Anal. Chem.
1996, 68, 850-858
Espectrometría de masas secuenciación de proteínas de Plata manchada
geles de poliacrilamida
Andrej Shevchenko, Matthias Wilm, Ole Forma, y Matthias Mann *
Europeo de Biología Molecular (EMBL), Heidelberg, Alemania
Las proteínas de los geles teñidos con plata
pueden ser digeridos enzy- ticamente y los
péptidos resultantes se analizaron y SE-extinguió
mediante espectrometría de masas. proteínas
Rendimiento Estándar los mismos mapas de
péptidos cuando se extrae de Coomassie- y geles
teñidos con plata, como se juzga por electrospray
y espectrometría de masas MALDI. El rango de
nanogramos bajo se puede alcanzar por los
protocolos descritos aquí, y el método es robusto.
Un gel unidimensional teñido con plata de una
fracción de proteínas de levadura se analizó por
nano- electrospray tandemmass espectrometría.
En el ing sequenc-, más de 1000 aminoácidos
estaban cubiertas, lo que resulta en ninguna
evidencia de modificaciones químicas debido al
procedimiento de tinción con plata. La tinción con
plata permite un acortamiento sustancial de
andmay tiempo de preparación de la muestra, por
lo tanto, ser preferible más de tinción Coomassie.
En las proteínas de investigación biológica ahora
están aislados o ensayó por unidimensional o
electroforesis en gel de dos dimensiones más
comúnmente. Las proteínas se visualizaron por tinción
posteriormente, a menudo por Coomassie Brilliant Blue
si la proteína es suficientemente abundante (es decir,
más de 100 ng). Por electrotransferencia y digerir la
proteína en una membrana o mediante la digestión
directamente en gel, péptidos son producidos que se
extraen y se analizan. Este análisis consiste más
comúnmente de la degradación de Edman de los
péptidos separados por HPLC. El objetivo es obtener
información de la secuencia para identificar la proteína
en bases de datos de secuencia o para clonar el gen
correspondiente. 1-3 La espectrometría de masas ha
comenzado recientemente a ser empleados en este
esquema, típicamente para análisis de masas de los
péptidos separados 4-7 sino también para la obtención
de mapas de masas de péptidos que se utilizará en las
búsquedas de bases de datos. 8-13
La visualización mediante tinción con Coomassie
es tedioso y puede interferir con etapas de análisis
subsiguientes. En primer lugar, el gel se tiñe para
2-3
h, y luego el fondo gel se destiñó durante la noche
para visualizar las proteínas. Para promover la
escisión enzimática eficiente y reducir el fondo para
el análisis de espectrometría de masas posterior,
cualquier exceso de Coomassie se debe retirar con
cuidado. Después de una mancha de proteína se ha
escindido, pasos adicionales largo de lavado son
necesarias para eliminar Coomassie asociada con la
proteína. Los ralentiza tinción y la decoloración
establecen los procedimientos y limita su
rendimiento, y las extensas etapas de lavado
podrían conducir a pérdidas de proteína.
Recientemente, la espectrometría de masas por
electrospray 14-16 y matrixassisted desorción láser
espectrometría de masas 17,18 han alcanzado los
límites de detección muy bajos en el análisis de
péptidos aislados. Por ejemplo, Emmett y Caprioli
19 tener bajos límites de detección attomol
demostrado con electrospray, y Forma et al. 20 han
obtenido el mismo con láser asistida por matriz de
desorción / ionización (MALDI). detección
Subpicomole y secuenciación de proteínas a partir
de poliacrilamida es por lo tanto una propuesta
realista.
En nuestro laboratorio, hemos desarrollado una fuente
de iones de nanoelectropulverización (nanoes), 21,22
que hemos utilizado para la secuenciación de proteínas
a partir de geles de poliacrilamida. 23 En el curso de
este trabajo, se hizo evidente que el límite de detección
50-100 ng de la tinción de Coomassie no era lo
suficientemente baja para los niveles que podrían ser
alcanzadas.
La tinción con plata es un método de tinción popular y
más sensible, con un límite de detección entre 1 y 10
ng. 24,25 El uso de la tinción de plata, si es posible,
sería abordar los dos problemas mencionados encima.
Sería disminuir la cantidad de tratamiento final gel
mediante la eliminación de etapas de lavado, ya que,
en contraste con la tinción por colorantes, tinción con
plata no actúa mediante la unión a la proteína
específica. 26 Aún más importante, que reduciría la
cantidad de proteína necesaria para el sine qua non
paso de la visualización de proteínas y proporcionar
los medios para la espectrometría de masas para
mejorar la sensibilidad a unos pocos nanogramos de
material de proteína en el gel.
Varios protocolos bien establecidos para la tinción de
plata han sido publicados (ver, por ejemplo, refs 24,
27, y 28 y las referencias citadas en la ref 25). La
mayor preocupación en la aplicación de la técnica de
tinción de plata cuando seguido por microanálisis de
proteínas es que incluye tratamiento con la proteína
con el fuerte agente oxidante Ag +. Esto generalmente
se cree que causa el ataque oxidativo sobre la
proteína, lo que lleva a una modificación química o la
destrucción, lo que dificulta la posterior caracterización
de la estructura primaria. Además, varios protocolos
publicados requieren diversos tratamientos previos
sensibilizante del gel con glutaraldehído, ácido
crómico, tiosulfato de sodio, etc., que también podría
dar lugar a modificaciones covalentes de las proteínas.
Mientras que el microanálisis de proteínas teñidas con
plata fue por lo tanto generalmente se considera
imposible, pero no hemos podido encontrar ninguna
descripción sistemática de los procesos de
interferencia antes mencionados. Tampoco somos
conscientes de ningún informe de la aplicación de la
tinción de plata en los proyectos de
microsecuenciación de proteínas.
En este trabajo, se establece la viabilidad de la
microcharacterization de proteínas teñidas con plata
por MALDI y por nanoes espectrometría de masas en
tándem. Se realizaron estudios de modelos en
albúmina de suero bovino, debido a que es un
estándar utilizado mucho en la química de proteínas
que tiene un tamaño intermedio y presenta algunas
desafío debido a sus 17 puentes disulfuro. La
aplicabilidad práctica y la robustez del protocolo se
demuestra por el tándem caracterización de
espectrometría de masas de ocho bandas de
proteínas a partir de un gel de poliacrilamida teñido
con plata de una dimensión de una preparación de
afinidad de las proteínas de levadura en ciernes.
SECCION EXPERIMENTAL
Materiales y Reactivos. albúmina de suero bovino fue
de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Su secuencia
fue tomada de SwissProt, la adhesión no. P02769, sin la
señal y el propéptido (amino ácidos 1-24). La
concentración de la solución madre se determinó por
análisis de aminoácidos. Excepto cuando se indique lo
contrario, todos los productos químicos utilizados, R-
ciano-4hydroxy- trans- ácido cinámico para la
preparación de matriz de MALDI, se adquirieron de
Sigma y eran de calidad analítica, excepto nitrato de
plata, que era de grado SigmaUltra. Nitrocelulosa fue
fromBioRad (Richmond, CA). MilliQ agua (Millipore,
Bedford, MA) se utilizó para preparar soluciones de
tinción de Coomassie y plata. Para el análisis de
espectrometría de masa y la preparación de mancha de
gel, agua de grado HPLC, metanol y acetonitrilo
(LabScan, Dublín, Irlanda) se utilizaron.
One-dimensional electroforesis en gel de SDS-
poliacrilamida se realizó utilizando métodos estándar
en el sistema de Bio-Rad Mini-Protean II (7 cm × 10 cm
minigeles). 12% en geles de acrilamida de 0,5 o 1 mm
de espesor fueron utilizados en experimentos modelo.
Algunos geles, cuando se especifique, se tiñeron con
0,2% de Coomassie Brilliant Blue R250 en 50% de
MeOH en agua que contiene ácido acético al 2%
durante 1 h (que también corrige las proteínas) y se
destiñeron durante la noche con el mismo disolvente,
con exclusión del colorante.
La muestra de proteínas de levadura se obtuvo de un
grupo que colaboran en el programa de biología celular,
EMBL (líder de grupo, de Tony Hyman). Representa
una fracción a partir de una preparación de proteína de
levadura en ciernes eluida de una columna de afinidad
con el ADN inmovilizado. Esta fracción se sometió a
electroforesis unidimensional en un 0,75 mm, gel de
acrilamida al 8%.
La tinción con plata. La tinción con plata se llevó a
cabo de manera similar al método descrito en las
referencias 27 y 28, excepto que el tratamiento con
glutaraldehído (un agente de reticulación y de
sensibilización) se omitió. Después de la
electroforesis, la losa de gel se fijó en 50% de
metanol, ácido acético al 5% en agua durante 20
min. A continuación se lavó durante 10 minutos con
50% de metanol en agua y, además, durante 10 min
con agua para eliminar el ácido restante. El gel fue
sensibilizada por una incubación de 1 min en
tiosulfato de sodio 0,02%, y luego se enjuagó con
dos cambios de agua destilada durante 1 min cada
uno. Después de aclarar, el gel se sumergió en una
solución de nitrato de plata refrigerada 0,1% y se
incubó durante 20 min a 4 ° C. Después de la
incubación, el nitrato de plata se descartó, y la losa
de gel se lavó dos veces con agua durante 1 min y
luego se desarrolló en 0,04% de formalina carbonato
de sodio [35% de formaldehído en agua (Merck,
Darmstadt)] en 2% con agitación intensiva . Después
de que el desarrollador se volvió amarilla, se
desecha y se reemplaza con una porción fresca. Es
esencial que el desarrollo se lleva a cabo en una
solución absolutamente transparente. Después de
que se alcanzó la intensidad deseada de la tinción, el
desarrollo se terminó por desechar el reactivo,
seguido de lavado de la losa de gel con ácido acético
al 5%. El procedimiento de tinción completa de no
más de 1 h dura. geles desarrollados fueron
completamente transparente cuando se incluyó la
etapa de sensibilización con tiosulfato de sodio.
geles teñidos con plata se almacenaron en una
solución de ácido acético al 1% a 4 ° C hasta el
análisis.
En Gel digestión. manchas de proteínas se
escindieron del gel y en gel digerida con tripsina de
acuerdo con los procedimientos publicados 29,30
modificado por nosotros. 23 Un “control” pieza de gel
fue cortada de una región en blanco del gel y se
procesa en paralelo con la muestra. En contraste con
el protocolo descrito para geles Coomassiestained, 23
todo se omitieron pasos de prelavado. Después las
piezas de gel fueron extirpados y encogidos por
deshidratación en acetonitrilo, que fue retirado a
continuación, que se secaron en una centrífuga de
vacío. Un volumen de ditiotreitol 10 mM (DTT) en mM
NH 100 4 HCO 3
suficiente para cubrir las piezas de gel se añadió, y las
proteínas se redujeron durante 1 h a 56 ° C. Después
de enfriar a temperatura ambiente, la solución de DTT
se reemplazó con aproximadamente el mismo volumen
de yodoacetamida 55 mM en 100 mMNH 4 HCO 3.
Después de 45 min de incubación a temperatura
ambiente en la oscuridad con agitación ocasional, las
piezas de gel se lavaron con 50-100 μ L de NH mM 100
4 HCO.
durante 10 min, se deshidrataron mediante la adición
de acetonitrilo, se hinchó por rehidratación en mM
NH 100 4 HCO 3, y encogido de nuevo mediante la
adición del mismo volumen de acetonitrilo. La fase
líquida se retiró, y las piezas de gel se secaron
completamente en una centrífuga de vacío. Las
piezas de gel se hincharon en un tampón de
digestión que contiene 50 mM NH 4 HCO 3, CaCl 5
mM 2, y 12,5 ng / μ L de tripsina (Boehringer
Mannheim, grado de secuenciación) en un baño
enfriado con hielo. Después de 45 min, el
sobrenadante se retira y se sustituye con 5-10 μ L del
mismo tampón, pero sin tripsina, para mantener las
piezas de gel húmedo durante la escisión enzimática
(37 ° C, durante la noche). Los péptidos fueron
extraídos por un cambio de NH 20 mM 4 HCO 3 y
tres cambios
de ácido fórmico al 5% en acetonitrilo al 50% (20 min
para cada cambio) a temperatura ambiente y se secó
hacia abajo.
Preparación de la muestra para el análisis de MALDI.
Microcristalina matriz superficies se hicieron sobre la
puntas de sonda del espectrómetro de masas de
acuerdo con el procedimiento de preparación de la
muestra descrito en detalle previamente, 20
modificado como se indica a continuación.
El material de matriz ( R- ciano-4-hidroxi- trans- ácido
cinámico) y de nitrocelulosa se disolvieron en acetona /
2-propanol (1: 1 v / v) a una concentración de ~ 20 y 5 g
/ L, respectivamente. Aproximadamente 0.5 μ L de la
solución de matriz / de nitrocelulosa se depositó en un
escenario de ejemplo de acero inoxidable, donde se
extendió rápidamente, lo que permite la evaporación
rápida del disolvente. 31 Las alícuotas de 0,5 μ L de
solución de analito (idénticos a los utilizados para ESMS
antes de desalado / concentración) se deposita sobre
estas superficies de la matriz, y se dejó que el
disolvente se evapore a temperatura ambiente. Las
muestras se aclararon mediante la colocación de un 5-
10 μ volumen L de agua en la superficie de la matriz
después de la solución de analito había secado
completamente. El líquido fue dejado en la muestra
durante 10 s y luego se derrumbó por aire a presión.
Este procedimiento de lavado se repitió dos veces.
Espectrometría de masas MALDI. Se obtuvieron
Todos los espectros de masas en un espectrómetro
de masas Bruker REFLEX modificado (BrukerFranzen
Analytik, Bremen, Alemania). El sistema de
adquisición de datos original fue reemplazado por un
LeCroy 9350AM 1 gigasample / s osciloscopio de
almacenamiento digital (LeCroy Corp., Chestnut
Ridge, Nueva York), desde donde solo tiro espectros
fueron transferidos a un ordenador Macintosh
PowerPC 7100/80 (Apple Computer Inc., Cupertino,
CA) a través de una tarjeta controladora de National
Instruments DAQ NI GPIB (National Instruments,
Austin, TX). Control de todos los parámetros de
adquisición de datos y la transferencia y posterior
promedio de los datos timeof al vuelo, así como todo
el procesamiento de datos aún más, se llevaron a
cabo utilizando el programa informático laserone
desarrollado en nuestro grupo. MALDI péptido
espectros fueron calibrados usando varios picos de
iones matriz como patrones internos.
Nanoes espectrometría de masas. Agujas para
electrospraying se hicieron con un extractor de
micropipeta (Modelo P-87 del tirador, Sutter
Instrument Co., Novato, CA) de los capilares de
borosilicato (Clark Electromedicina Instruments,
Pangbourme, Reading, Inglaterra) y recubierto de oro
en lotes de alrededor de 20 en una vapor instrumento
de deposición (SCD 020, Balzers, Wiesbaden,
Alemania). 22 digiere las proteínas secas se
redisolvieron en 10 μ L de ácido fórmico al 5% y se
concentró / desaló en un capilar similar al capilar de
pulverización que estaba llena de ~ 100 nL de POROS
sorbente R2 (PerSeptive Biosystems, Framingham,
MA), esencialmente como se describe en la ref 22.
nanoes se realizó en un API III (Sciex, Toronto,
Canadá) espectrómetro de masas como se describe
en las referencias 21 y 32. Q 1 exploraciones se
realizaron con un paso de masa 0,1 Da. Para el
funcionamiento en el modo MS / MS, Q 1 fue
establecido para transmitir una ventana de la masa de
2 Da, y los espectros se acumularon con 0,2 pasos de
masas Da. Resolución se establece de modo que las
masas de los fragmentos podrían ser asignados a
mejor que 1 Da. Puesto que no era por lo general de 1
h de tiempo de medición por mezcla de péptidos
disponibles, la energía de colisión fue sintonizado
individualmente para cada péptido para obtener los
mejores MS posibles / MS espectros.
Interpretación TandemMass Spectra y búsqueda de
base de datos. El uso de software desarrollado en
nuestro grupo basado en AppleScript (Apple) y
BioMultiView (Sciex), los fragmentos de masa con
mayor m / z en ellos '' serie de iones (nomenclatura de
acuerdo con ref 33) en los espectros MS / MS de
péptido tríptico se unieron en un tramo de secuencia
corto. Junto con la información del peso molecular, que
se ensamblaron en una etiqueta de secuencia de
péptidos 32 y compararse con una base de datos de
secuencias de proteínas utilizando PeptideSearch
versión 2.6. 9,34 Todas las búsquedas se realizaron
contra una base de datos de secuencia no redundante
(nrdB, preparada a diario por el grupo de C. Sander en
EMBL) que contiene actualmente más de 160 000
entradas. La base de datos completa nrdB fue
convertido para su uso por PeptideSearch con un
programa semanal. No hay restricciones en peso
molecular de proteínas, p YO, o especies de origen se
aplicaron en las búsquedas de bases de datos.
Después de un partido de proteína había sido
encontrado con una etiqueta de secuencia de péptido,
todas las series de iones se utilizaron para confirmar la
identificación con el MS completos espectro / MS
utilizando BioMultiView. Cada partido péptido que se
encuentra en la base de datos se verificó de esta
manera, y ninguno fue aceptado sobre la base de la
recuperación única de la base solo. Si no era rival para
un péptido particular, se utilizó una búsqueda
errortolerant. Este tipo de búsqueda se describe en la
ref Brevemente, una etiqueta de secuencia de péptido
divide un péptido en tres regiones: la región media,
donde se ha determinado la secuencia, y las dos
regiones en los extremos N y C-terminales del péptido.
Por sólo requiere la coincidencia de dos de las tres
regiones, los péptidos con aminoácidos diferencias en la
secuencia de ácido entre el péptido real y la entrada de
base de datos y péptidos modificados químicamente o
de forma natural pueden ser recuperados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El procedimiento de tinción de plata. Muchos
protocolos de tinción de plata que dicen más o menos
el mismo límite de detección (aproximadamente 1-10
ng) se han reportado (ver ref 26 y las referencias
citadas en la ref
25). Brevemente, las proteínas se separaron en geles
de poliacrilamida son fijos, y geles luego se tratan con
los sensibilizadores s sustancias conocidas para
mejorar el contraste entre las bandas de proteínas
teñidas y el fondo, lo que mejora la sensibilidad. Los
sensibilizadores actúan a través de diferentes
mecanismos químicos s el aumento de la unión de la
plata (ácido sulfosalicílico), la creación de imágenes
latentes de bandas por la precipitación de microgránulos
de sulfuro de plata (tiosulfato de sodio, DTT), promoción
de la reducción de plata (glutaraldehído), de complejos
cationes de plata libres no unidos a una proteína
(quelantes), etcétera 25,26 s y su aplicación es
opcional. Después de la sensibilización, el gel se
expone a la solución de nitrato de plata, y plata iones
complejos con las proteínas. En la fase de desarrollo
posterior, que es similar al revelado fotográfico, los
iones de plata forman complejos con la proteína se
someten a una reducción más rápida de iones de plata
libres. Las partículas de plata coloidal (entre 20 y 80 nm
35) entonces formar preferentemente en las bandas de
proteína en las dos superficies del gel, haciéndolos
visibles.
Elegimos la llamada variante “ácido” en la
clasificación de los métodos de tinción de plata
Rabilloud, 26 en el que el gel se trató con una solución
de nitrato de plata a pH neutro o débilmente ácido. En
contraste con la mayoría de los métodos, se omite el
tratamiento de fijación / sensibilización con
glutaraldehído, que es conocido para unir
covalentemente a la proteína a través de la formación
de base de Schiff con - y R- amino grupos. Nos
preocupaba que estas bases de Schiff serían no más
tarde ser hidrolizados cuantitativamente,
especialmente desde glutaraldehído puede producir
fácilmente oligómeros reticulados. 26 De acuerdo con
varios protocolos de tinción con plata publicados, la
etapa de glutaraldehído sensibilización no es
crucial para la obtención de los límites de
detección en el rango de nanogramos bajo (véase
también a continuación y la Figura 3).
Figura 1. Comparación del péptido tríptico mapas de Coomassie- y BSA teñido con plata. Las muestras de 0,8 pmol de BSA se aplicaron a dos pocillos
de un gel de poliacrilamida unidimensional. Uno de los carriles fue teñido con plata, y el otro fue teñido por Coomassie. Después del procesamiento, las
dos muestras resultaron en los nanoes espectros mostrados en A (teñidos con plata) y B (teñidos con Coomassie). Todos los picos marcados han sido
identificados por espectrometría de masas en tándem. Los picos marcados con un asterisco son de autodigestión tríptico. La figura muestra cerca de la
identidad entre el péptido mapas obtenidos por los dos métodos de tinción.

resuelto todos los picos de péptidos, y la

Se encontró necesario obtener fondo gel
completamente transparente El tratamiento de la
sensibilización con tiosulfato de sodio y era inofensivo
hacia moléculas de proteína. En contraste con los
métodos publicados, se realizó el tratamiento de
nitrato de plata al 4 ° C con el fin de minimizar las
reacciones de oxidación.
El límite de detección del procedimiento de tinción
para BSA fue de 1,6 ng (25 fmol) aplicada al gel. El
procedimiento descrito aquí, por lo tanto, parece ser al
menos tan sensible como protocolos descritos por
otros trabajadores. 25
Compatibilidad con Microcharacterization proteína.
Para establecer la compatibilidad de plata tinción con
microsecuenciación (en comparación con tinción de
Coomassie), las siguientes preguntas deben ser
abordados: (a) la conveniencia de péptidos se puede
recuperar después de la digestión de las proteínas
teñidas con plata, y si es así, si son químicamente
modificadas y que grupos químicos son los objetivos
para esta modificación, y (b) si el recuperaron péptidos
son los mismos que los recuperado de una proteína
digerir de Coomassiestained.
desviación estándar de la precisión de la masa fue
mejor que 19 ppm (Tabla 1). La relación señal-
tonoise en el espectro era incluso mejor que en un
análisis de una cantidad equivalente de proteína
teñida con Coomassie, una observación que
hemos hecho en otros análisis también (datos no
mostrados). Previamente se ha demostrado que
Coomassie puede formar picos de aducto
intensivos en los espectros de las proteínas
electrotransferidas. 36 Por lo tanto, la mejor
relación señal-ruido en el análisis de geles teñidos
con plata podría ser debido a la ausencia de
colorante de interferencia residual todavía
asociada con la muestra. Sobre la base de sus
masas, 34 péptidos trípticos fueron asignados a la
secuencia correspondiente a una cobertura de casi
dos tercios de la secuencia. Se observaron muy
pocos picos que no pueda asignarse a la
secuencia o al fondo conocido. Al igual que en la
investigación realizada por nanoes, no hubo
evidencia de modificación química de BSA.

Para arrojar luz sobre estas preguntas, alícuotas de

0,8 pmol de albúmina de suero bovino (BSA) se
cargaron en dos pocillos de una minigel, y se realizó la
electroforesis. A continuación, el gel se cortó en dos
 partes, una de las cuales estaba manchada por la
plata y el otro por Coomassie. Los geles se procesaron
como se describe en la Sección Experimental y como reveló cuatro productos de digestión. la
en el protocolo previamente establecido, 23 fragmentación subsiguiente de estos iones en m / z
respectivamente. Los espectros de masas nanoes se 547,4, 582,5, 653,5, y 740,5 MS producidos / MS
espectros que contiene información suficiente para
obtuvieron de las mezclas de péptidos extraídos, y,
como la Figura 1 y la Tabla 1 muestran, no hay la identificación de proteínas a través de la base de
diferencias pudo ser detectado en los mapas datos que busca usando etiquetas de secuencias
de péptidos 32
de péptidos resultantes. péptidos que contienen cisteína Incluso
se detectaron en el S- acetamida-alquilado

forma (como se confirmó por espectrometría de

tandemmass), lo que demuestra que sus grupos de
cisteína no se habían oxidado o destruidos de alguna
otra manera irreversible.

Para establecer la compatibilidad de tinción con

Figura 3D).
plata con espectrometría de masas MALDI, un
(36) Eckerskorn, C .; Strupat, K .; Karas, M .;
pequeño porcentaje de la misma muestra, como se
Hillenkamp, F .; Lottspeich, F.
usa para electrospray se aplicó a una superficie de la
electroforesis 1992, 13, 664-665. (37) Wilm, M .;
matriz (véase la sección Experimental). El espectro de
Neubauer, G .; Mann, M. Anal. Chem. 1996, 68, 527-
reflector resultante (Figura 2) isotópicamente
533.
Analytical Chemistry, Vol. 68, N ° 5 1 de marzo de
1996 853
A continuación se investigó si la tinción de plata
podría conducir a una sensibilidad mejorada para
el procedimiento general de detección de la
proteína en el gel para análisis final de
espectrometría de masas. Para este propósito, 80
fmol de BSA se aplicó a un gel de 1 mm. Esta
cantidad de proteína no era fácilmente visible
después de la tinción de Coomassie, pero se
detectó como una banda nítida y clara después de
la tinción de plata (Figura 3A). El análisis de
espectrometría de masas de
nanoelectropulverización de la digestión tríptica de
esta banda en Q 1 modo de exploración mostró
sólo picos de autolisis de tripsina pero no hay
picos de péptidos de la proteína. Sin embargo, un
análisis de ion primario para el ión imonio de Leu o
Ile 37
 de cartografía péptido MALDI de las proteínas
Table 1. Measured Peptides Masses from Figures 1 and 2
teñidas con plata, incluso en este nivel de
AA calcd M r nanogramos bajo,
(Da) a MS/MS
residues (monoisomers) ∆ M b sequence c
La secuenciación de un gran número de
466-471 659.35 - 0.03 TPVSEK péptidos. La secuenciación de muchos péptidos
132-136 664.37 0.01 KFWGK
212-217 688.37 0.01 AWSVAR podría demostrar la aplicabilidad general de la
188-194 702.40 0.01 VLASSAR técnica de tinción de plata tanto por robusto y
5-10 711.37 0.04 SEIAHR
174-180 757.42 0.02 GACLLPK aplicable en la práctica la secuenciación de
233-239 788.46 0.02 LVTDLTK
428-435 816.48 - 0.03 SLGKVGTR
proteínas a partir de geles teñidos con plata y por la
538-544 817.42 0.02 ATEEQLK ausencia de modificaciones inducidas por la tinción.
205-211 819.46 - 0.07 FGERALK
218-224 846.50 0.01 LSQKFPK
En un proyecto que involucra proteínas de levadura
459-465 897.47 - 0.05 LCVLHEK biológica (colaboración con T. Hyman, EMBL), que
181-187 905.46 0.04 IETMREK
137-143 926.49 0.02 X YLYEIAR
con frecuencia identificamos muchas proteínas a
209-217 1000.58 0.02 ALKAWSVAR partir de una sola dimensión geles de poliacrilamida
574-583 1001.58 0.03 X LVVSTQTALA
525-533 1013.61 nf d X QTALVELLK sionales o bidimensional. Un tal gel s una
137-144 1082.59 0.03 YLYEIARR separación de una fracción de las proteínas
564-573 1106.51 0.07 EACFAVEGPK
524-533 1141.71 0.02 KQTALVELLK purificadas por afinidad a partir de levadura en
233-242 1152.68 nf d X LVDTLTKVHK
ciernes s se presenta aquí como un ejemplo. El, gel
42-51 1162.62 - 0.02 X LVNELTEFAK
436-444 1165.49 0.03 CCTKPESER de poliacrilamida unidimensional teñido con plata
1-10 1192.59 0.02 DTHKSEIAHR
378-388 1304.71 0.01 X HLVDEPQNLIK
muestra en la figura 4 revela una mezcla compleja,
534-544 1307.72 - 0.07 HKPKATEEQLK que contiene proteínas con una masa molecular en
65-76 1418.69 0.00 X SLHTLFGDELCK
336-347 1438.80 0.00 RHPEYAVSVLLR
el intervalo de 30-250 kDa y cantidades de la baja
52-64 1462.58 0.06 TCVADESHAGCEK nanogramo a la 1 μ gama g. Varias bandas de
397-409 1478.79 - 0.03 X LGEYGFQNALIVR
274-285 1531.77 0.01 LKECCDKPLLEK interés para el proyecto biológica se extirparon y se
459-471 1538.81 - 0.01 LCVLHEKTPVSEK procesaron como se describe en la Sección
323-335 1566.74 - 0.01 DAFLGSFLYEYSR
413-427 1638.93 - 0.05 X KVPQVSTPTLVEVSR Experimental.
323-336 1722.84 - 0.06 DAFLGSFLYEYSRR
445-458 1723.83 - 0.05 MPCTEDYLSLILNR
484-499 1879.91 - 0.04 X RPCFSALTPDETYVPK Como una herramienta para investigar las
505-520 1906.91 0.07 X LFTFHADICTLPDTEK
muestras de proteínas procesadas, elegimos la
317-335 2300.07 - 0.03 NYQEAKDAFLGSFLYEYSR
QNCDQFEKLGEYGFQNALI secuenciación mediante espectrometría nanoes
389-409 2528.21 - 0.05 VR
tandemmass, que ha demostrado ser una
a Calculated minus measured mass from the MALDI spectrum in Figure 2. b poderosa herramienta en proyectos de
NanoES tandem mass spectrometry was performed of the peptides marked in
this colum (shown in Figure 1). c C designates identificación de proteínas. 23
S- carbamidomethyl cysteine. d nf, not found.
Esta técnica es muy adecuado para la
La sensibilidad de la técnica de MALDI se secuenciación de alta sensibilidad debido a su
examinó mediante la aplicación de 10% de la robustez y velocidad, y porque no hay necesidad
mezcla de digestión se ha mencionado de separación cromatográfica de la mezcla de
anteriormente a una diana MALDI y la medición de péptidos. Nanoes espectrometría de masas en
un espectro de reflector. la precisión y la resolución tándem permite no sólo la determinación de
de masa se mantuvieron sin cambios a partir de la péptidos modificados en los digestos no
Figura 2 y la secuencia de la cobertura fue todavía separadas, sino también la determinación de la
39%. picos Diez que no podía ser correlacionada naturaleza de la modificación y la localización de
con la secuencia de BSA son evidentes en el su sitio. 37-39
espectro (marcado por asteriscos en la figura),
cuatro de los cuales son productos conocidos
autodigestión de tripsina y seis de los cuales no se
podrían asignar. No es raro observar picos no
asignables en MALDI espectros de péptido mapas a
partir de geles, es decir, picos que no corresponden
a masas de péptidos predichos o los cambios de
masa fácilmente explicables los mismos. Para
probar la viabilidad de la identificación de proteínas
Anteriormente, hemos demostrado que la Las familias de genes y empalme variantes (es
sensibilidad de la fuente de iones nanoes en nuestro decir, proteínas que difieren debido a diferente
instrumento de triple cuadrupolo para la procesamiento de ARNm) pueden todavía
secuenciación se encuentra en el 5-10 fmol / μ conducen a varias coincidencias, pero la identidad
gama L de mezclas de péptidos. Esto significa que, de los péptidos secuenciados es cierto.
con un rendimiento global del protocolo de incluso
20%, debe ser posible analizar mezclas de péptidos En el contexto de esta cierta identificación, nos
derivados partir de la 25-50 fmol de proteína sorprendieron los resultados de las bandas 5 y 7,
cargada en un gel, compatible con la sensibilidad de que se identificaron como proteínas de virus en
la tinción con plata. En la práctica, el problema no lugar de proteínas de levadura. Sin embargo,
está en la sensibilidad absoluta de la máquina pero recuperación
sobre todo en la capacidad de reconocer los
péptidos en el ruido químico. En el caso de nanoes,
la relación señal a ruido se puede aumentar
mediante exploraciones ion primario para la
detección selectiva de péptidos en mezclas
complejas, 37 como ya se ha explicado en los
experimentos con modelos de BSA.

Todas las ocho bandas de proteínas escindió

del gel teñido con plata se identificaron con éxito, y
los resultados se presentan en la Tabla 2. Puesto
que ninguna limitación se colocó en el peso
molecular de proteínas en la búsqueda de base de
datos, la coincidencia de pesos moleculares de
proteínas sólo es compatible con la validez de su
identificación. Como se explica en la Sección
Experimental de recuperación única de una
proteína sobre la base de una etiqueta de
secuencia de péptido no fue aceptado como una
prueba de la exactitud de una identificación. Más
bien, la secuencia del péptido recuperado tuvo que
coincida con las MS completos / espectro de MS y
no sólo la parte corta utilizados para construir la
etiqueta de secuencia. En este esquema de
coincidencia, la presencia de serie de todos los
iones (A, B, Y '', y la serie B a partir de prolina
interna) y la baja abundancia de algunos iones de
fragmentos (tales como los de la escisión C-
terminal a una prolina) se toman en cuenta. La
identificación positiva de una proteína se hizo
sobre la base de al menos tres péptidos
secuenciados de esta manera, y al menos 40
amino ácidos fueron cubiertos en la proteína: 101
aminoácidos por proteína en promedio. [Sin tener
en cuenta el caso de una proteína que estaba
presente como una traza en una mezcla de otras
proteínas y de los cuales apareció sólo un péptido
(véase la Tabla 2)]. Nos gustaría señalar que la
identificación de una proteína en una forma tal es
seguro y no meramente muy probable.
Figura 2. Espectro de masa del reflector MALDI de la mezcla de péptidos trípticos de 0,8 pmol de BSA aplicada a un gel. Se aplicó un volumen de 0,5 \
mu l de \ sim 25 \ mu l de solución de péptido a la diana MALDI. El inserto muestra la resolución de aproximadamente 2400 fwhh obtenida en los
péptidos. Todas las masas asignadas corresponden a péptidos trípticos dentro de 50 ppm, y la desviación estándar del error de masa es de 19 ppm (ver
Tabla 1). Los picos marcados adicionalmente por asteriscos son de productos de autodigestión trípticos u otros iones de fondo. Para mayor discusión,
vea el texto.

de información sobre las coincidencias encontradas
identificaron las dos proteínas como originadas por el
virus L-A de Saccharomyces cerevisiae, un virus de
ARN bicatenario no envuelto que se sabe que infecta
a S. cerevisiae
culturas. Dado que el genoma de este virus no forma
parte del genoma de la levadura, estas proteínas se
identificaron solo porque las etiquetas de la
secuencia peptídica se buscaron en la base de datos
inclusiva, no una restringida a ciertas especies.
Como se muestra en la Tabla 2, también se
identificaron otras proteínas que no son levaduras,
queratinas humanas.
La banda 7 también ilustra otra cuestión interesante
en la identificación de proteínas. La proteína
encontrada no se ha caracterizado bioquímicamente,
pero solo se conocía como un marco de lectura
abierto, es decir, una región de ADN derivada de la
secuenciación genómica que parecía codificar una
proteína. Por lo tanto, parece que esta proteína se
ha observado por primera vez en este experimento.
Se descubrió que la banda 4 (ver Tabla 2) contenía
tres proteínas que se identificaron de manera
confiable. La reinspección de otros carriles del gel
reveló una banda adicional débil justo por encima de
la banda principal. Por lo tanto, la técnica de
secuenciación por NanoES e identificación por
etiquetas de secuencia peptídica no se limita a
proteínas aisladas, sino que también puede
ocuparse de mezclas de proteínas no separadas,
una ocurrencia común en geles unidimensionales. Al
secuenciar proteínas a niveles muy bajos, como en
el contexto de geles teñidos con plata, las mezclas
de proteínas son la regla más que la excepción.
Como ejemplo, las queratinas humanas
mencionadas anteriormente que se originan a partir
de productos químicos y / o manipulación de
muestras a menudo se vuelven ubicuas en estos
niveles bajos. Hemos encontrado que el patrón real
de los péptidos de queratina no es predecible, por lo
que no se pueden restar usando un control.
No se pudieron asignar tres péptidos de las bandas 5 y 8 a los péptidos en la base de datos mediante una primera
búsqueda en la base de datos usando el enfoque de etiqueta de secuencia peptídica. Para verificar si eran
posibles productos de oxidación debido a la tinción con plata, era importante dilucidar su origen. Las búsquedas
de bases de datos tolerantes a errores que buscan una coincidencia de solo dos de las tres regiones de una
etiqueta de secuencia de péptidos permiten la identificación de picos cuya masa no se ajusta a ninguno de los
péptidos esperados presentes en la base de datos. (Tenga en cuenta que las modificaciones comunes como la
metionina oxidada y la cisteína acrilamidada se tuvieron en cuenta en la búsqueda directamente, por un peso
molecular modificado de estos aminoácidos).

El siguiente caso sirve como ilustración del procedimiento. En el mapa peptídico de la banda 5, observamos un
pico intensivo doblemente cargado a m / z 685.9 (Figura 5A).

Una serie de iones que se supone son iones Y '', que especificaron la secuencia parcial EVS, se recuperó rápida e
inequívocamente del espectro MS / MS de este pico como se describe en la Sección Experimental (Figura 5B). A
partir de este espectro único, no pudimos extender directamente la secuencia parcial al término C, ya que una
gran cantidad de picos de baja intensidad dieron como resultado demasiadas ambigüedades para continuar la
serie de iones Y ''. Búsqueda en la base de datos nrdb con la etiqueta de secuencia (870) SVE (1184.6) y masa
peptídica monoisotópica neutra 1369.8 Da no recuperó coincidencias. La búsqueda tolerante a errores coincidió
con un péptido parcial de la misma proteína viral (SVEVS). Esta secuencia N-terminal fue confirmada en el
espectro por la serie de iones B. El péptido tríptico correspondiente SVEVSTTIYDTHVQAGAHAVYHASR, sin
embargo, tiene la masa 2688.3 Da, lo que indica que
Figura 3. Sensibilidad de los métodos de espectrometría de masas demostrados en 80 fmol de BSA (5 ng) aplicados a
un gel de poliacrilamida unidimensional. (A) Imagen escaneada del gel teñido de plata con tres cantidades diferentes
de BSA cargado. El carril de 1,6 ng (25 fmol) todavía se puede detectar, mostrando una buena sensibilidad del
procedimiento de tinción. (B) espectro de masa reflector MALDI de la mezcla de péptidos trípticos del carril de 80 fmol;
El 10% de la mezcla de péptidos extraída se aplicó al objetivo. La precisión y la resolución de la masa fueron tan altas
como en la Figura 2. Las principales diferencias con respecto a la Figura 2 son una cobertura de secuencia más baja
(39 frente a 62%), una relación señal / ruido ligeramente más baja y la aparición de más picos que no corresponden a la
secuencia BSA (productos de autólisis de tripsina y otros iones de fondo, marcados con asteriscos). (C) Exploración
de iones parentales para el ión imonio de isoleucina / leucina (m / z 86) en los péptidos extraídos del carril 4 en A (5
ng). Los picos marcados han sido secuenciados por espectrometría de masas en tándem. (D) Análisis espectrométrico
de masas en tándem del pico con m / z 547.4 en C.

un sitio de escisión adicional debe estar presente en la secuencia y que puede ser la razón de la diferencia entre la
secuencia del péptido y la secuencia en la base de datos. Desde Arg o Lys debería ser el C-terminal del péptido,
restamos sus masas de la masa medida del péptido. La masa obtenida se encuentra como una pieza N-terminal
de la secuencia recuperada,
Figure 4. Scanned picture of a silver-stained gel from a onedimensional gel separation
of a fraction of yeast proteins. The bands used in the subsequent mass spectrometric
analysis are marked.

namely SVEVSTTIYDT R, and this sequence indeed fits the tandem mass
spectrometric data. One point mutation or a single mistake in a nucleotide
sequence can explain the observed sequence difference of R versus H.

Two other cases of inconsistency with the database sequences were

found in the heat shock protein (band 8) (data not shown). The method of
error-tolerant searching was applied essentially as described above. All
three cases of disagreement between found sequences and ones retrieved
from a database could be ascribed to the sequence, and in no case could
they be associated with an oxidative destruction processes.

Absence of Chemical Modifications. The sequencing encompassed more

than 80 peptides covering more than 1000 amino acid residues. A
representative range of amino acid compositions including all amino acids
was thus present in these peptides. Even peptides containing amino acid
residues highly susceptible to chemical modification were identified in their
native form, and in none of the peptides did we observe any indications of
protein oxidative destruction. Cysteine-containing peptides (four in four
proteins) were detected in an acetamide-alkylated form or (in one case) in an Figure 5. ( A) Peptide map of band 5 from the gel in Figure 4. Peaks marked with a bullet
were sequenced and used for a database search. (For identification see Table 2.) Peaks
acrylamide-modified form. Since alkylation was performed after staining, it
marked with asterisks are tryptic autolysis products. (b) Tandem mass spectrum of the ion
appears that no cysteine oxidation to cysteic acid or desulfurization took with
place during

m/z 685.9 (peptide T 568-597 2+ in Figure 5a) used for error-tolerant searching as discussed
in the text.

treatment with silver nitrate. Eight methionine-containing peptides were found in

five proteins. Five were detected in the native form, two were found in both the
native and sulfoxide forms, and one was found in the oxidized form only. Partial
oxidation of methionine residues is, in our experience, frequently observed in
the analysis of polyacrylamide gel-isolated proteins and has also been reported
by other groups. 40,41 All eight tryptophan-containing peptides in five proteins
were observed in their native form.

Table 2. Identification of Yeast Proteins in the Fraction Eluted from the Affinity Column, Separated by One-Dimensional Polyacrylamide Gel and Visualized by Silver Staining

no. of no. of amino

band apparent mol MW, peptides acids covered
no. a
mass, kDa protein identified acc. no. b calcd sequenced

1 210 fatty acid synthase, subunit R P19097 208 11 128

2 205 fatty acid synthase, subunit â P07149 228 14 175
3 180 clathrin, heavy chain P22137 187 12 164
4 110 R- ketoglutarate dehydrogenase P20967 114 3 40
phosphofructokinase 1 P16861 108 3 43
vesicular traffic control protein SEC15 P22224 105 1 10
5 80 S. cerevisiae virus L-A major coat protein P32503 76 7 86
6 75 vacuolar sorting protein 1 P21576 78 9 118
7 70 gene, “cap”; product, “capsid”; S. cerevisiae U01060 78 3 55
virus L-A complete genome
8 70 heat shock protein SSA1 P10591 70 8 124
contaminating human keratins c P04264 57-65 6 74
 P12035

P13645

P35908

a Band numbers correspond to the gel in Figure 4. b Accsession numberes correspond to SwissProt database, except no. 7, which corresponds to GenPept. c Human keratins were found as
the minor impurities in all the fractions analyzed.

Analytical Chemistry, Vol. 68, No. 5, March 1, 1996 857

MALDI analysis of several of the proteins (data not shown) also confirmed ES MS/MS technique combined with protein identification with peptide
the above findings. sequence tags. Protein sequencing on this level is often a sequencing from
mixtures (e.g., with human keratins), where the target protein is not always a
major component. Thus, the possibility of sequencing protein mixtures is a
All the results obtained in the present study show that no considerable
vital point when dealing with proteins in the silver staining range. The
oxidative damage occurs during silver staining of proteins in polyacrylamide
analysis of proteins at low levels often rests on a small number of detected
gels. This result was unexpected from common belief 42 but is in agreement
peptides. This means that it is not practical to split the collected data into
with what is known about the mechanism of the silver staining process. 26
acceptable and nonacceptable spectra and to use only the former ones for
Our results suggest that no “primary” protein oxidative destruction is
the interpretation and protein identification. Particularly for samples in low
necessary to generate the nucleation centers for the formation of colloidal
amounts, this underlines the usefulness of the sequence tag approach as
silver granules, visualizing the protein bands. Protein oxidative modification,
compared to approaches based on complete spectrum interpretation.
if it occurs at all, seems to be a minor side reaction and not a main process
that could be responsible for image development or for determining the
detection sensitivity.

As we have demonstrated, silver staining has considerable advantages

compared to the traditional Coomassie staining technique. Not only is the
detection limit nearly 100 times lower than that obtained with Coomassie
CONCLUSION AND PROSPECTS
staining, but the sample preparation time is shortened and the total
procedure results in less background. Thus, we recommend that silver
The above results clearly prove that silver staining (at least in the form staining be widely used in microanalytical work.
used here) is compatible with microanalytical protein characterization because
it does not introduce chemical modifications. Even side chains known to be
quite unstable toward oxidation, such as the -SH groups of cysteine,
methionine, and the tryptophan side chain, “survive” treatment with silver ACKNOWLEDGMENT
ions. Results we have obtained in similar studies with zinc-imidazole reverse
staining using the method of Fernandez-Patron 42,43 yielded essentially the
We thank the other members of the Protein & Peptide Group for active
same results as silver staining.
assistance, especially Anna Shevchenko for preparation of the gels, Ole
Jensen for critical discussion of the manuscript, and the group of T. Hyman
for good collaboration. Generous financial support for part of the work was
provided by a grant of the Bundesministerium fu¨r Biologische Forschung.
Mass spectrometric microsequencing of proteins at the
silverstained level pointed out some specific advantages of the Nano