Guia Labo Micro

UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA DE ICA”
Facultad de Medicina “Daniel Alcides Carrión”
Los laboratorios de microbiología clínica son ambientes especiales con respecto a la seguridad
de aquellos que trabajan en ellos y los riesgos pueden extenderse a laboratorios adyacentes y a
las familias del personal, es por eso que ciertos aspectos de la organización, diseño y
funcionamiento de este tipo de laboratorio deben ser aceptado en general como buenas prácticas
de seguridad en todas las áreas especializadas del laboratorio.
Existen dos fuentes importantes de riesgos biológicos en el laboratorio de Microbiología Clínica:

 El incremento de los riesgos que producen los cultivos de microorganismos.
 Y los microorganismos que se encuentran presentes en las muestras como sangre y
otros líquidos corporales, principalmente los virus de Hepatitis y VIH.
OBJETIVOS DE BIOSEGURIDAD
 Proteger al personal de laboratorio contra la exposición innecesaria e injustificada a
agentes infecciosos
 Salvaguardar la integridad de la muestra clínica, contra la degradación o contaminación
cruzada que pueda poner en peligro la validez de los hallazgos de Laboratorio.
 Mantener los agentes infecciosos dentro de los límites del laboratorio con la finalidad de
proteger a la comunidad.
CONCEPTO GENERAL DE BIOSEGURIDAD

La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas de sentido común para proteger la salud
y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesgos producidos
por agentes biológicos. Complementariamente se incluyen normas contra los riesgos producidos
por agentes físicos, químicos y mecánicos.
Laboratorio Microbiología Blga. María Pilar Martinez

PRINCIPIOS BASICOS
Universalidad: Asume que toda persona está infectada y que sus fluidos y todos los objetivos
que se ha usado en su atención son potencialmente infectantes, ya que es imposible saber a
simple vista, si alguien tiene o no una enfermedad.
Colocación de barreras protectoras: Un medio eficaz para evitar o disminuir el riesgo de

contacto con fluidos o materiales potencialmente infectado, es colocar una “barrera” física,
mecánica o químico entre persona y objeto.
PRACTICAS O MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Las siguientes medidas preventivas están diseñadas para minimizar los riesgos de infecciones.
1. Lavado de manos
El lavado de manos es una de las medidas preventivas más eficaces y debe realizarse:
 Antes de : Iniciar un procedimiento
 Después de : Manipular objetos o instrumentos contaminantes, tocar fluidos
corporales, piel, mucosas, sangre, etc.
El lavado de manos debe ser riguroso, con jabón o soluciones que contengan yodoforos
(Isodine, yovisol, etc.) por un tiempo de 3 – 5 minutos.
Para el secado se debe utilizar toallas en forma individual y en lo posible papel toalla
descartables.
2. Uso de barreras
Contención primaria. - Es la protección del personal y del medio ambiente inmediato contra
la exposición a agentes infecciosos y/o productos de riesgo químico. Se usan guantes,
mandil, mascarillas, etc.
Contención secundaria. - Es la protección del medio ambiente externo contra la exposición

de material infeccioso. Se logra por una combinación de las características de la edificación
y practicas operacionales.

3. Uso de antisépticos
Los antisépticos se usan en la preparación de la piel y mucosas antes de cualquier
intervención o para reducir el riesgo de infectarse después de cualquier contaminación
superficial, y estos pueden ser:
 Alcoholes (60 – 90°), etílico, isopropitico, alcohol metilado
 Gluconato de Clorohexidina (4%), Hibiscrub
 Hexaclorofeno (3%), phisohex
 Yodos (1-3%), acuoso y tintura, alcohol yodado
 Yodóforos, yodopovidona en diferentes concentraciones, Isodine, Betadine, Yovisol,
etc.
4. Manejo de agujas hipodérmicas

Las agujas y jeringas se deben de usar una sola vez y la cubierta protectora de las agujas
se debe de colocar correcta y cuidadosamente. Al finalizar su uso se deben de descartar en
recipientes de paredes resistentes e incinerarlos.

5. Limpieza, descontaminación y desinfección de alto nivel (DAN)

Limpieza: Proceso que permite eliminar los desechos orgánicos y otros para facilitar el
proceso de descontaminación.
Descontaminación: Proceso que permite disminuir notablemente los microorganismos

presentes en materiales - instrumentos y superficies de trabajo probablemente
contaminadas, este proceso se consigue mediante el uso de los siguientes agentes
químicos:
 Solución de cloro al 0.5% por 10 minutos
 Fenol al 5%
 Peroxido de hidrogeno al 6%
 Glutaraldehido
 Fomaldehido
DAN: Permite la erradicación del 94% de microorganismos, excepto esporas, se usan los
siguientes agentes químicos:
 Solución de cloro al 0.5% por 5 – 10 minutos
 Formaldehído al 8% por 24 horas
 Glutaraldehido al 2%, alcalina, neutra o ácido a 25° C (77 °F) por 20 minutos.
6. Esterilización
La esterilización erradica el 100% de microorganismos y es necesario realizar cuando se
cuenta con materiales como muestras biológicas, materiales con cultivos y otros antes de
eliminarlos o reutilizarlos.
La esterilización puede ser Físico o Químico:
Físico:
 Calor Húmedo : Autoclave a 121° C, 15 libras de presión por 20 – 30 minutos

 Calor seco : Horno a 180° C por 60 minutos o 160° C por 120 minutos
aproximadamente.
 Radiación UV.
Químico:
 Liquido : Inmersión en glutaraldehido al 2% por 8 horas.
Inmersión en ácido paraetico.
 Gas : Gas de óxido de etileno.
Gas de formaldehído.
Vapor de peroxido de hidrógeno.

El laboratorio de microbiología clínica presenta muchos peligros para las personas

desprevenidas y no entrenadas por lo que mediante este texto damos a conocer a los alumnos,
docentes y otros, las normas generales de trabajo que se deben de cumplir con la finalidad de
evitar accidentes.
NORMAS GENERALES:
 Estar presente en el laboratorio a la hora señalada para sus prácticas.
 Ingrese al laboratorio con su mandil puesto para evitar contaminar su ropa de uso diario
durante las prácticas, quitársela antes de abandonar el mismo.
 No coma, no beba ni fume dentro del laboratorio y evite llevarse cualquier objeto a la
boca.
 Coloque sus enseres personales como libros, maletines u otros, en lugares apropiados,
donde no puedan estar sujetos a contaminación por las muestras, cultivos, etc.
 Evite salir con el mandil fuera del laboratorio, mientras se desarrolle la práctica.
 Evitar el contacto directo de las mesas de trabajo, papel u otro material de uso frecuente
en el laboratorio con las muestras biológicas potencialmente contaminadas.
 Mantenga el orden y la disciplina durante el desarrollo de la práctica. No propicie ni
fomente los malos hábitos.
 Mantener las mesas de trabajos limpios y despejados de materiales innecesarios.
 Cumplir con el trabajo señalado por el profesor durante el desarrollo de las prácticas.

AL FINALIZAR LAS PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA

Para la finalización del trabajo práctico, el alumno tomara en cuenta lo siguiente:
a) Todos los cultivos que se incuben, deben tener las siguientes anotaciones:
 Grupo y mesa de trabajo
 Nombre del germen o muestra cultivada
 Fecha de Siembra.
b) Los tubos deben estar bien tapadas y colocadas en gradilla
c) Colocar los cultivos en la estufa a 35-37° C.
d) Concluida la practica:
 Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo.
 Dejar ordenado los materiales y/o reactivos para la siguiente practica
 Lavarse cuidadosamente las manos
 Anotar los requisitos o muestras necesarias para la siguiente práctica.
MATERIALES Y EQUIPOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA CLINICA
Los materiales de uso en el laboratorio de microbiología clínica, especialmente los de vidrio,

como tubos, pipeta y otro deben ser de vidrio neutro, encontrarse en buenas condiciones sin
rotura ni rajaduras, limpios y estériles. Entre los materiales más usados tenemos:

Materiales de Vidrio TUBOS DE ENSAYO

 Placas de petri
 Tubos de ensayo de diferentes medidas
 Láminas portaobjetos
 Varilla portaláminas
 Matraces
 Vaso de precipitación
 Pipetas
 Frasco gotero
 Probeta
 Agitadores o Baguetas
 Mecheros de ron o de alcohol.
MATRAZ
PLACA PETRI
VASO PRECIPITADO
PIPETA
PROBETA
MECHERO

Equipos
 Microscopio
 Autoclave
MICROSCOPIO
 Horno para esterilización
 Estufa de incubación a 37 °C
 Baño María
 Centrífuga
 Refrigerador
 Balanza
Otros
 Mechero de Bunsen
 Asa bacteriológica o de henle
 Pipetas automáticas
 Bombilla de seguridad
MICROSCOPIO ASA BACTERIOLOGICA
PIPETA AUTOMATICA
MECHERO BUNSEN

Eliminación apropiada de los desechos y flujo de trafico

Una vez concluido cualquier procedimiento, debe eliminarse en forma apropiada todo
material u objeto contaminado. Los recipientes usados deben ser los adecuadas como:
 Balde de plástico con tapa a prueba de fuga, que contengan soluciones cloradas al
0.5% o cualquier otro desinfectante
 Recipiente resistente a los pinchazos, de boca lo suficientemente apropiada para que
ingresen solo agujas y otros artículos punzo cortantes ya usados.
 Recipientes con tapa a prueba de fuga para materiales contaminados (gasas, algodón)
TIPO DE LABORATORIO CON RELACION AL NIVEL DE RIESGO

Los laboratorios se clasifican de acuerdo al nivel de riesgo, diseño y barreras de contención que
requieran.
Laboratorio con nivel I de bioseguridad

Es un laboratorio básico que permite el trabajo con agentes biológicos de bajo riesgo. El
laboratorio no está separado del edificio y el trabajo se realiza en mesas de laboratorio.
 Laboratorio en centros de Salud
 Laboratorios de hospitales de Nivel Local
 Laboratorios de diagnostico
 Laboratorio de Universidad y Centros de enseñanza
Los agentes biológicos manipulados en el nivel I, son aquellos que no poseen potencial patógeno
conocido para las personas inmuno competentes. Ejemplo: Bacillus Subtilis, Mycobacterium
gordonae,

Laboratorio con nivel II de bioseguridad

Laboratorio básico que cuenta con cámara o gabinete de bioseguridad y otros dispositivos
apropiados de protección personal o de contención física para proteger al operador
Laboratorio de Hospitales Regionales y de Salud pública. Los microorganismos o agentes
biológicos incluidos son los que se encuentran con mayor frecuencia en las muestras clínicas,
incluyen todos los agentes comunes de enfermedades infecciosas. Ejemplo: Salmonella,
Shigella, Mycobacterium tuberculosis.
Laboratorio con nivel III de bioseguridad

Laboratorio en los que se incluyen, además de las precauciones del nivel II, otras como el diseño
e ingeniería que aumentan el aislamiento del material potencialmente peligroso y el uso de
vestimenta y dispositivos protectores apropiados. Es de acceso restringido.
 Laboratorio de Diagnostico Especializado
Los procedimientos correspondientes al Nivel III de Bioseguridad han sido recomendables para
el manejo de material que presuntamente contiene ciertos virus como el de la estomatitis
vesicular, algunas arbovirus y arenavirus.

Laboratorio con nivel IV de bioseguridad

Los laboratorios de nivel IV de Bioseguridad son de contención máxima por lo general aislado de
los edificios, el personal y otros materiales son descontaminados antes de salir del laboratorio y
todos los procedimientos se realizan bajo las máximas condiciones de aislamiento (trajes o
gabinetes con presión regulada). Cuentan con sistemas de apoyo exclusivo y en cuyo diseño
incluyen barreras de contención que dan protección máxima al personal y/o comunidad. Sirven
para trabajar con agentes como el virus del Ebola.

Objetivos
 Saber que tipo de muestra es necesaria y como ha de obtenerse para el estudio
microbiológico de las distintas patologías.
 Conocer los métodos de obtención de las muestras más características (orina,
heces, esputo, etc.)
 Conocer como se deben transportar las muestras o especímenes, y los medios
que se disponen para ello.
Selección de la Muestra
Las consideraciones más importantes que deben tenerse en cuenta son que la muestra debe ser
representativa del proceso patológico y que la cantidad recogida sea suficiente para asegurar un
examen completo y adecuado. Por ejemplo, una pequeña cantidad de suero drenado de la úlcera
del pie de un diabético con una osteomielitis adyacente no es probable que permita encontrar
microorganismos. En el ejemplo citado, la muestra ideal sería una biopsia de hueso (para ser
estudiada histológica y bacteriológicamente). Aunque con frecuencia no es posible obtener tejido
infectado, éste es sin duda la muestra ideal. En orden de conveniencia el siguiente es un exudado
francamente purulento. En caso de una lesión progresiva de piel y tejido subcutáneo, el material
del margen activo de la lesión es la elegida. Los materiales obtenidos de localizaciones
normalmente estériles del organismo proporcionan un espécimen excelente. Si se sospecha de
un anaerobio se debe tener todo el cuidado necesario para no ponerla en contacto con el medio
ambiente.
Recolección o Toma de Muestras

Generalmente el informe del laboratorio bacteriológico solo puede indicar los hallazgos obtenidos
por examen microscópico y cultivo.
De esta manera se confirma o no un diagnóstico etiológico. Sin embargo, el fracaso en el
aislamiento del agente causal no se debe necesariamente a métodos técnicos inadecuados; a
menudo se debe a una mala toma de muestras. Con frecuencia en los hospitales con muchos
pacientes la recolección de la muestra se relega a personas que no comprenden los requisitos
ni las consecuencias de tales procedimientos. El laboratorio es el que proporciona los materiales
estériles y las instrucciones adecuadas. A continuación, se presentan las recomendaciones
generales para la toma de muestras:
 Siempre que sea posible las muestras deben ser obtenidas antes de iniciar la
administración de agentes antimicrobianos.
 Las muestras deben ser tomadas de los lugares donde sea más probable
encontrar al microorganismos y evitando la contaminación externa en los
posible.
 Se debe recolectar la muestra en el estadio de la enfermedad en el cual es más
probable encontrarlo.

 La cantidad de muestra colectada debe ser suficiente.

 Se deben colectar en recipientes estériles y evitar la contaminación externa del
recipiente con la muestra.
 Las muestras una vez obtenidas, deben ser remitidas rápidamente al laboratorio
o ser transportadas en un medio ideal.
 El laboratorio debe recibir la suficiente información clínica para guiar en la
selección de los medios y técnicas adecuadas.
Transporte de las muestras.

En el examen microbiológico de las muestras clínicas es esencial que el envase que las contiene
no contribuya con su propia flora microbiana. Además, la flora originas no debe multiplicarse ni
disminuir debido a una permanencia prolongada en la sala o una prolongada refrigeración en el
laboratorio. En otras palabras, debe usarse un recipiente estéril y la muestra debe inocularse
tan pronto como sea posible.
Existe una serie de medios de transportes, cuya finalidad es prolongar la viabilidad del
microorganismo:
 Hisopo de poliéster más ampolla de vidrio con medio stuart.
 Medio de transporte Stuart
 Medio de transporte Cary-blair
Los medios de transporte consisten en un agar semisólido con pH regulado que carece de
nutrientes, pero que contiene tioglicolato de sodio como agente reductor. Previenen la
deshidratación de las secreciones durante el transporte y la oxidación y autodestrucción
enzimática de los patógenos presentes, asi como la inhibición de la multiplicación de la flora total
presente. A continuación, se presentan las especificaciones para la recolección de las diferentes
muestras:
SECRECIÓN FARINGEA
Debe tomarse muestras con hisopo estéril de cada área amigdaliana antes de obtener otras de
la pared posterior de la faringe.
Recolección de la Muestra:
Con ayuda de una espátula de madera, se deprime la lengua y se solicita al paciente que
pronuncie la letra “a”, al mismo tiempo con un hisopo estéril humedecido en suero fisiológico se
frota cada área de las amígdalas y sobre la faringe posterior a fin de obtener una adecuada
muestra.

No debe transcurrir más de 1 hora desde el momento de la toma de la muestra hasta realizar el
frotis o su inoculación al medio de cultivo, a no ser que se utilice un medio de transporte.
SECRECIONES BRONQUIALES Y ESPUTO

El esputo es el material expulsado de los pulmones, tráquea o bronquios por la tos, y está
formado en gran parte del exudado mucoso inflamatorio.
Recolección de la Muestra
La recolección y transporte del esputo, constituye un riesgo para la salud pública, para el
laboratorista.
Debe adoptarse toda clase de precauciones para evitar la contaminación externa del envase y
salvaguardar al personal que manipule el material.
Al recoger la muestra se debe instruir al paciente que previamente se enjuague la boca con agua,
y en un frasco de boca ancha, con tapa rosca y cierre hermético, deposite sólo el material
expulsado por la tos. Es recomendable escoger el esputo por la mañana, de no haber suficiente
muestra, se tomará la cantidad total recolectada durante un periodo de 24 horas.
La secreción del tracto respiratorio también puede obtenerse por aspiración bronquial.

MUESTRAS DE ORINA
La formación de la orina se inicia en los glomérulos. La orina es un líquido de composición similar
al plasma, que contiene agua, cristaloides y una pequeña fracción de proteínas de bajo peso
molecular. En ella, existen sustancias de bajo umbral renal como los fosfatos, bicarbonatos, ácido
úrico, yodo y potasio, y sustancias sin umbral renal, que aparecen constantemente en la orina,
como la creatinina y los productos finales del metabolismo.
La orina secretada en el riñón es estéril, los mismos que la acumulada en la vejiga. Sin embargo,
en la uretra se halla una flora normal, de modo que la orina expulsada en forma normal contiene
una pequeña cantidad de bacterias. Debido a que es necesario distinguir los microorganismos
contaminantes de los de importancia etiológica, sólo el examen cuantitativo de la orina puede
producir resultados significativos.
El examen bacteriológico de la orina se hace principalmente cuando los signos y síntomas son
sugestivos de una infección de las vías urinarias, insuficiencia renal o hipertensión.
La condición más importante para un examen de orina es la recolección convenientemente
controlada de la muestra por examinar. Para la toma de la muestra se debe tomar en cuenta que
el paciente no haya recibido antimicrobianos por lo menos 5 días antes del examen. Dicha toma
de preferencia debe realizarse en el laboratorio.
En los varones, por lo general se obtienen muestras adecuadas aseando el meato con agua y
jabón y recolectando en un envase estéril la porción media de la orina expulsada. En las mujeres,
pueden conseguirse muestras equivalentes después de haber separado los labios y aseado con
agua y jabón. En lactantes y niños menores se utiliza bolsitas plásticas estériles especialmente
diseñadas, previo aseo con agua y jabón.
Otras formas de recolectar orina, incluyen el uso de sondas y la punción suprapúbica, cuando es
inevitable hacerlo, pero que acarrea el riesgo de introducir microorganismos a la vejiga.

MUESTRAS DE TRACTO GENITAL

La gonorrea, la uretritis no gonocócica (chlamydias, microplasma) y el herpes simple son las más
importantes infecciones que se manifiestan en los genitales. La sífilis, el chancro blando, LGV y
el granuloma inguinal son enfermedades importantes pero menos comunes.
Recolección de Muestras
La muestra a ser recolectada es el exudado vaginal o secreción uretral. Es esencial transportar
en medios tamponados, debido al carácter delicado y a la multiplicidad de las especies que
causan infecciones genitales. La toma de muestra se realiza empleando un hisopo estéril.
Inicialmente se debe realizar un frotis, así como un examen en fresco para buscar levaduras
(hongos) y tricomonas.
MUESTRAS DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS

El estudio microscópico de frotis y cultivos de muestras de heridas o abscesos a menudo
proporciona indicaciones tempranas e importantes acerca de la naturaleza del microorganismo
infectante, y de este modo ayuda en la elección de los antimicrobianos.
Tomar muestras de las lesiones cutáneas problemáticas con torundas recubiertas en suero y del
borde la lesión.

MUESTRAS DE HECES
La porción inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia: los
microorganismos prevalentes son los anaerobios (bacteroides, bacilos grampositivos y
estreptococos), microorganismos entéricos gramnegativos. Cualquier intento por aislar bacterias
patógenas de las heces implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través
del uso de Medios Selectivos Diferenciales y de enriquecer previamente la muestra.
Las heces y los hisopados rectales son las muestras de que se dispone con mayor facilidad. El
análisis de la muestra debe realizarse tan pronto como éste llegue al laboratorio, y en todo caso
antes de las 2 horas.
MUESTRAS DE SANGRE
Dado que la bacteremia con frecuencia augura un padecimiento que pone en peligro la vida, su
detección oportuna es esencial.
Se obtiene sangre:
 Dx. Enf. Parasitarias – gota gruesa (malaria y chagas).
 Hemocultivos – bacteremia, sépsis (E. coli, Staphylococcus, Salmonella)
 La mayoría se obtiene suero – Bioquímico, inmunológico ( Aspergillus,
Criptococcus VIH,
 Hepatitis, Clamydia, sífilis, brucelosis) y/o toxicológico.
 Rol indiscutible de muestra hemática en el Dx. y seguimiento de enf, infectocontagiosas.
Las muestras se pueden tomar antes o durante el tratamiento antimicrobianos, durante los
accesos febriles u otros síntomas de infección activa.
PROCEDIMIENTO:
 Colocar sobre la mesa todo el material necesario.
 Lavarse las manos y colocarse los guantes
 Hacer que el paciente se siente de la manera más cómoda posible de manera
que el brazo quede colocado paralelamente a la mesa donde se hará la extracción de
la sangre, con la palma de la mano vuelta hacia arriba.

 Colocar la ligadura aprox. dos dedos por encima de la flexión del codo.
 Desinfectar la zona donde se realizará la punción con pedazo de algodón embebido
en alcohol yodado.
 Tomar la jeringa y colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba e introduzca
la aguja en el centro de la vena.
 Dispense la muestra a los recipientes necesarios.
MUESTRAS DE LCR
La obtención es realizado por el médico por punción lumbar.

El LCR es colocado en frascos estériles wheaton o de tipo penicilina de capacidad de 5 a 10 ml. 3
frascos (estudio Celular, bioquímico y microbiológico)
Se transporta rápidamente al laboratorio a temperatura ambiente, NUNCA SE REFRIGERA.
MUESTRAS DE MATERIAL PURULENTO
Primero se limpia la zona afectada, con agua, jabón e hisopo y se obtiene la muestra de la lesión activa,
con un hisopo estéril.
Si es absceso cerrado será tomado por punción – aspiración con jeringa estéril.
Si la muestra ha drenado espontáneamente, esta se recogerá con un bisturí o espátula.
La muestra se transfiere en un frasco estéril o se puede colocar en medio de transporte, para su
envió al laboratorio en forma inmediata.
MUESTRAS DE OTROS LIQUIDOS CORPORALES: PLEURAL, PERITONEAL, ARTICULAR,

SINOVIAL
La muestra se obtiene con jeringa y se cola en frasco estéril, el líquido articular, sinovial puede ser
inoculada directamente en un frasco para hemocultivo.
La muestra será transportada inmediatamente al laboratorio, se procesa y si no se conservará a

temperatura ambiente. No se recomienda la refrigeración por que las baja temperatura
disminuye la viabilidad de ciertos microorganismos patógenos.

Leeuwenhoek realizó sus investigaciones hacia fines del siglo XVII; hasta entonces
solo se podía especular acerca de la existencia de agentes infecciosos más pequeños
que lo que el ojo humano podía distinguir. Desde ese momento, el microscopio óptico
se ha transformado en uno de los medios más importantes para el diagnóstico de las
infecciones. Aun hoy, a pesar del énfasis en los métodos rápidos de diagnóstico,
muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos inmunológicos,
la simple observación microscópica de la muestra clínica obtenida de un paciente es la
forma más rápida y específica de apoyar el diagnóstico clínico realizado por el médico.
En el estudio óptico o microscópico de los agentes infecciosos, se incluyen métodos
muy diferentes, cada uno de los cuales va proporcionar información sobre distintas
aspectos y propiedades de los microorganismos, que dependiendo del objeto que se
requiera alcanzar, se seleccionará uno u otro método. Sin embargo, muchos de los
agentes infecciosos pueden ser observados en forma confiable con solo unas pocas
coloraciones y un microscopio básico. Los métodos que se presentan a continuación
incluyen muchas técnicas microscópicas comunes usadas durante décadas.
I. EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS.

Examen que se utiliza principalmente para la investigación de la motilidad
bacteriana, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos,
división celular, etc. Se le conoce como la observación vital. Es el método más útil
para la identificación definitiva de la mayoría de los parásitos y de muchos hongos.
Entre los metidos utilizados tenemos:
A. Examen en fresco.
Muchas muestras clínicas pueden ser examinados en el microscopio con campo
claro o contraste de fase en su estado original, preferentemente ni bien se las
recoge o de cultivo jóvenes (24 horas).
Las muestras se colocan directamente sobre la superficie de un portaobjeto y
se cubren con laminilla, estas muestras incluyen esputo, exudado de lesiones,
liquido de aspiraciones, heces liquidas, flujo vaginal y sed imento urinario, si el
material es viscoso se debe diluir con solución salina estéril.
La mayoría de las observaciones del material se realizan con microscopia de
campo claro, aunque la principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula bacteriana y el medio en el cual se encuentran suspendidos. El
microscopio con contraste de fase resulta útil para la observación directa del
material sin teñir.

Las preparaciones se observan al microscopio con objetivo de inmersión y con

poca intensidad de luz, para facilitar la observación. El aceite de inmersión es
necesario para alcanzar la resolución suficiente para la visualización de la
mayoría de las bacterias; usualmente se emplea el objetivo por 100 junto con
oculares por 10 (aumento total por 1000).
Se incluyen dentro del examen en fresco a:
 Montaje o preparado húmedo (en fresco)
 Montaje o examen de la gota pendiente
 Montaje en tinta china.
Material.
 Cultivo bacteriano joven
 Laminas cubreobjetos
 Laminas porta objetos
 Laminas porta objetos con excavación
 Asa de Kolle
 Solución salina estéril
 Mechero
 Tinta china negra
 Varillas porta láminas
 microscopio
 Aceite de inmersión
Procedimiento.
 Coloque una gota de la muestra sobre la lámina porta objeto. Si la
muestra es sólida, diluir con solución salina.
 Cubra con la laminilla
 Observe al microscopio con aumento final de 1000 x.
Resultado.
Observe la morfología y movilidad del microorganismo, también puede lograr
observar agrupación.
B. Coloraciones vitales.
Son poco utilizados en la actualidad.

PREPARADO HUMEDO
 Colocar una gota de la muestra en la lámina portaobjetos, inmediatamente cubrir con

laminilla.
 Observar al microscopio a 1000 X, colocando una gota de aceite de inmersión sobre
la laminilla.
Resultado: MOVILIDAD Y MORFOL OGÍA
EXAMEN EN FRESCO
Preparado Húmedo
Levaduras
GOTA PENDIENTE
 Colocar una gota de material en la laminilla y hacer coincidir la gota con la excavación de la
lámina.
 Observar al microscopio a 1000x, colocando una gota de aceite de inmersión sobre la laminilla
Resultados: MOVILIDAD Y MORFOLOGIA.
TINTA CHINA
 Colocar una gota de la muestra y otra de tinta china en la lámina, homogenizar y cubrir con
laminilla.
 Agregar una gota de aceite de inmersión sobre la laminilla y observar a 1000 X aumento.
 Resultado: Observar CAPSULA REFRINGENTE.
B. COLORACIONES VITALES

EXAMEN EN FRESCO
Tinta China
NO POSEE CÁPSULA
II. EXAMEN DE MICROORGANISMOS POST – MORTEN –DEFINITIVOS O

COLORADOS.
El examen del material teñido, ya sea directamente a partir de muestras clínicas o
del desarrollo en los cultivos es el método más útil para la identificación presuntiva
de las bacterias y de ciertos virus.
Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los
colorantes básicos se manifiesta si tomamos e n cuenta su principal contenido en
ácidos nucleicos. Los colorantes básicos de mayor aplicación son los derivados del
alquitrán de hulla (anilina); estos colorantes llevan carga electropositiva en su parte
cromófora, la que tiene una fuerte afinidad por lo s grupos electronegativos, que
normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre las cuales se
encuentran los ácidos nucleicos y sus derivados. Los colorantes más usados son el
cristal violeta, fucsina básica, safranina, azul de metileno y verde de malaquita.
Pasos a seguir en cualquier coloración.

Se debe seguir cuidadosamente los pasos cualquiera sea la coloración elegida, esto
va garantizar la obtención de un resultado adecuado.
1. Extensión o “frotis”. -
Sobre un portaobjeto de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material
que se va a teñir o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra, si el
material viscoso es suspendido en una gota de agua o solución salina
previamente colocada sobre el portaobjeto, se homogeniza y finalmente se
extiende.
2. Secado. -
Una vez extendido, se deja secar al medio ambiente.

3. Fijación. -
Someter el frotis o extendido a la llama del mechero hasta que el vidrio este tan
caliente que moleste al tacto, pero este procedimiento no es bactericida. Debe
dejarse enfriar el preparado antes de colorear. Se puede usar otro fijador como
el alcohol según la recomendación de la técnica.
4. Coloración. -
Cubrir el extendido o frotis con el colorante, evitando la evaporación en el
tiempo que debe actuar. Según la t écnica se puede usar uno o más colorantes
y mordientes.
5. Lavado. -
Eliminar el exceso de colorantes con agua corriente o destilada a chorro suave
y que no incida directamente sobre el frotis.
6. Secado. -
Secar al medio ambiente, colocando el preparado inclinado para el
escurrimiento. Se puede acelerar el secado agitando la lámina o con la llama
del mechero, evitando sobrecalentamiento.
7. Observación. -
Observar al microscopio con objeto de inmersión y aceite.
Clases de Coloraciones:
A. Coloración simple.
Consiste en el agregado de un solo colorante y tiene como objetivo la observación
de la morfología bacteriana. Se puede utilizar cualquier colorante básico como azul
de metileno, safranina, verde malaquita, etc.
Material.
 Cultivo bacteriano joven
 Laminas cubreobjeto y porta objetos
 Asa bacteriológica
 Solución salina estéril
 Mechero
 Colorante: Azul de metileno, safranina y verde malaquita
 Varillas pórtala minas
 Microscopio
 Aceite de inmersión.

Procedimiento.
1. Preparar el frotis o extendido
2. Secar al medio ambiente
3. Fijar con la llama del mechero y luego dejar enfriar
4. Colorear con azul de metileno o safranina o verde malaquita, cubrir
completamente el frotis y dejar actuar por 2 a 3 minutos.
5. Lavar para eliminar el exceso de colora nte
7. Observar al microscopio con objeto de inmersión
EXAMEN POST
MORTEN
Azul de Metileno
B. Coloraciones diferenciales.
Utilizan más de un colorante en pasos sucesivos y las células bacterianas teñidas
se diferencian tanto por el color como por la forma. Las coloraciones diferenciales
son clásicas, los más empleados en microbiología clínica y son:
Coloración GRAM.
Coloración ideada por Hans Christian Gram. a fines del siglo XIX, permite dividir a
las especies bacterianas en dos grandes grupos: aquellos que por la coloración con
alcohol acetona requieren el colorante básico, cristal violeta, tiñendo finalmente de
azul violáceo (grampositivos) y aquellos que pierden el cristal violeta al ser
decoloradas y se recolorean con safranina que es colorante de contraste, tiñéndose
de rojo (gramnegativos).
Material.
 Cultivo bacteriano jóvenes
 Set de Gram.: Cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina.
 Laminas portaobjetos

 Varillas portaláminas
 Microscopio
 aceite de inmersión
Procedimiento.
1. Preparar el frotis o extendido
3. Fijar con la flama del mechero y dejar enfriar
4. Coloración:
 Cubrir con cristal violeta por 1 minuto
 Lavar a chorro lento con agua corriente
 Cubrir con lugol (mordiente) por 1 minuto
 Decolorar con alcohol acetona gota a gota hasta que no se desprenda más
colorante de la lámina o cubrir con el decolorante por un min uto.
 Cubrir con safranina como colorante final de contraste por 1 minuto
5. Lavar con agua corriente
7. Observar utilizando objetivos de
inmersión.
Mecanismo de la tinción.
Para explicar el mecanismo de la tinción Gram.
Se ha optado por la hipótesis fundada en la
naturaleza química de las paredes celulares de
los microorganismos. El mecanismo de la
tinción Gram esta reseñada en el siguiente
esquema.

Productos que se Reacción y coloración de las bacterias

utilizan
GRAM + GRAM -
1) Cristal violeta Células color violeta Células color violeta
2) Lugol solución Se forman el complejo Se forman el complejo

iodada CV-I. Las células CV-I las células
continúan teñidas de continúan teñidas de
color violeta. color violeta.
3) Alcohol acetona Se contraen los poros. Eliminación de las

Disminuyen la grasas de las paredes
permeabilidad. El celulares. Aumentan la
complejo CV-I no sale de porosidad. El complejo
las células que CV-I se separa de la
continúan teñidas de célula. Se decoloran.
color violeta.
Células no decoloradas; Células decoloradas; se

4) Safranina tiñen de color rosado.
quedan teñidos de color
violeta.
Resultados.
Determinar la reacción (grampositivos o gramnegativos), morfología y agrupación
de las bacterias utilizadas en las prácticas.
Nota. - Las bacterias gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que

los microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas
variables en ciertas condiciones (son gramlabiles). Por ejemplo, los
cultivos viejos de algunas bacterias grampositivos pierden la propiedad de
retener el complejo cristal violeta – yodo, y en consecuencia se tiñen por
la safranina apareciendo como gramnegativas.

EXAMEN POST MORTEN

Coloración Gram (+)
Cocos en cadena
EXAMEN POST MORTEN

Cocos
EXAMEN POST MORTEN

Levaduras

COLORACION ZIEHL NEELSEN.

La coloración Ziehl Neelsen se realiza para determinar la presencia de bacterias ácido
– alcohol resistente. Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen
ácido graso (ácidos mícólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que le
confieren la propiedad de resistir la decolo ración con alcohol ácido, después de la
tinción con colorantes básicos (fucsina). Por esto se denominan ácido – alcohol
resistente. La microbacterias como M. tuberculosis, M. Leprae y parásitos como
Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ác ido alcohol resistencia. La
coloración clásica de Ziehl – Neelsen requiere calentamiento para que el colorante
inicial básica atraviese la pared bacteriana que contiene ceras, las micobacterias son
bacilos aerobios con la composición química de una pared c elular grampositiva, pero
no se tiñen con esta coloración por los ácidos grasos que poseen.
Materiales.
 Muestra de esputo de pacientes sospechosos de tuberculosis.
 Set. De Ziehl – Neelsen: Fucsina fenicada básica, alcohol ácido, azul de
metileno.
 Laminas portaobjetos nuevos
 Varillas portalaminas
 Bajalenguas
 Mechero
 Microscopio.
Procedimiento.
1. Extendido del esputo con el bajalengua
2. Secado al medio ambiente. No utilice la llama del mechero para secar, para evitar
la formación de aerosoles.
3. Fijar a la llama del mechero
4. Coloración:
- Cubrir con fucsina fenicada básica, y con ayuda de un mechero calentar el
preparado, pasándolo lentamente por debajo de la lámina portaobjeto, hasta
que produzca la emisión de vapores, sin llegar a la ebullición. Repetir el
procedimiento hasta completar 3 emisiones sucesivas en 5 minutos. Dejar
enfriar.
- Lavar con agua corriente.
- Decolorar con alcohol ácido. Cubrir la totalidad del extendido y dejar por un
minuto. Proceso diferenciador.
- Lavar con agua corriente. El preparado debe quedar de color rosa pálido, de
lo contrario volver a cubrir con alcohol ácido hasta conseguir dicho propósito.
- Coloreado de fondo con azul de metileno. Cubrir el preparado con azul de
metileno por 30 segundos.

5. Lavar con agua corriente

6. secar al medio ambiente
7. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Mecanismo de la Coloración Ziehl Neelsen.

Productos que se Reacción y coloración de las bacterias.
utilizan
BAAR NO AAR
1. Fuccina fenicada Células se tiñen de rojo. Células se tiñen de rojo.

5’ ,3 vapores.
Resisten a la Se decoloran. No
2. Alcohol ácido. poseen ácidos grasos.
decoloración debido a la
presencia de ácidos
grasos. Continúan
teñidos de rojo.
Las bacterias de
3. Azul de metileno coloradas se tiñen de
Las bacterias no
decoloradas continúan color azul, al igual que
de rojo los demás elementos de
la muestra.
Resultado:
Determinar la presencia de bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) que se observan
de color rojo de forma abastonada aislados o agrupados sobre un f ondo azul y realizar
su conteo promedio. Leer 100 campos o 5 minutos tratando de recorrer la lámina, sin
duplicar el campo ya observado.
Informe:
Negativo (-) : No se encuentra bacilos ácidos alcohol resistente (BAAR) en 100
campos microscópicos observados
Positivo (+) : Se observan menos de 1 BAAR promedio por campo por 100 campos
observados (10-99 bacilos en 100 campos).
Positivo (++) : Se observan de 1 a 10 BAAR promedio por campo en 50 campos
observados.
Positivo (+++): Se observan más de 10 BAAR promedio por campo en 20 campos
Observados.
Muestra paucibacilar: Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscópicos.

EXAMEN POST MORTEN

Coloración Zielh Neelsen
BAAR
C. Coloraciones especiales y estructurales .
Entre las coloraciones estructurales y especiales tenemos aquellas que permiten

observar específicamente ciertas estructuras bacterianas como cápsula, flagelos,
esporas, gránulos metacromaticos, etc. Una coloración especial usada comúnmente
es la coloración vago.
Coloración Vago
Es propia de ciertas bacterias como las espiroquetas, que para poderlas observar
se tienen que adherir con el mercurio cromo en un fondo violeta.

Materiales.
 Muestra: Sarro dentario
 Mercurio cromo al 2%
 Violeta de genciana
 Palitos mondadientes
 Laminas portaobjetos
 Varillas porta laminas
 Mechero
 Asa de Kolle
 Microscopio.
Procedimiento.
1. frotis del sarro dentario, utilizando un mondadientes
3. fijar leve y rápidamente
4. colorear:
 cubrir el frotis con mercurio como por 3 minutos
 lavar con agua corriente
 cubrir con violeta genciana por 3 minutos
5. lavar con agua corriente
7. observar con objetivo de inmersión
Resultado.
Observar la presencia de bacterias fusoespirales (espiroquetas) teñidos de color
violeta.

El cultivo y la identificación de patógenos específicos a partir de muestras tomadas d e

pacientes con una presunta infección es el método más confiable, aunque no es el más
rápido, para el diagnóstico. Sin embargo, hasta que las técnicas de la biología
molecular hayan avanzado hasta el punto de que los microorganismos responsables de
enfermedades infecciosas pueden ser identificadas mediante marcadores genéticos
totalmente individuales, el diagnóstico definitivo de la mayoría de las infecciones
continuará exigiendo el aislamiento e identificación del agente etiológico. En el capítulo
anterior se trató sobre las características morfológicas básicas (colonias) en este
capítulo trataremos las pruebas enzimáticos y bioquímicas que se emplean para
identificar estos patógenos, una vez que han sido aislados.
Pruebas Bioquímicas o Enzimáticos Extrem adamente Rápidas.

Todas las pruebas que se describen aquí pueden ser realizados directamente con
inóculo obtenido de colonias desarrolladas en las placas de aislamiento primario. Los
resultados se obtienen rápidamente, estas pruebas permiten avanzar otro p aso en la
caracterización de un germen de morfología conocida y orientar la elección de procesos
adicionales necesarios para la identificación.
 Prueba para Catalasa. -

Esta prueba es útil para la identificación de muchas bacterias. Por ejemplo, los
estreptococos no poseen la enzima Catalasa que cataliza la liberación de agua y
oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno, un producto final del metabolismo, pero
todos los estafilococos son Catalasa positivos.
Material:
 Cultivo de staphylococcus y streptococcus

 Peróxido de hidrógeno
 Láminas portaobjetos
 Asa bacteriológica
Procedimiento
Colocar una porción de la colonia en estudio en la lámina portaobjetos, y agregar
una gota del peroxido de hidrógeno. La reacción se observa de inmediato.

Resultado:
Catalasa +: Se observa el burbujeo
Catalasa -: No hay reacción.
 Prueba para coagulasa
Se puede determinar coagulasa unida, denominado factor de agregación y se

realiza en lámina, leyéndose a los pocos segundos. La coagulasa libre se realiza
en tubo y se lee después de 4 horas. La coagulasa es un enzima que poseen ciertos
microorganismos como S. aureus, esta enzima es capaz de aglutinar el plasma
tratado con oxalato, citrato o etilendiaminotetracético o heparina en presencia de
un factor contenido en el suero.
Material:
 Cultivo de S. aureus
 Plasma citratado o oxalatado
 Tubo de ensayo
Procedimiento:
En un tubo ensayo colocar 0.5 ml de plasma, e inocular la cepa microbiana, incubar
en baño maría, y observar la reacción a las 4 horas a más.
Resultado:
Coagulasa + : si se observa que el plasma es coagulado
Coagulasa - : No se observa coagulación.

 Prueba para la oxidasa.
Esta prueba indica la presencia de la enzima citocroma oxidasa y se aplica en la

identificación de bacterias como Neisseria, Vibrio Cholevae, Psedomonas , etc.
Actualmente se usan tiras de papel de filtro embebido con el reactivo o ampollas
de vidrio conteniendo el reactivo y son comparables con las pruebas
convencionales.
Materiales.
 Cultivo de Pseudomonas
 Tiras reactivas de oxidasas
 Palitos mondadientes
Procedimiento.
Colocar una porción de la colonia en el extremo reactivo de la tira, esperar unos
segundos y observar la reacción
Resultados
Oxidasa + : la colonia se oscurece a violeta oscuro o negro
Oxidasa -: no se observa tal reacción
Información miscelánea
Así como la morfología de la colonia, también la producción de pigmento
(Pseudonomas), difusividad (proteus), reacciones hemolíticas en Agar sangre y
otras, son muy útiles para ir acotando las posibilidades de identificación

II. Pruebas bioquímicas metabólicas convencionales
Una fracción relativamente pequeña de la información genética de las bacterias

esta implicada en la producción de enzimas que metabolizan diversos sustratos.
Estas enzimas han sido usadas tradicionalmente como marcadores para diferenciar
grupos de especies. Si un microorganismo posee una enzima dada y es capaz de
utilizar un sustrato, podrá formar un producto final capaz de modificar el pH. Las
pruebas pueden ser de oxidación y fermentación, de hidrólisis, degradación de
aminoácidos, utilización de un único sustrato, reacciones para nitratos. Etc.
 Reacción de agar triple azúcar hierro (TSI)
Esta prueba permite la orientación en la identificación de los bacilos gramnegativos,

en especial de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Este medio puede
detectar tres características principales de una bacteria: La capacidad de generar
gas en su proceso de fermentación de azúcares, la formación de sulfuro de
hidrogeno gaseoso (que se visualiza por la formación de un precipitado negro que
contiene hierro) y la capacidad de fermentar lactosa, sacarosa, glucosa.
Material
 Cultivos de E.coli, Salmonella, Proteus

 Medio de cultivo TSI
 Asa bacteorológica
Procedimiento
Inocular la cepa por puntura y estría TSI, in cubar por 18-24 hrs. A 35-37°C
Resultado
Observar y anotar las diferentes reacciones. Presencia o ausencia de gas,
hidrogeno sulfurado y fermentación de azúcares.

 Degradación de aminoácidos: descarboxilacion de la lisina (LIA)
Ciertas enzimas formadas por los microorganismos pueden desaminar,

descarboxilar aminoácidos, degradándolos en componentes más pequeños. En
esta ocasión trataremos sobre la descarboxilación del aminoácido lisina, en una
amina (cadaverina) y amoniaco, productos alcalinos lo cual eleva el PH del medio,
observándose un viraje de su color original.
Material
 Cultivo de E.coli, Shigella, Citrobacter

 Medio de cultivo LIA
Procedimiento
Inocular a cepa por puntura y estrías, incubar por 18 -24 hrs a35-37°C.
Resultado
Observar si se ha presentado descarboxilación o no por la apreciación del color.
 Prueba para INDOL - SIM

Los microorganismos que producen la enzima triptofanasa son capaces de
degradar al aminoácido triptofano y dar ácido pirúbico, amoniaco e indol.
Este último se detecta por su combinación con el aldehído indicador que
forma un producto final coloriado.
Material
 Cultivo de E-coli y Klebsiella o Salmonella

 Medio SIM

 Reactivo de Kowac’s
Procedimiento
Sembrar la cepa por punción en el medio semisólido SIM, incubar a 35-37°C por
18.24 hrs.
Resultado
Indol + : Formación del anillo rojo
Indol - : Formación de un anillo incoloro o amarillo
Movilidad e inmovilidad
H 2 S (+) O (-)
 Utilización de un único sustrato: Citrato

Muchos microorganismos pueden ser reconocidos por su capacidad para crecer
en presencia de un único compuesto que satisface todos sus requerimientos
nutricionales.
Material
 Cultivo de E.coli y Klebsiella preunoniae

 Medio citrato
Procedimiento
Se siembra por estría en el medio citrato, se incuba a 35-
37°C por 18-24 hrs.
Resultado
Citrato (+) : vira al calor azul y se observa colonias
Citrato (-) : verde, sin desarrollo de colonias

El cultivo es el procedimiento mediante el cual se promueve el crecimiento de los

microorganismos, al proporcionarles las condiciones adecuadas, nutrientes, pH,
temperatura y aereación; además de otros factores que deben ser controlados.
Medios de Cultivo
Son sustancia nutritivas líquidas o sólidas, que se utilizan en el laboratorio para el
crecimiento de los microorganismos, pudiendo ser similares a sustancias naturales, en
los cuales estos crecen normalmente. Sus componentes básicos deben satisfacer las
mínimas exigencias nutricionales para el desarrollo microbiano y varía según el tipo de
bacteria. Es más, para que un medio responda con éxito en el cultivo deben cumplirse
las siguientes condiciones:
a. Contener todas las sustancias nutritivas necesarias para su crecimiento, como:
Compuestos orgánicos nitrogenados, compuestos inorgánicos, carbohidratos, etc.
b. La humedad, la temperatura y el PH deben ser óptimo.
c. Evitar la contaminación para prevenir la competencia con otros microorganismos.
d. Estar previamente esterilizado.
La fuente de nitrógeno comúnmente es la peptona que consiste en una mezcla de

proteasa, polipéptidos. La fuente de carbono se obtiene de los carbohidratos.
Ciertas bacterias exigentes requieren factores de crecimiento tales como: factor V,

factor X, NAD, etc., etc.
Clasificación de los medios de cultivo
1. Según su estado físico.
a. Medios Sólidos.- Presentan en su composición un agente solidificante, el
agar, en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. También puede
contener gelatina o albúmina.
b. Medios Semisólidos.- Presentan agar en su composición, en una proporción menor
que los sólidos, p.ej., Agar Cistina Tripticasa: 2.5 g/lt.
c. Medios Líquidos.- No contiene ningún agente solidificante.
2. Según la utilidad o requerimiento diagnostico.

a. Medios Nutritivos Simples. Caldo y Agar Nutritivo, desarrollan la mayoría de
microorganismos no exigentes.

b. Medios Selectivos, Inhibidores o de Aislamiento. Son medios con una serie

de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a
estudiar, y aislar, de esta forma, los microorganismos que se busca p. ej.,
Mac Conckey, Agar Sabouraud, Agar Hipertónico de Chapman, etc.
c. Medios Enriquecidos. Suelen ser medios con un nutriente simple que
presentan enriquecedores, tales como la sangre de car nero, la sangre del
caballo, etc. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy
exigentes, ej. Agar Sangre, Agar chocolate., etc.
d. Medios de Transporte y Mantenimiento. Se utilizan en la recogida, transporte
y conservación de muestras biológicas. Esencialmente, son medios no
nutrientes, semisólidos.
e. Medios de Enriquecimiento. Son medios que permiten estimular el desarrollo
de ciertos microorganismos particulares presentes en números escaso en
un medio que incluye gran cantidad de representantes de la FMN. Ejm:
Caldo Selenito, APA.
f. Medios Diferenciales. Contienen colorantes, azúcares e indicadores,
concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida,
generalmente el color, p. ej., Agar Citrato, Agar Urea, TSI, etc.
Siembra.- La siembra es el procedimiento por el cual se pone en contacto al

microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de
temperatura y tiempo de incubación pueda desarrollarse y multiplicarse “in vitro”, la
siembra se realiza con la finalidad de obtener un cultivo puro de bacterias a partir de
una muestra problema (orina, heces, secreciones, etc.), mediante el aislamiento.
Aislamiento.- Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a

partir de una muestra problema. Se requiere de un medio sólido con gran superficie
para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie,
mediante la formación de colonias separadas. Si se aíslan especies distintas, cada
colonia tendrá caracteres especiales.
Técnicas de siembra
A. Siembra por inoculación o agitación
Con un asa bacteriológica previamente esterilizada, se toma una cantidad suficiente
de inóculo o muestra y se introduce en el centro del medio líquido, agitándose para
luego retirar el asa.
B. Siembra por estría (en tubos de agar inclinado)

Con una asa bacteriológica sembrar por estrías la zona inclinada del agar, iniciando
las estrías desde el fondo del tubo.
C. Siembra puntura profunda o picadura.

Con el asa bacteriológica en forma de aguja, se toma una pequeña cantidad de la
colonia y se siembra en el agar semisólido introduciendo la aguja en forma vertical.

D. Siembra por incorporación o vertido de placa.

Para obtener colonias bien aisladas, es preciso hacer una serie de diluciones en
varios tubos, puesto que no se conoce de antemano la magnitud de la población
bacteriana contenida en la muestra original. Con una pipeta se coloca 1ml de
muestra o dilución de ella en una placa de Petri estéril y luego se agrega medio
licuado, mantenido a 45 °C, realizando movimientos rotatorios para homogenizar y
se deja solidificar.
Incubación
Después de la siembra se debe incubar en la estufa a una temperatura y tiempo óptimo,
generalmente a 37 °C, durante 18 a 24 horas, para favorecer el crecimiento de los
gérmenes. Los tubos se colocan en gradillas y las placas de Petri en forma invertida
para evitar que el agua de condensación bañe el medio de cultivo e impida una buena
separación de las colonias.
Estudios de los cultivos

Transcurrido la incubación se procede al estudio del crecimiento bacteriano
(características culturales) en los diferentes medios de cultivo.
1. Crecimiento en medio líquido.
Cantidad: Nulo, escaso, moderado o abundante.
Distribución: Uniforme (turbio), limitado a la superficie, flocúlenlo, formación de película,
formación de anillo o acumulado en sedimento.
2. Crecimiento en medio semisólido

Interpretar si hay movimiento o no, verificando si el desarrollo bacteriano solo esta
en la línea de siembra o se expandió.
3. Crecimiento en medio sólido en tubo

- Observar si hay crecimiento y la,
- Cantidad: Escaso, moderado o abundante.
4. Crecimiento en medio sólido en placa. (Identificación de Colonia)

Una vez que se ha logrado el aislamiento del microorganismo, podemos realizar
una identificación preliminar de las colonias. La primera pauta para la identificación
de la colonia aislada es la naturaleza del medio en el cual ha desarrollado el
microorganismo, si es un medio selectivo, enriquecido o nutritivo, luego
determinamos:
- Tamaño: desde fracción de milímetro hasta mm de diámetro.
- Forma. Circular, puntiforme, granular, rizoie, irregular.
- Borde: Entero, ondulado, rizado, filamentoso, dentado, lobulado.

- Elevación: Plana, elevada, convexo, umbilicada, acuminada o monticular.

- Consistencia: Cremosa, membranosa, mucosa.
- Caracteres Ópticas: Opacos, translúcidos u opalescentes.
- Cromogénesis: Pigmentados o no pigmentados.
Se debe concluir la identificación preliminar de las colonias con observación microscópica de
estas.
Material
 Cultivos bacterianos
 Tubos con caldo y agar nutritivo
 Tubo con medio semisólido
 Placas con agar nutritivo, sangre y Mac – Conkey
 Láminas portaobjetos
 Set de Gram.
 Mechero
 Microscopio
 Varilla porta láminas
Procedimiento:
Sembrar usando la técnica adecuada en medio líquido, sólido inclinado en tubo, semisólido y en
medio sólido en placa.
Rotular, incubar y realizar la lectura o el estudio según lo indicado.
Resultados:
An otar el desarrollo o crecimiento bacteriano en cada medio de cultivo según el protocolo.


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