LABORATORIO DE CINÉTICA DE ENZIMAS LIBRES

1. INTRODUCCIÓN

Las reacciones catalíticas son una de las reacciones que presentan mayor interés
en los sistemas biológicos. Son realizadas por catalizadores o enzimas, las cuales
son sustancias que afectan la velocidad de reacción, sin alterar el equilibrio y sin
experimentar ella misma, cambio alguno.

Las enzimas, complejo de enzimas, órganos de células y células enteras pueden

actuar como catalizadores, los cuales pueden ser de origen microbiano, vegetal o
animal (Doran, 1998). Son moléculas orgánicas complejas, las cuales pueden ser
empleadas en procesos industriales y alimentarios, en la mejora del medio
ambiente y en medicina. Las enzimas son altamente específicas y funcionan solo
sobre tipos específicos de compuestos: los sustratos. Un cambio de pH y
temperatura puede hacer perder su la actividad (Smith, 2006).

Las reacciones catalíticas se diferencian en reacciones homogéneas y

heterogéneas. Una reacción es homogénea cuando la temperatura y todas las
concentraciones del sistema son uniformes. Las reacciones heterogéneas se
producen en gradiente de concentración o de temperatura (Doran, 1998).

Las cinéticas de muchas reacciones biológicas son bien de orden cero, de primer
orden o una combinación de ellas denominada cinética Michaelis-Menten, la cual
se representa mediante:

Vmax (S)
VA =
Km + S

Dónde:
VA : velocidad volumétrica de reacción.
S : concentración del sustrato.
Vmax : velocidad máxima de reacción a concentración infinita de reactante.
Km : constante de Michaelis para el reactante A.

Para especificar completamente la cinética de las reacciones Michaelis-Menten es

necesario calcular dos constantes de velocidad V max y Km. El primer paso en el
análisis cinético de las reacciones enzimáticas consiste en obtener datos de la
velocidad de reacción (V) en función de la concentración de sustrato (S).
Generalmente solo se utilizan los datos de velocidades iniciales. Esto significa que
se realizan varios experimentos discontinuos con diferentes concentraciones
iniciales de sustrato y de cada uno de ellos se obtiene la velocidad inicial a tiempo
cero. Las velocidades iniciales y las correspondientes concentraciones iniciales de
sustrato se utilizan como parejas (V, S) que pueden representarse de diferentes
maneras.
La linealización de la ecuación de Michaelis-Menten permite obtener la
representación de Lineweaver-Burk:

1 1 Km 1
= +
V Vmax Vmax (S)

Sin embargo el proceso de liberalización distorsiona el error experimental en (V)

por lo que estos errores se ven aumentados a concentraciones bajas de sustrato.
Como consecuencia la representación de Lineweaver-Burk a menudo produce
resultados imprecisos y no es muy recomendable (Doran, 1998).

Otra linealización es la de Eadie-Hofstee:

V Vmax V
= −
(S) Km Km

V
V = Vmax − K m
(S)

La que distorsiona los errores existentes en los datos originales, por lo que este
método presenta una precisión limitada.

La linealización de Langmuir / Hanes-Woolf:

(S) Km 1
= + (S)
V Vmax Vmax

Minimiza la distorsión de los errores experimentales, por lo que se recomienda su

utilización para el cálculo de Vmax y Km (Doran, 1998).

Las enzimas son proteínas que se comportan como catalizadores; acelerando la

velocidad con la que las reacciones se llevan a cabo sin alterar el equilibrio. Entre
estas destacan las amilasas que degradan al almidón y tienen numerosas
aplicaciones biotecnológicas, entre ellas la producción de jarabes (glucosa,
maltosa, dextrinas) y a escala industrial ha reemplazado los procesos tradicionales
de catálisis ácida. En USA, cerca del 75% de los jarabes y dextrosa sólida son
producidos por procesos enzimáticos por efecto de las amilasas entre ellas α-
amilasa (E.C.3.2.1.1), β-amilasa (E.C.3.2.1.2), amiloglucosidasa (E.C.3.2.1.3),
isoamilasa (E.C.3.2.1.60) y pululanasa (E.C.3.2.1.41) principalmente, que son
producidos por bacterias y hongos. Estas enzimas actúan sobre el almidón
hidrolizando enlaces glucosídicos α-(1-4) y/o α-(1-6). Si bien un producto
comercial está integrado por un amezcla de enzimas diferentes, los dos grupos de
enzimas amilolíticas mas importantes están representados por la α-amilasa y β-
amilasa (Vargas y Silver, 2002).
Para identificar almidón y el producto de su hidrólisis, se puede utilizar Lugol que
es solución de yodo metálico (I2)y yoduro de potasio (IK). El yodo como tal es muy
poco soluble en agua, por lo tanto el reactivo de Lugol se prepara mediante la
disolución de yodo en agua en presencia de yoduro de potasio. Esto hace que el
complejo de iones triyoduro lineal sea soluble. El ion triyoduro se desliza en la
fracción helicoidal del almidón (amilosa) causando un color azul negro intenso.
Cuando se agrega sustancia que lleva almidón a una solución de yodo (lugol),
estas se tiñen de color azul intenso. Esto es debido a que los átomos de yodo se
introducen en las espirales (amilosa), dándole esa coloración. El color desaparece,
al calentar la disolución, volviéndose transparente, porque los átomos de yodo se
salen de la espiral. Al enfriar la disolución retorna el color azul (. Asimismo Cuando
la amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en
presencia de I2/IK ya no dará una coloración azul. En este sentido se puede
observar el consumo del sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para
determinar cualitativamente la actividad de un preparado enzimático crudo en el
almidón.

2. OBJETIVOS

- Obtener un preparado enzimático crudo (PEC) de papaya y confirmar su

actividad enzimática mediante un análisis cualitativo.
- Realizar la marcha analítica de cuantificación de almidón por espectrofotometría,
utilizando la curva de calibración para determinar la actividad enzimática en
Unidades Street Close (USC) del PEC.
- Determinar los parámetros cinéticos en la degradación del almidón utilizando el
PEC.
- Manipular y desarrollar el laboratorio virtual: Enzimas biomodel.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y equipos
- Pulpa de papaya madura
- KCl 0.154 M
- HCl 0.1N
- Solución iodada de lugol
- Solución de almidón soluble (400 ppm)
- Agua destilada
- 20 tubos de ensayo
- 2 vasos de precipitación de 500 mL
- 5 pipetas graduadas de 5 mL
- 1 mortero con pilón
- 1 embudo de vidrio
- 1 balanza analítica
- 1 centrífuga
- 1 cocina eléctrica
- 1 baño María
- 1 espectrofotómetro
- 10 toallas de papel o rollo de gasa

A. Evaluación cualitativa de la actividad enzimática del PEC

Se debe obtener un Preparado Enzimático Crudo (PEC) de acuerdo a la siguiente

secuencia (Figura) 1.

Figura 1. Secuencia del proceso para la preparación de muestras de PEC.

Luego de obtenido el PEC, se debe de proceder de acuerdo a:

A.1. Preparación de solución de almidón soluble 400 ppm

- Pesar 0.1 g de almidón soluble y diluir en una fiola de 250 mL de capacidad,

agregando 150 mL de agua destilada.
- Llevar a ebullición con agitación constante.
- Enfriar y enrasar con agua destilada hasta completar un volumen de 250 mL.

A.2. Evaluación de la actividad enzimática

Preparar 3 tubos de acuerdo a la Tabla 1, en cual servirá para comparar el color

del tubo problema frente a un tubo testigo y un blanco. Se debe de agregar la
misma cantidad de HCl (inhibidor de la actividad enzimática) y solución lugol que
colorea al almidón, para mantener constantes estas condiciones en los 3 tubos.
Tabla 1. Agregados y procedimiento para los tubos testigo, problema y blanco en
PEC
Agregado y Testigo Problema Blanco
procedimiento (mL) (mL) (mL)
Solución almidón 2.5 2.5 0.0
Agua destilada 0.5 0.4 2.9
PEC 0.0 0.1 0.1
Incubar a 35°C por 15 minutos
HCl 0.1 N 2.5 2.5 2.5
Lugol 0.2 0.2 0.2

B. Determinación la curva de calibración del PEC

B.1. Preparar los patrones para obtener la curva de calibración utilizando cinco
tubos con soluciones de almidón a diferentes concentraciones y un tubo blanco,
de acuerdo a la Tabla 2.

Tabla 2. Preparación de los patrones para la determinación de la curva de

calibración
Tubos
Componentes Blanco t1 t2 t3 t4 t5
Solución de almidón (mL) 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Agua destilada (mL) 3 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Mezclar
HCl 0.1N (mL) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Mezclar
Lugol (mL) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

B.2. Llevar los 5 tubos al espectrofotómetro y leer la absorbancia a 550 nm.

Previamente calibrar el tubo “blanco”.
B.3. Graficar la línea/curva de calibración la absorbancia en función a la
concentración de almidón y determinar el factor de conversión.
B.4. Cuantificar la acción de PEC en función al sustrato, para lo cual se debe de
preparar un tubo blanco (B) y un tubo problema (P), de acuerdo a la Tabla 3:

Tabla 3. Cuantificación de la acción de PEC

COMPONENTE TUBO TUBO
BLANCO PROBLEMA
Solución de almidón 0.0 2.5
Agua destilada 2.9 0.4
PEC 0.1 0.1
Incubar a 37 ºC x 15 min
HCl 0.1 N 2.5 2.5
Lugol 0.2 0.2

B.5. Llevar al espectrofotómetro y leer la absorbancia a 550 nm del tubo blanco (B)
y del tubo problema (P).
B.6. Determinar los miligramos de almidón hidrolizados y USC que es la cantidad
de enzima capaz de hidrolizar 20 mg de almidón a 37 ºC por 15 minutos a pH 7.1
(Cueva et al. 1983), realizando para ello la lectura corregida del tubo problema (P),
luego los miligramos de almidón residual, para lo que se utiliza el factor de
conversión “A” determinado en la curva de calibración (inversa de la pendiente en
una relación lineal entre absorbancia y mg de almidón). Con los miligramos de
almidón residual se puede determinar los miligramos de almidón hidrolizado y con
este las USC; siguiendo los pasos como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Determinación de los miligramos de almidón hidrolizados y de las USC
Muestra Lectura Lectura Almidón Almidón USC (0.1 PEC)
de Abs. corregida residual hidrolizado (mg)
(mg)
Blanco (B) LB Abs= LP - LB Lectura (almidón inicial)- Almidón
Problema (P) LP corregida*A (almidón residual) hidrolizado/20

*Almidón inicial: 2.5 mL 400 ppm = 1 mg

C. Determinación de la cinética enzimática del PEC

Controlar el pH de la solución pues en este caso no se está utilizando buffer que

garantice que en todos los tratamientos se tendrá pH constante.

C.1. Tomar las medidas de absorbancia y realizar los cálculos de acuerdo a la

Tabla 5:

Tabla 5. Absorbancias y velocidad de reacción enzimática del PEC a diferente

cantidad de sustrato
Tubo Blanco 1 2 3 4 5
Almidón inicial (mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Lectura
Lectura corregida
Almidón residual (mg)
Almidón hidrolizado (mg)
V (mg/min)

C.2. Graficar velocidad en función de la concentración de sustrato y velocidad en

función de la concentración de la enzima.

C.3.Graficar utilizando el modelo Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee,

Langmuir/Hanes-Woolf, Michaelis-Menten en software R y determinar la velocidad
máxima de la reacción y la constante de Michaelis

D. Enzimas biomodel

Entrar a la dirección: http://biomodel.uah.es/metab/enzimas/inicio.htm y ejecutar:

D.1. Conceptos moleculares:
• Saturación de los centros activos por sustrato: Simulación de la unión de un
sustrato a una enzima: Realizar los ejercicios para asimilar los conceptos y
presentar los resultados de las respuestas.
• Mecanismo catalítico de la quimiotripsina. Revisar los conceptos del
mecanismo catalítico (Revisar: J. Batra, T.R. Caulfield, E.S. Radisky, 2013.
doi:10.1074/jbc.M113.457382 Supplemental Model 1, jbc.M113.457382-
1.pdb)
D.3. Medida de la actividad enzimática:
• Ensayo de la actividad enzimática: Revisar el fundamento del ensayo.
• Encontrar las condiciones óptimas de pH y temperatura para la enzima 6-
O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168). Presentar los resultados.
(Revisar los datos experimentales de Bárbara Neher; doi:10.1007/s00253-
015-7088-x ; PMID:26549237)
D.4. Cinética enzimática:
• Influencia de la concentración de sustrato:
o Realizar el análisis gráfico de la cinética de Michaelis y Menten y
Presentar las respuestas correctas de las actividades planteadas.
o Realizar las representaciones linealizadas y presentar los gráficos
respectivos.
• Influencia de la concentración de la enzima: Realizar las actividades y
presentar los resultados.
• Diseño experimental: Realizar el ensayo y presentar los resultados.
• Cálculo: Realizar los regresión no lineal por mínimos cuadrados aplicada a
la cinética de Michaelis y Menten y presentar los resultados (el autor del
algoritmo de regresión es John C. Pezzullo (past profesor en los
departamentos de Farmacología y Bioestadística de la Universidad de
Georgetown, en Washington, DC, EEUU, http://statpages.org/nonlin.html)
• Cooperatividad: Presentar los resultados (el coeficiente de Hill (n) indica
cuántas de las zonas de unión de sustrato de una enzima afectan a la
afinidad de la unión del sustrato en el resto de las zonas de unión. El
coeficiente de Hill puede tomar valores mayores o menores que 1: n < 1:
indica cooperatividad negativa).
4. RESULTADOS

A. Evaluación cualitativa de la actividad enzimática del PEC

Se debe indicar con el signo (+) el color en la Tabla 5:

Tabla 5. Análisis cualitativo de la actividad enzimática del PEC

Muestra Características (color) Actividad
Tubo testigo Tubo Tubo blanco enzimática
problema
Papaya madura Azul Lila claro Amarillo claro Si (+)/no (-)
(+) (+) (+) (+)

Nota: el experimento podrá continuar si la prueba cualitativa se asemeja al color

de los tubos mostrados en la Figura 2.

Figura 2. Prueba cualitativa de la actividad enzimática del PEC.

B. Determinación la curva de calibración del PEC

Determinación de B.3: Valores de absorbancia leídos en el espectrofotómetro:

Ejemplo(*).

Figura 3. Tubos de ensayo preparados para la construcción de la curva de

calibración.
 Tabla 6. Determinación de absorbancia de las muestras preparadas
Blanco Tubo 1 Tubo2 Tubo3 Tubo4 Tubo 5
Solución de almidón (mg) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(*) Absorbancia (Valores leídos) 0.0 0.552 1.056 1.658 2.18 2.79

Graficar los valores la absorbancia en función de la concentración del almidón

(mg) y obtener el la pendiente, verificando la consistencia experimental (R2).

Determinación de B.6:

𝟏
𝐅𝐚𝐜𝐭𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐧𝐯𝐞𝐫𝐬𝐢ó𝐧 "𝐀" =
𝐕𝐚𝐥𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐥𝐚 𝐩𝐞𝐧𝐝𝐢𝐞𝐧𝐭𝐞 𝐨𝐛𝐭𝐞𝐧𝐢𝐝𝐨𝐬 𝐝𝐞 𝐥𝐨𝐬 𝐝𝐚𝐭𝐨𝐬 𝐝𝐞 𝐥𝐚 𝐓𝐚𝐛𝐥𝐚 𝟔

Tabla 6. Determinación de la actividad enzimática en unidades Street - Close en el

tubo Problema
Lectura Almidón Almidón
Muestra Absorbancia corregida residual hidrolizado (mg) USC(0.1 PEC)
(mg)
Problema (P) 0.722 0.722 x ”A” 1.0 – Almidón residual Almidón hidrolizado/20
Blanco (B) 0
Almidón inicial: 2.5 mL = 1.0 mg

Calcular la Unidades Street Close (USC):

𝐕𝐚𝐥𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐔𝐒𝐂(𝟎. 𝟏 𝐏𝐄𝐂)𝐱 𝟏𝟎𝟎

𝟎. 𝟏

Expresar el resultado:
Se obtuvo para 100 mL de muestra de papaya un valor de --- USC (Unidades
Street Close) usando una curva de calibración con un R2 de ----

C. Determinación de la cinética enzimática del PEC

C.1. Medidas de absorbancia y cálculos:

Tabla 7. Absorbancias y velocidad de reacción enzimática del PEC a diferentes

cantidades de sustrato
Tubo Blanco 1 2 3 4 5

Almidón inicial (mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Lectura
Lectura corregida 0 0.069 0.254 0.396 0.644 0.794
Almidón residual (mg) 0 0.069xA 0.254xA 0.396xA 0.644xA 0.794xA
Almidón hidrolizado (mg) 0 0.2-Almidón residual 0.4-Almidón residual 0.6-Almidón residual 0.8-Almidón residual 1.0-Almidón residual

V (mg/min) 0 Almidón hidrolizado/15 Almidón hidrolizado/15 Almidón hidrolizado/15 Almidón hidrolizado/15 Almidón hidrolizado/15
C.3. Velocidad máxima de la reacción y la constante de Michaelis-Menten

Tabla 8. Parámetros cinéticos del PEC por diferentes métodos

Método KM Vmax R2
Lineweaver-Burk
Eadie-Hofstee
Langmuir/Hanes-Woolf
Michaelis-Menten (software R)

5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Batra, J., Szabó, A., Caulfield, T. R., Soares, A. S., Sahin-Tóth, M., & Radisky, E.
S. (2013). Long-range electrostatic complementarity governs substrate recognition
by human chymotrypsin C, a key regulator of digestive enzyme activation. Journal
of Biological Chemistry, 288(14), 9848-9859.

Cueva, F., Villanueva, E., Ponce, H., Canchachi, W., & Ilich, E. (1983).
Termoestabilidad de Alfa Amilasa en Extractos crudos de cuatro cultivos de
Bacillus sp. Cong Iberoamer CC Químicas, 21.

Doran, P. (1998). Principios de ingeniería de los bioprocesos. Editorial Acribia.

Zaragoza, España, 468.

Neher, B. D., Mazzaferro, L. S., Kotik, M., Oyhenart, J., Halada, P., Křen, V., &
Breccia, J. D. (2016). Bacteria as source of diglycosidase activity: Actinoplanes
missouriensis produces 6-O-α-L-rhamnosyl-β-D-glucosidase active on flavonoids.
Applied microbiology and biotechnology, 100(7), 3061-3070.

Smith, J. E. (2006). Biotecnología. Editorial Acribia. Zaragoza (España). Pp. 267.

Vargas, A. & Silver, L. (2002). Selección y Evaluación de bacterias del Género

Bacillus productoras de amilasa en cultivo sumergido.Tesis Digital UNMSM.
Recuperado de:
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/Tesis/Salud/vargas_as/Antec_Fund_Cie
ntif.pdf