Remediación de fondos de tanque por utilización de

microorganismos autóctonos

Acuña, Adrián*, Cambarieri, Luciana, Pucci, Oscar (1), Pucci, Graciela (1)

Grupo de Estudios Ambientales (GEA) Facultada Regional Santa Cruz, Universidad Tecnológica
Nacional.
Los Inmigrantes 555, Río Gallegos (CP 9400), Santa Cruz. adrianjacuna@yahoo.com.ar.

(1) Centro de Estudios e Investigación en Microbiología Aplicada, Universidad Nacional de la

Patagonia San Juan Bosco, Comodoro Rivadavia (9000) Chubut.

RESUMEN.
Los fondos de tanque provenientes de la industria petrolera son un problema ambiental a resolver en
la cuenca del Golfo San Jorge. En este trabajo se estudio la biodegradación del hidrocarburo
remanente que queda en el sedimento después del lavado con agua y detergente del fondo de
tanque. Para tal fin se realizaron biorreactores en los cuales, el proceso de biodegradación, se
monitoreo por consumo de oxígeno, recuentos de bacterias aerobias totales y degradadoras de
hidrocarburos y cuantificación de hidrocarburos por espectroscopia infrarroja (FTIR) y por
cromatografía gaseosa (GC). El sedimento proveniente del lavado de fondo de tanque contenía
cantidad suficiente de bacterias degradadoras de hidrocarburos y aerobias totales, con un predominio
de los géneros Pseudomonas sp y Rhodococcus sp que junto a las condiciones de 20 % humedad,
oxigenación y nutrientes en una proporción de 100:3:0,3 redujeron los hidrocarburos presentes de 2,9
a 0,4 %. La degradación se produjo mayoritariamente entre los hidrocarburos alifáticos de cadena
entre 13 a 26 átomos de carbono, siendo la fracción aromática la que presentó la menor
biodegradación.

Palabras Claves: Fondo de tanque, biodegradación, hidrocarburos.

ABSTRACT.
Oil bottom tank sludge is an environmental problem to be solved in the Gulf San Jorge basin. In this
paper we study the biodegradation of hydrocarbon remaining in the sediment after washing with water
and detergent of the oil bottom tanks. Bioreactors were performed in which the biodegradation process
was monitored by oxygen consumption, total aerobic bacteria counts and hydrocarbon degraders and
quantification of hydrocarbons by infrared spectroscopy (FTIR) and by gas chromatography (GC). Oil
bottom tank contained enough oil degrading bacteria and total aerobic, with a predominance of the
genera Pseudomonas sp and Rhodococcus sp which together with the conditions of 20% humidity,
oxygen and nutrients in a ratio of 100:3:0,3 reduced the hydrocarbons present from 2.9 to 0.4%. The
degradation was mainly from aliphatic hydrocarbon chain from 13 to 26 carbon atoms, with the
aromatic fraction which had the lowest biodegradation.

Keywords: Bottom tank, biodegradation, hydrocarbons.

1
1. INTRODUCCIÓN
El manejo inadecuado de los materiales y residuos ha generado en todo el mundo un problema de
contaminación en suelos y cuerpos de agua. Entre las más severas contaminaciones se destacan las
producidas a causa de la extracción y el manejo del petróleo en todos los países productores de
hidrocarburos [1]. El tratamiento de residuos contaminados con hidrocarburos es esencial para
mantener la calidad del medio ambiente y la salud de la población. La industria petrolera genera
contaminantes sólidos, semisólidos y líquidos que requieren diferentes formas de tratamiento. Los
tratamientos pueden ser físicos, químicos y biológicos dependiendo de la muestra y el estado de
contaminación que posea. Los tratamientos biológicos son muy buenos pero necesitan condiciones de
pH, humedad, nutrientes y concentraciones de hidrocarburos y metales pesados por debajo de 5% y
2500 ppm respectivamente [2].
Uno de los residuos generados por esta actividad en las plantas de tratamiento y almacenamiento son
los llamados fondos de tanque. Se trata de un producto acumulado en el fondo de los tanques de
almacenamiento de petróleo y otras instalaciones, formado por la precipitación de partículas sólidas y
fracciones del petróleo. Los fondos de tanque de petróleo son periódicamente removidos ya que
quitan espacio de almacenamiento. Estos suelen contener agua, sedimentos, arenas, grasas, aceites,
petróleo, compuestos orgánicos y elementos inorgánicos. Existen varios métodos para limpiar los
fondos de tanque, en algunas áreas se realiza un lavado del mismo con detergentes y agua caliente,
quedando un residuo que contiene partículas finas de sedimento y un porcentaje variable de
hidrocarburos, que muchas veces sigue siendo superior a lo que exige la legislación vigente.
Existe una gran variedad de tratamientos que pueden aplicarse a este tipo de residuos contaminados
con hidrocarburos, que van desde solo disponerlos en lugares considerados seguros, métodos de
incineración, tratamientos químicos y tratamientos biológicos. La biorremediación, un tratamiento
biológico, es una de las herramientas más adecuadas para el saneamiento de estos residuos. Es una
técnica de bajo costo de operación que ha sido aplicada exitosamente en este tipo de
contaminaciones en suelos patagónicos [3, 4].
En la experiencia se ha podido observar que existen diversos parámetros que pueden aumentar la
eficiencia de estos tratamientos, como el agregado de nutrientes e inoculación de bacterias
seleccionadas obtenidas del mismo sitio [5]. Otro aspecto de gran importancia es la composición del
residuo a tratar, los tres grupos principales de compuestos presentes en los hidrocarburos del petróleo
(alifáticos, aromáticos y polares) tienen diferentes velocidades de biodegradación y algunos de ellos
también presentan una marcada toxicidad para ciertos grupos bacterianos e inhiben su crecimiento
[6]. La biodegradación puede complementarse con otras tecnologías que pueden en determinadas
situaciones aumentar su eficiencia. La utilización de bacterias es factible, hay autores que han
trabajado con mezclas de microorganismos a fin de optimizar la degradación [7, 8, 9], ya que son
muestras complejas con hidrocarburos de cadenas largas.
El objetivo del trabajo fue estudiar la posibilidad de la degradación de los hidrocarburos presentes en
los sedimentos que quedaron después del proceso de lavado del fondo de tanque por parte de la
comunidad bacteriana presente en la muestra con agregado de nutrientes para favorecer el proceso.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Muestra de fondo de tanque.

Se trabajó con fondos de tanque de la industria petrolera que habían sido tratados previamente con la
técnica de lavado, que redujo el contenido de hidrocarburo. El fondo de tanque contenía un pH 7,5,
humedad de 8,9%, residuo orgánico de 25%, residuo inorgánico de 75%, densidad aparente de 0,8,
porosidad de 49%, capacidad de retención de agua de 64%, cloruros 32260ppm, bicarbonatos 226
ppm, sulfatos 2553 ppm, calcio 5511ppm, magnesio 1337 ppm, hierro 39ppm, amonio 18 ppm, fosfato
1,5 ppm e hidrocarburos totales del petróleo (TPH) 2,9% compuesto por 48, 35, y 17% de
hidrocarburos alifáticos, aromáticos y polares respectivamente.

2.2. Experiencia de biodegradación

Se diseñaron bioreactores conteniendo 100gr de sedimento de fondo de tanque, por triplicado, a los
cuales se les adicionó agua destilada y nutrientes en una relación 100:3:0,3 de carbono, nitrógeno y
fósforo respectivamente. Se incubó a 28°C durante 80 días en frascos color caramelo en sistemas
OxiTop para medición automática de consumo de oxígeno. A estos sistemas se los monitoreo, no solo
por medición de consumo de oxígeno, sino también por conteo de bacterias totales y degradadoras de
hidrocarburos y por cuantificación de hidrocarburos.

2
2.3. Enumeración de microorganismos
El número de microorganismos fue determinado por la técnica de conteo en placa. Se utilizó una
suspensión de 10 g de suelo en 90 mL de solución fisiológica estéril que se agitó 30 minutos a 150
r.p.m. Para bacterias totales se utilizó agar nutritivo (5g peptona de carne, 3g extracto de levadura,
12g de agar, 1000 mL de agua destilada, pH 7,2), para bacterias degradadoras de hidrocarburos
(BDH) se utilizó un medio mineral (solución I: cloruro de calcio 0,235 g, nitrato de potasio 0,427 g,
sulfato de amonio 5 g, cloruro de magnesio hexahidratado 1 g, bicarbonato de potasio 1,2 g. Solución
II: fosfato ácido di sódico dihidratado 0,5 g, fosfato monopotásico 0,5 g. Solución III: EDTA-Na 800 g,
cloruro ferroso 300 g, cloruro de calcio hexahidratado 4 g, cloruro de manganeso tetrahidratado 10 g,
sulfato cúprico 1g, permanganato de potasio dihidratado 3 g, cloruro de zinc 2 g, cloruro de litio 0,5 g)
al cual se le agregó 30 μL de una mezcla de petróleo y gasoil 1:1 por diseminación en superficie que
se denominó MBM-PGO [6].

2.4. Análisis de hidrocarburos.

2.4.1. Determinación por espectrofotometría infrarroja (FTIR).

Sobre dos gramos de muestra mezclados con dos gramos de sulfato de sodio, se procedió a extraer
los hidrocarburos presentes con tetracloruro de carbono durante 30 minutos por sonicación. El
extracto orgánico obtenido se limpió con sílica gel para posteriormente realizar la lectura en el
-1
infrarrojo medio a 2930 cm según lo propuesto por la norma EPA 418.1.

2.4.2. Determinación de hidrocarburos por Cromatografía Gaseosa (GC).

Para determinar la composición de los hidrocarburos presentes se mezclo 2 g de muestra, 1 g
SO4Na2 y 10 ml de Hexano, la cual se filtró para separar la fase solida y liquida. Seis mililitros del
filtrado se evaporo cuidadosamente hasta sequedad, y se resuspendió con 50 μL de Hexano. Para la
cuantificación se utilizo un cromatógrafo de gases Varian 3800 GC, con detector FID y una columna
capilar VF-5ms (30 m, 0,25 mm, 0,2523 μm). La temperatura del inyector fue de 200°C y la del
detector FID 300°C, se inyecto 1 μL. Los parámetros de corrida de la columna fueron las siguientes:
45 a 100 °C con un aumento de 5 °C/min y una segunda rampa de 100 a 275 °C a 8 °C/min. La
temperatura final de 275ºC y se mantuvo por 5 minutos.

2.5. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas.

A partir de las placas de MBM-PGO utilizadas para conteo de bacterias, se aislaron e identificaron 90
cepas por metil ésteres de ácidos grasos (FAMEs) según el método Sherlock MIDI versión 6.0. La
extracción de ácidos grasos de membrana se realizó sobre 40 mg de masa celular comenzando con
una saponificación con alcohol metílico, hidróxido de sodio y agua (150 mL: 45 g: 150 mL).
Posteriormente se realizó una metilación con ácido clorhídrico 6 N y alcohol metílico (325 mL: 275
mL), seguido de una extracción con n-hexano y metil terbutil éter (1:1). Finalmente se realizó un
lavado con hidróxido de sodio y agua (10,8 g en 900 mL) de acuerdo a lo propuesto por el sistema de
identificación (MIDI Newark, Del., USA).
Los ácidos grasos obtenidos se determinaron como metil ésteres por cromatografía gaseosa. Para tal
fin se utilizó una columna capilar Ultra 2 de 25 m de longitud y 0,2 mm de diámetro. El análisis se llevó
a cabo con un cromatógrafo HP 6890 series II GC (inyección splitless, presión inicial 10 psi, programa
-1 -1
de temperatura: 170-288 °C a 28 °C.min , 288-310 °C a 60 °C.min , 1,5 min de permanencia a 310
°C, detector por ionización de llama). La integración de los pico se efectuó mediante el programa HP
10.01 Chem Station.
Los ácidos grasos fueron identificados utilizando el sistema Sherlock (versión 6.0) con el estándar
Agilent “Calibration standards kit for the microbial identification system”. La composición en ácidos
grasos fue calculada como porcentaje del área de pico (MIDI).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
El valor de pH se encontró dentro de los valores óptimos para el desarrollo bacteriano, entre 6,5 y 7,5.
Se observó un alto contenido de cloruro, sodio y potasio, valores frecuentes dado que el petróleo de la
zona se extrae en un 40% por recuperación secundaria por lo que está acompañado de agua de
formación que es muy rica en sales [10] y que el petróleo de la cuenca posee una salinidad medida en
cloruros de 2000-20000 ppm. Se ha comprobado que estos valores de salinidad pueden resultar
tóxicos para algunos grupos de bacterias, desarrollando aquellos discretamente halófilos que
presenten tolerancia a niveles de salinidad de 1 a 6% de cloruro de sodio [11]. Los valores de

3
densidad, tanto aparente como real, se observaron por debajo de los valores normales, de 1 a 1,8
para densidad aparente y 2,6 a 2,7 para densidad real, esto es debido al alto contenido de
hidrocarburos en la muestra.
De un valor inicial de 2,9 % de TPH en la muestra de fondo de tanque, se logro reducir a un 0,4% por
medio de la mineralización biológica (Tabla 1).

Tabla 1. Valores de los recuentos de bactarias aeróbias totales

(BAT), de las bacterias degradadoras de hidrocarburos (BDH),
hidrocarburos totales del petróleo (TPH) y consumo de oxigeno
final.
Parámetro Inicial Final
5 3
BAT (UFC/gr) 1,60x10 4,90x10
6 4
BDH (UFC/gr) 1,27x10 8,76x10
TPH (%) 2,9 0,44
Consumo de oxígeno (ppm) - 6400

La cromatografía gaseosa de la muestra inicial y la expuesta a biodegradación durante 80 días (Tabla

2) muestra que, a partir del tratamiento de biorremediación asistida, se logro una reducción del
contenido de hidrocarburos pertenecientes al grupo de los n-alcanos de 31%, obteniéndose en C13,
C14 y C15 los más altos porcentajes de degradación, de 100%, 87% y 82% respectivamente. Los
hidrocarburos poliaromáticos se degradaron más lentamente, logrando una degradación del 4,5%, la
presencia de benzo-antraceno con niveles superiores a los exigidos para suelos industriales seria lo
que limita la disposición final de estos, no en todos los fondos de tanque se encuentran valores tan
elevados de este compuesto [12, 13].

Tabla 2. Análisis de hidrocarburos por cromatografía gaseosa del los sedimentos

de fondo de taque al inicio al final del ensayo de biodegradación.
Hidrocarburos ppm Inicial ppm Final % biodegradación
C13 21,167 0,000 100,000
C14 192,681 24,728 87,166
C15 466,232 81,324 82,557
C16 514,107 158,178 69,232
C17 1486,560 1387,921 6,635
C18 288,177 248,514 13,763
C19 624,138 154,944 75,175
C20 377,095 259,470 31,192
C21 327,058 204,673 37,420
C22 513,235 260,742 49,196
C23 623,938 595,594 4,543
C24 434,236 431,711 0,582
C25 404,857 347,498 14,168
C26 515,291 515,225 0
n-Alcanos totales 6783,773 4670,523 31,152
2-Metilnaftaleno 17,351 17,134 1,252
Acenaftileno 31,650 30,997 2,064
Acenaftaleno 19,096 19,024 0,374
Fenantreno 179,963 179,342 0,345
Antraceno 166,027 108,704 34,526
Fluorantreno 335,107 335,088 0,006
Benzo(a)antraceno 233,597 233,242 0,152
Criseno 282,962 282,991 0
PAH totales 1265,754 1206,523 4,680

El sedimento resultante del lavado del fondo de tanque presento una cantidad da bacterias compatible
para el uso de este en procesos biológicos de degradación y valores normales encontrados en suelos
patagónicos con procesos de biodegradación aceptables [14, 6]. Esta elevada concentración de
bacterias con capacidad de degradar hidrocarburos indica un importante potencial de biodegradación
4
[15]. La identificación de cepas bacterianas a partir de sus ácidos grasos de membrana permitió
observar la presenta bacterias de los géneros Micrococcus sp, Ocrhobactrum sp, Clavibacter sp,
Kocuria rosasea, Bacillus sp. y Rhodococcus sp. Todos microorganismos que poseen metabolismos
con capacidad de degradar hidrocarburos. En los procesos de lavado previo al análisis de laboratorio
se pierden bacterias por la temperatura y los detergentes utilizados aunque existe una población
bacteriana capaz de soportar dicho proceso formada principalmente por bacterias gram positivas y
algunas gram negativas. Predominó el género Pseudomonas sp. (35% de las identificaciones) que son
ampliamente conocidas por poseer la habilidad de utilizar diversos sustratos xenobióticos, incluyendo
los hidrocarburos [15, 16, 17, 18]. El género Rhodococcus (24% de las identificaciones) posee una
gran variedad de vías metabólicas para la degradación y modificación de compuestos aromáticos,
incluyendo las actividades de di-oxigenasas sobre anillos aromáticos, así como la actividad de ruptura
de catecol. Algunas cepas presentan también la vía del 3-oxoadipato. Lo anterior sumado a su
capacidad de crecimiento en medios con escasos nutrientes, la carencia de un sistema de represión
catabólica y su persistencia ambiental lo hacen un excelente candidato para los tratamientos de
biorremediación en suelos. Estas son bacterias degradadoras de hidrocarburos con alta resistencia a
la desecación y adaptadas a sistemas ecológicos con bajo contenido de nutrientes y temperaturas
bajas. Ambos géneros bacterianos se encuentran comúnmente presentes en suelos patagónicos [19].
En los recuentos bacterianos de las muestras de los biorreactores, luego de 80 días de mineralización,
se observó un buen desarrollo, tanto de bacterias aerobias totales como de bacterias degradadoras de
hidrocarburos. No se observan diferencias significativas (P < 0,5) en los valores de los tres sistemas
ya que el aumento de un logaritmo está dentro del error del método. Esto demuestra que la diferencia
en el rendimiento de la biodegradación no se debe a una mayor población bacteriana sino a un
incremento de su capacidad degradadora de hidrocarburos gracias al agregado de nutrientes [14].

4. CONCLUSIONES.
El residuo proveniente del lavado de fondo de tanque contenía bacterias en cantidad suficiente para
la biodegradación de hidrocarburos de la muestra, esta presentaba un predominio de los géneros
Pseudomonas sp y Rhodococcus sp que junto a las condiciones de 20 % humedad y nutrientes en
una proporción de 100:3:03 redujeron los hidrocarburos de 2,9 a 0,4 % medidos por el método EPA
418.1. La fracción de hidrocarburos de mayor degradación fue la de los hidrocarburos alcanos de
cadena entre 13 a 26 átomos de carbono, siendo las fracciones aromáticas más difíciles de degradar
por lo que requieren tratamientos más prolongados para obtener resultados satisfactorios o el
complemento de otras técnicas como la electriobiorremediación [20, 21, 22].

5. REFERENCIAS.

[1] Wang, Z; Fingas, M; Yang, C; Christensen, J. (2006). Environmental Forensics. USA. 1°

Edición. ElSevierScience (Ed.). USA.
[2] Environmental Protection Agency. (1983). Method 418.1 (Spectrophotometric, Infrared):
Petroleum Hydrocarbons Total Recoverable. USA.
[3] Pucci, O; Bak, M; Peressutti, S; Klein, I; Härting, C; Alvarez, H; Wünsche, L. (2000). “Influence
of Crude Oil Contamination on the Bacterial Community of Semiarid Soil of Patagonia
(Argentina)”. Acta Biotechnologica. 20, 2, 129-146. Alemania.
[4] Pucci, O; Acuña, A; Pucci, G. (2013). “Biodegradación de residuos de estaciones de servicio y
lavaderos industriales por la cepa Rhodococcus erythropolis ohp-al-gp”. Acta Biológica
Colombiana. 18, 2, 251-258. Colombia.
[5] Acuña, A; Pucci, O; Pucci, G. (2012). “Effect of nitrogen deficiency in the biodegradation of
aliphatic and aromatic hydrocarbons in patagonian contaminated soil”. International Journal of
Research and Reviews in Applied Sciences. 11, 3, 479-485. Pakistan.
[6] Pucci, G; Pucci, O. (2003). “Biodegradabilidad de Componentes de Mezclas Naturales de
Hidrocarburos Previamente Sometidas a Landfarming”. Revista Argentina de Microbiología.
35, 2, 62-68. Argentina.
[7] Ferrari, M; Neirotti, E; Albornoz, C; Mostazo, M; Cozzo, M. (1996). “Biotreatment of
hydrocarbons from petroleum tank bottom sludges in soil slurries”. Biotechnology letters. 18,
11, 1241-1246. Holanda.
[8] Gallego, J; García-Martínez, M; Llamas, J; Belloch, C; Peláez, A; Sanchez, J. (2007).
“Biodegradation of oil tank bottom sludge using microbial consortia”. Biodegradation. 18, 3,
269-281. Holanda.
[9] Saikia, R; Deka, S. (2013). “Removal of hydrocarbon from refinery tank bottom sludge

5
 employing microbial culture”. Environmental Science and Pollution Research. 20, 12, 9026-
9033. Alemania.
[10] Avellaneda, A. (1990). Petróleo e impacto ambiental en Colombia., Revista de la Universidad
Nacional. 6, 24, 21-28. Colombia.
[11] Meshler, M; Pucci, O. (2006). “Biodegradación de Hidrocarburos de la Comunidad Bacteriana
en Condiciones de Alta Concentración en Sales de Sulfato”. Ingeniería Sanitaria y Ambiental.
89, 92-97. Argentina.
[12] Bojes, H; Pope, P. (2007). “Characterization of EPA’s 16 priority pollutant polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) in tank bottom solids and associated contaminated soils at oil
exploration and production sites in Texas”. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 47, 3,
288-295. USA.
[13] Pucci, G; Acuña, A; Pucci, O. (2013). “Electro bioremediación de fondos de tanques
petroleros”. Revista Peruana de Biología. 20, 2, 199-201. Perú.
[14] Acuña, A; Pucci, O; Pucci, G. (2008). “Caracterización de un Proceso de Biorremediación de
Hidrocarburos en Deficiencia de Nitrógeno en un Suelo de la Patagonia Argentina”.
Ecosistemas. 17, 2, 85-93. España.
[15] Atlas, R. (1981). “Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental
perspective”. Microbiological Reviews. 45, 1, 180–209. USA.
[16] Foght, J; Westlake, D. (1988). “Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and aromatic
heterocycles by a Pseudomonas species”. Canadian Journal of Microbiology. 34, 10, 1135-
1141. Canada.
[17] Yan, P; Lu, M; Yang, Q; Zhang, H; Zhang, Z; Chen, R. (2012). “Oil recovery from refinery oily
sludge using a rhamnolipid biosurfactant-producing Pseudomonas”. Bioresource Technology.
116, 24-28. USA.
[18] Zhang, X; Xu, D; Zhu, C; Lundaa, T; Scherr, K. (2012). “Isolation and identification of
biosurfactant producing and crude oil degrading Pseudomonas aeruginosa strains”. Chemical
Engineering Journal. 209, 138-146. USA.
[19] Peressutti, S; Alvarez, H; Pucci, O. (2003). “Dynamics of Hydrocarbon-Degrading
Bacteriocenosis of an Experimental Oil Pollution in Patagonian Soil”. International
Biodeterioration & Biodegradation. 52, 21-30. Reino Unido.
[20] Acuña, A; Pucci, O; Pucci, G. (2012). New Technologies in the Oil and Gas Industry. Croacia.
1° Edición. Intech. Croacia.
[21] Pucci, G; Acuña, A; Wick, L; Pucci, O. (2012). “The use if electrobioremediation in hydrocarbon
release and bioremediation”. International Journal of Current Research. 4, 12, 451-454. India.
[22] Pucci, G; Acuña, A; Wick, L; Pucci, O. (2012). “Electrobioremediation of Patagonian Soils
contaminated with Hydrocarbon”. Portugaliae Electrochimica Acta. 30, 5, 361-370. Portugal.