumbre y sal), salsa de soja (fermentación por aspergillus soja).

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3.- ¿A qué se debe que la mezcla de la fermentación libera gases?

En el proceso, las levaduras obtienen energía disociando


las moléculas de glucosa y generan como desechos alcohol y CO2 en forma
gaseosa

4.- ¿Qué tipo de gases se liberan?

 CO2 en forma gaseosa


 Moléculas de ATP que consumen los propios microrganismos en su
metabolismo celular energético anaeróbico.

5.- Explica brevemente como actúan las levaduras en el proceso de


fermentación.

Las levaduras son importantes por su capacidad para realizar la descomposición


mediante fermentación (predominantemente alcohólica) de diversos compuestos
orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas
sustancias.

La levadura, siendo la más común la S. cerevisiae, se utiliza en panadería como un


agente de fermentación, que convierte los compuestos fermentables presentes en
la masa en gas dióxido de carbono. Esto hace que la masa se expanda o aumente,
a medida que el gas forma burbujas o bolsillos. Cuando se hornea la masa, la
levadura muere y las bolsas de aire quedan "fijadas", dando al producto horneado
una textura suave y esponjosa. El uso de las patatas, agua de ebullición de patata,
huevos o azúcar en una masa de pan, acelera el crecimiento de las levaduras. La
mayoría de las levaduras utilizadas en panadería y pastelería son de la misma
especie que las usadas en la fermentación alcohólica.

6.- Menciona cuáles son los factores que definen que las levaduras mueran.

Los factores extrínsecos son propios del ambiente, entre los que se incluyen la
temperatura, humedad y la tensión de oxígeno, estos parámetros pueden influir
sobre el crecimiento de las levaduras en respuesta a cambios del ambiente que las
rodea. Modifican su estructura y mecanismos de funcionamiento para poder
sobrevivir en las nuevas condiciones.

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En principio, los cambios se pueden producir en dos vías, cambios en la constitución


genética o cambios en su fenotipo. La levadura que presente capacidad de
metabolizar y como los nutrientes tiene más ventajas de competitividad.

8. ANEXAR FOTOGRAFÍAS, ESQUEMAS Y OBSERVACIONES PERTINENTES

Se pesaron aproximadamente Ya juntos los materiales se


52.5 gramos de azúcar morena le agrego 1 gr de levadura Se obtiene una
en un matraz Erlenmeyer. Los de panadería en barra el mezcla de azúcar,
cuales se aforaron con 300 ml de agua destilada y
cual se agregó y se disolvió
agua destilada. levadura.
completamente.

Se logro obtener 20° brix en la


sustancia, si estaba está bajo de
°brix se le agregaba más de
azúcar a modo de tener esa Después se le puso un
concentración de 20° brix. tapón de algodón y papel
aluminio el cual se llevó a
incubar durante 24 hrs

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Antes de la incubación se tomo una muestra para poder observar


en la cámara de neubauer. Al tener una concentración muy alta
a modo de no observar la cuadricula de la cámara se realizó una
disolución de 1 ml en 25 ml.

Donde se encontraron en una cuadricula de 4x4  33 U.F.C

Que con medidas de la cámara son 0.2 mm * 0.2 mm * 0.1mm

Obteniendo 247.5*107 U.F.C/ML

Después de las 24 horas se toma una segunda muestra y observar en la


cámara de Neubauer
En esta se observaron en una cuadricula de 4x4  58 U.F.C

Con una dilución de 1ml en 25 ml

Con las mismas medidas de la cámara anterior, obteniendo 43.5 *


108 U.F.C/ ML.

DILUCIÓN

Z=1*1025 (43.5*108)
1ml

Z= 4.35* 1034

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TIEMPO DE DOBLADO

TD= T/µ TD= 24 HRS


83.86
µ= LOG B- LOG b
LOG 2 TD=O.28HRS

µ= LOG(4.35*1034)-LOG(247.5*107) (0.00476 MIN)

LOG 2

µ= 83.86

LA SUSTANCIA SE QUEDO EN INCUBACION APROXIMADAMENTE 15 DÍAS.


A un tubo de ensaye se le agrego 10 ml de la sustancia
del matraz que estaba en la incubadora al cual se le
agrego 2 gotas de azul de metileno diluido.

El cual se llevó a observar en el microscopio en la cámara


de neubauer para observar aquellas colonias teñidas del
colorante, las cuales estas eran no viables (muertas).

En la cámara se observó el 62% no viables teñidas


de color azul.

Se realizo una dilución de 10ml en 25 ml

De acuerdo con los datos de la anterior medición de


las 24 hrs. Que se obtuvierón 43.5 * 108 U.F.C/ ML.
Afectado por el 62% no viables se obtienen
269.7*107U.F.C/ML.

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DILUCIÓN TIEMPO DE DOBLADO

Z=1*1025 (43.5*108) TD= T/µ


10ml
µ= LOG B- LOG b TD= 360 HRS
83.63
Z= 43.5*108

µ= LOG(43.5*108)-LOG(247.5*107) TD=4.30HRS
LOG 2 (0.071MIN)

µ= 83.86

9. RESULTADOS

De acuerdo con lo investigado a las condiciones en


las que una fermentación debe estar expuesta como
es la temperatura en la incubación en ausencia de
oxígeno y añadido un microorganismo este logro una
producción de ácido pirúvico el cual se convirtió en
etanol con CO2 en forma gaseosa. Este en el lapso
de entre las 24-48 hrs. Y observado bajo en el
microscopio un crecimiento representativo de
microorganismos. Los cuales en el lapso de 15 días
estos al terminarse el sustrato fueron haciéndose no
viables y haciendo menor el numero de
microorganismos en la fermentación

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CONCLUSIÓN

Con la práctica y la investigación obtenida durante ésta, pude notar que la fermentación
alcohólica es la base para a la obtención de productos comercializados que van desde el
consumo humano como lácteos, cerveza hasta farmacéutica, sin embargo, su importancia
no está únicamente en la obtención de etanol a partir de los azúcares, sino que además
durante este proceso se van a formar una gran cantidad de productos secundarios que
influyen en la calidad. También noté que esta fermentación sería completamente imposible
sin un soluto como lo es la glucosa, y obviamente variaría demasiado sin la cantidad exacta
de ésta. Es necesario modificar las variables de forma en que nos demos cuenta que
cambio se genera al modificar cada una. Algunos microorganismos que realizan la
fermentación alcohólica son: levaduras (Hongos unicelulares eucariotas) como
Saccharomyces cerevisiae, Anaerobias Facultativas (pueden o no fijar el O2 atmosférico),
Bacterias Anaerobias Obligadas que producen la Fermentación alcohólica natural en
Frutas.

DISPOSICIÓN FINAL Y TRATAMIENTO DE RESIDUOS

Al término de la fermentación se dispuso a esterilizar la muestra la cual se vertió a


una de las plantas dentro de la institución, ya que no es dañino para su ambiente y
es un nutriente para el mismo.

BIBLIOGRAFÍA

Nombre del Libro, Nombre del autor, Edición y Páginas consultadas.

 https://nubiavalcarcel.wordpress.com/
 https://www.ecured.cu/Fermentaci%C3%B3n_alcoh%C3%B3lica
 https://core.ac.uk/download/pdf/18293069.pdf
 https://es.slideshare.net/JudyRosero/fermentacin-5290812
 https://www.tesisenred.net/bitstream/handle/10803/8389/TSMAC1de3.pdf?s
equence=1&isAllowed=y

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LISTA DE COTEJO PARA EL REPORTE DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO

El reporte es un recuento breve de las actividades realizadas en la práctica,


identificando los pasos del método científico que se hayan aplicado, incluyendo los
resultados y las conclusiones, junto con las respuestas a las preguntas que se
hayan planteado

Competencia
Estándares Sí No Observaciones
s

1) Empleo adecuado del material


de vidrio

2) Empleo adecuado del


instrumental electrónico o
mecánico
Científico
Técnicas 3) Utilizó la ropa de trabajo
adecuadamente.

4) Cuidado y limpieza del


instrumental

5) Sigue las indicaciones del


docente al respecto del manejo
de algunos productos peligrosos
o delicados.

Metodológicas 6) Secuencia lógica de los pasos


a seguir

7) Capacidad de análisis e
interpretación de resultados

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8) Correcta expresión, redacción


y ortografía; elaboración de un
informe final conforme a los pasos
del método científico; cuestionario
contestado correctamente.

9) Empleo de vocabulario técnico


adecuado

10) Cumplimiento de la tarea en el


tiempo asignado

11) Consulta sus dudas de forma


clara y concisa

12) Mantenimiento del orden en el


lugar de trabajo

13) Comunicación con los


Sociales
integrantes del grupo de trabajo

14)Respeto por las normas de


seguridad e higiene

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