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[FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA II Y LAB.

] UNIDAD II

Componentes de un examen microbiológico :

• a. Muestreo : de forma adecuada y siguiendo unos protocolos , las muestras tienen que ser
estadísticamente significativas y por eso se llevan a cabo planes o programas de muestreo .

• b. Método Analítico : hoy en día existen muchos , elegimos el más sensible para detectar lo que
queramos y se busca también que sea económico .

• c. Interpretación de resultados : por eso hay que saber el significado de los microorganismos .

Muestreo

• Es la sucesión de pasos para asegurar que la muestra posea las características esenciales del 1
lote.

Muestra

• Una porción de material tomada y seleccionada de tal forma que sea representativa del lote
(IUPAC).

• La muestra seleccionada para el análisis debe ser representativa del lote entero del alimento y lo
suficientemente grande para poder llevar acabo todas las determinaciones.

• La técnica de análisis sea ejecutada con estricto apego a la metodología establecida.

• Comparación con normas o estándares de calidad

Criterios Generales de Muestreo.

• Todo el material que se use debe esterilizarse y envolverse.

• Al colectar la muestra hay que evitar contaminación del ambiente (polvo, tierra, agua, saliva).

• Rotular o etiquetar.

• Consignar información que pueda afectar la prueba o el significado del resultado. Por ejemplo la
presencia de algún conservador, olor, color, condiciones de conservación, temperatura.

• Para muestras sólidas se recomienda un peso de 100 gramos. Si se encuentra a granel o en


recipientes o piezas grandes habrá que retirar porciones de diferentes puntos para integrar una
muestra representativa. O bien manejar varias muestras independientes de áreas que se considere
pueden tener mayor riesgo.

• Cuando se trata de productos sólidos es necesario someterlos previamente a una suspensión ,


utilizando un eluyente estéril y una posterior homogeneización con la finalidad de liberar los
microorganismos presentes en el producto . Esto es una tarea difícil , en los cuales los
microorganismos suelen estar adheridos a las partículas .

• En productos como carne y pescado deben tomarse muestras de la superficie y profundas


(minimizando la contaminación de la superficie).

• En alimentos congelados se pueden usar sacabocados para tener muestras sin descongelar.

• Transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeración (2-8°C) o en congelación si son


alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda contaminar el alimento.
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• Reducir el tiempo comprendido entre recolección y entrega de la muestra.

• Muestras líquidas deben encontrarse homogéneas, emplearse de 100 a 500 ml.

• Obtención de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda de bisturí y


pinzas, uso de hisopos inertes estériles humedecidos en solución diluyente estéril.
Para determinar anaerobios estrictos se debe exponer lo menos posible a la atmósfera y usar
líquidos de dilución con bajo potencial redox como el medio de Stuart (con tioglicolato) o medio
enriquecido para clostridios (con cisteína).

• Si la toma es de un agua de grifo , hay que considerar que estos pueden contaminarse fácilmente a
partir del medio ambiente , y en sus partes internas pueden desarrollarse microorganismo 2
formando un , por lo tanto , es importante que el grifo se limpie adecuadamente y se deje
correr abundante agua . Los grifos de metal o cerámica , pueden ser desinfectados durante el
flameado con un soplete . Los grifos no resistentes al calor , deben ser desinfectados utilizando el
alcohol o la lejía . Después de la desinfección se abre el grifo y se desecha la primera porción ,
dejando fluir el agua durante 1-2 minutos antes de recogerla en el recipiente estéril , este
permanecerá cerrado hasta el momento de llenarlo y posteriormente será cerrado
convenientemente en condiciones asépticas . Es importante dejar un espacio aéreo en el recipiente
, al menos de 2’5 cm , para poder agitarlo fácilmente , porque es muy importante la
homogeneización .

Diluyentes de uso general

• Agua peptonada 0.1% pH 6.8-7

• Solución amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7

• Solución de Ringer

• Medio enriquecido para clostridios

• Solución de sacarosa al 20% o NaCl al 15%, osmófilos y halófilos respectivamente.

NUTRICIÓN MICROBIANA

Los microorganismos, para su crecimiento y desarrollo, deben tomar del medio las sustancias que
necesitan para la síntesis de su material celular. Esta síntesis requiere del gasto de energía, por lo que
también deben obtener ésta del medio ambiente. De esta forma, todas las sustancias empleadas por la
célula como fuente de materia prima para la biosíntesis y la generación de energía, son denominadas
nutrientes.

NUTRIENTES

Los nutrientes que requiere una célula para su crecimiento se pueden clasificar en los siguientes grupos:

 Macronutrientes: carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno.


 Micronutrientes: fósforo, potasio, azufre, magnesio.
 Vitaminas y hormonas
 Elementos traza: zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto.
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Tipos de nutrición

Como se planteó anteriormente, la nutrición microbiana debe llenar dos necesidades básicas de la célula:
el suministro de carbono para el mantenimiento de su composición y el suministro de energía para la
actividad metabólica.

Teniendo en cuenta estos aspectos, los diferentes tipos de nutrición microbiana se clasifican:

1. Según la naturaleza del donador de hidrógeno (para obtención de energía):


 Orgánica: Organótrofos. 3
 Inorgánica: Litótrofos.

2. Según la combinación del origen del carbono y del donador del hidrógeno:
 Fotoorganótrofos: Obtienen el carbono del CO2 y la energía de la luz radiante y de donadores
de hidrógeno orgánicos.
 Fotolitótrofos: Obtienen el carbono del CO2 y la energía de la luz radiante y de donadores de
hidrógeno inorgánicos.
 Quimioorganótrofos: Obtienen el carbono y la energía de la oxidación de compuestos
orgánicos y donadores de hidrógeno orgánicos.
 Quimiolitótrofos: Obtienen el carbono y la energía de la oxidación de compuestos orgánicos y
de donadores de hidrógeno inorgánicos.

CLASIFICACION DE LOS ORGANISMOS SEGUN SU FUENTE DE CARBONO Y ENERGIA

FUENTE DE ENERGÍA FUENTE DE CARBONO

 FOTOTROFOS LUZ
 QUIMIOTROFOS QUÍMICA
 AUTOTROFOS CO2
 HETEROTROFOS COMPUESTOS ORGANICOS

FUENTE DE ENERGÍA FUENTE DE CARBONO


 FOTOAUTOTROFOS LUZ CO2
 FOTOHETEROTROFOS LUZ COMPUESTOS ORGANICOS
 QUIMIOAUTOTROFOS QUÍMICA CO2
 QUIMIOHETEROTROFOS QUÍMICA COMPUESTOS ORGANICOS
 Fotoautotrofos: Vegetales, algas, bacterias fotosintéticas.
 Fotoheterotrofos: Bacterias
 Quimioautotrofos: Bacterias.
 Quimioheterotrofos: Animales, Protozoos, bacterias.

Requerimientos nutricionales

Los requerimientos nutricionales varían para cada especie microbiana y es necesario su conocimiento
para lograr un aislamiento satisfactorio de las cepas en estudio, así como su posterior crecimiento y
desarrollo.
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Algunos microorganismos tienen requerimientos nutricionales muy específicos. Por ejemplo, las diatomeas
y otras algas sintetizan paredes celulares fuertemente impregnadas de sílice y por tanto requieren de un
suministro de silicatos. El sodio es necesario en elevadas cantidades por las cianobacterias.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Es el procedimiento mediante el cual se promueve el crecimiento de los microorganismos, éste se logra,


proporcionándoles condiciones nutricionales y ambientales adecuadas.

CONDICIONES DE CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS.


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• NUTRIENTES

• pH

• CONCENTRACIÓN DE SAL

• PRESIÓN OSMÓTICA

• TENSIÓN DE OXÍGENO

• TEMPERATURA

• FACTORES ESPECIALES (LUZ PARA LOS ORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS)

Medios de cultivo

Conjunto de elementos o sustancias que garantizan a los microorganismos los nutrientes necesarios para
su conservación o desarrollo

Los medios de cultivo son preparaciones sólidas, semisólidas o líquidas utilizadas para el crecimiento de
los microorganismos. Estos medios pueden ser sustratos naturales sobre los cuales crezcan especies
microbianas de forma habitual, por ejemplo, la leche para los organismos que viven en ella, o extracto de
suelo para las especies microbianas endémicas de este hábitat.

Importancia

1. Facilitan el estudio de los requerimientos nutricionales de los microorganismos su


metabolismo, características morfológicas y bioquímicas en condiciones controladas
2. Permiten su aislamiento del habitad natural u ocasional
3. Posibilitan su identificación y el estudio de la influencia de factores físicos, químicos y
mecánicos
4. Permiten el cultivo masivo de microorganismos productores de sustancias de interés

Cualquiera que sea el medio debe incluir todo lo necesario para el crecimiento microbiano, lo cual variará
de acuerdo con la fisiología específica del microorganismo que se desee cultivar.
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Ingredientes fundamentales

 agua
 bases nutritivas (peptonas, digeridos, extractos, infusiones, hidrolizados)
 carbohidratos y otras fuentes de carbono (azúcares, almidones, ...)
 macro y micro elementos (de origen orgánico e inorgánico)
 colorantes e indicadores
 otras sustancias (proteínas, aminoácidos, celulosa, .....)
 suplementos (vitaminas, antibióticos, ...)

CARACTERÍSTICAS Y PROPIEDADES COMUNES


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 Deben ser nutritivos.
 Deben poseer una concentración determinada de iones H +
 Deben ser isotónicos para las células,
 Los medios al emplearse en el laboratorio y posterior a su elaboración industrial (líquidos y listos
para el uso) deben ser, por lo general, estériles
 Deben poseer un determinado potencial de oxidación-reducción
 Deben contener una cantidad fija de ingredientes

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios se pueden clasificar por la:

 CONSISTENCIA
 COMPOSICIÓN
 NATURALEZA DE LOS INGREDIENTES
 COMPOSICIÓN DE LAS BASES NUTRITIVAS QUE LO COMPONEN
 FINALIDAD DE SU EMPLEO
 INTENSIDAD DEL CRECIMIENTO
 APLICACIÓN EN LA MICROBIOLOGÍA
 CAMPO DE UTILIZACIÓN
 MICROORGANISMOS A CULTIVAR
 ESCALA DE USO
 PRESENCIA DE AGAR COMO COMPONENTE
 FORMA DE PRESENTACIÓN
 PRESENCIA DE SUSTRATOS ESPECÍFICOS

Para estudios

 Sintéticos: Composición química conocida. Tiene elevada repetibilidad, se utilizan en estudio más
finos.
 No sintéticos: Composición química ignorada. Tienen baja repetibilidad, se usan en estudios más
groseros.

Estado:

o A.- Medios líquidos Ayudan a la identificación de los microorganismos mediante la


acumulación de sustancias producidas por él mismo, o sea, por sus desechos metabólicos
(producción de Indol, fermentación de azúcares, ..)Los microorganismos pueden realizar
libremente sus movimientos y no contienen agentes solidificantes.En algunos casos, se le
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adicionan partículas sólidas al medio de cultivo líquido. Comúnmente se denominan


CALDOS

o B.- Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico
producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una
concentración del 1,5%. Los microorganismos se multiplican en el lugar formando colonias
de características específicas

o C.- Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%


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Composición:

 Medios sintéticos o químicamente definidos.


 Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como
extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes
en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos
nutrientes.
 Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para
favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
 Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento
rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.

En algunos casos pueden combinar propiedades como ser selectivos y/o diferenciales.

 Selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un


microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos a partir de una población microbiana mixta Un medio se hace selectivo por la
adición de sustancias antimicrobianas para las especies microbianas indeseables y que pudieran
interferir en el crecimiento de los microorganismos deseados.Ej. puede estar dado por la
modificación del pH en el medio (pH ácido es adecuado para hongos filamentosos pero no para
bacterias).
 Diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Es aquel medio en el
que ciertas especies producen colonias características, fáciles de reconocer.

POR LA PRESENCIA DE SUSTRATOS ESPECIALES

CROMOGÉNICOS

Contienen sustratos incoloros, que al ser degradados por enzimas específicas, tiñen las colonias de un
color característico

FLUOROGÉNICOS

Contienen sustratos incoloros, que al ser degradados por enzimas específicas, y en presencia de luz
ultravioleta emiten luz fluorescente.
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POR SU APLICACIÓN EN LA MICROBIOLOGÍA

INDUSTRIA ALIMENTICIA

Exámenes de bebidas, aguas industriales o residuales

Exámenes de leche y productos lácteos

Exámenes de otros alimentos

Exámenes de envases y embalajes 7


DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO EN MEDICINA HUMANA Y VETERINARIA

Exámenes de identificación

Ensayos de sensibilidad a los antimicrobianos

EXÁMENES DE SUELOS Y MEDIO AMBIENTE

EXAMEN DE PLANTAS Y MATERIAL VEGETAL

PRODUCCIÓN DE VACUNAS Y ANTIBIÓTICOS

Exámenes de esterilidad

OBTENCIÓN DE PRODUCTOS

BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS

PRODUCCIÓN DE METABOLITOS

OTRAS APLICACIONES

METODOS DE SIEMBRA, AISLAMIENTO Y OBSERVACION DE MICROORGANISMOS

Cultivo Puro

I. El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros
microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del
laboratorio.

II. Para determinar las características de especies concretas de microorganismos, es imperativo que
el organismo se aislé y se desarrollo en el laboratorio como un cultivo libre de otras especies.

Métodos para aislar cultivos puros

I. Técnica de siembra por estrías en placa.


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Con un asa bacteriológica, se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho
a base de agar y se siembra en el medio por estrías en cuadrantes.

II. Técnicas de siembra por difusión en placa

Para sembrar por difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la
muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar
quedan las bacterias separadas unas de otras.

III. Técnica de vertido en placa.

El principio de la técnica de la placa vertida es la dilución (adelgazamiento) de la muestra en tubos. El


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medio se mantiene al estado líquido a una temperatura de 45 – 52º C para permitir que el inoculo se
distribuya adecuadamente en el medio. Esta técnica se hace en forma cualitativa o cuantitativa.

IV. Técnica de enriquecimiento del cultivo

El principio de esta técnica, es procurar un ambiente de cultivo diseñado (medio de composición conocida
y condiciones específicas de incubación) que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de
bacterias que necesitemos pero que no sea adecuado para las demás.Los medios de enriquecimiento se
usan generalmente cuando el tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra en muy pequeñas
cantidades y se desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes en el inóculo.

V. Técnica de las diluciones en serie:

Se utiliza para microorganismos cuya proporción es mayoritaria dentro de la población mixta. Se realiza
mediante diluciones seriadas.Se basa en cuando la muestra esté muy diluida contendrá solamente la
bacteria que buscamos.O dependiendo de la dilución realizada se aislara el microorganismo adecuado.

VI. Técnica de aislamiento de una sola célula mediante un micromanipulador.

Filtros de membrana

La técnica de filtración por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través
de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Se
utilizan membranas que tienen un tamaño de poro de 0.45 micras ya que la mayoría de los
microorganismos tienen un tamaño superior (diámetro) y se coloca el filtro sobre una placa del medio de
cultivo apropiado.

Films secos (Petrifilm)

En la actualidad se dispone de un medio rápido para el recuento, conocido como método de las Placas
Petrifilm, que es un sistema de medios de cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes, un
agente gelificante soluble en agua fría , nutrientes e indicadores en un formato seco no perecedero que
facilita la enumeración de las colonias. Las Placas Petrifilm se utilizan en la enumeración de la población
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total existente de bacterias aerobias en productos, superficies, etc.Son películas deshidratadas de medios
de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la
incubación se hace el recuento.Cada placa contiene un agente gelificante soluble en agua

Método del número más probable

El método del número más probable (NMP), al igual que el método de recuento en placa, nos
proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacion una serie de diluciones seriadas al
décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo.

Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones 9
más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exácto.

Por ejemplo, se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0,1
g. de muestra, en tres 0,01 g y en los otros tres restantes 0,001 g. Luego de la incubación, se observan y
se cuentan el número de tubos positivos.
Se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que:
1) Hubo crecimiento que se detecta como aparición de turbidez (siempre que la muestra sembrada no
enturbie el medio).
2) Detección de productos del metabolismo del microorganismo
 Producción de gas que se observa en una campanita invertida (Durham) en el tubo.
 Viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc.).
 Producción de pigmento.
 Otros (reducción de NO , producción de indol, hidrólisis de una proteína, etc.)

Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente positivos a
placa, o a otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo.

El número de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta
etapa de confirmación, siendo el valor anterior sólo un valor presuntivo. La interpretación de los resultados,
se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y en general se emplean tablas preparadas de
acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Ejemplo 1:

El resultado 3-1-0 se busca en la tabla del NMP y se obtiene un valor de 43/g o ml, cuando en la primer
serie de tubos se siembra 0,1 g. Si no tenemos condiciones entonces hay que realizar conversión. En este
caso resulta claro que estamos sembrando diez veces menos en la primera serie de tubos (0,01 g), por lo
tanto el factor a utilizar es multiplicando el resultado de tabla por diez. El resultado a informar
es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 43/g.

Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso
de la dilución sembrada en la serie del medio. Ej:
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Otro ejemplo, ahora cuando se trabaja con 5 tubos

De la tabla del NMP con 5 tubos surge el valor: 5/ml. Como la siembra no está realizada en las
condiciones de la tabla debe aplicarse el factor de corrección.

Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 ml.


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AISLAMIENTO

Aislar es separar un microorganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. En hábitat
natural raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo),
por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar los distintos tipos de
microorganismos presentes para luego así poder identificarlos.

El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos
están en una proporción adecuada.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:

a) aislamiento por estrías.

b) aislamiento por dilución

AISLAMIENTO EN PLACA POR ESTRÍAS

Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas.

Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la
superficie de la placa; se quema el ansa, se enfría, se gira la placa 90º y se vuelve a estriar
tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por
último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

AISLAMIENTO POR DILUCIÓN EN MEDIO SÓLIDO

Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser
necesario diluir la muestra usando suero fisiológico o algún otro diluyente.
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

Para aislar microorganismos anaerobios estrictos -que son rápidamente destruidos por exposición al
oxígeno-, pueden prepararse placas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes
cerrados en atmósfera sin oxígeno. También se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y
termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina, para evitar el acceso de aire. Con
anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaeróbicas, o también usando la técnica del
"roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfría;
se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de oxígeno mientras el tubo está destapado.

BÚSQUEDA
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Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en una
muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda que involucra una primera etapa de aumento
del número del tipo de microorganismo que se desea aislar. Luego se aisla por el método de estrías o por
dilución y se identifica.
Una búsqueda implica los siguientes pasos:

1) enriquecimiento

2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales)

3) reaislamiento (medio no selectivo)

4) identificación

El objetivo de la etapa de enriquecimiento es aumentar el número del microorganismo que se desea


determinar y puede subdividirse en dos: preenriquecimiento y enriquecimiento selectivo. El
preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los microorganismos
buscados están debilitados o dañados y se usan siempre medios nutrientes líquidos, no selectivos. El
enriquecimiento selectivo se realiza incubando la muestra en medios líquidos selectivos, ya sea en
presencia de agentes químicos o biológicos que favorecen el desarrollo en particular del o de los
microorganismos buscados frente al resto de los microorganismos acompañantes.

Luego de cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando la


técnica de estrías en superficie en medios sólidos selectivos y diferenciales. En estos medios deben
examinarse las colonias típicas para el tipo de microorganismo que estamos buscando. Las colonias
deben describirse por examen macroscópico en función del tamaño, la forma, el borde, la elevación, la
transparencia y el color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación.

En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en un medio no
selectivo por el método de estrías. Esto se conoce como reaislamiento y es necesario para asegurar la
obtención de un CULTIVO PURO del microorganismo de interés. En los medios de aislamiento selectivos
puede ocurrir que una colonia característica del microorganismo que estamos buscando pueda contener
como contaminantes –en muy bajo número– otros microorganismos que no hayan crecido en este medio
por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer. El examen
microscópico de una colonia de un cultivo puro de un microorganismo debe mostrar células
razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfología.

El informe de una búsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA en los gramos o mL
de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento).
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DESCRIPCIÓN DE COLONIAS

Las colonias de microorganismos se pueden describir teniendo en cuenta el tamaño, color, superficie, etc.

Tamaño:

Grande diámetro mayor a 1 mm

Mediana diámetro aproximadamente igual a 1 mm

Pequeña diámetro menor a 1 mm

Color 13
Blanco, Crema, Amarillo limón, Negro, etc

Superficie
Brillante, Lisa, Granular, Rugosa

Consistencia
Viscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla)

Densidad (con luz a través de la colonia)

Opaca, Transparente, Traslúcida

Forma

Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Lanceolada

Elevación

Chata Elevada Convexa Cúpula Umbonada Umbilicada

Margen

Entero Ondulado Lobado Ondeado Filamentoso


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Técnicas de siembra, aislamiento y recuento bacterianos

Las técnicas de siembra se pueden dividir desde el punto de vista docente y práctico en tres apartados:

 Inoculaciones o siembras
 Aislamientos
 Recuentos

Técnicas de inoculación: Las técnicas de inoculación son aquellas cuya finalidad es depositar una parte
de la muestra objeto de estudio sobre el medio de cultivo para obtener un crecimiento visible en forma de
colonias. Pueden realizarse en:
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En medio líquido

 En tubo:

Con asa de platino

 a partir de una colonia


 a partir de una suspensión bacteriana
 a partir de una muestra biológica

Con torunda o escobillón

 a partir de una muestra biológica


 a partir de una suspensión bacteriana

Con pipeta

 a partir de una suspensión bacteriana

En medio sólido

 En placa
a. Inoculación parcial
Con asa de platino
Con torunda

b. Inoculación total
 Con asa de platino
 Con torunda
 en una sola dirección
 en tres direcciones

 Por inundación
 Por inmersión
 Con asa de Drigalsky
 En profundidad
 Por contacto
 En tubo
Inclinado

o Por picadura en profundidad


o Por estría en superficie inclinada
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Recto

Por picadura en profundidad

En medio semisólido

 En tubo
Por picadura en profundidad

Técnicas de aislamiento
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Las técnicas de aislamiento se realizan fundamentalmente sobre medio sólido en placa, salvo algunas
excepciones. El objetivo de las técnicas de aislamiento es procurar la separación necesaria de las colonias
bacterianas sobre la superficie del medio de cultivo para que éstas puedan ser procesadas
individualmente. Pueden realizarse:

En medio sólido:

 En tubo: No se hace rutinariamente.


 En placa
a. Con asa de platino (estría)
 Estría simple o agotamiento
 3 giros o estría múltiple
 4 cuadrantes

b. Por dilución

Recuentos celulares bacterianos

Los recuentos bacterianos se efectúan para hacer un recuento del número de microorganismos que hay
presentes en una muestra líquida. Los recuentos cuantitativos no se pueden efectuar sobre muestras no
fluidas.

En medio líquido

 Turbidimetría: Escala de MacFarland


 Cámaras de recuento
 Bioluminiscencia (ATP)
 Contadores electrónicos de partículas
En medio sólido

 Mediante asa calibrada e inoculación total


a. Con asa de platino
b. Con asa de Drigalsky
 Mediante diluciones seriadas
Inoculación total

1. en profundidad
2. en superficie
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Mantenimiento y preservación de cultivos

Se utilizan diversos procedimientos de acuerdo con las características y la tolerancia del microorganismo
en cuestión:

i.- Resiembra periódica en medios frescos.


– Depende de el medio de cultivo
– Temperatura propia para mantener los cultivos
– El tiempo de resiembra.

ii.- Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral.


Para cultivos en agar inclinado el aceite deberá cubrir mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del 16
agar inclinado.

iii.- Liofilización

iv. Almacenamiento a temperaturas muy bajas


– Nitrógeno líquido (temperatura de -196º C).
– Las células se congelan con un agente protector (glicerol o dimetil sulfoxido).

Almacenamiento
Método Ventajas Desventajas
(años)

Secado del agar, baja


Simple, bajo costo, equipamiento requerido
Agar 0.5-2 estabilidad genética,
bajo
riesgo contaminación

bajo costo, equipamiento trabajo moderado, baja


Aceite mineral 2-20
requerido bajo estabilidad genética

Requiere protectores,
Equipamiento requerido bajo, Alto costo de freezer (-
Congelamiento 4-5
buena estabilidad genética 80ºC). Células pueden
ser sensibles al O2

Preparación rápida, buena Suministro regular de N


N líquido infinito
estabilidad genetica líquido

Bajo riesgo de contaminación,


Alto costo de
Liofilización 15-20 buena a regular estabilidad
equipamiento
genetica

Simple , bajo costo, bajo Estabilidad genética


Agua 1-5
equipamiento requerido regular
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Simple , bajo costo, bajo


L-drying 3-10 estabilidad genética?
equipamiento requerido

METODOLOGIAS RAPIDAS.

Realizar un test en Microbiología suele ser una labor que consume gran cantidad de tiempo y trabajo , de
ahí la necesidad de desarrollar métodos rápidos y fáciles para cuantificar y detectar microorganismos .
Muchas veces es necesario dar resultados rápidos , que permitan tomar decisiones lo más pronto posible , 17
lo cual muchas veces es imposible , debido a

1. La necesidad de la espera a que los microorganismos crezcan en los medios de cultivo y podamos así
visualizar su presencia , siendo además muchos de ellos de crecimiento lento .
2. Los microorganismos de interés están presentes a menudo en cantidades muy pequeñas con respecto
al resto de la microbiota acompañante , de ahí que sea necesario hacer un preenriquecimiento previo
en medios selectivos .
3. En función del producto a analizar , es necesario realizar un previo tratamiento o purificación de los
microorganismos , para evitar las interferencias de la matriz en la que estos se encuentran (
decantaciones , trituraciones ... ) .

Se define como “método rápido” a cualquier método destinado a la detección, el recuento, la


caracterización y la subtipificación de microorganismos (patógenos y del deterioro) mediante el cual se
obtienen resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los métodos convencionales.
Los métodos rápidos se basan en técnicas físico-químicas , inmunológicas y moleculares .

•Películas de medios
de cultivo •Enzimoinmunoensayo
deshidratados
generales o •Aglutinación
selectivos. •Radioinmunoensayo
•Medios •Inmunocromatografía
cromogénicos y •Citometría
fluorogénicos

FISICO QUIMICAS INMUNOLOGICAS

BIOQUIMICAS MOLECULARES

• Hibridacion
•Galerías •PCR
miniaturizadas y •Biochips
automatizadas
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PRUEBAS BIOQUIMICAS

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales,
conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a


partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de
acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

Las pruebas bioquímicas no determinan cultivos mixtos son única y exclusivamente para
18
microorganismos puros.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en
forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada
actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada
temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio
profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de
trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si
se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio
de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en
estudio es exigente.

A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación,


comerciales, etc.).

a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos
deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios
prontos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de
resultados.

REACCIONES IMViC

Se designan con el término nemotécnico IMViC un grupo de cuatro reacciones bioquímicas que se utilizan
para la diferenciación fisiológica de los bacilos coliformes. Las cuatro reacciones bioquímicas son:

- I: Formación de indol a partir de triptófano


- M: Prueba del rojo de metilo
- V: Prueba de Voges- Proskauer
- iC: La utilización del citrato como fuente de carbono

a) Prueba del Indol (I):

Fundamento: Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el


triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs).
El triptófano forma parte de las peptonas del medio.Esta prueba se analiza en el medio de SIM, el cual
se utiliza también para investigar la motilidad (M) y la producción de H2S (s). Este medio enriquecido con
triptófano, aminoácido suministrado por una peptona adecuada que se descompone en indol por acción de
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algunas bacterias. Para comprobarlo pueden realizarse las pruebas de Erlich o de Kovac´s: Se requiere
agregar unas gotas de reactivo de Erlich o de Kovac´s a la superficie del medio entubado después de que
han crecido las colonias. La reacción positiva hará que la solución cristalina adquiera un color rosa fuerte o
rojo. De no ocurrir esto la prueba es entonces negativa.

b) Prueba del rojo de metilo (M):

Fundamento: Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.),


relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un
indicador (rojo de metilo) al cultivo. Los microorganismos se cultivan en caldo peptona glucosa con tapón 19
de fosfato. Después de la incubación se añaden al caldo 4 gotas de indicador rojo de metilo, un color rojo
indica una reacción positiva ( ácida).

c) Prueba de Voges. Proskauer (V):

Fundamento: Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad


de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo,
(alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o
acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloración roja
al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio (Ej. Arginina).

El medio empleado es idéntico al mencionado antes. Después de dos días de incubación se añaden a 5 ml
del medio 1 ml de KOH ( potasa) al 10 %; se observa de cuando en cuando las 24 horas siguientes. Un
color rosa de eosina indica una reacción positiva, debida a la producción de acetilmetilcarbinol ( CH3- CO-
CHOH- CH3 ) a partir de glucosa. Se obtiene una reacción más rápida añadiendo huellas de creatinina al
medio incubado y luego 2.5 ml de NaOH al 40%, en este caso el color rosa aparece en pocos minutos.

d) Prueba del citrato (iC)

Fundamento: Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. La
prueba emplea un medio definido (Koser) con citrato como única fuente carbonada (se detecta turbidez).
Alternativamente se utiliza el medio de Simmons: utiliza un medio sólido con citrato sódico y un indicador
ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del
citrato.Para esta prueba se utiliza el agar de Simmons que contiene citrato de sodio y azul de timol como
indicador. La única fuente de carbono en este medio es el citrato. Si la reacción es positiva el indicador se
vuelve azul. Los demás microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde, indicando una
reacción negativa.

OXIDASA

El ensayo de citocromo c oxidasa permite detectar la presencia en el microorganismo de ciertas enzimas


del sistema citocromo oxidasa, capaces de oxidar rápidamente al colorante redox . Este ensayo es útil
para sospechar la presencia de los géneros de bacterias que dan el ensayo positivo como Neisseria,
Aeromonas, Vibrio, Camplylobacter y Pseudomonas y para excluir las Enterobacterias que dan reacciones
negativas.

Ureasa.
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Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por
acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y
se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
retardado.
Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose
así de manifiesto la actividad ureasa.

TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de
producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la
detección de la producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de enterobacterias. 20

LIA (Agar lisina hierro)

Este ensayo permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilación o desanimación de la
lisina. Se puede detectar además la producción de SH2. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de
salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los
medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

Coagulasa

La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. se
cree que la coagulasa funciona en vivo, produciendo una barrera en el sitio de infección estafilocócica. En
el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus
aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus.

Catalasa

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. La catalasa es
una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la
molécula están en estado oxidado (Fe +++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.

Principio

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico
de los carbohidratos. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas.
La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:

H2O2 → H2O + ½O2 (burbujas de gas)

La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comúnmente utilizada para


diferenciar Streptococcus (catalasa negativa) de Staphylococcus (catalasa positiva).

Medios y reactivos

1. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y que no contenga sangre.


2. Peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución de 30% con agua destilada).

Nitrato
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Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio
manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su
incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio
de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color,
se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de
nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la
interpretación final.
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar
entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

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O.F (OXIDACIÒN FERMENTACIÒN)

El medio más comúnmente utilizado es el de Hugh-Leifson que -a diferencia de otros medios de cultivo-
contiene una baja concentración de peptonas (0,2 %). A las concentraciones de peptona habitualmente
usadas en otros medios (1 al 2%), no es posible detectar la baja concentración de ácidos que se produce
por metabolismo oxidativo de azúcares, ya que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas
alcalinizan el medio. La baja concentración de peptona del medio Hugh-Leifson permite diferenciar los
microorganismos oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores externos
de electrones (ej. NO3-), la oxidación de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto que la
fermentación es un proceso que no requiere oxígeno. El medio de cultivo es semisólido.

ANTIBIOGRAMA

Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo de ellos) a


varios antibióticos. Se puede utilizar para tratar un patógeno, añadir a alimentos, en definitiva para saber
como se comporta un germen frente a determinado antibiótico.

GELATINA

Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas
producidas por algunas Enterobacterias. La reacción positiva hace que el medio permanezca líquido
después de la incubación aún después de dejarse en refrigeración durante media hora. La reacción
negativa permite nuevamente la solidificación.
PROTEASAS O GELATINASAS (+):En esta prueba se determina la producción de enzimas de carácter
proteolítico en un medio nutritivo de gelatina.

SULFUROS INDOL MOTILIDAD (SIM)

Este medio se utiliza para tres pruebas bioquímicas como ya se menciono anteriormente: la del sulfuro de
hidrógeno (S) de la misma manera que en el agar Kliger, la del indol (I) y la motilidad (M).
La motilidad (M) a través del medio semisólido se traduce por diseminación de la opacidad bacteriana a
partir del trayecto de la picadura de inoculación (reacción positiva). Si la motilidad es negativa, el
crecimiento se encuentra restringido al trayecto de la picadura.

Fundamentos de la producción de H2S:


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La mayor parte de las proteínas tienen aminoácidos sulfurados. Algunos microorganismos tienen enzimas
que desprenden el átomo de azufre de estos aminoácidos, el cual es luego reducido con hidrógeno (de los
substratos), para formar ácido sulfhídrico, en este proceso los microorganismos cumplen con la actividad
que puede catalogarse como fermentación proteica, que es la producción de ácido sulfhídrico.

Batería de pruebas API20E

La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para enterobacterias y otras bacterias
Gram(-). Básicamente consta de 20 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de
datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a
la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada
tubo es una prueba bioquímica distinta. 22

Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que
rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a
producir cambios de color espontáneos o bien al añadir reactivos.

La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde se indica si los
microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido.

En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato y luego de la incubación


visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado
de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación. La prueba
bioquímica también puede consistir en demostrar el crecimiento en presencia de determinado inhibidor.

2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima


inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el
microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura adecuados.
Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los
correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para
ese test.

Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se
enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de
ensayo y se denominan según su nombre corriente.

1) Enzimas vinculadas con la respiración

oxidasa
catalasa

2) Requerimientos de oxígeno

OF

Caldo tioglicolato
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3) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros

Producción de ácido, o ácido y gas

Detección de enzimas y vías metabólicas (RM-VP, O.N.P.G. -orto nitro ß-D-galactopiranósido-, esculina)

4) Fuente única de carbono

citrato

malonato 23

5) Utilización de compuestos nitrogenados

asimilación de nitrato (reducción a amonio)

desnitrificación (utilización de nitrato como aceptor de electrones)

descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros (indol, fenilalanina, urea, descarboxilación de lisina,


etc)

6) Ensayos combinados

TSI (Triple azúcar hierro)

LIA (Agar hierro lisina)

7) Detección de exoenzimas (lecitinasa, proteasas, coagulasa, celulasas, etc)

8) Test de crecimiento o inhibición (temperatura, cloruro de sodio en alta concentración, antibióticos)

9) Otros (solubilidad en bilis, producción de pigmentos)

OBSERVACIÓN Y EXAMEN MICROSCÓPICO

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por
lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones
para microscopios ópticos.

La observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales:


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– observando los microorganismos vivos sin teñir.


– observando las células fijadas, teñidas con colorantes

Preparación en fresco

Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en
suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar
burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases

Técnicas de tinción

La coloración de las bacterias tiene como fines:


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– poder visualizarlas para determinar morfología y tamaño.
– diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes.
– revelar la presencia de distintas estructuras internas.

Los colorantes utilizados son sales en las que el anión o el catión es el responsable del color; en el primer
caso se trata de un colorante ácido o aniónico y en el segundo, básico o catiónico. La célula bacteriana
tiene una débil carga negativa cuando el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad. Como la
diferencia de carga eléctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y la célula, las bacterias
tendrán afinidad por los colorantes básicos (ej.: cristal violeta y azul de metileno).

En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación,
tratamiento con colorantes y observación.

1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es
líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
H2O.

2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para
facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra
repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.

3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los
procesos anteriores. Puede ser de varios tipos:

TIPOS DE TINCION

 Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo
su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
 Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción
negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
 Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante
que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de
contraste

Tinción de Gram

Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue
el danés Christian Gram. Consiste básicamente en añadir lo siguiente:
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 Cristal violeta (colorante azul) (1 min). Lavar con agua


 Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción de un colorante)(1 min)
 Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias) (5 – 15 seg.)
 Lavar con agua.
 Safranina (colorante de contraste, rojo) (20 seg.). Secar y examinar.
Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias según la composición de la pared celular; las
Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol después de la decoloración con alcohol y
aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+) que sí lo retienen y aparecen teñidas de púrpura.

Tinción de Ziehl Neelsen

Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos


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patógenos.

Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una serie de bacterias con estructura de
pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no está basada en peptidoglicano como
las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta particularidad las hace
resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se produce en casi ningún otro tipo bacteriano.

Utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante.
Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el
colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes. (BAAR). Por último el azul de metileno
tiñe de azul el resto de la preparación.

Tinción de esporas

La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los géneros Bacillus y Clostridium.

Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como
mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el
microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando
las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse
formas vegetativas.

Están descritos varios métodos para teñir esporas.El de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita.
Este colorante se une fuertemente a las esporas gracias a la utilización de calor como mordiente.
La fase de decoloración en este caso se realiza con agua abundante. Las formas vegetativas pierden el
color verde y se tiñen con el colorante de contraste (fucsina o safranina).