dextrano

18-1166-12

Edición AA
1
 Manuales de
Amersham Biosciences

purificación de anticuerpos

Manual
18-1037-46

El Manual de proteína recombinante

La amplificación y purificación de proteínas simple

18-1142-75

La purificación de proteínas Cromatografía de fase inversa

Manual Principios y Métodos
Ficoll-Paque PLUS
18-1132-29 18-1134-16
por in vitro aislamiento de linfocitos
18-1152-69
Cromatografía de intercambio de iones Adsorción de lecho expandido

Principios y Métodos Principios y Métodos

Sistema de GST de fusión de genes
18-1114-21 18-1124-26
Manual
18-1157-58
Cromatografía de afinidad cromatoenfoque
Principios y Métodos con Polybuffer PBE y
2-D electroforesis
18-1022-29 18-1009-07 utilizando gradientes de pH inmovilizados

Principios y Métodos
Cromatografía de interacción hidrofóbica cultivo de células de microvehículo
80-6429-60
Principios y Métodos Principios y Métodos
18-1020-90 18-1140-62
Preparación de la muestra para la
electroforesis:
Filtración en gel Percoll IEF, SDS-PAGE y 2-D electroforesis

Principios y Métodos Metodología y Aplicaciones Principios y Métodos

18-1022-18 18-1115-69 80-6484-89

2
 dextrano

por AN De Belder

3
4
Contenido

1. Introducción ............................................... .............................................. 7

2. Estructura, propiedades físico-químicas y reactividad .................................. 9

2.1. Estructura ................................................. .................................................. .......... 9
2.2. Propiedades físico-químicas. .................................................. ............................ 11
2.3. Reactividad ................................................. .................................................. ....... 14

3. La biosíntesis ............................................... ............................................ 15

3.1. Dextransucrase (sacarosa: 1,6 una- D-glucano 6- una- glucosil transferasa, ec. 2.4.1.5.) ...... 15
3.1.1. La purificación ................................................. .................................................. ..................... 15
3.1.2. Propiedades ................................................. .................................................. ....................... dieciséis
3.1.3. Donantes de especificidad de sustrato ............................................... .................................................. . dieciséis

3.2. Mecanismo ................................................. .................................................. ..... 17

3.3. reacciones aceptor ................................................ .............................................. 18
3.4. La ramificación ................................................. .................................................. ....... 20

4. Producción de dextrano clínico ............................................ ...................... 21

4.1. La fermentación ................................................. .................................................. 21 ..
4.2. Elaboración de dextransucrase ............................................... ............................... 22
4.2.1. pH ................................................. .................................................. ................................. 22
4.2.2. Concentración de sacarosa ................................................ .................................................. ....... 22
4.2.3. Hora ................................................. .................................................. .............................. 23

4.3. Biosíntesis de dextrano ............................................... ........................................ 23

4.3.1. pH ................................................. .................................................. ................................. 23
4.3.2. Concentración de sacarosa ................................................ .................................................. ....... 23
4.3.3. Temperatura ................................................. .................................................. ................... 24
4.3.4. El calcio ................................................. .................................................. ......................... 24
4.3.5. Hora ................................................. .................................................. .............................. 25

4.4. fracciones clínicos ................................................ ................................................ 26

4.4.1. hidrólisis ácida parcial ............................................... .................................................. ........ 26
4.4.2. procedimientos de fraccionamiento ................................................ .................................................. ... 26

4.5. Seguro de calidad ................................................ ............................................... 27

4.6. Estabilidad en solución ............................................... ............................................. 28
4.7. Futuros desarrollos ................................................ .......................................... 29

5. Historia de las aplicaciones médicas ............................................ .................... 31

5.1. Dextrano 70 ................................................ .................................................. ...... 31
5.2. Dextrano 40 ................................................ .................................................. ...... 32
5.3. Dextrano 1 ................................................ .................................................. ........ 32
5.4. Hierro-dextrano ............................................... .................................................. ...... 32
5.5. El sulfato de dextrano ................................................ .................................................. . 33
5.6. dextrano dietilaminoetilo (DEAE-dextrano) ........................................... ................. 33
5.7. disoluciones de perfusión ................................................ ............................................. 33
5.8. Debrisan ................................................. .................................................. ......... 34
5.9. Hyskon ................................................. .................................................. ........... 34

5
 6. Las aplicaciones generales de dextrano y sus derivados ....................................... 35
6.1. fracciones de dextrano ................................................ ................................................ 35
6.2. Sephadex ................................................. .................................................. ....... 36
6.3. preparaciones de dextrano-hemoglobina .............................................. ........................... 37

6.4. Los conjugados de dextrano con sustancias biológicamente activas ....................................... 37

6.5. derivados de dextrano ................................................ ................................................ 39

6.5.1. El sulfato de dextrano ................................................ .................................................. ................. 39
a. Efectos sobre las enzimas ............................................... .................................................. .................. 39
si. Efectos sobre la respuesta inmune .............................................. .................................................. ...... 40
C. Efectos sobre los virus ............................................... .................................................. .................... 40
re. Toxicidad ................................................. .................................................. ................................. 40
mi. La manipulación genética ................................................ .................................................. .................. 41
6.5.2. DEAE-dextrano ............................................... .................................................. ................... 41
6.5.3. dextranos fluoresceína marcado con .............................................. ................................................. 41

6.6. Microportadores para el cultivo celular .............................................. .................................. 42

6.7. 99m Tc-dextrano ............................................... .................................................. .... 42

7. Análisis de dextrano .............................................. ....................................... 43

8. Agradecimientos ............................................... .................................. 43

Referencias ................................................. ................................................ 45

Información sobre pedidos ................................................ ................................... 60

6
1. Introducción

Una breve búsqueda de la base de datos Chemical Abstracts de dextrano y títulos relacionados con dextrano
deja a uno en pocas dudas del interés prolífica en este ámbito; un interés que pueda ser atribuido a la
continua importancia clínica, científica y técnica de dextrano y sus derivados.

Actualmente, más de 1000 publicaciones que tratan de dextrano aparecen cada año. Opiniones en este campo

se publican con regularidad impresionante (1-25). Ciertas limitaciones tuvieron que ser impuesta a esta revisión

y que por lo tanto se ha restringido a dextranos de interés comercial, en particular de mesenteroides

Leuconostroc
NRRL B-512 (F); otros dextranos y los glucanos cariogénicos solamente se hace referencia a cuando son
de particular relevancia. Las referencias a dextranasas se limita únicamente a los de interés para el
dextrano B-512 (F). Ciertas abreviaturas se han utilizado a lo largo de:

MWD distribución de peso molecular

METRO W masa molecular promedio en masa

METRO norte masa molecular promedio en número

MW peso molecular
dextrano 70 una fracción de dextrano con M W de 70 000

DS grado de sustitución

7
8
2. Estructura, propiedades físico-químicas y reactividad

2.1. Estructura

El dextrano elaborado por Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 (F) consta de una una( 1 6) = Conectado glucano con cadenas laterales
unidas a los 3-posiciones de las unidades de glucosa columna vertebral. De peryodato (26, 27) y la metilación (28-31) análisis, el grado de
ramificación se estima como 5%. El valor del análisis de la metilación es que no sólo identifica la (1 3) enlaces de rama sino que también les
cuantifica. Un estudio sistemático de este análisis en nuestros laboratorios, sin embargo, ha puesto de manifiesto que la estimación de

2,4-dimetil-glucosa por cromatografía gas-líquido está sujeto a un lugar alto coeficiente de variación; 11-20%, dependiendo de las
condiciones utilizadas. El grado de ramificación se encuentra a disminuir en la hidrólisis ácida parcial, aunque el efecto no es
dramática (29).

dextrano La ramificación (%)

dextrano nativo 4.6

dextrano 80 3.8
dextrano 10 3.0

Tabla 1. Dependencia del grado de ramificación en el peso molecular.

Aunque los valores dados en la Tabla 1 son algo más bajos que
los generalmente aceptado ahora para B-512 (F), que
proporcionan una comparación relativa útil.

C1 C2
La razón de esta disminución se basa en la mayor labilidad al
C3
ácido de una( 1 3) Relación en comparación con una( 1 6) enlaces
(32, 33). El uso de técnicas menos sensibles, Bremner (34) no se
encontró ninguna diferencia en la ramificación entre dextrano
nativo y dextrano, M W 3 000. La 1 H y 13 C-RMN espectros
proporcionar evidencia convincente de las principales
características estructurales de dextrano. los 13 espectro de C-RMN
para nativo NRRL dextrano B-512 (F) se muestra en la Figura 1 y
las asignaciones individuales se muestran en la Tabla 2.

'C6 C5 C4

13 C (ppm) 1 H (ppm)

C1-H 97.8 4.99

C2-H 71.5 3.6
C3-H 73.5 3.76
C6
C4-H 70.0 3.52
C5-H 70.3 3,88-4,04
100 90 80 70 60 50 ppm C6-H 66.1 3,88-4,04
3,81-3,86
C6 '-H 61.0 -

Figura 1. 13 espectro de C-RMN de dextrano nativo de Leuconostoc mesenteroides B-512 Tabla 2. 13 C y 1 H desplazamientos químicos para dextrano B-512 (F) (35-37)

(F) en D 2 O.

9
La señal en 61 ppm, asignada al átomo C6 sobre la no reducción de la glucosa-unidades, es de interés considerable, ya que corresponde a
la ramificación (35-36). La señal de campo abajo a 99,5 ppm se asigna tentativamente a la una( 1 3) carbono anomérico (36). Los estudios
realizados en nuestros laboratorios en la determinación del grado de ramificación de dextrano clínico por RMN se obtiene un valor de 4.8 a
5.5%, dependiendo de la técnica de integración empleado (38).

Desde los primeros estudios sobre dextranos por Pasika y Cragg (39) usando 1 H-RMN, se ha hecho un progreso rápido en la resolución y la
calidad de los espectros. Un nuevo examen exhaustivo de la técnica aplicada a dextranos ha sido publicada por Gagnaire (37) y Seymour
(40). Las asignaciones de las señales de los protones se incluyen en la Tabla 2. Dado que los espectros necesariamente mucho más
complejo, no ha sido posible resolver e identificar todas las señales, en especial los menores de edad. Hemos encontrado espectroscopía
de RMN útil para detectar rastros de levan en dextrano nativo. La Figura 2 muestra la 13 C-espectro de dextrano nativo que contiene 20%
añadido levan. Muchos detalles de la estructura fina siguen sin resolverse, en particular, la longitud y la distribución de las cadenas
laterales.

degradación secuencial, que cuantitativamente elimina

grupos terminales no reductores, se ha empleado para
investigar la longitud de las cadenas laterales (30). El
procedimiento se basa en la degradación alcalina de
unidades de glucosa terminal en el que el grupo
6-hidroxilo está sustituido con grupos
Cp-tolylsulphonylmethyl. Larm y sus colegas (30) llegaron
a la conclusión de ese modo que el 40% de las cadenas
laterales son una unidad de largo, 45% son dos unidades
de largo y el 15% restante más de dos. Estudios previos
que implican oxidación catalítica también habían
implicado la presencia de uno ramas de la unidad (29). La
preponderancia de las ramas de una sola unidad se ha
demostrado en varios otros dextranos por Abbott (41) y
Bourne (42). La disponibilidad de enzimas con
propiedades bien caracterizadas ha permitido Walker y
sus colegas para corroborar estos resultados (43, 44). Por
medio de HPLC, Penicillium funiculosum.
x xx
xx

110100 90 80 70 60 50 ppm x

Figura 2. 13 espectro de C-RMN de dextrano nativo B-512 (F) que contiene 20% levan en D 2
O. Las señales marcadas X se deben a levan.

1 2

3 3- glucosylisomaltotetraose 3 3- isomaltosylisomaltotriose

10
Un dextrano-glucosidasa (de mitis Streptococcus) con la actividad de exo-dextranasa liberado sorprendentemente 25% de glucosa a partir de
dextrano nativo B-512 (F) (43). El dextrano límite obtenido tenía un M W de 20 x 10 6

y la ramificación se mantuvo sin cambios indica que no hay escisión interna. Para tener en cuenta esta cantidad de glucosa, las cadenas
laterales de más de dos unidades tendrían que ser al menos 33 unidades de longitud. Nuestra comprensión de la distribución de las
cadenas laterales es también imperfecta. Covacevich y Richards (45) mediante el análisis de la distribución de oligosacáridos a partir del
hidrolizado de dextrano con una endo-dextranasa concluyeron que las ramas no se agruparon pero fueron distribuidos de una manera
relativamente regular. Estas conclusiones se basaron en una serie de hipótesis, una de ellas, que las ramas son sólo una unidad de tiempo,
es cuestionable. La evidencia de la presencia de ramas largas también se ha aducido a partir de estudios de la M W y la viscosidad durante la
biosíntesis de dextrano (46). Se hace referencia adicional a la ramificación en la sección siguiente.

2.2. Propiedades físico-químicas

Dextran B-512 (F) es libremente soluble en agua, sulfóxido de metilo, formamida, etilenglicol, glicerol, 4-metilmorfolina-4-óxido, y
hexametilfosforamida (un carcinógeno). Algunas fracciones de dextrano pueden adoptar un cierto grado de cristalinidad y sólo
se puede poner en solución por calentamiento fuerte.

El peso molecular del dextrano nativo NRRL B-512 (F) se ha investigado en muchos laboratorios (46-51) y los valores para la M W
de 9 x 10 6 a 500 x 10 6 Se han obtenido. Mediciones en una variedad de disolventes, por ejemplo 4 M NaCl y 6 M urea, no
revelaron ninguna evidencia de que la asociación contribuyó a estos valores extremadamente altos (49, 50). La relación entre M W
y la viscosidad intrínseca [ h] se ha investigado en un amplio intervalo de M W ( véase la Figura 3) (47, 52-56).

[]
1.0

0.5

0.1

10 4 10 5 METRO10
W 6

Fig. 3. Representación logarítmica de [ h] M contra W para dextrano B-512 (F) (línea azul) y para un dextrano hipotético lineal (línea roja) (47).

11
La desviación de la linealidad en mayor MW se atribuye al aumento de la ramificación y la polimolecularidad de las fracciones
utilizadas. Granath (52) obtiene la siguiente relación para el dextrano en el rango clínico.

[ h] = 2,23 x 10- 3 METRO W0.43 ( para MW <5 x 10 5)

Recientemente, un valor de 0,47 se obtuvo para el exponente con las fracciones de dextrano de pesos moleculares de hasta 500 000
(57). El valor del exponente disminuye con el aumento MW y para un M W > 10 6

un valor de 0,22 se ha derivado (47). El comportamiento newtoniano de soluciones de dextrano se atribuye a su ramificación.

A partir de mediciones de g, que representa la relación entre el radio cuadrático medio de giro de la molécula ramificada con el
de una molécula no ramificado de la misma M W, Bovey (46) y Senti et al.
(47) calculado que, cuando la presencia de un alto porcentaje de ramas individuales se tuvo en cuenta, el acuerdo sólo podía ser obtenida por
el supuesto de que las largas ramas deben tener al menos 50 unidades de longitud. Esto se compara bien con las implicaciones de los
estudios de la enzima de Walker. Gales et al., ( 56) aplicado teoría similar para calcular longitudes medias de rama y espaciados por una
fracción de dextrano, M W aprox.
300 000, y derivados figuras de 6 y 9 unidades de glucosa, respectivamente. Más recientemente, Garg y Stivala (58) valores G derivados de bajo
ángulo de dispersión de rayos X y obtienen valores similares para la ramificación. Sin embargo, ninguno de estos estudios ha tenido en cuenta el
hecho de que al menos el 80% de las ramas son <2 unidades de longitud. Existe cierta evidencia de que las cadenas más largas tienen ramas más
largas (57).

Muchos aspectos de la estructura fina de dextrano quedan

por resolver, en particular, si las ramas son parte de una
2
estructura en forma de peine o una estructura más
ramificada. El mecanismo de aceptación sería de hecho

40
apoyo de esta última.

o
an
xtr
mmH O
de

La presión osmótica de coloides de soluciones de

dextrano, un parámetro de muy considerable importancia
en sus efectos de expansión de volumen de plasma, ha 2000 P
recibido mucha atención en nuestros laboratorios y en
otros lugares (60, 61). La dependencia de la concentración
se representa por dextrano 40 y 70 en la figura 4. El
70

aumento de la divergencia de las presiones osmóticas de 1000 1500

no
ra
xt

dextrano de las de la albúmina a concentraciones más

de

altas refleja la mayor interacción entre dextrano y agua,

que es un buen disolvente para el dextrano, y las
500 mina
propiedades conferida por la estructura de espiral al azar Albú

(62).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentración,%

Fig 4. Parcela de presión osmótica (mm H 2 O) frente a la concentración (%) para dextrano 40,
dextrano 70, y albúmina.

12
Los estudios sobre la difusión de dextrano a través de una serie de membranas sugieren que el dextrano es menos impedido de lo que se predijo

sobre la base de un radio de Stokes (63, 64). los una( 1 6) polisacáridos con enlaces representan una clase de polímeros muy flexibles y largos (65).

Por encima de M W 2 000, dextrano se comporta en la solución como una bobina expansible. Las dimensiones moleculares dependen de la

disolvente, y el MW y la concentración del polisacárido (véase la Tabla 3). Las propiedades de la solución indican que las moléculas de dextrano

con MW> 10 5 comportarse como si estuvieran altamente ramificados. A medida que el MW aumenta aún más, las moléculas alcanzan incluso

mayor simetría (47, 52, 56).

METRO W x 10- 3 Radio de giro radio de Stokes

UNA UNA

2000 380 270

1000 275 199
500 200 147
200 130 95
100 95 69
70 80 58
50 68 49.5
40 62 44.5
10 - 23.6

Tabla 3. dimensiones moleculares de B512 dextrano como radio de giro del radio de Stokes
(52)

En el rango de oligosacárido M W < 2000, las propiedades de la solución se explican mejor por una transición desde una bobina a una conformación en

forma de varilla (66). bobinas de dextrano son bastante compacto en disolventes pobres,

por ejemplo, etilenglicol, pero se expanden considerablemente en un buen disolvente, tal como sulfóxido de metilo o formamida (55). Garg y

Stivala (58) han demostrado por Small ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) que las dimensiones moleculares de la disminución de dextrano

con una concentración creciente (0,5-3,0%). Se han hecho varios intentos para cristalizar dextrano a fin de registrar los patrones de difracción de

rayos X y por lo tanto dilucidar la arquitectura molecular detallada. Jeanes (67) obtuvo patrones de líneas de rayos X a partir de muestras de

dextranos “cristalinas” preparados por humidificación o tratamiento con etanol. Barham (68) describe un procedimiento mejorado para la

preparación de películas esferulıticas de fracciones de dextrano como se informó anteriormente por Pasika y West (69). Las esferulitas dieron

diagramas de polvo similares a los obtenidos por Jeanes. cristales individuales se han cultivado a partir de una fracción de dextrano, M W 19 900

(70-72). A partir de los datos de difracción de electrones, se propuso que el dextrano adopta una conformación en forma de cinta con unidades de

glucosa consecutivos en una relación cerca de tornillo doble, la celda unitaria que contiene dos cadenas antiparalelas de dos unidades de glucosa.

13
2.3. Reactividad

La reactividad de dextrano implica principalmente un estudio de las reactividades relativas de los grupos hidroxilo secundarios,
ecuatorialmente orientado, HO-2, HO-3, y HO-4. Un pequeño porcentaje de los grupos hidroxilo en el dextrano son primarios
(aprox. 1,5%), aunque esta cifra aumenta ligeramente en pesos moleculares bajos debido a la contribución de los no reductoras
grupos terminales. Los intentos de tritylate los hidroxilos primarios selectivamente en metil sulfóxido / piridina han sido reportados.
Aunque Rees y colaboradores (73) encontraron que algunas tritilación de hidroxilos secundarios no se pudo evitar, se utilizó con
éxito la reacción por Larm (30) para el estudio de la longitud de las ramas.

Los estudios sobre la metilación parcial (74) revelaron lo siguiente reactividades k2 relativa: k3: k4 = 8: 1: 3,5. Buena concordancia
entre la distribución experimental y teórico de éteres metílicos solamente se obtuvo cuando asignación se hizo para la reactividad
mejorada en HO-3 como resultado de la sustitución en la HO-2 o HO-4. Así, por ejemplo, k3 es mejorada por un factor de 5,2 por
sustitución en tanto HO-2 y HO-4 (74).

Como con otros glucanos, la reactividad en HO-2 hacia agentes alquilantes es mayor que en HO-3 o HO-4. Esto se racionaliza en
términos de la mayor acidez de la HO-2 debido a su proximidad al centro anomérico (75). Una investigación de la metilación parcial de
algunos compuestos modelo, por ejemplo, metilo una- y si- glucopiranósidos D y sus derivados 6-O-sustituidos, indicaron que no hay
efectos especiales necesitan ser invocados en los polímeros para explicar la baja reactividad en HO-3 (76). Cuando se ionizan HO-2 y
HO-4, la reactividad en HO-3 está deprimido. Sin embargo, la sustitución en HO-2 o HO-4 suprime este efecto con posterior aumento
en la reactividad a HO-3 (74). Se necesita algo de precaución en la aplicación de estas generalizaciones, tal como la fuerza de la base
puede afectar a las reactividades relativas y absolutas de los hidroxilos (77, 78).

Las reactividades relativas de los grupos hidroxilo hacia óxido de etileno sigue de cerca las de metilación (79). A
mayores grados de sustitución (DS), sin embargo, el patrón de sustitución se hace compleja debido a la introducción de
sitios de hidroxilo primarios.

Las acilaciones pueden diferir de alquilaciones en que pueden estar sujetos a control termodinámico debido a la migración de los
sustituyentes. Un estudio de la acetilación parcial del dextrano con anhídrido acético / piridina (80) reveló que k2> k3 = k4. Este
orden de reactividad es similar a la mostrada por metilo si-
D-glucopiranósido. Cuando, sin embargo, la acilación se llevó a cabo en álcali acuoso, las reactividades fueron prácticamente idénticos, lo
que indica reordenamiento.

Una investigación de la distribución de los grupos sulfato en dextrano parcialmente sulfatado, usando dextrano N-4 con una estructura
similar a B-512 (F), mostró que HO-2 fue de nuevo más alta con k2: k3: k4 = 1,6: 1,06: 1,0 (81). El porcentaje de unidades de glucosa
di-sustituidas fue sorprendentemente alta incluso a DS bajos. Los grupos carbonilo pueden ser introducidos en dextrano por el reactivo de
Fenton (82), metil sulfóxido / reactivo anhídrido acético (83), o por medio de bromo acuoso a pH 7 (84). Con el último reactivo, la
oxidación parece ocurrir principalmente en C-2 (21%) y en C-4 (25%). Patrones similares se obtienen con metilo una- D-glucopiranósido
(85). Cuando la oxidación se lleva a cabo en presencia de borato, menos escisión oxidativa a dicarbonilo restos resultados (86).

14
3. La biosíntesis

3.1. Dextransucrase (sacarosa: 1,6 una- D-glucano 6- una- glucosil transferasa, CE. 2.4.1.5.)

3.1.1. Purificación

Aunque las propiedades formadoras de limo de los extractos filtrados de Bacillus mesentericus se observaron por primera vez por Beijerinck
(87) en 1910, la evidencia publicada por Hehre (88, 89) en 1939 y 1941 proporcionan una prueba más rigurosa de la actividad de síntesis de
dextrano presente en Leuconostoc extractos. Durante las próximas dos décadas, un aumento de la actividad dio lugar a una rápida expansión
en el conocimiento de las propiedades de dextransacarasas. Aunque se hicieron una serie de mejoras en el aislamiento de la enzima durante
estos años, los primeros intentos para purificar la enzima B-512 (F) fueron descritos por Ebert y Schenk (90).

Su procedimiento implicaba precipitaciones metanol, cromatografía de fosfato de calcio y precipitación con sulfato de amonio y dio altas
actividades. se informó de valores de 2000 unidades por miligramo (U / mg) de dextrano residual. La purificación de la enzima fue
re-examinado por Robyt y Walseth (91). La eliminación del dextrano unido por tratamiento con una endo-dextranasa constituido un paso
importante y novedosa en la purificación. El concentrado de enzima muestra una actividad específica de 53 U / mg (recuperación 33%)
después de la ultrafiltración final. El examen de la enzima purificada por PAGE reveló sólo dos bandas, ambos de los cuales poseían
dextransucrase actividad. La banda más rápido fue asignado al monómero y la más lenta a los agregados. En reposo, los agregados
enzima purificada (91, 92). Levansacarasa y invertasa por ejemplo estaban ausentes de la preparación. La enzima impura no se
precipita mediante sulfato de amonio, incluso en 80% (w / v) (90). Itaya (93) informó que el enzima podría ser precipitado directamente a
partir del cultivo por sulfato de amonio proporcionado ovoalbúmina se añadió. La existencia de múltiples formas de dextransucrase de
B-512 (F) fue establecido por GPC y electroforesis. Un componente dando una única banda en PAGE y enfoque isoeléctrico fue aislado
e identificado como un dextransucrase. Se produjo un dextrano muy similar a la obtenida a partir de un cultivo de células (92). La
enzima purificada pierde rápidamente actividad a 4 ° C y, incluso a -15 ° C su actividad disminuyó en un 60% durante 20 días. La
enzima puede ser estabilizada, sin embargo, mediante la adición de dextrano pero una concentración mínima de 4 mg / ml se requiere.
La disparidad entre los informes en la literatura sobre la estabilidad de las preparaciones dextransucrase es, presumiblemente, atribuible
a las variaciones en las concentraciones de dextrano residuales. Las preparaciones liofilizadas de la enzima purificada parecen ser
estables indefinidamente (92). Para la purificación de Leuconostoc dextransacarasas, un tratamiento preliminar con dextranasa pueden
ser seguidos por una de varias técnicas. Polietilenglicoles (M W desde 400-6000) a concentraciones de 5% a 40%, respectivamente,
precipitar eficazmente la enzima (94). cromatografía de permeación en gel en Bio-gel A5M o Sepharose ™ 6B (94-96) y la cromatografía
de intercambio iónico en un gel de tipo DEAE (93-97) se han utilizado frecuentemente. Se encontró cromatografía hidrofóbica utilizando
O- celulosa (fenoxiacetil) que es ventajoso con los dextransacarasas B-1355 (94). McCabe y colaboradores (98) encontraron que
dextransucrase muestra una afinidad para Sephadex ™. Esta técnica también se ha aplicado Leuconostoc enzimas (99). La enzima
purificada, sin embargo, no muestra ninguna afinidad para Sephadex ™ G-100 (92).

15
3.1.2. propiedades

El dextransucrase altamente purificado aislado por Robyt y Walseth (91) parece ser una glicoproteína con manosa como el
azúcar preponderante. Sólo se detectaron trazas de glucosa. La importancia de los iones de calcio para la actividad de la enzima
ya había sido observado por Brock Neely y Hallmark en 1961 (100). Robyt y Walseth (91) encontraron que la actividad de la
enzima que había sido desactivado por incubación con EDTA sólo podía ser completamente restaurado por iones de calcio.
Sugirieron que la enzima era un metalloprotein calcio. la dependencia de calcio similar se ha observado para dextransucrase de Leuconostoc
mesenteroides IAM 1046 (93).

Los estudios sobre la naturaleza del sitio catalítico de la enzima sugieren que los fosfatos polyisophenol están involucrados (96, 101, 102).

El valor (284 000) para el MW de la B-512 (F) dextransucrase (90) es casi seguramente demasiado alta. Los preparados utilizados
pueden no haber sido totalmente libre de dextrano unido y también pueden haber sido agregados. En un estudio reciente de la enzima
B-512 (F), se informó de un valor para la enzima monomérica de 64 000 por electroforesis en gel de SDS (92). del MW reportado para
las enzimas estreptocócicas eran 94 000 para S. mutans 6715 (103) y 102 000 para S. sanguis 10.558 (96), aunque para

S. mutans HS-6, un valor de 170 000 ha sido citado (95). La actividad de la enzima depende, Entre otros, en pH. El pH óptimo se extiende

sobre un intervalo bastante estrecho, 5,0-5,3. A este pH, la enzima también es más estable y se encontró una muestra parcialmente

purificada de retener su actividad durante al menos 24 horas a 2 ° C (18, 104, 105).

3.1.3. Donantes de especificidad de sustrato

Dextransucrase es en muchos aspectos una enzima notablemente versátil. Una amplia gama de productos puede formarse dependiendo

de la naturaleza y las concentraciones de los sustratos donadores y aceptores. Se creía durante mucho tiempo que la sacarosa fue el único

sustrato natural para sacarasa dextrano. Sin embargo, durante los últimos años, una serie de otros donantes, tanto naturales como

sintéticos, han sido reconocidos. Por lo tanto Genghoff y Hehre (106) encontraron que una- fluoruro de D-glucopiranosil produce un dextrano

de alto peso molecular en presencia de dextransucrase de Leuconostoc mesenteroides B-512 (F) o Streptococcus DS var. De hecho, los

parámetros cinéticos para las reacciones eran prácticamente idénticos a los de sacarosa (107). Estos resultados son de particular interés,

ya que indican que la síntesis opera a través de transferencia de glucosilo de acuerdo con el mecanismo generalmente aceptado.

Lactulosucrose (O- una- D-galactopiranosil- (1 4) -O- una- D-fructofuranosyl- (2 1) - una- D-glycopyronoside) se informa para dar dextrano

cuando se incubaron con diversas sacarasas de dextrano Leuconostoc (108). Recientemente, Binder y Robyt (109) reportaron que el

p-nitrofenil una- D-glucopiranósido actuó como un sustrato donante para la forma dextransucrase (preparación purificada) Leuconostoc

mesenteroides B-512 (F) y Streptococcus mutans 6715. Los productos eran dextranos de alto peso molecular y glucósidos nitrofenılicos

isomaltodextrin. La tasa de transferencia era, sin embargo, mucho menor que el de la sacarosa. La evidencia se ha aducido que C-3, C-4 y

C-6 son sitios importantes para la unión de sacarosa a dextransucrase (110).

dieciséis
En 1960, Tsuchiya (13) observó que cuando dextrano y dextransucrase se incubaron en ausencia de sacarosa con aceptores adecuados,
por ejemplo la glucosa y la maltosa, se produjeron los oligosacáridos correspondientes. Llegó a la conclusión de que incluso dextrano podría
actuar como un donante y esto ha sido recientemente reafirmado por Binder y compañeros de trabajo (99). Por medio de un estudio
cromatográfico utilizando
enzimas purificadas, encontraron que panosa, isomaltotriosa y dextrano (M W aprox. 10 000), que son todos reconocido como buenos
aceptores, también actuó como donantes de glucosilo, y, en ausencia de sacarosa, oligosacáridos que ofrece.

3.2. Mecanismo

Para establecer el mecanismo de acción de dextransucrase, Robyt y compañeros de trabajo (111) utilizan una forma inmovilizada de la
enzima por una serie de experimentos de “pulso y persecución”. El dextransucrase soluble se une covalentemente a perlas de P2
Bio-gel mediante la técnica de etilendiamina glutaraldehído y después se incubó con una concentración baja de 14 C-sacarosa (pulso) y,
posteriormente, con una alta concentración de sacarosa fría (chase). Experimentos similares se realizaron con el

Leuconostoc las células a las que se une de forma natural la enzima.

Después de lavar a fondo el gel o células, los productos fueron liberados por tratamiento a pH 2 durante 10 min a 95 ° C. Sólo se
encontraron dos productos, a saber, dextrano y glucosa. Se estableció que la glucosa no era debido a la hidrólisis del dextrano
durante las operaciones de liberación. Tras el experimento de pulso, la actividad se encuentra tanto en la glucosa y el dextrano pero,
después del pulso y persecución, sólo en el dextrano.

Una parte esencial de las pruebas fue derivado mediante reducción e hidrólisis del dextrano producido. Se midió la actividad de la sorbitol y

glucosa producida. Después del pulso la relación de actividades para sorbitol / glucosa fue considerablemente más altos que los después del

experimento de pulso / persecución. por tanto, se propone un mecanismo para la biosíntesis en la que la enzima tiene dos funciones: en

primer lugar, la hidrólisis de la sacarosa y la unión del resto glucosilo, a partir de entonces, la construcción de la cadena de dextrano por un

mecanismo de inserción (véase la Figura 5).

GF sol FXG GF
X XG XG GG

productos

X XG X sol sol XG
GF GF

Fig 5. Dos mecanismo de sitio para la biosíntesis de cadenas de dextrano por dextransucrase. GF representa una molécula de sacarosa compuesto de
glucosa (G) y moléculas de fructosa (F). GG representa una( 1 6) vinculado residuos de glucosa. Los sitios de unión X de la enzima pueden no ser
estructuralmente similares (adaptado de Robyt et al. [ 111]).

17
El mecanismo puede resumirse como sigue:

1.Formation de los derivados de glucosilo en la enzima.

2. Ataque por el hidroxilo primario de un resto glicosilo en el carbono
anomérico del otro resto glucosilo para formar un disacárido.

3. Formación del derivado nueva glucosilo en el lugar desocupado.

4. Ataque por el hidroxilo primario de este último en el carbono anomérico del

disacárido para formar un trisacárido.

5. La repetición de estos procesos.

6. reacción de terminación.

Este mecanismo ha sido simulado con modelos moleculares (101). Aunque cierta crítica se ha dirigido al trabajo experimental
de Robyt y compañeros de trabajo, en particular, la pureza de la preparación de enzima, la baja actividad de las enzimas
unidas y el tiempo de incubación prolongado con
14 C-sacarosa, las conclusiones anteriores fueron sin embargo reivindicados. Ditson y Mayer (112), utilizando un dextransucrase altamente

purificada a partir de Streptococcus sanguis ATCC-10558, fueron capaces de confirmar que la glucosa fue incorporado en el extremo reductor de

la cadena en crecimiento. Con su técnica de acoplamiento, que fueron capaces de retener más del 80% de las secuencias de actividad y de

pulso enzimáticas de 10-30 s eran suficientes para efectuar la polimerización considerable. Ellos mostraron que los grupos terminales marcados

incorporados durante la fase de pulso corto disminuyeron bruscamente durante la persecución con sacarosa fría. Más elaborados experimentos

de pulso y persecución se han realizado con dos enzimas purificadas a partir de Streptococcus mutans. Los resultados fueron de nuevo

consistente con el mecanismo de inserción (113). Estos estudios (111-113) han confirmado ampliamente las propuestas anteriores de Ebert y

Patat (114, 115) en el que fue concebido primero el mecanismo de tipo “inserción”.

La forma glucosilada de la enzima se ha preparado y caracterizado por Mayer y colegas (116, 117).

3.3. reacciones aceptor

Un número de azúcares y derivados de azúcares funcionar como aceptores de glucosilo, en particular, maltosa, isomaltosa, metilo una- D-glucósido
y dextrano de bajo peso molecular (118, 119). Los experimentos con
14 C-glucosa, 14 C-fructosa y 14 maltosa C de extremo marcado en presencia y ausencia de sacarosa (120) confirmó la hipótesis de
que dextransucrase se une covalentemente grupos glucosilo y dextranosyl y que éstos son liberados de la enzima por el aceptor
por ataque en el extremo reductor. Este MECHNISM es consistente con las observaciones siguientes;

(1) la reacción de aceptor se produce en ausencia de sacarosa;

(2) la molécula aceptora se incorpora en el extremo reductor del producto; (3) los productos son dextranos y oligosacáridos
de bajo peso molecular (s); (4) como la relación del aceptor a los aumentos de sacarosa, la proporción de dextrano
disminuye y la de
aumentos de oligosacáridos.

serie homóloga de oligosacáridos se puede explicar suponiendo que cuando se forma cada miembro que actúa como un nuevo
aceptor, de ese modo dando lugar a la siguiente miembro superior de la serie.

18
Un estudio más detallado de la actividad aceptor de varios azúcares se llevó a cabo por Mayer y compañeros de trabajo (121). Los
investigadores estudiaron el curso temporal de la transferencia de glucosilo a estos aceptadores, y encontraron que la aparición de los
homólogos fue consistente con la transferencia secuencial de unidades glucosilo al aceptor.

Robyt y Eklund (101) enumeran 26 aceptores conocidos de diferente actividad y recientemente exploraron los aspectos cuantitativos de la
actividad aceptor en el sistema dextransucrase. Los productos eran dextrano y en ciertos casos una serie homóloga de
isomalto-oligosacáridos. La glucosa, siendo el producto de la reacción de aceptor de agua, también se encuentra en pequeñas cantidades.
Dos productos aceptores de fructosa siempre estaban presentes en pequeñas proporciones; leucrosa (O- una- D-glucopiranosil- (1 5)
-D-glucopyranse) aprox. 2% y la isomaltulosa (O- una- D-glucopiranosil- (1 6) -fructofuranose) aprox. 1%. Los productos de una reacción
aceptor serán, sin embargo, dependerá, Entre otros, de la proporción de aceptor al sustrato (122).

hallazgos de Walker (123) ahora pueden racionalizarse en términos de un mecanismo de aceptación. Se encontró que cuando 14 C-sacarosa
y un exceso de isomalto-oligosacáridos se incubaron con dextransucrase, el producto principal fue el siguiente homólogo más alta
con el marcador radiactivo unido al extremo no reductor.

Sin embargo, el problema se ha vuelto más complicada por las observaciones de que dextrano y una serie de oligosacáridos D-glucosilo
(por ejemplo, isomaltotriosa, panosa) puede de hecho servir tanto como donantes de glicosilo y aceptores para dextransucrase (99).
Curiosamente, también establecen que la enzima podría transferir unidades de glicosilo individuales a partir de dextrano a una molécula
aceptora. Más recientemente, Luzio y Mayer (124) han destacado la dependencia de la reacción del aceptor de la concentración. Se
informó de que a bajas concentraciones de sacarosa, 0,05 mM a 0,5 mM, la reacción del aceptor de agua se convirtieron significativa y la
hidrólisis de la sacarosa y la fructosa predominado sobre la síntesis de dextrano.

El hecho de que hidroliza dextrano sirve como un aceptor eficiente ya se había establecido en los años 50 (125, 126). Hehre (125)
encontró que un suplemento de 1 mg / ml de dextrano de bajo MW marcadamente bajó el MW del dextrano producido por
dextransucrase. Este hallazgo fue desarrollado por Hellman y sus colegas (126) en Peoria, que utiliza un suplemento de 2% de dextrano,
M W 17 600, y obtiene un rendimiento del 33% de un dextrano en el rango clínico. También encontraron que los rendimientos aumentaron
como el MW del dextrano añadido disminuyó. Utilizando 14 dextrano marcado con C, Mayer y sus colegas (121) encontraron que el MW del
dextrano aceptor aumentó significativamente durante la incubación con dextransucrase, confirmando de este modo su función como un
aceptor. Además, los datos cinéticos identificaron dextrano hidrolizado (M W aprox. 10 000) como uno de los más potentes aceptores con
un Km más bajo que el de la maltosa e isomaltosa y los tiempos de V 4-5 mayor que cualquier otro azúcar. por lo tanto sus resultados
corroboran los hallazgos anteriores de Robyt y Corrigan (127). La adición de dextrano (M W aprox. 70 000) a una enzima purificada, libre de
dextrano causó un aumento de 5 veces en la actividad (129). De los datos cinéticos, se concluyó que la unión de dextrano a la enzima
también aumenta la afinidad de la enzima para la sacarosa.

19
3.4. Derivación

Los intentos de racionalizar las actividades de ramificación de dextransucrase todavía se ven obstaculizados por un conocimiento
incompleto de ramificación en dextrano nativo. Ebert y sus colegas (15, 115, 128) habían propuesto originalmente un mecanismo de
ramificación basado en una reacción aceptor mediante el cual crecientes cadenas de dextrano (o cadenas de oligosacáridos) se
transfieren consecutivamente al dextrano aceptor por la enzima, lo que da lugar a un dextrano ramificada. Su hipótesis se basó en un
estudio de los productos obtenidos mediante la adición de un dextrano aceptor marcado radiactivo de M W aprox. 25 000, a la enzima
purificada y sacarosa (5%). Las enzimas de B-512 (F), se estudiaron B-1299 y B-1307. Se examinó la MWD de los productos (aunque no
cuantitativamente) y también se investigó la actividad específica. Los resultados demostraron claramente que el dextrano producido
contenía una molécula aceptora. Sin embargo, no se estableció la naturaleza de la nueva vinculación.

Una evidencia más convincente para el mecanismo de aceptación de ramificación fue acumulado por Robyt y Taniguchi (130) que,
utilizando-marcaje radioactivo, estableció la presencia de recién formado una( 1 3) enlaces. El patrón de marcaje fue consistente con el
mecanismo de aceptación anteriormente mencionado. Para tener en cuenta la presencia de ramas en un dextrano nativo, sintetizado por la
enzima y sólo sacarosa, se presume que las moléculas de dextrano libres se liberan en los medios de comunicación por reacciones aceptor
con glucosa o fructosa. El mecanismo de ramificación, que es esencialmente una reacción aceptor, se representa en la Figura 6.

XG X sol
GGG
n ()
+ GG GGG

X GGG X
n ()

GG GGG

Fig 6. Mecanismo para la formación de sucursales en dextrano B-512 (F). La secuencia --GG-representa parte de una
cadena de dextrano (adaptado de Robyt et al. [ 111]).

Todos los intentos para demostrar la presencia de una enzima de ramificación separado hasta ahora han fracasado. La presencia de
dextrano fuertemente unida sobre la enzima complica la purificación. Recientemente, la degradación de este dextrano obligado por una
endodextranase se ha hecho posible. De esta manera, Côté y Robyt (94) fueron capaces de separar dos enzimas extracelulares de Leuconostoc
mesenteroides
B-1355, una alternano de síntesis, un glucano con alterna una( 1 3) y una( 1 6) los vínculos y la otra síntesis de un dextrano
similar a B-512 (F).

Recientemente, sin embargo, Kobahashi y compañeros de trabajo (92, 129) demostraron que una dextransucrase purificada a partir de B-1416
sólo dio una única banda de proteína con actividad de dextrano-sintetización de página. Se aislaron también una proteína aparentemente
homogénea de-B 512 dextransucrase (F), que apareció como una única banda en PAGE y enfoque isoeléctrico. Esta enzima produce un
dextrano muy similares a los dextranos producidos por los preparados de enzimas estándar. Para tener en cuenta el hecho de que los
dextranos altamente ramificados, tales como B-742, tienen, ramas preponderantemente individuales, mientras que B-512 (F) tiene una baja
proporción de ramas más largas, Côté y Robyt (131) postularon que la mayor afinidad entre la aceptor y el sitio de unión en la enzima y el
aumento de la frecuencia resultante de la reacción de aceptor con respecto a la reacción de elongación de la cadena promoverán ramas más
cortas.

20
4. Producción de dextrano clínico y técnico

Dextrano de productos clínicos y técnicos se produce en los países más desarrollados de todo el mundo. cifras fiables sobre la
producción mundial anual de dextrano no están disponibles, pero una estimación basada en las unidades de dextrano clínico que se
consume en algunos países daría lugar a una cifra de más de 500 toneladas métricas.

En Occidente, la mayoría de los productores utilizan el Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 (F) o la cepa B-512 para la fermentación. En otras

partes del mundo, las cepas alternativas parecen utilizarse (132, 133). La mayoría de los productores principales de dextrano emplean un proceso

basado en la cultura de forma discontinua Leuconostoc

en presencia de sacarosa. El fluido de cultivo viscosa se precipita a continuación en etanol o metanol, tras lo cual el dextrano nativo obtenido
se hidroliza en ácido diluido y el dextrano deseado se aísla por fraccionamiento. A pesar de que el estado actual de la técnica ofrece
métodos alternativos de producción de fracciones definidas, la mayoría de los productores siguen operando un procedimiento introducido
hace unos 35 años. En la introducción de cualquier cambio, el productor debe estar convencido de que, no sólo es necesario que el nuevo
proceso de ser más eficientes en el hombre-poder y materiales, pero el producto final debe cumplir en todos los aspectos con los requisitos
médicos para la seguridad y la eficacia. El organismo, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 (F), es un miembro de la familia
Lactobacillaceae, género Leuconostoc y especies (mesenteroides 134). El organismo produce células esféricas u ovoides y clasifica como un
anaerobio facultativo gram-positiva. Aparte de dextrano y ácido láctico, que produce, Entre otros, dióxido de carbono, etanol, manitol y ácido
acético.

4.1. Fermentación

Aunque muchos azúcares, por ejemplo, el azúcar invertido de glucosa y maltosa, servirá como fuentes de energía para el crecimiento de las
bacterias, solamente sacarosa sirve para inducir la producción de dextransucrase (89, 104, 135-137). Por lo tanto los medios de cultivo se basa
necesariamente en sacarosa suplementado con varios requisitos nutricionales. El ácido nicotínico, tiamina, ácido pantoténico se ha encontrado
esencial para todos Leuconostoc y cistina, ácido glutámico, isoleucina y valina para Leuconostoc mesenteroides en particular, (138-141). En la
práctica, estos requisitos son satisfechos por extractos de levadura, licores de maceración de maíz, caseína hidrolizada ácido o extractos de malta
generalmente con la adición de peptona o caldo de triptona (104, 142-145). Jeanes (142) ha descrito la producción de laboratorio de dextrano en
detalle excelente. Los dextranos obtenidos a partir de cultivos utilizando extracto de levadura, extracto de malta o extracto de hígado,
respectivamente, fueron similares (145). Es digno de mención que incluso a concentraciones de nutrientes una cuarta parte de los empleados
generalmente en las fermentaciones, los rendimientos de dextrano se mantuvieron sin cambios aunque se requieren tiempos más largos (146).

Además de la presencia de diversos cationes, se añaden sales de fosfato (por ejemplo, dihidrógeno fosfato de sodio o fosfato de
hidrógeno) al 0,5%. Para 2% licores de maceración de maíz, Tsuchiya y compañeros de trabajo (104) encontrado 3,5% de potasio
dihidrógeno fosfato óptima. Sin embargo, la producción de biomasa en 0,1% y 1% de fosfato se encontró que eran idénticas. Además la
desintegración en dextransucrase actividad entre 12 y 24 horas fue mucho menos con fosfato 0,1% (147).

En el laboratorio, se reivindican culturas sacudido para dar rendimientos consistentemente más altos que los cultivos fijas (104).

21
4.2. Elaboración de dextransucrase

Los factores que influyen en la elaboración de la enzima han proporcionado una zona fértil de estudio.

4.2.1. pH

El pH afecta a la producción de la enzima por el organismo, la actividad de la enzima y su estabilidad. Por desgracia, estos óptimos no
son idénticos. valores de pH iniciales para los medios de fermentación en general se encuentran entre 6,7 y 7,2. Tsuchiya (104)
observó que la producción vigorosa de la enzima comenzó después de aprox. 6 horas cuando el pH había caído 6,9-6,4 (véase la
Figura 7).

pH
7 dextrano 11

6 20 9

mg de dextrano / ml mg
5 16 7
de sacarosa / ml

4 12 pH 5

3 48 3

sACAROSA
2 0
1 2 3
Dias

Fig 7. Los cambios en la concentración de sacarosa, pH, y la concentración de dextrano durante la fermentación de Leuconostoc
mesenteroides ( 137).

Ellos mostraron, además, que se obtuvo la actividad enzimática máxima (tal como se mide mediante la reducción de la liberación de

azúcar en condiciones de incubación estándar) en cultivos mantenidos a pH 6,7. Tsuchiya y colegas (119) recomienda la adición de álcali

al cultivo para mantener un pH de 6,7 hasta que la actividad enzimática máxima se alcanza, después de lo cual se permite que el pH

caiga a aprox. 5, en donde la enzima adquiere su máxima actividad y la estabilidad (véase la sección 4.3.1).

4.2.2. la concentración de sacarosa

Se estableció en una fase temprana de que, para concentraciones de sacarosa de 0,5% a 8,0%, el aumento de los niveles de sacarosa que ofrece

aumento de las actividades dextransucrase (104, 136). El aumento de la actividad dextransucrase es más marcado en las concentraciones de sacarosa

de hasta 2%; a partir de entonces los incrementos son correspondientemente menor. Alsop (18), sin embargo, no fue capaz de confirmar una correlación

entre los niveles de sacarosa y actividades dextransucrase. López y Monsan (148) encontraron que la alimentación continua de la sacarosa a la cultura

condujo a rendimientos de dextransucrase aumentado considerablemente. Sin embargo, en la selección de la concentración óptima de sacarosa, el

rendimiento y calidad del dextrano producido también deben ser tomadas en consideración (ver sección 4.3).

22
4.2.3. Hora

Los rendimientos máximos de dextransucrase se registran aprox. 6-8 horas después del inicio de la fermentación (104, 105, 147, 148).
Después de ello, la inestabilidad de la enzima de pH> 6,2 contribuirá a una disminución de la actividad.

4.3. Biosíntesis de dextrano

4.3.1. pH

La actividad de síntesis de dextrano de la enzima presenta un máximo a pH 5,2, que es considerablemente menor que para la
elaboración óptima de la enzima en cultivo (104, 119, 149-151). Es, quizás, fortuito que la enzima también exhibe una estabilidad
máxima en el intervalo de pH 5-6,5 (105, 119, 149, 151-153). La estabilidad de la enzima es, sin embargo, depende de la presencia
de otras sustancias, de las cuales dextrano de alto peso molecular actúa como un estabilizador por excelencia ( 154). A medida que
avanza la fermentación, el pH cae desde el valor inicial, 7.2, a aprox. 5 dentro de 20 horas debido a la liberación de ácidos
orgánicos, por lo tanto, la creación de un entorno favorable para la síntesis de dextrano. Aunque la neutralización periódica (pH 6,7)
del cultivo con 5-10 N de hidróxido de sodio a fin de aumentar los niveles de dextransucrase ha sido recomendada, hay poca
evidencia de que esto también conduce a rendimientos mejorados de dextrano de alta calidad (104, 135, 143, 155). PH alto (8) y
baja temperatura (20 ° C) parecen favorecer la formación de levan (3).

4.3.2. la concentración de sacarosa

Muy poco dextrano se produce en cultivos de células a concentraciones de sacarosa de menos de 2%; concentraciones más altas pueden influir

significativamente en el rendimiento, la distribución de peso molecular, y la estructura del dextrano. Hehre (144) demostraron que la concentración

(0,5-5%) de sacarosa creciente proporcionó rendimientos de dextrano incrementó. Los estudios detallados sobre los efectos de la concentración más

alta (10-50%), aunque en su mayoría en sistemas libres de células, han revelado que los rendimientos de dextrano de alto MW disminuyen en

consecuencia con los correspondientes incrementos en las proporciones de dextrano de bajo peso molecular (18, 119, 126 , 149). Los rendimientos

de dextrano (M W < 5000) obtenida a diversas concentraciones de sacarosa se muestran en la Tabla 4. Los datos de las concentraciones más altas de

sacarosa se derivan de estudios de enzimas como las células no florecen a concentraciones de sacarosa> 20-25%.

sacarosa Rendimiento de dextrano

concentración (%) % (G / 100 g de sacarosa) ref.
18 árbitro. 107

2 45.9 -
5 44.4 -
10 39 38
20 17.9 -
30 - 17
50 - 2.5

Tabla 4. Efecto de la concentración de sacarosa en el rendimiento de dextrano.

23
El material restante se compone de mono- y oligo-sacáridos y baja de dextrano de PM. datos precisos sobre las distribuciones de peso
molecular de estas fracciones es deficiente. Un factor de complicación adicional es la observación de que la relación de derivación disminuye
al aumentar la concentración de sacarosa. Por lo tanto, a una concentración de sacarosa de 30%, la relación de (1 6) Enlaces a NO (1 6)
enlaces fue 29 mientras que a 5% de sacarosa, el valor fue de 8,5 (156). Estos valores fueron obtenidos por oxidación con peryodato y no han
sido confirmadas por las técnicas modernas.

4.3.3. Temperatura

Los estudios publicados utilizando dextransucrase concentrados, suponiendo que se pueden extrapolar a condiciones de células enteras, sugieren
que la temperatura puede influir en el proceso de muchas maneras: (a) rendimiento de dextrano de alto MW; (B) velocidad de formación; (C) MWD
y la estructura de dextrano formadas. El rendimiento de dextrano de alto MW disminuye a temperaturas más bajas (intervalo de 25 ° C a 4 ° C) con
un aumento concomitante en la fracción de MW bajo (119, 126). Curiosamente, el rendimiento global no parece cambiar (véase la Tabla 5).

Temperatura. ° C Total dextrano% bajo MW% Alta MW%

30 45.9 21.2 24.7

15 47.4 43.4 4.0
4 47.2 45.9 1.3

Tabla 5. Efecto de la temperatura sobre la MWD de dextrano (126). % Se basa en sacarosa añadida. Los
rendimientos de dextrano de bajo y alto MW se determinaron por precipitaciones con etanol
fraccionarios.

A temperaturas superiores a 35 ° C, Hehre y Sugg (152) encontró que el rendimiento de dextrano fue considerablemente menor que a 23 ° C.

Por encima de 32 ° C, la enzima es inestable (149, 151-153). Los estudios cinéticos (149, 157) utilizando un concentrado de enzima mostraron

que la tasa (V max) aumento de 10 veces entre 0 ° C y 32 ° C para las concentraciones de sacarosa del 2 al 6%. Tsuchiya y compañeros de

trabajo (119) observaron que el tiempo requerido para la conversión completa a 15 ° C fue el doble que a 30 ° C. Para fines prácticos, una

temperatura de aprox. Se recomienda 25 ° C. A esta temperatura el dextrano se puede recuperar después de 24-28 horas (135, 142, 143,

158). Los estudios basados ​en dispersión de luz, viscosidad y enzimas han establecido que la ramificación aumenta con la temperatura de

síntesis en el intervalo de 0-30 ° C (159, 160).

4.3.4. Calcio

La dependencia de la actividad dextransucrase en el calcio se observó por primera vez por Brock Neely y Hallmark (100), aunque por la
enzima a partir de arabinosaceous Betacoccus. Más tarde, la dependencia de calcio de dextransucrase ( Leuconostoc mesenteroides IAM
1046) se confirmó pero los rendimientos de dextrano no se mejoró en presencia de un exceso de calcio (93). Jeanes (135) anterior había
informado de que ni el rendimiento ni la viscosidad del dextrano parecían ser mejorado mediante la inclusión de carbonato de calcio 2% en el
medio de cultivo.

Robyt y Walseth (91) informaron de un aumento del doble en los niveles de enzimas en cultivos de células enteras en presencia de cloruro de
0,001-0,1% de calcio (véase la Figura 8). Lopes y Monsan (148) encontraron que las actividades de dextransucrase elaborados en 0,005 y cloruro
de calcio 0,05% fueron similares. Al considerar los efectos del calcio, es importante tener en cuenta que la solubilidad de hidrogenofosfato de
calcio en agua es de sólo 31 mg / 100 ml. En la práctica, la cantidad de calcio puede ser separó por filtración después de la adición de fosfato.

24
 2.0 0.2

biomasa

1.5 0.15

0,05% CaCl 2
dextransucrase (U / ml)

Turbidez (550 nm)

1.0 0.1

0.5 0.05
sin CaCl 2

2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)

Fig 8. La producción de dextransucrase extracelular en ausencia de cloruro de calcio y en presencia de cloruro de

calcio 0,05%. La biomasa fue similar en ambos casos (adaptado de Robyt y Walseth [91]).

4.3.5. Hora

A diferencia de varios otros cepas de Leuconostoc, prolongación de las culturas B-512 (F) más allá de 24 horas conduce a una disminución en el
peso molecular del dextrano nativo aislado (135, 158). Cuando se le permitió una fermentación continúe durante 273 horas, el dextrano
resultante tenía un M W de 8,6 millones en comparación con 39 millones después de 23 horas. El rendimiento total de dextrano era sin embargo
sin cambios (158). En cultivos de células enteras, una disminución significativa en la viscosidad relativa después de aprox. se encontró 50 horas
de fermentación, en cuyo momento el rendimiento había alcanzado su máximo (143). Braswell y compañeros de trabajo (156, 161) no detectaron
ninguna disminución en MW (dispersión de la luz) durante la síntesis enzimática pero la escala de tiempo de sus experimentos es incierto. Del
mismo modo, Tsuchiya y colegas (119) informaron poco cambio en MW del dextrano elaborado por un concentrado de enzima.

25
4.4. fracciones clínicas

La conversión de dextrano nativo a fracciones clínicos refinados abarca dos operaciones clave.

1.El hidrólisis parcial de dextrano nativo a productos que contienen tamaños

moleculares apropiados.

2.Fractionation por medio de etanol o metanol para dar dextranos

clínicos.

Las fracciones más comúnmente utilizados en la medicina tienen M W de aproximadamente 70 000 o 40 000 en las monografías
oficiales, las especificaciones de tamaño molecular se estipulan en términos de los límites para los valores medios de la distribución
total y del 10% alto y 10% bajo metanol precipitó fracciones. Estos valores se expresan en términos de la M W o [ h]. Para una revisión
autorizada ver Nilsson y Söderlund (162). Así, el objetivo primordial de los fabricantes es alcanzar rendimientos máximos de
reunión dextrano estas especificaciones en lo que respecta tanto MWD y pureza.

4.4.1. hidrólisis ácida parcial

Después de los estudios pioneros de Ingelman y Halling (163) en la hidrólisis y fraccionamiento de dextrano, los estudios extensos y
detallados sobre los parámetros que influyen en la hidrólisis de dextrano nativo B-512 (F) y el fraccionamiento de los productos apareció en
1954-5 ( 164, 165). Se encontró que sólo mejoras marginales en los rendimientos máximos de las fracciones de dextrano clínicos podrían
alcanzarse mediante la variación de la naturaleza y concentración del ácido, el tiempo y la temperatura para la hidrólisis y la naturaleza del
disolvente orgánico usado para el fraccionamiento. A pesar de la llegada de las técnicas modernas de gran alcance para el estudio de las
distribuciones, han aparecido unos nuevos estudios. Basedow et al. ( 166), el estudio de los aspectos cinéticos de la hidrólisis de fracciones
estrechas (M W 738 000, 72 700, y 4 380) concluyeron que la constante de velocidad era dependiente de la ubicación del enlace en la cadena,
siendo más reactivos a la hidrólisis ácida que aquellos en el centro de los enlaces en los extremos. Este postulado se confirmó por análisis
de productos utilizando GPC (167).

Jones y colaboradores (168) encontraron que las constantes de velocidad para la isomaltosa y dextrano son 12,3 h- 1

y el 3,9 h- 1, respectivamente, lo que implica que el MW de hecho influyó en la tasa de hidrólisis. La constante de dextrano tasa correspondía
a un grado de hidrólisis de menos de 2% (basado en enlaces escindidos / bonos en total). Cuando se considera la hidrólisis de dextranos
nativos, especialmente los que están sólo ligeramente ramificada, la contribución de estos efectos a la distribución del producto es
presumiblemente mínima en vista del gran tamaño de las moléculas y el hecho de que estamos tratando con un grado de hidrólisis de 1,5%
(bonos escinden enlaces / total). Las condiciones de hidrólisis son por tanto elegidos principalmente con respecto a los factores
operacionales y la economía.

4.4.2. procedimientos de fraccionamiento

Después de la hidrólisis, la fracción clínico deseado es aislado por precipitaciones fraccionadas. Wolff y colaboradores (164) encontraron
que una fracción clínica podría ser precipitado entre 39-46% de etanol; para el metanol se deben utilizar límites ligeramente más altas
(42-50%). El fraccionamiento requiere un control cuidadoso de la temperatura si buena reproducibilidad se va a obtener. Usando las mismas
condiciones de fraccionamiento, el rendimiento y M norte de las fracciones obtenidas a 20 ° C fueron 20% y 32 400, respectivamente, y a 30 °
C, 33% y 47 600, respectivamente (164). El rendimiento inferior a 20 ° C es debido al hecho de que más de dextrano aparece en las
fracciones no clínicos a la temperatura inferior. La sedimentación de dextrano sobre

26
fraccionamiento ha sido recientemente interpretado en términos de modelos matemáticos (169). La dependencia de la solubilidad del
dextrano en mezclas de etanol / agua en el MW se muestra en la Figura 9 (55). Para ayudar a la coagulación y la sedimentación del
precipitado dextrano, cloruro de sodio (2% basado en el presente dextrano) se debe añadir.

METRO w

10 5

10 4

10 3
30 40 50 60 70
% etanol

Fig 9. La solubilidad del dextrano en mezclas de etanol / agua a 25 ° C. Ellos w eje se refiere a los límites de
solubilidad superiores para dextrano (adaptado de Basedow y Ebert [55]).

4.5. Seguro de calidad

Aunque dextranos clínicos están sometidos a muchas pruebas para la pureza química y biológica (incluyendo inmunológica), el MWD
es reconocida como una de las propiedades críticas de duración de la fracción y sus efectos biológicos. El desarrollo de la
cromatografía de exclusión molecular (GPC), por primera vez para el control de dextrano por Granath (170-173), proporciona una
determinación rápida y cuantitativa de la distribución. Otros estudios sobre GPC para la medición de las distribuciones de dextrano y un
análisis crítico de los errores sistemáticos y aleatorios involucrados ha sido presentado por Nilsson y Nilsson (174). Alsop (175, 176) y
Nilsson (177) han evaluado el valor de GPC en el control de calidad de dextranos clínicos.

En las monografías para Dextran 40, 60 y 70 que han sido recientemente incluidos en Ph.Eur (3 rd ed.) y USP24 (sólo Dextran
40 y 70), un método GPC reemplaza ahora el método de precipitación obsoleta para controlar la distribución.

Además de los controles mencionados anteriormente, otras pruebas de rutina para la aceptación de soluciones de infusión, por ejemplo
pirógenos, partículas, el color y la esterilidad, deben llevarse a cabo. Con los años, sin embargo, los estudios sobre posibles impurezas han
continuado.

27
En estudios dirigidos a la detección de macromoléculas contaminantes, Richter (178) era incapaz de levantar PCA anticuerpos reactivos
con el sobrenadante se centrifugó de un hidrolizado de crudo de nativo Leuconostoc mesenteroides B-512 (F) de dextrano o un dextrano
clínico purificada (M W 70 000), ya sea en conejos o cobayas y llegó a la conclusión de que las impurezas inmunogénicas estaban ausentes.
Sin embargo, otros estudios basados ​en invertido de inmunodifusión radial simple (RSRI) usando antisueros de alto título contra el
componente celular (libre de dextrano) de Leuconostoc mesenteroides revelado la presencia de antígenos en muestras clínicas de varios
países (179). Desde entonces, algunos fabricantes han eliminado con éxito estas impurezas de sus productos. El hallazgo de que el
antígeno reacciona de forma cruzada con manano de levadura indicó que el antígeno es, presumiblemente, un mannano-péptido (179).
Hedin (180) ha examinado el papel de los contaminantes biológicamente activos en dextranos clínicos y otros de la cepa B-512 (F) por
medio del bioensayo anaphylatoxin rata, la in vitro prueba de Limulus y el ensayo de pirógenos en conejos. Considerando que estas pruebas
sensibles dieron reacciones positivas en dextranos de calidad técnica, los productos clínicos (Macrodex y Rheomacrodex) no respondieron.

4.6. Estabilidad en solución

Los estudios sobre la estabilidad química de dextranos clínicos a pH 4,5 a 7, cuando se almacena durante varios años a temperaturas de 4 ° C a 40 ° C,

reveló que el dextrano tiene una excelente estabilidad (181, 182). Incluso cuando severamente manejado con, por ejemplo, hasta a los ciclos de hielo /

deshielo 50 de congelación, no se observaron cambios significativos en MWD, la capacidad de pH y tampón (183) (véase la Tabla 6).

Tratamiento METRO W METRO norte METRO W / METRO norte

Muestra de referencia 69 500 41 500 1.67

Congelación / descongelación 67 400 40 300 1.67

Tabla 6. Efecto de ciclos de congelación / descongelación en dextrano

Lafrenz (184) investigó la estabilidad de dextranos comerciales en varios frascos de vidrio y de plástico y se encontró que los cambios en [ h] eran

insignificantes más de 1 año (20 ° C y 40 ° C). Poco después de la producción a gran escala de dextrano clínico se puso en marcha, se hizo

evidente que los copos tendían a formar en una pequeña proporción de las botellas. La formación de escamas se agravó por ciclos de congelación

/ calentamiento pero sólo unos pocos miligramos de la cantidad total presente apareció fo formar copos. Los copos generalmente volvieron a

disolver en la calefacción (185, 186). Los estudios han confirmado que las escamas tienen una MWD similar a la de dextrano soluble en la botella.

La tendencia para la asociación molecular ordenada en dextrano se ha demostrado por Jeanes (67) usando patrones de difracción de
rayos-X. La cristalinidad se mejoró en fracciones de dextrano hidrolizadas particularmente después del tratamiento con 60-70% de etanol.
Otra prueba para la asociación intermolecular dependiente del tiempo en una fracción de dextrano 40 se ha aportado por Aizawa y
colaboradores (187) usando 1 H-RMN, mediciones de viscosidad y de IR, aunque usando concentraciones bastante altas 10-50%.

28
4.7. Futuros desarrollos

dextrano nativo generalmente se produce por lotes en cultivos celulares. Sin embargo, un número de procesos alternativos se han
ideado, por ejemplo (1) el uso de extractos de enzimas libres de células; (2) fermentaciones en presencia de aceptores; (3) procesos
continuos.

Se descubrió hace unos 30 años por Hehre (125) y Tsuchiya (188) que un suplemento (1 mg / ml) de dextrano de bajo MW para el fluido de

cultivo marcadamente afectada el PM del dextrano producido. Este descubrimiento fue explotada adicionalmente por Tsuchiya y compañeros

de trabajo (119) y Nadel (146). Un rendimiento del 33% de dextrano clínico se ha obtenido a partir de un concentrado de enzima (126).

Pocos fabricantes parecen haber adoptado esta técnica. Las razones son muchas; (1) la fracción clínico principal invariablemente parece

estar acompañado por una fracción muy alto MW; (2) los rendimientos no pueden exceder los obtenidos mediante procedimientos estándar;

(3) un proceso separado para la producción de la dextrano de bajo MW debe idear; (4) nuevos datos de seguridad para apoyar la

conmutación debe ser ensamblado. La producción de dextrano por dextransucrase inmovilizada ha dado resultados prometedores a escala

de laboratorio (148, 151, 155, 189). Un dextrano clínico ha sido producido por esta técnica (155). Estudios para mejorar los métodos

existentes de despolimerización y fraccionamiento han continuado. Los informes de Basedow y Ebert y colegas (166, 190-192) sobre los

efectos de estrés o de ultrasonido de cizallamiento, ya sea solo o en combinación con la hidrólisis ácida, son de particular interés a este

respecto. Estos autores han examinado también los productos que se forman por la acción de una endo-dextranasa (193). Hay indicios de

que estos procedimientos dan lugar a un producto menos polidispersa. técnicas de etanol fraccionamiento convencional son engorrosos y

consume mucho tiempo. Producción de ultrafiltración escala ha estado disponible desde hace muchos años. Por desgracia, esta técnica

también tiene sus limitaciones; tal vez el más grave es que los dextranos presentan una mala selectividad con estas membranas a causa de

su capacidad de deformarse dentro de los poros de la membrana (194). Recientemente, sin embargo, Alsop y compañeros de trabajo (195)

han descrito un proceso que implica la GPC, la ultrafiltración e intercambio de iones para el fraccionamiento eficaz de un hidrolizado de

dextrano.

29
30
5. Historia de las aplicaciones médicas

5.1. dextrano 70

A principios de 1940, al mismo tiempo que Stacey y sus asociados (196, 197) en Birmingham estaban estudiando dextranos bacterianas y
Hehre y colegas (89, 152) en los EE.UU. fueron persiguiendo el dextrano actividad productora de extractos libres de células de Leuconostoc,
un bioquímico sueco joven, B. Ingelman, en el Departamento de Bioquímica y Química Física, Universidad de Uppsala comenzaron a
investigar los polisacáridos y proteínas de jugo de remolacha azucarera.

Uno de los episodios críticos fue el descubrimiento de dextrano en una muestra infectada del jugo. Esto inició una serie de
investigaciones sobre el polisacárido (198). A finales de 1942, un recién titulados
MD, A. Grönwall, se unió al laboratorio para estudiar la tuberculina. Se está dedicando un esfuerzo considerable en el momento de
la liofilización del plasma sanguíneo para la medicina militar. En el espacio de meses, y Ingelman Grönwall habían tropezado con la
idea de utilizar un dextrano hidrolizado como un sustituto del plasma. Después de los estudios sobre la hidrólisis parcial,
fraccionamiento, y extensos estudios biológicos, una compañía farmacéutica sueca adoptó el proyecto en 1943, y ese mismo año,
comenzó los ensayos clínicos preliminares. En 1944, bajo la dirección del cirujano, G. Bohmansson, extensos ensayos clínicos se
iniciaron en el Hospital Regional en Örebro. El dextrano utilizado en ese momento se derivó de Leuconostoc mesenteroides, 7E
cepa, y fue ligeramente más ramificada que la actual. En 1947, cerca de cuatro años después de la innovación, una solución al 6%
de una fracción de dextrano había sido aprobado para uso clínico en Suecia y, poco después, en el Reino Unido, un logro que sería
inconcebible bajo el actual clima regulador.

El producto fue gradualmente mejorada y fue designado Dextrano 70. Muestras del producto sueco pronto fueron probados clínicamente en
los EE.UU.. Mientras tanto, en el Departamento de Agricultura de EE.UU., Northern Regional Research Laboratory en Peoria, Allene
Jeanes había estado llevando a cabo estudios sobre los dextranos que iban a tener una influencia importante en el curso de los
acontecimientos (199, 200). Durante estos estudios, se ha establecido que una cepa de Leuconostoc mesenteroides aislado de una botella
infectada de la cerveza de raíz por RG Benedict y designado NRRL B-512 era un productor de dextrano vigorosa y su dextrano se sólo
ligeramente ramificada. En 1949-1950, un gran interés entre el gobierno estadounidense y las autoridades médicas y la defensa de los
Dres. Jeanes, Tsuchiya, y Koepsell en Peoria, estimularon un programa de investigación multidisciplinaria en el NRRC para proporcionar
información básica sobre la producción de un expansor de volumen de la sangre sintética a partir de dextrano. El progreso fue rápida y a
finales de 1951, cuatro compañías americanas estaban produciendo dextrano de la subcepa NRRL B-512 (F) para fines clínicos.

Numerosas otras dextranos habían sido comparados pero B-512 (F) se consideró clínicamente superiores y técnicamente
como un expansor del volumen plasmático. Este subcepa había sido aislado de la cepa original B-512 en 1948 por WC
Haynes mediante la selección de colonias con características de crecimiento vigorosas. Las actividades de estas colonias
fueron seguidos a través de los ciclos de crecimiento repetidos y los mejores resultados se obtuvieron de un crecimiento en
un matraz Fernbach, que de este modo dio lugar a la designación (F) (199). La producción de dextranos clínicos desde
entonces ha crecido de manera constante en todo el mundo. Dextrano 70 es generalmente comercializado como una
solución al 6% en solución salina normal y, como tal sigue manteniendo su posición en todo el mundo como el expansor del
volumen plasmático de elección. Se recomienda para el tratamiento de choque o inminente choque debido, por ejemplo, a
la hemorragia, quemaduras, cirugía o trauma (201-203).

31
5.2. dextrano 40

La introducción en 1961 de un producto de dextrano adicional, dextrano 40, siguiendo una sugerencia de Ingelman y Gelin (206, 207), fue
una consecuencia directa de las observaciones anteriores de indirecta y Thorsen (208) en el eritrocito desagregar propiedades de dextrano
de M W < 50 000 y el informe clásico por Gelin en los trastornos circulatorios después de un traumatismo y choque (209). El interés en este
producto fue estimulado por el hallazgo importante que las fracciones de bajo MW también imparten propiedades de mejora del flujo
sanguíneo por reducción de viscosidad de la sangre y la inhibición de la agregación de eritrocitos (210, 211). Aunque se observó el efecto
desagregación óptima alrededor de M W 25 000, un dextrano 40 fue finalmente elegido con la debida consideración a la excreción renal.

El efecto antitrombótico de tanto Dextran 40 y 70, demostrado experimentalmente por Gelin y sus colegas (212) y clínicamente por
Koekkenberg (213), proporciona un tratamiento profiláctico de la trombosis venosa profunda y embolia pulmonar fatal
post-operatorio. Una dosis no superior a 20 ml / kg peso corporal de dextrano 40 (10% en solución salina normal) se recomienda
durante las primeras 24 horas en pacientes sometidos a cirugía de alto riesgo o que sufren de alta trauma riesgo

5.3. dextrano 1

Con el aumento del uso de dextranos clínicos, siguió un aumento en el número de informes de reacciones anafilactoides
dextraninduced (DIARs). La incidencia de numerosos estudios varía de 0.03-4.7% (214). Como estas reacciones son a veces, aunque
raramente, que amenaza la vida, un estudio de colaboración se llevó a cabo entre 1968 y 1981 para dilucidar los mecanismos
subyacentes DIARs. Desde que se muestran reacciones graves estar mediada anticuerpo, se examinó la idea de aplicar el principio de
inhibición de hapteno. Después de una amplia animales y ensayos clínicos, una fracción monovalente hapteno de dextrano (M W 1 000)
se introdujo en 1982. Un pequeño volumen (20 ml de una solución al 15%) se administró antes de la infusión de dextrano 40 o 70.
ensayos multicéntricos han demostrado que la incidencia de DIARs graves se reduce así considerablemente (214).

5.4. Hierro-dextrano

El valor terapéutico de los preparados de hierro coloidales se informó por primera vez en la década de 1950 por Londres y Twigg (215). Se han

hecho numerosos intentos para mejorar estas preparaciones de hierro (216-218). Así dextrano ([ h] 0.05) se calienta primero con álcali, y luego se

neutraliza en presencia de solución de cloruro férrico. Los estudios sobre este producto han revelado que cada partícula consiste en un núcleo

central de hierro, aproximadamente 3 nm de diámetro, rodeado por una funda de dextrano de aproximadamente 13 nm de diámetro (219, 34). El

complejo se visualiza como una partícula formada por una funda de protección de dextrano unido por unidades de ácido metasaccharinic terminales

a una si- núcleo FeOOH. Una solución de este complejo que contiene 5% de hierro y 20% de dextrano (Imferon ™) es adecuado para la inyección

intramuscular e intravenosa para el tratamiento de la anemia por deficiencia de hierro. El producto se utiliza ampliamente en la actualidad para el

tratamiento de la anemia en lechones recién nacidos.

El uso de estas preparaciones ha sido re-examinado en los seres humanos y un dramático aumento en la hemoglobina fue reportado
después de la infusión intravenosa. La solución se administra mejor junto con soluciones de glucosa (220-222).

32
5.5. El sulfato de dextrano

El sulfato de dextrano (sulfato de hidrógeno de dextrano, sal de sodio) ha sido probado como un sustituto potencial para la heparina en la
terapia anticoagulante (223). Después de los estudios por Ingelman (224), Walton y Ricketts (225-227) exploró las propiedades
anticoagulantes de una amplia gama de sulfatos de dextrano (M W 7 000 a
458 000) y establecieron que los productos de peso molecular más bajos muestran las más altas propiedades anticoagulantes. Sin embargo, en el mejor

de esto sólo representaba 15% de la actividad de la heparina.

La toxicidad de estos productos se ha reconocido en una etapa temprana. Sin embargo, una fracción de bajo peso molécula con M W 7 000 y S,

16% se consideró ser cualitativamente similar a la heparina (228, 229). Los ensayos clínicos preliminares fueron desafortunadamente

desalentador y revelaron reacciones graves adversos, en particular, rigidez en las articulaciones y dolorosas, erupción de la piel, pérdida de

cabello y los síntomas gastrointestinales (230). En estudios de toxicidad crónica en animales, se observó retraso en el aumento de peso y la

osteoporosis con fracturas espontáneas (231, 232). Cabe señalar que las dosis en los ensayos clínicos correspondían a 1,3 g / día, que es

aproximadamente diez veces la utilizada en la terapia de heparina actual. Con la introducción de la terapia de heparina a dosis bajas para

profilaxis de la trombosis en los años 70 (233-235), el interés en polianiones de bajo peso molecular se ha reavivado y han aparecido informes

sobre las interacciones con los sistemas de enzima / inhibidor individuales en la cascada de coagulación (236, 237) (véase también 6.5.1). El

sulfato de dextrano inmovilizado sobre celulosa se ha encontrado para eliminar el colesterol LDL preferentemente durante plasmaféresis (238).

5.6. Dietilaminoetil dextrano (DEAE-dextrano)

McKernan y Ricketts (239) informaron originalmente la preparación y propiedades de DEAE-dextrano, una preparación con M W aprox.
500 000 tiene, en una dosis oral diaria de 2-3 g, ha demostrado que efectuar una reducción en el colesterol sérico y los triglicéridos en 8
y 14%, respectivamente (240). Esta dosis debe ser comparado con las dosis considerablemente más grandes (4 x 4 g al día) de las
resinas catiónicas insolubles (por ejemplo, colestiramina ™) que se deben tomar para lograr efectos comparables. han aparecido más
informes sobre la farmacología de DEAE-dextrano (241, 242).

5.7. disoluciones de perfusión

El trasplante de órganos en los últimos años ha hecho grandes avances. La necesidad de preservar la viabilidad de órganos para
trasplante es urgente. Uno de los requisitos de una solución de perfusión es que debe ser iso-osmótica con el fluido intracelular. La
adición de dextrano de bajo MW 5-10% ha demostrado ser beneficiosa en preservar isoosmolality y buenos resultados se han obtenido
con el riñón, el hígado y perfusiones córnea (243-247).

33
5.8. Debrisan

Debrisan ™ es un agente de cicatrización de limpieza preparado en forma de perlas por la polimerización en emulsión de
dextrano con epiclorhidrina. El producto actúa por absorción (aprox. 4 ml / g) exudado de la herida en la secreción, heridas
infectadas, úlceras y llagas, acortando así el tiempo de curación. La idea, que ejemplifica una de las muchas innovaciones
casuales en la industria farmacéutica, fue concebido en 1972, cuando Ulf Rothman en el Hospital General de Malmö,
Suecia estaba investigando las proteínas en el exudado de las glándulas sudoríparas apocrinas en los pacientes que sufren
de sudoración axilar excesiva (248). El exudado se recogió inicialmente con papel de filtro, pero más tarde se utilizó
Sephadex G-25. Un paciente con úlceras infectadas gravemente mostró una marcada mejoría después de la aplicación de
este material. Esta observación inspiró Rothman y sus colegas (249,

5.9. Hyskon

Una solución 32% de Dextrano 70 se estabilizó en 10% de glucosa ha demostrado ser valioso como un medio de distensión en histeroscopia

quirúrgica (254, 255). También se ha demostrado para prevenir la formación de adherencias de tejido postoperatorias después de la cirugía de

trompas o abdominal (256-258).

34
6. Las aplicaciones generales de dextrano y sus derivados

En esta sección, se han seleccionado ejemplos de aplicaciones comerciales conocidas de productos de dextrano y ejemplos de
aplicaciones con efectos técnicos o biológicos probadas. Un factor que ha restringido el uso comercial generalizado de dextrano es el
precio, que es algo mayor que la mayoría de los productos de almidón y de celulosa en el mercado. Los dextranos son por lo tanto más
probable encontrar aplicación en alta calidad o productos de alta tecnología.

6.1. fracciones de dextrano

La demanda de dextranos técnicos de la industria ha mostrado un aumento significativo en la última década. Desde sacarosa hogar, frutas o

bebidas de frutas podrían estar contaminados con restos de dextranos, la ingestión de dextranos, aunque en pequeñas cantidades, puede no ser

infrecuente. Dextran NRRL B-512 (F) es degradada por bacterias dextrano de reparto en el intestino humano y la mayoría de los productos de

hidrólisis puede ser absorbida para producir un rápido aumento de azúcar en la sangre y el glucógeno del hígado (259-262). Sin embargo, en la

industria alimentaria, donde se patentaron innumerables aplicaciones de dextranos en los productos alimenticios en los años 50 y los años 60, sin

aplicación parece que se hayan interpuesto y los estudios toxicológicos obligatorios para obtener la aprobación de la FDA no fueron realizados. De

ahí que en 1977, se eliminó el GRAS (generalmente reconocido como seguro) de estado de dextranos (263-265). Dextranos no están permitidos en

el Reino Unido o en Europa como aditivos alimenticios, y no parece haber sido considerada por el Comité Mixto FAO / OMS de Expertos en Aditivos

alimenticio (JECFA) dextranos. Los dextranos son, sin embargo, consideran tan seguro como componentes de los materiales de envasado de

alimentos.

fracciones de dextrano no parecen ser incluido en las listas de aditivos permitidos (ingredientes) para formulaciones farmacéuticas,
tales como pomadas y cremas de uso tópico y las tabletas y las cápsulas para uso oral. Sin embargo, proporcionar la
documentación correspondiente se presenta, no existen a priori
razones por las que no se pueden utilizar. De hecho, varios productos en los que se utiliza una fracción de dextrano como un ingrediente no activo

están en el mercado.

fracciones de dextrano purificado con alta claridad y bajos niveles de cloruro de encontrar amplias aplicaciones en la industria fotográfica. La
adición de bajas concentraciones de dextrano a la emulsión de plata se encuentra para mejorar significativamente la calidad de las
imágenes. El efecto es presumiblemente atribuible al efecto de dextrano sobre la conformación de las moléculas de gelatina.

Desde Albertsson (266) reveló el enorme potencial de los sistemas de polímeros de 2 fases, especialmente los sistemas de
dextrano-PEG, para la partición de partículas subcelulares y macromoléculas, un inmenso número de aplicaciones ha evolucionado.
Estos sistemas ofrecen un medio de fraccionamiento más allá de la gama de técnicas convencionales. Algunas aplicaciones recientes
son: la separación de células de sangre periférica (267), eritrocitos distintivas de pacientes con esclerosis múltiple (268), la separación
de enzimas, por ejemplo pululanasa, a partir de células Klebsiella pneumoniae ( 269), y la partición de linfoblastos murinos (270).

El dextrano se ha recomendado como un agente crioprotector para las células humanas, animales y vegetales (271-273). Por lo tanto se encontró una

mezcla de 5% de sulfóxido de metilo y 9% de dextrano 70 para proporcionar crioprotección óptima de las células humanas de médula ósea

comprometidos madre (273).

35
El efecto de los dextranos como adyuvantes para prolongar el bloqueo anestésico local ha sido un asunto de debate. Los
primeros resultados habían demostrado ser algo contradictoria (274-276). Recientes nuevo examen por Hassan y colegas
(277-278) ha revelado que la prolongación del efecto del anestésico depende del anestésico utilizado, el PM del dextrano, y el
tipo de derivado de dextrano utilizado. se ha obtenido una prolongación de hasta 350%.

6.2. Sephadex

La introducción de Sephadex en 1959 anunció una nueva era en la ciencia de la separación. El concepto de cromatografía de permeación
en gel (GPC) se desarrolló lentamente y los acontecimientos clave que conducen al descubrimiento de Sephadex puede atribuirse a
Ingelman's Los primeros estudios sobre la reticulación de dextrano, la posterior patente por Flodin y Ingelman (279) en el preparación de
geles reticulados y la explotación de sus propiedades de filtración de gel por Flodin y Porath (280).

Tal vez el caso más crítico fue la síntesis de estos geles en forma de perlas con tasas considerablemente mejoradas de flujo (281), una innovación
que condujo a la aceptación inmediata de estos geles en la tecnología de separación. Varios tipos de Sephadex están actualmente disponibles,
cada una con un intervalo de fraccionamiento característica. El gel más porosa, Sephadex G-200, fraccionará proteínas en el M r rango 4 0-800 000,
mientras que el límite superior de Sephadex G-25 es 5 000. Aunque los geles de Sephadex son ampliamente utilizados para el fraccionamiento y
purificación de biopolímeros, la desalinización constituye una de las aplicaciones más importantes. En este contexto, la desalación se refiere
también a amortiguar las operaciones de cambio y la eliminación de impurezas de bajo peso molecular distintos de las sales. Sephadex G-25 se
utiliza ahora para el desalado o tampón de intercambio en muchas operaciones a gran escala (282). los productores de insulina utilizan Sephadex
G-50 para eliminar de proinsulina y la proteasa impurezas en las etapas finales de purificación de la especie porcina o bovina insulinas (283, 284).

La estructura de Sephadex G-25 ha sido recientemente investigado por Holmberg (285) y las siguientes características estructurales
novedosas han salido a la luz.

1.Only 4% de las unidades de glucosa están reticulados.

Se identificaron 2.Eight elementos estructurales diferentes, incluyendo varios éteres de glicerilo de glucosa
y estructuras cíclicas que contienen 1, los anillos de 4-dioxano. Dos de estos fragmentos están
representados por debajo de 3 y 4.

3,80% de las perlas consiste en dextrano.

O O O
O O O
O OH O

OO HO O
OH
HO OO
HO HO
O O

3 4

Un número de aniones de alta capacidad y intercambiadores catiónicos basados ​en Sephadex han sido preparados y están disponibles
comercialmente. El sulfopropil y cuaternizado DEAE (QAE) derivados pueden ser utilizados para la separación de sustancias que sólo se
cobran a de extremos de pH, mientras que el DEAE y carboxymethylderivative se pueden utilizar para las gamas intermedias.

36
Estos geles se emplean ahora comercialmente para el fraccionamiento de proteínas plasmáticas, en particular, albúmina de suero

humano, factores de coagulación sanguínea, la inmunoglobulina G y haptoglobulin (282) y estas técnicas chromatograpic están

reemplazando gradualmente mayores fraccionamientos por lotes. Para la separación según el tamaño molecular en medios orgánicos, se

desarrolló un derivado hidroxipropilo de Sephadex LH-20. Esto facilita la separación de los lípidos, las hormonas, ácidos grasos etc.

6.3. preparaciones de dextrano-hemoglobina

hemoglobina libre de estroma sería ostensiblemente parecen proporcionar el sustituto de la sangre ideal. Los estudios han demostrado, sin
embargo, que la hemoglobina no modificada se excreta demasiado rápidamente por los riñones (286-287). La preparación y propiedades de los
complejos de dextrano-hemoglobina preparados por reacciones consecutivas con bromuro de cianógeno, diamina de etileno, bromuro de
bromoacetilo, y, finalmente, la hemoglobina se han estudiado (288, 289). Un complejo que contiene aprox. 1: 1 proporciones molares de
hemoglobina para Dextrano 20 se aclaró lentamente de la circulación (aprox. 20% después de 4 horas) (290). Se encontró, sin embargo, que el
oxígeno se une mucho más estrechamente que en la hemoglobina y el potencial de suministro de oxígeno de estos complejos necesita ser
explorado más. Aunque se encontraron los complejos a ser no inmunogénica en las especies homólogas (con respecto a la hemoglobina) (291),
los riesgos inherentes a la activación del sistema inmune a la fracción de dextrano aún no se han estudiado. Este enfoque puede, sin embargo,
permitir que las células rojas obsoletos para ser utilizado con ventaja (292).

6.4. Los conjugados de dextrano con sustancias biológicamente activas

Una cuenta de la investigación en esta área, que abarca el acoplamiento de fármacos, enzimas, hormonas, y anticuerpos, merecería un

capítulo a sí mismo. Molteni (293, 294) y Rogovin (295) han examinado algunas de las fascinantes facetas de este tema. Los objetivos

de la conjugación con dextrano son varias:

1. Para prolongar la vida útil del componente activo

2. para aumentar su estabilidad

3. para facilitar la orientación de la droga

4. a deprimir la antigenicidad del resto de proteína

La búsqueda de procedimientos de acoplamiento leves ha proporcionado un terreno de mucho ingenio. El procedimiento clásico,
informado por Porath y colaboradores en 1967, en la activación de polisacáridos con bromuro de cianógeno todavía se usa ampliamente
(296-298). El mecanismo se representa en la Figura 10.

37
 jefe

O NH 2

OH OH CNBr OH OCN OO
2 NH

NH
OCO

Fig 10. La activación de dextrano produciendo las estructuras intermedias 1, carbamato de 2,

imidicarbonate lineal y 3, imidocarbonato cíclico. Este último es el más reactivo.

Muchos procedimientos de acoplamiento alternativos desde entonces se han ideado, por ejemplo a través de la activación

1,1'-carbonildiimidazol (299), aminación reductora (300), isocianuros (301) y carbonatos cíclicos

(302, 303).

Marshall (304) ha revisado la preservación de las enzimas por acoplamiento a dextrano. Estudios sobre conjugados entre dextrano y una-
amilasa o tripsina han establecido que los conjugados adquieren mayor resistencia a la inactivación por calor, a proteinasas y a la
acción de inhibidores. El tiempo de vida de un 70 conjugado de asparaginasa-dextrano se prolongó de 20 veces, en vivo, mediante el
cual un paciente con leucemia linfoblástica fue capaz de agotar asparaginasa plasma durante aprox. 100 días en comparación con 7
días de asparaginasa en sí mismo (305). Los conjugados entre dextrano y una serie de peptidasas del suero se han preparado, G2 por
ejemplo carboxipeptidasa (306, 307), calicreína (308), y fibrinolisina (309). La conjugación de citostáticos a dextrano se ha explorado y,
en muchos casos, estos conjugados se muestra una alta absorción celular, buena actividad y menor toxicidad. Estos efectos son, en
parte, atribuible a la absorción preferencial de dextrano por los lisosomas y la mayor actividad endocítica de las células tumorales (310).
El acoplamiento de daunomicina (311, 312), metotrexato (313), daunorubicina (314), mitomicina C (315-317) y 7-desazaguanina (318)
se ha descrito.

Larsen (319, 320) ha utilizado derivados de dextrano O-benzoil como compuestos modelo para el estudio de la cinética y el
mecanismo de la hidrólisis del éster en el plasma. Se concluyó que la hidrólisis no está mediada por enzimas. Factores que afectan
a la liberación de metronidazol y el naproxeno de conjugados de dextrano han sido investigados (321-323).

Se han reportado intentos exitosos para acoplar a la insulina dextrano (324, 325). La acción hipoglucemiante del complejo se afirma

que es superior y más prolongado que el de la propia insulina. El acoplamiento de polen de ambrosía antígeno de A a dextrano ha

reducido la alergenicidad y la antigenicidad de los alérgenos en un factor de 7 (sobre una base molar). Este efecto fue, sin embargo,

insuficiente para justificar más estudios clínicos (326).

38
Antes de que el potencial clínico de estos dispositivos puede ser plenamente explotado, la seguridad de estos compuestos se debe documentar.

1.How Cómo afecta la sustitución del metabolismo y la toxicidad de la compañía? Se sabe que
incluso bajos grados de sustitución pueden retardar seriamente el metabolismo y la
eliminación del cuerpo.

2. ¿Está la inmunogenicidad del complejo mejorado (327)?

3.Can sustancia activa suficiente estar acoplado al dextrano de modo que los niveles
terapéuticos se pueden alcanzar sin el uso de concentraciones excesivamente altas del
conjugado?

6.5. derivados de dextrano

6.5.1. El sulfato de dextrano

Alguna referencia a esta sustancia en relación con sus efectos sobre la coagulación ya se ha hecho en la sección 5.5. Su amplia
gama de propiedades biológicas ha atraído la atención de muchos científicos. Los informes pueden ser agrupados de acuerdo a
los siguientes efectos biológicos.

a. inhibición de la enzima, la activación y la liberación

efecto b.Adjuvant sobre la respuesta inmune

C. interacciones y respuesta celular

EFECTOS DIG sobre la infectividad del virus

Esta clasificación es necesariamente bastante arbitraria como, en muchos casos, los efectos biológicos observados son el resultado de dos

más de estas actividades. Los estudios relativos a las enzimas constituyen, con mucho, el grupo más grande con aproximadamente la mitad

que demuestran efectos y medio inhibitorios, efectos de activación. En cada caso particular, hay que subrayar que los efectos observados

dependen no sólo de la MW y DS del sulfato de dextrano, sino también de la concentración, el pH y la fuerza iónica. A menos que se indique lo

contrario, un sulfato de dextrano con M W de 500 000 y MD alto aprox. 2 se ha utilizado en la mayor parte de los estudios.

a. Efectos sobre las enzimas

Los efectos inhibitorios se han reportado, Entre otros, hialuronidasa (328), LH-sensible adenilato ciclasa (329), PGE 1- ciclasa sensible
ciclasa (330, 331), humano una- glucosidasa (332), la ornitina descarboxilasa, que desempeña un papel clave en el crecimiento celular
(333), una- amilasa y dextranasa bacteriana (334). sulfatos de dextrano son inhibidores potentes no competitivos de la elastasa
leucocitaria humana, una enzima que puede estar implicado en la degeneración del cartílago (335). La actividad parece aumentar con
el aumento de MW y DS. Informes sobre la activación de enzimas por sulfatos de dextrano son igualmente numerosos. Si estamos
tratando aquí con la inhibición de un inhibidor en el sistema es incierto.

39
El sulfato de dextrano parece estimular las siguientes enzimas, dependiente de AMP conejo músculo fosforilasa b (336),
tirosina-3-monoxygenase (337), uroquinasa (338), calium dependiente de ATP-asa (339), y cerebro de rata triptófano hidroxilasa (
340).

Numerosos estudios sobre el espectáculo cascada de la coagulación que tanto la activación y la inhibición pueden ser operativos. Por lo tanto
el sulfato de dextrano se ha encontrado para activar la polimerización de monómero de fibrina (341), ATIII (342), la conversión de precalicreína
a calicreína (343-345) y la fibrinolisis (346, 347). Sin embargo, la calicreína (344), la conversión de fibrinógeno en fibrina (341) y trombina (348,
349) parece ser inhibida por sulfato de dextrano. Estos efectos pueden ser, Entre otros, dependiente de la concentración.

si. Efectos sobre la respuesta inmune

Muchos informes sirven para ilustrar que el sulfato de dextrano interfiere de muchas maneras con la respuesta inmune. La evidencia de
que es un mitógeno de células B estimulando la proliferación de células B y de este modo se ha presentado la respuesta inmune
(350-354). Sin embargo, en vivo, sulfato de dextrano (ip, 50 mg / kg) se ha encontrado para aumentar la susceptibilidad de los ratones a la
infección bacteriana (355-357). Estas observaciones se han atribuido a los efectos tóxicos de sulfato en los fagocitos mononucleares (357,
358). Incluso a concentraciones bajas (20 mg / ml), la exposición de los macrófagos para sulfato de dextrano conduce a una acumulación
en los lisosomas secundarios y una inhibición de la fusión interacción fagosoma-lisosoma (354-361) y por lo tanto puede interferir con las
enzimas responsables de matar bacterias (362). Aumento de la permeabilidad de los linfocitos con fugas excesivas de componentes de
bajo MW también puede ser un factor importante (363-365). El sulfato de dextrano también induce la movilización de linfocitos B y T

en vivo ( 366-369).

C. Efectos sobre los virus

Los informes sobre los efectos del sulfato de dextrano sobre la infectividad del virus y el crecimiento (como con el crecimiento del tumor) son
contradictorios. Efectos variables se indican con los virus de fiebre aftosa (370). se inhibieron virus del herpes simple (371). Aunque el sulfato de
dextrano inhibe la liberación de viriones de las células (372), una combinación de lipopolisacárido y sulfato de dextrano induce su liberación a
partir de células de bazo de ratón (373). En vivo, la resistencia de los animales de experimentación a la infección viral se potenció por sulfato de
dextrano (374, 375).

En 1987, la actividad antiviral de sulfato de dextrano frente al virus de la inmunodeficiencia humana se estableció VIH-1 (376, 377).
La actividad óptima, in vitro, se obtiene con un peso molecular (M W) de aprox. 10 000 y DS 2 (378, 379). El sulfato de dextrano con M W de
aprox. 7000 es, sin embargo, pobremente absorbida en el intestino (380) y no se sabe si las concentraciones terapéuticas se pueden
obtener por esta vía.

re. Toxicidad

La toxicidad de un sulfato de dextrano de bajo MW, administrado por vía intravenosa, se ha mencionado en la Sección 5.5. Más
recientemente la atención se ha centrado en la toxicidad de la sustancia administrada por vía oral. Los suplementos de 0,25% y 0,5%
durante 82 semanas en ratas no aumentó la incidencia de infección o tumores (381). Las dosis más altas (1-10%) dio lugar a la
mortalidad y los tumores (382, 383). Aparte de la dosis, la toxicidad depende también de MW (384).

estudios de adsorción en el intestino utilizando una amplia gama de sulfatos de dextrano (3 000-200 000) sugieren solamente se absorbe una
pequeña proporción de la dosis (385-387). La administración intravenosa también ha sido investigado (388). La inhibición de la metástasis por
sulfato de dextrano (M W 6-7 x 10 3, DS aprox. 2) se ha probado clínicamente pero la tasa de supervivencia de 5 años en el cáncer de pulmón no
mejoró (389, 390). Las pruebas de mutagenicidad y citogenicidad de sulfato de dextrano de bajo MW resultaron negativos (391).

40
mi. La manipulación genética

Finalmente, alguna mención debe hacerse de la aplicación exitosa de sulfato de dextrano en la manipulación de genes, donde se ha
convertido un reactivo de particular valor para la aceleración de la hibridación de fragmentos de ADN (392-394); para acelerar la
transferencia de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa (394); y para la detección de virus de mamífero recombinantes en
placas (395).

6.5.2. DEAE-dextrano

La reacción de cloruro de dietilaminoetilo con dextrano en álcali proporciona un derivado en el que tres tipos de grupos amino
cargados se pueden distinguir (396, 397): el sustituyente único DEAE con pK una 9.2; el grupo terciario con pK una 5,5; y el grupo
cuaternario en el grupo tándem que se disocia en todos los valores de pH.

Al igual que los polianiones, los policationes también exhiben una amplia gama de propiedades biológicas interesantes. En particular,
DEAE-dextranos parecen mejorar una serie de procesos celulares. Muchos informes (398-401) testimonio de la mejora de la captación
celular de ARN viral y también partículas de virus intactas. considerable interés se ha centrado en la producción mejorada de interferón
por los complejos de polirribonucleótidos en presencia de DEAE-dextrano (402-404). Estos procesos parecen operar sin efectos
perjudiciales sobre la viabilidad de las células (398). Hasta qué punto estos efectos se deben a la interacción entre la superficie de la
célula (carga neta negativa) y el policatión es incierto. Para la mayoría de estos estudios, una columna de DEAE-dextrano con M W aprox.
500 000 y DS 0.5 ha sido utilizado en concentraciones de 10-500 mg / ml.

Informes sobre sus efectos en el crecimiento del tumor son contradictorios. Larsen y Thorling (405) encontraron que la incubación de 4 tipos
diferentes de células tumorales con DEAE-dextrano impide la proliferación de células en animales de experimentación. Sin embargo, Mincheva
(406) no encontró efectos significativos en la metástasis de carcinoma pulmonar en ratas. Rice y compañeros de trabajo (407) reportaron que
las inyecciones repetidas de DEAE-dextrano (500 g) en ratones inducidos sarcomas.

6.5.3. dextranos marcados con fluoresceína

isotiocianato de fluoresceína reacciona con dextrano para dar un derivado fluorescente (408) que ha demostrado ser útil como un trazador
macromolecular en los estudios de la microcirculación y, en particular la permeabilidad, vascular en salud y enfermedad.

Las técnicas desarrolladas en los años 70 (409-412) han sido explotados para estudiar permeabilidades de capilares del cerebro (413), conducto

pancreático (414), la córnea (415), la vasculatura de la retina (416), y el músculo esquelético (417).

41
6.6. Microportadores para el cultivo celular

En 1967, van Wezel (418) informó del uso de DEAE-Sephadex A-50 como un microvehículo para el cultivo de células animales dependientes
de anclaje. Sin embargo, estas microesferas no eran ideales para el crecimiento de células especialmente a concentraciones microportadores
más altos (> 2 mg / ml). Estudios posteriores (419-422) estableció que el grado óptimo de sustitución para el crecimiento celular era aprox. 1,5
meq / g, que era considerablemente más baja que la del intercambiador de iones entonces disponible. Varios microvehículos basados ​en
dextrano reticulado están ahora disponibles comercialmente: (1) un microvehículo con DEAE-grupos distribuidos por toda la matriz (Cytodex ™ 1);
y (2) un microvehículo a la que una capa de colágeno se adjunta (Cytodex ™ 3). La tecnología de microportadores ahora se emplea
comercialmente para la producción de, entre otros, los virus, vacunas y productos celulares tales como el interferón.

6.7. 99m Tc-dextrano

Technetium parece compleja fuertemente con dextrano y, como tal, ha sido probado como un agente para linfoescintigrafía con
resultados prometedores en la pierna, los ganglios linfáticos pélvicos y paraaórticos (423-
425). El pertecnato radio-marcado se reduce primero con el ion estannoso y después se añadió a dextrano para producir el complejo de
tecnecio.

42
7. Análisis de dextrano

La elección del método será dictada por la sensibilidad requerida, la naturaleza de la muestra y, posiblemente, por el peso
molecular de la presente dextrano.

En la industria del azúcar, el método de alcohol neblina se utiliza comúnmente (426, 427), pero puede ser sustituido por un método de cobre más
específica (428).

Muchos métodos se han ideado para medir dextranos clínicos en suero y orina. Los métodos generalmente implican la eliminación
de proteínas por el ácido pícrico (429) o el ácido tricloroacético (430) seguido por la precipitación de dextrano con reactivo alcalino
de cobre (430), o-toluidina-ácido acético (431), o etanol (429).

El dextrano puede ser entonces determinado por el reactivo de antrona (429, 432), turbidimétricamente (433), polarimétricamente
(434) o como azúcar reductor después de la hidrólisis (431). Numerosas mejoras a estos métodos han aparecido en la literatura
(435-437). Un procedimiento que emplea glucosa oxidasa se ha descrito (438).

Una determinación inmunoquímica específica y sensible se ha desarrollado que detecta las concentraciones de dextrano a
2,5 g / ml (439).

8. Agradecimientos

Estoy en deuda con los Dres. Aleno Jeanes, Kirsti Granath, el difunto profesor Björn Ingelman y Kerstin Nilsson por su
inestimable ayuda.

43
44
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 Información sobre pedidos
El dextrano nativo

Producto Tamaño del paquete Numero de código.

El dextrano nativo Polvo 20 kg 30-0464-10

Solución de dextrano nativo (jarabe) 1000 l IBC * 30-0464-20

* Bulk Container IBC = Internacional

El dextrano técnico

Producto Tamaño del paquete Numero de código.

T10P 40 kg 10-4276-01
T20P 40 kg 17-0260-07
T40P 40 kg 17-5102-07
T45P 40 kg 17-5188-01
T70P 40 kg 17-0281-01

Las fracciones de dextrano

Producto Tamaño del paquete Numero de código.

Dextrano 1 ( METRO W 1000) 5 kg 10-1663-05

30 kg 10-1663-01
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextrano 3,5 ( METRO W 3500) 40 kg 10-1657-01

Dextran 5 (M W 5000) 100 gramos 10-1654-04
500 g 10-1654-05
5 kg 10-1654-06
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextran 10 ( METRO W 10 000) 100 gramos 17-0250-01

500 g 17-0250-02
5 kg 17-0250-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextran 20 ( METRO W 20 000) 100 gramos 17-5239-01

500 g 17-5239-02
5 kg 17-5239-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextran 40 ( METRO W 40 000) 100 gramos 17-0270-01

500 g 17-0270-02
5 kg 17-0270-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextran 70 ( METRO W 70 000) 100 gramos 17-0280-01

500 g 17-0280-02
5 kg 17-0280-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextran 110 ( METRO W 110 000) 500 g 17-0290-02

5 kg 17-0290-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextran 500 ( METRO W 500 000) 100 gramos 17-0320-01

500 g 17-0320-02
5 kg 17-0320-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con su representante local

Dextrano 2000 ( METRO W 2 000 000) 100 gramos 17-0330-01

500 g 17-0330-02
5 kg 17-0330-03
Para volúmenes mayores, por favor, póngase en contacto con el representante local se

CB dextrano 40 kg 10-1659-01

60
Los dextranos clínicos

Producto Tamaño del paquete Numero de código.

Dextrano 1 Sustancia 5 kg 10-1663-05

30 kg 10-1663-01
* NDC no. 63297-841-30 30 kg 10-1663-02 EE.UU.

Para volúmenes mayores, cita previa solicitud

Dextrano 10 Sustancia 100 gramos 17-0251-01

500 g 17-0251-02
5 kg 17-0251-03
40 kg 17-0251-07
Para volúmenes mayores, cita previa solicitud

Dextrano 40 Ph Eur 5 kg 10-4309-06

20 kg 10-4309-04
40 kg 10-4309-01
Para volúmenes mayores, cita previa solicitud

Dextrano 40 USP
* NDC no. 63297-821-05 5 kg 10-4309-05
* NDC no. 63297-821-20 20 kg 10-4309-03
* NDC no. 63297-821-40 40 kg 10-4309-02
Para volúmenes mayores, cita previa solicitud

Dextrano 60 Ph Eur 40 kg 10-4280-01

Dextrano 70 Ph Eur 5 kg 10-4279-06

20 kg 10-4279-04
40 kg 10-4279-01
Para volúmenes mayores, cita previa solicitud

Dextrano 70 USP

* NDC no. 63297-811-05 5 kg 10-4279-05

* NDC no. 63297-811-20 20 kg 10-4279-03
* NDC no. 63297-811-40 40 kg 10-4279-02

Dextrano 40 Sustancia JP 40 kg 10-4310-01

Dextrano 70 JP Sustancia 40 kg 10-4278-01

* EE.UU. NDC: Código Nacional de Medicamentos

sal de sodio de sulfato de dextrano

Tamaño del paquete Numero de código.

100 gramos 17-0340-01

500 g 17-0340-02
1 kg 17-0340-08
5 kg 17-0340-03
40 kg 17-0340-20

Para cantidades mayores, póngase en contacto con su representante local.

sal de sodio 10 Sulfato de dextrano

Tamaño del paquete Numero de código.

1 kg 17-0345-08
5 kg 17-0345-03

61
 DEAE-dextrano

Tamaño del paquete Numero de código.

100 gramos 17-0350-01

500 g 17-0350-02
1 kg 17-0350-09
5 kg 17-0350-03

Para volúmenes más grandes, póngase en contacto con su representante.

62
Percoll, Sephadex, Sepharose, Sephacyl, Ficoll, Ficoll-Paque y Cytodex, son marcas comerciales de Amersham Biosciences Limited o sus subsidiarias.

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Todos los bienes y servicios se venden de conformidad con los términos y condiciones de venta de la empresa dentro del grupo de Amersham

Biosciences que les suministra. Una copia de estos términos y condiciones están disponibles bajo petición. © Amersham Biosciences AB 2003 -

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Amersham Biosciences KK, Sanken Bldg. 3-25-1, Hyakunincho Shinjuku-ku, Tokio 169-0073 Japón

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